近赤外蛍光造影剤
【課題】近赤外蛍光造影剤の造影成分として有用な新規化合物の提供。
【解決手段】下記一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩：
式中、式中、Ｘはスルホン酸基を示し；Ｒ1とＲ2は置換基を表し；Ｒ3〜Ｒ6は置換基を有していてもよいアルキル基を表し；Ｒ7及びＲ8は置換基を有していてもよいアルキル基を表し； Ｌ1〜Ｌ3は置換基を有していてもよいメチン基を表し、但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基であり；ｒは０〜３の整数を表し、rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3はそれぞれ同一でも異なっていてもよく；Ｍは水素原子、アルカリ金属等を表し；ｍ,ｎはそれぞれ独立に０〜３の整数を表し；前記置換基の少なくとも一つはスルホン酸基又はスルホン酸基を含む基である。
【解決手段】下記一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩：
式中、式中、Ｘはスルホン酸基を示し；Ｒ1とＲ2は置換基を表し；Ｒ3〜Ｒ6は置換基を有していてもよいアルキル基を表し；Ｒ7及びＲ8は置換基を有していてもよいアルキル基を表し； Ｌ1〜Ｌ3は置換基を有していてもよいメチン基を表し、但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基であり；ｒは０〜３の整数を表し、rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3はそれぞれ同一でも異なっていてもよく；Ｍは水素原子、アルカリ金属等を表し；ｍ,ｎはそれぞれ独立に０〜３の整数を表し；前記置換基の少なくとも一つはスルホン酸基又はスルホン酸基を含む基である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物を含む近赤外蛍光造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療において、生体内の疾患によって引き起こされる形態学的および機能的変化をその疾患の早期段階で検出することは重要である。特に癌の治療のためには、腫瘍の位置や大きさ、性質を予め知ることは、将来の治療のための戦略やプロトコルを決定するために極めて重要となる。このために従来用いられている方法としては、穿刺等による生検の他、X線造影、MRI、PET、超音波造影などの画像診断が挙げられる。生検は確定診断としては有効であるが、被験者への負担が大きく、また病変の経時的な追跡には適さない。またX線造影やMRI、PETは必然的に被験者に放射線や電磁波への被曝を起こす。さらに、上述したような従来の画像診断は、測定と診断に複雑な操作と長い時間を要する。また、装置の大きさおよび形状の点から、外科手術中にこれらの方法を用いながらナビゲーション下で手術を行うことも困難である。
【０００３】
蛍光造影法はこれらの問題を解決する画像診断法の一つである。この方法は、特定の波長の励起光への暴露により蛍光を発する物質を造影剤として用いる。また、この方法は、生体外から励起光を照射し、生体内の蛍光物質から放射される蛍光を検出する工程を含む。
シアニン系化合物はこのような蛍光造影法に用いることができる代表的な化合物である。実際、インドシアニングリーン（以下、ICGと略す）は、現在、肝機能検査、眼底検査に用いられている。しかし、ICGは易溶化のためにヨウ素が添加された製剤として用いる必要があるため、ヨウ素過敏症患者には用いることができないといった問題点を有する。
この溶解性の問題を解決したシアニン系化合物として、特許文献１の請求項１に記載の化合物（以下「SF-64」と称する）が挙げられる。該色素は、水溶性に優れた低毒性の色素であることを特徴としており、また腫瘍描出性能を有することが該特許内に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３５０７０６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、近赤外蛍光造影剤の造影成分として有用な新規化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはSF-64を用いて、シアニン系化合物の腫瘍集積機序について鋭意検討を行った。その結果、該色素および、その誘導体が血漿中においてアルブミンと複合体を形成することを初めて明らかとした。この知見に基づいて、SF64と比較して腫瘍描出時間などにおいて実際的な造影機能が向上している新規な色素化合物群を見出し、この知見を基に本発明を完成させた。すなわち本発明は以下［１］〜［８］を提供するものである。
【０００７】
［１］下記一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【０００８】
【化１】
【０００９】
式中、式中、Ｘはスルホン酸基を示し；Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に置換基を表し；Ｒ3〜Ｒ6は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基を表し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を表し； Ｌ1〜Ｌ3は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいメチン基を表し、但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基であり；ｒは０〜３の整数を表し、rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3はそれぞれ同一でも異なっていてもよく；Ｍは水素原子、アルカリ金属、又はアルカリ土類金属を表し；ｍ,ｎはそれぞれ独立に０〜３の整数を表し；前記置換基の少なくとも一つはスルホン酸基又はスルホン酸基を含む基である。
［２］下記一般式（II）で表される［１］に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【００１０】
【化２】
【００１１】
式中、
Ｒ10及びＲ11は同一又は異なって、スルホン酸基、カルボン酸基、又はホスホン酸基で置換されているアルキル基を表し；Ｒ9は、メチル基以外のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロ環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、又はアシルアミノアリールオキシ基を表す。
［３］Ｒ9がエチル基、アリール基、又はアリールメチル基である［２］に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
［４］酸基の１つ以上がナトリウムイオンと塩を形成している［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩を含む近赤外蛍光造影剤。
【００１２】
［６］腫瘍の造影に用いられる［５］に記載の近赤外蛍光造影剤。
［７］SPARCが高発現している癌種の造影に用いられる［６］に記載の近赤外蛍光造影剤。
［８］口腔、咽頭、消化器、呼吸器、骨および間接、軟組織、皮膚、乳房、生殖系、泌尿器系、眼および眼窩、脳及び中枢神経又は内分泌系に発生する腫瘍の造影に用いられる［６］又は［７］に記載の近赤外蛍光造影剤。
【００１３】
本発明のさらに別の観点からは、蛍光造影剤の製造のための上記の化合物の使用；蛍光造影法であって、上記の化合物を、ヒトを含む哺乳類動物に投与した後に蛍光造影する工程を含む方法；腫瘍の造影方法であって、上記の化合物を、ヒトを含む哺乳類動物に投与した後に蛍光造影する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、新規なシアニン系化合物が提供される。上記シアニン系化合物は腫瘍等の疾患部位への集積性が高く、近赤外蛍光造影剤の造影成分として適している。本発明の化合物を含む近赤外蛍光造影剤は、腫瘍描出時間が長いという特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】試験例３に記載の方法に従いHCT116細胞を移植したマウスに、化合物Ｂ（●：黒丸）、化合物１（□：四角）、化合物３（△：三角）を投与し、各時点における腫瘍部位の蛍光強度を大腿部位の蛍光強度で割った比率（S/N比）の時間推移を測定した結果を示すグラフである。
【図２】各種腫瘍細胞を移植したマウスに、本発明の化合物1を投与した際の、投与直後、2時間後、4時間後、6時間後における造影結果を示す図である。
【図３】マウスの腫瘍組織から抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である：左からHCT116（動物1）、HCT116（動物2）、HCT116（動物3）、HT1080(動物4)、HT1080(動物5)、HT1080(動物6)、A431(動物7)、A431(動物8)、A431(動物9)の各腫瘍細胞を移植した動物の腫瘍部位から抽出したタンパク質を用いた結果である。
【図４】ＨＣＴ１１６細胞を移植することで腫瘍を形成したマウスの腫瘍および大腿の組織から抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である：左から標品（ヒトSPARC）、大腿抽出液(動物１0)、大腿抽出液(動物11)、大腿抽出液(動物12)、腫瘍抽出液(動物１0)、腫瘍抽出液(動物11)、腫瘍抽出液(動物12)。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「置換基」、または「置換又は無置換の」というときの置換基としては例えば下記の置換基群から選択される置換基が挙げられる。
【００１７】
置換基群：ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シアノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、カルボン酸基（カルボキシル基）、アルコキシ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホン酸基（スルホ基）、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリールアゾ基、ヘテロ環アゾ基、イミド基、ホスホン酸基（リン酸基）、ホスフィノ基、ホスフィニル基、ホスフィニルオキシ基、ホスフィニルアミノ基、及びシリル基。
【００１８】
なお、これらの基のうち塩を形成することが可能な基、又は一個もしくは二個以上の水素イオンの脱離により塩を形成することが可能な基については、これらいずれかの基が塩を形成したものであってもよい。これらの塩における対イオンとしては、本発明の化合物中に存在し得る陽電荷又は陰電荷、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンが挙げられる。
【００１９】
ハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
アルキル基としては、直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、又はそれらの任意の組み合わせのいずれでもよく、炭素数１から３０の直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−エチルヘキシル）、炭素数３から３０のシクロアルキル基（例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル）、炭素数５から３０のビシクロアルキル基（炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基：例えば、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イル）、及び更に環構造が多いトリシクロ構造を有するアルキル基などが挙げられる。
アルキル部分を持つ置換基のアルキル部分についても、別に説明の無い限り、上記アルキル基の説明と同様である。
【００２０】
アルケニル基としては、直鎖、分岐、環状のいずれでもよく、炭素数２から３０の直鎖アルケニル基（例えば、ビニル、アリル、プレニル、ゲラニル、オレイル）、炭素数３から３０シクロアルケニル基（炭素数３から３０のシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基：例えば２−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル）、及び炭素数５から３０のビシクロアルケニル基（二重結合を一個持つビシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基：例えば、ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エン−１−イル、ビシクロ［２，２，２］オクト−２−エン−４−イル）などが挙げられる。アルキニル基としては、炭素数２から３０のアルキニル基（例えば、エチニル、プロパルギル）が好ましく挙げられる。アリール基としては好ましくは炭素数６から３０のアリール基であればよく、例えばフェニル、ｐ−トリル、ナフチルが挙げられる。
【００２１】
ヘテロ環基としては好ましくは５又は６員のヘテロ環基であればよく、芳香族もしくは非芳香族のヘテロ環化合物から一個の水素原子を取り除いた一価の基であればよい。より好ましくは、炭素数３から３０の５もしくは６員の芳香族のヘテロ環基であり、例えば、２−フリル、２−チエニル、２−ピリミジニル、及び２−ベンゾチアゾリルが挙げられる。アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルコキシ基であればよく、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−オクチルオキシが挙げられる。アリールオキシ基としては、好ましくは、炭素数６から３０のアリールオキシ基であればよく、例えば、フェノキシ基が挙げられる。シリルオキシ基としては、好ましくは、炭素数３から２０のシリルオキシ基であればよく、例えば、トリメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシが挙げられる。
【００２２】
ヘテロ環オキシ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のヘテロ環オキシ基であればよく、テトラゾールー５−オキシ、２−テトラヒドロピラニルオキシが挙げられる。アシルオキシ基としては、ホルミルオキシ基、炭素数２から３０のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数６から３０のアリールカルボニルオキシ基等であればよく、例えば、ホルミルオキシ、アセチルオキシ、ピバロイルオキシ、ステアロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルカルボニルオキシが挙げられる。カルバモイルオキシ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のカルバモイルオキシ基であればよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルオキシ、モルホリノカルボニルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルアミノカルボニルオキシ、及びＮ−ｎ−オクチルカルバモイルオキシが挙げられる。アルコキシカルボニルオキシ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のアルコキシカルボニルオキシ基であればよく、例えばメトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ、及びｎ−オクチルカルボニルオキシが挙げられる。
