試薬部の配置を改良した分析用具および分析方法
本発明は、血球を含んだ試料を移動させるための流路(５)と、流路(５)に試料を導入するための導入口(50)と、流路(５)の内部に配置された試薬部(51)と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るための電子検出媒体(52)と、を備えた分析用具(１)に関する。試薬部(51)は、試料中の分析対象成分から取り出した電子を電子検出媒体(52)に供給するための電子伝達物質を含んでおり、かつ少なくとも一部が導入口(50)の近傍に配置されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる分析対象成分を分析する技術、たとえば血液中のグルコース濃度を測定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
全血を試料とするグルコースセンサとしては、比色法あるいは電極法を採用したものがある(たとえば特許文献１，２参照)。いずれの方法を採用したグルコースセンサを用いる場合であっても、グルコースから取り出した電子を電子検出媒体(発色剤あるいは電極)に供給し、その電子供給量をグルコースセンサの外部から把握することにより、グルコース濃度を演算することができる。グルコースセンサは、通常、酸化還元酵素によってグルコースから電子を取り出し、その電子を、電子伝達物質を介して電子検出媒体に供給するように構成される。
【０００３】
全血を用いてグルコース濃度を測定する場合、測定結果が血球濃度(ヘマトクリット)の影響を受け、高ヘマトクリットの全血ほど、測定結果が真値よりも低値となることが知られている。この原因の１つとして、血清(血漿)中に存在するグルコースからの電子の取り出しに比べて、血球中に存在するグルコースからの電子の取り出しのほうに時間がかかることが指摘されている。すなわち、血清(血漿)中のグルコースからは、酸化還元酵素によって即座に電子を取り出すことができる。これに対して、血球中のグルコースからは、血清(血漿)にグルコースを移行させた後でないと、電子を取り出すことができない。しかも、血球内から血清(血漿)へのグルコースの移行は、血球内外でのグルコース濃度の差に起因する単純拡散ではなく、血球膜のグルコース透過能力に依存する促進拡散である。すなわち、血球外へのグルコースの拡散速度は、ミカエリスメンテン式にしたがうものであって、限界値を有しており、血球内外のグルコース濃度の差が一定値以上となれば、血球外へのグルコースの拡散速度は一定値となる。そのため、全血内において、酸化還元酵素、電子伝達物質および電子検出媒体が共存する系では、血清(血漿)内でのグルコースから取り出された電子が即座に電子検出媒体に供給されるものの、その供給量に対応したグルコースを血球外に拡散させるには時間がかかる。その結果、もともと血球内に存在していたグルコースから取り出される電子は、もともと血清(血漿)内に存在していたグルコースに比べて、電子検出媒体に対して遅れて供給される。このような遅れは、血球濃度の高い全血において大きく現れる。したがって、血糖値が同じ全血であっても、試料の供給から一定時間経過後の段階では、血球濃度の高い全血では、血球濃度の低い全血に比べて、血球から血清(血漿)へのグルコースの移行割合が少ないという現象が起こりうる。
【０００４】
近年においては、測定時間が短縮化の傾向にあり、そのために新たな酸化還元酵素および電子伝達物質が模索されている。このような状況下においては、血清(血漿)中に存在するグルコースは、より短時間で消費される。これに対して、血球内から血清(血漿)へのグルコースの拡散は、血球膜のグルコース透過能力に依存するものであるため、血球からのグルコースの移行速度については大きな変化はない。したがって、高ヘマトクリットの全血では、測定時間を短縮化すればするほど、当該測定時間内において血球内から血清(血漿)に移行させることができるグルコースの割合が少なくなり、低値化の問題がより顕著に現れる。
【０００５】
また、酸化還元酵素および電子伝達物質は、たとえば血液に溶解する固相の試薬部としてグルコースセンサにおいて保持される（たとえば特許文献３参照）。そのため、測定時間を短縮化する場合には、試薬部の溶解性が測定精度に与える影響が大きくなる。すなわち、試薬部の溶解性が悪ければ、血液によって試薬部を溶解させたときに生じる液相反応系において、酸化還元酵素や電子伝達物質が均一に分散せず、測定結果にバラツキを生じさせる。このような測定結果のバラツキは、血液中のグルコース濃度が小さい場合により顕著に現れる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１７５６９９号公報
【特許文献２】特公平８−１０２０８号公報
【特許文献３】特開２００４−１０１５１９号公報
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、血球を含んだ試料の分析を行う場合（たとえば血液中のグルコース濃度を測定する場合）に、血球濃度の影響を抑制し、とくに高血球濃度の試料における低値化を抑制することを目的としている。
【０００８】
本発明はさらに、測定時間を短縮化する場合に生じる測定結果のバラツキを抑制し、とくに低濃度域での測定再現性を向上させることを目的としている。
【０００９】
本発明の第１の側面においては、血球を含んだ試料（たとえば血液）を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、上記流路の内部に配置された試薬部と、試料中の対象成分（たとえばグルコース）の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るための電子検出媒体と、を備えた分析用具であって、上記試薬部は、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含んでおり、かつ少なくとも一部が上記導入口の近傍に配置されている、試薬部の配置を改良した分析用具が提供される。
【００１０】
試薬部は、たとえば電子検出媒体とは分離された状態で、電子検出媒体よりも試料の流れ方向における上流側に配置される。この場合の試薬部は、流路に試料を供給したときに溶解する固体状に形成するのが好ましい。
【００１１】
試薬部と電子検出媒体との間の距離は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が試料に含まれる場合において、上記上限量の分析対象成分から電子伝達物質への電子移動が、電子伝達物質が電子検出媒体に対して電子を供給しうる状態となるまでの間に、実質的に完了する長さに設定するのが好ましい。
【００１２】
試薬部における電子伝達物質の含有量は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が試料に含まれる場合において、上記上限量のグルコースから取り出せる全ての電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量に設定するのが好ましい。
【００１３】
電子検出媒体は、発色剤を含んだものとして構成することができる。この場合、電子検出媒体は、試料に対して難溶性の多孔質体に、発色剤を保持させた構成とするのが好ましい。多孔質体としては、典型的には、ポリアクリルアミドあるいはポリビニルアルコールなどのゲル状物を挙げることができる。一方、発色剤としては、たとえばＭＴＴ(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)、ＩＮＴ（2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride) 、ＷＳＴ−４(2-(4- lodophenyl) -3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4- disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt)、および４ＡＡ(4-Aminoantipyrine)が挙げられる。
【００１４】
電子検出媒体は、導体として構成することもできる。導体としては、たとえば流路に試料が供給されたときに、電子伝達物質に電圧を印加するために利用されるものが挙げられる。
【００１５】
試薬部は、たとえば試料中の分析対象成分から電子を取り出して電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含んだものとして構成される。酸化還元酵素は、試薬部とは分離した追加の試薬部として分析用具に保持させてもよい。この場合、追加の試薬部は、流路の内部における試料の流れ方向において、試薬部と電子検出媒体との間に配置するのが好ましい。追加の試薬部は、たとえば流路に試料を供給したときに溶解する固体状に形成される。
【００１６】
本発明の第２の側面においては、血球を含んだ試料を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るためのものであり、かつ試料に対して難溶性の多孔質体に発色剤を保持させた構成の電子検出媒体と、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された電子伝達物質層と、試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された酸化還元酵素層と、を備えた分析用具であって、上記流路において、上記電子伝達物質層、上記酸化還元酵素層および上記電子検出媒体がこの順序で、試料の流れ方向の上流側から順番に並んで配置されている、分析用具が提供される。
【００１７】
試薬部（電子伝達物質層）は、たとえば追加の試薬部（酸化還元酵素層）よりも、平面視面積が大きく、試料の流れ方向の長さが大きく、あるいは厚みが小さく（たとえば酸化還元酵素層の厚みの１５〜８０％）とされる。試薬部（電子伝達物質層）は、追加の試薬部（酸化還元酵素層）における導入口側の縁から導入口までの距離における５０〜９０％の長さ範囲を占めるように形成してもよい。試薬部（電子伝達物質層）はまた、流路における電子検出媒体の平面視面積の１．５〜１０倍の平面視面積を有するものとすることもできる。
【００１８】
本発明における電子伝達物質としては、Ｒｕ錯体を用いるのが好ましい。Ｒｕ錯体としては、[Ｒｕ(ＮＨ3)5Ｘ]n+として表現されるものを使用するのが好ましい。ここで、上記化学式において、Ｘは、たとえばＮＨ3、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ2Ｏであり、ｎ＋は、Ｘの種類により決定される酸化型Ｒｕ(III)錯体の価数である。
【００１９】
本発明における酸化還元酵素としては、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用することができる。ＧＤＨとしては、ＰＱＱＧＤＨ、αＧＤＨ、あるいはＣｙＧＤＨを用いるのが好ましい。
【００２０】
ここで、ＰＱＱＧＤＨとは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするものである。一方、αＧＤＨ およびＣｙＧＤＨは、国際公開第ＷＯ０２／３６７７９号パンフレットに開示されているものをさしている。すなわち、αＧＤＨおよびＣｙＧＤＨは、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）をさしており、形質転換体に産出させたものも含まれる。
【００２１】
より具体的には、αＧＤＨは、ＦＡＤを補欠因子としてもち、かつグルコース脱水素活性を有するサブユニットとして、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるＧＤＨ活性タンパク質(αサブユニット)を含んだものである。一方、ＣｙＧＤＨは、αサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである電子伝達タンパク質(チトクロムＣ)と、をサブユニットとして含むものである。αＧＤＨやＣｙＧＤＨとしては、αサブユニットやチトクロムＣ以外のサブユニットをさらに有するものを使用することもできる。
【００２２】
ＣｙＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物が菌体外に分泌した酵素を精製し、あるいは当該菌体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。一方、αＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したαＧＤＨをコードする遺伝子が移入された形質転換体を形成し、この形質転換体から外部に分泌された酵素を精製し、あるいは当該形質転換体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。
【００２３】
ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物としては、たとえばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を使用することができる。このＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立特許法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６)に微生物受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。
【００２４】
本発明のグルコースセンサは、流路において毛細管力が生じるように構成することもできる。
【００２５】
本発明の第３の側面においては、血球を含んだ試料が移動した状態において、上記試料に含まれる分析対象成分から取り出した電子を電子伝達物質に供給し、上記試料に含まれる全ての分析対象成分から上記電子伝達物質への電子移動を、実質的に完了する過程と、上記試料の移動が停止した状態において、上記電子伝達物質と電子検出媒体との間の電子授受反応を行う過程と、上記電子検出媒体を介して得られる情報に基づいて、分析対象成分の分析に必要な演算を行う過程と、を含んでいる、分析方法が提供される。
【００２６】
電子検出媒体は、本発明の第１の側面と同様に、たとえば発色剤を含んだものとして、あるいは導体として構成される。
【００２７】
ここで、本発明において血球を含んだ試料とは、少なくとも全血、および全血の希釈液などの調整液を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図２】図１のII−II線に沿う断面図である。
【図３】図１に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図４】図１に示したグルコースセンサの作用を説明するための図２に相当する断面図である。
【図５】本発明の第２の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図６】図５のVI−VI線に沿う断面図である。
【図７】図５に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図８】本発明の第３の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図９】図８のIX−IX線に沿う断面図である。
【図１０】図８に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図１１】本発明の第４の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図１２】図１１のＸII−ＸII線に沿う断面図である。
【図１３】図１１に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図１４】実施例１〜３において使用したグルコースセンサの基本構成を説明するための斜視図である。
