走査型顕微鏡
【課題】光学系の光学限界能を超えた標本の画像を取得することができる走査型顕微鏡を提供する。
【解決手段】走査型顕微鏡１０は、光源装置２０から照射された照明光により走査光学系３０を用いて標本７０を走査する照明光学系と、標本７０からの光を検出部（例えば、第１検出部４０）へ導く集光光学系と、走査光学系３０による標本７０における照明光の走査位置を制御するとともに、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように、走査位置に応じて制御する制御部１００と、を有することを特徴とする。但し、ｎは１以上の整数である。
【解決手段】走査型顕微鏡１０は、光源装置２０から照射された照明光により走査光学系３０を用いて標本７０を走査する照明光学系と、標本７０からの光を検出部（例えば、第１検出部４０）へ導く集光光学系と、走査光学系３０による標本７０における照明光の走査位置を制御するとともに、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように、走査位置に応じて制御する制御部１００と、を有することを特徴とする。但し、ｎは１以上の整数である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡光学系の分解能よりも高い分解能で標本を観察する超解像技術について、様々な手法が提案されている。それらの中には、構造化照明と画像処理とを組み合わせる方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２１６７７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
構造化照明を行う方法として、例えば、回折格子で空間変調した照明光を標本に照射する構成があるが、励起光と蛍光の共通光路中に標本の共役面が形成されるように構成させる、一般的な走査型顕微鏡に適用することは現実的ではない。
【０００５】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、光学系の光学限界能を超えた標本の画像を取得することができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源部から照射された照明光により走査手段を用いて標本を走査する照明光学系と、標本からの光を検出部へ導く集光光学系と、走査手段による標本における照明光の走査位置を制御するとともに、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように、走査位置に応じて制御する制御部と、を有することを特徴とする。但し、ｎは１以上の整数である。
【０００７】
このような走査型顕微鏡において、光源部は、音響光学素子を含み、制御部は、走査位置に応じて音響光学素子を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することが好ましい。
【０００８】
また、このような走査型顕微鏡において、光源部は、レーザ光源を含み、制御部は、走査位置に応じてレーザ光源を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することが好ましい。
【０００９】
また、このような走査型顕微鏡において、制御部は、照明光の正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像から演算により標本の画像を生成することが好ましい。
【００１０】
また、このような走査型顕微鏡において、照明光の正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、照明光の正弦波状波形の位相を変化させることにより照明縞パターンの位相が変化した照明状態で取得した複数の画像であることが好ましい。
【００１１】
また、このような走査型顕微鏡において、照明光の正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、照明光の正弦波状波形の位相を走査ライン毎に変化させることにより照明縞パターンが回転した照明状態で取得した複数の画像であることが好ましい。
【００１２】
また、このような走査型顕微鏡において、制御部は、強度変調の１周期分のデータを記憶する駆動波形テーブルと、駆動波形テーブルのプリセット値として指定された位置を開始位置として、データを循環読み出しするカウンタと、を有し、照明状態に応じてプリセット値を設定して読み出したデータにより正弦波状波形を制御することが好ましい。
【００１３】
また、このような走査型顕微鏡は、標本を介して照明光学系に対向する位置に配置され、標本を透過した照明光を検出する検出部をさらに有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を以上のように構成すると、光学系の光学限界能を超えた標本の画像を取得することができる走査型顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図２】超解像の画像を取得するための照明状態を説明するための説明図である。
【図３】上記走査型顕微鏡の制御部の構成を示す説明図である。
【図４】照明縞信号発生器の構成を示す説明図である。
【図５】同期信号発生器から出力される同期信号のタイミングを示す説明図である。
【図６】ＡＯＴＦの駆動方法を説明するための説明図であって、（ａ）は駆動波形を示し、（ｂ）は駆動波形テーブルの構成を示す。
【図７】位相をずらした縞照明の駆動波形を示す説明図である。
【図８】縞照明をπ／３回転させる場合の駆動波形を示す説明図である。
【図９】２光子励起のための駆動波形を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて走査型顕微鏡の光学系の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、光源装置２０から放射されたレーザ光（照明光）をステージ上に載置された標本７０に照射して走査する走査光学系３０と、標本７０からの蛍光（観察光）を検出する第１検出部４０及び第２検出部５０と、標本７０を透過した照明光を検出する第３検出部６０と、を有して構成される。なお、以降の説明において、走査光学系３０の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。
【００１７】
この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能に構成された光源２１と、後述するＡＯＴＦドライバの制御により、通過するレーザ光の強度を０〜１００％の間で変化させる（強度変調させる）強度変調素子であるＡＯＴＦ（音響光学素子）２２とから構成されている。なお、以降の説明においては、光源２１から赤外光および可視光の２種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、この光源２１から射出される赤外光は、標本７０の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短いパルス状の光（例えば、１００フェムト秒のパルス光であって、以下、「ＩＲパルス光」と呼ぶ）であるものとする。
【００１８】
走査光学系３０は、光源装置２０側から順に、第１ダイクロイックミラー３１、走査ユニット３２、スキャンレンズ３３、第２対物レンズ３４、第２ダイクロックミラー３５、及び、対物レンズ３６を有して構成されている。
【００１９】
また、第１検出部４０は、ＮＤＤ（Non Descanned Detector）であって、第２ダイクロイックミラー３５の側方に配置され、この第２ダイクロイックミラー３５側から順に、第１集光レンズ４１、第２集光レンズ４２、及び、第１光検出器４３から構成される。ここで、第１光検出器４３の受光面は対物レンズ３６の射出瞳Ｐの位置と略共役に配置されている。
【００２０】
また、第２検出部５０は、第１ダイクロイックミラー３１の側方に配置されており、この第１ダイクロイックミラー３１側から順に、第３集光レンズ５１、対物レンズ３６の標本側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光板５２、及び、第２光検出器５３から構成される。ここで、遮光板５２にはピンホール５２ａが設けられており、このピンホール５２ａは走査光学系３０の光軸を含むように配置されている。
【００２１】
また、第３検出部６０は、標本７０を挟んで対物レンズ３６の反対側に配置されており、この標本７０側から順に、第４集光レンズ６１及び第３光検出器６２から構成されている。
【００２２】
