軸索再生促進剤およびその候補物質を同定する方法
【課題】新規な軸索再生促進剤を提供すること
【解決手段】
第一の手段として、Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤及びＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤の少なくともいずれかを有効成分として含有する軸索再生促進剤とする。軸索再生促進剤は、中枢神経系の軸索の再生を促進するものとして有用である。
また、第二の手段として、試験物質をＷｎｔ又はＲｙｋと接触させ、前記試験物質がＷｎｔ若しくはＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定する軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法とする。
【解決手段】
第一の手段として、Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤及びＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤の少なくともいずれかを有効成分として含有する軸索再生促進剤とする。軸索再生促進剤は、中枢神経系の軸索の再生を促進するものとして有用である。
また、第二の手段として、試験物質をＷｎｔ又はＲｙｋと接触させ、前記試験物質がＷｎｔ若しくはＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定する軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞、特に、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤、及び、軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄等の中枢神経が交通事故等に起因する傷害や脳血管障害等で損傷を受けるとしばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。ところが神経機能は失われたまま再生することはできない。これは末梢神経が再生するのと対照的である。したがって、損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
【０００３】
一方、成人の中枢神経の軸索が末梢神経のグラフトを介して再生し得るという報告がある（例えば下記非特許文献１参照）。したがって、成人の中枢神経が再生しない主な原因は、神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆されており、中枢神経の再生を阻害する主な阻害物質として、Ｎｏｇｏ、ミエリン結合糖タンパク質（以下「ＭＡＧ」という。）及び乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（以下「ＯＭｇｐ」という。）が同定されている（これらについては例えば下記非特許文献２乃至４参照）。
【０００４】
また一方で、本発明者等はこれまでにＲｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（以下「ＲＧＭ」という。）が軸索成長を阻害することを明らかにし、ＲＧＭに対するポリクローナル抗体がＲＧＭの軸索成長阻害活性の中和活性を有することを見いだしている（下記特許文献１及び下記非特許文献５参照）。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０８７２６８号パンフレット
【非特許文献１】Ｓ．Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，９３１−９３３，１９８１
【非特許文献２】Ｍ．Ｓ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３，４３４−４３９，２０００
【非特許文献３】Ｇ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１３，７５７−７６７，１９９４
【非特許文献４】Ｖ．Ｋｏｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，８２，１５６６−１５６９，２００２
【非特許文献５】Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７３，４７−５８，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記軸索再生阻害活性を中和する物質だけでなく、他により有効な軸索再生阻害剤を探索することは非常に重要である。そこで本発明は、中枢神経の軸索の再生を促進することができる新規な軸索再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題につき鋭意検討を行ったところ、脊髄が損傷するとこの近傍でＷｎｔタンパク質（以下「Ｗｎｔ」と表記する。）の発現が増大し、軸索の再生を阻害する活性（以下「軸索成長阻害活性」という。）を有することを見出し、Ｗｎｔの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することで軸索再生が促進することに想到した。また、本発明者等は、Ｗｎｔの高親和性レセプターであるＲｙｋタンパク質（以下「Ｒｙｋ」という。）についても発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することで軸索再生が促進することに想到した。更に、本発明者等は、ＷｎｔとＲｙｋとの結合自体を阻害することでも軸索再生が促進することに想到した。
【０００７】
即ち、上記課題を解決する一手段に係る軸索再生促進剤は、Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤、及びＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなる。
【０００８】
ここで「Ｗｎｔ阻害剤」とは、Ｗｎｔの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいい、限定されるわけではないが、例えば抗Ｗｎｔ抗体及びその抗体断片、アンチセンスオリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉（以下「ＲＮＡｉ」という。）をひき起す分子、を例示することができる。
【０００９】
また「Ｒｙｋ阻害剤」とは、Ｒｙｋの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいい、限定されるわけではないが、例えば抗Ｒｙｋ抗体及びその抗体断片、アンチセンスオリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉをひき起す分子、を例示することができる。
【００１０】
またここで「Ｗｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤」とは、ＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害することができる物質をいう。
【００１１】
ここで「Ｗｎｔ」とは、進化の間に保存されている軸索ガイダンス分子である。Ｗｎｔファミリーのメンバーは、主要な発生プロセス、例えば、パターン形成、細胞の運命の特定、および組織極性の決定の鍵となるレギュレータとして報告されている（Ｃｉａｎｉ Ｌ．&Ｓａｌｉｎａｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，６，３５１−３６２、２００５、及び、Ｚｏｕ Ｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７，５２８−５３２，２００４参照）。ヒトＷｎｔ−５ａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４１２２１）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２０８６１）、ヒトＷｎｔ−３ａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ５６７０４）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６０２８４）、並びにラットＷｎｔ−５ａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ１５５８８）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８８３３３）を、それぞれ配列番号１−６に示しておく。
【００１２】
また「Ｒｙｋ」は、Ｗｎｔの高親和性レセプターであり、ニューロン中で反発シグナルを伝達することが示されている（Ｌｉｕ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８，１１５１−１１５９（２００５）、Ｓｃｈｍｉｔｔ Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９，３１−３７（２００６）、Ｋｅｅｂｌｅ Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２６，５８４０−５８４８（２００６）、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２２，５８３−５８８（２００３））。またＲｙｋは対応する年齢で小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）中で発現される（Ｋａｍｉｔｏｒｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１４，１４９−１６０（１９９９））。ヒトＲｙｋのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３４９２５）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３４９２５）、ラットＲｙｋのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ_５３６３２７ ＸＰ_３４３４５９）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６６９３４０）を、それぞれ配列番号７−１０に示しておく。
【００１３】
なお本手段において、限定されるわけではないが、再生される軸索としては中枢神経系の軸索であることが好ましい。「中枢神経系」とは、脳及び脊髄をいい、限定されるわけではないが、例えば皮質脊髄路の神経、脊髄視床路の神経が該当する。
【００１４】
なお、上記課題の解決に寄与する他の手段として、本発明に係る軸索再生促進剤の候補物質同定方法は、試験物質をＷｎｔ又はＲｙｋと接触させ、試験物質がＷｎｔ若しくはＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定することとする。
【発明の効果】
【００１５】
