超耐熱性アガロ―ス分解酵素
【課題】融点が６０℃以上のアガロース、特に融点が７０〜８０℃のアガロースを工業的に分解し得るアガロース分解酵素を提供する。
【解決手段】寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上である、アガロース分解酵素。
【解決手段】寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上である、アガロース分解酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な耐熱性のアガロース分解酵素およびその利用、該アガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびその利用、該アガロース分解酵素の製造方法、ならびに該アガロース分解酵素を生産する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
寒天は、テングサ、オゴノリ等の紅藻類から得られる多糖類であり、その主成分はアガロースである。寒天中にはアガロースに硫酸、硫酸ピルビン酸等がエステル結合したアガロペクチンと総称される多糖も少量存在している。
【０００３】
アガロースをアガロース分解酵素の一種であるβ−アガラーゼにより加水分解することによりネオアガロオリゴ糖が得られる。ネオアガロオリゴ糖は、デンプン老化防止作用が強いこと、加熱処理により静菌作用を生じること、低カロリーであること等の面から食品分野で高機能性食品の原料として有用である。また、海藻成分をβ−アガラーゼにより加水分解して得られるオリゴ糖には免疫機能活性化機能や、肌への美白、保湿効果が認められている。さらに、アガロース分解酵素を用いて海藻類の強固な細胞組織を分解し、生理活性物質を抽出したり、あるいは該酵素を用いて作成したプロトプラストを利用して海藻の有用品種の開発をすることは未開発の海洋生物資源の新たな有効利用として期待されている。
【０００４】
アガロース分解酵素としては、たとえば、本発明者らによって見出されたアガロース分解酵素が知られている（特許文献１を参照）。特許文献１に記載の酵素は、５４℃で３０分間の熱処理を行っても活性が残存することから、寒天の高温下での迅速分解を実現でき、産業上有利に利用することができる。
【０００５】
この他にも、至適温度が６０℃付近にあるアガロース分解酵素が特許文献２および３に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０９０１２７号パンフレット
【特許文献２】特開平７−２５５４７５号公報
【特許文献３】特再公表２００２−０６８６５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、アガロースとしては種々のものがあり、融点が６０℃以上であるものは少なくない。また、酵素の性質として、至適温度の範囲が広く、その至適温度の高温域で安定性が認められるものは、工業上安定して利用され得る。
【０００８】
そこで、本発明は、融点が６０℃以上のアガロース、特に融点が７０〜８０℃のアガロースを工業的に分解し得るアガロース分解酵素を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。また、これに関連して、該アガロース分解酵素の利用、該アガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびその利用、該アガロース分解酵素の製造方法、ならびに該アガロース分解酵素を生産する微生物を提供することもまた、発明が解決しようとする課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、これまでアガロース分解酵素の産生可能性について注目されていなかったハロコッカス属微生物が耐熱性のアガロース分解酵素を産生し得ることを見出した。また、本発明者らが取得することに成功したハロコッカス属微生物であるハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） 197A（受領番号：FERM ABP-11336）は、至適温度の範囲として７０〜８０℃を含み、かつ、この温度範囲において安定性が認められる新規の耐熱性アガロース分解酵素を生産し得るものであった。本発明は、これらの知見や成功例に基づき、完成された発明である。
【００１０】
したがって、本発明によれば、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上である、前記アガロース分解酵素が提供される。
【００１１】
好ましくは、分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５４，０００〜５８，０００、または、ゲルろ過法では５３，０００〜５７，０００である。
好ましくは、一価陽イオンとして、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＬｉ＋を要求する。
好ましくは、至適ｐＨが５．５〜７．０である。
好ましくは、ハロコッカス属微生物由来の酵素である。
好ましくは、前記ハロコッカス属微生物がハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）である。
【００１２】
本発明の別の態様として、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上であり、かつ、
以下（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、前記アガロース分解酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００１３】
好ましくは、前記アミノ酸配列が配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列である。
【００１４】
本発明の別の態様として、本発明のアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
好ましくは、前記塩基配列が以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列である。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
【００１６】
好ましくは、前記塩基配列が配列表の配列番号９に記載の塩基配列である。
【００１７】
本発明の別の態様として、本発明のポリヌクレオチドを有する組換えベクターが提供される。
【００１８】
本発明の別の態様として、本発明の組換えベクターにより形質転換された微生物が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様として、本発明の微生物を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様として、ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様として、本発明の製造方法により得られる、アガロース分解酵素が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様として、ＤＮＡを含有したアガロースゲルに、本発明のアガロース分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを含む、アガロースゲル中のＤＮＡの回収方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様として、本発明のアガロース分解酵素、
ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、および
ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液
を含む、アガロースゲル中のＤＮＡを回収するためのキットが提供される。
【００２４】
本発明の別の態様として、ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）が提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のアガロース分解酵素によれば、融点が６０℃以上のアガロース、特に融点が７０〜８０℃のアガロースを分解することができる。特に、本発明のアガロース分解酵素は、８０℃での温度安定性を有するものであるため、８０℃という高温条件下で寒天からの安定したネオアガロオリゴ糖の工業生産を可能とする。
【００２６】
本発明のアガロース分解酵素の製造方法および本発明のポリヌクレオチドや微生物を利用したアガロース分解酵素の製造方法によれば、生産物であるアガロース分解酵素が耐熱性を有することから、アガロース分解酵素を工業的に安定して生産できる。
【００２７】
本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法によれば、従来のアガロース分解酵素と比べて回収率を向上させたアガロースゲル電気泳動後の核酸抽出が実施できる。この用途のために、本発明のキットは、遺伝子解析関連試薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】アガラーゼ生産菌が形成した分解斑を示した図である。寒天分解活性をヨウ素液で検出し、寒天の分解によって還元糖が生じた部分を非染色領域として検出している。
【図２】アガラーゼ生産菌と既知近縁種との近隣結合系統樹を示した図である。括弧内はアクセッション番号を示す。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量解析を示した図である。Ｍは分子量マーカー。（Ａ）はハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） １９７Ａ株が生産するアガラーゼを示す。
【図４】アガラーゼ活性に対するＮａＣｌ濃度の影響を示した図である。ＮａＣｌ濃度３．４Ｍにおける活性を１００％とした相対活性でプロットしてある。
【図５】アガラーゼ活性に対するＫＣｌとＬｉＣｌ濃度の影響を示した図である。ＮａＣｌ濃度３．４Ｍにおける活性を１００％とした相対活性でプロットしてある。■ＫＣｌおよび◆ＬｉＣｌ。
【図６】アガラーゼ活性に対する温度の影響を示した図である。７０℃における活性を１００％とした相対活性でプロットしてある。
【図７】アガラーゼの温度安定性を示した図である。各温度で０−６０分間加熱処理したときの残存活性。■７０℃、◆８０℃、▲９０℃および●９５℃。
【図８】アガラーゼ活性のｐＨ依存性を示した図である。測定結果はｐＨ ６．８のリン酸ナトリウム緩衝液を１００％とした相対活性でプロットしてある。■クエン酸緩衝液、◆ＭＥＳ緩衝液、▲リン酸ナトリウム緩衝液、●グリシルグリシン緩衝液および−ＴＡＢＳ緩衝液。
【図９】アガラーゼ分解産物のＴＬＣ解析を示した図である。１、２２：ネオアガロ６糖。２、２１：ネオアガロ４糖。３、２０：ガラクトース。４−８：ＪＡＭＢ−Ａ３３由来α−アガラーゼ分解産物（０、２、４、８、１６時間）。９−１４：１９７Ａ株由来アガラーゼ分解産物（０、１、２、４、８、１６時間）。１５−１９：ＪＡＭＢ−Ａ９４株由来β−アガラーゼ分解産物（０、２、４、８、１６時間）。
【図１０】ゲノムシークエンスにより取得したリード配列の長さと数を示した図である。
【図１１】新規アガラーゼの遺伝子配列とアミノ酸配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の詳細について説明する。
［１］本発明のアガロース分解酵素
本発明のアガロース分解酵素は、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素である。本発明のアガロース分解酵素は、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間、より好ましくは３０分間、さらに好ましくは６０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上（以下、高温条件下の残存活性ともいう）である。
【００３０】
本明細書において「アガロース分解酵素」とは、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有する酵素をいう。アガロース分解酵素の該活性は、アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する活性であるものと推測される。そこで、本明細書では、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を「アガラーゼ活性」ともいう。
【００３１】
本発明のアガロース分解酵素は、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。本発明のアガロース分解酵素の好ましい態様はエンド型β−アガラーゼである。
【００３２】
本発明のアガロース分解酵素は、研究用試薬として、アガロースゲルにアプライしたＤＮＡを電気泳動後にゲルから回収する方法等に使用することができる。さらに、藻類、特に紅藻類からのプロトプラストの製造や有用物質の抽出等の用途に使用することができる。
【００３３】
本発明のアガロース分解酵素のアガラーゼ活性は、特に別段の記載がない限り、ＤＮＳ法（Ｄｉｎｉｔｒｏ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ法）による還元糖の定量により、実施例の第２ １．［１］に記載の通りに測定する。概略すると、まず、アガロース基質溶液９００μｌと酵素液１００μｌとの混合溶液を７５℃、１５分間で反応させる。次いで反応後の混合溶液に１ｍｌのＤＮＳ試薬を加えて混合した反応液を、１００℃、５分間の加熱により発色させる。次いで発色させた反応液を室温まで冷却した後、４ｍｌの蒸留水を加えて希釈し、分光光度計により波長５３５ｎｍの吸収を測定する。１分間に１μｍｏｌのガラクトースに相当する還元糖を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義する。
【００３４】
本明細書において「至適温度」とは、アガラーゼ活性測定において、アガロース基質溶液と酵素液との混合溶液を反応させる温度を変化させた場合に、その温度を７０℃に設定したときのアガラーゼ活性を１００％として、８０％以上の相対活性が観測された温度をいう。
【００３５】
本発明のアガロース分解酵素について、高温条件下の残存活性を測定する際は、アガラーゼ活性測定に用いる酵素液を２分割し、一方を８０℃で所定の期間の高温条件下に曝した後にアガラーゼ活性測定に供し、他方を該高温条件下に曝すことなくアガラーゼ活性測定に供する。
【００３６】
本発明のアガロース分解酵素は、至適温度および高温条件下の残存活性が上記した通りのものであれば特に制限されないが、たとえば、分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５４，０００〜５８，０００、または、ゲルろ過法で５３，０００〜５７，０００であり；一価陽イオンとしてＮａ＋、Ｋ＋またはＬｉ＋を要求し；および、至適ｐＨは５．５〜７．０である。ただし、「至適ｐＨ」とは、アガラーゼ活性測定において、アガロース基質溶液の緩衝液をクエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン緩衝液またはＴＡＢＳ緩衝液としてｐＨを変化させた場合に、そのｐＨを６．０（ＭＥＳ緩衝液）に設定したときのアガラーゼ活性を１００％として、８０％以上の相対活性が観測されたｐＨをいう。
【００３７】
本発明のアガロース分解酵素は、上記したアガラーゼ活性、至適温度および高温条件下の残存活性の他、分子量、一価陽イオン要求性および至適ｐＨなどを指標として、種々の微生物、たとえば、ハロコッカス属（Halococcus sp.）微生物の生産物を分析および評価することにより採取することが可能である。
【００３８】
本発明のアガロース分解酵素を生産する微生物を取得する方法は特に制限されないが、たとえば、天日塩サンプル、好ましくは高度好塩菌の存在が確認できた天日塩サンプルから、アガラーゼを生産する古細菌を探索することにより取得できる。アガラーゼ生産菌の探索用培地としては種々のものが使用できるが、好ましいのは実施例の表１に示した固体寒天培地である。アガラーゼ生産菌の存在は、たとえば、固体寒天培地の寒天の分解によって生じる凹みを目視で観察することにより検出できる。次いで、陽性の可能性がある株については、たとえば、固体寒天培地にルゴール液をかけて染色し、寒天の加水分解で生じた還元糖による非染色領域を形成せしめたものをアガラーゼ生産菌として取得できる。菌株を単離する方法は特に制限されないが、たとえば、画線法と限界希釈法により純粋培養株とすることができる。このようにして取得したアガラーゼ生産菌の中から、本発明のアガロース分解酵素を生産する微生物を取得できる。
【００３９】
本発明のアガロース分解酵素を生産するハロコッカス属微生物として好ましいのは、後述する本発明の微生物であるハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） 197Aである。
【００４０】
本発明のアガロース分解酵素の具体的な態様は、アガラーゼ活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、
８０℃で１０分間、好ましくは３０分間、より好ましくは６０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上であり、かつ、
以下（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、前記アガロース分解酵素である。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００４１】
上記（１）のアミノ酸配列は、後述する実施例に記載の５０２アミノ酸からなる。
【００４２】
上記（２）のアミノ酸配列の「１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入」における「１から複数個」の範囲は、上記（２）のアミノ酸配列を含むアガロース分解酵素について、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後のアガラーゼ活性が、該高温条件下に供する前のアガラーゼ活性と比べて８０％以上であれば特に限定されないが、たとえば、１から２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、より好ましくは１、２、３、４、５、６または７個、さらに好ましくは１、２、３、４または５個、特に好ましくは１、２または３個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基が欠落もしくは消失していること、「アミノ酸の置換」とは配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていること、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が付け加えられていること、および「アミノ酸の挿入」とは配列中のアミノ酸残基の間に別のアミノ酸残基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００４３】
「１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入」の具体的な態様としては、１から複数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。たとえば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４４】
上記（３）のアミノ酸配列は、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後のアガラーゼ活性が該高温条件下に供する前のアガラーゼ活性と比べて８０％以上であるアガロース分解酵素を構成するものとして、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の相同性（同一性ともいう）、好ましくは９３％以上の相同性、より好ましくは９５％以上の相同性、さらに好ましくは９７％以上の相同性、なおさらに好ましくは９９％以上の相同性があるアミノ酸配列をいう。アミノ酸配列の相同性を求める方法は特に制限されないが、たとえば、通常知られる方法を利用して、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と対象となるアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を計算することにより求められる。
【００４５】
本発明のアガロース分解酵素の好適な具体的態様は、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するアガロース分解酵素である。配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列は５２９アミノ酸からなり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端側にシグナル配列を有するものである。
【００４６】