また、この走査型顕微鏡１０には、ＡＯＴＦ２２及び走査ユニット３２の作動を制御するとともに、走査ユニット３２でレーザ光を走査する位置（標本７０上の走査面内の座標）及び第１、第２及び第３光検出器４３，５３，６２で検出された値を処理する制御部１００（図１には図示していない）が設けられている。なお、第１〜第３光検出器４３，５３，６２としては、例えば、ＰＭＴ（Photo Multiplier Tube:光電子倍増管）が用いられる。
【００２３】
この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０の光源２１から放射された略平行光束であるレーザ光は、ＡＯＴＦ２２を透過した後、第１ダイクロイックミラー３１を透過し、走査ユニット３２に入射する。この走査ユニット３２は、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、レーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸に直交する面内で所定の方向（この方向をｘ軸方向とする）に偏向させる第１の偏向素子、及び、光軸に直交する面内で第１の偏向素子の偏向方向と略直交する方向（この方向をｙ軸方向とする）に偏向させる第２の偏向素子からなる２つの偏向素子で構成されている。そして、この走査ユニット３２を出射したレーザ光（略平行光束）はスキャンレンズ３３により一次像面Ｉに結像された後、第２対物レンズ３４を通過することにより再び略平行光束となり、第２ダイクロイックミラー３５を透過して対物レンズ３６によって標本７０上の対物レンズ３６の焦点面に集光される。なお、標本７０上に集光されたレーザ光は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３６の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。
【００２４】
ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、標本７０の観察時には、光源２１から放射されるレーザ光のうち、ＩＲパルス光又は可視光の何れか一方が、標本７０の画像を得るためのイメージング用の照明光（励起光）として用いられる。
【００２５】
例えば、ＩＲパルス光を照明光（励起光）として用いる場合、可視光は全く使用されないか、又は、標本７０の光刺激用として使用される。この場合、ＩＲパルス光が標本７０に照射されると、標本７０からは多光子励起による蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３６に入射し、この対物レンズ３６で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３５で反射されて第１検出部４０に入射する。そして、この観察光は第１集光レンズ４１及び第２集光レンズ４２で必要な径の略平行光束に変換されて第１光検出器４３に入射して検出される。なお、この第１検出部４０には、標本７０や対物レンズ３６等で反射され、観察光とともにこの第１検出部４０に入射するＩＲパルス光を除去するために、図示しないＩＲカットフィルタを配置しても良い。
【００２６】
一方、可視光を照明光（励起光）として用いる場合、ＩＲパルス光は標本７０の光刺激用として使用しても良い。この場合、観察光が標本７０に照射されると、標本７０からは蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３６に入射し、この対物レンズ３６で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３５を透過する。そして、この観察光は、第２対物レンズ３４により一次像面Ｉに結像された後、さらにスキャンレンズ３３で略平行光束にされて走査ユニット３２に入射し、この走査ユニット３２でデスキャンされて出射し、第１ダイクロイックミラー３１で反射されて第２検出部５０内に入り、第３集光レンズ５１により遮光板５２のピンホール５２ａ上に集光される。この第２検出部５０において、遮光板５２のピンホール５２ａを通過した光のみが第２光検出器５３に到達し検出される。
【００２７】
上述のように、遮光板５２のピンホール５２ａは標本７０上の走査面に集光されたレーザ光の点像と共役であり、標本７０上の照射領域（対物レンズ３６の焦点面）から出た観察光（蛍光）はこのピンホール５２ａを通過することができる。一方、標本７０上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール５２ａ上には集光されず、通過することができない。
【００２８】
以上より、走査光学系３０は、光源部である光源装置２０から照射された照明光により標本７０を走査する照明光学系及び走査手段、並びに、標本７０からの光を第１及び第２検出部４０，５０に導く集光手段の機能を有している。そして、図示しない制御部１００が走査ユニット３２の走査に同期されて第１及び第２光検出器４３，５３で検出された光信号を処理することにより、標本７０上のレーザ光の走査位置と光信号から求められる輝度を用いて、標本７０の走査面における二次元的な画像を得ることができる。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で標本７０の像を得ることができる。このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、走査型多光子顕微鏡及び走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。なお、走査型多光子顕微鏡として使用する場合は、第２検出部５０は不要であり、走査型共焦点顕微鏡として使用する場合は、第１検出部４０は不要である。
【００２９】
ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、この走査型顕微鏡１０の光学分解能を超えた分解能（以下、「超解像」と呼ぶ）の画像を得るために、光源装置２０に設けられたＡＯＴＦ２２のレーザ光の透過率を走査ユニット３２の動作に応じて変化させる。その際、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は（２光子励起）、標本７０上の走査領域に対して強度変化の２乗が正弦波状になる（レーザ光の強度変化が正弦波の１／２乗になる）ようにレーザ光の強度変調を行い、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）、標本７０上の走査領域に対して強度変化が正弦波状になるように、レーザ光の強度変化を行って、異なる照明状態の画像を複数取得するように構成されている。つまり、レーザ光の強度変化のｎ乗が正弦波状になるように、即ち、レーザ光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように行う（ｎは、励起時の励起光の光子数）。具体的には、可視光を励起光として用いる場合（１光子励起）において、図２に示すように、走査領域においてｘ軸方向にレーザ光の強度が正弦波状に変化する縞状の照明状態を基準とし（この照明状態を「０位相」と呼ぶ）、この０位相の状態から正弦波状波形の位相をｘ軸方向に−２π／３及び＋２π／３ずらした照明状態（それぞれ「−２π／３位相」及び「＋２π／３位相」と呼ぶ）の３つの照明状態を１組とし（この組を「θｒａｄ」と呼ぶ）、さらに、この組に加えてこの組のそれぞれの照明縞を光軸を中心に＋π／３ｒａｄ及び−π／３ｒａｄ回転させ（それぞれの組を「θ＋π／３ｒａｄ」及び「θ−π／３ｒａｄ」と呼ぶ）、合計９つの照明状態の標本７０の画像を取得し（９枚の画像を取得し）、これらの画像から超解像の画像を取得するように構成されている。
【００３０】
以下に、レーザ光の強度変調をして標本７０を走査するための構成について図３を用いて説明する。なお、図３は、走査型顕微鏡１０の制御部１００の構成を中心に示し、光学系は主要部分だけを示している。また、ここでは、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）標本７０から出射した蛍光を第２検出部５０を用いて画像の取得を行う場合について説明する。
【００３１】
この制御部１００は、ＡＯＴＦ２２の透過率、走査ユニット３２によるレーザ光（照明光）の走査位置（座標）、並びに、第２光検出器５３による蛍光（観察光）の検出及び記憶を同期させるための同期信号を発生する同期信号発生器１０１、同期信号によりレーザ光の強度変調を行うための信号（照明縞信号）を発生する照明縞信号発生器１０２、デジタル信号である照明縞信号をアナログ信号に変換する外部ＤＡ変換素子１０３、アナログ信号の照明縞信号によりＡＯＴＦ２２の透過率を制御するＡＯＴＦドライバ１０４、同期信号発生器１０１から出力される駆動信号により走査ユニット３２の第１及び第２の偏向素子の回転角を制御するスキャナドライバ１０５、第２光検出器５３の出力信号を増幅する信号増幅器１０６、同期信号発生器１０１から出力される信号により、第２光検出器５３の出力信号（アナログ信号）をデジタル信号に変換するＡＤ変換素子１０７，及び、このデジタル信号を記憶するメモリ１０８から構成される。