以上のとおり、本発明により新規な軸索再生促進剤を提供することができる。また、試験物質とＷｎｔ又はＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定することで新規な軸索再生促進剤の候補物質を同定することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に説明する実施形態、実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００１７】
（実施形態１）
本実施形態に係る軸索再生促進剤はＷｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤を有効成分として含有する。
【００１８】
ここで「Ｗｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤」とは、Ｗｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかに起因する軸索成長阻害活性を消失又は少なくとも有意に減少させることができる物質を意味する。なお「軸索成長阻害活性」とは、軸索の成長を阻害する指標となるものであり、後述する実施例に記載から明らかであるが例えば神経突起伸長アッセイにより調べることができる。Ｗｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤の例としては、Ｗｎｔ−Ｒｙｋのシグナリングを阻害することができる任意の物質、例えば、Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤、更にはＷｎｔとＲｙｋとの結合阻害剤物質（以下「Ｗｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤」という。）を挙げることができる。
【００１９】
本実施形態に係るＷｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤は、上記のとおり、Ｗｎｔの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質を意味する。Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としては、限定されるわけではないが、抗Ｗｎｔ抗体、抗Ｒｙｋ抗体及びこれらの抗体断片、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、並びにＲＮＡ干渉（以下「ＲＮＡｉ」という。）を引き起こす分子を挙げることができる。
【００２０】
本明細書において「抗Ｗｎｔ抗体」とはＷｎｔと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味し、「抗Ｒｙｋ抗体」とはＲｙｋと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤として抗体を採用する場合、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
ポリクローナル抗体は、通常よく使用される方法により得られるものでよい。限定されるわけではないが、例えばＷｎｔまたはＲｙｋを感作抗原として用いて動物を免疫し、その血清から得ることができる。
【００２２】
モノクローナル抗体は、通常よく使用される方法により得られるものでよい。限定されるわけではないが、モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマにより産生される抗体、遺伝子組み換え抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体を挙げることができる。ハイブリドーマにより産生される抗体は、例えばＷｎｔ又はＲｙｋを感作抗原として用いて動物を免疫し、得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ、抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。遺伝子組み換え抗体は、例えば抗体遺伝子を含む発現ベクターで動物細胞や植物細胞等を形質転換し、これを培養することにより得ることができる。この抗体遺伝子は、例えば上記ハイブリドーマから抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングすることで得ることができる。また遺伝子組み換え抗体は、抗体遺伝子を動物の胚に導入してトランスジェニック動物を作製し、このトランスジェニック動物から融合タンパク質の形で得ることができる。キメラ抗体は、ある動物（例えばマウス）に由来する抗体遺伝子における可変領域を、他の動物（例えばヒト）の抗体遺伝子の定常領域を組み込んだ発現ベクターに入れ、これを培養することで得ることができる。またＣＤＲ移植抗体は、例えば上記抗体遺伝子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいてそれぞれＣＤＲ１、２、３をコードする遺伝子配列を設計し、他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１、２、３の配列と置き換えることにより得ることができる。
【００２３】
本実施形態においては、上記抗Ｗｎｔ抗体、抗Ｒｙｋ抗体の抗体断片も採用することができる。ＷｎｔまたはＲｙｋに結合しうる抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ディアボディー等を挙げることができる。上記したモノクローナル抗体をパパインやトリプシン等の酵素で処理することにより、又は、これらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより製造することができる。
【００２４】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、Ｗｎｔ又はＲｙｋをコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体であって、ｍＲＮＡと特異的に結合し、転写及び翻訳の少なくともいずれかを阻害することでＷｎｔ又はＲｙｋの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいう。なお結合の種類については限定されず、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく、トリプレックス形成によるものでもよい。
【００２５】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としてのリボザイムは、触媒的特性を有するＲＮＡであって、Ｗｎｔ又はＲｙｋの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいう。リボザイムの構造は、上記機能を奏する限りにおいて限定されず種々の構造を採用することができるが、ハンマーヘッドタイプやヘアピンタイプといった二次構造は好ましい態様である。
【００２６】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としてのＲＮＡｉを引き起こす分子とは、ＲＮＡｉによりＷｎｔ−Ｒｙｋのシグナリングを阻害することのできるものをいう。なおＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
【００２７】
本実施形態に係るＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤は、ＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害することのできるものを意味する。この物質は、この機能を有する限りにおいて限定されず、例えば後述する実施形態にて言及する方法で見出すことができる。
【００２８】
本実施形態に係る軸索再生促進剤は、上記Ｗｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤の他、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝材（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合剤成分を含有することができる。
【００２９】
また本実施形態に係る軸索再生促進剤は、その使用形態に応じて経口的に又は非経口的に投与することができる。経口的な投与としては通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを直接損傷部位に投与する形態を採用することができる。
【００３０】
本実施形態に係る軸索再生促進剤の投与量は、患者の体重、性別、神経損傷の程度、投与の方法に応じて適宜選択されうるが、例えば非経口な投与であって、損傷部位に直接投与する場合、例えば成人１日、１損傷部位あたり、有効成分を１ｍｇ以上１００ｍｇ以下の範囲内で含む量であることが好ましく、より好ましくは有効成分を１ｍｇ以上２０ｍｇ以下の範囲内で含む量である。なお、注射による投与の場合、非経口な投与であっても、有効成分が上記有効成分の量の１０倍程度の範囲内にあることが好ましい。
【００３１】
本発明者等は、下記の実施例で明らかなように、脊髄傷害の後、傷害部位の周囲でＷｎｔタンパク質が発現されていること、更には、Ｒｙｋに対する中和抗体を胸部脊髄挫傷を有するラットに髄腔内投与すると皮質脊髄管の軸索が有意に成長し、機能の回復が促進されることを発見した。これらの結果はＷｎｔファミリーのメンバーが成人中枢神経系において軸索再成長を阻害すること、Ｗｎｔ−Ｒｙｋシグナリングの阻害はヒトＣＮＳ傷害に対する治療としての可能性を有することを示している。即ち、本実施形態により、新規な軸索再生促進剤を提供することができる。
【００３２】
（実施形態２）
本実施形態は、軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法に関する。本実施形態に係る方法では、試験物質をＷｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかと接触させ、この試験物質がＷｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかの機能、並びに、ＷｎｔとＲｙｋとの結合の少なくともいずれかを阻害するか否かを判定する。
【００３３】
試験物質がＷｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかの機能を阻害するか否かを判定する方法としては、限定されるわけではないが、例えば神経突起伸長アッセイを挙げることができる。また、Ｒｙｋの存在下で試験物質をＷｎｔと接触させ、Ｒｈｏキナーゼ活性を測定する方法も挙げることができる。ＷｎｔがそのレセプターであるＲｙｋと結合するとＲｈｏキナーゼ活性が上昇するため、試験物質の存在下でＲｈｏキナーゼ活性の上昇が見られない場合には、その試験物質はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害していると考えることができる。
【００３４】