本発明のアガロース分解酵素を取得する方法は特に制限されるものではなく、上記したスクリーニング法以外にも、たとえば、本発明のアガロース分解酵素の製造方法により製造してもよいし、配列表の配列番号１の記載を参照して物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に本発明のポリヌクレオチドから作成してもよいし、本発明の微生物から培養工学的に製造してもよい。
【００４７】
本発明のアガロース分解酵素を用いた寒天由来オリゴ糖の製造としては、特に限定はされないが、たとえば、次に示す手順を用いることができる。アガロース、寒天等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合、α−１，３結合した骨格を持つ多糖類または同様の骨格を有するオリゴ糖を含む藻類の破砕または抽出物に、本発明のアガロース分解酵素を混ぜ、ｐＨ５．５〜７．０、６０〜８０℃の範囲で保温することで寒天由来オリゴ糖等のオリゴ糖を生成できる。
【００４８】
本発明のアガロース分解酵素を用いた、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を持つ多糖類を細胞組織成分に有する藻類を原料としたプロトプラストの製造は、特に限定はされないが、たとえば、以下の手順で実施することができる。供試海藻を０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でパパインを作用させる。その後０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、４０μｍのナイロンメッシュでろ過洗浄し、洗浄した葉体をナイフで数ミリ片に裁断する。裁断片を本発明酵素と市販のセルラーゼオノズカＲＳならびに、マイセロチームＲ−１０、それに０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）（塩化ナトリウム含有）中で振とうすることによって、プロトプラストを得ることができる。
【００４９】
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドの好ましい態様は、たとえば、以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
【００５０】
上記（ａ）の塩基配列は、後述する実施例に記載の１５０９ｂｐからなる塩基配列である。
【００５１】
上記（ｂ）のポリヌクレオチドの塩基配列における「１から複数個の塩基の欠失、置換、付加および／または挿入」における「１から複数個」の範囲は、該塩基配列が、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後のアガラーゼ活性が、該高温条件下に供する前のアガラーゼ活性と比べて８０％以上であるアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードするものであれば特には限定されないが、たとえば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、さらに好ましくは１、２、３、４または５個、特に好ましくは１、２または３個程度を意味する。また、「塩基の欠失」とは配列中の塩基が欠落もしくは消失していること、「塩基の置換」とは配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていること、「塩基の付加」とは塩基が付け加えられていること、および「塩基の挿入」とは配列中の塩基の間に別の塩基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００５２】
上記（ｃ）のポリヌクレオチドについての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）または、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons
(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５３】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、たとえば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、たとえば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、たとえば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性（同一性ともいう）を有するポリヌクレオチドが挙げられ、たとえば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。塩基配列の相同性を求める方法は特に制限されないが、たとえば、通常知られる方法を利用して、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と対象となる塩基配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を計算することにより求められる。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドの好適な具体的態様は、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。配列表の配列番号９に記載の塩基配列は１５９０ｂｐからなり、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の５’末端側にシグナル配列をコードする塩基配列を有するものである。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドの取得方法は特に限定されない。たとえば、本明細書中の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列および配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてハロコッカス属微生物やその他の微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の情報を基に化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に通常知られる任意の方法で作製することができる。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律増殖可能なベクターを含んでなり、本発明のポリヌクレオチドを入手できれば、通常知られる組換えＤＮＡ技術により調製することができる。たとえば、本発明のポリヌクレオチドを自律増殖可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、この菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取する。
【００５８】
［３］本発明の組換えベクター
本発明のポリヌクレオチドは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、たとえば、自律的に複製することが可能なベクター（たとえばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞の染色体に組み込まれ、染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のポリヌクレオチドは、転写に必要な要素（たとえば、プロモーター等）と機能的に連結される。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
また、自律的に複製することが可能なベクターの具体例としては、ｐＥＴ２１ａ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＣＲ２．１、ｐＬＥＸ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７、ｐＴＡ２等のプラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５等のファージベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、ｐＥＴ２１ａ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、ｐＣＲ２．１およびｐＴＡ２が好適であり、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１およびφ１０５が好適である。ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００６０】
作動可能なプロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中において機能することができるプロモーターであれば特に制限されないが、たとえば、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）などのプロモーターやｔａｃプロモーターを挙げることができ；枯草菌においてはバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）のキシロシダーゼ遺伝子などのプロモーターを挙げることができ；酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ガラクトシダーゼ遺伝子（ＧＡＬ）、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）などのプロモーター、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどを挙げることができ；カビではα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）、セロビオハイドロラーゼＩ遺伝子（ＣＢＨＩ）などのプロモーター、ＡＤＨ３プロモーター、ｔｐｉＡプロモーターなどを挙げることができ；哺乳動物細胞では、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、アデノウイルス２主後期プロモーターなどを挙げることができ；昆虫細胞では、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーターなどを挙げることでき、その他としてはファージ・ラムダのＰRプロモーター、ＰLプロモーターなどを挙げることができる。
【００６１】
本発明の組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、たとえば、薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカーを使用することができる。選択マーカーの具体例としては、使用する宿主細胞が細菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシ耐性遺伝子などであり、酵母の場合はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子、トリプトファン合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン合成遺伝子（ＬＥＵ２）などがあり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）などが挙げられる。
【００６２】
本発明の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドによって転写されるタンパク質の発現に必要なＤＮＡ配列、たとえばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、分泌シグナル配列、ターミネーターなどを適当な順で連結していることことが好ましい。本発明の組換えベクターを構築する方法や本発明の組換えベクターを宿主に挿入する方法は当業者に通常知られるものである。
【００６３】
［４］本発明の形質転換体
本発明の組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、本発明の形質転換体とは、本発明の組換えベクターにより形質転換された微生物をいう。
【００６４】
本発明の組換えベクターが導入される宿主細胞は、宿主−ベクター系が確立されているものであればいずれも利用可能であり、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、枯草菌または放線菌等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法等により行えばよい。
【００６５】
本発明の形質転換体を製造する上で好ましい宿主−ベクター系としては、たとえば、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ−１０１（ＴａＫａＲａ）−ＴＡクローニング用ベクターｐＴＡ２が挙げられる。
【００６６】
本発明の形質転換体を用いて、本発明のアガロース分解酵素を得ることができる。たとえば、本発明の形質転換体を適当な条件で培養し、得られた培養液から一般的な方法によって酵素の分取や精製を行うことにより本発明のアガロース分解酵素を得ることができる。
【００６７】
［５］本発明のアガロース分解酵素の製造方法
本発明のアガロース分解酵素の製造方法は、本発明の形質転換体またはハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）（以下、これらを酵素生産微生物ともいう）を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む。具体的には、酵素生産微生物を常法にしたがって適当な培地に接種して適切な条件下で培養し、得られた培養物からアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法である。
【００６８】
本発明のアガロース分解酵素の製造方法は、大別すると、（ａ）酵素生産微生物を培養して、アガロース分解酵素含有培養物を得る工程、および（ｂ）該培養物からアガロース分解酵素を採取する工程の二つの工程に分けられる。
【００６９】
培養に用いる栄養培地としては、酵素生産微生物が増殖し得る培地を広く使用できる。酵素生産微生物の培養に際して、微生物増殖用とアガロース分解酵素生産用の二種類の培地を用いてもよい。この場合、アガロース分解酵素生産用の培地には、寒天またはアガロース、寒天分解物等を炭素源として含むことが望ましい。寒天、アガロースは、市販のもの、あるいは加工、精製される前の紅藻類を単独、併用して用いることができる。寒天またはアガロースの濃度は、０．１〜１．５％が好ましい。酵素生産微生物を培養して得た培養物をそのまま粗酵素として用いる場合、培地調製において、ｐＨ、一価塩その他酵素活性に影響する要因には注意を要する。
【００７０】
培養法としては液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）が好ましく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。酵素生産微生物がハロコッカス属微生物である場合の培養は、通常、温度２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で好気的に実施する。培養時間はハロコッカス属微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは数時間〜数日間であり、さらに好ましくは所望のアガラーゼ活性が最大値に達成する時間までである。菌体増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養、灌流培養など、いずれを用いてもよい。
【００７１】
上記のようにして培養して得られた培養物から、アガロース分解酵素を採取する。アガロース分解酵素の採取法は、一般の酵素の採取の手段に準じて実施することができる。たとえば、固液分離などの通常知られる手段によって細胞を除いた後に培養上清を粗酵素として用いることができる。固液分離には、通常知られる方法を制限なく利用することができ、たとえば、培養物を遠心分離する方法、培養物に濾過助剤を加えることや濾過助剤をプレコートしたプレコートフィルターなどにより濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する方法などが採用される。
【００７２】
粗酵素は、そのままで使用することもできるが、精製して使用することが好ましい。たとえば、ここに挙げるものに限定されるものではないが、得られた粗酵素を、熱処理などの耐熱性の差を利用する方法；透析、限外ろ過、レジンカラム、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法；塩沈澱、硫安沈殿、アルコール沈殿およびその他の溶媒沈澱などの溶解性の差を利用する方法；ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂などを用いるイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；ブチルトヨパール樹脂などを用いる疎水クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；吸着クロマトグラフィーなどの物理化学的な吸着性の差を利用する方法；等電点電気泳動および等電点クロマトグラフィーなどの等電点の差を利用する方法といった通常知られる方法を単独または組み合わせて供することにより、精製酵素を調製できる。
【００７３】
粗酵素および精製酵素は、固定化することもできる。たとえば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを採用することができる。
【００７４】
本発明のアガロース分解酵素の製造方法によって得られるアガロース分解酵素は、本発明のアガロース分解酵素の別の態様として提供される。
【００７５】
［６］本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法
本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法は、ＤＮＡを含有したアガロースゲルに、本発明のアガロース分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを含む。本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法の具体例としては、特に制限されないが、次の方法が挙げられる。ＤＮＡを電気泳動で分画後、目的のＤＮＡ断片含むアガロースゲル断片に本発明のアガロース分解酵素を加えて、溶解する。溶解後、必要であればＤＮＡ断片を含む溶液を、たとえば、フェノール処理、エタノール沈澱、カラムや樹脂を使用した精製等の精製方法を単独、あるいは併用して精製することも可能である。
【００７６】
［７］本発明のキット
本発明のキットは、本発明のアガロース分解酵素、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、およびｐＨ５．５〜７．０の緩衝液を含む、アガロースゲル中のＤＮＡを回収するためのキットである。ナトリウム塩、カリウム塩およびリチウム塩としては特に制限されないが、たとえば、塩化物やフッ化物などのハロゲン化物などが挙げられる。ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液としては、特に制限されないが、たとえば、ｐＨ５．５〜７．０のＭＥＳ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン緩衝液などが挙げられる。
【００７７】
本発明のキットは、本発明のアガロース分解酵素、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、およびｐＨ５．５〜７．０の緩衝液がそれぞれ個別に包装されていてもよく、それらが混合した状態で存在していてもよい。
【００７８】
本発明のキットの構成成分のアガロースゲルへの添加順序は特に制限されないが、それぞれ個装されている場合には、ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩および本発明のアガロース分解酵素の順に添加することが好ましい。
【００７９】
［８］本発明の微生物
本発明の微生物は、本発明の酵素を生産し得るハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） 197A（受領番号：FERM ABP-11336）に関する。このハロコッカス・スピーシーズ 197Aは、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に２０１１年１月２７日付けで受領番号：FERM ABP-11336として寄託されている。
【００８０】
Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株は２５％のＮａＣｌを含む寒天培地上で、直径が１〜２ｍｍ、橙色〜赤色のコロニーを形成した。液体培養した細胞は直径０．８〜２．０μｍの球形を呈した。本菌株は濃度０．５％のＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）とＣａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）を栄養源として、ＮａＣｌ濃度２５％、ｐＨ７の条件下で極めて良好に増殖した。
【００８１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００８２】
第１ アガラーゼ生産菌の探索
１．実験方法
［Ｉ］アガラーゼの探索
天日塩から、アガラーゼを生産する微生物を探索した。用いた培地組成は表１に示した。培地のｐＨは１Ｎ ＫＯＨ溶液あるいは１Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ ７に調製した後、１２１℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を行って調製した。天日塩１ｇを１Ｍ ＮａＣｌ溶液３ｍｌに溶解し、プレート１枚につき５００μｌを塗布した後、３７℃で培養した。
【表１】
【００８３】
［ＩＩ］１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列による系統解析
（１）粗精製ゲノムＤＮＡの抽出
対数増殖期後期まで培養した培養液から８０００×ｇ、３分間の遠心により菌体を回収した。培養液５ｍｌから回収した菌体ペレットを２００μｌのＳＴ緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）に再懸濁した後、２００μｌのＬＳ緩衝液（１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０、０．２％ ＳＤＳ）を加えて転倒混和した。１０分間静置した後、２．６ｍｌの滅菌蒸留水を加えて転倒混和した。調製した溶菌液に６ｍｌのエタノールを重層し、ガラス棒で界面をかき混ぜながら長鎖ＤＮＡを巻き取って回収した。回収したＤＮＡは７０％ エタノール溶液で２度洗浄し、風乾の後で適量の滅菌蒸留水に再溶解した。調製したＤＮＡ溶液は−２０℃で保存した。
【００８４】
（２）ＰＣＲによる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅
ゲノムＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。プライマーセットは配列表の配列番号３および４に示した。
【００８５】
（３）アガロース電気泳動
増幅したＤＮＡ断片を１．１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いた電気泳動によって分析および分離精製を行った。泳動用緩衝液にはＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、２０ｍＭ 酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた。分子量マーカーにはＨｉ−Ｌｏ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（アートケム）を用い、ＤＮＡ溶液は４×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと混合してゲルにセットした。１００Ｖ、３０ｍｉｎの電気泳動の後、エチジウムブロマイド溶液に浸漬してＤＮＡを染色し、波長３６５ｎｍのＵＶライトを照らしてＤＮＡのバンドを確認した。ＵＶライト照射下でＤＮＡのバンドを切り出し、ＤＮＡのゲル抽出精製に供した。精製にはＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
【００８６】
（４）ＴＡクローニングおよび形質転換
精製したＰＣＲ産物はＴＡクローニング用ベクターｐＴＡ２（ＴＯＹＯＢＯ ＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ）に連結した後、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ−１０１（ＴａＫａＲａ）を形質転換した。形質転換体の検出には１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ（ＤＩＦＣＯ）寒天培地 を用い、３４℃で１６時間培養した。同寒天培地上にコロニーを形成した株をプラスミド抽出に供した。
【００８７】
（５）プラスミドＤＮＡの抽出
１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地（ＤＩＦＣＯ）で１８０ｒｐｍ、３７℃、１６時間培養した形質転換体をプラスミドＤＮＡの抽出に用いた。培養液を１２０００×ｇ、１分間の遠心で集菌し、菌体ペレット中からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００８８】
（６）塩基配列の解析
調製したＤＮＡサンプルについて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖｅｒ． ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンス反応を行った。使用したプライマーは配列表の配列番号５および６に示した。反応産物の精製にはＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。得られた試料は真空引きしたデシケータ−内で完全に乾燥させた後、Ｈｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に再溶解し、９８℃で３分間、次いで４℃で３分間の熱処理を施して、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた配列解析に供した。
【００８９】
（７）塩基配列の結合編集および相同性検索
シークエンス解析の結果はＡＴＧＣ Ｖｅｒ．６（ＧＥＮＥＴＹＸコーポレーション）を用いて結合編集した後、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用いて既知１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列との相同性検索を行い、近縁種を推定した。
【００９０】
（８）系統樹の作成
分離株と、既知近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列データをＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ． １０（ＧＥＮＥＴＹＸコーポレーション）を用いてＦＡＳＴＡフォーマットに変換し、ＣｌｕｓｔａｌＸ Ｖｅｒ．２を用いてＭｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｍｅｎｔｓを行った。出力ファイルから近隣結合法を用いて系統樹を作成した。この時、ブートストラップ値は１０００として枝分岐の信頼度を計算した。
【００９１】
２．実験結果
（１）アガラーゼ活性の検出
アガラーゼ生産菌は、寒天の分解によって生じる寒天培地の凹みを目視で観察して検出した。陽性と疑われた株についてはルゴール液をかけて寒天を染色し、寒天の加水分解で生じた還元糖による非染色領域を形成したものをアガラーゼ生産菌として取得した（図１）。菌株は画線法と限界希釈法により純粋培養株とし、アガラーゼ生産菌１９７Ａ株（受領番号：FERM ABP-11336）を分離した。
【００９２】
（２）アガラーゼ生産菌の系統解析
取得した１９７Ａ株からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて増幅した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行った。決定した配列を用いてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムにより既知近縁種を推定し、系統樹を作成した（図２）。本解析の結果、１９７Ａ株は既知近縁種と９９％以下の相同性を示し、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓの近縁種であることが判った。
【００９３】
第２ Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株が生産するアガラーゼの性質解析
１．実験方法
［Ｉ］アガラーゼ活性の定義
アガラーゼ活性の測定はＤＮＳ法（Ｄｉｎｉｔｒｏ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ法）による還元糖の定量によって行った。反応液の組成はアガロース基質溶液（表２；いずれも終濃度）９００μｌ、酵素液１００μｌとし、反応条件は７５℃、１５分間とした。反応後の溶液に１ｍｌのＤＮＳ試薬（表３；１Ｌ当り）を加えて混合して１００℃、５分間の加熱により発色させた。反応液は室温まで冷却した後、４ｍｌの蒸留水を加えて希釈し、分光光度計により波長５３５ｎｍの吸収を測定した。１分間に１μｍｏｌのガラクトースに相当する還元糖を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【表２】
【表３】
【００９４】
［ＩＩ］アガラーゼの生産と精製
アガラーゼ生産菌はＨｃｃ培地（１Ｌ当りの組成）（表４）で培養し、酵素生産の誘導にはＨｃｃ−Ｓａｌｔ培地（１Ｌ当りの組成）（表５）を用いた。
【表４】
【表５】
【００９５】
定常期まで培養したＨａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株をＨｃｃ培地に１％植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。Ｏ．Ｄ．６００を経時的にモニターし、対数増殖期中期まで培養した後、無菌的に８０００×ｇで遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体は培養に用いたＨｃｃ培地と同量のＨｃｃ−Ｓａｌｔ培地に再懸濁し、１２０ｒｐｍ、３７℃で３日間の酵素生産を行った。誘導の後、８０００×ｇで１５分間の遠心操作により、菌体と培養上清を分離した。これより以後の操作は全て４℃で実施した。得られた培養上清にＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液を終濃度５ｍＭ加え、次いでＮａＣｌを飽和するまで溶解し、３０％ ＮａＣｌを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０（東ソー、２．５×１５ｃｍ）に供した。平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄し、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０溶液を含む５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．５および０Ｍ ＮａＣｌ溶液で段階的にタンパク質の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を回収し、再び飽和するまでＮａＣｌを溶解した後、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０カラム（１×１０ｃｍ）に供した。タンパク質の溶出は５〜０ＭのＮａＣｌ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０）を用いた直線濃度勾配により行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を回収し、２．５Ｍ ＮａＣｌを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液に透析し、得られた酵素液をその後の性質解析実験に用いた。
【００９６】
［ＩＩＩ］分子量測定
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
遠心式限外ろ過濃縮カラム（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３ｋＤａ）を用いて酵素液を濃縮した後、微量透析器 （トミー精工、ＥａｓｙＳｅｐ ＭＤ−００３）を用いて５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液に透析を行った。透析済のサンプル溶液を再度限外ろ過濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−ＰｏｌｙＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｐｈｏｒｅｓｉｓ）に供した。分離用ゲルには５〜２０％の濃度勾配ゲル（和光純薬、ＳｕｐｅｒＳｅｐ ５−２０％）を用い、プレシジョンＰｌｕｓデュアルスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ、１０−２５０ｋＤａ）を分子量マーカーとして分子量を解析した。電気泳動後のゲルは蒸留水でＳＤＳを除去した後、ＣＢＢにより染色し、タンパク質を検出した。
【００９７】
（２）ゲル濾過クロマトグラフィー
濃縮した酵素溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ＧＥヘルスケア）カラムによる分子量解析に供した。移動相には５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７を含む３．５Ｍ ＮａＣｌ溶液 （１．５ ｍｌ／ｍｉｎ）を用い、制御および検出装置にはＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥヘルスケア）を使用した。分子量は同条件で解析したリボヌクレアーゼ（１４．８ｋＤａ）、オブアルブミン（４３．５ｋＤａ）、アルブミン（６１．３ｋＤａ）、アルドラーゼ（１７６ｋＤａ）、カタラーゼ（２１９ｋＤａ）のリテンションタイムから計算した。
【００９８】
［ＩＶ］アガラーゼ配列の解析
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析したゲルをＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてポアサイズ０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に転写した。転写膜はＣＢＢ染色によりタンパク質を染色して可視化した後、メタノールを含む脱色液で洗浄して不要なＣＢＢを除去した。風乾により乾燥した膜から目的のバンドをカッターナイフで切り出してＮ末端アミノ酸配列解析の試料とした。解析システムにはＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣアミノ酸シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、１５サイクルのエドマン分解とアミノ酸分析を行った。
【００９９】
（２）ゲノムシークエンスの解析
アガラーゼ遺伝子の取得を目的とし、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株のゲノム遺伝子配列を決定した。解析装置にはＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、７０Ｍｂｐ程度のデータ取得を目標とした。本シークエンス解析装置は１フラグメント当たりの読み取り塩基長が４００ｂｐ程度に設定されており、データ取得後の配列結合解析が容易なことから、Ｄｅ ｎｏｖｏ解析に有効である。
【０１００】
まず、対数増殖基中期まで培養した菌体をＳＤＳおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを用いた定法により溶菌し、ＲＮａｓｅ処理した後、ＰＣＩ抽出とエタノール中でのスプーリングによって高分子ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは３００−８００ｂｐに断片化処理し、３’末端と５’末端に特異的に結合する２種類のアダプターを結合・反応させて最終的に１本差ＤＮＡとし、アダプターを介して１つずつビーズに結合させた。各ビーズは油水エマルジョン中に包み込むことでマイクロリアクターを形成し、アダプターの塩基配列を利用したｅｍＰＣＲによりフラグメント配列を増幅した。増幅反応後に油水エマルジョンを破壊してビーズを回収し、シークエンス解析に用いた。
【０１０１】
２．結果
［Ｉ］酵素の精製
Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株が生産するアガラーゼはカラムクトマトグラム技術を用いて精製した。精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によりゲル上で単一のバンドを形成する事を確認し、このとき分子量は約５６ｋＤａと見積もられた（図３）。また、ゲルろ過クロマトグラフィー分析では、約５５ｋＤａに相当する位置にタンパク質に由来する波長２８０ｎｍの吸収ピークが現れた。回収したフラクション中のアガラーゼ活性のピークは、同ピークと一致した。
【０１０２】
精製酵素は０．３％ アガロース（ナカライテスク、Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥ）溶液（３．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ ６．８）を基質としたとき、７５℃、１５分間の測定条件下で、約２ｕｎｉｔ（酵素１ｍｇ当たり、１分間にガラクトース２μｍｏｌに相当する還元糖を生成）に相当するアガラーゼ活性を示した。
【０１０３】
［ＩＩ］酵素学的解析
（１）基質特異性
寒天はアンヒドロガラクトースとガラクトースを基本単位とした天然高分子であるが、原料とする海藻の種類や、採集地域、製法により、最終製品中のアンヒドロガラクトースや硫酸基の含有量が異なる。これらは寒天溶液の粘度やゲル強度等の物理化学的性質を決定する要素であるが、酵素学的には基質として不均質な状態と見なす事ができる。そこでＨａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株が生産するアガラーゼの基質として最適な寒天を検討した。表６に、Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥに対する活性を１００％とした各基質の相対活性を示す。基質溶液は終濃度３．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのｐＨ ６．８リン酸カリウム緩衝液をベースとし、各基質を０．３％加えて調製した。
【０１０４】
試験した基質
Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥ（ナカライテスク）、Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ（ニッポンジーン）、Ａｇａｒｏｓｅ ＬＥ（ナカライテスク）、Ａｇａｒ Ｎｏｂｌｅ（ＤＩＦＣＯ）、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）、Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、Ａｇａｒ（ＷＡＫＯ）。
【表６】
【０１０５】
（２）塩濃度依存性
ＮａＣｌ濃度を０−５．０Ｍに調製した基質溶液を用いて、アガラーゼ活性のＮａＣｌ濃度依存性を調べた（図４）。
【０１０６】
（３）塩の代替
基質溶液中のＮａＣｌ（塩化ナトリウム）を、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＣａＣｌ２（塩化カルシウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（塩化マグネシウム六水和物）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（硫酸マグネシウム七水和物）に変更し、塩化ナトリウム以外の塩溶液中で活性を発現できるか調べた（表７）。表７において、“○”は代替可能なもの、“×”は代替不可のものを示す。代替できたＬｉＣｌおよびＫＣｌについてはその濃度依存性についても調べた（図５）。
【表７】
【０１０７】
その結果、１９７Ａ株が生産するアガラーゼは塩化ナトリウム、塩化カリウムあるいは塩化リチウム存在下で活性を呈した。一方、その他の塩化物塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、硫酸塩では代替できなかった。従って、本酵素の活性の発現には１価の陽イオンが必須であった。
【０１０８】
（４）温度依存性
活性測定を３５−１００℃でそれぞれ行い、活性の温度依存性を調べた。結果を図６に示す。
【０１０９】
（５）温度安定性
酵素溶液を７０℃、８０℃、９０℃および９５℃で、それぞれ０−６０ｍｉｎ処理した後の残存活性を経時的に調べた。結果を図７に示す。
【０１１０】
（６）ｐＨ依存性