【００３２】
ここで、走査領域上の５１２×５１２の点の画像（点像）を取得する場合を例に説明する。なお、以降の説明において、同期信号発生器１０１は、ＡＯＴＦ２２を駆動するための基準クロックｃｌｋＡ、走査領域上の点像を取得するタイミングを示すピクセルクロックｐｃｌｋ及び水平同期信号Ｈｓｙｎｃ、点像の情報をメモリ１０８に記憶するタイミングを示すメモリコントロールｍｅｍ＿ｃｎｔ、並びに、走査ユニット３２を作動させるための駆動信号ｓｉｇＡを出力する。
【００３３】
同期信号発生器１０１において、ピクセルクロックｐｃｌｋは、１ライン５１２分割された等間隔のクロックとなり、これに同期して等速の駆動信号ｓｉｇＡを発生させる。また、水平同期信号Ｈｓｙｎｃは、１ライン毎の水平方向に同期した信号である（ピクセルクロックｐｃｌｋが５１２カウントされる毎に変化するクロックである）。また、同期信号発生器１０１は、ピクセルクロックｐｃｌｋに同期した基準クロックｃｌｋＡを照明縞信号発生器１０２へと出力し、照明縞信号発生器１０２はピクセルクロックｐｃｌｋに同期した基準クロックｃｌｋＡにて照明縞信号を構成することができる。これら、駆動信号ｓｉｇＡ、水平同期信号Ｈｓｙｎｃ、ピクセルクロックｐｃｌｋ、及び、このピクセルクロックｐｃｌｋに同期した基準クロックｃｌｋＡの概略タイミングチャートを図５に示す。
【００３４】
次に、９枚の画像取得に必要なレーザ光の強度変調の発生方法、及び、照明縞信号発生器１０２について述べる。今、図６（ａ）に示すように、照明縞を発生させるための正弦波の駆動波形を３００個の離散値に分割し、それぞれをＮ０からＮ２９９とし、このデータを「駆動データ」と呼ぶ。この図６（ａ）に示す駆動波形を上述のθｒａｄにおける０位相としたとき、これらの駆動データを図４に示す駆動波形テーブル１０２ｂに持ち、同期信号発生器１０１により生成された基準クロックｃｌｋＡを３００データを１周期としてカウンタ１０２ａにてカウントし、駆動波形テーブル１０２ｂより順次データを読み出す。０位相ではプリセット値は０であり、１周期でカウンタ１０２ａをリセットする。＋２π／３位相及び−２π／３位相ずらした波形は、プリセット値を１００及び２００とすれば良い。すなわち、＋２π／３位相のときは、駆動データをＮ１００から読み出せば良く、また、−２π／３位相のときは、駆動データをＮ２００から読み出せば、図７に示すように駆動波形をずらすことができる。上述のように、Ｎ２９９まで読み出されると、カウンタ１０２ｂがリセットされてＮ０から順次データが読み出される（この動作を「循環読み出し」と呼ぶ）。
【００３５】
ここで、対物レンズ３６の解像限界をｆｍａｘとすると、この解像限界は対物レンズ３６の開口数ＮＡと波長λからｆｍａｘ＝２ＮＡ／λで定義される。一方、サンプリングによる空間周波数をｆｓａｍｐｌｅとすると、この空間周波数は標本画像を取得するためのピクセルサイズＰからｆｓａｍｐｌｅ＝２／Ｐとなる。この走査型顕微鏡１０で取得した画像が対物レンズ３６の解像限界を超えるためには、ｆｍａｘ＜ｆｓａｍｐｌｅの関係を有することが必要であり、実空間では対物レンズ３６の解像限界が２．５〜３画素程度になっていることが望ましい。すなわち、２画素未満の場合、対物レンズ３６の性能を活かしていないと言える。そのため、上述の駆動波形は２画素以上で１周期とすることが必要である。本実施形態では、３画素（ピクセルクロックｐｃｌｋが３クロック）で、駆動波形が１周期となるように制御されている。
【００３６】
次に、照明縞を回転させる方法を示す。この場合も、照明縞信号発生器１０２により駆動波形テーブル１０２ｂから駆動データを読み出すときのプリセット値を各々の回転に合わせて設定すれば良いが、位相をずらすだけの場合はすべてのラインに対して１画像で同じプリセット値を与えれば良いのに対して、回転の場合はプリセット値を１ライン毎に設定する必要がある。例えば、０位相からπ／３ｒａｄ回転させる場合（θ＋π／３ｒａｄの０位相とする場合）、ライン毎に駆動波形をπ／３位相ずつずらして行けばよいため、１ライン目はプリセット値を０とし、２ライン目はプリセット値を５０とし、３ライン目はプリセット値を１００とし、４ライン目はプリセット値を１５０とし、５ライン目はプリセット値を２００とし、６ライン目はプリセット値を２５０とする。１ライン目から６ライン目までを1周期とすると、７ライン目はプリセット値を再び０とし、同様な繰り返しによりプリセット値を設定すると、図８に示すように、＋π／３ｒａｄ回転した照明縞パターンを発生することができる。その他の画像においても同様に適宜プリセット値を与えることで、図２に示すような９種類の照明縞パターンを構築することができる。
【００３７】
照明縞信号発生器１０２にて照明縞信号（照明パターン）を生成し、外部ＤＡ変換素子１０３にて基準クロックｃｌｋＡと同期したアナログ信号（正弦波駆動信号）をＡＯＴＦドライバ１０４へ入力し、ＡＯＴＦ２２の透過率を制御してレーザ光の強度変調を行う。このレーザ光により励起されて得られた蛍光は第２光検出器５３にて電気信号へと変換された後、信号増幅器１０６にて増幅され、ＡＤ変換素子１０７でピクセルクロックｐｃｌｋに同期してサンプリングされる。そして、このＡＤ変換素子１０７にてサンプリングされた画像データは、同期信号発生器１０１より発生するメモリコントロール信号ｍｅｍ＿ｃｎｔにてコントロールされてメモリ１０８へ格納される。
【００３８】
このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０では、θｒａｄのときの０位相の１周期分の駆動波形を照明縞信号発生器１０２の駆動波形テーブル１０２ｂに記憶し、カウンタ１０２ａのプリセット値を縞状の照明状態に応じて設定するだけで、上述の９つの縞状の照明状態を実現することができるので、少ない記憶領域及び簡単な構成で、超解像を得るための照明状態を発生させることができる。
【００３９】
以上のようにして、縞状の照明状態を変化させて格納された９枚の画像データから、演算により最終的に超解像の１枚の画像を得る。以下に超解像の画像を得る方法について説明する。
【００４０】
画像上の点ｒ＝（ｘ，ｙ）における点像強度分布Ｐ（ｒ）を持つ顕微鏡光学系において、標本７０上の点Ｏ（ｒ）に、ある強度分布を持った照明を与えると標本７０におけるレーザ光（照明光）は空間変調を受ける。単一の空間周波数成分ベクトルＫを持つ正弦波状の照明の場合、空間変調成分としては、０，±１次の３変調成分となる。これらの空間変調をｍ1ｅｘｐ（ｉｌｋｒ＋ｉｌφ），（ｌ＝１，０，−１）と表記すると、空間変調を受けた標本７０の像は、次式（１）のように表すことができる。ここで、ｒは標本７０上の位置ベクトルであり、Ｋｒは内積を示し、＊は畳み込み積分を示す。
【００４１】
【数１】
【００４２】
上述のように縞照明を変化させて画像の取得を行うと、同一の変調周波数、変調振幅を持ち、変調位相φのみ異なる画像がＮ枚（ここでは、３枚）得られるが、このときのｊ番目の画像の照明の位相をφjと表すと、ｊ番目の画像は次式（２）のように表され、Ｎ個の方程式が得られる。
【００４３】
【数２】
【００４４】
また、光検出器（上述の例では第２光検出器５３）の入力光量と出力信号の事前の測定データから、入射光量Ｉ（ｒ）を出力信号Ｓ（ｒ）の多項式によって次式（３）のように近似する。なお、事前の測定データは、テーブルとして制御部１００のメモリに記憶しておくことが望ましい。
【００４５】
【数３】
【００４６】
なお、入射光量と出力信号の関係は、光検出器の温度によって異なる。したがって、実際に利用する光検出器の温度に合わせて、それぞれデータを取得し、近似する必要があり、それぞれの温度でデータを取得し、テーブルとして制御部１００のメモリに記憶しておくことが望ましい。
【００４７】
上述の式（２）及び式（３）より、次式（４）のようなＮ個の方程式が得られる。
【００４８】
【数４】
【００４９】
これらの方程式ではＯ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ），（ｌ＝−１，０，１）が未知数であり、それらはＮ≧３の画像を取得することで求めることができる。Ｎ個の方程式（４）のうち３つの式を用いると、次式（５）が得られる。
【００５０】
【数５】
【００５１】
この方程式を解くことで、Ｏ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ），（ｌ＝−１，０，１）を求めることができる。
【００５２】