【００２３】
アリールオキシカルボニルオキシ基としては、好ましくは、炭素数７から３０のアリールオキシカルボニルオキシ基であればよく、例えば、フェノキシカルボニルオキシが挙げられる。アルキルアミノ基としては炭素数１から３０のアルキルアミノ基であればよく、例えばメチルアミノ及びジメチルアミノが挙げられる。アリールアミノ基としては好ましくは炭素数６から３０のアリールアミノ基であればよく、例えば、アニリノ及びジフェニルアミノが挙げられる。アシルアミノ基としては好ましくは、ホルミルアミノ基、炭素数１から３０のアルキルカルボニルアミノ基又は炭素数６から３０のアリールカルボニルアミノ基であればよく、例えば、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、ピバロイルアミノ、ラウロイルアミノ、ベンゾイルアミノ、及び３，４，５−トリ−ｎ−オクチルオキシフェニルカルボニルアミノが挙げられる。アミノカルボニルアミノ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアミノカルボニルアミノ基であればよく、例えば、カルバモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノカルボニルアミノ、及びモルホリノカルボニルアミノが挙げられる。
【００２４】
アルコキシカルボニルアミノ基としては、好ましくは炭素数２から３０のアルコキシカルボニルアミノ基であればよく、例えば、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ、及びｎ−オクタデシルオキシカルボニルアミノが挙げられる。アリールオキシカルボニルアミノ基としては、好ましくは、炭素数７から３０のアリールオキシカルボニルアミノ基であればよく、例えば、フェノキシカルボニルアミノが挙げられる。スルファモイルアミノ基としては、好ましくは、炭素数０から３０のスルファモイルアミノ基であればよく、例えば、スルファモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニルアミノ、及びＮ−ｎ−オクチルアミノスルホニルアミノが挙げられる。アルキル及びアリールスルホニルアミノ基としては、好ましくは炭素数１から３０のアルキルスルホニルアミノ又は炭素数６から３０のアリールスルホニルアミノであればよく、例えば、メチルスルホニルアミノ、ブチルスルホニルアミノ、及びフェニルスルホニルアミノが挙げられる。アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルチオ基であればよく、例えばメチルチオ、エチルチオ及びｎ−ヘキサデシルチオが挙げられる。アリールチオ基としては、好ましくは炭素数６から３０のアリールチオ基であればよく、例えば、フェニルチオが挙げられる。ヘテロ環チオ基としては、好ましくは炭素数２から３０のヘテロ環チオ基であればよく、例えば、２−ベンゾチアゾリルチオ及びテトラゾール−５−イルチオが挙げられる。
【００２５】
スルファモイル基としては、好ましくは炭素数０から３０の置換もしくは無置換のスルファモイル基であればよく、例えば、Ｎ−エチルスルファモイル、Ｎ−（３−ドデシルオキシプロピル）スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル、Ｎ−アセチルスルファモイル、Ｎ−ベンゾイルスルファモイル、及びＮ−（Ｎ’−フェニルカルバモイル）スルファモイルが挙げられる。アルキルスルフィニル基及びアリールスルフィニル基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルスルフィニル基、又は６から３０のアリールスルフィニル基であればよく、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、及びフェニルスルフィニルが挙げられる。アルキル及びアリールスルホニル基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルスルホニル基又は６から３０のアリールスルホニル基であればよく、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、及びフェニルスルホニルが挙げられる。アシル基としては、好ましくはホルミル基、炭素数２から３０のアルキルカルボニル基、炭素数７から３０のアリールカルボニル基、又は炭素数４から３０の炭素原子でカルボニル基と結合しているヘテロ環カルボニル基であればよく、例えば、アセチル、ピバロイル、ステアロイル、ベンゾイル、２―ピリジルカルボニル、及び２―フリルカルボニルが挙げられる。アリールオキシカルボニル基としては、好ましくは、炭素数７から３０のアリールオキシカルボニル基であればよく、例えば、フェノキシカルボニルが挙げられる。
【００２６】
アルコキシカルボニル基としては、好ましくは、炭素数２から３０のアルコキシカルボニル基であればよく、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、及びｎ−オクタデシルオキシカルボニルが挙げられる。カルバモイル基としては、好ましくは、炭素数１から３０のカルバモイル基であればよく、例えば、カルバモイル、Ｎ−メチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルカルバモイル、及びＮ−（メチルスルホニル）カルバモイル）が挙げられる。アリールアゾ基及びヘテロ環アゾ基としては、好ましくは炭素数６から３０のアリールアゾ基、炭素数３から３０のヘテロ環アゾ基であればよく、例えば、フェニルアゾ、１，３，４−チアジアゾール−２−イルアゾが挙げられる。イミド基として好ましい例としては、Ｎ−スクシンイミド及びＮ−フタルイミドが挙げられる。ホスフィノ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィノ基であればよく、例えば、ジメチルホスフィノ、ジフェニルホスフィノ、及びメチルフェノキシホスフィノが挙げられる。ホスフィニル基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィニル基であればよく、例えば、ホスフィニル、ジオクチルオキシホスフィニル、及びジエトキシホスフィニルが挙げられる。ホスフィニルオキシ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィニルオキシ基であればよく、例えば、ジフェノキシホスフィニルオキシ及びジオクチルオキシホスフィニルオキシが挙げられる。ホスフィニルアミノ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィニルアミノ基であればよく、例えば、ジメトキシホスフィニルアミノ及びジメチルアミノホスフィニルアミノが挙げられる。シリル基としては、好ましくは、炭素数３から３０のシリル基であればよく、例えば、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル及びフェニルジメチルシリルが挙げられる。
【００２７】
上記の置換基は更に上記の置換基で置換されていてもよい。そのような置換基の例としては、アリールアルキル基、アシルアミノアリールオキシ基、アルキルカルボニルアミノスルホニル基、アリールカルボニルアミノスルホニル基、アルキルスルホニルアミノカルボニル基、及びアリールスルホニルアミノカルボニル基が挙げられる。その例としては、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｐ−メチルフェニルスルホニルアミノカルボニル、アセチルアミノスルホニル、及びベンゾイルアミノスルホニル基が挙げられる。
【００２８】
以下、一般式（I）で表される化合物について詳細に説明する。
一般式（I）で表される化合物は分子中に3個以上のスルホン酸基を有する。3個以上のスルホン酸基は一般式（I）中に示される２つのＸのほか、Ｒ1〜Ｒ8で表される基のいずれか1つ以上に含まれる1つ以上のスルホン酸基から成っていればよい。なお、スルホン酸基等の酸基は、プロトンが脱離して塩を形成している基であってもよい。
一般式（I）で表される化合物はＬ1〜Ｌ3で表されるポリメチン基部分にエチル基以上の嵩高さの置換基を有することを特徴とする。
【００２９】
一般式（I）において、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に置換基を表す。置換基は上記置換基群から選択される置換基であればよい。Ｒ1、Ｒ2として好ましくはハロゲン原子、アルキル基（直鎖、分岐、環状アルキル基を含む）、アリール基、ヘテロ環基、シアノ基、カルボン酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホン酸基、アルキル及びアリールスルホニル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、イミド基が挙げられる。より好ましくはハロゲン原子、アルキル基（直鎖、分岐、環状アルキル基を含む）、アリール基、ヘテロ環基、カルボン酸基、アルコキシ基、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、スルファモイル基、スルホン酸基、カルバモイル基、イミド基が挙げられる。さらに好ましくはハロゲン原子、炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状アルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数１〜１０のヘテロ環基、カルボン酸基又はスルホン酸基が挙げられる。特に好ましくは、臭素原子、ヨウ素原子、メチル基、エチル基、フェニル基、ナフチル基、チエニル基、フリル基、ピリジル基が挙げられる。
【００３０】
一般式（I）において、ｍ、ｎは０〜３の整数である。ｍ、ｎが2又は３のときは複数存在するＲ1、Ｒ2はそれぞれ異なっていても同一でもよい。ｍ、ｎは０又は１であることが好ましく、特に好ましくは０である。
【００３１】
一般式（I）において、Ｒ3〜Ｒ6は同一又は異なって、それぞれ置換又は無置換のアルキル基であるが、該アルキル基は、Ｒ1、Ｒ2におけるアルキル基と同義であり、置換基を有する場合は上記置換基群から選択される置換基であればよい。Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれ独立に１〜20のアルキル基であることが好ましく、総炭素数１〜15のアルキル基であることがより好ましく、総炭素数１〜10のアルキル基であることがさらに好ましく、総炭素数1〜３のアルキル基であることが特に好ましい。また、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれ独立に無置換のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがもっとも好ましい。
【００３２】
一般式（I）において、Ｒ7及びＲ8は同一又は異なって、それぞれ置換又は無置換のアルキル基である。アルキル基は、直鎖アルキル基（好ましくは炭素数１から３０の直鎖アルキル基）、分岐アルキル基（好ましくは炭素数３から３０の分岐アルキル基）、又は環状のアルキル基（トリシクロ構造を有するものを含み、好ましくは炭素数３から３０のシクロアルキル基、又は炭素数５から３０のビシクロアルキル基、（炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基）であればよい。例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−エチルヘキシル、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イルが挙げられる。
これらのうち、炭素数１から２０の直鎖アルキル基が好ましく、炭素数１から１０の直鎖アルキル基がより好ましく、炭素数１から５の直鎖アルキル基がさらに好ましい。
【００３３】
Ｒ7又はＲ8で表される置換アルキル基における置換基の種類、数、位置は特に限定されない。Ｒ7又はＲ8が置換アルキル基の場合の置換基として好ましくはハロゲン原子、カルボン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基であり、より好ましくはカルボン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基であり、更に好ましくはスルホン酸基である。置換アルキル基が置換直鎖アルキル基の場合、置換位置はＲ7又はＲ8として置換直鎖アルキル基が置換している窒素原子から炭素数２個以上介した位置にあることが好ましく、より好ましくは末端の炭素であることが好ましい。置換基の数は１が好ましい。
【００３４】
Ｌ1〜Ｌ3は同一又は異なって、それぞれ置換又は無置換のメチン基を表す。但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基である。ｒは０〜３の整数を表す。 rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3は同一でも異なっていてもよい。Ｌ1〜Ｌ3が置換メチン基である場合には、その置換基は上記置換基群から選択される置換基であればよい。Ｌ1〜Ｌ3のいずれか２つ以上が置換メチン基である場合には、それらの置換基同士が結合して環を形成していてもよい。
エチル基以上の嵩高さの置換基の具体例及び置換基同士が結合して環を形成する場合の具体例を以下に示す。なお、以下においてはr=２であって、２つのＬ2に挟まれるＬ3がエチル基以上の嵩高さの置換基を含む場合の Ｌ1〜Ｌ3で表されるポリメチン基部分の構造として示す。なお、＊は他の２つの部分構造それぞれとの結合部分を示す。
【００３５】
【化３】
【００３６】
【化４】
【００３７】
【化５】
【００３８】
【化６】
【００３９】
【化７】
【００４０】
【化８】
【００４１】
ｒは０〜３の整数を表すが、好ましくは１〜３であり、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは３である。Ｌ1〜Ｌ3において、好ましくは無置換メチン基がＬ1〜Ｌ3のうち一つ以上あり、より好ましくは置換メチン基が1〜3個であり残りは全て無置換メチン基であり、特に好ましくは置換メチン基が1個であり残りは全て無置換メチン基である。
【００４２】
酸基が塩を形成している基である場合、塩としては陰電荷となっているもの、アルカリ金属、又はアルカリ土類金属と塩を形成しているものが好ましい。アルカリ金属、又はアルカリ土類金属として好ましくはＮａ又はＫであり、より好ましくはＮａである。
【００４３】
なお、一般式（I）で表される化合物の陽電荷は分子内あるいは分子外にある対アニオンにより中和されている。対アニオンの例としては、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどのハロゲンイオン、アセテートイオン、オキサレートイオン、フマレートイオン、ベンゾエートイオンなどのカルボキシレートイオン、ｐ−トルエンスルホネート、メタンスルホネート、ブタンスルホネート、ベンゼンスルホネートなどのスルホネートイオン、硫酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン、硝酸イオン、等が挙げられる。分子内にカルボキシレート基、スルホネート基等に負電荷を有する基が存在する場合には、化合物の陽電荷とともに分子内塩を形成していてもよい。分子外対アニオンとしては、ハロゲンイオン、メタンスルホネートイオン、硫酸イオン、が好ましく、クロロイオン、ブロモイオン又はメタンスルホネートイオンが特に好ましい。