基質溶液中の緩衝液を、クエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ５．５、６．０、６．５）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５、６．８、７．０、７．５、８．０）、グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ ７．０、７．５、８．０、８．５）、ＴＡＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．５、９．０、９．５）に変更してそれぞれ活性測定を行い、アガラーゼ活性のｐＨ依存性を調べた。結果を図８に示す。
【０１１１】
（７）分解産物
アガロースを酵素分解した反応産物をＴＬＣ解析した。反応産物のリファレンスには、ガラクトース、ネオアガロオリゴ４糖、ネオアガロ６糖、アガロースにＴｈａｌａｓｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ３３由来α−アガラーゼを作用させた分解産物、アガロースにＭｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ９４由来β−アガラーゼを作用させた分解産物を用いた。
【０１１２】
実験の結果、本酵素はアガロースからネオアガロ糖を生成するエンド型β−アガラーゼと判断された（図９）。
【０１１３】
［ＩＩＩ］アガラーゼ配列の解析
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
精製酵素２．８ｐｍｏｌをＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣアミノ酸シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により解析して、１５残基のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号７）を決定した。
【０１１４】
得られた配列をサーチキーとしてＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴプログラムによる相同配列検索を行ったが、糖質の加水分解に関連するどのタンパク質もヒットせず、新規性の高いアミノ酸配列を持つアガラーゼであることが判った。
【０１１５】
（２）ゲノムシークエンスの解析
Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ）によるゲノムシークエンスの結果、総リード数１８６，７８８、総塩基数６９，２１７，１２８ｂｐ（約６９Ｍｂｐ）のシークエンスデータを得た。各リードの平均長さは３７０．５７ｂｐであった（図１０）。
【０１１６】
取得した全リードデータをＧＳ ＦＬＸ付属ソフトウェアＧＳ Ｄｅ Ｎｏｖｏ ＡｓｓｅｍｂｌｅｒのＧｅｎｏｍｅ ＰｒｏｊｅｃｔによってＤｅ ｎｏｖｏアッセンブルした。５００ｂｐ以上の配列が得られたコンティグ数は４５、総塩基数は３，４７２，７３２ｂｐ（約３．５Ｍｂｐ）、コンティグの平均長さは７７，１７１ｂｐであり、得られたコンティグの５０％以上は１６６，７５８ｂｐ以上の長さを有していた。配列の９９．８３％は誤差率０．０１％以下の高精度で決定した。また、コンティグ後に１００ｂｐ以上の配列が得られたコンティグ数は５８、総塩基数は３，４７５，３２０ｂｐ（約３．５Ｍｂｐ）であった。ゲノムシークエンス結果の概要を表８に示す。
【表８】
【０１１７】
（３）アガラーゼ遺伝子の取得
Ｎ末端アミノ酸配列解析によって得られた１５残基のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）をサーチキーとして、ゲノムシークエンス解析によって得られた塩基配列に対しＢＬＡＳＴ Ｘ検索（プロテインクエリー ＶＳ 翻訳塩基配列）を行った。検索対象の塩基配列データベースは、検索過程でフォワードおよびリバース方向の計６つの読み取り枠でアミノ酸翻訳した。検索プログラムにはＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１０（ＧＥＮＥＴＹＸコーポレーション）を使用した。その結果、コンティグＮｏ．００００５の約６０ｋｂｐの配列中から、サーチキーに用いたＮ末端アミノ酸配列と１００％一致する配列が１件ヒットした。他の配列との相同性は２９％以下であり、類似配列は得られなかった。
【０１１８】
ヒットした配列の２７残基上流には、開始コドンと考えられるＡＴＧ／メチオニンが、４８８残基下流には終止コドンと考えられるＴＡＡが存在しており、本ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）は５２９アミノ酸（１５９０ｂｐ）で構成されていた（図１１）。分子量は５７．２ｋＤａでシステインを３残基含み、本酵素を構成するアミノ酸は疎水性４８．５８％、親水性２８．１７％、酸性１１．９８％、塩基性１１．３４％、中性２３．２５％であった。また、ｐＩ値は５．１７と計算された。
【０１１９】
Ｎ末端アミノ酸配列の解析によって得られた１５残基のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）から終止コドンまでの５０２アミノ酸から計算される分子量は約５４．６ｋＤａと見積もられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過クロマトグラフィーで解析した分子量（５６ｋＤａ、５５ｋＤａ）とも良く一致した。相同配列の検索では、１５０アミノ酸以下の短い部分配列に対して最大２９％の相同性を持つ配列がアサインされるのみであり、またその件数も僅か８件に過ぎず、酵素として有意に相同性のある配列はヒットしなかった。Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １６（ＧＨ１６）、ＧＨ５０、ＧＨ８６、ＧＨ１１８に属する既知のアガラーゼと配列のアライメント解析も試みたが、触媒残基等の保存領域は見つからなかった。
【０１２０】
［配列番号１］耐熱性アガロース分解酵素のアミノ酸配列
ARETVPPNASASKIQKRIDRAHRKTDAHGYGIVDGEGRTYTIGESLVLRSNTVLQNMKIRVAKGANIDAVTSANFEQNVENSAKTPAEGVPYNFGLSHVTIDGNRGKSNDETYGFSETYNTEGRGVAFYGQNITAQHVTIYRCAGDGWYSRFDHVAPYWEDDWDDLRGLAHTVIGPMYIRRCGGHGLHWEGPHDTTLTKVISAMNNKRGWYQKGVGMDAGVVHTFANSWGSDKSAYPNLHEAPLHINIYYADDDLVVANEMLQAATFRGPYGPNLTLNSNAQIGNLSIWGAGESRDGVVFNGWANQSVNNLNVYEYDGDGVVIDGPHVHIADGRSVQNTGYGVRMGVGTKVWACNVSFQGLNRNEKAGFRYGPAGGGEDNVNSYNRVNLRDWIAGEYVGYDTEDGTLPDSTDEFHIALSGSAEGTGMSWEEGSAVRSGGNGKQFTIAHDMVAAPEHVQITPKTEAAMGEYRVDGDGEAITITYRNAPASGTDNLGWYYRAAL
［配列番号２］耐熱性アガロース分解酵素遺伝子の塩基配列
GCCCGTGAAACCGTTCCGCCGAACGCCTCGGCATCCAAAATCCAGAAGCGGATCGACAGGGCTCACCGGAAAACCGACGCTCACGGCTACGGGATCGTCGATGGAGAGGGGCGGACGTACACCATCGGTGAGTCGCTCGTCCTTCGGTCGAACACCGTCCTCCAGAACATGAAGATTCGGGTCGCCAAGGGCGCGAACATCGACGCCGTCACGTCGGCGAACTTCGAACAGAACGTGGAAAACAGCGCGAAGACCCCCGCGGAAGGCGTCCCGTACAACTTCGGTCTGTCCCACGTCACCATCGACGGCAACCGTGGCAAGTCGAACGACGAGACGTACGGGTTCAGCGAGACGTACAACACGGAGGGCCGCGGTGTCGCCTTCTACGGTCAGAACATCACGGCTCAACACGTCACGATCTACAGATGTGCCGGGGACGGGTGGTACTCCAGGTTCGATCACGTCGCCCCGTACTGGGAGGACGACTGGGACGACCTCCGAGGCCTCGCACACACCGTCATCGGTCCGATGTACATCCGACGCTGTGGCGGCCACGGCCTCCACTGGGAGGGACCACACGACACGACCCTCACCAAAGTGATCAGCGCGATGAACAACAAGCGGGGATGGTACCAGAAGGGAGTCGGGATGGATGCGGGCGTCGTCCACACGTTCGCGAACTCGTGGGGGAGCGACAAGAGCGCCTACCCGAATCTCCACGAGGCGCCGCTCCATATCAACATCTACTACGCGGACGACGACCTCGTCGTGGCCAACGAGATGCTCCAGGCGGCGACCTTCCGGGGGCCCTACGGTCCGAACCTCACGCTCAACAGCAACGCACAGATCGGGAACCTGTCGATCTGGGGAGCCGGTGAATCACGGGATGGCGTCGTCTTCAACGGCTGGGCGAACCAGAGCGTCAACAATCTCAACGTGTACGAGTACGACGGGGACGGCGTCGTGATCGATGGTCCCCACGTGCATATCGCCGACGGTCGGTCGGTCCAGAACACGGGTTACGGCGTCCGGATGGGTGTCGGGACGAAGGTCTGGGCCTGCAACGTGTCGTTCCAGGGGCTGAACCGAAACGAGAAGGCAGGGTTCCGCTACGGCCCCGCCGGCGGCGGGGAGGACAACGTCAACTCGTACAACCGCGTGAACCTCCGGGACTGGATCGCGGGGGAGTACGTGGGCTACGACACCGAGGACGGAACGCTCCCCGACTCCACCGACGAGTTCCACATCGCGCTCTCCGGTTCGGCCGAAGGGACCGGCATGTCGTGGGAGGAGGGGAGCGCGGTCCGGAGCGGGGGCAACGGGAAACAGTTCACGATCGCACACGACATGGTCGCCGCGCCCGAACACGTCCAGATCACGCCGAAGACCGAGGCCGCGATGGGCGAGTATCGGGTCGACGGCGACGGGGAAGCGATCACGATCACGTACCGGAACGCGCCAGCGAGCGGCACGGACAACCTCGGCTGGTACTACAGGGCGGCGCTGTAA
［配列番号３］古細菌用ユニバーサルプライマー １Ｆ
ATTCCGGTTGATCCTGCCGG
［配列番号４］古細菌用ユニバーサルプライマー １４７２Ｒ
AGGAGGTGATCCAGCCGCAG
［配列番号５］ｐＴＡ＿Ｆ （ｖｅｃｔｏｒ’ｓ ｓｉｄｅ）
GTAAAACGACGGCCAGTGAGCG
［配列番号６］ｐＴＡ＿Ｒ （ｖｅｃｔｏｒ’ｓ ｓｉｄｅ）
GGAGCTCCACCGCGGTGGC
［配列番号７］Ｎ末端アミノ酸配列
ARETVPPNASASKIQ
［配列番号８］シグナル配列を含む耐熱性寒天分解酵素アガロース分解酵素のアミノ酸配列
MAFGGRASADTESSVASEAAGPSGTQQARETVPPNASASKIQKRIDRAHRKTDAHGYGIVDGEGRTYTIGESLVLRSNTVLQNMKIRVAKGANIDAVTSANFEQNVENSAKTPAEGVPYNFGLSHVTIDGNRGKSNDETYGFSETYNTEGRGVAFYGQNITAQHVTIYRCAGDGWYSRFDHVAPYWEDDWDDLRGLAHTVIGPMYIRRCGGHGLHWEGPHDTTLTKVISAMNNKRGWYQKGVGMDAGVVHTFANSWGSDKSAYPNLHEAPLHINIYYADDDLVVANEMLQAATFRGPYGPNLTLNSNAQIGNLSIWGAGESRDGVVFNGWANQSVNNLNVYEYDGDGVVIDGPHVHIADGRSVQNTGYGVRMGVGTKVWACNVSFQGLNRNEKAGFRYGPAGGGEDNVNSYNRVNLRDWIAGEYVGYDTEDGTLPDSTDEFHIALSGSAEGTGMSWEEGSAVRSGGNGKQFTIAHDMVAAPEHVQITPKTEAAMGEYRVDGDGEAITITYRNAPASGTDNLGWYYRAAL
［配列番号９］シグナル配列を含む耐熱性寒天分解酵素アガロース分解酵素遺伝子の塩基配列
ATGGCGTTTGGCGGACGTGCCTCCGCCGACACCGAGTCGTCCGTGGCGAGCGAAGCAGCGGGGCCCAGCGGAACCCAGCAGGCCCGTGAAACCGTTCCGCCGAACGCCTCGGCATCCAAAATCCAGAAGCGGATCGACAGGGCTCACCGGAAAACCGACGCTCACGGCTACGGGATCGTCGATGGAGAGGGGCGGACGTACACCATCGGTGAGTCGCTCGTCCTTCGGTCGAACACCGTCCTCCAGAACATGAAGATTCGGGTCGCCAAGGGCGCGAACATCGACGCCGTCACGTCGGCGAACTTCGAACAGAACGTGGAAAACAGCGCGAAGACCCCCGCGGAAGGCGTCCCGTACAACTTCGGTCTGTCCCACGTCACCATCGACGGCAACCGTGGCAAGTCGAACGACGAGACGTACGGGTTCAGCGAGACGTACAACACGGAGGGCCGCGGTGTCGCCTTCTACGGTCAGAACATCACGGCTCAACACGTCACGATCTACAGATGTGCCGGGGACGGGTGGTACTCCAGGTTCGATCACGTCGCCCCGTACTGGGAGGACGACTGGGACGACCTCCGAGGCCTCGCACACACCGTCATCGGTCCGATGTACATCCGACGCTGTGGCGGCCACGGCCTCCACTGGGAGGGACCACACGACACGACCCTCACCAAAGTGATCAGCGCGATGAACAACAAGCGGGGATGGTACCAGAAGGGAGTCGGGATGGATGCGGGCGTCGTCCACACGTTCGCGAACTCGTGGGGGAGCGACAAGAGCGCCTACCCGAATCTCCACGAGGCGCCGCTCCATATCAACATCTACTACGCGGACGACGACCTCGTCGTGGCCAACGAGATGCTCCAGGCGGCGACCTTCCGGGGGCCCTACGGTCCGAACCTCACGCTCAACAGCAACGCACAGATCGGGAACCTGTCGATCTGGGGAGCCGGTGAATCACGGGATGGCGTCGTCTTCAACGGCTGGGCGAACCAGAGCGTCAACAATCTCAACGTGTACGAGTACGACGGGGACGGCGTCGTGATCGATGGTCCCCACGTGCATATCGCCGACGGTCGGTCGGTCCAGAACACGGGTTACGGCGTCCGGATGGGTGTCGGGACGAAGGTCTGGGCCTGCAACGTGTCGTTCCAGGGGCTGAACCGAAACGAGAAGGCAGGGTTCCGCTACGGCCCCGCCGGCGGCGGGGAGGACAACGTCAACTCGTACAACCGCGTGAACCTCCGGGACTGGATCGCGGGGGAGTACGTGGGCTACGACACCGAGGACGGAACGCTCCCCGACTCCACCGACGAGTTCCACATCGCGCTCTCCGGTTCGGCCGAAGGGACCGGCATGTCGTGGGAGGAGGGGAGCGCGGTCCGGAGCGGGGGCAACGGGAAACAGTTCACGATCGCACACGACATGGTCGCCGCGCCCGAACACGTCCAGATCACGCCGAAGACCGAGGCCGCGATGGGCGAGTATCGGGTCGACGGCGACGGGGAAGCGATCACGATCACGTACCGGAACGCGCCAGCGAGCGGCACGGACAACCTCGGCTGGTACTACAGGGCGGCGCTGTAA
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な耐熱性のアガロース分解酵素およびその利用、該アガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびその利用、該アガロース分解酵素の製造方法、ならびに該アガロース分解酵素を生産する微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
寒天は、テングサ、オゴノリ等の紅藻類から得られる多糖類であり、その主成分はアガロースである。寒天中にはアガロースに硫酸、硫酸ピルビン酸等がエステル結合したアガロペクチンと総称される多糖も少量存在している。
【０００３】
アガロースをアガロース分解酵素の一種であるβ−アガラーゼにより加水分解することによりネオアガロオリゴ糖が得られる。ネオアガロオリゴ糖は、デンプン老化防止作用が強いこと、加熱処理により静菌作用を生じること、低カロリーであること等の面から食品分野で高機能性食品の原料として有用である。また、海藻成分をβ−アガラーゼにより加水分解して得られるオリゴ糖には免疫機能活性化機能や、肌への美白、保湿効果が認められている。さらに、アガロース分解酵素を用いて海藻類の強固な細胞組織を分解し、生理活性物質を抽出したり、あるいは該酵素を用いて作成したプロトプラストを利用して海藻の有用品種の開発をすることは未開発の海洋生物資源の新たな有効利用として期待されている。
【０００４】
アガロース分解酵素としては、たとえば、本発明者らによって見出されたアガロース分解酵素が知られている（特許文献１を参照）。特許文献１に記載の酵素は、５４℃で３０分間の熱処理を行っても活性が残存することから、寒天の高温下での迅速分解を実現でき、産業上有利に利用することができる。
【０００５】
この他にも、至適温度が６０℃付近にあるアガロース分解酵素が特許文献２および３に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００４／０９０１２７号パンフレット
【特許文献２】特開平７−２５５４７５号公報
【特許文献３】特再公表２００２−０６８６５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、アガロースとしては種々のものがあり、融点が６０℃以上であるものは少なくない。また、酵素の性質として、至適温度の範囲が広く、その至適温度の高温域で安定性が認められるものは、工業上安定して利用され得る。
【０００８】
そこで、本発明は、融点が６０℃以上のアガロース、特に融点が７０〜８０℃のアガロースを工業的に分解し得るアガロース分解酵素を提供することを、発明が解決しようとする課題とした。また、これに関連して、該アガロース分解酵素の利用、該アガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドおよびその利用、該アガロース分解酵素の製造方法、ならびに該アガロース分解酵素を生産する微生物を提供することもまた、発明が解決しようとする課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究を積み重ねた結果、これまでアガロース分解酵素の産生可能性について注目されていなかったハロコッカス属微生物が耐熱性のアガロース分解酵素を産生し得ることを見出した。また、本発明者らが取得することに成功したハロコッカス属微生物であるハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） 197A（受領番号：FERM ABP-11336）は、至適温度の範囲として７０〜８０℃を含み、かつ、この温度範囲において安定性が認められる新規の耐熱性アガロース分解酵素を生産し得るものであった。本発明は、これらの知見や成功例に基づき、完成された発明である。
【００１０】
したがって、本発明によれば、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上である、前記アガロース分解酵素が提供される。
【００１１】
好ましくは、分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５４，０００〜５８，０００、または、ゲルろ過法では５３，０００〜５７，０００である。
好ましくは、一価陽イオンとして、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＬｉ＋を要求する。
好ましくは、至適ｐＨが５．５〜７．０である。
好ましくは、ハロコッカス属微生物由来の酵素である。
好ましくは、前記ハロコッカス属微生物がハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）である。
【００１２】
本発明の別の態様として、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上であり、かつ、
以下（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、前記アガロース分解酵素が提供される。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００１３】
好ましくは、前記アミノ酸配列が配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列である。