または、Ｎ≧４の画像から、公知の手法により最小二乗法を用いて求めても良い。最小二乗法を用いることでノイズを低減させることができる。これらは、ｌ＝０が超解像ではない通常の顕微鏡像に、ｌ＝±１が超解像成分に対応する。
【００５３】
上記で求められるＯ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ），（ｌ＝−１，０，１）は波数空間では、それぞれＯk（ｋ）Ｐk（ｒ+1Ｋ），（ｌ＝−１，０，１）に対応する。ここで、Ｏk（ｋ）は標本７０における発光体の分布のフーリエ変換、Ｐk（ｋ）は強度分布を持たない照明を与えた場合の顕微鏡光学系が持つ伝達関数（ＯＴＦ：Optical Transfer Function）である。
【００５４】
強度分布を持たない照明を与えた場合の通常の伝達関数は光の波長λ、対物レンズ３６の開口数ＮＡに対してｋ＝−２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λであるから、上記で得られた標本情報Ｏ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ），（ｌ＝−１，０，１）は、ｌ＝−１，０，１に対して、ｋ＝−２ＮＡ／λ−Ｋ〜２ＮＡ／λ−Ｋ、ｋ＝−２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λ、ｋ＝−２ＮＡ／λ＋Ｋ〜２ＮＡ／λ＋Ｋの情報を含むことが分かる。従って、Ｏ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ）全体としてはｋ＝−２ＮＡ／λ−Ｋ〜２ＮＡ／λ＋Ｋまでの情報を含むので、高い解像度を持った顕微鏡画像を得ることができる。
【００５５】
上述のように、強度変調の位相をずらした照明状態及びこれらを回転させた照明状態により得られた９枚の画像から超解像画像を得る場合、例えば、光軸方向のセクショニング性能（半値幅）は３３０ｎｍ、横方向の分解能（半値幅）は１００ｎｍとすることができる。
【００５６】
なお、標本７０を透過した照明光（励起光）を第３検出部６０の第３光検出器６２で検出し、標本７０上のレーザ光の走査位置と光信号から求められる輝度を用いて、標本７０の透過像を得ることができる。この場合、照明光の強度変調の位相がずれた３枚の画像（−２π／３位相、０位相、＋２π／３位相の画像）を重ね合わせることにより、標本７０の透過像を得ることができる。
【００５７】
また、以上の説明では、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は（２光子励起）、標本７０から出射した蛍光を第１光検出部４０の第１光検出器４３で検出し、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）、標本７０から出射した蛍光を第２検出部５０の第２光検出器５３で検出して超解像画像を得るように構成していたが、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）、第２光検出器５３の位置に分光装置を配置し、標本７０から出射した蛍光を所定の波長毎に分光して検出し、それぞれの波長毎の超解像画像を得ることもできる。多波長の蛍光観察を行う場合、ある蛍光成分の中に複数の蛍光成分のもれ込みが存在するため、上述の９枚の画像毎にアンミックス処理を行い単独の蛍光サンプル毎の蛍光画像を取得し、この９枚の単独の蛍光画像から上述の処理により超解像の蛍光画像を得ることが好ましい。
【００５８】
なお、上述の照明光の強度は、正弦波状に変調した場合について説明したが、２光子励起による観察を行うときは、図９に示すように、強度分布の２乗が正弦波状になるように変調することが望ましい。この場合も、図９に示す強度分布から、所定の個数（例えば３００個）に分けた駆動データを駆動波形テーブル１０２ｂに格納し、同期信号発生器１０１により生成された基準クロックｃｌｋＡを分割数（３００データ）を１周期としたカウンタ１０２ａにてカウントし、駆動波形テーブル１０２ｂより順次データを読み込んでＡＯＴＦ２２を制御することにより実現できる。
【００５９】
また、以上の説明においては、ＡＯＴＦ２２を駆動するための駆動波形を、離散値に変換して駆動波形テーブル１０２ｂに格納し、この駆動波形テーブル１０２ｂのデータに基づいて制御する構成を示したが、正弦波を発生する信号発生器と、この正弦波の位相を任意の位相だけ遅延させることができる遅延回路とを用いて、ＡＯＴＦドライバ１０４の作動を制御するように構成することも可能である。遅延量については、上述の説明と同じである。
【００６０】
また、以上の説明では、光源装置２０を、レーザ光を放射する光源２１と、このレーザ光の強度変調を行うＡＯＴＦ２２とから構成した場合について説明したが、この構成は一例であり、本発明はこれに限定されることはない。例えば、レーザ光の強度を直接変化させることができるレーザ光源を用いることもできる。
【００６１】
また、ＡＯＴＦ２２は、光源装置２０の構成である必要はなく、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は(２光子励起)、光源２１から第２ダイクロイックミラー３５までの空間であれば、任意の位置に配置可能である。
【００６２】
また、第３検出部６０は、標本７０を透過した照明光(励起光)を検出することによって透過像を取得するために用いるが、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は(２光子励起)、標本７０から発生した蛍光を効率よく取得するために、透過蛍光を取得するためにも用いてもよい。この場合、透過蛍光取得のタイミングは、第１検出部４０による蛍光取得のタイミングに同期させる必要がある。
【符号の説明】
【００６３】
１０ 走査型顕微鏡
２０ 光源装置 ２１ 光源 ２２ ＡＯＴＦ（強度変調素子）
３０ 走査光学系 ３１ 第１ダイクロイックミラー ３２ 走査ユニット
３３ スキャンレンズ ３４ 第２対物レンズ
３５ 第２ダイクロイックミラー ３６ 対物レンズ
４０ 第１検出部 ４１ 第１集光レンズ ４２ 第２集光レンズ
４３ 第１光検出器
５０ 第２検出部 ５１ 第３集光レンズ
５２ 遮光板 ５２ａ ピンホール ５３ 第２光検出器
６０ 第３検出部 ６１ 第４集光レンズ ６２ 第３光検出器
７０ 標本 １００ 制御部 １０１ 同期信号発生器
１０２ 照明縞信号発生器 １０２ａ カウンタ １０２ｂ 駆動波形テーブル
１０３ ＤＡ変換素子 １０４ ＡＯＴＦドライバ
１０５ スキャナドライバ １０６ 信号増幅器 １０７ ＡＤ変換素子
１０８ メモリ Ｉ 一次像面 Ｐ 射出瞳
【技術分野】
【０００１】
本発明は、走査型顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、顕微鏡光学系の分解能よりも高い分解能で標本を観察する超解像技術について、様々な手法が提案されている。それらの中には、構造化照明と画像処理とを組み合わせる方法がある（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００８−２１６７７８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
構造化照明を行う方法として、例えば、回折格子で空間変調した照明光を標本に照射する構成があるが、励起光と蛍光の共通光路中に標本の共役面が形成されるように構成させる、一般的な走査型顕微鏡に適用することは現実的ではない。
【０００５】
本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、光学系の光学限界能を超えた標本の画像を取得することができる走査型顕微鏡を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題を解決するために、本発明に係る走査型顕微鏡は、光源部から照射された照明光により走査手段を用いて標本を走査する照明光学系と、標本からの光を検出部へ導く集光光学系と、走査手段による標本における照明光の走査位置を制御するとともに、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように、走査位置に応じて制御する制御部と、を有することを特徴とする。但し、ｎは１以上の整数である。
【０００７】
このような走査型顕微鏡において、光源部は、音響光学素子を含み、制御部は、走査位置に応じて音響光学素子を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することが好ましい。
【０００８】
また、このような走査型顕微鏡において、光源部は、レーザ光源を含み、制御部は、走査位置に応じてレーザ光源を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することが好ましい。