【図１５】実施例１１〜３において使用したグルコースセンサの試薬部の構成を説明するための透明カバーを省略して示した平面図である。
【図１６Ａ】実施例１において、グルコースセンサ(１)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】実施例１において、グルコースセンサ(２)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１６Ｃ】実施例１において、グルコースセンサ(３)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１７】Ｈｃｔが４２％のときを基準とした場合のバイアスとして、Ｈｃｔの影響を示したグラフである。
【図１８Ａ】実施例２において、グルコースセンサ(１)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１８Ｂ】実施例２において、グルコースセンサ(２)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１８Ｃ】実施例２において、グルコースセンサ(３)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１９】実施例４において使用した本案グルコースセンサの試薬部の構成を説明するための透明カバーを省略して示した平面図である。
【図２０Ａ】実施例４において、本案グルコースセンサを使用して波長６６０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２０Ｂ】実施例４において、本案グルコースセンサを使用して波長９４０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２０Ｃ】実施例４において本案グルコースセンサを使用したときに、波長６６０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果から波長９４０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果を差分として表したタイムコースである。
【図２１Ａ】実施例４において、参照グルコースセンサを使用して波長６６０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２１Ｂ】実施例４において、参照グルコースセンサを使用して波長９４０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２１Ｃ】実施例４において参照グルコースセンサを使用したときに、波長６６０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果から波長９４０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果を差分として表したタイムコースである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の第１〜第４の実施の形態について図面を参照しつつ説明する。
【００３０】
まず、本発明の第１の実施の形態について、図１〜図３を参照しつつ説明する。
【００３１】
図１〜図３に示したグルコースセンサ１は、使い捨てとして構成されたものであり、比色により血液中のグルコース濃度を測定するように構成されたものである。このグルコースセンサ１は、長矩形の基板２に対して、スペーサ３を介してカバー４を接合した形態を有しており、各要素２〜４により、基板２の長手方向に延びるキャピラリ５が規定されている。キャピラリ５は、毛細管力により血液を移動させるとともに、反応場を提供するためのものである。このキャピラリ５は、開口５０を介して外部と連通している。開口５０は、キャピラリ５の内部に血液を導入するためのものである。
【００３２】
基板２は、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ビニロンなどにより透明に形成されている。基板２には、キャピラリ５の内部に収容された状態で第１および第２試薬部５１，５２が設けられている。
【００３３】
第１試薬部５１は、第２試薬部５２よりも血液の流れ方向の上流に位置するように、開口５０の近傍に設けられている。この第１試薬部５１は、たとえば酸化還元酵素および電子伝達物質を含んでおり、血液に対して溶解しやすい固体状に形成されている。このため、キャピラリ５に血液を導入した場合には、キャピラリ５の内部には、グルコース、酸化還元酵素および電子伝達物質を含む液相反応系が構築される。
【００３４】
酸化還元酵素としては、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いることができ、典型的にはＰＱＱＧＤＨ、αＧＤＨあるいはＣｙＧＤＨが使用される。
【００３５】
電子伝達物質としては、たとえば Ｒｕ錯体やＯｓ錯体などの金属錯体を用いることができる。Ｒｕ錯体としては、[Ｒｕ(ＮＨ3)6]Ｃｌ3を用いるのが好ましい。電子伝達物質としては、ＰＭＳ（5-methylphenazinium methylsulfate）の他、チトクロムやＮＡＤ-1を使用することもできる。ここで、電子伝達物質の含有量は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、上限量のグルコースから取り出せる全ての電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量として設定されている。たとえば、測定範囲の上限量が６００ｍｇ／ｄＬ(３３ｍＭ)であり、グルコースと電子伝達物質が化学量論的に１：２の割合で反応する場合には、電子伝達物質の含有量は、キャピラリ５が血液によって満たされたときの濃度が６６ｍＭ以上となるように設定される。
【００３６】
第２試薬部５２は、発色剤を含んでおり、血液に対して難溶性の固層として形成されている。この第２試薬部５２は、たとえば基板２に対して固定されたゲル状担体に対して、発色剤を担持させた構成とされている。この構成では、発色剤を血液に分散させることなく、第２試薬部52の内部に電子伝達物質を拡散させ、第２試薬部５２において、発色剤に対して電子伝達物質からの電子を供給することができる。
【００３７】
ゲル状担体としては、ポリアクリルアミドあるいはポリビニルアルコールを使用することができる。一方、発色剤としては、公知の種々のものを用いることができるが、電子を受け取って発色したときの吸収波長が、血液の吸収波長からずれたものを用いるのが好ましい。発色剤としては、たとえばＭＴＴ、ＩＮＴ、ＷＳＴ−４、および４ＡＡを用いることができる。
【００３８】
ここで、第１試薬部５１と第２試薬部５２との中心間距離Ｄ１は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が第２試薬部５２に到達するまで（電子伝達物質が発色剤に電子を供給することが可能となるまで）の間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了する長さに設定されている。この中心間距離Ｄ１は、酸化還元酵素がグルコースから電子を取り出す速度（触媒能力）、電子伝達物質がグルコースから電子を受け取る速度（電子伝達速度）、およびキャピラリ５における血液の移動速度などに応じて適宜設定される。たとえば、キャピラリ５を血液により満たすのに要する時間が２秒であり、酸化還元酵素としてＰＱＱＧＤＨを用い、電子伝達物質として[Ｒｕ(ＮＨ3)6]Ｃｌ3を用いる場合には、中心間距離Ｄ１は、たとえば０．５〜１．０ｍｍの範囲に設定される。
【００３９】
スペーサ３は、基板２とカバー４の間の距離、すなわちキャピラリ５の高さ寸法を規定するためのものである。このスペーサ３は、キャピラリ５の幅寸法を規定するためのスリット３０を有している。
【００４０】
カバー４は、全体が透明に形成されている。このカバー４は、基板２と同様な材料により形成することができる。カバー４には、貫通孔４０が形成されている。貫通孔４０は、キャピラリ５の内部の気体を外部に排出するためのものであり、キャピラリ５の内部に連通している。
【００４１】
グルコースセンサ１では、開口５０を介してキャピラリ５に血液を供給した場合には、図４Ａ〜図４Ｃに示したように、キャピラリ５において生じる毛細管力により、血液がキャピラリ５の内部を進行する。血液の進行過程においては、図４Ａおよび図４Ｂに示したように、血液により第１試薬部５１が溶解させられる。これにより、第１試薬部５１に含まれる酸化還元酵素および電子伝達物質が血液中に分散し、これらが血液とともに貫通孔４０ひいては第２試薬部５２に向けて移動する。このとき、酸化還元酵素によって血清（血漿）のグルコースから電子が取り出され、グルコースがグルコノラクトンとされ、血清（血漿）におけるグルコース濃度が減少する。グルコースから取り出された電子は、酸化還元酵素の作用によって電子伝達物質に供給される。一方、血清（血漿）におけるグルコース濃度の減少に伴い、血球中のグルコースが血清（血漿）中に移行する。血球外に移行したグルコースからは、先に説明したのと同様にして電子が取り出され、電子伝達物質に供給される。
【００４２】
図４Ｃに示したように、血液の進行は、血液が貫通孔４０に到達したときに停止する。このとき、血液が第２試薬部５２に浸透する。キャピラリ５においては、血液とともに電子伝達物質も移動させられるため、第２試薬部５２への血液の浸透に伴い、第２試薬部５２の内部に電子伝達物質が拡散する。このため、第２試薬部５２においては、発色剤に対して電子伝達物質から電子が供給されて発色剤が発色し、第２試薬部５２が着色される。第２試薬部５２の着色の程度は、血液の供給開始から一定時間経過後において、たとえば第２試薬部５２に対してカバー４を介して光を照射し、そのときに第２試薬部５２および基板２を透過した光、あるいは反射した光を受光することにより把握される。照射光の波長は、発色剤の発現色における吸収の大きな波長の光のものが採用される。最終的なグルコース濃度は、たとえば照射光の強度と、透過光の強度と、の比に基づいて演算される。
【００４３】
グルコースセンサ１では、第１試薬部５１が第２試薬部５２に比べて、血液の流れ方向の上流側に設けられている。そのため、キャピラリ５に対する血液の導入と同時に電子伝達物質をグルコースと反応させることができる。しかも、第１試薬部５１を開口５０の近傍に配置することにより、血液が第２試薬部５２に到達するまでの間において、電子伝達物質とグルコースとを反応させるための時間を長く確保することができる。その結果、電子伝達物質が第２試薬部５２に到達する前（電子伝達物質が発色剤と反応する前）に電子伝達物質を積極的にグルコースと反応させることができる。とくに、グルコースセンサ１では、電子伝達物質の含有量が、測定濃度範囲の上限量のグルコースの全てから電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量として設定され、中心間距離Ｄ１が、血液が第２試薬部５２に到達するまでの間に、グルコースの全てから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了するように設定されている。したがって、グルコースセンサ１では、電子伝達物質が発色剤と反応を開始するまでの間に、血球中のグルコースを確実に血清（血漿）中に移行させることができる。その結果、血液における血球濃度の影響を抑制し、精度良くグルコース濃度を測定できるようになる。
【００４４】
次に、本発明の第２の実施の形態に係るグルコースセンサについて、図５〜図７を参照して説明する。ただし、図５〜図７においては、先に説明したグルコースセンサ１（図１ないし図３参照）と同様な要素については同一の符号を付してあり、重複説明は省略する。
【００４５】
図５〜図７に示したグルコースセンサ１′は、第１ないし第３試薬部５１′，５２′，５３′を備えている点において、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）とは異なっている。
【００４６】
第１試薬部５１′は、電子伝達物質を含んだものであり、キャピラリ５に試料が供給されたときに溶解するように構成されている。この第１試薬部５１′は、開口５０の近傍に設けられている。第１試薬部５１′に含ませる電子伝達物質としては、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様なものを例示することができる。
【００４７】
第２試薬部５２′は、先に説明したグルコースセンサ１の第２試薬部５２（図１〜図３参照）と同様な構成とされている。すなわち、第２試薬部５２′は、たとえば電子検出媒体である発色剤を、血液に対して難溶性のゲル状担体に担持させた構成とされている。
【００４８】
第３試薬部５３′は、酸化還元酵素を含んだものであり、キャピラリ５に試料が供給されたときに溶解するように構成されている。この第３試薬部５３′は、第１試薬部５１′と第２試薬部５２′との間に設けられている。第３試薬部５３′に含ませる酸化還元酵素としては、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様なものを例示することができる。
【００４９】
ここで、第１試薬部５１′と第２試薬部５２′との中心間距離Ｄ１は、グルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様に設定されている。すなわち、中心間距離Ｄ１は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が第２試薬部５２′に到達するまで（電子伝達物質が発色剤に電子を供給することが可能となるまで）の間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了する長さに設定されている。一方、第１試薬部５１′と第３試薬部５３′との中心間距離Ｄ２は、第１試薬部５１′に含まれる電子伝達物質の存在によって血球中から血球外に取り出し可能なグルコースの最大量の殆ど全ての量のグルコースを取り出せる距離に設定される。第２試薬部５２′と第３試薬部５３′との中心間距離Ｄ３は、第３試薬部５３′が十分に溶解し、酸化還元酵素を血液中に十分に分散させることができる距離に設定される。
【００５０】
このようなグルコースセンサ１′においては、キャピラリ５に血液が供給されたときに、まず第１試薬部５１′が溶解して血液中に電子伝達物質が分散する。このとき、血球の周りに無機物たる電子伝達物質が存在しているために、血球中から血球外へのグルコースの拡散が促進される。次いで、血液が第３試薬部５３′に到達したときに第３試薬部５３′が溶解して血液中に酸化還元酵素が分散する。このとき、酸化還元酵素の作用によって、血清中のグルコースと電子伝達物質の反応が促進される。最終的には、血液が第２試薬部５２′に到達した場合には、酸化還元酵素の作用によって、電子伝達物質から発色剤に電子が供給され、発色剤が発色する。
【００５１】
グルコースセンサ１′では、血清中のグルコースを電子伝達物質に供給する前に、血球中のグルコースを積極的に取り出すようにしている。すなわち、電子伝達物質に酸化還元酵素を作用させる前に、血清中にグルコース濃度が高くされており、電子伝達物質に酸化還元酵素を作用させた後における血球中からのグルコースの拡散が少なくなるようになされている。その結果、後述の実施例からも明らかとなるが、電子伝達物質と発色剤との間の反応初期速度が大きくなり、測定時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００５２】
次に、本発明の第３の実施の形態に係るグルコースセンサについて、図８〜図１０を参照して説明する。ただし、図８〜図１０においては、先に説明したグルコースセンサ１，１′(図１〜図３、あるいは図５〜図７参照)と同様な要素については同一の符号を付してあり、重複説明は省略する。
【００５３】
図８〜図１０に示したグルコースセンサ１″は、第１〜第３試薬部５１″，５２″，５３″を備えている点において、第１の実施の形態に係るグルコースセンサ１(図１〜図３参照)とは異なっている一方で、第２の実施の形態に係るグルコースセンサ１′(図５〜図７参照)と同様な構成とされている。また、グルコースセンサ１″は、第１試薬部５１″の構成が第２の実施の形態に係るグルコースセンサ１′(図５〜図７参照)とは異なっている。