また、試験物質がＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定する方法としても、通常良く用いられる方法を採用することができ、例えばＥＬＩＳＡ、放射性標識競合アッセイなどを用いることができる。
【００３５】
本実施形態に記載の方法によりＷｎｔ−Ｒｙｋの機能を阻害するものとして同定された物質は、軸索再生促進剤の候補物質となる。ただし、この候補物質については、更に、通常良く用いられる軸索成長アッセイ法等を用いた軸索再生促進効果の確認が必要であり、この効果が認められれば軸索再生促進剤と認定できる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明が以下に示す実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３７】
脊髄挫傷モデルラットの作製
麻酔した（２％ハロタン）雌スプラグドーリーラット（２００〜２５０ｍｇ）にＴ９／Ｔ１０椎骨レベルの椎弓切除を行い脊髄を露出させ、その脊髄を挫傷させた。なお、脊髄の挫傷は脊髄挫傷装置（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｍｐａｃｔｏｒ （Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｆａｉｒｆａｘ， ＶＡ）を用い、その衝撃力は２００ｋｄｙｎとした。
【００３８】
動物モデルにおいて中和抗体処置を行うため、ＳＣＩ（脊髄損傷）の直後にラットに浸透圧ミニポンプを装着した（２００μｌ、０．５μｌ／ｈ、２週間投与；Ａｌｚｅｔ ２００２；Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）。これらのポンプに，対照ウサギＩｇＧ（１５匹，１３．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ，２週間）（Ｓｉｇｍａ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）または抗Ｒｙｋ抗体（１３匹，１３．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ，２週間）を入れた。抗Ｒｙｋ抗体はＲｙｋの細胞外ドメインに対して生じさせたものである（Ａｂｇｅｎｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。動物の背中の皮下にミニポンプを置き，ミニポンプの出口に接続したシラスティックチューブを先端が傷害部位のすぐ尾側になるように脊髄挫傷部位の硬膜下に設置した。硬膜から突出したチューブを固定するために，フィブリンシーラント（Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ; ＺＬＢ Ｂｅｈｒｉｎｇ， Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ， ＰＡ）を硬膜上に滴下した。その後，筋肉および皮膚層を縫合した。膀胱機能が回復するまで少なくとも１日に２回手動で腹部加圧することにより膀胱から排泄させた。シャム手術ラット（ｎ＝６）は，椎骨レベルＴ９／Ｔ１０で椎弓切除を施し，脊髄を露出させた。３匹のラットでは，０．８５％食塩水を入れたミニポンプおよびこれに接続したシラスティックチューブを設置した。それ以外のラットには，ミニポンプもシラスティックチューブも設置しなかった。次に，筋肉および皮膚層を縫合した。
【００３９】
脊髄切断モデルラットの作製
脊髄切断モデルとしては，ラットに椎骨レベルＴ９／１０で椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。１１番の刃を用いて脊髄を全切除し，筋肉および皮膚層を縫合した。
【００４０】
免疫組織化学によるＷｎｔ発現のアッセイ
ラット組織切片モデルを用いて胸部脊髄傷害（ＳＣＩ）後のＷｎｔ発現を調べた。傷害を受けていない脊髄，および傷害の１、３、および７日後の脊髄組織切片を固定して，免疫組織化学を実施した。
【００４１】
免疫組織化学のために、傷害を受けていない脊髄および傷害の１、３、７日後の脊髄から組織を取得した。具体的には、動物にペントバルビタールナトリウムを投与して深く麻酔した後ＰＢＳで、次に４％パラホルムアルデヒドで潅流することにより犠牲死させた。脊髄を切開し、同じ固定剤中で一晩固定し、ＰＢＳ中の２０％ショ糖溶液中で低温保存した。損傷部位から５ｍｍ以上吻側および５ｍｍ以上尾側に位置する脊髄（長さ１０ｍｍ）をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ中に包埋し、直ちに液体窒素で−８０℃で凍結した。傍矢状または横断面の一連の切片をクリオスタットを用いて５０μｍに切断し、ＰＬＬで被覆したＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−Ｐｌｕｓスライド（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ， Ｏｓａｋａ Ｊａｐａｎ）上にマウントした。
【００４２】
切片をＰＢＳで３回洗浄し、５％ウシ血清アルブミンおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で室温で１時間ブロッキングした。切片は一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、フルオレセイン結合二次抗体（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに室温で１時間インキュベートした。
【００４３】
抗Ｗｎｔ−３ａ抗体は，マウスＷｎｔ−３ａ（Ｋｉｓｈｉｄａ Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ． &Ｋｉｋｕｃｈｉ Ａ．、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２４、４４８７−４５０１（２００４））のアミノ酸残基１３９−１５５に対応する合成ペプチド（ＳＳＲＬＱＧＳＰＧＥＧＷＫＷＧＧＣ（配列番号１１））でウサギを免疫することにより生成した。抗Ｗｎｔ−５ａ抗体はマウスＷｎｔ−５ａに対応する合成ペプチドでウサギを免疫することにより生成した。また，アストロサイトおよびニューロンを検出するための一次抗体としては，抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはニューロン特異的β−チューブリンＩＩＩタンパク質を認識するモノクローナル抗体（Ｔｕｊ１）（１：５００；Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｙ，ＣＡ）を用いた。
【００４４】
成人ラットの傷害を受けていない脊髄から調製した傍矢状切片は抗Ｗｎｔ−５ａ抗体で染色され、抗Ｔｕｊ１抗体および抗Ｗｎｔ−５ａ抗体で二重染色された。したがってＷｎｔ−５ａは白質の軸索で発現されていることが示された。
【００４５】
次に，ＧＦＡＰ，ＩＢ４および抗Ｗｎｔ−５ａ抗体を用いて，傷害後の脊髄におけるＷｎｔ−５ａ発現を調べた。ＳＣＩの１日後および７日後，損傷部位の中心点の周りのグリア筋原線維産生タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性の星状膠細胞で強いＷｎｔ−５ａの発現が観察された。Ｗｎｔ−５ａの発現はＩＢ４陽性細胞（おそらくは小神経膠細胞／マクロファージ）でも観察された。以上の結果から，Ｗｎｔ−５ａは脊髄傷害後に誘導されることがわかった。
【００４６】
また，同様にして，ＧＦＡＰ，ＩＢ４および抗Ｗｎｔ−３ａ抗体を用いて，傷害後の脊髄におけるＷｎｔ−３ａ発現を調べた。ＳＣＩの７日後にＧＦＡＰとＷｎｔ−３ａが損傷部位の周りに局在していることが示された。また，ＳＣＩの７日後にＩＢ４とＷｎｔ−３ａ抗体による二重標識が共局在していることが示された。すなわち，Ｗｎｔ−３ａについても，傷害の７日後にＷｎｔ−５ａと同様の誘導パターンが観察された。
【００４７】
ウエスタンブロット分析
さらに，これらの脊髄組織を用いたウエスタンブロッティングにより，Ｗｎｔタンパク質の発現を調べた。
【００４８】
成人ラット脊髄を，プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および０．５％ Ｂｒｉｊ−５８（Ｓｉｇｍａ）中で溶解した。溶解物を４℃で２０分間インキュベートし、次に１３，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離することにより清澄化した。上清を回収しタンパク質濃度に関して標準化した。１２％β−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファを等量で加えて５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し抗Ｗｎｔ−５ａ抗体（１：１０００）または抗Ｗｎｔ−３ａ抗体（１：１０００）とともにインキュベートした。検出のためには、ＥＣＬ化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、及びＨＲＰ結合二次抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ）を用いた。
【００４９】
結果を図１に示す。なお図中、「Ｒｏｓｔａｌ」は損傷部位の５ｍｍ吻側に位置する脊髄組織を意味し、「Ｌｅｓｉｏｎ ｓｉｔｅ」は損傷部位の脊髄組織を意味し、「Ｃａｕｄａｌ」は損傷部位の５ｍｍ尾側に位置する脊髄組織を意味し、Ｃｏｎｔｒｏｌは傷害を与えていない動物の骨髄組織を意味する。その結果、傷害の７日後にＷｎｔ−５ａおよびＷｎｔ−３ａが脊髄の損傷組織で発現していることが示された。
【００５０】
神経突起伸長アッセイ
胸部脊髄傷害（ＳＣＩ）において，Ｗｎｔタンパク質が軸索阻害に寄与しているか否かをインビトロで確かめるため，出生後ラット（Ｐ６−Ｐ１０）から得た小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を用いて神経突起伸長を測定した。
【００５１】
出生後ラット仔（Ｐ６−Ｐ１０）から小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を採取して，トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＰＢＳ，３７℃で１０分間）により解離させた後，血清含有培地中に再懸濁し，ばらばらにした後，ＰＢＳで３回洗浄した。細胞は無血清ＤＭＥＭ培地中で成長させた。
【００５２】
出生後ラットからのＣＧＮを，ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）で被覆したスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ， Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ; Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）上でコンディションド培地に播種し、Ｗｎｔ−５ａの存在下または非存在下で２４時間インキュベートした。Ｗｎｔ−５ａタンパク質は９０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｗｎｔ−５ａのＹ２７６３２（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｊａｐａｎ）を用いる場合には１０μＭとなるように培養物に加えた。中和抗体アッセイのためには抗Ｒｙｋ抗体（Ａｂｇｅｎｔ）を０．５μｇ／ｍｌの濃度で培養物に加えた。