【００４４】
一般式（I）で表される化合物はより好ましくは、上記一般式（II）で表される化合物であればよい。
【００４５】
一般式（II）において、Ｒ9がアルキル基の場合、該アルキル基の総炭素数が2〜20であることが好ましく、2〜15であることがより好ましく、2〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、エチル基、n-プロピル基、2-プロピル基、シクロプロピル基が挙げられ、更に好ましくはエチル基、n-プロピル基、2-プロピル基、シクロプロピル基である。
【００４６】
Ｒ9がアリール基の場合、該アリール基の総炭素数が5〜20であることが好ましく、5〜15であることがより好ましく、5〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、フェニル基、4−メチルフェニル基、4−フェニルフェニル基、ナフチル基が挙げられる。
【００４７】
Ｒ9がアリールアルキル基の場合、該アリールアルキル基の総炭素数が7〜30であることが好ましく、7〜20であることがより好ましく、7〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基が挙げられる。
【００４８】
Ｒ9がヘテロ環基の場合、該ヘテロ環基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、4−ピリジル基、２−フリル基、２−チエニル基、2−オキソピロリジン−１−イル基が挙げられる。
【００４９】
Ｒ9がアシルアミノ基の場合、該アシルアミノ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基、ピバロイルアミノ基、4-フェニルベンゾイルアミノ基が挙げられる。
【００５０】
Ｒ9がアリールアミノ基の場合、該アリールアミノ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、N-フェニルアミノ基、N-トリルアミノ基、N,N-ジフェニルアミノ基が挙げられる。
【００５１】
Ｒ9がN-アリール-N-アルキルアミノ基の場合、該N-アリール-N-アルキルアミノ基の総炭素数が7〜30であることが好ましく、7〜20であることがより好ましく、7〜15であ
ることがさらに好ましい。
特に好ましい具体例としては、N-フェニル-N-メチルアミノ基、N-トリル-N-メチルアミノ基が挙げられる。
【００５２】
Ｒ9がアリールチオ基の場合、該アリールチオ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、フェニルチオ基、トリルチオ基、4-フェニルフェニルチオ基、ナフチルチオ基が挙げられる。
【００５３】
Ｒ9がアリールオキシ基の場合、該アリールチオ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、フェニルオキシ基、4-アセチルアミノフェニルオキシ基、4-フェニルフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基が挙げられる。
【００５４】
Ｒ9がアシルアミノアリールオキシ基の場合、該アシルアミノアリールオキシ基の総炭素数が7〜30であることが好ましく、7〜20であることがより好ましく、7〜15であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、ベンゾイルアミノフェニルオキシ基が挙げられる。
【００５５】
Ｒ10、Ｒ11は、それぞれ独立して、カルボン酸基、スルホン酸基、又はホスホン酸基で置換されているアルキル基を表す。Ｒ10、Ｒ11は同一又は異なって、アルキル基としては、直鎖アルキル基（好ましくは炭素数１から３０の直鎖アルキル基）、分岐アルキル基（好ましくは炭素数３から３０の分岐アルキル基）、又は環状のアルキル基（トリシクロ構造を有するものを含み、好ましくは炭素数３から３０のシクロアルキル基、又は炭素数５から３０のビシクロアルキル基、（炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基）であればよい。例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−エチルヘキシル、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イルが挙げられる。これらのうち、炭素数１から２０の直鎖アルキル基が好ましく、炭素数１から１０の直鎖アルキル基がより好ましく、炭素数１から５の直鎖アルキル基がさらに好ましい。
【００５６】
Ｒ10、Ｒ11におけるカルボン酸基、スルホン酸）、又はホスホン酸基の数、位置は特に限定されないが、Ｒ10、Ｒ11は好ましくはカルボン酸基、スルホン酸基を有するアルキル基であり、更に好ましくはスルホン酸基を有するアルキル基である。スルホン酸基は水素原子が脱離して塩を形成していてもよい。
また、Ｒ10、Ｒ11に上記の基が置換するとき、その置換基の位置はＲ10、Ｒ11がそれぞれ置換している窒素原子から炭素数２個以上介した位置であることが好ましく、より好ましくは末端の炭素であることが好ましい。
【００５７】
生体内で使用されることになる蛍光造影剤は特に水溶性であることが必要である。本発明の近赤外蛍光造影剤は上記化合物中に３個以上のスルホン酸基を導入することにより水溶性が顕著に改善されている。優れた水溶性を得るにはスルホン酸基、カルボン酸基、ホスホン酸基の総数が４個以上であることが好ましい。合成を容易にするには、スルホン酸基、カルボン酸基、ホスホン酸基の数は10個以下、好ましくは８個以下である。水溶性の改善は各化合物の分配係数の測定、例えば分配係数をブタノール／水の二相系で測定することにより調べることができる。より詳しく言えば、３個以上のスルホン酸基の導入によりn-ブタノール／水の分配係数log Po/wは -1.00以下となる。
【００５８】
生体における水溶性は、生理的食塩水に溶解し、３６℃において時間経過後も沈殿や析出のないことを指標として判断することができる。
【００５９】
本発明の近赤外蛍光造影剤に造影成分として含まれる物質は、一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩である限りいかなるものでもよい。これらの化合物は「シアニン染料及び関連化合物」, F.M. Hamer, John Wiley and Sons, New York, 1964; Cytometry, 10, 3-10 (1989); Cytometry, 11, 418-430 (1990); Cytometry, 12, 723-730 (1990); Bioconjugate Chem. 4, 105-111 (1993), Anal. Biochem., 217, 197-204 (1994), Tetrahedron, 45, 4845-4866 (1989), EP-A-0591820A1, EP-A-0580145A1等に開示されているシアニン染料化合物の公知の製造方法によって合成することができる。あるいは、それらは市販のシアニン染料化合物から公知の方法によって半合成することもできる。特に、それらはジアニル化合物及びヘテロ環化合物四級塩を反応させることによって合成することができる。
【００６０】
本発明の化合物の具体例として、例えば以下の化合物があげられる。
【００６１】
【化９】
【００６２】
上記化合物は700-1300 nm、特に約700-900 nmの近赤外光領域に吸収及び蛍光を示し、100,000以上のモル吸光係数を有する。
【００６３】
本発明の近赤外蛍光造影剤は一般式（I）で表される化合物及び／又はそれらの医薬上許容しうる塩を含む限りは特に限定されない。この化合物又はその塩は単独で又は組み合わせて当該造影剤に含まれていてもよい。
【００６４】
具体的には、該造影剤は、上記化合物もしくはその医薬上許容しうる塩、又は注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等のような溶媒中に懸濁若しくは溶解した上記化合物を含む。必要に応じて、担体、賦形剤等のような薬理上許容しうる添加物を加えてもよい。これらの添加物としては、薬理上許容しうる電解質、バッファー、洗剤のような物質及び浸透圧を調整し安定性及び溶解性を改善するための物質（例えば、シクロデキストリン、リポソーム等）が挙げられる。関連分野で一般に使用される多様な添加物が使用できる。本発明の近赤外蛍光造影剤は医薬用の場合は好ましくは滅菌処理を経て製造される。
当該造影剤は、注射、噴射又は塗布、血管内（静脈、動脈）、経口、腹膜内、経皮、皮下、膀胱内又は気管支内投与によって生体に投与することができる。好ましくは、本造影剤は血管内に水剤、乳剤又は懸濁剤の形態で投与される。
【００６５】
本発明の近赤外蛍光造影剤の用量は、その用量によって最終的に診断すべき部位の検出が可能である限りは特に限定されず、使用される近赤外蛍光を放射する化合物の種類、年齢、体重及び投与対象の標的器官などによって適当に調整される。典型的には、用量は当該化合物の量として0.01-100 mg/kg体重、好ましくは0.01-20 mg/kg体重である。本発明の造影剤はヒト以外の多様な動物に適宜使用することができる。投与の形態、経路及び用量は対象動物の体重及び状態によって適当に決定される。
【００６６】
一般式（I）で表される化合物、特に好ましくは一般式（II）で表される化合物は腫瘍組織中に顕著に蓄積される傾向がある。この特性を利用することにより、本発明の蛍光造影剤を用いて腫瘍組織を特異的にイメージングすることができる。さらに、本発明の化合物は血清中半減期が長いことから、血管造影剤としても良好に機能することが期待される。
【００６７】
本発明の近赤外蛍光造影剤は、蛍光造影法（蛍光イメージング）に用いることができる。この方法は公知の方法に準じて実施され、励起波長及び検出すべき蛍光波長のようなそれぞれのパラメーターは投与される近赤外蛍光造影剤の種類及び投与対象により最適のイメージング及び評価が行えるように適宜決定される。本発明の近赤外蛍光造影剤の測定対象への投与から本発明の蛍光イメージング法による測定開始までにかかる時間は使用される近赤外蛍光造影剤の種類及び投与対象によって異なる。例えば、腫瘍イメージングを目的として造影剤が一般式（I）で表される化合物を含む場合、消失時間は投与後およそ4-120時間と考えられる。特に一般式（II）で表される化合物の場合、消失時間は投与後およそ24-120時間と考えられる。消失時間が短すぎると、蛍光が強すぎて標的部位と他の部位を明確に分けることができない。長すぎると、当該造影剤が身体から排泄されてしまうことがある。
【００６８】
SF-64に基づいた本発明者らの研究の結果、シアニン系化合物は血漿中においてアルブミンと複合体を形成することにより腫瘍に集積することが初めて明らかになった。Ｌ1〜Ｌ3で表されるポリメチン基部分にエチル基以上の嵩高さの置換基を有する一般式（I）で表される化合物はSF-64よりも高いアルブミン結合性を有する。
本発明の化合物は、高いアルブミン結合性を有することにより、SPARC、キュビリン、またはTGFβのようなアルブミン結合タンパク質と結合可能である。そのため、本発明の化合物は、アルブミン結合タンパク質が主要な役割を果たすと共に正常組織に比べて過剰発現されている疾患を対象として造影を行う際の造影剤として使用できる。アルブミン結合性タンパク質はSPARC、キュビリン、またはTGFβから選択されることが好ましい。より好ましくは、アルブミン結合性タンパク質はSPARCである。
【００６９】
すなわち、本発明の化合物およびその医薬上許容しうる塩は、SPARC発現組織の検出剤として機能し、SPARCが関与する病態全般に対する診断薬として使用することができる。本発明の化合物を造影剤として用いることが適した病態としては、軟組織、結合組織、骨、固形臓器、血管等を含めた任意の肉体組織中での、増殖の異常形態、組織再構築、過形成、過度の創傷治癒が挙げられる。具体的には例えば、癌、糖尿病性又は他の網膜症、炎症、関節炎、血管または人工血管移植片又は、血管内装置における再狭窄等が挙げられる。
【００７０】
本発明の化合物によって検出される腫瘍型は、一般的にヒトを含む哺乳動物中に見出されるものである。該腫瘍は、実験動物などでのように、接種からも生じ得る。該腫瘍とは公知のように「新生物」としても知られており、多くの型と種類とがある。本発明の化合物が造影剤として適用される腫瘍は、いかなる特定の腫瘍型又は種類にも限定されない。
本発明の化合物は、腫瘍細胞及び関連間質細胞、固形腫瘍、並びに、例えばヒトの軟組織肉腫のような軟組織に関連した腫瘍の造影に有用である。腫瘍又は癌は、口腔および咽頭、消化器系、呼吸器系、骨および関節（例えば骨転移）、軟組織、皮膚（例えばメラノーマ）、乳房、生殖系、泌尿器系、眼および眼窩、脳及び中枢神経（例えばグリオーマ）又は内分泌系（例えば甲状腺）中に位置し、必ずしも原発腫瘍又は癌に限定されない。口腔に関連した組織としては、例えば、舌および口の組織が挙げられる。癌は、例えば食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢および膵臓を含む、消化器系の組織中で発生し得る。呼吸系の癌は、咽頭、肺および気管支に発生し得る。腫瘍は、男性および女性の生殖器を構成する、子宮頚部、子宮体部、卵巣外陰、膣、前立腺、精巣および陰茎、並びに、泌尿器系を構成する膀胱、腎臓、腎盂及び尿管で発生し得る。腫瘍又は癌は頭部および/又は、頚部で発生し得る。腫瘍または癌は、リンパ組織系においても発生しうるものであり、そのような例としてはホジキン病および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。腫瘍または癌は、造血系においても発生しうるものであり、そのような例としては多発性骨髄種または白血病、例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病などが挙げられる。腫瘍は、膀胱、肝臓、膵臓、卵巣、腎臓、食道、胃、腸、脳、皮膚または乳房に位置することが好ましい。
【００７１】
アルブミンは、SPARCに対して親和性を持つ。従って、本発明の化合物は、正常組織への集積をほとんど又は全く伴うことなく、SPARCが発現している疾患部位に蓄積する。
【００７２】
試料中のSPARCタンパク質の発現は、当該分野で公知のあらゆる好適な方法により検出および定量化することができる。タンパク質の検出および定量化の好適な方法としては、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定法（ELISA）、銀染色法、BCAアッセイ（Smith et al., Anal.. Biochem., 150, 76-85 (1985)）に記載）、タンパク質−銅複合体に基づく比色分析法であるローリータンパク質アッセイ（例えばLowry et. al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)に記載）および、タンパク質結合の際のクマシーブルー G-250の吸光度変化に基づくブラッドフォードタンパク質分析(例えば Bradford et. al., Anal. Biochem., 72, 248, (1976)に記載)が挙げられる。腫瘍生検は、任意の従来の方法により行うか、又は適切な可視化システム（すなわち、HRP基質およびHRP接合二次抗体）と併せて、抗SPARC抗体（モノクロナールもしくはポリクロナールのいずれか）を用いる免疫組織化学により行うことができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。なお、下記の実施例中の化合物番号は上記に示した化合物例の番号に対応している。尚、以下の実施例において示された化合物名は、必ずしもＩＵＰＡＣ命名法に従うものではない。