【００５４】
第１試薬部５１″は、先に説明したグルコースセンサ１，１′と同様な電子伝達物質を含んだものであり、キャピラリ５に試料が供給されたときに溶解するように構成されている。この第１試薬部５１″は、開口５０と第３試薬部５３″との間において塗り広げられている。
【００５５】
第１試薬部５１″は、第２試薬部５２″および第３試薬部５３″よりも、平面視面積、およびキャピリラリ５における血液の流れ方向の長さが大きい長矩形状に形成されている。より具体的には、第１試薬部５１″は、開口５０から第３試薬部５３″における開口５０側の縁までの間において、その占有長さが５０〜９０％とされ、その厚みが、たとえば第３試薬部５３″の厚みの１５〜８０％とされる。これらの数値範囲は、第１試薬部５１″の溶解性を十分に改善することができ、かつ、製造上の限界を考慮したものである。第１試薬部５１″は、第２試薬部５３″を基準とした場合には、その平面視面積が第２試薬部５３″の１．５〜１０倍とされる。
【００５６】
第１試薬部５１″と第２試薬部５２″中心間距離Ｄ１は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が第２試薬部５２″に到達するまで（電子伝達物質が発色剤に電子を供給することが可能となるまで）の間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了する長さに設定されている。一方、第１試薬部５１″と第３試薬部５３″との中心間距離Ｄ２は、第１試薬部５１″に含まれる電子伝達物質の存在によって血球中から血球外に取り出し可能なグルコースの最大量の殆ど全ての量のグルコースを取り出せる距離に設定される。第２試薬部５２″と第３試薬部５３″との中心間距離Ｄ３は、第３試薬部５３″が十分に溶解し、酸化還元酵素を血液中に十分に分散させることができる距離に設定される。
【００５７】
このようなグルコースセンサ１″においては、第１試薬部５１″が薄く塗り広げられたものとなっているため、キャピラリ５に血液が供給されたときに、第１試薬部５１″の溶解性が高く、血液中に電子伝達物質が良好に分散する。そのため、キャピラリ５に血液が供給されたときに形成される血液と電子伝達物質の混合系においては、電子伝達物質の濃度のバラツキが小さくなる。その結果、測定後の反応速度のバラツキを抑制できるようになり、電子伝達物質の濃度のバラツキの影響を受けやすい低濃度域での測定再現性が向上する。また、グルコースセンサ１″では、グルコースセンサ１′と同様に、血清中のグルコースを電子伝達物質に供給する前に、血球中のグルコースをより積極的に取り出すようにしているために、電子伝達物質と発色剤との間の反応初期速度が大きくなって、測定時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００５８】
次に、本発明の第４の実施の形態に係るグルコースセンサについて、図１１〜図１３を参照して説明する。
【００５９】
図１１〜図１３に示したグルコースセンサ６は、使い捨てとして構成されたものであり、電極法によりグルコース濃度を測定できるように構成されたものである。このグルコースセンサ６は、先に説明したグルコースセンサ１(図１〜図３参照)と同様に、基板７に対して、スペーサ８を介してカバー９を積層した形態を有しており、各要素７〜９により規定されたキャピラリ６０を有している。
【００６０】
スペーサ８およびカバー９は、先に説明したグルコースセンサ１のスペーサ３およびカバー４（図１〜図３参照）と同様な構成とされている。すなわち、スペーサ８は、キャピラリ６０の幅寸法を規定するスリット８０を有しており、カバー９はキャピラリ６０の内部に連通する貫通孔９０を有している。ただし、カバー９は必ずしも透明に形成する必要はない。
【００６１】
基板７の上面７０には、作用極７１、対極７２および試薬部７３が形成されている。作用極７１および対極７２は、端部７１ａ，７２ａが基板７の短手方向に延びている。端部７１ａ，７２ａは、貫通孔９０に比較的に近い部位において基板７の長手方向に並んで設けられており、それらの一部がキャピラリ６０の内部において臨んでいる。一方、作用極71および対極72の端部７１ｂ，７２ｂは、キャピラリ６０の外部において露出している。これらの端部７１ｂ，７２ｂは、端部７１ａ，７２ａの間に電位差を生じさせる際に、プローブなどの端子を接触させるための部分である。
【００６２】
試薬部７３は、キャピラリ６０の内部において開口６１の近傍に設けられている。すなわち、試薬部７３は、作用極７１および対極７２の端部７１ａ，７２ａとは分離された状態において、キャピラリ６０における試料の流れ方向の上流に設けられている。この試薬部７３は、たとえば電子伝達物質および酸化還元酵素を含む固体状に形成されている。この試薬部７３は、血液に対して容易に溶解するものとして形成されている。酸化還元酵素および電子伝達物質としては、グルコースセンサ１の第１試薬部５１（図１〜図３参照）における酸化還元酵素および電子伝達物質と同様なものを使用することができる。
【００６３】
ここで、試薬部７３における電子伝達物質の含有量は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、上限量のグルコースから取り出せる全ての電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量として設定されている。また、試薬部７３と作用極７１の端部７１ａとの中心間距離Ｄ４は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が作用極７１の端部７１ａに到達するまでの間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了するように設定されている。
【００６４】
グルコースセンサ６においても、開口６１を介してキャピラリ６０に血液を供給した場合には、キャピラリ６０において生じる毛細管力により、血液がキャピラリ６０の内部を進行する。血液の進行過程においては、血液により試薬部７３が溶解させられる。このとき、酸化還元酵素によって血清（血漿）のグルコースから電子が取り出される一方、グルコースから取り出された電子は、酸化還元酵素の作用によって電子伝達物質に供給される。血球内のグルコースは、血液におけるグルコースの消費に伴って血清（血漿）中に移行し、移行したグルコースからは、先に説明したのと同様にして電子が取り出されて電子伝達物質に供給される。血液の進行は、血液が貫通孔９０に到達したときに停止する。このとき、電子伝達物質が作用極７１の端部７１ａの表面に存在する。作用極７１の端部７１ａに対しては、作用極７１と対極７２の間に電圧を印加することにより、電子伝達物質から電子が供給される。最終的なグルコース濃度は、作用極７１の端部７１ａに対して電子伝達物質から供給された電子の量に基づいて演算される。
【００６５】
グルコースセンサ６では、試薬部７３が作用極７１の端部７１ａに比べて、血液の流れ方向の上流側に設けられ、かつ開口５０の近傍に配置されている。そのため、電子伝達物質が作用極７１の端部７１ａに到達する前に、電子伝達物質を積極的にグルコースと反応させることができる。したがって、グルコースセンサ６では、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様に、全血中における血球濃度の影響を抑制し、精度良くグルコース濃度を測定できるようになる。
【００６６】
グルコースセンサ６においては、試薬部７３が電子伝達物質および酸化還元酵素を含んでいたが、先に説明したグルコースセンサ１′，１″（図８〜図１０、あるいは図１１〜図１３参照）と同様に、電子伝達物質を含む試薬部と、酸化還元酵素を含む試薬部に分離して形成してもよい。
【００６７】
本発明は、試料として血液以外のもの、たとえば血液の希釈液を使用するように構成されたグルコースセンサにも適用することができる。本発明はさらに、グルコース以外の成分、たとえばコレステロールや乳酸を分析するように構成された分析用具に適用することもできる。
【実施例１】
【００６８】
本実施例においては、比色用のグルコースセンサを用いた血糖値の測定において、血液における血球濃度（ヘマトクリット値（Ｈｃｔ））が測定結果に与える影響を検討した。グルコースセンサとしては、以下に説明するグルコースセンサ(１)〜(３)を用いた。Ｈｃｔ値が測定結果に与える影響は、吸光度のタイムコースおよび特定時間経過後におけるバイアスに基づいて検討した。
【００６９】
(グルコースセンサの基本構成)
グルコースセンサ(１)〜(３)の基本構成（試薬部を除く）は図１４に示した通りである。すなわち、各グルコースセンサ(１)〜(３)は、透明基板２Ａに対してスペーサ３Ａを介して透明カバー４Ａを積層した形態を有するとともに、各要素２Ａ〜４Ａによってキャピラリ５Ａが規定されたものとされている。キャピラリ５Ａの寸法は、図１４に記入したように、１．３ｍｍ×９ｍｍ×５０μｍである。透明基板２Ａおよび透明カバー４Ａは、厚みが２５０μｍであるＰＥＴにより形成し、スペーサ３Ａは両面テープにより構成した。
【００７０】
(試薬部の構成および形成方法)
各グルコースセンサ(１)〜(３)においては、発色剤を含んだ試薬部を、電子伝達物質および酸化還元酵素のうちの少なくとも一方を含む試薬部に対して、キャピラリの流れ方向に分離して設けた。
【００７１】
グルコースセンサ(１)（本案）では、図１５Ａに示したように電子伝達物質および酸化還元酵素を含む第１試薬部５１Ａをキャピラリ５Ａの上流側に、発色剤を含む第２試薬部５２Ａをキャピラリ５Ａにおける下流側に設けた。第１試薬部５１Ａは、その中心が試料導入口５０Ａから３ｍｍの距離のところに位置し、かつ血液に対して溶解するように形成した。第２試薬部５２Ａは、その中心が貫通孔４０Ａの最上流点４０Ａａから１ｍｍの距離のところに位置するとともに、透明基板２Ａに対して固定化され、かつ血液に対して難溶なゲル状担体に発色剤を保持させた構成に形成した。第１試薬部５１Ａと第２試薬部５２Ａとの中心間距離は、５ｍｍに設定した。
【００７２】
第１および第２試薬部５１Ａ，５２Ａは、目的とする材料液を目的部位に塗布した後、材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）させることにより形成した。なお、第１および第２試薬部５１Ａ，５２Ａを形成する場合の材料液の組成および材料液の塗布量については、下記表１および表２に示した通りである。
【００７３】
【表１】
【００７４】
【表２】
【００７５】
グルコースセンサ(２)（本案）は、図１５Ｂに示したように、グルコースセンサ(１)（図１５Ａ参照）において第１試薬部５１Ｂが酸化還元酵素を含まないものとする代わりに、第１試薬部５１Ｂと第２試薬部５２Ｂとの間に、酸化還元酵素を含む第３試薬部５３Ｂを形成したものとした。この第３試薬部５３Ｂは、その中心が、第１試薬部５１Ｂの中心と第２試薬部５２Ｂの中心との中間に位置するように形成した。
【００７６】
第１〜第３試薬部５１Ｂ，５２Ｂ，５３Ｂは、目的とする材料液を目的部位に塗布した後、材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）させることにより形成した。なお、第１〜第３試薬部５１Ｂ，５２Ｂ，５３Ｂを形成する場合の材料液の組成および材料液の塗布量については、下記表３〜表５に示した通りである。
【００７７】
【表３】
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
グルコースセンサ(３)（比較）は、図１５Ｃに示したように、グルコースセンサ(１)（図１５Ａ参照）において、発色剤を含む試薬部の位置と、電子伝達物質および酸化還元酵素を含む試薬部の位置とを入れ替えた構成とした。すなわち、第１試薬部５１Ｃは、グルコースセンサ(１)における第２試薬部５２Ａに対応する部位（下流側）において、血液に対して難溶なゲル状担体に電子伝達物質および酸化還元酵素を保持させた状態で透明基板２Ａに対して固定化した。一方、第２試薬部５２Ｃは、グルコースセンサ(１)における第１試薬部５１Ａに対応する部位（上流側）において、血液に対して溶解するように形成した。
【００８１】
第１および第２試薬部５１Ｃ，５２Ｃは、目的とする材料液を目的部位に塗布した後、材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）させることにより形成した。なお、第１および第２試薬部５１Ｃ，５２Ｃを形成する場合の材料液の組成および材料液の塗布量については、下記表６および表７に示した通りである。
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】
【００８４】
表１〜表７において、ＣＨＡＰＳは3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acidの略号であり、ＡＣＥＳはN-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acidの略号であり、ＭＴＴは3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromideの略
号である。ＣＨＡＰＳとしては同仁化学研究所（日本国）製「ＫＣ０６２」を、ＡＣＥＳとしては同仁化学研究所（日本国）製「ＥＤ０６７」を、ＭＴＴとしては同仁化学研究所（日本国）製「Ｍ００９」を、ＰＱＱＧＤＨとしては同仁化学研究所（日本国）製のものを、[Ｒｕ(ＮＨ3)6]Ｃｌ3としては同仁化学研究所（日本国）製「ＬＭ７２２」を、スクロースモノラウレートとしては同仁化学研究所（日本国）製「ＰＶ６８９」を、ポリアクリルアミドとしてはナカライテスク（日本国）製「Ｚ２Ｔ８０７１」を使用した。
【００８５】
(吸光度のタイムコース測定)
吸光度タイムコースは、キャピラリに検体を供給した時点から０．１秒毎に吸光度を繰り返し測定して作成した。各回の吸光度の測定においては、グルコースセンサ(１)，(２)については第２試薬部５２Ａ，５２Ｂに対して、グルコースセンサ(３)については第１試薬部５１Ｃに対して、それぞれキャピラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにグルコースセンサ(１)〜(３)を透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて、６３０ｎｍの光を照射することにより行った。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。吸光度は、下記数式１により算出した。
【００８６】
【数１】
【００８７】
吸光度のタイムコースは、各グルコースセンサ(１)〜(３)において、ヘマトクリット値の異なる３種類の検体（Ｈｃｔ＝２０％、４２％、６０％）について５回ずつ測定した。検体におけるグルコース濃度は、４３０ｍｇ／ｄＬに調整した。吸光度のタイムコースについては、グルコースセンサ(１)については図１６Ａに、グルコースセンサ(２)については図１６Ｂに、グルコースセンサ(３)については図１６Ｃにそれぞれ示した。一方、バイアスの演算結果については、図１７に示した。図１７においては、バイアスは測定開始から５秒経過後の吸光度に基づいて、各グルコースセンサ(１)〜(３)毎および各Ｈｃｔの検体毎に、５回の測定の平均値として示してある。
【００８８】
図１６Ａ 〜図１６Ｃから分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて試薬部への酵素含有量（活性基準）が少ないにも拘らず、いずれのＨｃｔの検体においても、吸光度の立ち上がりが大きい上に吸光度が一定値に漸近するまでの時間が短い。そのため、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）を用いれば、使用する酵素量を少なくしつつも、測定時間の短縮化を図ることができるといえる。とくに、グルコースセンサ(２)（本案）においては、グルコースセンサ(１)（本案）に比べて測定初期（５秒以下）におけるタイムコースが安定し、かつ一定値に漸近するまでの時間が短い。そのため、Ｈｃｔが未知の検体を短時間で正確に測定する観点からは、グルコースセンサ(２)（本案）がさらに有用である。