【００１４】
本発明の別の態様として、本発明のアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
好ましくは、前記塩基配列が以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列である。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
【００１６】
好ましくは、前記塩基配列が配列表の配列番号９に記載の塩基配列である。
【００１７】
本発明の別の態様として、本発明のポリヌクレオチドを有する組換えベクターが提供される。
【００１８】
本発明の別の態様として、本発明の組換えベクターにより形質転換された微生物が提供される。
【００１９】
本発明の別の態様として、本発明の微生物を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法が提供される。
【００２０】
本発明の別の態様として、ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法が提供される。
【００２１】
本発明の別の態様として、本発明の製造方法により得られる、アガロース分解酵素が提供される。
【００２２】
本発明の別の態様として、ＤＮＡを含有したアガロースゲルに、本発明のアガロース分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを含む、アガロースゲル中のＤＮＡの回収方法が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様として、本発明のアガロース分解酵素、
ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、および
ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液
を含む、アガロースゲル中のＤＮＡを回収するためのキットが提供される。
【００２４】
本発明の別の態様として、ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）が提供される。
【発明の効果】
【００２５】
本発明のアガロース分解酵素によれば、融点が６０℃以上のアガロース、特に融点が７０〜８０℃のアガロースを分解することができる。特に、本発明のアガロース分解酵素は、８０℃での温度安定性を有するものであるため、８０℃という高温条件下で寒天からの安定したネオアガロオリゴ糖の工業生産を可能とする。
【００２６】
本発明のアガロース分解酵素の製造方法および本発明のポリヌクレオチドや微生物を利用したアガロース分解酵素の製造方法によれば、生産物であるアガロース分解酵素が耐熱性を有することから、アガロース分解酵素を工業的に安定して生産できる。
【００２７】
本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法によれば、従来のアガロース分解酵素と比べて回収率を向上させたアガロースゲル電気泳動後の核酸抽出が実施できる。この用途のために、本発明のキットは、遺伝子解析関連試薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】アガラーゼ生産菌が形成した分解斑を示した図である。寒天分解活性をヨウ素液で検出し、寒天の分解によって還元糖が生じた部分を非染色領域として検出している。
【図２】アガラーゼ生産菌と既知近縁種との近隣結合系統樹を示した図である。括弧内はアクセッション番号を示す。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量解析を示した図である。Ｍは分子量マーカー。（Ａ）はハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） １９７Ａ株が生産するアガラーゼを示す。
【図４】アガラーゼ活性に対するＮａＣｌ濃度の影響を示した図である。ＮａＣｌ濃度３．４Ｍにおける活性を１００％とした相対活性でプロットしてある。
【図５】アガラーゼ活性に対するＫＣｌとＬｉＣｌ濃度の影響を示した図である。ＮａＣｌ濃度３．４Ｍにおける活性を１００％とした相対活性でプロットしてある。■ＫＣｌおよび◆ＬｉＣｌ。
【図６】アガラーゼ活性に対する温度の影響を示した図である。７０℃における活性を１００％とした相対活性でプロットしてある。
【図７】アガラーゼの温度安定性を示した図である。各温度で０−６０分間加熱処理したときの残存活性。■７０℃、◆８０℃、▲９０℃および●９５℃。
【図８】アガラーゼ活性のｐＨ依存性を示した図である。測定結果はｐＨ ６．８のリン酸ナトリウム緩衝液を１００％とした相対活性でプロットしてある。■クエン酸緩衝液、◆ＭＥＳ緩衝液、▲リン酸ナトリウム緩衝液、●グリシルグリシン緩衝液および−ＴＡＢＳ緩衝液。
【図９】アガラーゼ分解産物のＴＬＣ解析を示した図である。１、２２：ネオアガロ６糖。２、２１：ネオアガロ４糖。３、２０：ガラクトース。４−８：ＪＡＭＢ−Ａ３３由来α−アガラーゼ分解産物（０、２、４、８、１６時間）。９−１４：１９７Ａ株由来アガラーゼ分解産物（０、１、２、４、８、１６時間）。１５−１９：ＪＡＭＢ−Ａ９４株由来β−アガラーゼ分解産物（０、２、４、８、１６時間）。
【図１０】ゲノムシークエンスにより取得したリード配列の長さと数を示した図である。
【図１１】新規アガラーゼの遺伝子配列とアミノ酸配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明の詳細について説明する。
［１］本発明のアガロース分解酵素
本発明のアガロース分解酵素は、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素である。本発明のアガロース分解酵素は、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間、より好ましくは３０分間、さらに好ましくは６０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上（以下、高温条件下の残存活性ともいう）である。
【００３０】
本明細書において「アガロース分解酵素」とは、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有する酵素をいう。アガロース分解酵素の該活性は、アガロースのβ−１，４結合を加水分解し、ネオアガロオリゴ糖を生成する活性であるものと推測される。そこで、本明細書では、寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を「アガラーゼ活性」ともいう。
【００３１】
本発明のアガロース分解酵素は、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を有する多糖類ならびに同骨格を有するオリゴ糖に作用し、寒天由来オリゴ糖を生成する。本発明のアガロース分解酵素の好ましい態様はエンド型β−アガラーゼである。
【００３２】
本発明のアガロース分解酵素は、研究用試薬として、アガロースゲルにアプライしたＤＮＡを電気泳動後にゲルから回収する方法等に使用することができる。さらに、藻類、特に紅藻類からのプロトプラストの製造や有用物質の抽出等の用途に使用することができる。
【００３３】
本発明のアガロース分解酵素のアガラーゼ活性は、特に別段の記載がない限り、ＤＮＳ法（Ｄｉｎｉｔｒｏ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ法）による還元糖の定量により、実施例の第２ １．［１］に記載の通りに測定する。概略すると、まず、アガロース基質溶液９００μｌと酵素液１００μｌとの混合溶液を７５℃、１５分間で反応させる。次いで反応後の混合溶液に１ｍｌのＤＮＳ試薬を加えて混合した反応液を、１００℃、５分間の加熱により発色させる。次いで発色させた反応液を室温まで冷却した後、４ｍｌの蒸留水を加えて希釈し、分光光度計により波長５３５ｎｍの吸収を測定する。１分間に１μｍｏｌのガラクトースに相当する還元糖を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義する。
【００３４】
本明細書において「至適温度」とは、アガラーゼ活性測定において、アガロース基質溶液と酵素液との混合溶液を反応させる温度を変化させた場合に、その温度を７０℃に設定したときのアガラーゼ活性を１００％として、８０％以上の相対活性が観測された温度をいう。
【００３５】
本発明のアガロース分解酵素について、高温条件下の残存活性を測定する際は、アガラーゼ活性測定に用いる酵素液を２分割し、一方を８０℃で所定の期間の高温条件下に曝した後にアガラーゼ活性測定に供し、他方を該高温条件下に曝すことなくアガラーゼ活性測定に供する。
【００３６】
本発明のアガロース分解酵素は、至適温度および高温条件下の残存活性が上記した通りのものであれば特に制限されないが、たとえば、分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５４，０００〜５８，０００、または、ゲルろ過法で５３，０００〜５７，０００であり；一価陽イオンとしてＮａ＋、Ｋ＋またはＬｉ＋を要求し；および、至適ｐＨは５．５〜７．０である。ただし、「至適ｐＨ」とは、アガラーゼ活性測定において、アガロース基質溶液の緩衝液をクエン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン緩衝液またはＴＡＢＳ緩衝液としてｐＨを変化させた場合に、そのｐＨを６．０（ＭＥＳ緩衝液）に設定したときのアガラーゼ活性を１００％として、８０％以上の相対活性が観測されたｐＨをいう。
【００３７】
本発明のアガロース分解酵素は、上記したアガラーゼ活性、至適温度および高温条件下の残存活性の他、分子量、一価陽イオン要求性および至適ｐＨなどを指標として、種々の微生物、たとえば、ハロコッカス属（Halococcus sp.）微生物の生産物を分析および評価することにより採取することが可能である。
【００３８】
本発明のアガロース分解酵素を生産する微生物を取得する方法は特に制限されないが、たとえば、天日塩サンプル、好ましくは高度好塩菌の存在が確認できた天日塩サンプルから、アガラーゼを生産する古細菌を探索することにより取得できる。アガラーゼ生産菌の探索用培地としては種々のものが使用できるが、好ましいのは実施例の表１に示した固体寒天培地である。アガラーゼ生産菌の存在は、たとえば、固体寒天培地の寒天の分解によって生じる凹みを目視で観察することにより検出できる。次いで、陽性の可能性がある株については、たとえば、固体寒天培地にルゴール液をかけて染色し、寒天の加水分解で生じた還元糖による非染色領域を形成せしめたものをアガラーゼ生産菌として取得できる。菌株を単離する方法は特に制限されないが、たとえば、画線法と限界希釈法により純粋培養株とすることができる。このようにして取得したアガラーゼ生産菌の中から、本発明のアガロース分解酵素を生産する微生物を取得できる。
【００３９】
本発明のアガロース分解酵素を生産するハロコッカス属微生物として好ましいのは、後述する本発明の微生物であるハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） 197Aである。
【００４０】
本発明のアガロース分解酵素の具体的な態様は、アガラーゼ活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、
８０℃で１０分間、好ましくは３０分間、より好ましくは６０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上であり、かつ、
以下（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、前記アガロース分解酵素である。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【００４１】
上記（１）のアミノ酸配列は、後述する実施例に記載の５０２アミノ酸からなる。
【００４２】
上記（２）のアミノ酸配列の「１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入」における「１から複数個」の範囲は、上記（２）のアミノ酸配列を含むアガロース分解酵素について、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後のアガラーゼ活性が、該高温条件下に供する前のアガラーゼ活性と比べて８０％以上であれば特に限定されないが、たとえば、１から２０個、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、より好ましくは１、２、３、４、５、６または７個、さらに好ましくは１、２、３、４または５個、特に好ましくは１、２または３個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基が欠落もしくは消失していること、「アミノ酸の置換」とは配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていること、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が付け加えられていること、および「アミノ酸の挿入」とは配列中のアミノ酸残基の間に別のアミノ酸残基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００４３】
「１から複数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および／または挿入」の具体的な態様としては、１から複数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。たとえば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４４】
上記（３）のアミノ酸配列は、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後のアガラーゼ活性が該高温条件下に供する前のアガラーゼ活性と比べて８０％以上であるアガロース分解酵素を構成するものとして、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列の相同性（同一性ともいう）、好ましくは９３％以上の相同性、より好ましくは９５％以上の相同性、さらに好ましくは９７％以上の相同性、なおさらに好ましくは９９％以上の相同性があるアミノ酸配列をいう。アミノ酸配列の相同性を求める方法は特に制限されないが、たとえば、通常知られる方法を利用して、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と対象となるアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を計算することにより求められる。
【００４５】
本発明のアガロース分解酵素の好適な具体的態様は、配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するアガロース分解酵素である。配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列は５２９アミノ酸からなり、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列のＮ末端側にシグナル配列を有するものである。
【００４６】
本発明のアガロース分解酵素を取得する方法は特に制限されるものではなく、上記したスクリーニング法以外にも、たとえば、本発明のアガロース分解酵素の製造方法により製造してもよいし、配列表の配列番号１の記載を参照して物理化学的に合成してもよいし、遺伝子工学的に本発明のポリヌクレオチドから作成してもよいし、本発明の微生物から培養工学的に製造してもよい。
【００４７】
本発明のアガロース分解酵素を用いた寒天由来オリゴ糖の製造としては、特に限定はされないが、たとえば、次に示す手順を用いることができる。アガロース、寒天等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合、α−１，３結合した骨格を持つ多糖類または同様の骨格を有するオリゴ糖を含む藻類の破砕または抽出物に、本発明のアガロース分解酵素を混ぜ、ｐＨ５．５〜７．０、６０〜８０℃の範囲で保温することで寒天由来オリゴ糖等のオリゴ糖を生成できる。
【００４８】
本発明のアガロース分解酵素を用いた、寒天、アガロース等のＤ−ガラクトースと３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースが交互にβ−１，４結合およびα−１，３結合した骨格を持つ多糖類を細胞組織成分に有する藻類を原料としたプロトプラストの製造は、特に限定はされないが、たとえば、以下の手順で実施することができる。供試海藻を０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中でパパインを作用させる。その後０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、４０μｍのナイロンメッシュでろ過洗浄し、洗浄した葉体をナイフで数ミリ片に裁断する。裁断片を本発明酵素と市販のセルラーゼオノズカＲＳならびに、マイセロチームＲ−１０、それに０．７Ｍのマンニトール含有ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）（塩化ナトリウム含有）中で振とうすることによって、プロトプラストを得ることができる。
【００４９】
［２］本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドの好ましい態様は、たとえば、以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列を有するポリヌクレオチドである。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
【００５０】
上記（ａ）の塩基配列は、後述する実施例に記載の１５０９ｂｐからなる塩基配列である。
【００５１】
上記（ｂ）のポリヌクレオチドの塩基配列における「１から複数個の塩基の欠失、置換、付加および／または挿入」における「１から複数個」の範囲は、該塩基配列が、至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、８０℃で１０分間の高温条件下に供した後のアガラーゼ活性が、該高温条件下に供する前のアガラーゼ活性と比べて８０％以上であるアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードするものであれば特には限定されないが、たとえば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個、さらに好ましくは１、２、３、４または５個、特に好ましくは１、２または３個程度を意味する。また、「塩基の欠失」とは配列中の塩基が欠落もしくは消失していること、「塩基の置換」とは配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていること、「塩基の付加」とは塩基が付け加えられていること、および「塩基の挿入」とは配列中の塩基の間に別の塩基が挿し入れられていることをそれぞれ意味する。
【００５２】
上記（ｃ）のポリヌクレオチドについての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」ポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989（以下、モレキュラークローニング第２版と略す）または、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons
(1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００５３】
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件および高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、たとえば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、３２℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、たとえば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、４２℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、たとえば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５０℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（たとえばＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【００５４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドとしては、プローブとして使用するポリヌクレオチドの塩基配列と一定以上の相同性（同一性ともいう）を有するポリヌクレオチドが挙げられ、たとえば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、さらに好ましくは９５％以上、なおさらに好ましくは９８％以上の相同性を有するポリヌクレオチドが挙げられる。塩基配列の相同性を求める方法は特に制限されないが、たとえば、通常知られる方法を利用して、配列表の配列番号２に記載の塩基配列と対象となる塩基配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を計算することにより求められる。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドの好適な具体的態様は、配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドである。配列表の配列番号９に記載の塩基配列は１５９０ｂｐからなり、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の５’末端側にシグナル配列をコードする塩基配列を有するものである。