以下の実施例において、化合物の連続番号は化学構造式とともに上に列挙した化合物の番号に対応する。
【００７４】
以下の手順に従い、本発明化合物合成のための中間体を得た。
なお、５−スルホー２，３，３−トリメチルインドレインは公知の合成法に従って合成した（特開平２−２３３６５８号公報）
【００７５】
【化１０】
【００７６】
中間体１（ヘテロ環四４級塩化合物）は特許記載の方法によって合成した（特表-2002-526458号公報）。
すなわち、２−クロロエタンスルホニルクロリドを、トリエチルアミン存在下、DMACに溶解した５−スルホー２，３，３−トリメチルインドレイン溶液へ室温にて攪拌しながら２時間かけて滴下した後、更に３時間攪拌した。メタノールを３０分かけて滴下した後に、水酸化ナトリウム水溶液を１時間かけて滴下し、更に１時間室温にて攪拌した。反応終了後、アセトニトリルを２時間かけて滴下し、室温にて一晩放置することで結晶を沈殿させた。濾過により結晶を回収後、DMAｃ/メタノール/水/アセトニトリル＝5/4/4/40溶液、続いてアセトニトリルで洗浄し、減圧下にて乾燥することで中間体１を得た。
【００７７】
【化１１】
【００７８】
３−フェニルピリジン(1当量)、２−クロロベンゾチアゾール(2当量)をDMAc中、100℃で3時間攪拌した。反応終了後、アセトンを加え、固体を濾取することで中間体１５を得た。
【００７９】
以下に示す、ジアニル化合物は特許文献（特表2008-526802号公報）記載の方法により入手または合成した。
【００８０】
【化１２】
【００８１】
以下に示す化合物およびその塩、上記のヘテロ４級塩化合物およびジアニル化合物またはベンゾチアゾール化合物を用いて、例えば下記に示される方法によって製造された。
公知または公知の合成法または上記の合成法により合成されるヘテロ４級塩化合物（5mmol）を、メタノール溶媒中、トリエチルアミン(25mmol)および無水酢酸(45mmol)存在下、公知または公知の合成法または上記の合成法により合成されるジアニル化合物(10mmol)またはベンゾチアゾール化合物(10mmol)と室温にて４時間攪拌する。反応混合物に酢酸ナトリウム(33mmol)を加え、室温で３０分攪拌する。生成した結晶を濾取し、メタノールで洗浄する。逆相薄相クロマトグラフィーにて目的物以外の生成物の存在を確認した場合は、展開溶媒にメタノールを用いたサイズ排除クロマトグラフィーや、展開溶媒に水・メタノール混合溶媒を用いた逆相クロマトグラフィーによる精製を行うことにより製造する。
【００８２】
化合物１： 中間体１と中間体15を用いて上記に示す合成法により合成した。
1H NMR (400MHz, D2O) δ1.17 (s, 12H), 3.32 (t, 4H), 4.39 (t, 4H), 6.36 (d, 2H), 6.78 (d, 2H), 6.92-7.00 (m, 2H), 7.18-7.24 (m, 2H), 7.26-7.37 (m, 2H), 7.52-7.62 (m, 3H), 7.65-7.70 (m, 4H)、MS(ESI+) 758 [M+1]+、λmax=750nm
化合物２：中間体１と中間体19を用いて上記に示す合成法により合成した。
1H NMR (400MHz, D2O) δ1.29 (s, 12H), 3.36 (t, 4H), 4.45 (t, 4H), 6.44 (d, 2H), 6.81 (d, 2H), 7.20-7.35 (m, 6H), 7.74-7.78 (m, 4H), 8.76 (d, 2H)、λmax=790nm
化合物３：中間体１と中間体18を用いて上記に示す合成法により合成した。
1H NMR (400MHz, D2O) δ1.50 (s, 12H), 3.32 (t, 4H) , 4.24 (s, 2H), 4.36 (t, 4H), 6.32 (d, 2H), 6.72 (d, 2H), 7.31 (d, 2H), 7.37-7.44 (m, 5H), 7.75-7.81 (m, 4H), 8.00 (dd, 2H)、λmax=791nm
【００８３】
【化１３】
【００８４】
化合物Ｂ（SF-64）は特許３５０７０６０号の段落「００５８」に記載されているように、中間体１および中間体17から合成した。
化合物Cは特許３５０７０６０号の段落「００５８」に記載されているように、中間体１および中間体16から合成した。
【００８５】
試験例１
超遠心法による血清タンパク結合率試験
被験物質をcalf serumに5ug/mLとなるように溶解し、３７℃で２０分間振とうした後、NaBrを用いた密度勾配遠心（1000000×g, 24h）を行った。遠心後、アルブミン、リポタンパク分画および残りの分画中に含まれる色素濃度をHPLCにより定量した。結果を表１に示す。
【００８６】
【表１】
【００８７】
表１より、一般式（I）で表される構造を有する本発明の化合物は、血液中のタンパク成分のうち、特にアルブミンに対して高い結合率を有することが明らかである。また、ICGのように水溶性に劣る化合物は、主に血液中のタンパク成分のうちリポタンパク質に結合することも明らかである。
【００８８】
一方、表１より、メチン鎖の置換基が嵩高くなるのに伴ってアルブミン結合率が向上していることが明らかである。よって、メチン鎖の置換基のかさ高さに因ってアルブミン結合性を制御可能することが可能なことがわかる。
【００８９】
試験例２
マウスに対する経静脈での化合物の投与及び血漿のサンプリングおよび血漿半減期の評価
BALB-cA Jcl-nu/nuマウス（日本クレア）を８週齢で購入し、検疫・馴化飼育を約一週間行った。静脈内投与は、生理食塩水（日本薬局方、大塚製薬工場）に1mg/mLとなるように被験物質を溶解した後、投与用量5mL/Kg体重とし、翼状注射針（27G）を用いて尾静脈内に１回投与した。採血時点は、投与後５，１５及び３０分、１、２、４、及び６時間とした。採血は軽麻酔下で頚静脈から行い、各時点の採血量は約５０μLとし、採血終了後の動物はエーテル深麻酔により安楽死させた。採血した血液試料は、ヘパリン処理したシリンジに採取後遠沈管に移して、氷冷し、遠心分離（約４℃、8200×g、５分間）により血漿（２０μL）を得る。この血漿にリン酸緩衝液４０μLを添加し、−８０℃以下の冷凍庫に一時保管した。各被験物質は、動物各時点雄３匹について試験を実施した。各時点より得られた試料中の被験物質濃度は、蛍光強度をEnVision(GE社)を用いて測定後、検量線から算出した。血漿半減期は、血漿中の化合物の濃度が最初の値の半分に減少するのに要した時間である。これは、典型的には試験化合物の静脈投与後に次いで、上述した通りにして血漿試料中の化合物濃度の測定をして決定される。血漿半減期を、試料採取時間に対する血漿濃度の対数をプロットする片対数プロットから評価する。見かけ一次消失率定数は線の傾斜に等しく、消失半減期は前記消失率定数の逆数である(Gibaldi, M及びPerrier, D, 1975 Pharmacokinetics, Marcel Dekker, New York)。
化合物１および化合物Ｂの血漿半減期を測定し、マウス血漿タンパク結合率と比較した結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】
表２より、本発明にしたがって作製されたアルブミン結合性化合物１の血中濃度の時間推移は、Ｂに比較して向上したことが分かる。すなわち、アルブミン結合率がSF-64より高い本発明の化合物においては、SF-64の課題であった腫瘍描出時間が改善されていることがわかる。
【００９２】
試験例３
造影実験
ヒト癌細胞HCT116 （SPARC発現＋）、A431（SPARC発現‐）、HT1080（SPARC発現‐）を生理食塩水に懸濁液をBALB-cA Jcl-nu/nuマウス（５週齢、日本クレア）の右胸部皮下に注射した。１４日後、腫瘍が成長したところでマウスを実験に使用した。被験化合物を0.5mg/mLとなるように生理食塩水に溶解し、5.0mg/kg用量でマウスの尾静脈から単回投与した。投与後の撮像は軽麻酔下、LAS-4000 IR multicolor（富士フィルム）を用いて行った。その際、励起光にはIR LED (中心波長710nm)を、励起光カットフィルターにはIR用IR785を使用した。撮像時点は、投与後１０分、３０分及び１、２、４、６および２４時間とした。各被験化合物は、それぞれの細胞を移植したマウス３匹について試験を実施した。
試験例３に記載の方法に従いHCT116細胞を移植したマウスに、上記化合物Ｂ（図中黒丸）、化合物１（四角）、化合物３（三角）を投与し、各時点における腫瘍部位の蛍光強度を大腿部位の蛍光強度で割った比率（S/N比）の時間推移を測定した結果を図１に示す。各被験化合物は、それぞれの細胞を移植したマウス３匹について試験を実施した。
【００９３】
表２および図１より、血漿タンパク結合率が高い化合物１、３は、比較化合物Bと比べて長時間に渡って、腫瘍組織（Ｓ：シグナル）と正常組織（例えば大腿、Ｎ：ノイズ）との識別の蛍光比率（Ｓ／Ｎ）が高い状態を維持していることが分かる。
【００９４】
上記の結果より、本発明の化合物は従来の化合物と比較して高い血漿タンパク結合率を有し、これにより、長時間に渡り良好なＳ/Ｎを保持できることが明らかである。
【００９５】
試験例３に記載の方法に従い各種腫瘍細胞を移植したマウスに、本発明の化合物1を投与し造影を行った。投与直後、2時間後、4時間後、6時間後における撮像結果を図２に示す。
【００９６】
図２より、HCT116細胞を移植することで形成された癌には化合物１が集積しているが、A431細胞およびHT1080細胞を移植することで形成された癌には化合物１は集積していないことが判る。本発明の化合物を用いてＳＰＡＲＣが高発現している癌の造影効果が顕著なことが確認された。
【００９７】
試験例４
ウエスタンブロット分析
造影に使用したマウスの腫瘍部を摘出後、速やかに液体窒素で冷凍した後に、クライオプレス(マイクロテック・ニチオン)を用いて粉末化した。得られた腫瘍粉末を、Cell lysate buffer (cell signaling technology)を添加し、０℃で1分超音波処理をした後に５分放置した。懸濁液を14000gで10分遠心処理した後に、上清を分離した。各上清に含まれるタンパク量をBCA protein assay(Piers Biotechnology)により定量化した後、100μg/ウエルとなるようにPBSで希釈した溶液を12.5%ポリアクリルアミドゲル（REAL GEL PLATE、バイオクラフト）上でSDSゲル電気泳動にて分析した。その後、TRANS-BLOT Semi Dry cell(BIO-RAD)を用いてPVDF膜にエレクトロブロットし、３％スキムミルクを含むTPBS緩衝液にて12時間ブロッキング、一次交代として抗SPARC抗体(SPARC(H-90) SantaCruz)を、二次抗体としてAnti-Rabbit-IgG Horseradish Peroxidase-linked whole antibody from donkey (GE Healthcare)を結合させて、ECL plus (GE Healthcare)を用いた強化化学ルミネッセンス検出を行った。視覚化には蛍光イメージリーダー（LAS-3000 富士フイルム）を使用した。
【００９８】
図２に示す造影実験に用いたマウスの腫瘍組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、一次抗体として抗SPARC抗体(SPARC(H-90))を、二次抗体としてＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ抗体を結合させて、ECL plusで発色させ、蛍光イメージャーにより撮像した。結果を図３に示す。図の左からHCT116（動物1）、HCT116（動物2）、HCT116（動物3）、HT1080(動物4)、HT1080(動物5)、HT1080(動物6)、A431(動物7)、A431(動物8)、A431(動物9)の各腫瘍細胞を移植した動物の腫瘍部位から抽出したタンパク質を用いて試験した結果である。
【００９９】
試験例３に記載の方法に従いＨＣＴ１１６細胞を移植することで腫瘍を形成したマウスを用いた造影実験後、同マウスの腫瘍および大腿の組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、一次抗体として抗SPARC抗体(SPARC(H-90))を、二次抗体としてＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ抗体を結合させて、ECL plusで発色させ、蛍光イメージャーにより撮像した。結果を図４に示す。尚、左から標品（ヒトSPARC）、大腿抽出液(動物１0)、大腿抽出液(動物11)、大腿抽出液(動物12)、腫瘍抽出液(動物１0)、腫瘍抽出液(動物11)、腫瘍抽出液(動物12)である。
【０１００】
図２、３および４の結果より、一般式（Ｉ）で表される構造有する本発明の化合物を含むアルブミン結合性を示す化合物は、ＳＰＡＲＣが発現している部位を選択的に造影できることがわかる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規化合物を含む近赤外蛍光造影剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
疾患の治療において、生体内の疾患によって引き起こされる形態学的および機能的変化をその疾患の早期段階で検出することは重要である。特に癌の治療のためには、腫瘍の位置や大きさ、性質を予め知ることは、将来の治療のための戦略やプロトコルを決定するために極めて重要となる。このために従来用いられている方法としては、穿刺等による生検の他、X線造影、MRI、PET、超音波造影などの画像診断が挙げられる。生検は確定診断としては有効であるが、被験者への負担が大きく、また病変の経時的な追跡には適さない。またX線造影やMRI、PETは必然的に被験者に放射線や電磁波への被曝を起こす。さらに、上述したような従来の画像診断は、測定と診断に複雑な操作と長い時間を要する。また、装置の大きさおよび形状の点から、外科手術中にこれらの方法を用いながらナビゲーション下で手術を行うことも困難である。
【０００３】
蛍光造影法はこれらの問題を解決する画像診断法の一つである。この方法は、特定の波長の励起光への暴露により蛍光を発する物質を造影剤として用いる。また、この方法は、生体外から励起光を照射し、生体内の蛍光物質から放射される蛍光を検出する工程を含む。
シアニン系化合物はこのような蛍光造影法に用いることができる代表的な化合物である。実際、インドシアニングリーン（以下、ICGと略す）は、現在、肝機能検査、眼底検査に用いられている。しかし、ICGは易溶化のためにヨウ素が添加された製剤として用いる必要があるため、ヨウ素過敏症患者には用いることができないといった問題点を有する。
この溶解性の問題を解決したシアニン系化合物として、特許文献１の請求項１に記載の化合物（以下「SF-64」と称する）が挙げられる。該色素は、水溶性に優れた低毒性の色素であることを特徴としており、また腫瘍描出性能を有することが該特許内に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３５０７０６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の課題は、近赤外蛍光造影剤の造影成分として有用な新規化合物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らはSF-64を用いて、シアニン系化合物の腫瘍集積機序について鋭意検討を行った。その結果、該色素および、その誘導体が血漿中においてアルブミンと複合体を形成することを初めて明らかとした。この知見に基づいて、SF64と比較して腫瘍描出時間などにおいて実際的な造影機能が向上している新規な色素化合物群を見出し、この知見を基に本発明を完成させた。すなわち本発明は以下［１］〜［８］を提供するものである。