【０００９】
また、このような走査型顕微鏡において、制御部は、照明光の正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像から演算により標本の画像を生成することが好ましい。
【００１０】
また、このような走査型顕微鏡において、照明光の正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、照明光の正弦波状波形の位相を変化させることにより照明縞パターンの位相が変化した照明状態で取得した複数の画像であることが好ましい。
【００１１】
また、このような走査型顕微鏡において、照明光の正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、照明光の正弦波状波形の位相を走査ライン毎に変化させることにより照明縞パターンが回転した照明状態で取得した複数の画像であることが好ましい。
【００１２】
また、このような走査型顕微鏡において、制御部は、強度変調の１周期分のデータを記憶する駆動波形テーブルと、駆動波形テーブルのプリセット値として指定された位置を開始位置として、データを循環読み出しするカウンタと、を有し、照明状態に応じてプリセット値を設定して読み出したデータにより正弦波状波形を制御することが好ましい。
【００１３】
また、このような走査型顕微鏡は、標本を介して照明光学系に対向する位置に配置され、標本を透過した照明光を検出する検出部をさらに有することが好ましい。
【発明の効果】
【００１４】
本発明を以上のように構成すると、光学系の光学限界能を超えた標本の画像を取得することができる走査型顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】走査型顕微鏡の構成を示す説明図である。
【図２】超解像の画像を取得するための照明状態を説明するための説明図である。
【図３】上記走査型顕微鏡の制御部の構成を示す説明図である。
【図４】照明縞信号発生器の構成を示す説明図である。
【図５】同期信号発生器から出力される同期信号のタイミングを示す説明図である。
【図６】ＡＯＴＦの駆動方法を説明するための説明図であって、（ａ）は駆動波形を示し、（ｂ）は駆動波形テーブルの構成を示す。
【図７】位相をずらした縞照明の駆動波形を示す説明図である。
【図８】縞照明をπ／３回転させる場合の駆動波形を示す説明図である。
【図９】２光子励起のための駆動波形を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明の好ましい実施形態について図面を参照して説明する。まず、図１を用いて走査型顕微鏡の光学系の構成について説明する。この走査型顕微鏡１０は、光源装置２０から放射されたレーザ光（照明光）をステージ上に載置された標本７０に照射して走査する走査光学系３０と、標本７０からの蛍光（観察光）を検出する第１検出部４０及び第２検出部５０と、標本７０を透過した照明光を検出する第３検出部６０と、を有して構成される。なお、以降の説明において、走査光学系３０の光軸方向をｚ軸とし、このｚ軸に直交する面内で互いに直交する方向をそれぞれｘ軸及びｙ軸とする。
【００１７】
この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能に構成された光源２１と、後述するＡＯＴＦドライバの制御により、通過するレーザ光の強度を０〜１００％の間で変化させる（強度変調させる）強度変調素子であるＡＯＴＦ（音響光学素子）２２とから構成されている。なお、以降の説明においては、光源２１から赤外光および可視光の２種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、この光源２１から射出される赤外光は、標本７０の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短いパルス状の光（例えば、１００フェムト秒のパルス光であって、以下、「ＩＲパルス光」と呼ぶ）であるものとする。
【００１８】
走査光学系３０は、光源装置２０側から順に、第１ダイクロイックミラー３１、走査ユニット３２、スキャンレンズ３３、第２対物レンズ３４、第２ダイクロックミラー３５、及び、対物レンズ３６を有して構成されている。
【００１９】
また、第１検出部４０は、ＮＤＤ（Non Descanned Detector）であって、第２ダイクロイックミラー３５の側方に配置され、この第２ダイクロイックミラー３５側から順に、第１集光レンズ４１、第２集光レンズ４２、及び、第１光検出器４３から構成される。ここで、第１光検出器４３の受光面は対物レンズ３６の射出瞳Ｐの位置と略共役に配置されている。
【００２０】
また、第２検出部５０は、第１ダイクロイックミラー３１の側方に配置されており、この第１ダイクロイックミラー３１側から順に、第３集光レンズ５１、対物レンズ３６の標本側の焦点面と略共役な位置に配置された遮光板５２、及び、第２光検出器５３から構成される。ここで、遮光板５２にはピンホール５２ａが設けられており、このピンホール５２ａは走査光学系３０の光軸を含むように配置されている。
【００２１】
また、第３検出部６０は、標本７０を挟んで対物レンズ３６の反対側に配置されており、この標本７０側から順に、第４集光レンズ６１及び第３光検出器６２から構成されている。
【００２２】
また、この走査型顕微鏡１０には、ＡＯＴＦ２２及び走査ユニット３２の作動を制御するとともに、走査ユニット３２でレーザ光を走査する位置（標本７０上の走査面内の座標）及び第１、第２及び第３光検出器４３，５３，６２で検出された値を処理する制御部１００（図１には図示していない）が設けられている。なお、第１〜第３光検出器４３，５３，６２としては、例えば、ＰＭＴ（Photo Multiplier Tube:光電子倍増管）が用いられる。
【００２３】
この走査型顕微鏡１０において、光源装置２０の光源２１から放射された略平行光束であるレーザ光は、ＡＯＴＦ２２を透過した後、第１ダイクロイックミラー３１を透過し、走査ユニット３２に入射する。この走査ユニット３２は、光軸に直交する方向（上述のｘ軸方向及びｙ軸方向）にレーザ光を２次元的に走査するものであり、例えば、レーザ光を反射することによりこのレーザ光を光軸に直交する面内で所定の方向（この方向をｘ軸方向とする）に偏向させる第１の偏向素子、及び、光軸に直交する面内で第１の偏向素子の偏向方向と略直交する方向（この方向をｙ軸方向とする）に偏向させる第２の偏向素子からなる２つの偏向素子で構成されている。そして、この走査ユニット３２を出射したレーザ光（略平行光束）はスキャンレンズ３３により一次像面Ｉに結像された後、第２対物レンズ３４を通過することにより再び略平行光束となり、第２ダイクロイックミラー３５を透過して対物レンズ３６によって標本７０上の対物レンズ３６の焦点面に集光される。なお、標本７０上に集光されたレーザ光は点像となっており、その点像の径は対物レンズ３６の開口数（ＮＡ）で決まる大きさである。
【００２４】
ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０において、標本７０の観察時には、光源２１から放射されるレーザ光のうち、ＩＲパルス光又は可視光の何れか一方が、標本７０の画像を得るためのイメージング用の照明光（励起光）として用いられる。
【００２５】
例えば、ＩＲパルス光を照明光（励起光）として用いる場合、可視光は全く使用されないか、又は、標本７０の光刺激用として使用される。この場合、ＩＲパルス光が標本７０に照射されると、標本７０からは多光子励起による蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３６に入射し、この対物レンズ３６で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３５で反射されて第１検出部４０に入射する。そして、この観察光は第１集光レンズ４１及び第２集光レンズ４２で必要な径の略平行光束に変換されて第１光検出器４３に入射して検出される。なお、この第１検出部４０には、標本７０や対物レンズ３６等で反射され、観察光とともにこの第１検出部４０に入射するＩＲパルス光を除去するために、図示しないＩＲカットフィルタを配置しても良い。
【００２６】
一方、可視光を照明光（励起光）として用いる場合、ＩＲパルス光は標本７０の光刺激用として使用しても良い。この場合、観察光が標本７０に照射されると、標本７０からは蛍光が発生し、この蛍光は観察光となって対物レンズ３６に入射し、この対物レンズ３６で略平行光束となり第２ダイクロイックミラー３５を透過する。そして、この観察光は、第２対物レンズ３４により一次像面Ｉに結像された後、さらにスキャンレンズ３３で略平行光束にされて走査ユニット３２に入射し、この走査ユニット３２でデスキャンされて出射し、第１ダイクロイックミラー３１で反射されて第２検出部５０内に入り、第３集光レンズ５１により遮光板５２のピンホール５２ａ上に集光される。この第２検出部５０において、遮光板５２のピンホール５２ａを通過した光のみが第２光検出器５３に到達し検出される。