【００８９】
一方、図１７から分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて、高Ｈｃｔ検体（６０％）および低Ｈｃｔ検体（２０％）の双方における５秒値のバイアスが小さく、中Ｈｃｔ検体（４２％）からのずれ量が小さい。この点からは、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べてＨｃｔの影響を受けにくいといえる。
【実施例２】
【００９０】
本実施例においては、実施例１と同様にして作成したグルコースセンサ(１)〜(３)を用いて、グルコース濃度が異なる５種類の検体（０ｍｇ／ｄＬ 、１１３ｍｇ／ｄＬ、２１２ｍｇ／ｄＬ、４３０ｍｇ／ｄＬ、５９８ ｍｇ／ｄＬ）について、実施例１と同様にして吸光度のタイムコースを測定した。その結果を図１８Ａ〜図１８Ｃに示した。
【００９１】
図１８Ａ〜図１８Ｃから分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて試薬部への酵素含有量（活性基準）が少ないにも拘らず、いずれのグルコース濃度の検体においても、吸光度の立ち上がりが大きい上に吸光度が一定値に漸近するまでの時間が短い。このことは同時に、グルコースセンサ(１)，(２)は、グルコースセンサ(３)に比べて、測定時間が短い場合（たとえば５秒以下）においても、吸光度とグルコース濃度との関係が高い直線性を示すことを意味している。すなわち、グルコースセンサ(１)，(２)では、測定レンジを広く確保しつつも、測定時間の短縮化を図ることができる。
【実施例３】
【００９２】
実施例２において得られたデータに基づいて、測定再現性を評価した。測定再現性は、各グルコースセンサ(１)〜(３)毎に、各グルコース濃度の検体について、測定開始から５秒後における吸光度のバラツキを計算することにより行った。計算結果については、下記表８〜表１０に示した。
【００９３】
【表８】
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
表８〜表１０から分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて、総合的にＣ．Ｖ．（％）が小さく、その値自体も小さいことから、測定再現性が優れていると言える。
【００９７】
実施例１〜３の結果を総合すれば、次のように結論付けることができる。すなわち、電子伝達物質を含んだ第１試薬部５１Ａ，５１Ｂと発色剤を含んだ第２試薬部５２Ａ，５２Ｂとを分離し、かつ第１試薬部５１Ａ，５１Ｂを第２試薬部５２Ａ，５２Ｂよりも上流側に配置した場合（グルコースセンサ(１)，(２)）には、第２試薬部５２Ｃを第１試薬部５１Ｃよりも上流側に配置した場合（グルコースセンサ(３)）に比べて、Ｈｃｔの影響を受けにくく、少ない酵素量によって、測定レンジを広く確保しつつ測定時間の短縮化を図ることができる。とくに、電子伝達物質を含んだ第１試薬部５１Ｂと酸化還元酵素を含んだ第３試薬部５３Ｂとを分離し、かつ第１試薬部５１Ｂを第３試薬部５３Ｂよりも上流側に配置した場合（グルコースセンサ(２)）には、電子伝達物質と酸化還元酵素とを混在させて第１試薬部５１Ａを構成する場合（グルコースセンサ(１)）に比べて、さらに測定時間の短縮化を図り、しかも測定安定性を向上させることができる。
【実施例４】
【００９８】
本実施例では、図１９に示した構成の本案グルコースセンサ、および図１５Ｂのグルコースセンサ(２)に相当する参照グルコースセンサについて測定再現性を検討した。
【００９９】
参照グルコースセンサについては、実施例１のグルコースセンサ(２)と同様な手法により作成した。一方、本案グルコースセンサは、参照グルコースセンサ（実施例１のグルコースセンサ(２)）を形成する場合において、第１試薬部５１Ｂ′は、第１試薬部５１Ｂを形成するときと同量かつ同組成の材料液を塗布した後に、この材料液を目的とする大きさに広げてから乾燥させて形成した点を除いて、参照グルコースセンサ（実施例１のグルコースセンサ(２)）と同様にして作成した。ここで、本案グルコースセンサにおける第１試薬部５１Ｂ′は、第３試薬部５３Ｂよりも長い３．５ｍｍの長さに、第３試薬部５３Ｂよりも厚みを小さく形成し、第３試薬部５３Ｂにおける導入口５０Ｂ側の縁から導入口５０Ｂまでの距離における８７．５％の長さ範囲を占めるものとして形成した。
【０１００】
測定再現性については、上述の本案グルコースセンサおよび参照グルコースセンサを用いて、Ｈｃｔが４２％である検体について、実施例１と同様にして吸光度のタイムコースを測定した結果、および測定開始から５秒後における吸光度のバラツキを計算することにより検討した。検体としては、グルコース濃度が異なる３種類（０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ）のものを使用した。タイムコースは、各グルコースセンサについて、０ｍｇ／ｄＬの検体において５回、１００ｍｇ／ｄＬおよび４００ｍｇ／ｄＬの検体において１０回測定した。
【０１０１】
吸光度のタイムコースを測定した結果は、本案グルコースセンサについては図２０Ａ〜図２０Ｃに、参照グルコースセンサについては図２１Ａ〜図２１Ｃにそれぞれ示した。５秒後の吸光度のバラツキの計算結果は、本案グルコースセンサについては表１１に、参照グルコースセンサについては表１２にそれぞれ示した。なお、図２０Ａ〜図２０Ｃおよび図２１Ａ〜図２１Ｃにおいては、波長６６０ｎｍで吸光度を測定した結果、波長９４０ｎｍで吸光度を測定した結果、および波長６６０ｎｍでの測定結果から波長９４０ｎｍでの測定結果を差分した結果をそれぞれ示し、表１１および表１２においては波長６６０ｎｍでの測定結果から波長９４０ｎｍでの測定結果を差分した結果についてのバラツキの計算結果を示した。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
【表１２】
【０１０４】
図２０Ａ〜図２０Ｃと、図２１Ａ〜図２１Ｃとを比較すれば分かるように、本案グルコースセンサのほうが参照グルコースセンサに比べて、吸光度のタイムコースにおけるバラツキが明らかに少ない。一方、表１１と表１２とを比較すれば分かるように、５秒値における吸光度のバラツキは、本案グルコースセンサのほうが参照グルコースセンサに比べて、低濃度域（１００ｍｇ／ｄＬ以下）におけるＣ．Ｖ．（％）が小さい。すなわち、本案グルコースセンサのほうが参照グルコースセンサに比べて、低濃度域（１００ｍｇ／ｄＬ以下）における測定再現性が優れていると言える。
【０１０５】
ここで、参照グルコースセンサは、実施例１〜３におけるグルコースセンサ(２)に相当するものであり、このグルコースセンサ(２)は、実施例１〜３におけるグルコースセンサ(１)，(３)に比べて測定再現性に優れるものである。すなわち、本案グルコースセンサにおいては、測定再現性に優れるグルコースセンサ(２)（参照グルコースセンサ）よりもさらに、低濃度における再現性が優れたものとなっている。
【０１０６】
この結果は、本案グルコースセンサにおいて、第１試薬部５１Ｂ′を薄く塗り広げることにより第１試薬部５１Ｂ′の溶解性が高められ、流路に導入された試料における電子伝達物質の濃度のバラツキが小さくなっているためであると考えられる。そのため、低濃度における再現性を改善するためには、電子伝達物質と酸化還元酵素とを分離しつつも、電子伝達物質については、その溶解性（試料に対する拡散性）を高めるために、第１試薬部５１Ｂ′を薄膜とし、あるいは他の試薬部５２Ｂ，５３Ｂやなどよりも試料の流れ方向に長い形態とするのが好ましいと言える。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料に含まれる分析対象成分を分析する技術、たとえば血液中のグルコース濃度を測定する技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
全血を試料とするグルコースセンサとしては、比色法あるいは電極法を採用したものがある(たとえば特許文献１，２参照)。いずれの方法を採用したグルコースセンサを用いる場合であっても、グルコースから取り出した電子を電子検出媒体(発色剤あるいは電極)に供給し、その電子供給量をグルコースセンサの外部から把握することにより、グルコース濃度を演算することができる。グルコースセンサは、通常、酸化還元酵素によってグルコースから電子を取り出し、その電子を、電子伝達物質を介して電子検出媒体に供給するように構成される。
【０００３】
全血を用いてグルコース濃度を測定する場合、測定結果が血球濃度(ヘマトクリット)の影響を受け、高ヘマトクリットの全血ほど、測定結果が真値よりも低値となることが知られている。この原因の１つとして、血清(血漿)中に存在するグルコースからの電子の取り出しに比べて、血球中に存在するグルコースからの電子の取り出しのほうに時間がかかることが指摘されている。すなわち、血清(血漿)中のグルコースからは、酸化還元酵素によって即座に電子を取り出すことができる。これに対して、血球中のグルコースからは、血清(血漿)にグルコースを移行させた後でないと、電子を取り出すことができない。しかも、血球内から血清(血漿)へのグルコースの移行は、血球内外でのグルコース濃度の差に起因する単純拡散ではなく、血球膜のグルコース透過能力に依存する促進拡散である。すなわち、血球外へのグルコースの拡散速度は、ミカエリスメンテン式にしたがうものであって、限界値を有しており、血球内外のグルコース濃度の差が一定値以上となれば、血球外へのグルコースの拡散速度は一定値となる。そのため、全血内において、酸化還元酵素、電子伝達物質および電子検出媒体が共存する系では、血清(血漿)内でのグルコースから取り出された電子が即座に電子検出媒体に供給されるものの、その供給量に対応したグルコースを血球外に拡散させるには時間がかかる。その結果、もともと血球内に存在していたグルコースから取り出される電子は、もともと血清(血漿)内に存在していたグルコースに比べて、電子検出媒体に対して遅れて供給される。このような遅れは、血球濃度の高い全血において大きく現れる。したがって、血糖値が同じ全血であっても、試料の供給から一定時間経過後の段階では、血球濃度の高い全血では、血球濃度の低い全血に比べて、血球から血清(血漿)へのグルコースの移行割合が少ないという現象が起こりうる。
【０００４】
近年においては、測定時間が短縮化の傾向にあり、そのために新たな酸化還元酵素および電子伝達物質が模索されている。このような状況下においては、血清(血漿)中に存在するグルコースは、より短時間で消費される。これに対して、血球内から血清(血漿)へのグルコースの拡散は、血球膜のグルコース透過能力に依存するものであるため、血球からのグルコースの移行速度については大きな変化はない。したがって、高ヘマトクリットの全血では、測定時間を短縮化すればするほど、当該測定時間内において血球内から血清(血漿)に移行させることができるグルコースの割合が少なくなり、低値化の問題がより顕著に現れる。
【０００５】
また、酸化還元酵素および電子伝達物質は、たとえば血液に溶解する固相の試薬部としてグルコースセンサにおいて保持される（たとえば特許文献３参照）。そのため、測定時間を短縮化する場合には、試薬部の溶解性が測定精度に与える影響が大きくなる。すなわち、試薬部の溶解性が悪ければ、血液によって試薬部を溶解させたときに生じる液相反応系において、酸化還元酵素や電子伝達物質が均一に分散せず、測定結果にバラツキを生じさせる。このような測定結果のバラツキは、血液中のグルコース濃度が小さい場合により顕著に現れる。
【０００６】
【特許文献１】特開２００２−１７５６９９号公報
【特許文献２】特公平８−１０２０８号公報
【特許文献３】特開２００４−１０１５１９号公報
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、血球を含んだ試料の分析を行う場合（たとえば血液中のグルコース濃度を測定する場合）に、血球濃度の影響を抑制し、とくに高血球濃度の試料における低値化を抑制することを目的としている。
【０００８】
本発明はさらに、測定時間を短縮化する場合に生じる測定結果のバラツキを抑制し、とくに低濃度域での測定再現性を向上させることを目的としている。
【０００９】
本発明の第１の側面においては、血球を含んだ試料（たとえば血液）を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、上記流路の内部に配置された試薬部と、試料中の対象成分（たとえばグルコース）の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るための電子検出媒体と、を備えた分析用具であって、上記試薬部は、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含んでおり、かつ少なくとも一部が上記導入口の近傍に配置されている、試薬部の配置を改良した分析用具が提供される。
【００１０】
試薬部は、たとえば電子検出媒体とは分離された状態で、電子検出媒体よりも試料の流れ方向における上流側に配置される。この場合の試薬部は、流路に試料を供給したときに溶解する固体状に形成するのが好ましい。
【００１１】
試薬部と電子検出媒体との間の距離は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が試料に含まれる場合において、上記上限量の分析対象成分から電子伝達物質への電子移動が、電子伝達物質が電子検出媒体に対して電子を供給しうる状態となるまでの間に、実質的に完了する長さに設定するのが好ましい。
【００１２】
試薬部における電子伝達物質の含有量は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が試料に含まれる場合において、上記上限量のグルコースから取り出せる全ての電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量に設定するのが好ましい。
【００１３】
電子検出媒体は、発色剤を含んだものとして構成することができる。この場合、電子検出媒体は、試料に対して難溶性の多孔質体に、発色剤を保持させた構成とするのが好ましい。多孔質体としては、典型的には、ポリアクリルアミドあるいはポリビニルアルコールなどのゲル状物を挙げることができる。一方、発色剤としては、たとえばＭＴＴ(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)、ＩＮＴ（2-(4-lodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazolium chloride) 、ＷＳＴ−４(2-(4- lodophenyl) -3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4- disulfophenyl)-2H-tetrazolium,monosodium salt)、および４ＡＡ(4-Aminoantipyrine)が挙げられる。
【００１４】
電子検出媒体は、導体として構成することもできる。導体としては、たとえば流路に試料が供給されたときに、電子伝達物質に電圧を印加するために利用されるものが挙げられる。
【００１５】
試薬部は、たとえば試料中の分析対象成分から電子を取り出して電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含んだものとして構成される。酸化還元酵素は、試薬部とは分離した追加の試薬部として分析用具に保持させてもよい。この場合、追加の試薬部は、流路の内部における試料の流れ方向において、試薬部と電子検出媒体との間に配置するのが好ましい。追加の試薬部は、たとえば流路に試料を供給したときに溶解する固体状に形成される。
【００１６】