【００５３】
細胞を４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒド中で固定し，ニューロン特異的β−チューブリンＩＩＩタンパク質を認識するモノクローナル抗体（Ｔｕｊ１）（１：１０００；Ｃｏｖａｎｃｅ）で免疫染色した。次にβ−チューブリンＩＩＩ陽性ニューロンのそれぞれについて最も長い神経突起の長さを測定した。
【００５４】
図２ａは、小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を可溶型Ｗｎｔ−５ａ（９０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＹ２７６３２（１０μＭ）とともに、またはそれらなしで２４時間培養した後、Ｔｕｊ１で染色した結果を示す。図２ｂはニューロンあたりの最長神経突起の平均長さを示す。なお、図中のデータは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表している。また図中＊は、対照と比較してｐ＜０．０１であることを、＊＊は、Ｗｎｔ−５ａと比較してｐ＜０．０１（一元ＡＮＯＶＡ、次にシェフェの多重比較検定）であることを意味している。
【００５５】
この結果，可溶型のＷｎｔ−５ａはＣＧＮの神経突起伸長を有意に阻害することが示された。また、ＣＧＮを１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｈｏ−キナーゼの特異的阻害剤）で処理すると、Ｗｎｔ−５ａの効果が弱まり、一方、Ｙ２７６３２単独では神経突起の成長に影響を及ぼさないことからこの阻害効果はＲｈｏ関連セリン／トレオニンキナーゼ（Ｒｈｏ−キナーゼ）に依存することがわかった。すなわちＷｎｔ−５ａはＲｈｏ−キナーゼ依存性のメカニズムによりＣＧＮの神経突起伸長を阻害することが明らかとなった。
【００５６】
次に、Ｗｎｔに媒介されるＣＧＮの神経突起成長の阻害にＷｎｔの高親和性レセプターであるＲｙｋが関与しているか否かを調べた。Ｒｙｋの細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体（抗Ｒｙｋ）を用いて抗Ｒｙｋ抗体がＷｎｔ−５ａ媒介性の神経突起成長阻害をブロックしうるか否かを試験した。
【００５７】
図２ｃは、ＣＧＮをＰＬＬで被覆したチャンバースライドでコンディションド培地で可溶性Ｗｎｔ−５ａ（９０ｎｇ／ｍｌ）および／または抗Ｒｙｋ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）とともにまたはそれらなしで２４時間培養した後、Ｔｕｊ１で染色した結果を示す。また図２ｄは、ニューロンあたりの最長神経突起の平均長さを示す。なお図中、データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表しており。＊は、対照と比較してｐ＜０．０１であることを、＊＊は、Ｗｎｔ−５ａと比較してｐ＜０．０１（一元ＡＮＯＶＡ，次にシェフェの多重比較検定）であることを意味している。
【００５８】
この結果、抗Ｒｙｋ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）を加えるとＷｎｔ−５ａの阻害効果が有効にブロックされたことが観察された。一方、抗Ｒｙｋ抗体単独では神経突起成長に影響を与えなかった。したがって抗Ｒｙｋ抗体はＷｎｔ−５ａの効果を逆転させることがわかった。
【００５９】
上述の結果は，Ｗｎｔタンパク質が神経突起伸長を阻害する能力をもち，ＳＣＩ後の傷害を受けた軸索の再成長のバリアとして作用すること、およびＷｎｔタンパク質の機能またはシグナル伝達をブロックするとＳＣＩ後の回復が促進されることを示唆している。
【００６０】
挙動試験
臨床病態を模倣するラット脊髄外傷モデルを用いて挙動試験を行った。上述のように胸部脊髄障害（ＳＣＩ）を与えた後、傷害部位の近傍に留置した髄腔内カテーテルを通して浸透圧ミニポンプにより抗Ｒｙｋ抗体または対照ウサギＩｇＧを２週間投与した。傷害後８週間、動物の運動能力をモニターした。モデル動物における脊髄障害後の挙動回復はオープンフィールド環境中でＢＢＢ（Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ）運動評点スケールを用いて評価した。定量は２名の観察者により盲目方式で行った。
【００６１】
図３は、抗Ｒｙｋ抗体処置、対照ＩｇＧ処置、およびシャム手術ラットにおいて、胸部挫傷後の一定時間にＢＢＢスコアを測定した結果を示す。図中の値は、それぞれ１３、１５、および６匹のラットの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示している。＊は対照と比較してｐ＜０．０５であることを意味している。
【００６２】
脊髄傷害を受けていないシャム手術ラットは，ＢＢＢ運動評点スケールによるフルスコアに達した。これに対し、脊髄を傷害したすべてのラットは傷害の後第１日から第３日にほぼ完全に対麻痺となった。ＢＢＢスコアにより示されるように、ラットは徐々に運動挙動の部分的な回復を示した。傷害の２−８週間後、抗Ｒｙｋ抗体で処置したラットの運動能力は対照ＩｇＧで処置したラットより優れた回復を示す傾向にあった。平均では手術の８週間後に対照ＩｇＧ処置ラットのＢＢＢスコアは１２．７であり、抗Ｒｙｋ抗体処置ラットでは統計学的に有意に高いＢＢＢスコアである１５．８を示した。すなわち抗Ｒｙｋ抗体を投与することによりＳＣＩ後の運動の回復が促進されることが明らかになった。
【００６３】
順行性ＣＳＴ標識
ビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）を片側の感覚運動皮質に注入することにより先に試験したラットの背側下行皮質脊髄管（ＣＳＴ）の一体性を評価した。傷害の６週間後，麻酔下でＢＤＡ（食塩水中１０％，皮質あたり２．０μｌ，ＭＷ：１０，０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を左運動皮質に注入し（座標：ブレグマの０．５−２．５ｍｍ後方、ブレグマの２ｍｍ側方、深さ１．５ｍｍ）、ＣＳＴ線維をＢＤＡで標識した。マイクロリットルシリンジに取り付けた内径１５−２０μｍのガラスキャピラリーを通して０．５μｌのＢＤＡを３０秒間かけて注射した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）。合計で４匹の対照および７匹の抗Ｒｙｋ抗体処置ラットについてＳＣＩ後の再生応答を調べ、比較した。
【００６４】
ＢＤＡ注射の１４日後ＰＢＳで、次に４％パラホルムアルデヒドで潅流することにより動物を犠牲死させた。脊髄を切開し、同じ固定剤中で一晩固定し、ＰＢＳ中の２０％ショ糖溶液中で低温保存した。損傷部位から５ｍｍ以上吻側および５ｍｍ以上尾側に位置する脊髄（長さ１０ｍｍ）をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ中に包埋した。これらのブロックから矢状面（５０μｍ）または水平面で切片を作成し、各切片を保存した。また、傷害部位の５ｍｍ以上吻側および尾側に位置する脊髄からも水平面切片を作成した。これらの切片を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ストレプトアビジン（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに１時間インキュベートした。
【００６５】
４匹の対照ラットおよび７匹の抗Ｒｙｋ抗体処置ラットについて、傷害の中心の５ｍｍ吻側および５ｍｍ尾側に延びるブロックを矢状面で切りだした。抗Ｒｙｋ抗体処置ラットにおいては損傷部位の尾側の組織で典型的な異常蛇行成長パターンを有する標識された線維が高頻度に観察された。一方、対照ＩｇＧ処置ラットではＢＤＡで標識されたＣＳＴ線維は検出されなかった。なお、傷害部位の１０ｍｍ上方に位置する標識された線維の総数は、抗Ｒｙｋ抗体処置と対照ＩｇＧ処置ラットとの間で有意な相違は観察されなかった。したがって、ＢＤＡ取り込みの程度はこれらの群の間で同一であることが示された。
【００６６】
次に、傷害脊髄の横断面切片を再構築し、標識されたＣＳＴ線維の数を評価した。４匹の対照および７匹の抗Ｒｙｋ抗体処置ラットについて５０μｍ厚さの横断面切片を評価した。各切片について損傷部位の４ｍｍ上から４ｍｍ下までのＢＤＡ標識線維の交点の数を数えた。軸索数は損傷部位の４ｍｍ上の小脳顆粒ニューロン（ＣＳＴ）が無傷である部位で観察された線維に対するパーセンテージとして計算した。損傷部位の中心から尾側の距離を正の距離、吻側を負の距離として評点した。
【００６７】
結果を図４に示す。なお図中、ｘ軸は脊髄の吻尾軸に沿った特定の位置を示す。ｙ軸は示されている部位におけるＢＤＡ標識繊維の数の損傷部位の４ｍｍ吻側における数に対する比率を示す。尚図中＊は、対照と比較してｐ＜０．０１であることを意味し、＊＊は、対照と比較してｐ＜０．０６（スチューデントｔ検定）であることを意味する。
【００６８】
抗Ｒｙｋ抗体処置ラットでは、損傷部位の４ｍｍ吻側で観察された標識された線維の数と比較して、標識された線維の２０％以上が損傷部位の中心から１−２ｍｍ尾側で観察された。しかし、対照ＩｇＧ処置ラットにおいては、標識された線維のわずかの割合（傷害部位の尾側１ｍｍでは０％、２ｍｍでは３％）しか観察されなかった。標識された線維は抗Ｒｙｋ抗体で処置した傷害動物の灰白質で検出された。これらの結果は抗Ｒｙｋ抗体を投与することによりＳＣＩ後の背側下行皮質脊髄管（ＣＳＴ）線維の成長が促進され，軸索の再生が促進されることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明に係る軸索再生促進剤は、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤として有効であり、中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として産業上の利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は，脊髄組織におけるＷｎｔタンパク質の発現を示す。
【図２】図２は，小脳顆粒ニューロンを用いる神経突起伸長アッセイの結果を示す。
【図３】図３は，脊髄損傷後に抗Ｒｙｋ抗体で処置したラットの挙動試験の結果を示す。
【図４】図４は，ＢＤＡで標識した背側下行皮質脊髄管線維の成長を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経細胞、特に、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤、及び、軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脊髄等の中枢神経が交通事故等に起因する傷害や脳血管障害等で損傷を受けるとしばしば部分的又は完全な麻痺が起きる。ところが神経機能は失われたまま再生することはできない。これは末梢神経が再生するのと対照的である。したがって、損傷した中枢神経を再生させることは医療分野における重要な課題である。