【００２７】
上述のように、遮光板５２のピンホール５２ａは標本７０上の走査面に集光されたレーザ光の点像と共役であり、標本７０上の照射領域（対物レンズ３６の焦点面）から出た観察光（蛍光）はこのピンホール５２ａを通過することができる。一方、標本７０上の他の領域から出た光のほとんどはこのピンホール５２ａ上には集光されず、通過することができない。
【００２８】
以上より、走査光学系３０は、光源部である光源装置２０から照射された照明光により標本７０を走査する照明光学系及び走査手段、並びに、標本７０からの光を第１及び第２検出部４０，５０に導く集光手段の機能を有している。そして、図示しない制御部１００が走査ユニット３２の走査に同期されて第１及び第２光検出器４３，５３で検出された光信号を処理することにより、標本７０上のレーザ光の走査位置と光信号から求められる輝度を用いて、標本７０の走査面における二次元的な画像を得ることができる。これによりこの走査型顕微鏡１０は、高い分解能で標本７０の像を得ることができる。このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、走査型多光子顕微鏡及び走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。なお、走査型多光子顕微鏡として使用する場合は、第２検出部５０は不要であり、走査型共焦点顕微鏡として使用する場合は、第１検出部４０は不要である。
【００２９】
ここで、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０は、この走査型顕微鏡１０の光学分解能を超えた分解能（以下、「超解像」と呼ぶ）の画像を得るために、光源装置２０に設けられたＡＯＴＦ２２のレーザ光の透過率を走査ユニット３２の動作に応じて変化させる。その際、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は（２光子励起）、標本７０上の走査領域に対して強度変化の２乗が正弦波状になる（レーザ光の強度変化が正弦波の１／２乗になる）ようにレーザ光の強度変調を行い、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）、標本７０上の走査領域に対して強度変化が正弦波状になるように、レーザ光の強度変化を行って、異なる照明状態の画像を複数取得するように構成されている。つまり、レーザ光の強度変化のｎ乗が正弦波状になるように、即ち、レーザ光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように行う（ｎは、励起時の励起光の光子数）。具体的には、可視光を励起光として用いる場合（１光子励起）において、図２に示すように、走査領域においてｘ軸方向にレーザ光の強度が正弦波状に変化する縞状の照明状態を基準とし（この照明状態を「０位相」と呼ぶ）、この０位相の状態から正弦波状波形の位相をｘ軸方向に−２π／３及び＋２π／３ずらした照明状態（それぞれ「−２π／３位相」及び「＋２π／３位相」と呼ぶ）の３つの照明状態を１組とし（この組を「θｒａｄ」と呼ぶ）、さらに、この組に加えてこの組のそれぞれの照明縞を光軸を中心に＋π／３ｒａｄ及び−π／３ｒａｄ回転させ（それぞれの組を「θ＋π／３ｒａｄ」及び「θ−π／３ｒａｄ」と呼ぶ）、合計９つの照明状態の標本７０の画像を取得し（９枚の画像を取得し）、これらの画像から超解像の画像を取得するように構成されている。
【００３０】
以下に、レーザ光の強度変調をして標本７０を走査するための構成について図３を用いて説明する。なお、図３は、走査型顕微鏡１０の制御部１００の構成を中心に示し、光学系は主要部分だけを示している。また、ここでは、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）標本７０から出射した蛍光を第２検出部５０を用いて画像の取得を行う場合について説明する。
【００３１】
この制御部１００は、ＡＯＴＦ２２の透過率、走査ユニット３２によるレーザ光（照明光）の走査位置（座標）、並びに、第２光検出器５３による蛍光（観察光）の検出及び記憶を同期させるための同期信号を発生する同期信号発生器１０１、同期信号によりレーザ光の強度変調を行うための信号（照明縞信号）を発生する照明縞信号発生器１０２、デジタル信号である照明縞信号をアナログ信号に変換する外部ＤＡ変換素子１０３、アナログ信号の照明縞信号によりＡＯＴＦ２２の透過率を制御するＡＯＴＦドライバ１０４、同期信号発生器１０１から出力される駆動信号により走査ユニット３２の第１及び第２の偏向素子の回転角を制御するスキャナドライバ１０５、第２光検出器５３の出力信号を増幅する信号増幅器１０６、同期信号発生器１０１から出力される信号により、第２光検出器５３の出力信号（アナログ信号）をデジタル信号に変換するＡＤ変換素子１０７，及び、このデジタル信号を記憶するメモリ１０８から構成される。
【００３２】
ここで、走査領域上の５１２×５１２の点の画像（点像）を取得する場合を例に説明する。なお、以降の説明において、同期信号発生器１０１は、ＡＯＴＦ２２を駆動するための基準クロックｃｌｋＡ、走査領域上の点像を取得するタイミングを示すピクセルクロックｐｃｌｋ及び水平同期信号Ｈｓｙｎｃ、点像の情報をメモリ１０８に記憶するタイミングを示すメモリコントロールｍｅｍ＿ｃｎｔ、並びに、走査ユニット３２を作動させるための駆動信号ｓｉｇＡを出力する。
【００３３】
同期信号発生器１０１において、ピクセルクロックｐｃｌｋは、１ライン５１２分割された等間隔のクロックとなり、これに同期して等速の駆動信号ｓｉｇＡを発生させる。また、水平同期信号Ｈｓｙｎｃは、１ライン毎の水平方向に同期した信号である（ピクセルクロックｐｃｌｋが５１２カウントされる毎に変化するクロックである）。また、同期信号発生器１０１は、ピクセルクロックｐｃｌｋに同期した基準クロックｃｌｋＡを照明縞信号発生器１０２へと出力し、照明縞信号発生器１０２はピクセルクロックｐｃｌｋに同期した基準クロックｃｌｋＡにて照明縞信号を構成することができる。これら、駆動信号ｓｉｇＡ、水平同期信号Ｈｓｙｎｃ、ピクセルクロックｐｃｌｋ、及び、このピクセルクロックｐｃｌｋに同期した基準クロックｃｌｋＡの概略タイミングチャートを図５に示す。
【００３４】
次に、９枚の画像取得に必要なレーザ光の強度変調の発生方法、及び、照明縞信号発生器１０２について述べる。今、図６（ａ）に示すように、照明縞を発生させるための正弦波の駆動波形を３００個の離散値に分割し、それぞれをＮ０からＮ２９９とし、このデータを「駆動データ」と呼ぶ。この図６（ａ）に示す駆動波形を上述のθｒａｄにおける０位相としたとき、これらの駆動データを図４に示す駆動波形テーブル１０２ｂに持ち、同期信号発生器１０１により生成された基準クロックｃｌｋＡを３００データを１周期としてカウンタ１０２ａにてカウントし、駆動波形テーブル１０２ｂより順次データを読み出す。０位相ではプリセット値は０であり、１周期でカウンタ１０２ａをリセットする。＋２π／３位相及び−２π／３位相ずらした波形は、プリセット値を１００及び２００とすれば良い。すなわち、＋２π／３位相のときは、駆動データをＮ１００から読み出せば良く、また、−２π／３位相のときは、駆動データをＮ２００から読み出せば、図７に示すように駆動波形をずらすことができる。上述のように、Ｎ２９９まで読み出されると、カウンタ１０２ｂがリセットされてＮ０から順次データが読み出される（この動作を「循環読み出し」と呼ぶ）。
【００３５】
ここで、対物レンズ３６の解像限界をｆｍａｘとすると、この解像限界は対物レンズ３６の開口数ＮＡと波長λからｆｍａｘ＝２ＮＡ／λで定義される。一方、サンプリングによる空間周波数をｆｓａｍｐｌｅとすると、この空間周波数は標本画像を取得するためのピクセルサイズＰからｆｓａｍｐｌｅ＝２／Ｐとなる。この走査型顕微鏡１０で取得した画像が対物レンズ３６の解像限界を超えるためには、ｆｍａｘ＜ｆｓａｍｐｌｅの関係を有することが必要であり、実空間では対物レンズ３６の解像限界が２．５〜３画素程度になっていることが望ましい。すなわち、２画素未満の場合、対物レンズ３６の性能を活かしていないと言える。そのため、上述の駆動波形は２画素以上で１周期とすることが必要である。本実施形態では、３画素（ピクセルクロックｐｃｌｋが３クロック）で、駆動波形が１周期となるように制御されている。
【００３６】