【０００７】
［１］下記一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【０００８】
【化１】
【０００９】
式中、式中、Ｘはスルホン酸基を示し；Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に置換基を表し；Ｒ3〜Ｒ6は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基を表し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を表し； Ｌ1〜Ｌ3は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいメチン基を表し、但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基であり；ｒは０〜３の整数を表し、rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3はそれぞれ同一でも異なっていてもよく；Ｍは水素原子、アルカリ金属、又はアルカリ土類金属を表し；ｍ,ｎはそれぞれ独立に０〜３の整数を表し；前記置換基の少なくとも一つはスルホン酸基又はスルホン酸基を含む基である。
［２］下記一般式（II）で表される［１］に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【００１０】
【化２】
【００１１】
式中、
Ｒ10及びＲ11は同一又は異なって、スルホン酸基、カルボン酸基、又はホスホン酸基で置換されているアルキル基を表し；Ｒ9は、メチル基以外のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロ環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、又はアシルアミノアリールオキシ基を表す。
［３］Ｒ9がエチル基、アリール基、又はアリールメチル基である［２］に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
［４］酸基の１つ以上がナトリウムイオンと塩を形成している［１］〜［３］のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
［５］［１］〜［４］のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩を含む近赤外蛍光造影剤。
【００１２】
［６］腫瘍の造影に用いられる［５］に記載の近赤外蛍光造影剤。
［７］SPARCが高発現している癌種の造影に用いられる［６］に記載の近赤外蛍光造影剤。
［８］口腔、咽頭、消化器、呼吸器、骨および間接、軟組織、皮膚、乳房、生殖系、泌尿器系、眼および眼窩、脳及び中枢神経又は内分泌系に発生する腫瘍の造影に用いられる［６］又は［７］に記載の近赤外蛍光造影剤。
【００１３】
本発明のさらに別の観点からは、蛍光造影剤の製造のための上記の化合物の使用；蛍光造影法であって、上記の化合物を、ヒトを含む哺乳類動物に投与した後に蛍光造影する工程を含む方法；腫瘍の造影方法であって、上記の化合物を、ヒトを含む哺乳類動物に投与した後に蛍光造影する工程を含む方法が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、新規なシアニン系化合物が提供される。上記シアニン系化合物は腫瘍等の疾患部位への集積性が高く、近赤外蛍光造影剤の造影成分として適している。本発明の化合物を含む近赤外蛍光造影剤は、腫瘍描出時間が長いという特徴を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】試験例３に記載の方法に従いHCT116細胞を移植したマウスに、化合物Ｂ（●：黒丸）、化合物１（□：四角）、化合物３（△：三角）を投与し、各時点における腫瘍部位の蛍光強度を大腿部位の蛍光強度で割った比率（S/N比）の時間推移を測定した結果を示すグラフである。
【図２】各種腫瘍細胞を移植したマウスに、本発明の化合物1を投与した際の、投与直後、2時間後、4時間後、6時間後における造影結果を示す図である。
【図３】マウスの腫瘍組織から抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である：左からHCT116（動物1）、HCT116（動物2）、HCT116（動物3）、HT1080(動物4)、HT1080(動物5)、HT1080(動物6)、A431(動物7)、A431(動物8)、A431(動物9)の各腫瘍細胞を移植した動物の腫瘍部位から抽出したタンパク質を用いた結果である。
【図４】ＨＣＴ１１６細胞を移植することで腫瘍を形成したマウスの腫瘍および大腿の組織から抽出したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である：左から標品（ヒトSPARC）、大腿抽出液(動物１0)、大腿抽出液(動物11)、大腿抽出液(動物12)、腫瘍抽出液(動物１0)、腫瘍抽出液(動物11)、腫瘍抽出液(動物12)。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において、「置換基」、または「置換又は無置換の」というときの置換基としては例えば下記の置換基群から選択される置換基が挙げられる。
【００１７】
置換基群：ハロゲン原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロ環基、シアノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、カルボン酸基（カルボキシル基）、アルコキシ基、アリールオキシ基、シリルオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ基、アルコキシカルボニルオキシ基、アリールオキシカルボニルオキシ、アミノ基、アルキルアミノ基、アリールアミノ基、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、メルカプト基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホン酸基（スルホ基）、アルキルスルフィニル基、アリールスルフィニル基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、アシル基、アリールオキシカルボニル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、アリールアゾ基、ヘテロ環アゾ基、イミド基、ホスホン酸基（リン酸基）、ホスフィノ基、ホスフィニル基、ホスフィニルオキシ基、ホスフィニルアミノ基、及びシリル基。
【００１８】
なお、これらの基のうち塩を形成することが可能な基、又は一個もしくは二個以上の水素イオンの脱離により塩を形成することが可能な基については、これらいずれかの基が塩を形成したものであってもよい。これらの塩における対イオンとしては、本発明の化合物中に存在し得る陽電荷又は陰電荷、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオンが挙げられる。
【００１９】
ハロゲン原子としては、例えば、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。
アルキル基としては、直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、又はそれらの任意の組み合わせのいずれでもよく、炭素数１から３０の直鎖アルキル基（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−エチルヘキシル）、炭素数３から３０のシクロアルキル基（例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル）、炭素数５から３０のビシクロアルキル基（炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基：例えば、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イル）、及び更に環構造が多いトリシクロ構造を有するアルキル基などが挙げられる。
アルキル部分を持つ置換基のアルキル部分についても、別に説明の無い限り、上記アルキル基の説明と同様である。
【００２０】
アルケニル基としては、直鎖、分岐、環状のいずれでもよく、炭素数２から３０の直鎖アルケニル基（例えば、ビニル、アリル、プレニル、ゲラニル、オレイル）、炭素数３から３０シクロアルケニル基（炭素数３から３０のシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基：例えば２−シクロペンテン−１−イル、２−シクロヘキセン−１−イル）、及び炭素数５から３０のビシクロアルケニル基（二重結合を一個持つビシクロアルケンの水素原子を一個取り去った一価の基：例えば、ビシクロ［２，２，１］ヘプト−２−エン−１−イル、ビシクロ［２，２，２］オクト−２−エン−４−イル）などが挙げられる。アルキニル基としては、炭素数２から３０のアルキニル基（例えば、エチニル、プロパルギル）が好ましく挙げられる。アリール基としては好ましくは炭素数６から３０のアリール基であればよく、例えばフェニル、ｐ−トリル、ナフチルが挙げられる。
【００２１】
ヘテロ環基としては好ましくは５又は６員のヘテロ環基であればよく、芳香族もしくは非芳香族のヘテロ環化合物から一個の水素原子を取り除いた一価の基であればよい。より好ましくは、炭素数３から３０の５もしくは６員の芳香族のヘテロ環基であり、例えば、２−フリル、２−チエニル、２−ピリミジニル、及び２−ベンゾチアゾリルが挙げられる。アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルコキシ基であればよく、例えば、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシ、ｔ−ブトキシ、ｎ−オクチルオキシが挙げられる。アリールオキシ基としては、好ましくは、炭素数６から３０のアリールオキシ基であればよく、例えば、フェノキシ基が挙げられる。シリルオキシ基としては、好ましくは、炭素数３から２０のシリルオキシ基であればよく、例えば、トリメチルシリルオキシ、ｔ−ブチルジメチルシリルオキシが挙げられる。
【００２２】
ヘテロ環オキシ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のヘテロ環オキシ基であればよく、テトラゾールー５−オキシ、２−テトラヒドロピラニルオキシが挙げられる。アシルオキシ基としては、ホルミルオキシ基、炭素数２から３０のアルキルカルボニルオキシ基、炭素数６から３０のアリールカルボニルオキシ基等であればよく、例えば、ホルミルオキシ、アセチルオキシ、ピバロイルオキシ、ステアロイルオキシ、ベンゾイルオキシ、フェニルカルボニルオキシが挙げられる。カルバモイルオキシ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のカルバモイルオキシ基であればよく、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルバモイルオキシ、モルホリノカルボニルオキシ、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルアミノカルボニルオキシ、及びＮ−ｎ−オクチルカルバモイルオキシが挙げられる。アルコキシカルボニルオキシ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のアルコキシカルボニルオキシ基であればよく、例えばメトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、ｔ−ブトキシカルボニルオキシ、及びｎ−オクチルカルボニルオキシが挙げられる。
【００２３】
アリールオキシカルボニルオキシ基としては、好ましくは、炭素数７から３０のアリールオキシカルボニルオキシ基であればよく、例えば、フェノキシカルボニルオキシが挙げられる。アルキルアミノ基としては炭素数１から３０のアルキルアミノ基であればよく、例えばメチルアミノ及びジメチルアミノが挙げられる。アリールアミノ基としては好ましくは炭素数６から３０のアリールアミノ基であればよく、例えば、アニリノ及びジフェニルアミノが挙げられる。アシルアミノ基としては好ましくは、ホルミルアミノ基、炭素数１から３０のアルキルカルボニルアミノ基又は炭素数６から３０のアリールカルボニルアミノ基であればよく、例えば、ホルミルアミノ、アセチルアミノ、ピバロイルアミノ、ラウロイルアミノ、ベンゾイルアミノ、及び３，４，５−トリ−ｎ−オクチルオキシフェニルカルボニルアミノが挙げられる。アミノカルボニルアミノ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアミノカルボニルアミノ基であればよく、例えば、カルバモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノカルボニルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノカルボニルアミノ、及びモルホリノカルボニルアミノが挙げられる。
【００２４】
アルコキシカルボニルアミノ基としては、好ましくは炭素数２から３０のアルコキシカルボニルアミノ基であればよく、例えば、メトキシカルボニルアミノ、エトキシカルボニルアミノ、ｔ−ブトキシカルボニルアミノ、及びｎ−オクタデシルオキシカルボニルアミノが挙げられる。アリールオキシカルボニルアミノ基としては、好ましくは、炭素数７から３０のアリールオキシカルボニルアミノ基であればよく、例えば、フェノキシカルボニルアミノが挙げられる。スルファモイルアミノ基としては、好ましくは、炭素数０から３０のスルファモイルアミノ基であればよく、例えば、スルファモイルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノスルホニルアミノ、及びＮ−ｎ−オクチルアミノスルホニルアミノが挙げられる。アルキル及びアリールスルホニルアミノ基としては、好ましくは炭素数１から３０のアルキルスルホニルアミノ又は炭素数６から３０のアリールスルホニルアミノであればよく、例えば、メチルスルホニルアミノ、ブチルスルホニルアミノ、及びフェニルスルホニルアミノが挙げられる。アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルチオ基であればよく、例えばメチルチオ、エチルチオ及びｎ−ヘキサデシルチオが挙げられる。アリールチオ基としては、好ましくは炭素数６から３０のアリールチオ基であればよく、例えば、フェニルチオが挙げられる。ヘテロ環チオ基としては、好ましくは炭素数２から３０のヘテロ環チオ基であればよく、例えば、２−ベンゾチアゾリルチオ及びテトラゾール−５−イルチオが挙げられる。
【００２５】