【０００３】
一方、成人の中枢神経の軸索が末梢神経のグラフトを介して再生し得るという報告がある（例えば下記非特許文献１参照）。したがって、成人の中枢神経が再生しない主な原因は、神経細胞を取り巻く局所的な環境にあることが示唆されており、中枢神経の再生を阻害する主な阻害物質として、Ｎｏｇｏ、ミエリン結合糖タンパク質（以下「ＭＡＧ」という。）及び乏突起神経膠細胞−ミエリン糖タンパク質（以下「ＯＭｇｐ」という。）が同定されている（これらについては例えば下記非特許文献２乃至４参照）。
【０００４】
また一方で、本発明者等はこれまでにＲｅｐｕｌｓｉｖｅ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ（以下「ＲＧＭ」という。）が軸索成長を阻害することを明らかにし、ＲＧＭに対するポリクローナル抗体がＲＧＭの軸索成長阻害活性の中和活性を有することを見いだしている（下記特許文献１及び下記非特許文献５参照）。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００５／０８７２６８号パンフレット
【非特許文献１】Ｓ．Ｄａｖｉｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，９３１−９３３，１９８１
【非特許文献２】Ｍ．Ｓ．Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０３，４３４−４３９，２０００
【非特許文献３】Ｇ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１３，７５７−７６７，１９９４
【非特許文献４】Ｖ．Ｋｏｔｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，８２，１５６６−１５６９，２００２
【非特許文献５】Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７３，４７−５８，２００６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記軸索再生阻害活性を中和する物質だけでなく、他により有効な軸索再生阻害剤を探索することは非常に重要である。そこで本発明は、中枢神経の軸索の再生を促進することができる新規な軸索再生促進剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題につき鋭意検討を行ったところ、脊髄が損傷するとこの近傍でＷｎｔタンパク質（以下「Ｗｎｔ」と表記する。）の発現が増大し、軸索の再生を阻害する活性（以下「軸索成長阻害活性」という。）を有することを見出し、Ｗｎｔの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することで軸索再生が促進することに想到した。また、本発明者等は、Ｗｎｔの高親和性レセプターであるＲｙｋタンパク質（以下「Ｒｙｋ」という。）についても発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することで軸索再生が促進することに想到した。更に、本発明者等は、ＷｎｔとＲｙｋとの結合自体を阻害することでも軸索再生が促進することに想到した。
【０００７】
即ち、上記課題を解決する一手段に係る軸索再生促進剤は、Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤、及びＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤の少なくともいずれかを有効成分として含有してなる。
【０００８】
ここで「Ｗｎｔ阻害剤」とは、Ｗｎｔの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいい、限定されるわけではないが、例えば抗Ｗｎｔ抗体及びその抗体断片、アンチセンスオリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉（以下「ＲＮＡｉ」という。）をひき起す分子、を例示することができる。
【０００９】
また「Ｒｙｋ阻害剤」とは、Ｒｙｋの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいい、限定されるわけではないが、例えば抗Ｒｙｋ抗体及びその抗体断片、アンチセンスオリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉをひき起す分子、を例示することができる。
【００１０】
またここで「Ｗｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤」とは、ＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害することができる物質をいう。
【００１１】
ここで「Ｗｎｔ」とは、進化の間に保存されている軸索ガイダンス分子である。Ｗｎｔファミリーのメンバーは、主要な発生プロセス、例えば、パターン形成、細胞の運命の特定、および組織極性の決定の鍵となるレギュレータとして報告されている（Ｃｉａｎｉ Ｌ．&Ｓａｌｉｎａｓ，Ｐ．Ｃ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，６，３５１−３６２、２００５、及び、Ｚｏｕ Ｙ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７，５２８−５３２，２００４参照）。ヒトＷｎｔ−５ａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ４１２２１）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２０８６１）、ヒトＷｎｔ−３ａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ５６７０４）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０６０２８４）、並びにラットＷｎｔ−５ａのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＦ１５５８８）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ１８８３３３）を、それぞれ配列番号１−６に示しておく。
【００１２】
また「Ｒｙｋ」は、Ｗｎｔの高親和性レセプターであり、ニューロン中で反発シグナルを伝達することが示されている（Ｌｉｕ Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，８，１１５１−１１５９（２００５）、Ｓｃｈｍｉｔｔ Ａ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３９，３１−３７（２００６）、Ｋｅｅｂｌｅ Ｔ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２６，５８４０−５８４８（２００６）、Ｙｏｓｈｉｋａｗａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４２２，５８３−５８８（２００３））。またＲｙｋは対応する年齢で小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）中で発現される（Ｋａｍｉｔｏｒｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． Ｄｅｖ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． １１４，１４９−１６０（１９９９））。ヒトＲｙｋのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３４９２５）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ３４９２５）、ラットＲｙｋのアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ_５３６３２７ ＸＰ_３４３４５９）及びこれをコードするｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ６６９３４０）を、それぞれ配列番号７−１０に示しておく。
【００１３】
なお本手段において、限定されるわけではないが、再生される軸索としては中枢神経系の軸索であることが好ましい。「中枢神経系」とは、脳及び脊髄をいい、限定されるわけではないが、例えば皮質脊髄路の神経、脊髄視床路の神経が該当する。
【００１４】
なお、上記課題の解決に寄与する他の手段として、本発明に係る軸索再生促進剤の候補物質同定方法は、試験物質をＷｎｔ又はＲｙｋと接触させ、試験物質がＷｎｔ若しくはＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定することとする。
【発明の効果】
【００１５】
以上のとおり、本発明により新規な軸索再生促進剤を提供することができる。また、試験物質とＷｎｔ又はＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定することで新規な軸索再生促進剤の候補物質を同定することもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明するが、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に説明する実施形態、実施例に限定されるものではないことはいうまでもない。
【００１７】
（実施形態１）
本実施形態に係る軸索再生促進剤はＷｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤を有効成分として含有する。
【００１８】
ここで「Ｗｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤」とは、Ｗｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかに起因する軸索成長阻害活性を消失又は少なくとも有意に減少させることができる物質を意味する。なお「軸索成長阻害活性」とは、軸索の成長を阻害する指標となるものであり、後述する実施例に記載から明らかであるが例えば神経突起伸長アッセイにより調べることができる。Ｗｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤の例としては、Ｗｎｔ−Ｒｙｋのシグナリングを阻害することができる任意の物質、例えば、Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤、更にはＷｎｔとＲｙｋとの結合阻害剤物質（以下「Ｗｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤」という。）を挙げることができる。
【００１９】