次に、照明縞を回転させる方法を示す。この場合も、照明縞信号発生器１０２により駆動波形テーブル１０２ｂから駆動データを読み出すときのプリセット値を各々の回転に合わせて設定すれば良いが、位相をずらすだけの場合はすべてのラインに対して１画像で同じプリセット値を与えれば良いのに対して、回転の場合はプリセット値を１ライン毎に設定する必要がある。例えば、０位相からπ／３ｒａｄ回転させる場合（θ＋π／３ｒａｄの０位相とする場合）、ライン毎に駆動波形をπ／３位相ずつずらして行けばよいため、１ライン目はプリセット値を０とし、２ライン目はプリセット値を５０とし、３ライン目はプリセット値を１００とし、４ライン目はプリセット値を１５０とし、５ライン目はプリセット値を２００とし、６ライン目はプリセット値を２５０とする。１ライン目から６ライン目までを1周期とすると、７ライン目はプリセット値を再び０とし、同様な繰り返しによりプリセット値を設定すると、図８に示すように、＋π／３ｒａｄ回転した照明縞パターンを発生することができる。その他の画像においても同様に適宜プリセット値を与えることで、図２に示すような９種類の照明縞パターンを構築することができる。
【００３７】
照明縞信号発生器１０２にて照明縞信号（照明パターン）を生成し、外部ＤＡ変換素子１０３にて基準クロックｃｌｋＡと同期したアナログ信号（正弦波駆動信号）をＡＯＴＦドライバ１０４へ入力し、ＡＯＴＦ２２の透過率を制御してレーザ光の強度変調を行う。このレーザ光により励起されて得られた蛍光は第２光検出器５３にて電気信号へと変換された後、信号増幅器１０６にて増幅され、ＡＤ変換素子１０７でピクセルクロックｐｃｌｋに同期してサンプリングされる。そして、このＡＤ変換素子１０７にてサンプリングされた画像データは、同期信号発生器１０１より発生するメモリコントロール信号ｍｅｍ＿ｃｎｔにてコントロールされてメモリ１０８へ格納される。
【００３８】
このように、本実施形態に係る走査型顕微鏡１０では、θｒａｄのときの０位相の１周期分の駆動波形を照明縞信号発生器１０２の駆動波形テーブル１０２ｂに記憶し、カウンタ１０２ａのプリセット値を縞状の照明状態に応じて設定するだけで、上述の９つの縞状の照明状態を実現することができるので、少ない記憶領域及び簡単な構成で、超解像を得るための照明状態を発生させることができる。
【００３９】
以上のようにして、縞状の照明状態を変化させて格納された９枚の画像データから、演算により最終的に超解像の１枚の画像を得る。以下に超解像の画像を得る方法について説明する。
【００４０】
画像上の点ｒ＝（ｘ，ｙ）における点像強度分布Ｐ（ｒ）を持つ顕微鏡光学系において、標本７０上の点Ｏ（ｒ）に、ある強度分布を持った照明を与えると標本７０におけるレーザ光（照明光）は空間変調を受ける。単一の空間周波数成分ベクトルＫを持つ正弦波状の照明の場合、空間変調成分としては、０，±１次の３変調成分となる。これらの空間変調をｍ1ｅｘｐ（ｉｌｋｒ＋ｉｌφ），（ｌ＝１，０，−１）と表記すると、空間変調を受けた標本７０の像は、次式（１）のように表すことができる。ここで、ｒは標本７０上の位置ベクトルであり、Ｋｒは内積を示し、＊は畳み込み積分を示す。
【００４１】
【数１】
【００４２】
上述のように縞照明を変化させて画像の取得を行うと、同一の変調周波数、変調振幅を持ち、変調位相φのみ異なる画像がＮ枚（ここでは、３枚）得られるが、このときのｊ番目の画像の照明の位相をφjと表すと、ｊ番目の画像は次式（２）のように表され、Ｎ個の方程式が得られる。
【００４３】
【数２】
【００４４】
また、光検出器（上述の例では第２光検出器５３）の入力光量と出力信号の事前の測定データから、入射光量Ｉ（ｒ）を出力信号Ｓ（ｒ）の多項式によって次式（３）のように近似する。なお、事前の測定データは、テーブルとして制御部１００のメモリに記憶しておくことが望ましい。
【００４５】
【数３】
【００４６】
なお、入射光量と出力信号の関係は、光検出器の温度によって異なる。したがって、実際に利用する光検出器の温度に合わせて、それぞれデータを取得し、近似する必要があり、それぞれの温度でデータを取得し、テーブルとして制御部１００のメモリに記憶しておくことが望ましい。
【００４７】
上述の式（２）及び式（３）より、次式（４）のようなＮ個の方程式が得られる。
【００４８】
【数４】
【００４９】
これらの方程式ではＯ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ），（ｌ＝−１，０，１）が未知数であり、それらはＮ≧３の画像を取得することで求めることができる。Ｎ個の方程式（４）のうち３つの式を用いると、次式（５）が得られる。
【００５０】
【数５】
【００５１】
この方程式を解くことで、Ｏ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ），（ｌ＝−１，０，１）を求めることができる。
【００５２】
または、Ｎ≧４の画像から、公知の手法により最小二乗法を用いて求めても良い。最小二乗法を用いることでノイズを低減させることができる。これらは、ｌ＝０が超解像ではない通常の顕微鏡像に、ｌ＝±１が超解像成分に対応する。
【００５３】
上記で求められるＯ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ），（ｌ＝−１，０，１）は波数空間では、それぞれＯk（ｋ）Ｐk（ｒ+1Ｋ），（ｌ＝−１，０，１）に対応する。ここで、Ｏk（ｋ）は標本７０における発光体の分布のフーリエ変換、Ｐk（ｋ）は強度分布を持たない照明を与えた場合の顕微鏡光学系が持つ伝達関数（ＯＴＦ：Optical Transfer Function）である。
【００５４】
強度分布を持たない照明を与えた場合の通常の伝達関数は光の波長λ、対物レンズ３６の開口数ＮＡに対してｋ＝−２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λであるから、上記で得られた標本情報Ｏ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ），（ｌ＝−１，０，１）は、ｌ＝−１，０，１に対して、ｋ＝−２ＮＡ／λ−Ｋ〜２ＮＡ／λ−Ｋ、ｋ＝−２ＮＡ／λ〜２ＮＡ／λ、ｋ＝−２ＮＡ／λ＋Ｋ〜２ＮＡ／λ＋Ｋの情報を含むことが分かる。従って、Ｏ（ｒ）ｅｘｐ（ｉｌＫｒ）＊Ｐ（ｒ）全体としてはｋ＝−２ＮＡ／λ−Ｋ〜２ＮＡ／λ＋Ｋまでの情報を含むので、高い解像度を持った顕微鏡画像を得ることができる。
【００５５】
上述のように、強度変調の位相をずらした照明状態及びこれらを回転させた照明状態により得られた９枚の画像から超解像画像を得る場合、例えば、光軸方向のセクショニング性能（半値幅）は３３０ｎｍ、横方向の分解能（半値幅）は１００ｎｍとすることができる。
【００５６】
なお、標本７０を透過した照明光（励起光）を第３検出部６０の第３光検出器６２で検出し、標本７０上のレーザ光の走査位置と光信号から求められる輝度を用いて、標本７０の透過像を得ることができる。この場合、照明光の強度変調の位相がずれた３枚の画像（−２π／３位相、０位相、＋２π／３位相の画像）を重ね合わせることにより、標本７０の透過像を得ることができる。
【００５７】
また、以上の説明では、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は（２光子励起）、標本７０から出射した蛍光を第１光検出部４０の第１光検出器４３で検出し、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）、標本７０から出射した蛍光を第２検出部５０の第２光検出器５３で検出して超解像画像を得るように構成していたが、可視光を励起光として用いる場合は（１光子励起）、第２光検出器５３の位置に分光装置を配置し、標本７０から出射した蛍光を所定の波長毎に分光して検出し、それぞれの波長毎の超解像画像を得ることもできる。多波長の蛍光観察を行う場合、ある蛍光成分の中に複数の蛍光成分のもれ込みが存在するため、上述の９枚の画像毎にアンミックス処理を行い単独の蛍光サンプル毎の蛍光画像を取得し、この９枚の単独の蛍光画像から上述の処理により超解像の蛍光画像を得ることが好ましい。
【００５８】
なお、上述の照明光の強度は、正弦波状に変調した場合について説明したが、２光子励起による観察を行うときは、図９に示すように、強度分布の２乗が正弦波状になるように変調することが望ましい。この場合も、図９に示す強度分布から、所定の個数（例えば３００個）に分けた駆動データを駆動波形テーブル１０２ｂに格納し、同期信号発生器１０１により生成された基準クロックｃｌｋＡを分割数（３００データ）を１周期としたカウンタ１０２ａにてカウントし、駆動波形テーブル１０２ｂより順次データを読み込んでＡＯＴＦ２２を制御することにより実現できる。
【００５９】