本発明の第２の側面においては、血球を含んだ試料を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るためのものであり、かつ試料に対して難溶性の多孔質体に発色剤を保持させた構成の電子検出媒体と、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された電子伝達物質層と、試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された酸化還元酵素層と、を備えた分析用具であって、上記流路において、上記電子伝達物質層、上記酸化還元酵素層および上記電子検出媒体がこの順序で、試料の流れ方向の上流側から順番に並んで配置されている、分析用具が提供される。
【００１７】
試薬部（電子伝達物質層）は、たとえば追加の試薬部（酸化還元酵素層）よりも、平面視面積が大きく、試料の流れ方向の長さが大きく、あるいは厚みが小さく（たとえば酸化還元酵素層の厚みの１５〜８０％）とされる。試薬部（電子伝達物質層）は、追加の試薬部（酸化還元酵素層）における導入口側の縁から導入口までの距離における５０〜９０％の長さ範囲を占めるように形成してもよい。試薬部（電子伝達物質層）はまた、流路における電子検出媒体の平面視面積の１．５〜１０倍の平面視面積を有するものとすることもできる。
【００１８】
本発明における電子伝達物質としては、Ｒｕ錯体を用いるのが好ましい。Ｒｕ錯体としては、[Ｒｕ(ＮＨ3)5Ｘ]n+として表現されるものを使用するのが好ましい。ここで、上記化学式において、Ｘは、たとえばＮＨ3、ハロゲンイオン、ＣＮ、ピリジン、ニコチンアミド、あるいはＨ2Ｏであり、ｎ＋は、Ｘの種類により決定される酸化型Ｒｕ(III)錯体の価数である。
【００１９】
本発明における酸化還元酵素としては、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を使用することができる。ＧＤＨとしては、ＰＱＱＧＤＨ、αＧＤＨ、あるいはＣｙＧＤＨを用いるのが好ましい。
【００２０】
ここで、ＰＱＱＧＤＨとは、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を補酵素とするものである。一方、αＧＤＨ およびＣｙＧＤＨは、国際公開第ＷＯ０２／３６７７９号パンフレットに開示されているものをさしている。すなわち、αＧＤＨおよびＣｙＧＤＨは、ブルクホルデリア属に属する微生物に由来のグルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）をさしており、形質転換体に産出させたものも含まれる。
【００２１】
より具体的には、αＧＤＨは、ＦＡＤを補欠因子としてもち、かつグルコース脱水素活性を有するサブユニットとして、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約６０ｋＤａであるＧＤＨ活性タンパク質(αサブユニット)を含んだものである。一方、ＣｙＧＤＨは、αサブユニットと、還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における分子量が約４３ｋＤａである電子伝達タンパク質(チトクロムＣ)と、をサブユニットとして含むものである。αＧＤＨやＣｙＧＤＨとしては、αサブユニットやチトクロムＣ以外のサブユニットをさらに有するものを使用することもできる。
【００２２】
ＣｙＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物が菌体外に分泌した酵素を精製し、あるいは当該菌体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。一方、αＧＤＨは、たとえばブルクホルデリア・セパシアに属する微生物から採取したαＧＤＨをコードする遺伝子が移入された形質転換体を形成し、この形質転換体から外部に分泌された酵素を精製し、あるいは当該形質転換体の菌体内酵素を精製することにより得ることができる。
【００２３】
ブルクホルデリア・セパシアに属する微生物としては、たとえばブルクホルデリア・セパシアＫＳ１株を使用することができる。このＫＳ１株は、平成１２年９月２５日に独立特許法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６)に微生物受託番号第ＦＥＲＭ ＢＰ−７３０６として寄託されている。
【００２４】
本発明のグルコースセンサは、流路において毛細管力が生じるように構成することもできる。
【００２５】
本発明の第３の側面においては、血球を含んだ試料が移動した状態において、上記試料に含まれる分析対象成分から取り出した電子を電子伝達物質に供給し、上記試料に含まれる全ての分析対象成分から上記電子伝達物質への電子移動を、実質的に完了する過程と、上記試料の移動が停止した状態において、上記電子伝達物質と電子検出媒体との間の電子授受反応を行う過程と、上記電子検出媒体を介して得られる情報に基づいて、分析対象成分の分析に必要な演算を行う過程と、を含んでいる、分析方法が提供される。
【００２６】
電子検出媒体は、本発明の第１の側面と同様に、たとえば発色剤を含んだものとして、あるいは導体として構成される。
【００２７】
ここで、本発明において血球を含んだ試料とは、少なくとも全血、および全血の希釈液などの調整液を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図２】図１のII−II線に沿う断面図である。
【図３】図１に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図４】図１に示したグルコースセンサの作用を説明するための図２に相当する断面図である。
【図５】本発明の第２の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図６】図５のVI−VI線に沿う断面図である。
【図７】図５に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図８】本発明の第３の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図９】図８のIX−IX線に沿う断面図である。
【図１０】図８に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図１１】本発明の第４の実施の形態に係るグルコースセンサの全体斜視図である。
【図１２】図１１のＸII−ＸII線に沿う断面図である。
【図１３】図１１に示したグルコースセンサの分解斜視図である。
【図１４】実施例１〜３において使用したグルコースセンサの基本構成を説明するための斜視図である。
【図１５】実施例１１〜３において使用したグルコースセンサの試薬部の構成を説明するための透明カバーを省略して示した平面図である。
【図１６Ａ】実施例１において、グルコースセンサ(１)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１６Ｂ】実施例１において、グルコースセンサ(２)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１６Ｃ】実施例１において、グルコースセンサ(３)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１７】Ｈｃｔが４２％のときを基準とした場合のバイアスとして、Ｈｃｔの影響を示したグラフである。
【図１８Ａ】実施例２において、グルコースセンサ(１)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１８Ｂ】実施例２において、グルコースセンサ(２)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１８Ｃ】実施例２において、グルコースセンサ(３)を使用して吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図１９】実施例４において使用した本案グルコースセンサの試薬部の構成を説明するための透明カバーを省略して示した平面図である。
【図２０Ａ】実施例４において、本案グルコースセンサを使用して波長６６０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２０Ｂ】実施例４において、本案グルコースセンサを使用して波長９４０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２０Ｃ】実施例４において本案グルコースセンサを使用したときに、波長６６０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果から波長９４０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果を差分として表したタイムコースである。
【図２１Ａ】実施例４において、参照グルコースセンサを使用して波長６６０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２１Ｂ】実施例４において、参照グルコースセンサを使用して波長９４０ｎｍで吸光度のタイムコースを測定した結果を示すグラフである。
【図２１Ｃ】実施例４において参照グルコースセンサを使用したときに、波長６６０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果から波長９４０ｎｍにおいて吸光度を測定したときの結果を差分として表したタイムコースである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の第１〜第４の実施の形態について図面を参照しつつ説明する。
【００３０】
まず、本発明の第１の実施の形態について、図１〜図３を参照しつつ説明する。
【００３１】
図１〜図３に示したグルコースセンサ１は、使い捨てとして構成されたものであり、比色により血液中のグルコース濃度を測定するように構成されたものである。このグルコースセンサ１は、長矩形の基板２に対して、スペーサ３を介してカバー４を接合した形態を有しており、各要素２〜４により、基板２の長手方向に延びるキャピラリ５が規定されている。キャピラリ５は、毛細管力により血液を移動させるとともに、反応場を提供するためのものである。このキャピラリ５は、開口５０を介して外部と連通している。開口５０は、キャピラリ５の内部に血液を導入するためのものである。
【００３２】
基板２は、ＰＥＴ、ＰＭＭＡ、ビニロンなどにより透明に形成されている。基板２には、キャピラリ５の内部に収容された状態で第１および第２試薬部５１，５２が設けられている。
【００３３】
第１試薬部５１は、第２試薬部５２よりも血液の流れ方向の上流に位置するように、開口５０の近傍に設けられている。この第１試薬部５１は、たとえば酸化還元酵素および電子伝達物質を含んでおり、血液に対して溶解しやすい固体状に形成されている。このため、キャピラリ５に血液を導入した場合には、キャピラリ５の内部には、グルコース、酸化還元酵素および電子伝達物質を含む液相反応系が構築される。
【００３４】
酸化還元酵素としては、たとえばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いることができ、典型的にはＰＱＱＧＤＨ、αＧＤＨあるいはＣｙＧＤＨが使用される。
【００３５】
電子伝達物質としては、たとえば Ｒｕ錯体やＯｓ錯体などの金属錯体を用いることができる。Ｒｕ錯体としては、[Ｒｕ(ＮＨ3)6]Ｃｌ3を用いるのが好ましい。電子伝達物質としては、ＰＭＳ（5-methylphenazinium methylsulfate）の他、チトクロムやＮＡＤ-1を使用することもできる。ここで、電子伝達物質の含有量は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、上限量のグルコースから取り出せる全ての電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量として設定されている。たとえば、測定範囲の上限量が６００ｍｇ／ｄＬ(３３ｍＭ)であり、グルコースと電子伝達物質が化学量論的に１：２の割合で反応する場合には、電子伝達物質の含有量は、キャピラリ５が血液によって満たされたときの濃度が６６ｍＭ以上となるように設定される。
【００３６】
第２試薬部５２は、発色剤を含んでおり、血液に対して難溶性の固層として形成されている。この第２試薬部５２は、たとえば基板２に対して固定されたゲル状担体に対して、発色剤を担持させた構成とされている。この構成では、発色剤を血液に分散させることなく、第２試薬部52の内部に電子伝達物質を拡散させ、第２試薬部５２において、発色剤に対して電子伝達物質からの電子を供給することができる。
【００３７】
ゲル状担体としては、ポリアクリルアミドあるいはポリビニルアルコールを使用することができる。一方、発色剤としては、公知の種々のものを用いることができるが、電子を受け取って発色したときの吸収波長が、血液の吸収波長からずれたものを用いるのが好ましい。発色剤としては、たとえばＭＴＴ、ＩＮＴ、ＷＳＴ−４、および４ＡＡを用いることができる。
【００３８】
ここで、第１試薬部５１と第２試薬部５２との中心間距離Ｄ１は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が第２試薬部５２に到達するまで（電子伝達物質が発色剤に電子を供給することが可能となるまで）の間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了する長さに設定されている。この中心間距離Ｄ１は、酸化還元酵素がグルコースから電子を取り出す速度（触媒能力）、電子伝達物質がグルコースから電子を受け取る速度（電子伝達速度）、およびキャピラリ５における血液の移動速度などに応じて適宜設定される。たとえば、キャピラリ５を血液により満たすのに要する時間が２秒であり、酸化還元酵素としてＰＱＱＧＤＨを用い、電子伝達物質として[Ｒｕ(ＮＨ3)6]Ｃｌ3を用いる場合には、中心間距離Ｄ１は、たとえば０．５〜１．０ｍｍの範囲に設定される。
【００３９】
スペーサ３は、基板２とカバー４の間の距離、すなわちキャピラリ５の高さ寸法を規定するためのものである。このスペーサ３は、キャピラリ５の幅寸法を規定するためのスリット３０を有している。
【００４０】
カバー４は、全体が透明に形成されている。このカバー４は、基板２と同様な材料により形成することができる。カバー４には、貫通孔４０が形成されている。貫通孔４０は、キャピラリ５の内部の気体を外部に排出するためのものであり、キャピラリ５の内部に連通している。
【００４１】
グルコースセンサ１では、開口５０を介してキャピラリ５に血液を供給した場合には、図４Ａ〜図４Ｃに示したように、キャピラリ５において生じる毛細管力により、血液がキャピラリ５の内部を進行する。血液の進行過程においては、図４Ａおよび図４Ｂに示したように、血液により第１試薬部５１が溶解させられる。これにより、第１試薬部５１に含まれる酸化還元酵素および電子伝達物質が血液中に分散し、これらが血液とともに貫通孔４０ひいては第２試薬部５２に向けて移動する。このとき、酸化還元酵素によって血清（血漿）のグルコースから電子が取り出され、グルコースがグルコノラクトンとされ、血清（血漿）におけるグルコース濃度が減少する。グルコースから取り出された電子は、酸化還元酵素の作用によって電子伝達物質に供給される。一方、血清（血漿）におけるグルコース濃度の減少に伴い、血球中のグルコースが血清（血漿）中に移行する。血球外に移行したグルコースからは、先に説明したのと同様にして電子が取り出され、電子伝達物質に供給される。
【００４２】
図４Ｃに示したように、血液の進行は、血液が貫通孔４０に到達したときに停止する。このとき、血液が第２試薬部５２に浸透する。キャピラリ５においては、血液とともに電子伝達物質も移動させられるため、第２試薬部５２への血液の浸透に伴い、第２試薬部５２の内部に電子伝達物質が拡散する。このため、第２試薬部５２においては、発色剤に対して電子伝達物質から電子が供給されて発色剤が発色し、第２試薬部５２が着色される。第２試薬部５２の着色の程度は、血液の供給開始から一定時間経過後において、たとえば第２試薬部５２に対してカバー４を介して光を照射し、そのときに第２試薬部５２および基板２を透過した光、あるいは反射した光を受光することにより把握される。照射光の波長は、発色剤の発現色における吸収の大きな波長の光のものが採用される。最終的なグルコース濃度は、たとえば照射光の強度と、透過光の強度と、の比に基づいて演算される。