【００５６】
本発明のポリヌクレオチドの取得方法は特に限定されない。たとえば、本明細書中の配列表の配列番号１に記載したアミノ酸配列および配列番号２に記載の塩基配列の情報に基づいて適当なプローブやプライマーを調製し、それらを用いてハロコッカス属微生物やその他の微生物の染色体ＤＮＡライブラリーから本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、配列表の配列番号２に記載の塩基配列の情報を基に化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に通常知られる任意の方法で作製することができる。
【００５７】
本発明のポリヌクレオチドは、通常、組換えＤＮＡの形態で宿主に導入される。組換えＤＮＡは、通常、ＤＮＡと自律増殖可能なベクターを含んでなり、本発明のポリヌクレオチドを入手できれば、通常知られる組換えＤＮＡ技術により調製することができる。たとえば、本発明のポリヌクレオチドを自律増殖可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを適宜宿主に導入して得られる形質転換体を培養し、培養物から菌体を採取し、この菌体から当該ＤＮＡを含むプラスミドを採取する。
【００５８】
［３］本発明の組換えベクター
本発明のポリヌクレオチドは適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、たとえば、自律的に複製することが可能なベクター（たとえばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞の染色体に組み込まれ、染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明のポリヌクレオチドは、転写に必要な要素（たとえば、プロモーター等）と機能的に連結される。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００５９】
また、自律的に複製することが可能なベクターの具体例としては、ｐＥＴ２１ａ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＣＲ２．１、ｐＬＥＸ、ｐＪＬ３、ｐＳＷ１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ４２０、ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ｐＵＢ１１０、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７、ｐＢＳ７、ｐＴＡ２等のプラスミドベクターやλｇｔ１１、λＺＡＰ、λｇｔ・λＢ、ρ１１、φ１、φ１０５等のファージベクターが挙げられるが、大腸菌で発現させるには、ｐＥＴ２１ａ、ｐＲＳＥＴＡ、ｐＣＲ８、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、ｐＣＲ２．１およびｐＴＡ２が好適であり、枯草菌で発現させるには、ｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１およびφ１０５が好適である。ｐＨＹ３００ＰＬＫ、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７およびｐＢＳ７は、組換えＤＮＡを２種以上の宿主内で増殖させる場合に有用である。
【００６０】
作動可能なプロモーターとしては、挿入断片に含まれる宿主中において機能することができるプロモーターであれば特に制限されないが、たとえば、大腸菌においてはラクトースオペロン（ｌａｃ）、トリプトファンオペロン（ｔｒｐ）などのプロモーターやｔａｃプロモーターを挙げることができ；枯草菌においてはバチルス・ステアロテルモフィルス（Bacillus stearothermophilus）のマルトジェニックアミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）のα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）のアルカリプロテアーゼ遺伝子、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）のキシロシダーゼ遺伝子などのプロモーターを挙げることができ；酵母ではアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）、酸性フォスファターゼ遺伝子（ＰＨＯ）、ガラクトシダーゼ遺伝子（ＧＡＬ）、グリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ＧＰＤ）などのプロモーター、酵母解糖系遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１プロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーターなどを挙げることができ；カビではα−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）、セロビオハイドロラーゼＩ遺伝子（ＣＢＨＩ）などのプロモーター、ＡＤＨ３プロモーター、ｔｐｉＡプロモーターなどを挙げることができ；哺乳動物細胞では、ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、アデノウイルス２主後期プロモーターなどを挙げることができ；昆虫細胞では、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモーター、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモーター、バキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモーターなどを挙げることでき、その他としてはファージ・ラムダのＰRプロモーター、ＰLプロモーターなどを挙げることができる。
【００６１】
本発明の組換えベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、たとえば、薬剤耐性マーカー、栄養要求マーカーを使用することができる。選択マーカーの具体例としては、使用する宿主細胞が細菌の場合はアンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシ耐性遺伝子などであり、酵母の場合はジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、シゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子、トリプトファン合成遺伝子（ＴＲＰ１）、ウラシル合成遺伝子（ＵＲＡ３）、ロイシン合成遺伝子（ＬＥＵ２）などがあり、カビの場合はハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｈｙｇ）、ビアラホス耐性遺伝子（Ｂａｒ）、硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉａＤ）などが挙げられる。
【００６２】
本発明の組換えベクターは、本発明のポリヌクレオチドによって転写されるタンパク質の発現に必要なＤＮＡ配列、たとえばプロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、分泌シグナル配列、ターミネーターなどを適当な順で連結していることことが好ましい。本発明の組換えベクターを構築する方法や本発明の組換えベクターを宿主に挿入する方法は当業者に通常知られるものである。
【００６３】
［４］本発明の形質転換体
本発明の組換えベクターを適当な宿主に導入することによって形質転換体を作製することができる。すなわち、本発明の形質転換体とは、本発明の組換えベクターにより形質転換された微生物をいう。
【００６４】
本発明の組換えベクターが導入される宿主細胞は、宿主−ベクター系が確立されているものであればいずれも利用可能であり、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。細菌細胞の例としては、枯草菌または放線菌等のグラム陽性菌または大腸菌等のグラム陰性菌が挙げられる。これら細菌の形質転換は、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法等により行えばよい。
【００６５】
本発明の形質転換体を製造する上で好ましい宿主−ベクター系としては、たとえば、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ−１０１（ＴａＫａＲａ）−ＴＡクローニング用ベクターｐＴＡ２が挙げられる。
【００６６】
本発明の形質転換体を用いて、本発明のアガロース分解酵素を得ることができる。たとえば、本発明の形質転換体を適当な条件で培養し、得られた培養液から一般的な方法によって酵素の分取や精製を行うことにより本発明のアガロース分解酵素を得ることができる。
【００６７】
［５］本発明のアガロース分解酵素の製造方法
本発明のアガロース分解酵素の製造方法は、本発明の形質転換体またはハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）（以下、これらを酵素生産微生物ともいう）を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む。具体的には、酵素生産微生物を常法にしたがって適当な培地に接種して適切な条件下で培養し、得られた培養物からアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法である。
【００６８】
本発明のアガロース分解酵素の製造方法は、大別すると、（ａ）酵素生産微生物を培養して、アガロース分解酵素含有培養物を得る工程、および（ｂ）該培養物からアガロース分解酵素を採取する工程の二つの工程に分けられる。
【００６９】
培養に用いる栄養培地としては、酵素生産微生物が増殖し得る培地を広く使用できる。酵素生産微生物の培養に際して、微生物増殖用とアガロース分解酵素生産用の二種類の培地を用いてもよい。この場合、アガロース分解酵素生産用の培地には、寒天またはアガロース、寒天分解物等を炭素源として含むことが望ましい。寒天、アガロースは、市販のもの、あるいは加工、精製される前の紅藻類を単独、併用して用いることができる。寒天またはアガロースの濃度は、０．１〜１．５％が好ましい。酵素生産微生物を培養して得た培養物をそのまま粗酵素として用いる場合、培地調製において、ｐＨ、一価塩その他酵素活性に影響する要因には注意を要する。
【００７０】
培養法としては液体培養法（振とう培養法もしくは通気攪拌培養法）が好ましく、工業的には通気攪拌培養法が好ましい。酵素生産微生物がハロコッカス属微生物である場合の培養は、通常、温度２０〜４５℃、好ましくは２５〜４０℃、ｐＨ５〜９、好ましくは６〜８から選ばれる条件で好気的に実施する。培養時間はハロコッカス属微生物が増殖し始める時間以上の時間であればよく、好ましくは数時間〜数日間であり、さらに好ましくは所望のアガラーゼ活性が最大値に達成する時間までである。菌体増殖を確認する方法は特に制限はないが、たとえば、培養物を採取して顕微鏡で観察してもよいし、吸光度で観察してもよい。また、培養液の溶存酸素濃度には特に制限はないが、通常は、０．５〜２０ｐｐｍが好ましい。そのために、通気量を調節したり、撹拌したり、通気に酸素を追加したりすればよい。培養方式は、回分培養、流加培養、連続培養、灌流培養など、いずれを用いてもよい。
【００７１】
上記のようにして培養して得られた培養物から、アガロース分解酵素を採取する。アガロース分解酵素の採取法は、一般の酵素の採取の手段に準じて実施することができる。たとえば、固液分離などの通常知られる手段によって細胞を除いた後に培養上清を粗酵素として用いることができる。固液分離には、通常知られる方法を制限なく利用することができ、たとえば、培養物を遠心分離する方法、培養物に濾過助剤を加えることや濾過助剤をプレコートしたプレコートフィルターなどにより濾過分離する方法、平膜、中空糸膜などを用いる膜濾過分離する方法などが採用される。
【００７２】
粗酵素は、そのままで使用することもできるが、精製して使用することが好ましい。たとえば、ここに挙げるものに限定されるものではないが、得られた粗酵素を、熱処理などの耐熱性の差を利用する方法；透析、限外ろ過、レジンカラム、ゲルろ過、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を利用する方法；塩沈澱、硫安沈殿、アルコール沈殿およびその他の溶媒沈澱などの溶解性の差を利用する方法；ＤＥＡＥ−トヨパール樹脂などを用いるイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；ブチルトヨパール樹脂などを用いる疎水クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；吸着クロマトグラフィーなどの物理化学的な吸着性の差を利用する方法；等電点電気泳動および等電点クロマトグラフィーなどの等電点の差を利用する方法といった通常知られる方法を単独または組み合わせて供することにより、精製酵素を調製できる。
【００７３】
粗酵素および精製酵素は、固定化することもできる。たとえば、イオン交換体への結合法、樹脂および膜などとの共有結合・吸着法、高分子物質を用いた包括法などを採用することができる。
【００７４】
本発明のアガロース分解酵素の製造方法によって得られるアガロース分解酵素は、本発明のアガロース分解酵素の別の態様として提供される。
【００７５】
［６］本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法
本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法は、ＤＮＡを含有したアガロースゲルに、本発明のアガロース分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを含む。本発明のアガロースゲル中のＤＮＡの回収方法の具体例としては、特に制限されないが、次の方法が挙げられる。ＤＮＡを電気泳動で分画後、目的のＤＮＡ断片含むアガロースゲル断片に本発明のアガロース分解酵素を加えて、溶解する。溶解後、必要であればＤＮＡ断片を含む溶液を、たとえば、フェノール処理、エタノール沈澱、カラムや樹脂を使用した精製等の精製方法を単独、あるいは併用して精製することも可能である。
【００７６】
［７］本発明のキット
本発明のキットは、本発明のアガロース分解酵素、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、およびｐＨ５．５〜７．０の緩衝液を含む、アガロースゲル中のＤＮＡを回収するためのキットである。ナトリウム塩、カリウム塩およびリチウム塩としては特に制限されないが、たとえば、塩化物やフッ化物などのハロゲン化物などが挙げられる。ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液としては、特に制限されないが、たとえば、ｐＨ５．５〜７．０のＭＥＳ緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、グリシルグリシン緩衝液などが挙げられる。
【００７７】
本発明のキットは、本発明のアガロース分解酵素、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、およびｐＨ５．５〜７．０の緩衝液がそれぞれ個別に包装されていてもよく、それらが混合した状態で存在していてもよい。
【００７８】
本発明のキットの構成成分のアガロースゲルへの添加順序は特に制限されないが、それぞれ個装されている場合には、ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液、ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩および本発明のアガロース分解酵素の順に添加することが好ましい。
【００７９】
［８］本発明の微生物
本発明の微生物は、本発明の酵素を生産し得るハロコッカス・スピーシーズ（Halococcus sp.） 197A（受領番号：FERM ABP-11336）に関する。このハロコッカス・スピーシーズ 197Aは、独立行政法人産業技術総合研究所の特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１−１−１ つくばセンター 中央第６）に２０１１年１月２７日付けで受領番号：FERM ABP-11336として寄託されている。
【００８０】
Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株は２５％のＮａＣｌを含む寒天培地上で、直径が１〜２ｍｍ、橙色〜赤色のコロニーを形成した。液体培養した細胞は直径０．８〜２．０μｍの球形を呈した。本菌株は濃度０．５％のＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ）とＣａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（ＤＩＦＣＯ）を栄養源として、ＮａＣｌ濃度２５％、ｐＨ７の条件下で極めて良好に増殖した。
【００８１】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
【実施例】
【００８２】
第１ アガラーゼ生産菌の探索
１．実験方法
［Ｉ］アガラーゼの探索
天日塩から、アガラーゼを生産する微生物を探索した。用いた培地組成は表１に示した。培地のｐＨは１Ｎ ＫＯＨ溶液あるいは１Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ ７に調製した後、１２１℃、２０分間のオートクレーブ滅菌を行って調製した。天日塩１ｇを１Ｍ ＮａＣｌ溶液３ｍｌに溶解し、プレート１枚につき５００μｌを塗布した後、３７℃で培養した。
【表１】
【００８３】
［ＩＩ］１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列による系統解析
（１）粗精製ゲノムＤＮＡの抽出
対数増殖期後期まで培養した培養液から８０００×ｇ、３分間の遠心により菌体を回収した。培養液５ｍｌから回収した菌体ペレットを２００μｌのＳＴ緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）に再懸濁した後、２００μｌのＬＳ緩衝液（１００ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０、０．２％ ＳＤＳ）を加えて転倒混和した。１０分間静置した後、２．６ｍｌの滅菌蒸留水を加えて転倒混和した。調製した溶菌液に６ｍｌのエタノールを重層し、ガラス棒で界面をかき混ぜながら長鎖ＤＮＡを巻き取って回収した。回収したＤＮＡは７０％ エタノール溶液で２度洗浄し、風乾の後で適量の滅菌蒸留水に再溶解した。調製したＤＮＡ溶液は−２０℃で保存した。
【００８４】
（２）ＰＣＲによる１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の増幅
ゲノムＤＮＡ中の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ法により増幅した。プライマーセットは配列表の配列番号３および４に示した。
【００８５】
（３）アガロース電気泳動
増幅したＤＮＡ断片を１．１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いた電気泳動によって分析および分離精製を行った。泳動用緩衝液にはＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、２０ｍＭ 酢酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いた。分子量マーカーにはＨｉ−Ｌｏ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ（アートケム）を用い、ＤＮＡ溶液は４×Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと混合してゲルにセットした。１００Ｖ、３０ｍｉｎの電気泳動の後、エチジウムブロマイド溶液に浸漬してＤＮＡを染色し、波長３６５ｎｍのＵＶライトを照らしてＤＮＡのバンドを確認した。ＵＶライト照射下でＤＮＡのバンドを切り出し、ＤＮＡのゲル抽出精製に供した。精製にはＷｉｚａｒｄ ＳＶ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ−ｕｐ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた。