スルファモイル基としては、好ましくは炭素数０から３０の置換もしくは無置換のスルファモイル基であればよく、例えば、Ｎ−エチルスルファモイル、Ｎ−（３−ドデシルオキシプロピル）スルファモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファモイル、Ｎ−アセチルスルファモイル、Ｎ−ベンゾイルスルファモイル、及びＮ−（Ｎ’−フェニルカルバモイル）スルファモイルが挙げられる。アルキルスルフィニル基及びアリールスルフィニル基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルスルフィニル基、又は６から３０のアリールスルフィニル基であればよく、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、及びフェニルスルフィニルが挙げられる。アルキル及びアリールスルホニル基としては、好ましくは、炭素数１から３０のアルキルスルホニル基又は６から３０のアリールスルホニル基であればよく、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、及びフェニルスルホニルが挙げられる。アシル基としては、好ましくはホルミル基、炭素数２から３０のアルキルカルボニル基、炭素数７から３０のアリールカルボニル基、又は炭素数４から３０の炭素原子でカルボニル基と結合しているヘテロ環カルボニル基であればよく、例えば、アセチル、ピバロイル、ステアロイル、ベンゾイル、２―ピリジルカルボニル、及び２―フリルカルボニルが挙げられる。アリールオキシカルボニル基としては、好ましくは、炭素数７から３０のアリールオキシカルボニル基であればよく、例えば、フェノキシカルボニルが挙げられる。
【００２６】
アルコキシカルボニル基としては、好ましくは、炭素数２から３０のアルコキシカルボニル基であればよく、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、及びｎ−オクタデシルオキシカルボニルが挙げられる。カルバモイル基としては、好ましくは、炭素数１から３０のカルバモイル基であればよく、例えば、カルバモイル、Ｎ−メチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−オクチルカルバモイル、及びＮ−（メチルスルホニル）カルバモイル）が挙げられる。アリールアゾ基及びヘテロ環アゾ基としては、好ましくは炭素数６から３０のアリールアゾ基、炭素数３から３０のヘテロ環アゾ基であればよく、例えば、フェニルアゾ、１，３，４−チアジアゾール−２−イルアゾが挙げられる。イミド基として好ましい例としては、Ｎ−スクシンイミド及びＮ−フタルイミドが挙げられる。ホスフィノ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィノ基であればよく、例えば、ジメチルホスフィノ、ジフェニルホスフィノ、及びメチルフェノキシホスフィノが挙げられる。ホスフィニル基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィニル基であればよく、例えば、ホスフィニル、ジオクチルオキシホスフィニル、及びジエトキシホスフィニルが挙げられる。ホスフィニルオキシ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィニルオキシ基であればよく、例えば、ジフェノキシホスフィニルオキシ及びジオクチルオキシホスフィニルオキシが挙げられる。ホスフィニルアミノ基としては、好ましくは、炭素数２から３０のホスフィニルアミノ基であればよく、例えば、ジメトキシホスフィニルアミノ及びジメチルアミノホスフィニルアミノが挙げられる。シリル基としては、好ましくは、炭素数３から３０のシリル基であればよく、例えば、トリメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル及びフェニルジメチルシリルが挙げられる。
【００２７】
上記の置換基は更に上記の置換基で置換されていてもよい。そのような置換基の例としては、アリールアルキル基、アシルアミノアリールオキシ基、アルキルカルボニルアミノスルホニル基、アリールカルボニルアミノスルホニル基、アルキルスルホニルアミノカルボニル基、及びアリールスルホニルアミノカルボニル基が挙げられる。その例としては、メチルスルホニルアミノカルボニル、ｐ−メチルフェニルスルホニルアミノカルボニル、アセチルアミノスルホニル、及びベンゾイルアミノスルホニル基が挙げられる。
【００２８】
以下、一般式（I）で表される化合物について詳細に説明する。
一般式（I）で表される化合物は分子中に3個以上のスルホン酸基を有する。3個以上のスルホン酸基は一般式（I）中に示される２つのＸのほか、Ｒ1〜Ｒ8で表される基のいずれか1つ以上に含まれる1つ以上のスルホン酸基から成っていればよい。なお、スルホン酸基等の酸基は、プロトンが脱離して塩を形成している基であってもよい。
一般式（I）で表される化合物はＬ1〜Ｌ3で表されるポリメチン基部分にエチル基以上の嵩高さの置換基を有することを特徴とする。
【００２９】
一般式（I）において、Ｒ1及びＲ2はそれぞれ独立に置換基を表す。置換基は上記置換基群から選択される置換基であればよい。Ｒ1、Ｒ2として好ましくはハロゲン原子、アルキル基（直鎖、分岐、環状アルキル基を含む）、アリール基、ヘテロ環基、シアノ基、カルボン酸基、アルコキシ基、アリールオキシ基、ヘテロ環オキシ基、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、アミノカルボニルアミノ基、アルコキシカルボニルアミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、スルファモイルアミノ基、アルキル及びアリールスルホニルアミノ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基、スルファモイル基、スルホン酸基、アルキル及びアリールスルホニル基、アシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、イミド基が挙げられる。より好ましくはハロゲン原子、アルキル基（直鎖、分岐、環状アルキル基を含む）、アリール基、ヘテロ環基、カルボン酸基、アルコキシ基、アミノ基（アニリノ基を含む）、アシルアミノ基、スルファモイル基、スルホン酸基、カルバモイル基、イミド基が挙げられる。さらに好ましくはハロゲン原子、炭素数１〜６の直鎖、分岐又は環状アルキル基、炭素数６〜１０のアリール基、炭素数１〜１０のヘテロ環基、カルボン酸基又はスルホン酸基が挙げられる。特に好ましくは、臭素原子、ヨウ素原子、メチル基、エチル基、フェニル基、ナフチル基、チエニル基、フリル基、ピリジル基が挙げられる。
【００３０】
一般式（I）において、ｍ、ｎは０〜３の整数である。ｍ、ｎが2又は３のときは複数存在するＲ1、Ｒ2はそれぞれ異なっていても同一でもよい。ｍ、ｎは０又は１であることが好ましく、特に好ましくは０である。
【００３１】
一般式（I）において、Ｒ3〜Ｒ6は同一又は異なって、それぞれ置換又は無置換のアルキル基であるが、該アルキル基は、Ｒ1、Ｒ2におけるアルキル基と同義であり、置換基を有する場合は上記置換基群から選択される置換基であればよい。Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれ独立に１〜20のアルキル基であることが好ましく、総炭素数１〜15のアルキル基であることがより好ましく、総炭素数１〜10のアルキル基であることがさらに好ましく、総炭素数1〜３のアルキル基であることが特に好ましい。また、Ｒ3〜Ｒ6はそれぞれ独立に無置換のアルキル基であることが好ましく、メチル基であることがもっとも好ましい。
【００３２】
一般式（I）において、Ｒ7及びＲ8は同一又は異なって、それぞれ置換又は無置換のアルキル基である。アルキル基は、直鎖アルキル基（好ましくは炭素数１から３０の直鎖アルキル基）、分岐アルキル基（好ましくは炭素数３から３０の分岐アルキル基）、又は環状のアルキル基（トリシクロ構造を有するものを含み、好ましくは炭素数３から３０のシクロアルキル基、又は炭素数５から３０のビシクロアルキル基、（炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基）であればよい。例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−エチルヘキシル、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イルが挙げられる。
これらのうち、炭素数１から２０の直鎖アルキル基が好ましく、炭素数１から１０の直鎖アルキル基がより好ましく、炭素数１から５の直鎖アルキル基がさらに好ましい。
【００３３】
Ｒ7又はＲ8で表される置換アルキル基における置換基の種類、数、位置は特に限定されない。Ｒ7又はＲ8が置換アルキル基の場合の置換基として好ましくはハロゲン原子、カルボン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基、アルキルチオ基、アリールチオ基、ヘテロ環チオ基であり、より好ましくはカルボン酸基、スルホン酸基、ホスホン酸基であり、更に好ましくはスルホン酸基である。置換アルキル基が置換直鎖アルキル基の場合、置換位置はＲ7又はＲ8として置換直鎖アルキル基が置換している窒素原子から炭素数２個以上介した位置にあることが好ましく、より好ましくは末端の炭素であることが好ましい。置換基の数は１が好ましい。
【００３４】
Ｌ1〜Ｌ3は同一又は異なって、それぞれ置換又は無置換のメチン基を表す。但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基である。ｒは０〜３の整数を表す。 rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3は同一でも異なっていてもよい。Ｌ1〜Ｌ3が置換メチン基である場合には、その置換基は上記置換基群から選択される置換基であればよい。Ｌ1〜Ｌ3のいずれか２つ以上が置換メチン基である場合には、それらの置換基同士が結合して環を形成していてもよい。
エチル基以上の嵩高さの置換基の具体例及び置換基同士が結合して環を形成する場合の具体例を以下に示す。なお、以下においてはr=２であって、２つのＬ2に挟まれるＬ3がエチル基以上の嵩高さの置換基を含む場合の Ｌ1〜Ｌ3で表されるポリメチン基部分の構造として示す。なお、＊は他の２つの部分構造それぞれとの結合部分を示す。
【００３５】
【化３】
【００３６】
【化４】
【００３７】
【化５】
【００３８】
【化６】
【００３９】
【化７】
【００４０】
【化８】
【００４１】
ｒは０〜３の整数を表すが、好ましくは１〜３であり、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは３である。Ｌ1〜Ｌ3において、好ましくは無置換メチン基がＬ1〜Ｌ3のうち一つ以上あり、より好ましくは置換メチン基が1〜3個であり残りは全て無置換メチン基であり、特に好ましくは置換メチン基が1個であり残りは全て無置換メチン基である。
【００４２】
酸基が塩を形成している基である場合、塩としては陰電荷となっているもの、アルカリ金属、又はアルカリ土類金属と塩を形成しているものが好ましい。アルカリ金属、又はアルカリ土類金属として好ましくはＮａ又はＫであり、より好ましくはＮａである。
【００４３】
なお、一般式（I）で表される化合物の陽電荷は分子内あるいは分子外にある対アニオンにより中和されている。対アニオンの例としては、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオンなどのハロゲンイオン、アセテートイオン、オキサレートイオン、フマレートイオン、ベンゾエートイオンなどのカルボキシレートイオン、ｐ−トルエンスルホネート、メタンスルホネート、ブタンスルホネート、ベンゼンスルホネートなどのスルホネートイオン、硫酸イオン、過塩素酸イオン、炭酸イオン、硝酸イオン、等が挙げられる。分子内にカルボキシレート基、スルホネート基等に負電荷を有する基が存在する場合には、化合物の陽電荷とともに分子内塩を形成していてもよい。分子外対アニオンとしては、ハロゲンイオン、メタンスルホネートイオン、硫酸イオン、が好ましく、クロロイオン、ブロモイオン又はメタンスルホネートイオンが特に好ましい。
【００４４】
一般式（I）で表される化合物はより好ましくは、上記一般式（II）で表される化合物であればよい。
【００４５】
一般式（II）において、Ｒ9がアルキル基の場合、該アルキル基の総炭素数が2〜20であることが好ましく、2〜15であることがより好ましく、2〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、エチル基、n-プロピル基、2-プロピル基、シクロプロピル基が挙げられ、更に好ましくはエチル基、n-プロピル基、2-プロピル基、シクロプロピル基である。
【００４６】
Ｒ9がアリール基の場合、該アリール基の総炭素数が5〜20であることが好ましく、5〜15であることがより好ましく、5〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、フェニル基、4−メチルフェニル基、4−フェニルフェニル基、ナフチル基が挙げられる。
【００４７】
Ｒ9がアリールアルキル基の場合、該アリールアルキル基の総炭素数が7〜30であることが好ましく、7〜20であることがより好ましく、7〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、ベンジル基、フェニルエチル基、フェニルプロピル基が挙げられる。
【００４８】
Ｒ9がヘテロ環基の場合、該ヘテロ環基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、4−ピリジル基、２−フリル基、２−チエニル基、2−オキソピロリジン−１−イル基が挙げられる。
【００４９】
Ｒ9がアシルアミノ基の場合、該アシルアミノ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、アセチルアミノ基、ベンゾイルアミノ基、ピバロイルアミノ基、4-フェニルベンゾイルアミノ基が挙げられる。
【００５０】
Ｒ9がアリールアミノ基の場合、該アリールアミノ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、N-フェニルアミノ基、N-トリルアミノ基、N,N-ジフェニルアミノ基が挙げられる。
【００５１】
Ｒ9がN-アリール-N-アルキルアミノ基の場合、該N-アリール-N-アルキルアミノ基の総炭素数が7〜30であることが好ましく、7〜20であることがより好ましく、7〜15であ
ることがさらに好ましい。
特に好ましい具体例としては、N-フェニル-N-メチルアミノ基、N-トリル-N-メチルアミノ基が挙げられる。
【００５２】
Ｒ9がアリールチオ基の場合、該アリールチオ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、フェニルチオ基、トリルチオ基、4-フェニルフェニルチオ基、ナフチルチオ基が挙げられる。
【００５３】
Ｒ9がアリールオキシ基の場合、該アリールチオ基の総炭素数が1〜20であることが好ましく、1〜15であることがより好ましく、1〜10であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、フェニルオキシ基、4-アセチルアミノフェニルオキシ基、4-フェニルフェニルオキシ基、ナフチルオキシ基が挙げられる。
【００５４】
Ｒ9がアシルアミノアリールオキシ基の場合、該アシルアミノアリールオキシ基の総炭素数が7〜30であることが好ましく、7〜20であることがより好ましく、7〜15であることがさらに好ましい。特に好ましい具体例としては、ベンゾイルアミノフェニルオキシ基が挙げられる。
【００５５】