【００４３】
グルコースセンサ１では、第１試薬部５１が第２試薬部５２に比べて、血液の流れ方向の上流側に設けられている。そのため、キャピラリ５に対する血液の導入と同時に電子伝達物質をグルコースと反応させることができる。しかも、第１試薬部５１を開口５０の近傍に配置することにより、血液が第２試薬部５２に到達するまでの間において、電子伝達物質とグルコースとを反応させるための時間を長く確保することができる。その結果、電子伝達物質が第２試薬部５２に到達する前（電子伝達物質が発色剤と反応する前）に電子伝達物質を積極的にグルコースと反応させることができる。とくに、グルコースセンサ１では、電子伝達物質の含有量が、測定濃度範囲の上限量のグルコースの全てから電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量として設定され、中心間距離Ｄ１が、血液が第２試薬部５２に到達するまでの間に、グルコースの全てから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了するように設定されている。したがって、グルコースセンサ１では、電子伝達物質が発色剤と反応を開始するまでの間に、血球中のグルコースを確実に血清（血漿）中に移行させることができる。その結果、血液における血球濃度の影響を抑制し、精度良くグルコース濃度を測定できるようになる。
【００４４】
次に、本発明の第２の実施の形態に係るグルコースセンサについて、図５〜図７を参照して説明する。ただし、図５〜図７においては、先に説明したグルコースセンサ１（図１ないし図３参照）と同様な要素については同一の符号を付してあり、重複説明は省略する。
【００４５】
図５〜図７に示したグルコースセンサ１′は、第１ないし第３試薬部５１′，５２′，５３′を備えている点において、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）とは異なっている。
【００４６】
第１試薬部５１′は、電子伝達物質を含んだものであり、キャピラリ５に試料が供給されたときに溶解するように構成されている。この第１試薬部５１′は、開口５０の近傍に設けられている。第１試薬部５１′に含ませる電子伝達物質としては、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様なものを例示することができる。
【００４７】
第２試薬部５２′は、先に説明したグルコースセンサ１の第２試薬部５２（図１〜図３参照）と同様な構成とされている。すなわち、第２試薬部５２′は、たとえば電子検出媒体である発色剤を、血液に対して難溶性のゲル状担体に担持させた構成とされている。
【００４８】
第３試薬部５３′は、酸化還元酵素を含んだものであり、キャピラリ５に試料が供給されたときに溶解するように構成されている。この第３試薬部５３′は、第１試薬部５１′と第２試薬部５２′との間に設けられている。第３試薬部５３′に含ませる酸化還元酵素としては、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様なものを例示することができる。
【００４９】
ここで、第１試薬部５１′と第２試薬部５２′との中心間距離Ｄ１は、グルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様に設定されている。すなわち、中心間距離Ｄ１は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が第２試薬部５２′に到達するまで（電子伝達物質が発色剤に電子を供給することが可能となるまで）の間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了する長さに設定されている。一方、第１試薬部５１′と第３試薬部５３′との中心間距離Ｄ２は、第１試薬部５１′に含まれる電子伝達物質の存在によって血球中から血球外に取り出し可能なグルコースの最大量の殆ど全ての量のグルコースを取り出せる距離に設定される。第２試薬部５２′と第３試薬部５３′との中心間距離Ｄ３は、第３試薬部５３′が十分に溶解し、酸化還元酵素を血液中に十分に分散させることができる距離に設定される。
【００５０】
このようなグルコースセンサ１′においては、キャピラリ５に血液が供給されたときに、まず第１試薬部５１′が溶解して血液中に電子伝達物質が分散する。このとき、血球の周りに無機物たる電子伝達物質が存在しているために、血球中から血球外へのグルコースの拡散が促進される。次いで、血液が第３試薬部５３′に到達したときに第３試薬部５３′が溶解して血液中に酸化還元酵素が分散する。このとき、酸化還元酵素の作用によって、血清中のグルコースと電子伝達物質の反応が促進される。最終的には、血液が第２試薬部５２′に到達した場合には、酸化還元酵素の作用によって、電子伝達物質から発色剤に電子が供給され、発色剤が発色する。
【００５１】
グルコースセンサ１′では、血清中のグルコースを電子伝達物質に供給する前に、血球中のグルコースを積極的に取り出すようにしている。すなわち、電子伝達物質に酸化還元酵素を作用させる前に、血清中にグルコース濃度が高くされており、電子伝達物質に酸化還元酵素を作用させた後における血球中からのグルコースの拡散が少なくなるようになされている。その結果、後述の実施例からも明らかとなるが、電子伝達物質と発色剤との間の反応初期速度が大きくなり、測定時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００５２】
次に、本発明の第３の実施の形態に係るグルコースセンサについて、図８〜図１０を参照して説明する。ただし、図８〜図１０においては、先に説明したグルコースセンサ１，１′(図１〜図３、あるいは図５〜図７参照)と同様な要素については同一の符号を付してあり、重複説明は省略する。
【００５３】
図８〜図１０に示したグルコースセンサ１″は、第１〜第３試薬部５１″，５２″，５３″を備えている点において、第１の実施の形態に係るグルコースセンサ１(図１〜図３参照)とは異なっている一方で、第２の実施の形態に係るグルコースセンサ１′(図５〜図７参照)と同様な構成とされている。また、グルコースセンサ１″は、第１試薬部５１″の構成が第２の実施の形態に係るグルコースセンサ１′(図５〜図７参照)とは異なっている。
【００５４】
第１試薬部５１″は、先に説明したグルコースセンサ１，１′と同様な電子伝達物質を含んだものであり、キャピラリ５に試料が供給されたときに溶解するように構成されている。この第１試薬部５１″は、開口５０と第３試薬部５３″との間において塗り広げられている。
【００５５】
第１試薬部５１″は、第２試薬部５２″および第３試薬部５３″よりも、平面視面積、およびキャピリラリ５における血液の流れ方向の長さが大きい長矩形状に形成されている。より具体的には、第１試薬部５１″は、開口５０から第３試薬部５３″における開口５０側の縁までの間において、その占有長さが５０〜９０％とされ、その厚みが、たとえば第３試薬部５３″の厚みの１５〜８０％とされる。これらの数値範囲は、第１試薬部５１″の溶解性を十分に改善することができ、かつ、製造上の限界を考慮したものである。第１試薬部５１″は、第２試薬部５３″を基準とした場合には、その平面視面積が第２試薬部５３″の１．５〜１０倍とされる。
【００５６】
第１試薬部５１″と第２試薬部５２″中心間距離Ｄ１は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が第２試薬部５２″に到達するまで（電子伝達物質が発色剤に電子を供給することが可能となるまで）の間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了する長さに設定されている。一方、第１試薬部５１″と第３試薬部５３″との中心間距離Ｄ２は、第１試薬部５１″に含まれる電子伝達物質の存在によって血球中から血球外に取り出し可能なグルコースの最大量の殆ど全ての量のグルコースを取り出せる距離に設定される。第２試薬部５２″と第３試薬部５３″との中心間距離Ｄ３は、第３試薬部５３″が十分に溶解し、酸化還元酵素を血液中に十分に分散させることができる距離に設定される。
【００５７】
このようなグルコースセンサ１″においては、第１試薬部５１″が薄く塗り広げられたものとなっているため、キャピラリ５に血液が供給されたときに、第１試薬部５１″の溶解性が高く、血液中に電子伝達物質が良好に分散する。そのため、キャピラリ５に血液が供給されたときに形成される血液と電子伝達物質の混合系においては、電子伝達物質の濃度のバラツキが小さくなる。その結果、測定後の反応速度のバラツキを抑制できるようになり、電子伝達物質の濃度のバラツキの影響を受けやすい低濃度域での測定再現性が向上する。また、グルコースセンサ１″では、グルコースセンサ１′と同様に、血清中のグルコースを電子伝達物質に供給する前に、血球中のグルコースをより積極的に取り出すようにしているために、電子伝達物質と発色剤との間の反応初期速度が大きくなって、測定時間の短縮化を図ることが可能となる。
【００５８】
次に、本発明の第４の実施の形態に係るグルコースセンサについて、図１１〜図１３を参照して説明する。
【００５９】
図１１〜図１３に示したグルコースセンサ６は、使い捨てとして構成されたものであり、電極法によりグルコース濃度を測定できるように構成されたものである。このグルコースセンサ６は、先に説明したグルコースセンサ１(図１〜図３参照)と同様に、基板７に対して、スペーサ８を介してカバー９を積層した形態を有しており、各要素７〜９により規定されたキャピラリ６０を有している。
【００６０】
スペーサ８およびカバー９は、先に説明したグルコースセンサ１のスペーサ３およびカバー４（図１〜図３参照）と同様な構成とされている。すなわち、スペーサ８は、キャピラリ６０の幅寸法を規定するスリット８０を有しており、カバー９はキャピラリ６０の内部に連通する貫通孔９０を有している。ただし、カバー９は必ずしも透明に形成する必要はない。
【００６１】
基板７の上面７０には、作用極７１、対極７２および試薬部７３が形成されている。作用極７１および対極７２は、端部７１ａ，７２ａが基板７の短手方向に延びている。端部７１ａ，７２ａは、貫通孔９０に比較的に近い部位において基板７の長手方向に並んで設けられており、それらの一部がキャピラリ６０の内部において臨んでいる。一方、作用極71および対極72の端部７１ｂ，７２ｂは、キャピラリ６０の外部において露出している。これらの端部７１ｂ，７２ｂは、端部７１ａ，７２ａの間に電位差を生じさせる際に、プローブなどの端子を接触させるための部分である。
【００６２】
試薬部７３は、キャピラリ６０の内部において開口６１の近傍に設けられている。すなわち、試薬部７３は、作用極７１および対極７２の端部７１ａ，７２ａとは分離された状態において、キャピラリ６０における試料の流れ方向の上流に設けられている。この試薬部７３は、たとえば電子伝達物質および酸化還元酵素を含む固体状に形成されている。この試薬部７３は、血液に対して容易に溶解するものとして形成されている。酸化還元酵素および電子伝達物質としては、グルコースセンサ１の第１試薬部５１（図１〜図３参照）における酸化還元酵素および電子伝達物質と同様なものを使用することができる。
【００６３】
ここで、試薬部７３における電子伝達物質の含有量は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、上限量のグルコースから取り出せる全ての電子を、電子伝達物質において受け取ることができる量として設定されている。また、試薬部７３と作用極７１の端部７１ａとの中心間距離Ｄ４は、予め設定した測定濃度範囲の上限量のグルコースが血液に含まれる場合において、血液が作用極７１の端部７１ａに到達するまでの間に、上限量のグルコースから電子伝達物質への電子移動が実質的に完了するように設定されている。
【００６４】
グルコースセンサ６においても、開口６１を介してキャピラリ６０に血液を供給した場合には、キャピラリ６０において生じる毛細管力により、血液がキャピラリ６０の内部を進行する。血液の進行過程においては、血液により試薬部７３が溶解させられる。このとき、酸化還元酵素によって血清（血漿）のグルコースから電子が取り出される一方、グルコースから取り出された電子は、酸化還元酵素の作用によって電子伝達物質に供給される。血球内のグルコースは、血液におけるグルコースの消費に伴って血清（血漿）中に移行し、移行したグルコースからは、先に説明したのと同様にして電子が取り出されて電子伝達物質に供給される。血液の進行は、血液が貫通孔９０に到達したときに停止する。このとき、電子伝達物質が作用極７１の端部７１ａの表面に存在する。作用極７１の端部７１ａに対しては、作用極７１と対極７２の間に電圧を印加することにより、電子伝達物質から電子が供給される。最終的なグルコース濃度は、作用極７１の端部７１ａに対して電子伝達物質から供給された電子の量に基づいて演算される。
【００６５】
グルコースセンサ６では、試薬部７３が作用極７１の端部７１ａに比べて、血液の流れ方向の上流側に設けられ、かつ開口５０の近傍に配置されている。そのため、電子伝達物質が作用極７１の端部７１ａに到達する前に、電子伝達物質を積極的にグルコースと反応させることができる。したがって、グルコースセンサ６では、先に説明したグルコースセンサ１（図１〜図３参照）と同様に、全血中における血球濃度の影響を抑制し、精度良くグルコース濃度を測定できるようになる。
【００６６】
グルコースセンサ６においては、試薬部７３が電子伝達物質および酸化還元酵素を含んでいたが、先に説明したグルコースセンサ１′，１″（図８〜図１０、あるいは図１１〜図１３参照）と同様に、電子伝達物質を含む試薬部と、酸化還元酵素を含む試薬部に分離して形成してもよい。
【００６７】
本発明は、試料として血液以外のもの、たとえば血液の希釈液を使用するように構成されたグルコースセンサにも適用することができる。本発明はさらに、グルコース以外の成分、たとえばコレステロールや乳酸を分析するように構成された分析用具に適用することもできる。
【実施例１】
【００６８】
本実施例においては、比色用のグルコースセンサを用いた血糖値の測定において、血液における血球濃度（ヘマトクリット値（Ｈｃｔ））が測定結果に与える影響を検討した。グルコースセンサとしては、以下に説明するグルコースセンサ(１)〜(３)を用いた。Ｈｃｔ値が測定結果に与える影響は、吸光度のタイムコースおよび特定時間経過後におけるバイアスに基づいて検討した。
【００６９】
(グルコースセンサの基本構成)
グルコースセンサ(１)〜(３)の基本構成（試薬部を除く）は図１４に示した通りである。すなわち、各グルコースセンサ(１)〜(３)は、透明基板２Ａに対してスペーサ３Ａを介して透明カバー４Ａを積層した形態を有するとともに、各要素２Ａ〜４Ａによってキャピラリ５Ａが規定されたものとされている。キャピラリ５Ａの寸法は、図１４に記入したように、１．３ｍｍ×９ｍｍ×５０μｍである。透明基板２Ａおよび透明カバー４Ａは、厚みが２５０μｍであるＰＥＴにより形成し、スペーサ３Ａは両面テープにより構成した。
【００７０】
(試薬部の構成および形成方法)
各グルコースセンサ(１)〜(３)においては、発色剤を含んだ試薬部を、電子伝達物質および酸化還元酵素のうちの少なくとも一方を含む試薬部に対して、キャピラリの流れ方向に分離して設けた。
【００７１】
グルコースセンサ(１)（本案）では、図１５Ａに示したように電子伝達物質および酸化還元酵素を含む第１試薬部５１Ａをキャピラリ５Ａの上流側に、発色剤を含む第２試薬部５２Ａをキャピラリ５Ａにおける下流側に設けた。第１試薬部５１Ａは、その中心が試料導入口５０Ａから３ｍｍの距離のところに位置し、かつ血液に対して溶解するように形成した。第２試薬部５２Ａは、その中心が貫通孔４０Ａの最上流点４０Ａａから１ｍｍの距離のところに位置するとともに、透明基板２Ａに対して固定化され、かつ血液に対して難溶なゲル状担体に発色剤を保持させた構成に形成した。第１試薬部５１Ａと第２試薬部５２Ａとの中心間距離は、５ｍｍに設定した。