本実施形態に係るＷｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤は、上記のとおり、Ｗｎｔの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質を意味する。Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としては、限定されるわけではないが、抗Ｗｎｔ抗体、抗Ｒｙｋ抗体及びこれらの抗体断片、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、並びにＲＮＡ干渉（以下「ＲＮＡｉ」という。）を引き起こす分子を挙げることができる。
【００２０】
本明細書において「抗Ｗｎｔ抗体」とはＷｎｔと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味し、「抗Ｒｙｋ抗体」とはＲｙｋと抗原抗体反応により結合しうる抗体を意味する。Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤として抗体を採用する場合、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【００２１】
ポリクローナル抗体は、通常よく使用される方法により得られるものでよい。限定されるわけではないが、例えばＷｎｔまたはＲｙｋを感作抗原として用いて動物を免疫し、その血清から得ることができる。
【００２２】
モノクローナル抗体は、通常よく使用される方法により得られるものでよい。限定されるわけではないが、モノクローナル抗体は、例えばハイブリドーマにより産生される抗体、遺伝子組み換え抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体を挙げることができる。ハイブリドーマにより産生される抗体は、例えばＷｎｔ又はＲｙｋを感作抗原として用いて動物を免疫し、得られる免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞と融合させ、抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、このハイブリドーマを培養することにより得ることができる。遺伝子組み換え抗体は、例えば抗体遺伝子を含む発現ベクターで動物細胞や植物細胞等を形質転換し、これを培養することにより得ることができる。この抗体遺伝子は、例えば上記ハイブリドーマから抗体をコードするｃＤＮＡをクローニングすることで得ることができる。また遺伝子組み換え抗体は、抗体遺伝子を動物の胚に導入してトランスジェニック動物を作製し、このトランスジェニック動物から融合タンパク質の形で得ることができる。キメラ抗体は、ある動物（例えばマウス）に由来する抗体遺伝子における可変領域を、他の動物（例えばヒト）の抗体遺伝子の定常領域を組み込んだ発現ベクターに入れ、これを培養することで得ることができる。またＣＤＲ移植抗体は、例えば上記抗体遺伝子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の遺伝子配列に基づいてそれぞれＣＤＲ１、２、３をコードする遺伝子配列を設計し、他の動物に由来する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むベクター中の対応するＣＤＲ１、２、３の配列と置き換えることにより得ることができる。
【００２３】
本実施形態においては、上記抗Ｗｎｔ抗体、抗Ｒｙｋ抗体の抗体断片も採用することができる。ＷｎｔまたはＲｙｋに結合しうる抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ディアボディー等を挙げることができる。上記したモノクローナル抗体をパパインやトリプシン等の酵素で処理することにより、又は、これらをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を得ることにより製造することができる。
【００２４】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としてのアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、Ｗｎｔ又はＲｙｋをコードするｍＲＮＡと相補的な配列を有する核酸分子またはその誘導体であって、ｍＲＮＡと特異的に結合し、転写及び翻訳の少なくともいずれかを阻害することでＷｎｔ又はＲｙｋの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいう。なお結合の種類については限定されず、ワトソン・クリックまたはフーグスティーン型の塩基対相補性によるものでもよく、トリプレックス形成によるものでもよい。
【００２５】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としてのリボザイムは、触媒的特性を有するＲＮＡであって、Ｗｎｔ又はＲｙｋの発現及び機能の少なくともいずれかを抑制することができる物質をいう。リボザイムの構造は、上記機能を奏する限りにおいて限定されず種々の構造を採用することができるが、ハンマーヘッドタイプやヘアピンタイプといった二次構造は好ましい態様である。
【００２６】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤としてのＲＮＡｉを引き起こす分子とは、ＲＮＡｉによりＷｎｔ−Ｒｙｋのシグナリングを阻害することのできるものをいう。なおＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡ分子を用いて標的遺伝子をサイレンシングする手法をいう。
【００２７】
本実施形態に係るＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤は、ＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害することのできるものを意味する。この物質は、この機能を有する限りにおいて限定されず、例えば後述する実施形態にて言及する方法で見出すことができる。
【００２８】
本実施形態に係る軸索再生促進剤は、上記Ｗｎｔ−Ｒｙｋ阻害剤の他、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、賦形剤、希釈剤（例えば蒸留水）、ｐＨ緩衝材（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合剤成分を含有することができる。
【００２９】
また本実施形態に係る軸索再生促進剤は、その使用形態に応じて経口的に又は非経口的に投与することができる。経口的な投与としては通常用いられる投与形態、例えば粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁液、油剤、乳化剤等の投与形態を採用することができる。非経口的な投与としては、通常用いられる投与形態、例えば上記の液剤、懸濁液等にしたものを直接損傷部位に投与する形態を採用することができる。
【００３０】
本実施形態に係る軸索再生促進剤の投与量は、患者の体重、性別、神経損傷の程度、投与の方法に応じて適宜選択されうるが、例えば非経口な投与であって、損傷部位に直接投与する場合、例えば成人１日、１損傷部位あたり、有効成分を１ｍｇ以上１００ｍｇ以下の範囲内で含む量であることが好ましく、より好ましくは有効成分を１ｍｇ以上２０ｍｇ以下の範囲内で含む量である。なお、注射による投与の場合、非経口な投与であっても、有効成分が上記有効成分の量の１０倍程度の範囲内にあることが好ましい。
【００３１】
本発明者等は、下記の実施例で明らかなように、脊髄傷害の後、傷害部位の周囲でＷｎｔタンパク質が発現されていること、更には、Ｒｙｋに対する中和抗体を胸部脊髄挫傷を有するラットに髄腔内投与すると皮質脊髄管の軸索が有意に成長し、機能の回復が促進されることを発見した。これらの結果はＷｎｔファミリーのメンバーが成人中枢神経系において軸索再成長を阻害すること、Ｗｎｔ−Ｒｙｋシグナリングの阻害はヒトＣＮＳ傷害に対する治療としての可能性を有することを示している。即ち、本実施形態により、新規な軸索再生促進剤を提供することができる。
【００３２】
（実施形態２）
本実施形態は、軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法に関する。本実施形態に係る方法では、試験物質をＷｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかと接触させ、この試験物質がＷｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかの機能、並びに、ＷｎｔとＲｙｋとの結合の少なくともいずれかを阻害するか否かを判定する。
【００３３】
試験物質がＷｎｔ及びＲｙｋの少なくともいずれかの機能を阻害するか否かを判定する方法としては、限定されるわけではないが、例えば神経突起伸長アッセイを挙げることができる。また、Ｒｙｋの存在下で試験物質をＷｎｔと接触させ、Ｒｈｏキナーゼ活性を測定する方法も挙げることができる。ＷｎｔがそのレセプターであるＲｙｋと結合するとＲｈｏキナーゼ活性が上昇するため、試験物質の存在下でＲｈｏキナーゼ活性の上昇が見られない場合には、その試験物質はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害していると考えることができる。
【００３４】
また、試験物質がＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定する方法としても、通常良く用いられる方法を採用することができ、例えばＥＬＩＳＡ、放射性標識競合アッセイなどを用いることができる。
【００３５】
本実施形態に記載の方法によりＷｎｔ−Ｒｙｋの機能を阻害するものとして同定された物質は、軸索再生促進剤の候補物質となる。ただし、この候補物質については、更に、通常良く用いられる軸索成長アッセイ法等を用いた軸索再生促進効果の確認が必要であり、この効果が認められれば軸索再生促進剤と認定できる。
【実施例】
【００３６】
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明が以下に示す実施例に限定されるものでないことはいうまでもない。
【００３７】
脊髄挫傷モデルラットの作製
麻酔した（２％ハロタン）雌スプラグドーリーラット（２００〜２５０ｍｇ）にＴ９／Ｔ１０椎骨レベルの椎弓切除を行い脊髄を露出させ、その脊髄を挫傷させた。なお、脊髄の挫傷は脊髄挫傷装置（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｍｐａｃｔｏｒ （Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ， Ｆａｉｒｆａｘ， ＶＡ）を用い、その衝撃力は２００ｋｄｙｎとした。
【００３８】