【００８６】
（４）ＴＡクローニングおよび形質転換
精製したＰＣＲ産物はＴＡクローニング用ベクターｐＴＡ２（ＴＯＹＯＢＯ ＴＡｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ）に連結した後、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ−１０１（ＴａＫａＲａ）を形質転換した。形質転換体の検出には１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ（ＤＩＦＣＯ）寒天培地 を用い、３４℃で１６時間培養した。同寒天培地上にコロニーを形成した株をプラスミド抽出に供した。
【００８７】
（５）プラスミドＤＮＡの抽出
１００μｇ／ｍｌのアンピシリン含有ＬＢ培地（ＤＩＦＣＯ）で１８０ｒｐｍ、３７℃、１６時間培養した形質転換体をプラスミドＤＮＡの抽出に用いた。培養液を１２０００×ｇ、１分間の遠心で集菌し、菌体ペレット中からＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００８８】
（６）塩基配列の解析
調製したＤＮＡサンプルについて、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｖｅｒ． ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンス反応を行った。使用したプライマーは配列表の配列番号５および６に示した。反応産物の精製にはＣＥＮＴＲＩ−ＳＥＰ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。得られた試料は真空引きしたデシケータ−内で完全に乾燥させた後、Ｈｉ−Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に再溶解し、９８℃で３分間、次いで４℃で３分間の熱処理を施して、ＡＢＩ ３１３０ｘｌ ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた配列解析に供した。
【００８９】
（７）塩基配列の結合編集および相同性検索
シークエンス解析の結果はＡＴＧＣ Ｖｅｒ．６（ＧＥＮＥＴＹＸコーポレーション）を用いて結合編集した後、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を用いて既知１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列との相同性検索を行い、近縁種を推定した。
【００９０】
（８）系統樹の作成
分離株と、既知近縁種の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子配列データをＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ． １０（ＧＥＮＥＴＹＸコーポレーション）を用いてＦＡＳＴＡフォーマットに変換し、ＣｌｕｓｔａｌＸ Ｖｅｒ．２を用いてＭｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｍｅｎｔｓを行った。出力ファイルから近隣結合法を用いて系統樹を作成した。この時、ブートストラップ値は１０００として枝分岐の信頼度を計算した。
【００９１】
２．実験結果
（１）アガラーゼ活性の検出
アガラーゼ生産菌は、寒天の分解によって生じる寒天培地の凹みを目視で観察して検出した。陽性と疑われた株についてはルゴール液をかけて寒天を染色し、寒天の加水分解で生じた還元糖による非染色領域を形成したものをアガラーゼ生産菌として取得した（図１）。菌株は画線法と限界希釈法により純粋培養株とし、アガラーゼ生産菌１９７Ａ株（受領番号：FERM ABP-11336）を分離した。
【００９２】
（２）アガラーゼ生産菌の系統解析
取得した１９７Ａ株からＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法にて増幅した１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析を行った。決定した配列を用いてＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴプログラムにより既知近縁種を推定し、系統樹を作成した（図２）。本解析の結果、１９７Ａ株は既知近縁種と９９％以下の相同性を示し、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓの近縁種であることが判った。
【００９３】
第２ Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株が生産するアガラーゼの性質解析
１．実験方法
［Ｉ］アガラーゼ活性の定義
アガラーゼ活性の測定はＤＮＳ法（Ｄｉｎｉｔｒｏ ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ法）による還元糖の定量によって行った。反応液の組成はアガロース基質溶液（表２；いずれも終濃度）９００μｌ、酵素液１００μｌとし、反応条件は７５℃、１５分間とした。反応後の溶液に１ｍｌのＤＮＳ試薬（表３；１Ｌ当り）を加えて混合して１００℃、５分間の加熱により発色させた。反応液は室温まで冷却した後、４ｍｌの蒸留水を加えて希釈し、分光光度計により波長５３５ｎｍの吸収を測定した。１分間に１μｍｏｌのガラクトースに相当する還元糖を生成する酵素活性を１ｕｎｉｔと定義した。
【表２】
【表３】
【００９４】
［ＩＩ］アガラーゼの生産と精製
アガラーゼ生産菌はＨｃｃ培地（１Ｌ当りの組成）（表４）で培養し、酵素生産の誘導にはＨｃｃ−Ｓａｌｔ培地（１Ｌ当りの組成）（表５）を用いた。
【表４】
【表５】
【００９５】
定常期まで培養したＨａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株をＨｃｃ培地に１％植菌し、３７℃、１２０ｒｐｍで振とう培養を行った。Ｏ．Ｄ．６００を経時的にモニターし、対数増殖期中期まで培養した後、無菌的に８０００×ｇで遠心分離して菌体を回収した。回収した菌体は培養に用いたＨｃｃ培地と同量のＨｃｃ−Ｓａｌｔ培地に再懸濁し、１２０ｒｐｍ、３７℃で３日間の酵素生産を行った。誘導の後、８０００×ｇで１５分間の遠心操作により、菌体と培養上清を分離した。これより以後の操作は全て４℃で実施した。得られた培養上清にＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液を終濃度５ｍＭ加え、次いでＮａＣｌを飽和するまで溶解し、３０％ ＮａＣｌを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０（東ソー、２．５×１５ｃｍ）に供した。平衡化に用いた緩衝液でカラムを洗浄し、５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０溶液を含む５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．５および０Ｍ ＮａＣｌ溶液で段階的にタンパク質の溶出を行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を回収し、再び飽和するまでＮａＣｌを溶解した後、Ｐｈｅｎｙｌ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０カラム（１×１０ｃｍ）に供した。タンパク質の溶出は５〜０ＭのＮａＣｌ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０）を用いた直線濃度勾配により行った。アガラーゼ活性のある溶出画分を回収し、２．５Ｍ ＮａＣｌを含む５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液に透析し、得られた酵素液をその後の性質解析実験に用いた。
【００９６】
［ＩＩＩ］分子量測定
（１）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
遠心式限外ろ過濃縮カラム（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３ｋＤａ）を用いて酵素液を濃縮した後、微量透析器 （トミー精工、ＥａｓｙＳｅｐ ＭＤ−００３）を用いて５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．０緩衝液に透析を行った。透析済のサンプル溶液を再度限外ろ過濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ−ＰｏｌｙＡｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｃａｔａｐｈｏｒｅｓｉｓ）に供した。分離用ゲルには５〜２０％の濃度勾配ゲル（和光純薬、ＳｕｐｅｒＳｅｐ ５−２０％）を用い、プレシジョンＰｌｕｓデュアルスタンダード（ＢＩＯ−ＲＡＤ、１０−２５０ｋＤａ）を分子量マーカーとして分子量を解析した。電気泳動後のゲルは蒸留水でＳＤＳを除去した後、ＣＢＢにより染色し、タンパク質を検出した。
【００９７】
（２）ゲル濾過クロマトグラフィー
濃縮した酵素溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００（ＧＥヘルスケア）カラムによる分子量解析に供した。移動相には５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７を含む３．５Ｍ ＮａＣｌ溶液 （１．５ ｍｌ／ｍｉｎ）を用い、制御および検出装置にはＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（ＧＥヘルスケア）を使用した。分子量は同条件で解析したリボヌクレアーゼ（１４．８ｋＤａ）、オブアルブミン（４３．５ｋＤａ）、アルブミン（６１．３ｋＤａ）、アルドラーゼ（１７６ｋＤａ）、カタラーゼ（２１９ｋＤａ）のリテンションタイムから計算した。
【００９８】
［ＩＶ］アガラーゼ配列の解析
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析したゲルをＭｉｎｉ Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてポアサイズ０．４５μｍのＰＶＤＦ膜に転写した。転写膜はＣＢＢ染色によりタンパク質を染色して可視化した後、メタノールを含む脱色液で洗浄して不要なＣＢＢを除去した。風乾により乾燥した膜から目的のバンドをカッターナイフで切り出してＮ末端アミノ酸配列解析の試料とした。解析システムにはＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣアミノ酸シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用し、１５サイクルのエドマン分解とアミノ酸分析を行った。
【００９９】
（２）ゲノムシークエンスの解析
アガラーゼ遺伝子の取得を目的とし、Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株のゲノム遺伝子配列を決定した。解析装置にはＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ）を使用し、７０Ｍｂｐ程度のデータ取得を目標とした。本シークエンス解析装置は１フラグメント当たりの読み取り塩基長が４００ｂｐ程度に設定されており、データ取得後の配列結合解析が容易なことから、Ｄｅ ｎｏｖｏ解析に有効である。
【０１００】
まず、対数増殖基中期まで培養した菌体をＳＤＳおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋを用いた定法により溶菌し、ＲＮａｓｅ処理した後、ＰＣＩ抽出とエタノール中でのスプーリングによって高分子ゲノムＤＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡは３００−８００ｂｐに断片化処理し、３’末端と５’末端に特異的に結合する２種類のアダプターを結合・反応させて最終的に１本差ＤＮＡとし、アダプターを介して１つずつビーズに結合させた。各ビーズは油水エマルジョン中に包み込むことでマイクロリアクターを形成し、アダプターの塩基配列を利用したｅｍＰＣＲによりフラグメント配列を増幅した。増幅反応後に油水エマルジョンを破壊してビーズを回収し、シークエンス解析に用いた。
【０１０１】
２．結果
［Ｉ］酵素の精製
Ｈａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株が生産するアガラーゼはカラムクトマトグラム技術を用いて精製した。精製酵素はＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によりゲル上で単一のバンドを形成する事を確認し、このとき分子量は約５６ｋＤａと見積もられた（図３）。また、ゲルろ過クロマトグラフィー分析では、約５５ｋＤａに相当する位置にタンパク質に由来する波長２８０ｎｍの吸収ピークが現れた。回収したフラクション中のアガラーゼ活性のピークは、同ピークと一致した。
【０１０２】
精製酵素は０．３％ アガロース（ナカライテスク、Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥ）溶液（３．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ ６．８）を基質としたとき、７５℃、１５分間の測定条件下で、約２ｕｎｉｔ（酵素１ｍｇ当たり、１分間にガラクトース２μｍｏｌに相当する還元糖を生成）に相当するアガラーゼ活性を示した。
【０１０３】
［ＩＩ］酵素学的解析
（１）基質特異性
寒天はアンヒドロガラクトースとガラクトースを基本単位とした天然高分子であるが、原料とする海藻の種類や、採集地域、製法により、最終製品中のアンヒドロガラクトースや硫酸基の含有量が異なる。これらは寒天溶液の粘度やゲル強度等の物理化学的性質を決定する要素であるが、酵素学的には基質として不均質な状態と見なす事ができる。そこでＨａｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． １９７Ａ株が生産するアガラーゼの基質として最適な寒天を検討した。表６に、Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥに対する活性を１００％とした各基質の相対活性を示す。基質溶液は終濃度３．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのｐＨ ６．８リン酸カリウム緩衝液をベースとし、各基質を０．３％加えて調製した。
【０１０４】
試験した基質
Ａｇａｒｏｓｅ ＭＥ（ナカライテスク）、Ａｇａｒｏｓｅ Ｓ（ニッポンジーン）、Ａｇａｒｏｓｅ ＬＥ（ナカライテスク）、Ａｇａｒ Ｎｏｂｌｅ（ＤＩＦＣＯ）、Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ（ＤＩＦＣＯ）、Ａｇａｒｏｓｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、Ａｇａｒ（ＷＡＫＯ）。
【表６】
【０１０５】
（２）塩濃度依存性
ＮａＣｌ濃度を０−５．０Ｍに調製した基質溶液を用いて、アガラーゼ活性のＮａＣｌ濃度依存性を調べた（図４）。
【０１０６】
（３）塩の代替
基質溶液中のＮａＣｌ（塩化ナトリウム）を、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＣａＣｌ２（塩化カルシウム）、ＬｉＣｌ（塩化リチウム）、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（塩化マグネシウム六水和物）、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（硫酸マグネシウム七水和物）に変更し、塩化ナトリウム以外の塩溶液中で活性を発現できるか調べた（表７）。表７において、“○”は代替可能なもの、“×”は代替不可のものを示す。代替できたＬｉＣｌおよびＫＣｌについてはその濃度依存性についても調べた（図５）。
【表７】
【０１０７】
その結果、１９７Ａ株が生産するアガラーゼは塩化ナトリウム、塩化カリウムあるいは塩化リチウム存在下で活性を呈した。一方、その他の塩化物塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、硫酸塩では代替できなかった。従って、本酵素の活性の発現には１価の陽イオンが必須であった。
【０１０８】
（４）温度依存性
活性測定を３５−１００℃でそれぞれ行い、活性の温度依存性を調べた。結果を図６に示す。
【０１０９】
（５）温度安定性
酵素溶液を７０℃、８０℃、９０℃および９５℃で、それぞれ０−６０ｍｉｎ処理した後の残存活性を経時的に調べた。結果を図７に示す。
【０１１０】
（６）ｐＨ依存性
基質溶液中の緩衝液を、クエン酸緩衝液（ｐＨ ４．０、４．５、５．０、５．５、６．０）、ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ ５．５、６．０、６．５）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．５、６．８、７．０、７．５、８．０）、グリシルグリシン緩衝液（ｐＨ ７．０、７．５、８．０、８．５）、ＴＡＢＳ緩衝液（ｐＨ ８．５、９．０、９．５）に変更してそれぞれ活性測定を行い、アガラーゼ活性のｐＨ依存性を調べた。結果を図８に示す。
【０１１１】
（７）分解産物
アガロースを酵素分解した反応産物をＴＬＣ解析した。反応産物のリファレンスには、ガラクトース、ネオアガロオリゴ４糖、ネオアガロ６糖、アガロースにＴｈａｌａｓｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ３３由来α−アガラーゼを作用させた分解産物、アガロースにＭｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｓｐ． ＪＡＭＢ−Ａ９４由来β−アガラーゼを作用させた分解産物を用いた。
【０１１２】
実験の結果、本酵素はアガロースからネオアガロ糖を生成するエンド型β−アガラーゼと判断された（図９）。
【０１１３】
［ＩＩＩ］アガラーゼ配列の解析
（１）Ｎ末端アミノ酸配列の解析
精製酵素２．８ｐｍｏｌをＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣアミノ酸シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により解析して、１５残基のＮ末端アミノ酸配列（配列表の配列番号７）を決定した。
【０１１４】
得られた配列をサーチキーとしてＮＣＢＩ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴプログラムによる相同配列検索を行ったが、糖質の加水分解に関連するどのタンパク質もヒットせず、新規性の高いアミノ酸配列を持つアガラーゼであることが判った。
【０１１５】
（２）ゲノムシークエンスの解析
Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ ＦＬＸ（Ｒｏｃｈｅ）によるゲノムシークエンスの結果、総リード数１８６，７８８、総塩基数６９，２１７，１２８ｂｐ（約６９Ｍｂｐ）のシークエンスデータを得た。各リードの平均長さは３７０．５７ｂｐであった（図１０）。
【０１１６】
取得した全リードデータをＧＳ ＦＬＸ付属ソフトウェアＧＳ Ｄｅ Ｎｏｖｏ ＡｓｓｅｍｂｌｅｒのＧｅｎｏｍｅ ＰｒｏｊｅｃｔによってＤｅ ｎｏｖｏアッセンブルした。５００ｂｐ以上の配列が得られたコンティグ数は４５、総塩基数は３，４７２，７３２ｂｐ（約３．５Ｍｂｐ）、コンティグの平均長さは７７，１７１ｂｐであり、得られたコンティグの５０％以上は１６６，７５８ｂｐ以上の長さを有していた。配列の９９．８３％は誤差率０．０１％以下の高精度で決定した。また、コンティグ後に１００ｂｐ以上の配列が得られたコンティグ数は５８、総塩基数は３，４７５，３２０ｂｐ（約３．５Ｍｂｐ）であった。ゲノムシークエンス結果の概要を表８に示す。
【表８】
【０１１７】
（３）アガラーゼ遺伝子の取得
Ｎ末端アミノ酸配列解析によって得られた１５残基のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）をサーチキーとして、ゲノムシークエンス解析によって得られた塩基配列に対しＢＬＡＳＴ Ｘ検索（プロテインクエリー ＶＳ 翻訳塩基配列）を行った。検索対象の塩基配列データベースは、検索過程でフォワードおよびリバース方向の計６つの読み取り枠でアミノ酸翻訳した。検索プログラムにはＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１０（ＧＥＮＥＴＹＸコーポレーション）を使用した。その結果、コンティグＮｏ．００００５の約６０ｋｂｐの配列中から、サーチキーに用いたＮ末端アミノ酸配列と１００％一致する配列が１件ヒットした。他の配列との相同性は２９％以下であり、類似配列は得られなかった。