Ｒ10、Ｒ11は、それぞれ独立して、カルボン酸基、スルホン酸基、又はホスホン酸基で置換されているアルキル基を表す。Ｒ10、Ｒ11は同一又は異なって、アルキル基としては、直鎖アルキル基（好ましくは炭素数１から３０の直鎖アルキル基）、分岐アルキル基（好ましくは炭素数３から３０の分岐アルキル基）、又は環状のアルキル基（トリシクロ構造を有するものを含み、好ましくは炭素数３から３０のシクロアルキル基、又は炭素数５から３０のビシクロアルキル基、（炭素数５から３０のビシクロアルカンから水素原子を一個取り去った一価の基）であればよい。例としてはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−オクチル、エイコシル、２−エチルヘキシル、シクロヘキシル、シクロペンチル、４−ｎ−ドデシルシクロヘキシル、ビシクロ［１，２，２］ヘプタン−２−イル、ビシクロ［２，２，２］オクタン−３−イルが挙げられる。これらのうち、炭素数１から２０の直鎖アルキル基が好ましく、炭素数１から１０の直鎖アルキル基がより好ましく、炭素数１から５の直鎖アルキル基がさらに好ましい。
【００５６】
Ｒ10、Ｒ11におけるカルボン酸基、スルホン酸）、又はホスホン酸基の数、位置は特に限定されないが、Ｒ10、Ｒ11は好ましくはカルボン酸基、スルホン酸基を有するアルキル基であり、更に好ましくはスルホン酸基を有するアルキル基である。スルホン酸基は水素原子が脱離して塩を形成していてもよい。
また、Ｒ10、Ｒ11に上記の基が置換するとき、その置換基の位置はＲ10、Ｒ11がそれぞれ置換している窒素原子から炭素数２個以上介した位置であることが好ましく、より好ましくは末端の炭素であることが好ましい。
【００５７】
生体内で使用されることになる蛍光造影剤は特に水溶性であることが必要である。本発明の近赤外蛍光造影剤は上記化合物中に３個以上のスルホン酸基を導入することにより水溶性が顕著に改善されている。優れた水溶性を得るにはスルホン酸基、カルボン酸基、ホスホン酸基の総数が４個以上であることが好ましい。合成を容易にするには、スルホン酸基、カルボン酸基、ホスホン酸基の数は10個以下、好ましくは８個以下である。水溶性の改善は各化合物の分配係数の測定、例えば分配係数をブタノール／水の二相系で測定することにより調べることができる。より詳しく言えば、３個以上のスルホン酸基の導入によりn-ブタノール／水の分配係数log Po/wは -1.00以下となる。
【００５８】
生体における水溶性は、生理的食塩水に溶解し、３６℃において時間経過後も沈殿や析出のないことを指標として判断することができる。
【００５９】
本発明の近赤外蛍光造影剤に造影成分として含まれる物質は、一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩である限りいかなるものでもよい。これらの化合物は「シアニン染料及び関連化合物」, F.M. Hamer, John Wiley and Sons, New York, 1964; Cytometry, 10, 3-10 (1989); Cytometry, 11, 418-430 (1990); Cytometry, 12, 723-730 (1990); Bioconjugate Chem. 4, 105-111 (1993), Anal. Biochem., 217, 197-204 (1994), Tetrahedron, 45, 4845-4866 (1989), EP-A-0591820A1, EP-A-0580145A1等に開示されているシアニン染料化合物の公知の製造方法によって合成することができる。あるいは、それらは市販のシアニン染料化合物から公知の方法によって半合成することもできる。特に、それらはジアニル化合物及びヘテロ環化合物四級塩を反応させることによって合成することができる。
【００６０】
本発明の化合物の具体例として、例えば以下の化合物があげられる。
【００６１】
【化９】
【００６２】
上記化合物は700-1300 nm、特に約700-900 nmの近赤外光領域に吸収及び蛍光を示し、100,000以上のモル吸光係数を有する。
【００６３】
本発明の近赤外蛍光造影剤は一般式（I）で表される化合物及び／又はそれらの医薬上許容しうる塩を含む限りは特に限定されない。この化合物又はその塩は単独で又は組み合わせて当該造影剤に含まれていてもよい。
【００６４】
具体的には、該造影剤は、上記化合物もしくはその医薬上許容しうる塩、又は注射用蒸留水、生理食塩水、リンゲル液等のような溶媒中に懸濁若しくは溶解した上記化合物を含む。必要に応じて、担体、賦形剤等のような薬理上許容しうる添加物を加えてもよい。これらの添加物としては、薬理上許容しうる電解質、バッファー、洗剤のような物質及び浸透圧を調整し安定性及び溶解性を改善するための物質（例えば、シクロデキストリン、リポソーム等）が挙げられる。関連分野で一般に使用される多様な添加物が使用できる。本発明の近赤外蛍光造影剤は医薬用の場合は好ましくは滅菌処理を経て製造される。
当該造影剤は、注射、噴射又は塗布、血管内（静脈、動脈）、経口、腹膜内、経皮、皮下、膀胱内又は気管支内投与によって生体に投与することができる。好ましくは、本造影剤は血管内に水剤、乳剤又は懸濁剤の形態で投与される。
【００６５】
本発明の近赤外蛍光造影剤の用量は、その用量によって最終的に診断すべき部位の検出が可能である限りは特に限定されず、使用される近赤外蛍光を放射する化合物の種類、年齢、体重及び投与対象の標的器官などによって適当に調整される。典型的には、用量は当該化合物の量として0.01-100 mg/kg体重、好ましくは0.01-20 mg/kg体重である。本発明の造影剤はヒト以外の多様な動物に適宜使用することができる。投与の形態、経路及び用量は対象動物の体重及び状態によって適当に決定される。
【００６６】
一般式（I）で表される化合物、特に好ましくは一般式（II）で表される化合物は腫瘍組織中に顕著に蓄積される傾向がある。この特性を利用することにより、本発明の蛍光造影剤を用いて腫瘍組織を特異的にイメージングすることができる。さらに、本発明の化合物は血清中半減期が長いことから、血管造影剤としても良好に機能することが期待される。
【００６７】
本発明の近赤外蛍光造影剤は、蛍光造影法（蛍光イメージング）に用いることができる。この方法は公知の方法に準じて実施され、励起波長及び検出すべき蛍光波長のようなそれぞれのパラメーターは投与される近赤外蛍光造影剤の種類及び投与対象により最適のイメージング及び評価が行えるように適宜決定される。本発明の近赤外蛍光造影剤の測定対象への投与から本発明の蛍光イメージング法による測定開始までにかかる時間は使用される近赤外蛍光造影剤の種類及び投与対象によって異なる。例えば、腫瘍イメージングを目的として造影剤が一般式（I）で表される化合物を含む場合、消失時間は投与後およそ4-120時間と考えられる。特に一般式（II）で表される化合物の場合、消失時間は投与後およそ24-120時間と考えられる。消失時間が短すぎると、蛍光が強すぎて標的部位と他の部位を明確に分けることができない。長すぎると、当該造影剤が身体から排泄されてしまうことがある。
【００６８】
SF-64に基づいた本発明者らの研究の結果、シアニン系化合物は血漿中においてアルブミンと複合体を形成することにより腫瘍に集積することが初めて明らかになった。Ｌ1〜Ｌ3で表されるポリメチン基部分にエチル基以上の嵩高さの置換基を有する一般式（I）で表される化合物はSF-64よりも高いアルブミン結合性を有する。
本発明の化合物は、高いアルブミン結合性を有することにより、SPARC、キュビリン、またはTGFβのようなアルブミン結合タンパク質と結合可能である。そのため、本発明の化合物は、アルブミン結合タンパク質が主要な役割を果たすと共に正常組織に比べて過剰発現されている疾患を対象として造影を行う際の造影剤として使用できる。アルブミン結合性タンパク質はSPARC、キュビリン、またはTGFβから選択されることが好ましい。より好ましくは、アルブミン結合性タンパク質はSPARCである。
【００６９】
すなわち、本発明の化合物およびその医薬上許容しうる塩は、SPARC発現組織の検出剤として機能し、SPARCが関与する病態全般に対する診断薬として使用することができる。本発明の化合物を造影剤として用いることが適した病態としては、軟組織、結合組織、骨、固形臓器、血管等を含めた任意の肉体組織中での、増殖の異常形態、組織再構築、過形成、過度の創傷治癒が挙げられる。具体的には例えば、癌、糖尿病性又は他の網膜症、炎症、関節炎、血管または人工血管移植片又は、血管内装置における再狭窄等が挙げられる。
【００７０】
本発明の化合物によって検出される腫瘍型は、一般的にヒトを含む哺乳動物中に見出されるものである。該腫瘍は、実験動物などでのように、接種からも生じ得る。該腫瘍とは公知のように「新生物」としても知られており、多くの型と種類とがある。本発明の化合物が造影剤として適用される腫瘍は、いかなる特定の腫瘍型又は種類にも限定されない。
本発明の化合物は、腫瘍細胞及び関連間質細胞、固形腫瘍、並びに、例えばヒトの軟組織肉腫のような軟組織に関連した腫瘍の造影に有用である。腫瘍又は癌は、口腔および咽頭、消化器系、呼吸器系、骨および関節（例えば骨転移）、軟組織、皮膚（例えばメラノーマ）、乳房、生殖系、泌尿器系、眼および眼窩、脳及び中枢神経（例えばグリオーマ）又は内分泌系（例えば甲状腺）中に位置し、必ずしも原発腫瘍又は癌に限定されない。口腔に関連した組織としては、例えば、舌および口の組織が挙げられる。癌は、例えば食道、胃、十二指腸、小腸、結腸、直腸、肛門、肝臓、胆嚢および膵臓を含む、消化器系の組織中で発生し得る。呼吸系の癌は、咽頭、肺および気管支に発生し得る。腫瘍は、男性および女性の生殖器を構成する、子宮頚部、子宮体部、卵巣外陰、膣、前立腺、精巣および陰茎、並びに、泌尿器系を構成する膀胱、腎臓、腎盂及び尿管で発生し得る。腫瘍又は癌は頭部および/又は、頚部で発生し得る。腫瘍または癌は、リンパ組織系においても発生しうるものであり、そのような例としてはホジキン病および非ホジキンリンパ腫が挙げられる。腫瘍または癌は、造血系においても発生しうるものであり、そのような例としては多発性骨髄種または白血病、例えば急性リンパ性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病などが挙げられる。腫瘍は、膀胱、肝臓、膵臓、卵巣、腎臓、食道、胃、腸、脳、皮膚または乳房に位置することが好ましい。
【００７１】
アルブミンは、SPARCに対して親和性を持つ。従って、本発明の化合物は、正常組織への集積をほとんど又は全く伴うことなく、SPARCが発現している疾患部位に蓄積する。
【００７２】
試料中のSPARCタンパク質の発現は、当該分野で公知のあらゆる好適な方法により検出および定量化することができる。タンパク質の検出および定量化の好適な方法としては、ウエスタンブロット法、酵素免疫測定法（ELISA）、銀染色法、BCAアッセイ（Smith et al., Anal.. Biochem., 150, 76-85 (1985)）に記載）、タンパク質−銅複合体に基づく比色分析法であるローリータンパク質アッセイ（例えばLowry et. al., J. Biol. Chem., 193, 265-275 (1951)に記載）および、タンパク質結合の際のクマシーブルー G-250の吸光度変化に基づくブラッドフォードタンパク質分析(例えば Bradford et. al., Anal. Biochem., 72, 248, (1976)に記載)が挙げられる。腫瘍生検は、任意の従来の方法により行うか、又は適切な可視化システム（すなわち、HRP基質およびHRP接合二次抗体）と併せて、抗SPARC抗体（モノクロナールもしくはポリクロナールのいずれか）を用いる免疫組織化学により行うことができる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。なお、下記の実施例中の化合物番号は上記に示した化合物例の番号に対応している。尚、以下の実施例において示された化合物名は、必ずしもＩＵＰＡＣ命名法に従うものではない。
以下の実施例において、化合物の連続番号は化学構造式とともに上に列挙した化合物の番号に対応する。
【００７４】
以下の手順に従い、本発明化合物合成のための中間体を得た。
なお、５−スルホー２，３，３−トリメチルインドレインは公知の合成法に従って合成した（特開平２−２３３６５８号公報）
【００７５】
【化１０】
【００７６】
中間体１（ヘテロ環四４級塩化合物）は特許記載の方法によって合成した（特表-2002-526458号公報）。
すなわち、２−クロロエタンスルホニルクロリドを、トリエチルアミン存在下、DMACに溶解した５−スルホー２，３，３−トリメチルインドレイン溶液へ室温にて攪拌しながら２時間かけて滴下した後、更に３時間攪拌した。メタノールを３０分かけて滴下した後に、水酸化ナトリウム水溶液を１時間かけて滴下し、更に１時間室温にて攪拌した。反応終了後、アセトニトリルを２時間かけて滴下し、室温にて一晩放置することで結晶を沈殿させた。濾過により結晶を回収後、DMAｃ/メタノール/水/アセトニトリル＝5/4/4/40溶液、続いてアセトニトリルで洗浄し、減圧下にて乾燥することで中間体１を得た。
【００７７】
【化１１】
【００７８】
３−フェニルピリジン(1当量)、２−クロロベンゾチアゾール(2当量)をDMAc中、100℃で3時間攪拌した。反応終了後、アセトンを加え、固体を濾取することで中間体１５を得た。
【００７９】
以下に示す、ジアニル化合物は特許文献（特表2008-526802号公報）記載の方法により入手または合成した。
【００８０】
【化１２】
【００８１】
以下に示す化合物およびその塩、上記のヘテロ４級塩化合物およびジアニル化合物またはベンゾチアゾール化合物を用いて、例えば下記に示される方法によって製造された。
公知または公知の合成法または上記の合成法により合成されるヘテロ４級塩化合物（5mmol）を、メタノール溶媒中、トリエチルアミン(25mmol)および無水酢酸(45mmol)存在下、公知または公知の合成法または上記の合成法により合成されるジアニル化合物(10mmol)またはベンゾチアゾール化合物(10mmol)と室温にて４時間攪拌する。反応混合物に酢酸ナトリウム(33mmol)を加え、室温で３０分攪拌する。生成した結晶を濾取し、メタノールで洗浄する。逆相薄相クロマトグラフィーにて目的物以外の生成物の存在を確認した場合は、展開溶媒にメタノールを用いたサイズ排除クロマトグラフィーや、展開溶媒に水・メタノール混合溶媒を用いた逆相クロマトグラフィーによる精製を行うことにより製造する。
【００８２】
化合物１： 中間体１と中間体15を用いて上記に示す合成法により合成した。
1H NMR (400MHz, D2O) δ1.17 (s, 12H), 3.32 (t, 4H), 4.39 (t, 4H), 6.36 (d, 2H), 6.78 (d, 2H), 6.92-7.00 (m, 2H), 7.18-7.24 (m, 2H), 7.26-7.37 (m, 2H), 7.52-7.62 (m, 3H), 7.65-7.70 (m, 4H)、MS(ESI+) 758 [M+1]+、λmax=750nm
化合物２：中間体１と中間体19を用いて上記に示す合成法により合成した。
1H NMR (400MHz, D2O) δ1.29 (s, 12H), 3.36 (t, 4H), 4.45 (t, 4H), 6.44 (d, 2H), 6.81 (d, 2H), 7.20-7.35 (m, 6H), 7.74-7.78 (m, 4H), 8.76 (d, 2H)、λmax=790nm
化合物３：中間体１と中間体18を用いて上記に示す合成法により合成した。
1H NMR (400MHz, D2O) δ1.50 (s, 12H), 3.32 (t, 4H) , 4.24 (s, 2H), 4.36 (t, 4H), 6.32 (d, 2H), 6.72 (d, 2H), 7.31 (d, 2H), 7.37-7.44 (m, 5H), 7.75-7.81 (m, 4H), 8.00 (dd, 2H)、λmax=791nm