【００７２】
第１および第２試薬部５１Ａ，５２Ａは、目的とする材料液を目的部位に塗布した後、材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）させることにより形成した。なお、第１および第２試薬部５１Ａ，５２Ａを形成する場合の材料液の組成および材料液の塗布量については、下記表１および表２に示した通りである。
【００７３】
【表１】
【００７４】
【表２】
【００７５】
グルコースセンサ(２)（本案）は、図１５Ｂに示したように、グルコースセンサ(１)（図１５Ａ参照）において第１試薬部５１Ｂが酸化還元酵素を含まないものとする代わりに、第１試薬部５１Ｂと第２試薬部５２Ｂとの間に、酸化還元酵素を含む第３試薬部５３Ｂを形成したものとした。この第３試薬部５３Ｂは、その中心が、第１試薬部５１Ｂの中心と第２試薬部５２Ｂの中心との中間に位置するように形成した。
【００７６】
第１〜第３試薬部５１Ｂ，５２Ｂ，５３Ｂは、目的とする材料液を目的部位に塗布した後、材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）させることにより形成した。なお、第１〜第３試薬部５１Ｂ，５２Ｂ，５３Ｂを形成する場合の材料液の組成および材料液の塗布量については、下記表３〜表５に示した通りである。
【００７７】
【表３】
【００７８】
【表４】
【００７９】
【表５】
【００８０】
グルコースセンサ(３)（比較）は、図１５Ｃに示したように、グルコースセンサ(１)（図１５Ａ参照）において、発色剤を含む試薬部の位置と、電子伝達物質および酸化還元酵素を含む試薬部の位置とを入れ替えた構成とした。すなわち、第１試薬部５１Ｃは、グルコースセンサ(１)における第２試薬部５２Ａに対応する部位（下流側）において、血液に対して難溶なゲル状担体に電子伝達物質および酸化還元酵素を保持させた状態で透明基板２Ａに対して固定化した。一方、第２試薬部５２Ｃは、グルコースセンサ(１)における第１試薬部５１Ａに対応する部位（上流側）において、血液に対して溶解するように形成した。
【００８１】
第１および第２試薬部５１Ｃ，５２Ｃは、目的とする材料液を目的部位に塗布した後、材料液を送風乾燥（３０℃、１０％Ｒｈ）させることにより形成した。なお、第１および第２試薬部５１Ｃ，５２Ｃを形成する場合の材料液の組成および材料液の塗布量については、下記表６および表７に示した通りである。
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】
【００８４】
表１〜表７において、ＣＨＡＰＳは3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio] propanesulfonic acidの略号であり、ＡＣＥＳはN-(2-acetamido)-2-aminoethanesulfonic acidの略号であり、ＭＴＴは3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromideの略
号である。ＣＨＡＰＳとしては同仁化学研究所（日本国）製「ＫＣ０６２」を、ＡＣＥＳとしては同仁化学研究所（日本国）製「ＥＤ０６７」を、ＭＴＴとしては同仁化学研究所（日本国）製「Ｍ００９」を、ＰＱＱＧＤＨとしては同仁化学研究所（日本国）製のものを、[Ｒｕ(ＮＨ3)6]Ｃｌ3としては同仁化学研究所（日本国）製「ＬＭ７２２」を、スクロースモノラウレートとしては同仁化学研究所（日本国）製「ＰＶ６８９」を、ポリアクリルアミドとしてはナカライテスク（日本国）製「Ｚ２Ｔ８０７１」を使用した。
【００８５】
(吸光度のタイムコース測定)
吸光度タイムコースは、キャピラリに検体を供給した時点から０．１秒毎に吸光度を繰り返し測定して作成した。各回の吸光度の測定においては、グルコースセンサ(１)，(２)については第２試薬部５２Ａ，５２Ｂに対して、グルコースセンサ(３)については第１試薬部５１Ｃに対して、それぞれキャピラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにグルコースセンサ(１)〜(３)を透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて、６３０ｎｍの光を照射することにより行った。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。吸光度は、下記数式１により算出した。
【００８６】
【数１】
【００８７】
吸光度のタイムコースは、各グルコースセンサ(１)〜(３)において、ヘマトクリット値の異なる３種類の検体（Ｈｃｔ＝２０％、４２％、６０％）について５回ずつ測定した。検体におけるグルコース濃度は、４３０ｍｇ／ｄＬに調整した。吸光度のタイムコースについては、グルコースセンサ(１)については図１６Ａに、グルコースセンサ(２)については図１６Ｂに、グルコースセンサ(３)については図１６Ｃにそれぞれ示した。一方、バイアスの演算結果については、図１７に示した。図１７においては、バイアスは測定開始から５秒経過後の吸光度に基づいて、各グルコースセンサ(１)〜(３)毎および各Ｈｃｔの検体毎に、５回の測定の平均値として示してある。
【００８８】
図１６Ａ 〜図１６Ｃから分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて試薬部への酵素含有量（活性基準）が少ないにも拘らず、いずれのＨｃｔの検体においても、吸光度の立ち上がりが大きい上に吸光度が一定値に漸近するまでの時間が短い。そのため、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）を用いれば、使用する酵素量を少なくしつつも、測定時間の短縮化を図ることができるといえる。とくに、グルコースセンサ(２)（本案）においては、グルコースセンサ(１)（本案）に比べて測定初期（５秒以下）におけるタイムコースが安定し、かつ一定値に漸近するまでの時間が短い。そのため、Ｈｃｔが未知の検体を短時間で正確に測定する観点からは、グルコースセンサ(２)（本案）がさらに有用である。
【００８９】
一方、図１７から分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて、高Ｈｃｔ検体（６０％）および低Ｈｃｔ検体（２０％）の双方における５秒値のバイアスが小さく、中Ｈｃｔ検体（４２％）からのずれ量が小さい。この点からは、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べてＨｃｔの影響を受けにくいといえる。
【実施例２】
【００９０】
本実施例においては、実施例１と同様にして作成したグルコースセンサ(１)〜(３)を用いて、グルコース濃度が異なる５種類の検体（０ｍｇ／ｄＬ 、１１３ｍｇ／ｄＬ、２１２ｍｇ／ｄＬ、４３０ｍｇ／ｄＬ、５９８ ｍｇ／ｄＬ）について、実施例１と同様にして吸光度のタイムコースを測定した。その結果を図１８Ａ〜図１８Ｃに示した。
【００９１】
図１８Ａ〜図１８Ｃから分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて試薬部への酵素含有量（活性基準）が少ないにも拘らず、いずれのグルコース濃度の検体においても、吸光度の立ち上がりが大きい上に吸光度が一定値に漸近するまでの時間が短い。このことは同時に、グルコースセンサ(１)，(２)は、グルコースセンサ(３)に比べて、測定時間が短い場合（たとえば５秒以下）においても、吸光度とグルコース濃度との関係が高い直線性を示すことを意味している。すなわち、グルコースセンサ(１)，(２)では、測定レンジを広く確保しつつも、測定時間の短縮化を図ることができる。
【実施例３】
【００９２】
実施例２において得られたデータに基づいて、測定再現性を評価した。測定再現性は、各グルコースセンサ(１)〜(３)毎に、各グルコース濃度の検体について、測定開始から５秒後における吸光度のバラツキを計算することにより行った。計算結果については、下記表８〜表１０に示した。
【００９３】
【表８】
【００９４】
【表９】
【００９５】
【表１０】
【００９６】
表８〜表１０から分かるように、グルコースセンサ(１)，(２)（本案）は、グルコースセンサ(３)（比較）に比べて、総合的にＣ．Ｖ．（％）が小さく、その値自体も小さいことから、測定再現性が優れていると言える。
【００９７】
実施例１〜３の結果を総合すれば、次のように結論付けることができる。すなわち、電子伝達物質を含んだ第１試薬部５１Ａ，５１Ｂと発色剤を含んだ第２試薬部５２Ａ，５２Ｂとを分離し、かつ第１試薬部５１Ａ，５１Ｂを第２試薬部５２Ａ，５２Ｂよりも上流側に配置した場合（グルコースセンサ(１)，(２)）には、第２試薬部５２Ｃを第１試薬部５１Ｃよりも上流側に配置した場合（グルコースセンサ(３)）に比べて、Ｈｃｔの影響を受けにくく、少ない酵素量によって、測定レンジを広く確保しつつ測定時間の短縮化を図ることができる。とくに、電子伝達物質を含んだ第１試薬部５１Ｂと酸化還元酵素を含んだ第３試薬部５３Ｂとを分離し、かつ第１試薬部５１Ｂを第３試薬部５３Ｂよりも上流側に配置した場合（グルコースセンサ(２)）には、電子伝達物質と酸化還元酵素とを混在させて第１試薬部５１Ａを構成する場合（グルコースセンサ(１)）に比べて、さらに測定時間の短縮化を図り、しかも測定安定性を向上させることができる。
【実施例４】
【００９８】
本実施例では、図１９に示した構成の本案グルコースセンサ、および図１５Ｂのグルコースセンサ(２)に相当する参照グルコースセンサについて測定再現性を検討した。
【００９９】
参照グルコースセンサについては、実施例１のグルコースセンサ(２)と同様な手法により作成した。一方、本案グルコースセンサは、参照グルコースセンサ（実施例１のグルコースセンサ(２)）を形成する場合において、第１試薬部５１Ｂ′は、第１試薬部５１Ｂを形成するときと同量かつ同組成の材料液を塗布した後に、この材料液を目的とする大きさに広げてから乾燥させて形成した点を除いて、参照グルコースセンサ（実施例１のグルコースセンサ(２)）と同様にして作成した。ここで、本案グルコースセンサにおける第１試薬部５１Ｂ′は、第３試薬部５３Ｂよりも長い３．５ｍｍの長さに、第３試薬部５３Ｂよりも厚みを小さく形成し、第３試薬部５３Ｂにおける導入口５０Ｂ側の縁から導入口５０Ｂまでの距離における８７．５％の長さ範囲を占めるものとして形成した。
【０１００】
測定再現性については、上述の本案グルコースセンサおよび参照グルコースセンサを用いて、Ｈｃｔが４２％である検体について、実施例１と同様にして吸光度のタイムコースを測定した結果、および測定開始から５秒後における吸光度のバラツキを計算することにより検討した。検体としては、グルコース濃度が異なる３種類（０ｍｇ／ｄＬ、１００ｍｇ／ｄＬ、４００ｍｇ／ｄＬ）のものを使用した。タイムコースは、各グルコースセンサについて、０ｍｇ／ｄＬの検体において５回、１００ｍｇ／ｄＬおよび４００ｍｇ／ｄＬの検体において１０回測定した。
【０１０１】
吸光度のタイムコースを測定した結果は、本案グルコースセンサについては図２０Ａ〜図２０Ｃに、参照グルコースセンサについては図２１Ａ〜図２１Ｃにそれぞれ示した。５秒後の吸光度のバラツキの計算結果は、本案グルコースセンサについては表１１に、参照グルコースセンサについては表１２にそれぞれ示した。なお、図２０Ａ〜図２０Ｃおよび図２１Ａ〜図２１Ｃにおいては、波長６６０ｎｍで吸光度を測定した結果、波長９４０ｎｍで吸光度を測定した結果、および波長６６０ｎｍでの測定結果から波長９４０ｎｍでの測定結果を差分した結果をそれぞれ示し、表１１および表１２においては波長６６０ｎｍでの測定結果から波長９４０ｎｍでの測定結果を差分した結果についてのバラツキの計算結果を示した。
【０１０２】
【表１１】
【０１０３】
【表１２】
【０１０４】
図２０Ａ〜図２０Ｃと、図２１Ａ〜図２１Ｃとを比較すれば分かるように、本案グルコースセンサのほうが参照グルコースセンサに比べて、吸光度のタイムコースにおけるバラツキが明らかに少ない。一方、表１１と表１２とを比較すれば分かるように、５秒値における吸光度のバラツキは、本案グルコースセンサのほうが参照グルコースセンサに比べて、低濃度域（１００ｍｇ／ｄＬ以下）におけるＣ．Ｖ．（％）が小さい。すなわち、本案グルコースセンサのほうが参照グルコースセンサに比べて、低濃度域（１００ｍｇ／ｄＬ以下）における測定再現性が優れていると言える。
【０１０５】
ここで、参照グルコースセンサは、実施例１〜３におけるグルコースセンサ(２)に相当するものであり、このグルコースセンサ(２)は、実施例１〜３におけるグルコースセンサ(１)，(３)に比べて測定再現性に優れるものである。すなわち、本案グルコースセンサにおいては、測定再現性に優れるグルコースセンサ(２)（参照グルコースセンサ）よりもさらに、低濃度における再現性が優れたものとなっている。
【０１０６】
この結果は、本案グルコースセンサにおいて、第１試薬部５１Ｂ′を薄く塗り広げることにより第１試薬部５１Ｂ′の溶解性が高められ、流路に導入された試料における電子伝達物質の濃度のバラツキが小さくなっているためであると考えられる。そのため、低濃度における再現性を改善するためには、電子伝達物質と酸化還元酵素とを分離しつつも、電子伝達物質については、その溶解性（試料に対する拡散性）を高めるために、第１試薬部５１Ｂ′を薄膜とし、あるいは他の試薬部５２Ｂ，５３Ｂやなどよりも試料の流れ方向に長い形態とするのが好ましいと言える。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血球を含んだ試料を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、上記流路の内部に配置された試薬部と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るための電子検出媒体と、を備えた分析用具であって、
上記試薬部は、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含んでおり、かつ少なくとも一部が上記導入口の近傍に配置されている、試薬部の配置を改良した分析用具。
【請求項２】
上記試薬部は、上記電子検出媒体とは分離された状態で、上記電子検出媒体よりも試料の流れ方向の上流側に配置されている、請求項１に記載の分析用具。
【請求項３】
上記試薬部は、上記流路に試料を供給したときに溶解する固体状に形成されている、請求項２に記載の分析用具。
【請求項４】
上記試薬部と上記電子検出媒体との間の中心間距離は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が上記試料に含まれる場合において、上記上限量の分析対象成分から上記電子伝達物質への電子移動が、上記電子伝達物質が上記電子検出媒体に対して電子を供給しうる状態となるまでの間に、実質的に完了する長さに設定されている、請求項３に記載の分析用具。
【請求項５】
上記試薬部における電子伝達物質の含有量は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が上記試料に含まれる場合において、上記上限量の分析対象成分から取り出せる全ての電子を、上記電子伝達物質において受け取ることができる量に設定されている、請求項３に記載の分析用具。
【請求項６】
上記電子検出媒体は、発色剤を含んでいる、請求項１に記載の分析用具。
【請求項７】
上記電子検出媒体は、試料に対して難溶性の多孔質体に、上記発色剤を保持させた構成を有している、請求項６に記載の分析用具。
【請求項８】
上記電子検出媒体は、導体である、請求項１に記載の分析用具。
【請求項９】
上記導体は、上記流路に試料が供給されたときに、上記電子伝達物質に電圧を印加するために利用されるものである、請求項８に記載の分析用具。
【請求項１０】