【０１１８】
ヒットした配列の２７残基上流には、開始コドンと考えられるＡＴＧ／メチオニンが、４８８残基下流には終止コドンと考えられるＴＡＡが存在しており、本ＯＲＦ（Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ）は５２９アミノ酸（１５９０ｂｐ）で構成されていた（図１１）。分子量は５７．２ｋＤａでシステインを３残基含み、本酵素を構成するアミノ酸は疎水性４８．５８％、親水性２８．１７％、酸性１１．９８％、塩基性１１．３４％、中性２３．２５％であった。また、ｐＩ値は５．１７と計算された。
【０１１９】
Ｎ末端アミノ酸配列の解析によって得られた１５残基のアミノ酸配列（配列表の配列番号７）から終止コドンまでの５０２アミノ酸から計算される分子量は約５４．６ｋＤａと見積もられ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびゲル濾過クロマトグラフィーで解析した分子量（５６ｋＤａ、５５ｋＤａ）とも良く一致した。相同配列の検索では、１５０アミノ酸以下の短い部分配列に対して最大２９％の相同性を持つ配列がアサインされるのみであり、またその件数も僅か８件に過ぎず、酵素として有意に相同性のある配列はヒットしなかった。Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ ｆａｍｉｌｙ １６（ＧＨ１６）、ＧＨ５０、ＧＨ８６、ＧＨ１１８に属する既知のアガラーゼと配列のアライメント解析も試みたが、触媒残基等の保存領域は見つからなかった。
【０１２０】
［配列番号１］耐熱性アガロース分解酵素のアミノ酸配列
ARETVPPNASASKIQKRIDRAHRKTDAHGYGIVDGEGRTYTIGESLVLRSNTVLQNMKIRVAKGANIDAVTSANFEQNVENSAKTPAEGVPYNFGLSHVTIDGNRGKSNDETYGFSETYNTEGRGVAFYGQNITAQHVTIYRCAGDGWYSRFDHVAPYWEDDWDDLRGLAHTVIGPMYIRRCGGHGLHWEGPHDTTLTKVISAMNNKRGWYQKGVGMDAGVVHTFANSWGSDKSAYPNLHEAPLHINIYYADDDLVVANEMLQAATFRGPYGPNLTLNSNAQIGNLSIWGAGESRDGVVFNGWANQSVNNLNVYEYDGDGVVIDGPHVHIADGRSVQNTGYGVRMGVGTKVWACNVSFQGLNRNEKAGFRYGPAGGGEDNVNSYNRVNLRDWIAGEYVGYDTEDGTLPDSTDEFHIALSGSAEGTGMSWEEGSAVRSGGNGKQFTIAHDMVAAPEHVQITPKTEAAMGEYRVDGDGEAITITYRNAPASGTDNLGWYYRAAL
［配列番号２］耐熱性アガロース分解酵素遺伝子の塩基配列
GCCCGTGAAACCGTTCCGCCGAACGCCTCGGCATCCAAAATCCAGAAGCGGATCGACAGGGCTCACCGGAAAACCGACGCTCACGGCTACGGGATCGTCGATGGAGAGGGGCGGACGTACACCATCGGTGAGTCGCTCGTCCTTCGGTCGAACACCGTCCTCCAGAACATGAAGATTCGGGTCGCCAAGGGCGCGAACATCGACGCCGTCACGTCGGCGAACTTCGAACAGAACGTGGAAAACAGCGCGAAGACCCCCGCGGAAGGCGTCCCGTACAACTTCGGTCTGTCCCACGTCACCATCGACGGCAACCGTGGCAAGTCGAACGACGAGACGTACGGGTTCAGCGAGACGTACAACACGGAGGGCCGCGGTGTCGCCTTCTACGGTCAGAACATCACGGCTCAACACGTCACGATCTACAGATGTGCCGGGGACGGGTGGTACTCCAGGTTCGATCACGTCGCCCCGTACTGGGAGGACGACTGGGACGACCTCCGAGGCCTCGCACACACCGTCATCGGTCCGATGTACATCCGACGCTGTGGCGGCCACGGCCTCCACTGGGAGGGACCACACGACACGACCCTCACCAAAGTGATCAGCGCGATGAACAACAAGCGGGGATGGTACCAGAAGGGAGTCGGGATGGATGCGGGCGTCGTCCACACGTTCGCGAACTCGTGGGGGAGCGACAAGAGCGCCTACCCGAATCTCCACGAGGCGCCGCTCCATATCAACATCTACTACGCGGACGACGACCTCGTCGTGGCCAACGAGATGCTCCAGGCGGCGACCTTCCGGGGGCCCTACGGTCCGAACCTCACGCTCAACAGCAACGCACAGATCGGGAACCTGTCGATCTGGGGAGCCGGTGAATCACGGGATGGCGTCGTCTTCAACGGCTGGGCGAACCAGAGCGTCAACAATCTCAACGTGTACGAGTACGACGGGGACGGCGTCGTGATCGATGGTCCCCACGTGCATATCGCCGACGGTCGGTCGGTCCAGAACACGGGTTACGGCGTCCGGATGGGTGTCGGGACGAAGGTCTGGGCCTGCAACGTGTCGTTCCAGGGGCTGAACCGAAACGAGAAGGCAGGGTTCCGCTACGGCCCCGCCGGCGGCGGGGAGGACAACGTCAACTCGTACAACCGCGTGAACCTCCGGGACTGGATCGCGGGGGAGTACGTGGGCTACGACACCGAGGACGGAACGCTCCCCGACTCCACCGACGAGTTCCACATCGCGCTCTCCGGTTCGGCCGAAGGGACCGGCATGTCGTGGGAGGAGGGGAGCGCGGTCCGGAGCGGGGGCAACGGGAAACAGTTCACGATCGCACACGACATGGTCGCCGCGCCCGAACACGTCCAGATCACGCCGAAGACCGAGGCCGCGATGGGCGAGTATCGGGTCGACGGCGACGGGGAAGCGATCACGATCACGTACCGGAACGCGCCAGCGAGCGGCACGGACAACCTCGGCTGGTACTACAGGGCGGCGCTGTAA
［配列番号３］古細菌用ユニバーサルプライマー １Ｆ
ATTCCGGTTGATCCTGCCGG
［配列番号４］古細菌用ユニバーサルプライマー １４７２Ｒ
AGGAGGTGATCCAGCCGCAG
［配列番号５］ｐＴＡ＿Ｆ （ｖｅｃｔｏｒ’ｓ ｓｉｄｅ）
GTAAAACGACGGCCAGTGAGCG
［配列番号６］ｐＴＡ＿Ｒ （ｖｅｃｔｏｒ’ｓ ｓｉｄｅ）
GGAGCTCCACCGCGGTGGC
［配列番号７］Ｎ末端アミノ酸配列
ARETVPPNASASKIQ
［配列番号８］シグナル配列を含む耐熱性寒天分解酵素アガロース分解酵素のアミノ酸配列
MAFGGRASADTESSVASEAAGPSGTQQARETVPPNASASKIQKRIDRAHRKTDAHGYGIVDGEGRTYTIGESLVLRSNTVLQNMKIRVAKGANIDAVTSANFEQNVENSAKTPAEGVPYNFGLSHVTIDGNRGKSNDETYGFSETYNTEGRGVAFYGQNITAQHVTIYRCAGDGWYSRFDHVAPYWEDDWDDLRGLAHTVIGPMYIRRCGGHGLHWEGPHDTTLTKVISAMNNKRGWYQKGVGMDAGVVHTFANSWGSDKSAYPNLHEAPLHINIYYADDDLVVANEMLQAATFRGPYGPNLTLNSNAQIGNLSIWGAGESRDGVVFNGWANQSVNNLNVYEYDGDGVVIDGPHVHIADGRSVQNTGYGVRMGVGTKVWACNVSFQGLNRNEKAGFRYGPAGGGEDNVNSYNRVNLRDWIAGEYVGYDTEDGTLPDSTDEFHIALSGSAEGTGMSWEEGSAVRSGGNGKQFTIAHDMVAAPEHVQITPKTEAAMGEYRVDGDGEAITITYRNAPASGTDNLGWYYRAAL
［配列番号９］シグナル配列を含む耐熱性寒天分解酵素アガロース分解酵素遺伝子の塩基配列
ATGGCGTTTGGCGGACGTGCCTCCGCCGACACCGAGTCGTCCGTGGCGAGCGAAGCAGCGGGGCCCAGCGGAACCCAGCAGGCCCGTGAAACCGTTCCGCCGAACGCCTCGGCATCCAAAATCCAGAAGCGGATCGACAGGGCTCACCGGAAAACCGACGCTCACGGCTACGGGATCGTCGATGGAGAGGGGCGGACGTACACCATCGGTGAGTCGCTCGTCCTTCGGTCGAACACCGTCCTCCAGAACATGAAGATTCGGGTCGCCAAGGGCGCGAACATCGACGCCGTCACGTCGGCGAACTTCGAACAGAACGTGGAAAACAGCGCGAAGACCCCCGCGGAAGGCGTCCCGTACAACTTCGGTCTGTCCCACGTCACCATCGACGGCAACCGTGGCAAGTCGAACGACGAGACGTACGGGTTCAGCGAGACGTACAACACGGAGGGCCGCGGTGTCGCCTTCTACGGTCAGAACATCACGGCTCAACACGTCACGATCTACAGATGTGCCGGGGACGGGTGGTACTCCAGGTTCGATCACGTCGCCCCGTACTGGGAGGACGACTGGGACGACCTCCGAGGCCTCGCACACACCGTCATCGGTCCGATGTACATCCGACGCTGTGGCGGCCACGGCCTCCACTGGGAGGGACCACACGACACGACCCTCACCAAAGTGATCAGCGCGATGAACAACAAGCGGGGATGGTACCAGAAGGGAGTCGGGATGGATGCGGGCGTCGTCCACACGTTCGCGAACTCGTGGGGGAGCGACAAGAGCGCCTACCCGAATCTCCACGAGGCGCCGCTCCATATCAACATCTACTACGCGGACGACGACCTCGTCGTGGCCAACGAGATGCTCCAGGCGGCGACCTTCCGGGGGCCCTACGGTCCGAACCTCACGCTCAACAGCAACGCACAGATCGGGAACCTGTCGATCTGGGGAGCCGGTGAATCACGGGATGGCGTCGTCTTCAACGGCTGGGCGAACCAGAGCGTCAACAATCTCAACGTGTACGAGTACGACGGGGACGGCGTCGTGATCGATGGTCCCCACGTGCATATCGCCGACGGTCGGTCGGTCCAGAACACGGGTTACGGCGTCCGGATGGGTGTCGGGACGAAGGTCTGGGCCTGCAACGTGTCGTTCCAGGGGCTGAACCGAAACGAGAAGGCAGGGTTCCGCTACGGCCCCGCCGGCGGCGGGGAGGACAACGTCAACTCGTACAACCGCGTGAACCTCCGGGACTGGATCGCGGGGGAGTACGTGGGCTACGACACCGAGGACGGAACGCTCCCCGACTCCACCGACGAGTTCCACATCGCGCTCTCCGGTTCGGCCGAAGGGACCGGCATGTCGTGGGAGGAGGGGAGCGCGGTCCGGAGCGGGGGCAACGGGAAACAGTTCACGATCGCACACGACATGGTCGCCGCGCCCGAACACGTCCAGATCACGCCGAAGACCGAGGCCGCGATGGGCGAGTATCGGGTCGACGGCGACGGGGAAGCGATCACGATCACGTACCGGAACGCGCCAGCGAGCGGCACGGACAACCTCGGCTGGTACTACAGGGCGGCGCTGTAA
【特許請求の範囲】
【請求項１】
寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上である、前記アガロース分解酵素。
【請求項２】
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５４，０００〜５８，０００、または、ゲルろ過法では５３，０００〜５７，０００である、請求項１に記載のアガロース分解酵素。
【請求項３】
一価陽イオンとして、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＬｉ＋を要求する、請求項１または２に記載のアガロース分解酵素。
【請求項４】
至適ｐＨが５．５〜７．０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素。
【請求項５】
ハロコッカス属微生物由来の酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素。
【請求項６】
前記ハロコッカス属微生物がハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）である、請求項５に記載のアガロース分解酵素。
【請求項７】
寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上であり、かつ、
以下（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、前記アガロース分解酵素。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【請求項８】
前記アミノ酸配列が配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列である、請求項７に記載のアガロース分解酵素。
【請求項９】
請求項７または８に記載のアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記塩基配列が以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
【請求項１１】
前記塩基配列が配列表の配列番号９に記載の塩基配列である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の微生物を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法。
【請求項１５】
ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法により得られる、アガロース分解酵素。
【請求項１７】
ＤＮＡを含有したアガロースゲルに、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを含む、アガロースゲル中のＤＮＡの回収方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素、
ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、および
ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液
を含む、アガロースゲル中のＤＮＡを回収するためのキット。
【請求項１９】
ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）。
【請求項１】
寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、かつ、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上である、前記アガロース分解酵素。
【請求項２】
分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で５４，０００〜５８，０００、または、ゲルろ過法では５３，０００〜５７，０００である、請求項１に記載のアガロース分解酵素。
【請求項３】
一価陽イオンとして、Ｎａ＋、Ｋ＋またはＬｉ＋を要求する、請求項１または２に記載のアガロース分解酵素。
【請求項４】
至適ｐＨが５．５〜７．０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素。
【請求項５】
ハロコッカス属微生物由来の酵素である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素。
【請求項６】
前記ハロコッカス属微生物がハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）である、請求項５に記載のアガロース分解酵素。
【請求項７】
寒天からのネオアガロオリゴ糖の生成を触媒する活性を有するアガロース分解酵素であって、
至適温度が６０〜８０℃であり、
８０℃で１０分間の高温条件下に供した後の前記活性が、該高温条件下に供する前の前記活性と比べて８０％以上であり、かつ、
以下（１）〜（３）のいずれかのアミノ酸配列を有する、前記アガロース分解酵素。
（１）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（２）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において１から複数個のアミノ酸が欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列
（３）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
【請求項８】
前記アミノ酸配列が配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配列である、請求項７に記載のアガロース分解酵素。
【請求項９】
請求項７または８に記載のアガロース分解酵素のアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記塩基配列が以下（ａ）〜（ｃ）のいずれかの塩基配列である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列
（ｂ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列において１から複数個の塩基が欠失、置換、付加および／または挿入された塩基配列
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの塩基配列
【請求項１１】
前記塩基配列が配列表の配列番号９に記載の塩基配列である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを有する組換えベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載の組換えベクターにより形質転換された微生物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の微生物を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法。
【請求項１５】
ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）を培養し、培養物よりアガロース分解酵素を採取することを含む、アガロース分解酵素の製造方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製造方法により得られる、アガロース分解酵素。
【請求項１７】
ＤＮＡを含有したアガロースゲルに、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素を作用させてアガロースゲル中のＤＮＡを回収することを含む、アガロースゲル中のＤＮＡの回収方法。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のアガロース分解酵素、
ナトリウム塩、カリウム塩またはリチウム塩、および
ｐＨ５．５〜７．０の緩衝液
を含む、アガロースゲル中のＤＮＡを回収するためのキット。
【請求項１９】
ハロコッカス・スピーシーズ 197A（受領番号：FERM ABP-11336）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１６５６５５（Ｐ２０１２−１６５６５５Ａ）
【公開日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２６７３６（Ｐ２０１１−２６７３６）
【出願日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５０１０６１３１９）学校法人 東洋大学 (68)
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年９月６日（２０１２．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【出願人】（５０１０６１３１９）学校法人 東洋大学 (68)
【出願人】（５０４１９４８７８）独立行政法人海洋研究開発機構 (110)
【Ｆターム（参考）】
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