動物モデルにおいて中和抗体処置を行うため、ＳＣＩ（脊髄損傷）の直後にラットに浸透圧ミニポンプを装着した（２００μｌ、０．５μｌ／ｈ、２週間投与；Ａｌｚｅｔ ２００２；Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐ．，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）。これらのポンプに，対照ウサギＩｇＧ（１５匹，１３．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ，２週間）（Ｓｉｇｍａ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）または抗Ｒｙｋ抗体（１３匹，１３．０μｇ／ｋｇ／ｄａｙ，２週間）を入れた。抗Ｒｙｋ抗体はＲｙｋの細胞外ドメインに対して生じさせたものである（Ａｂｇｅｎｔ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。動物の背中の皮下にミニポンプを置き，ミニポンプの出口に接続したシラスティックチューブを先端が傷害部位のすぐ尾側になるように脊髄挫傷部位の硬膜下に設置した。硬膜から突出したチューブを固定するために，フィブリンシーラント（Ｂｅｒｉｐｌａｓｔ; ＺＬＢ Ｂｅｈｒｉｎｇ， Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ， ＰＡ）を硬膜上に滴下した。その後，筋肉および皮膚層を縫合した。膀胱機能が回復するまで少なくとも１日に２回手動で腹部加圧することにより膀胱から排泄させた。シャム手術ラット（ｎ＝６）は，椎骨レベルＴ９／Ｔ１０で椎弓切除を施し，脊髄を露出させた。３匹のラットでは，０．８５％食塩水を入れたミニポンプおよびこれに接続したシラスティックチューブを設置した。それ以外のラットには，ミニポンプもシラスティックチューブも設置しなかった。次に，筋肉および皮膚層を縫合した。
【００３９】
脊髄切断モデルラットの作製
脊髄切断モデルとしては，ラットに椎骨レベルＴ９／１０で椎弓切除術を施し，脊髄を露出させた。１１番の刃を用いて脊髄を全切除し，筋肉および皮膚層を縫合した。
【００４０】
免疫組織化学によるＷｎｔ発現のアッセイ
ラット組織切片モデルを用いて胸部脊髄傷害（ＳＣＩ）後のＷｎｔ発現を調べた。傷害を受けていない脊髄，および傷害の１、３、および７日後の脊髄組織切片を固定して，免疫組織化学を実施した。
【００４１】
免疫組織化学のために、傷害を受けていない脊髄および傷害の１、３、７日後の脊髄から組織を取得した。具体的には、動物にペントバルビタールナトリウムを投与して深く麻酔した後ＰＢＳで、次に４％パラホルムアルデヒドで潅流することにより犠牲死させた。脊髄を切開し、同じ固定剤中で一晩固定し、ＰＢＳ中の２０％ショ糖溶液中で低温保存した。損傷部位から５ｍｍ以上吻側および５ｍｍ以上尾側に位置する脊髄（長さ１０ｍｍ）をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ中に包埋し、直ちに液体窒素で−８０℃で凍結した。傍矢状または横断面の一連の切片をクリオスタットを用いて５０μｍに切断し、ＰＬＬで被覆したＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ−Ｐｌｕｓスライド（Ｍａｔｓｕｎａｍｉ， Ｏｓａｋａ Ｊａｐａｎ）上にマウントした。
【００４２】
切片をＰＢＳで３回洗浄し、５％ウシ血清アルブミンおよび０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ中で室温で１時間ブロッキングした。切片は一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートし、ＰＢＳで３回洗浄した後、フルオレセイン結合二次抗体（１：１０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）とともに室温で１時間インキュベートした。
【００４３】
抗Ｗｎｔ−３ａ抗体は，マウスＷｎｔ−３ａ（Ｋｉｓｈｉｄａ Ｓ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ Ｈ． &Ｋｉｋｕｃｈｉ Ａ．、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、２４、４４８７−４５０１（２００４））のアミノ酸残基１３９−１５５に対応する合成ペプチド（ＳＳＲＬＱＧＳＰＧＥＧＷＫＷＧＧＣ（配列番号１１））でウサギを免疫することにより生成した。抗Ｗｎｔ−５ａ抗体はマウスＷｎｔ−５ａに対応する合成ペプチドでウサギを免疫することにより生成した。また，アストロサイトおよびニューロンを検出するための一次抗体としては，抗ＧＦＡＰモノクローナル抗体（１：２００；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）またはニューロン特異的β−チューブリンＩＩＩタンパク質を認識するモノクローナル抗体（Ｔｕｊ１）（１：５００；Ｃｏｖａｎｃｅ，Ｂｅｒｋｅｌｙ，ＣＡ）を用いた。
【００４４】
成人ラットの傷害を受けていない脊髄から調製した傍矢状切片は抗Ｗｎｔ−５ａ抗体で染色され、抗Ｔｕｊ１抗体および抗Ｗｎｔ−５ａ抗体で二重染色された。したがってＷｎｔ−５ａは白質の軸索で発現されていることが示された。
【００４５】
次に，ＧＦＡＰ，ＩＢ４および抗Ｗｎｔ−５ａ抗体を用いて，傷害後の脊髄におけるＷｎｔ−５ａ発現を調べた。ＳＣＩの１日後および７日後，損傷部位の中心点の周りのグリア筋原線維産生タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性の星状膠細胞で強いＷｎｔ−５ａの発現が観察された。Ｗｎｔ−５ａの発現はＩＢ４陽性細胞（おそらくは小神経膠細胞／マクロファージ）でも観察された。以上の結果から，Ｗｎｔ−５ａは脊髄傷害後に誘導されることがわかった。
【００４６】
また，同様にして，ＧＦＡＰ，ＩＢ４および抗Ｗｎｔ−３ａ抗体を用いて，傷害後の脊髄におけるＷｎｔ−３ａ発現を調べた。ＳＣＩの７日後にＧＦＡＰとＷｎｔ−３ａが損傷部位の周りに局在していることが示された。また，ＳＣＩの７日後にＩＢ４とＷｎｔ−３ａ抗体による二重標識が共局在していることが示された。すなわち，Ｗｎｔ−３ａについても，傷害の７日後にＷｎｔ−５ａと同様の誘導パターンが観察された。
【００４７】
ウエスタンブロット分析
さらに，これらの脊髄組織を用いたウエスタンブロッティングにより，Ｗｎｔタンパク質の発現を調べた。
【００４８】
成人ラット脊髄を，プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、および０．５％ Ｂｒｉｊ−５８（Ｓｉｇｍａ）中で溶解した。溶解物を４℃で２０分間インキュベートし、次に１３，０００ｇで４℃で１０分間遠心分離することにより清澄化した。上清を回収しタンパク質濃度に関して標準化した。１２％β−メルカプトエタノールを含むサンプルバッファを等量で加えて５分間煮沸し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し抗Ｗｎｔ−５ａ抗体（１：１０００）または抗Ｗｎｔ−３ａ抗体（１：１０００）とともにインキュベートした。検出のためには、ＥＣＬ化学発光システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）、及びＨＲＰ結合二次抗体（１：１０００；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｄａｎｖｅｒｓ， ＭＡ）を用いた。
【００４９】
結果を図１に示す。なお図中、「Ｒｏｓｔａｌ」は損傷部位の５ｍｍ吻側に位置する脊髄組織を意味し、「Ｌｅｓｉｏｎ ｓｉｔｅ」は損傷部位の脊髄組織を意味し、「Ｃａｕｄａｌ」は損傷部位の５ｍｍ尾側に位置する脊髄組織を意味し、Ｃｏｎｔｒｏｌは傷害を与えていない動物の骨髄組織を意味する。その結果、傷害の７日後にＷｎｔ−５ａおよびＷｎｔ−３ａが脊髄の損傷組織で発現していることが示された。
【００５０】
神経突起伸長アッセイ
胸部脊髄傷害（ＳＣＩ）において，Ｗｎｔタンパク質が軸索阻害に寄与しているか否かをインビトロで確かめるため，出生後ラット（Ｐ６−Ｐ１０）から得た小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を用いて神経突起伸長を測定した。
【００５１】
出生後ラット仔（Ｐ６−Ｐ１０）から小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を採取して，トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＰＢＳ，３７℃で１０分間）により解離させた後，血清含有培地中に再懸濁し，ばらばらにした後，ＰＢＳで３回洗浄した。細胞は無血清ＤＭＥＭ培地中で成長させた。
【００５２】
出生後ラットからのＣＧＮを，ポリＬ−リジン（ＰＬＬ）で被覆したスライド（Ｌａｂ−Ｔｅｋ， Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ; Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）上でコンディションド培地に播種し、Ｗｎｔ−５ａの存在下または非存在下で２４時間インキュベートした。Ｗｎｔ−５ａタンパク質は９０ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｗｎｔ−５ａのＹ２７６３２（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｊａｐａｎ）を用いる場合には１０μＭとなるように培養物に加えた。中和抗体アッセイのためには抗Ｒｙｋ抗体（Ａｂｇｅｎｔ）を０．５μｇ／ｍｌの濃度で培養物に加えた。
【００５３】
細胞を４％（ｗｔ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒド中で固定し，ニューロン特異的β−チューブリンＩＩＩタンパク質を認識するモノクローナル抗体（Ｔｕｊ１）（１：１０００；Ｃｏｖａｎｃｅ）で免疫染色した。次にβ−チューブリンＩＩＩ陽性ニューロンのそれぞれについて最も長い神経突起の長さを測定した。
【００５４】
図２ａは、小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を可溶型Ｗｎｔ−５ａ（９０ｎｇ／ｍｌ）および／またはＹ２７６３２（１０μＭ）とともに、またはそれらなしで２４時間培養した後、Ｔｕｊ１で染色した結果を示す。図２ｂはニューロンあたりの最長神経突起の平均長さを示す。なお、図中のデータは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表している。また図中＊は、対照と比較してｐ＜０．０１であることを、＊＊は、Ｗｎｔ−５ａと比較してｐ＜０．０１（一元ＡＮＯＶＡ、次にシェフェの多重比較検定）であることを意味している。
【００５５】
この結果，可溶型のＷｎｔ−５ａはＣＧＮの神経突起伸長を有意に阻害することが示された。また、ＣＧＮを１０μＭのＹ２７６３２（Ｒｈｏ−キナーゼの特異的阻害剤）で処理すると、Ｗｎｔ−５ａの効果が弱まり、一方、Ｙ２７６３２単独では神経突起の成長に影響を及ぼさないことからこの阻害効果はＲｈｏ関連セリン／トレオニンキナーゼ（Ｒｈｏ−キナーゼ）に依存することがわかった。すなわちＷｎｔ−５ａはＲｈｏ−キナーゼ依存性のメカニズムによりＣＧＮの神経突起伸長を阻害することが明らかとなった。
【００５６】