上記試薬部は、試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含んでいる、請求項１に記載の分析用具。
【請求項１１】
試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含み、かつ上記試薬部とは分離して設けられた追加の試薬部をさらに備えている、請求項１に記載の分析用具。
【請求項１２】
上記追加の試薬部は、上記流路の内部における試料の流れ方向において、上記試薬部と上記電子検出媒体との間に配置されている、請求項１１に記載の分析用具。
【請求項１３】
上記試薬部は、上記追加の試薬部よりも平面視面積が大きくされている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１４】
上記試薬部は、上記追加の試薬部よりも試料の流れ方向の長さが大きくされている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１５】
上記試薬部は、上記追加の試薬部よりも厚みが小さくされている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１６】
上記試薬部の厚みは、上記追加の試薬部の厚みの１５〜８０％である、請求項１５に記載の分析用具。
【請求項１７】
上記試薬部は、上記流路における上記電子検出媒体の平面視面積の１．５〜１０倍の平面視面積を有している、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１８】
上記試薬部は、上記追加の試薬部における上記導入口側の縁から上記導入口までの距離における５０〜９０％の長さ範囲を占めている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１９】
上記試薬部および上記追加の試薬部は、上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成されている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項２０】
上記酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である、請求項１０に記載の分析用具。
【請求項２１】
上記酸化還元酵素は、ＰＱＱＧＤＨ、αＧＤＨ、またはＣｙＧＤＨである、請求項２０に記載の分析用具。
【請求項２２】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ錯体である、請求項１に記載の分析用具。
【請求項２３】
試料中の分析対象成分は、グルコースである、請求項１に記載の分析用具。
【請求項２４】
上記流路は、毛細管力が生じるように構成されている、請求項１に記載の分析用具。
【請求項２５】
血球を含んだ試料を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るためのものであり、かつ試料に対して難溶性の多孔質体に発色剤を保持させた構成の電子検出媒体と、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された電子伝達物質層と、試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された酸化還元酵素層と、を備えた分析用具であって、
上記流路において、上記電子伝達物質層、上記酸化還元酵素層および上記電子検出媒体がこの順序で、試料の流れ方向の上流側から順番に並んで配置されている、分析用具。
【請求項２６】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層よりも平面視面積が大きくされている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項２７】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層よりも試料の流れ方向の長さが大きくされている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項２８】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層よりに厚みが小さくされている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項２９】
上記電子伝達物質層の厚みは、上記酸化還元酵素層の厚みの１５〜８０％である、請求項２８に記載の分析用具。
【請求項３０】
上記電子伝達物質層は、上記流路における上記電子検出媒体の平面視面積の１．５〜１０倍の平面視面積を有している、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項３１】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層における上記導入口側の縁から上記導入口までの距離における５０〜９０％の長さ範囲を占めている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項３２】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ錯体である、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項３３】
血球を含んだ試料が移動した状態において、上記試料に含まれる分析対象成分から取り出した電子を電子伝達物質に供給し、上記分析対象成分から上記電子伝達物質への電子移動を、実質的に完了する過程と、
上記試料の移動が停止した状態において、上記電子伝達物質と電子検出媒体との間の電子授受反応を行う過程と、
上記電子検出媒体を介して得られる情報に基づいて、分析対象成分の分析に必要な演算を行う過程と、
を含んでいる、分析方法。
【請求項３４】
上記電子検出媒体は、発色剤を含んでいる、請求項３３に記載の分析方法。
【請求項３５】
上記分析対象成分は、グルコースである、請求項３３に記載の分析方法。
【請求項１】
血球を含んだ試料を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、上記流路の内部に配置された試薬部と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るための電子検出媒体と、を備えた分析用具であって、
上記試薬部は、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含んでおり、かつ少なくとも一部が上記導入口の近傍に配置されている、試薬部の配置を改良した分析用具。
【請求項２】
上記試薬部は、上記電子検出媒体とは分離された状態で、上記電子検出媒体よりも試料の流れ方向の上流側に配置されている、請求項１に記載の分析用具。
【請求項３】
上記試薬部は、上記流路に試料を供給したときに溶解する固体状に形成されている、請求項２に記載の分析用具。
【請求項４】
上記試薬部と上記電子検出媒体との間の中心間距離は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が上記試料に含まれる場合において、上記上限量の分析対象成分から上記電子伝達物質への電子移動が、上記電子伝達物質が上記電子検出媒体に対して電子を供給しうる状態となるまでの間に、実質的に完了する長さに設定されている、請求項３に記載の分析用具。
【請求項５】
上記試薬部における電子伝達物質の含有量は、予め設定した検出範囲の上限量の分析対象成分が上記試料に含まれる場合において、上記上限量の分析対象成分から取り出せる全ての電子を、上記電子伝達物質において受け取ることができる量に設定されている、請求項３に記載の分析用具。
【請求項６】
上記電子検出媒体は、発色剤を含んでいる、請求項１に記載の分析用具。
【請求項７】
上記電子検出媒体は、試料に対して難溶性の多孔質体に、上記発色剤を保持させた構成を有している、請求項６に記載の分析用具。
【請求項８】
上記電子検出媒体は、導体である、請求項１に記載の分析用具。
【請求項９】
上記導体は、上記流路に試料が供給されたときに、上記電子伝達物質に電圧を印加するために利用されるものである、請求項８に記載の分析用具。
【請求項１０】
上記試薬部は、試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含んでいる、請求項１に記載の分析用具。
【請求項１１】
試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含み、かつ上記試薬部とは分離して設けられた追加の試薬部をさらに備えている、請求項１に記載の分析用具。
【請求項１２】
上記追加の試薬部は、上記流路の内部における試料の流れ方向において、上記試薬部と上記電子検出媒体との間に配置されている、請求項１１に記載の分析用具。
【請求項１３】
上記試薬部は、上記追加の試薬部よりも平面視面積が大きくされている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１４】
上記試薬部は、上記追加の試薬部よりも試料の流れ方向の長さが大きくされている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１５】
上記試薬部は、上記追加の試薬部よりも厚みが小さくされている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１６】
上記試薬部の厚みは、上記追加の試薬部の厚みの１５〜８０％である、請求項１５に記載の分析用具。
【請求項１７】
上記試薬部は、上記流路における上記電子検出媒体の平面視面積の１．５〜１０倍の平面視面積を有している、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１８】
上記試薬部は、上記追加の試薬部における上記導入口側の縁から上記導入口までの距離における５０〜９０％の長さ範囲を占めている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項１９】
上記試薬部および上記追加の試薬部は、上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成されている、請求項１２に記載の分析用具。
【請求項２０】
上記酸化還元酵素は、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）である、請求項１０に記載の分析用具。
【請求項２１】
上記酸化還元酵素は、ＰＱＱＧＤＨ、αＧＤＨ、またはＣｙＧＤＨである、請求項２０に記載の分析用具。
【請求項２２】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ錯体である、請求項１に記載の分析用具。
【請求項２３】
試料中の分析対象成分は、グルコースである、請求項１に記載の分析用具。
【請求項２４】
上記流路は、毛細管力が生じるように構成されている、請求項１に記載の分析用具。
【請求項２５】
血球を含んだ試料を移動させるための流路と、上記流路に試料を導入するための導入口と、試料中の分析対象成分の分析を行うために必要な情報を、電子授受量に相関させて得るためのものであり、かつ試料に対して難溶性の多孔質体に発色剤を保持させた構成の電子検出媒体と、試料中の分析対象成分から取り出した電子を上記電子検出媒体に供給するための電子伝達物質を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された電子伝達物質層と、試料中の分析対象成分から電子を取り出して上記電子伝達物質に電子を供給するための酸化還元酵素を含み、かつ上記流路に試料を供給したときに溶解するように構成された酸化還元酵素層と、を備えた分析用具であって、
上記流路において、上記電子伝達物質層、上記酸化還元酵素層および上記電子検出媒体がこの順序で、試料の流れ方向の上流側から順番に並んで配置されている、分析用具。
【請求項２６】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層よりも平面視面積が大きくされている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項２７】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層よりも試料の流れ方向の長さが大きくされている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項２８】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層よりに厚みが小さくされている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項２９】
上記電子伝達物質層の厚みは、上記酸化還元酵素層の厚みの１５〜８０％である、請求項２８に記載の分析用具。
【請求項３０】
上記電子伝達物質層は、上記流路における上記電子検出媒体の平面視面積の１．５〜１０倍の平面視面積を有している、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項３１】
上記電子伝達物質層は、上記酸化還元酵素層における上記導入口側の縁から上記導入口までの距離における５０〜９０％の長さ範囲を占めている、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項３２】
上記電子伝達物質は、Ｒｕ錯体である、請求項２５に記載の分析用具。
【請求項３３】
血球を含んだ試料が移動した状態において、上記試料に含まれる分析対象成分から取り出した電子を電子伝達物質に供給し、上記分析対象成分から上記電子伝達物質への電子移動を、実質的に完了する過程と、
上記試料の移動が停止した状態において、上記電子伝達物質と電子検出媒体との間の電子授受反応を行う過程と、
上記電子検出媒体を介して得られる情報に基づいて、分析対象成分の分析に必要な演算を行う過程と、
を含んでいる、分析方法。
【請求項３４】
上記電子検出媒体は、発色剤を含んでいる、請求項３３に記載の分析方法。
【請求項３５】
上記分析対象成分は、グルコースである、請求項３３に記載の分析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１６Ｃ】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１８Ｃ】
【図１９】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２０Ｃ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図２１Ｃ】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６６６３８
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【発行日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６９１０（Ｐ２００５−５１６９１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０００１５３
【国際出願日】平成１７年１月７日（２００５．１．７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年７月２１日（２００５．７．２１）
【発行日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００５／０００１５３
【国際出願日】平成１７年１月７日（２００５．１．７）
【出願人】（０００１４１８９７）アークレイ株式会社 (288)
【Ｆターム（参考）】
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