また、以上の説明においては、ＡＯＴＦ２２を駆動するための駆動波形を、離散値に変換して駆動波形テーブル１０２ｂに格納し、この駆動波形テーブル１０２ｂのデータに基づいて制御する構成を示したが、正弦波を発生する信号発生器と、この正弦波の位相を任意の位相だけ遅延させることができる遅延回路とを用いて、ＡＯＴＦドライバ１０４の作動を制御するように構成することも可能である。遅延量については、上述の説明と同じである。
【００６０】
また、以上の説明では、光源装置２０を、レーザ光を放射する光源２１と、このレーザ光の強度変調を行うＡＯＴＦ２２とから構成した場合について説明したが、この構成は一例であり、本発明はこれに限定されることはない。例えば、レーザ光の強度を直接変化させることができるレーザ光源を用いることもできる。
【００６１】
また、ＡＯＴＦ２２は、光源装置２０の構成である必要はなく、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は(２光子励起)、光源２１から第２ダイクロイックミラー３５までの空間であれば、任意の位置に配置可能である。
【００６２】
また、第３検出部６０は、標本７０を透過した照明光(励起光)を検出することによって透過像を取得するために用いるが、ＩＲパルス光を励起光として用いる場合は(２光子励起)、標本７０から発生した蛍光を効率よく取得するために、透過蛍光を取得するためにも用いてもよい。この場合、透過蛍光取得のタイミングは、第１検出部４０による蛍光取得のタイミングに同期させる必要がある。
【符号の説明】
【００６３】
１０ 走査型顕微鏡
２０ 光源装置 ２１ 光源 ２２ ＡＯＴＦ（強度変調素子）
３０ 走査光学系 ３１ 第１ダイクロイックミラー ３２ 走査ユニット
３３ スキャンレンズ ３４ 第２対物レンズ
３５ 第２ダイクロイックミラー ３６ 対物レンズ
４０ 第１検出部 ４１ 第１集光レンズ ４２ 第２集光レンズ
４３ 第１光検出器
５０ 第２検出部 ５１ 第３集光レンズ
５２ 遮光板 ５２ａ ピンホール ５３ 第２光検出器
６０ 第３検出部 ６１ 第４集光レンズ ６２ 第３光検出器
７０ 標本 １００ 制御部 １０１ 同期信号発生器
１０２ 照明縞信号発生器 １０２ａ カウンタ １０２ｂ 駆動波形テーブル
１０３ ＤＡ変換素子 １０４ ＡＯＴＦドライバ
１０５ スキャナドライバ １０６ 信号増幅器 １０７ ＡＤ変換素子
１０８ メモリ Ｉ 一次像面 Ｐ 射出瞳
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源部から照射された照明光により走査手段を用いて標本を走査する照明光学系と、
前記標本からの光を検出部へ導く集光光学系と、
前記走査手段による前記標本における前記照明光の走査位置を制御するとともに、前記照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように、前記走査位置に応じて制御する制御部と、を有することを特徴とする走査型顕微鏡。
但し、ｎは１以上の整数である。
【請求項２】
前記光源部は、音響光学素子を含み、
前記制御部は、前記走査位置に応じて前記音響光学素子を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、前記照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光源部は、レーザ光源を含み、
前記制御部は、前記走査位置に応じて前記レーザ光源を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、前記照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部は、前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像から演算により前記標本の画像を生成することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させることにより照明縞パターンの位相が変化した照明状態で取得した複数の画像であることを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、前記照明光の前記正弦波状波形の位相を走査ライン毎に変化させることにより照明縞パターンが回転した照明状態で取得した複数の画像であることを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記制御部は、
前記強度変調の１周期分のデータを記憶する駆動波形テーブルと、
前記駆動波形テーブルのプリセット値として指定された位置を開始位置として、前記データを循環読み出しするカウンタと、を有し、前記照明状態に応じて前記プリセット値を設定して読み出した前記データにより前記正弦波状波形を制御することを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記標本を介して前記照明光学系に対向する位置に配置され、前記標本を透過した前記照明光を検出する検出部をさらに有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項１】
光源部から照射された照明光により走査手段を用いて標本を走査する照明光学系と、
前記標本からの光を検出部へ導く集光光学系と、
前記走査手段による前記標本における前記照明光の走査位置を制御するとともに、前記照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように、前記走査位置に応じて制御する制御部と、を有することを特徴とする走査型顕微鏡。
但し、ｎは１以上の整数である。
【請求項２】
前記光源部は、音響光学素子を含み、
前記制御部は、前記走査位置に応じて前記音響光学素子を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、前記照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項３】
前記光源部は、レーザ光源を含み、
前記制御部は、前記走査位置に応じて前記レーザ光源を正弦波状波形の１／ｎ乗の駆動信号を用いて制御することにより、前記照明光の強度変化が正弦波状波形の１／ｎ乗となるように制御することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡。
【請求項４】
前記制御部は、前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像から演算により前記標本の画像を生成することを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項５】
前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させることにより照明縞パターンの位相が変化した照明状態で取得した複数の画像であることを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項６】
前記照明光の前記正弦波状波形の位相を変化させた照明状態で取得した複数の画像は、前記照明光の前記正弦波状波形の位相を走査ライン毎に変化させることにより照明縞パターンが回転した照明状態で取得した複数の画像であることを特徴とする請求項４に記載の走査型顕微鏡。
【請求項７】
前記制御部は、
前記強度変調の１周期分のデータを記憶する駆動波形テーブルと、
前記駆動波形テーブルのプリセット値として指定された位置を開始位置として、前記データを循環読み出しするカウンタと、を有し、前記照明状態に応じて前記プリセット値を設定して読み出した前記データにより前記正弦波状波形を制御することを特徴とする請求項４〜６のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【請求項８】
前記標本を介して前記照明光学系に対向する位置に配置され、前記標本を透過した前記照明光を検出する検出部をさらに有することを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１３−８００２４（Ｐ２０１３−８００２４Ａ）
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２１８８３９（Ｐ２０１１−２１８８３９）
【出願日】平成２３年１０月３日（２０１１．１０．３）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月２日（２０１３．５．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月３日（２０１１．１０．３）
【出願人】（０００００４１１２）株式会社ニコン (12,601)
【Ｆターム（参考）】
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