次に、Ｗｎｔに媒介されるＣＧＮの神経突起成長の阻害にＷｎｔの高親和性レセプターであるＲｙｋが関与しているか否かを調べた。Ｒｙｋの細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体（抗Ｒｙｋ）を用いて抗Ｒｙｋ抗体がＷｎｔ−５ａ媒介性の神経突起成長阻害をブロックしうるか否かを試験した。
【００５７】
図２ｃは、ＣＧＮをＰＬＬで被覆したチャンバースライドでコンディションド培地で可溶性Ｗｎｔ−５ａ（９０ｎｇ／ｍｌ）および／または抗Ｒｙｋ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）とともにまたはそれらなしで２４時間培養した後、Ｔｕｊ１で染色した結果を示す。また図２ｄは、ニューロンあたりの最長神経突起の平均長さを示す。なお図中、データは３回の独立した実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表しており。＊は、対照と比較してｐ＜０．０１であることを、＊＊は、Ｗｎｔ−５ａと比較してｐ＜０．０１（一元ＡＮＯＶＡ，次にシェフェの多重比較検定）であることを意味している。
【００５８】
この結果、抗Ｒｙｋ抗体（０．５μｇ／ｍｌ）を加えるとＷｎｔ−５ａの阻害効果が有効にブロックされたことが観察された。一方、抗Ｒｙｋ抗体単独では神経突起成長に影響を与えなかった。したがって抗Ｒｙｋ抗体はＷｎｔ−５ａの効果を逆転させることがわかった。
【００５９】
上述の結果は，Ｗｎｔタンパク質が神経突起伸長を阻害する能力をもち，ＳＣＩ後の傷害を受けた軸索の再成長のバリアとして作用すること、およびＷｎｔタンパク質の機能またはシグナル伝達をブロックするとＳＣＩ後の回復が促進されることを示唆している。
【００６０】
挙動試験
臨床病態を模倣するラット脊髄外傷モデルを用いて挙動試験を行った。上述のように胸部脊髄障害（ＳＣＩ）を与えた後、傷害部位の近傍に留置した髄腔内カテーテルを通して浸透圧ミニポンプにより抗Ｒｙｋ抗体または対照ウサギＩｇＧを２週間投与した。傷害後８週間、動物の運動能力をモニターした。モデル動物における脊髄障害後の挙動回復はオープンフィールド環境中でＢＢＢ（Ｂａｓｓｏ−Ｂｅａｔｔｉｅ−Ｂｒｅｓｎａｈａｎ）運動評点スケールを用いて評価した。定量は２名の観察者により盲目方式で行った。
【００６１】
図３は、抗Ｒｙｋ抗体処置、対照ＩｇＧ処置、およびシャム手術ラットにおいて、胸部挫傷後の一定時間にＢＢＢスコアを測定した結果を示す。図中の値は、それぞれ１３、１５、および６匹のラットの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示している。＊は対照と比較してｐ＜０．０５であることを意味している。
【００６２】
脊髄傷害を受けていないシャム手術ラットは，ＢＢＢ運動評点スケールによるフルスコアに達した。これに対し、脊髄を傷害したすべてのラットは傷害の後第１日から第３日にほぼ完全に対麻痺となった。ＢＢＢスコアにより示されるように、ラットは徐々に運動挙動の部分的な回復を示した。傷害の２−８週間後、抗Ｒｙｋ抗体で処置したラットの運動能力は対照ＩｇＧで処置したラットより優れた回復を示す傾向にあった。平均では手術の８週間後に対照ＩｇＧ処置ラットのＢＢＢスコアは１２．７であり、抗Ｒｙｋ抗体処置ラットでは統計学的に有意に高いＢＢＢスコアである１５．８を示した。すなわち抗Ｒｙｋ抗体を投与することによりＳＣＩ後の運動の回復が促進されることが明らかになった。
【００６３】
順行性ＣＳＴ標識
ビオチンデキストランアミン（ＢＤＡ）を片側の感覚運動皮質に注入することにより先に試験したラットの背側下行皮質脊髄管（ＣＳＴ）の一体性を評価した。傷害の６週間後，麻酔下でＢＤＡ（食塩水中１０％，皮質あたり２．０μｌ，ＭＷ：１０，０００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を左運動皮質に注入し（座標：ブレグマの０．５−２．５ｍｍ後方、ブレグマの２ｍｍ側方、深さ１．５ｍｍ）、ＣＳＴ線維をＢＤＡで標識した。マイクロリットルシリンジに取り付けた内径１５−２０μｍのガラスキャピラリーを通して０．５μｌのＢＤＡを３０秒間かけて注射した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）。合計で４匹の対照および７匹の抗Ｒｙｋ抗体処置ラットについてＳＣＩ後の再生応答を調べ、比較した。
【００６４】
ＢＤＡ注射の１４日後ＰＢＳで、次に４％パラホルムアルデヒドで潅流することにより動物を犠牲死させた。脊髄を切開し、同じ固定剤中で一晩固定し、ＰＢＳ中の２０％ショ糖溶液中で低温保存した。損傷部位から５ｍｍ以上吻側および５ｍｍ以上尾側に位置する脊髄（長さ１０ｍｍ）をＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ中に包埋した。これらのブロックから矢状面（５０μｍ）または水平面で切片を作成し、各切片を保存した。また、傷害部位の５ｍｍ以上吻側および尾側に位置する脊髄からも水平面切片を作成した。これらの切片を０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中でＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合ストレプトアビジン（１：４００；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに１時間インキュベートした。
【００６５】
４匹の対照ラットおよび７匹の抗Ｒｙｋ抗体処置ラットについて、傷害の中心の５ｍｍ吻側および５ｍｍ尾側に延びるブロックを矢状面で切りだした。抗Ｒｙｋ抗体処置ラットにおいては損傷部位の尾側の組織で典型的な異常蛇行成長パターンを有する標識された線維が高頻度に観察された。一方、対照ＩｇＧ処置ラットではＢＤＡで標識されたＣＳＴ線維は検出されなかった。なお、傷害部位の１０ｍｍ上方に位置する標識された線維の総数は、抗Ｒｙｋ抗体処置と対照ＩｇＧ処置ラットとの間で有意な相違は観察されなかった。したがって、ＢＤＡ取り込みの程度はこれらの群の間で同一であることが示された。
【００６６】
次に、傷害脊髄の横断面切片を再構築し、標識されたＣＳＴ線維の数を評価した。４匹の対照および７匹の抗Ｒｙｋ抗体処置ラットについて５０μｍ厚さの横断面切片を評価した。各切片について損傷部位の４ｍｍ上から４ｍｍ下までのＢＤＡ標識線維の交点の数を数えた。軸索数は損傷部位の４ｍｍ上の小脳顆粒ニューロン（ＣＳＴ）が無傷である部位で観察された線維に対するパーセンテージとして計算した。損傷部位の中心から尾側の距離を正の距離、吻側を負の距離として評点した。
【００６７】
結果を図４に示す。なお図中、ｘ軸は脊髄の吻尾軸に沿った特定の位置を示す。ｙ軸は示されている部位におけるＢＤＡ標識繊維の数の損傷部位の４ｍｍ吻側における数に対する比率を示す。尚図中＊は、対照と比較してｐ＜０．０１であることを意味し、＊＊は、対照と比較してｐ＜０．０６（スチューデントｔ検定）であることを意味する。
【００６８】
抗Ｒｙｋ抗体処置ラットでは、損傷部位の４ｍｍ吻側で観察された標識された線維の数と比較して、標識された線維の２０％以上が損傷部位の中心から１−２ｍｍ尾側で観察された。しかし、対照ＩｇＧ処置ラットにおいては、標識された線維のわずかの割合（傷害部位の尾側１ｍｍでは０％、２ｍｍでは３％）しか観察されなかった。標識された線維は抗Ｒｙｋ抗体で処置した傷害動物の灰白質で検出された。これらの結果は抗Ｒｙｋ抗体を投与することによりＳＣＩ後の背側下行皮質脊髄管（ＣＳＴ）線維の成長が促進され，軸索の再生が促進されることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明に係る軸索再生促進剤は、中枢神経系の神経細胞の軸索の再生を促進することができる軸索再生促進剤として有効であり、中枢神経系を損傷した患者のための治療剤として産業上の利用可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は，脊髄組織におけるＷｎｔタンパク質の発現を示す。
【図２】図２は，小脳顆粒ニューロンを用いる神経突起伸長アッセイの結果を示す。
【図３】図３は，脊髄損傷後に抗Ｒｙｋ抗体で処置したラットの挙動試験の結果を示す。
【図４】図４は，ＢＤＡで標識した背側下行皮質脊髄管線維の成長を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤及びＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤の少なくともいずれかを有効成分として含有する軸索再生促進剤。
【請求項２】
前記有効成分は抗Ｒｙｋ抗体を含む請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項３】
前記有効成分は抗Ｗｎｔ抗体を含む請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項４】
中枢神経系の軸索の再生を促進する請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項５】
試験物質をＷｎｔ又はＲｙｋと接触させ、前記試験物質がＷｎｔ若しくはＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定する軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法。
【請求項１】
Ｗｎｔ阻害剤、Ｒｙｋ阻害剤及びＷｎｔ−Ｒｙｋ結合阻害剤の少なくともいずれかを有効成分として含有する軸索再生促進剤。
【請求項２】
前記有効成分は抗Ｒｙｋ抗体を含む請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項３】
前記有効成分は抗Ｗｎｔ抗体を含む請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項４】
中枢神経系の軸索の再生を促進する請求項１記載の軸索再生促進剤。
【請求項５】
試験物質をＷｎｔ又はＲｙｋと接触させ、前記試験物質がＷｎｔ若しくはＲｙｋの機能又はＷｎｔとＲｙｋとの結合を阻害するか否かを判定する軸索再生促進剤の候補物質を同定する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−１８４３８４（Ｐ２００８−１８４３８４Ａ）
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１６３１９（Ｐ２００７−１６３１９）
【出願日】平成１９年１月２６日（２００７．１．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度独立行政法人 医薬基盤研究所 基礎研究推進事業、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１月２６日（２００７．１．２６）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度独立行政法人 医薬基盤研究所 基礎研究推進事業、産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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