【００８３】
【化１３】
【００８４】
化合物Ｂ（SF-64）は特許３５０７０６０号の段落「００５８」に記載されているように、中間体１および中間体17から合成した。
化合物Cは特許３５０７０６０号の段落「００５８」に記載されているように、中間体１および中間体16から合成した。
【００８５】
試験例１
超遠心法による血清タンパク結合率試験
被験物質をcalf serumに5ug/mLとなるように溶解し、３７℃で２０分間振とうした後、NaBrを用いた密度勾配遠心（1000000×g, 24h）を行った。遠心後、アルブミン、リポタンパク分画および残りの分画中に含まれる色素濃度をHPLCにより定量した。結果を表１に示す。
【００８６】
【表１】
【００８７】
表１より、一般式（I）で表される構造を有する本発明の化合物は、血液中のタンパク成分のうち、特にアルブミンに対して高い結合率を有することが明らかである。また、ICGのように水溶性に劣る化合物は、主に血液中のタンパク成分のうちリポタンパク質に結合することも明らかである。
【００８８】
一方、表１より、メチン鎖の置換基が嵩高くなるのに伴ってアルブミン結合率が向上していることが明らかである。よって、メチン鎖の置換基のかさ高さに因ってアルブミン結合性を制御可能することが可能なことがわかる。
【００８９】
試験例２
マウスに対する経静脈での化合物の投与及び血漿のサンプリングおよび血漿半減期の評価
BALB-cA Jcl-nu/nuマウス（日本クレア）を８週齢で購入し、検疫・馴化飼育を約一週間行った。静脈内投与は、生理食塩水（日本薬局方、大塚製薬工場）に1mg/mLとなるように被験物質を溶解した後、投与用量5mL/Kg体重とし、翼状注射針（27G）を用いて尾静脈内に１回投与した。採血時点は、投与後５，１５及び３０分、１、２、４、及び６時間とした。採血は軽麻酔下で頚静脈から行い、各時点の採血量は約５０μLとし、採血終了後の動物はエーテル深麻酔により安楽死させた。採血した血液試料は、ヘパリン処理したシリンジに採取後遠沈管に移して、氷冷し、遠心分離（約４℃、8200×g、５分間）により血漿（２０μL）を得る。この血漿にリン酸緩衝液４０μLを添加し、−８０℃以下の冷凍庫に一時保管した。各被験物質は、動物各時点雄３匹について試験を実施した。各時点より得られた試料中の被験物質濃度は、蛍光強度をEnVision(GE社)を用いて測定後、検量線から算出した。血漿半減期は、血漿中の化合物の濃度が最初の値の半分に減少するのに要した時間である。これは、典型的には試験化合物の静脈投与後に次いで、上述した通りにして血漿試料中の化合物濃度の測定をして決定される。血漿半減期を、試料採取時間に対する血漿濃度の対数をプロットする片対数プロットから評価する。見かけ一次消失率定数は線の傾斜に等しく、消失半減期は前記消失率定数の逆数である(Gibaldi, M及びPerrier, D, 1975 Pharmacokinetics, Marcel Dekker, New York)。
化合物１および化合物Ｂの血漿半減期を測定し、マウス血漿タンパク結合率と比較した結果を表２に示す。
【００９０】
【表２】
【００９１】
表２より、本発明にしたがって作製されたアルブミン結合性化合物１の血中濃度の時間推移は、Ｂに比較して向上したことが分かる。すなわち、アルブミン結合率がSF-64より高い本発明の化合物においては、SF-64の課題であった腫瘍描出時間が改善されていることがわかる。
【００９２】
試験例３
造影実験
ヒト癌細胞HCT116 （SPARC発現＋）、A431（SPARC発現‐）、HT1080（SPARC発現‐）を生理食塩水に懸濁液をBALB-cA Jcl-nu/nuマウス（５週齢、日本クレア）の右胸部皮下に注射した。１４日後、腫瘍が成長したところでマウスを実験に使用した。被験化合物を0.5mg/mLとなるように生理食塩水に溶解し、5.0mg/kg用量でマウスの尾静脈から単回投与した。投与後の撮像は軽麻酔下、LAS-4000 IR multicolor（富士フィルム）を用いて行った。その際、励起光にはIR LED (中心波長710nm)を、励起光カットフィルターにはIR用IR785を使用した。撮像時点は、投与後１０分、３０分及び１、２、４、６および２４時間とした。各被験化合物は、それぞれの細胞を移植したマウス３匹について試験を実施した。
試験例３に記載の方法に従いHCT116細胞を移植したマウスに、上記化合物Ｂ（図中黒丸）、化合物１（四角）、化合物３（三角）を投与し、各時点における腫瘍部位の蛍光強度を大腿部位の蛍光強度で割った比率（S/N比）の時間推移を測定した結果を図１に示す。各被験化合物は、それぞれの細胞を移植したマウス３匹について試験を実施した。
【００９３】
表２および図１より、血漿タンパク結合率が高い化合物１、３は、比較化合物Bと比べて長時間に渡って、腫瘍組織（Ｓ：シグナル）と正常組織（例えば大腿、Ｎ：ノイズ）との識別の蛍光比率（Ｓ／Ｎ）が高い状態を維持していることが分かる。
【００９４】
上記の結果より、本発明の化合物は従来の化合物と比較して高い血漿タンパク結合率を有し、これにより、長時間に渡り良好なＳ/Ｎを保持できることが明らかである。
【００９５】
試験例３に記載の方法に従い各種腫瘍細胞を移植したマウスに、本発明の化合物1を投与し造影を行った。投与直後、2時間後、4時間後、6時間後における撮像結果を図２に示す。
【００９６】
図２より、HCT116細胞を移植することで形成された癌には化合物１が集積しているが、A431細胞およびHT1080細胞を移植することで形成された癌には化合物１は集積していないことが判る。本発明の化合物を用いてＳＰＡＲＣが高発現している癌の造影効果が顕著なことが確認された。
【００９７】
試験例４
ウエスタンブロット分析
造影に使用したマウスの腫瘍部を摘出後、速やかに液体窒素で冷凍した後に、クライオプレス(マイクロテック・ニチオン)を用いて粉末化した。得られた腫瘍粉末を、Cell lysate buffer (cell signaling technology)を添加し、０℃で1分超音波処理をした後に５分放置した。懸濁液を14000gで10分遠心処理した後に、上清を分離した。各上清に含まれるタンパク量をBCA protein assay(Piers Biotechnology)により定量化した後、100μg/ウエルとなるようにPBSで希釈した溶液を12.5%ポリアクリルアミドゲル（REAL GEL PLATE、バイオクラフト）上でSDSゲル電気泳動にて分析した。その後、TRANS-BLOT Semi Dry cell(BIO-RAD)を用いてPVDF膜にエレクトロブロットし、３％スキムミルクを含むTPBS緩衝液にて12時間ブロッキング、一次交代として抗SPARC抗体(SPARC(H-90) SantaCruz)を、二次抗体としてAnti-Rabbit-IgG Horseradish Peroxidase-linked whole antibody from donkey (GE Healthcare)を結合させて、ECL plus (GE Healthcare)を用いた強化化学ルミネッセンス検出を行った。視覚化には蛍光イメージリーダー（LAS-3000 富士フイルム）を使用した。
【００９８】
図２に示す造影実験に用いたマウスの腫瘍組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、一次抗体として抗SPARC抗体(SPARC(H-90))を、二次抗体としてＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ抗体を結合させて、ECL plusで発色させ、蛍光イメージャーにより撮像した。結果を図３に示す。図の左からHCT116（動物1）、HCT116（動物2）、HCT116（動物3）、HT1080(動物4)、HT1080(動物5)、HT1080(動物6)、A431(動物7)、A431(動物8)、A431(動物9)の各腫瘍細胞を移植した動物の腫瘍部位から抽出したタンパク質を用いて試験した結果である。
【００９９】
試験例３に記載の方法に従いＨＣＴ１１６細胞を移植することで腫瘍を形成したマウスを用いた造影実験後、同マウスの腫瘍および大腿の組織から抽出したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、一次抗体として抗SPARC抗体(SPARC(H-90))を、二次抗体としてＨＲＰ結合ロバ抗ウサギ抗体を結合させて、ECL plusで発色させ、蛍光イメージャーにより撮像した。結果を図４に示す。尚、左から標品（ヒトSPARC）、大腿抽出液(動物１0)、大腿抽出液(動物11)、大腿抽出液(動物12)、腫瘍抽出液(動物１0)、腫瘍抽出液(動物11)、腫瘍抽出液(動物12)である。
【０１００】
図２、３および４の結果より、一般式（Ｉ）で表される構造有する本発明の化合物を含むアルブミン結合性を示す化合物は、ＳＰＡＲＣが発現している部位を選択的に造影できることがわかる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【化１】
式中、式中、Ｘはスルホン酸基を示し；Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に置換基を表し；Ｒ3〜Ｒ6は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基を表し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を表し； Ｌ1〜Ｌ3は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいメチン基を表し、但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基であり；ｒは０〜３の整数を表し、rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3はそれぞれ同一でも異なっていてもよく；Ｍは水素原子、アルカリ金属、又はアルカリ土類金属を表し；ｍ,ｎはそれぞれ独立に０〜３の整数を表し；前記置換基の少なくとも一つはスルホン酸基又はスルホン酸基を含む基である。
【請求項２】
下記一般式（II）で表される請求項１に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【化２】
式中、
Ｒ10及びＲ11は同一又は異なって、スルホン酸基、カルボン酸基、又はホスホン酸基で置換されているアルキル基を表し；Ｒ9は、メチル基以外のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロ環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、又はアシルアミノアリールオキシ基を表す。
【請求項３】
Ｒ9がエチル基、アリール基、又はアリールメチル基である請求項２に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
【請求項４】
酸基の１つ以上がナトリウムイオンと塩を形成している請求項1〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
【請求項５】
請求項1〜４のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩を含む近赤外蛍光造影剤。
【請求項６】
腫瘍の造影に用いられる請求項５に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項７】
SPARCが高発現している癌種の造影に用いられる請求項６に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項８】
口腔、咽頭、消化器、呼吸器、骨および間接、軟組織、皮膚、乳房、生殖系、泌尿器系、眼および眼窩、脳及び中枢神経又は内分泌系に発生する腫瘍の造影に用いられる請求項６又は７に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項１】
下記一般式（I）で表される化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【化１】
式中、式中、Ｘはスルホン酸基を示し；Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に置換基を表し；Ｒ3〜Ｒ6は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいアルキル基を表し；Ｒ7及びＲ8はそれぞれ独立に置換基を有していてもよいアルキル基を表し； Ｌ1〜Ｌ3は同一又は異なって、それぞれ置換基を有していてもよいメチン基を表し、但しＬ1〜Ｌ3の少なくとも一つはエチル基以上の嵩高さの置換基を有するメチン基であり；ｒは０〜３の整数を表し、rが２以上の場合に複数存在するＬ2及びＬ3はそれぞれ同一でも異なっていてもよく；Ｍは水素原子、アルカリ金属、又はアルカリ土類金属を表し；ｍ,ｎはそれぞれ独立に０〜３の整数を表し；前記置換基の少なくとも一つはスルホン酸基又はスルホン酸基を含む基である。
【請求項２】
下記一般式（II）で表される請求項１に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩：
【化２】
式中、
Ｒ10及びＲ11は同一又は異なって、スルホン酸基、カルボン酸基、又はホスホン酸基で置換されているアルキル基を表し；Ｒ9は、メチル基以外のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、ヘテロ環基、アシルアミノ基、アリールアミノ基、Ｎ−アリール−Ｎ−アルキルアミノ基、アリールチオ基、アリールオキシ基、又はアシルアミノアリールオキシ基を表す。
【請求項３】
Ｒ9がエチル基、アリール基、又はアリールメチル基である請求項２に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
【請求項４】
酸基の１つ以上がナトリウムイオンと塩を形成している請求項1〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩。
【請求項５】
請求項1〜４のいずれか一項に記載の化合物又はその医薬上許容しうる塩を含む近赤外蛍光造影剤。
【請求項６】
腫瘍の造影に用いられる請求項５に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項７】
SPARCが高発現している癌種の造影に用いられる請求項６に記載の近赤外蛍光造影剤。
【請求項８】
口腔、咽頭、消化器、呼吸器、骨および間接、軟組織、皮膚、乳房、生殖系、泌尿器系、眼および眼窩、脳及び中枢神経又は内分泌系に発生する腫瘍の造影に用いられる請求項６又は７に記載の近赤外蛍光造影剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−４６６６３（Ｐ２０１１−４６６６３Ａ）
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１９７７２７（Ｐ２００９−１９７７２７）
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月１０日（２０１１．３．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月２８日（２００９．８．２８）
【出願人】（３０６０３７３１１）富士フイルム株式会社 (25,513)
【Ｆターム（参考）】
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