造血器腫瘍の予防および／または治療剤
造血器腫瘍の特異的免疫療法に有用な標的分子を見出し、造血器腫瘍の予防および／または治療を可能にする手段を提供した。 具体的には、配列表の配列番号１から１０から選ばれるいずれか１のアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤、アジュバントをさらに含む前記造血器腫瘍の予防および／または治療剤、造血器腫瘍用癌ワクチンとして使用する前記予防および／または治療剤を提供することにより、造血器腫瘍、例えばＨＬＡ−Ａ２４陽性造血器腫瘍またはＨＬＡ−Ａ２４陽性であり且つ前記ペプチドを含む蛋白質を発現している造血器腫瘍の予防および／または治療を可能にした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。より詳しくは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。また、造血器腫瘍用癌ワクチンとして使用する上記造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを投与することを特徴とする造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血器腫瘍の治療には従来、非特異的な化学療法が行われてきた。また、同種骨髄移植や自己末梢血幹細胞移植等による治療も実施されている。しかし、化学療法には合併する有害事象の問題があり、同種骨髄移植や自己末梢血幹細胞移植には合併症および拒絶反応の問題やドナー確保の問題がある。また、これらの療法は、若年者においては高い効果が得られているが、癌の多発年齢層である中高齢者では、副作用の影響により必ずしも高い効果を得られていない。
【０００３】
近年、より副作用の少ない治療法として悪性腫瘍の分子メカニズムに基づく分子標的療法が注目されている。この療法によれば、分子標的剤が癌細胞に選択的且つ効率的に作用し、正常細胞への影響が少ないため、副作用が少なく且つ高い効果が得られることが多い。しかし、腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得する場合もあり、必ずしも高い効果が得られない。
【０００４】
かかる現状において、造血器腫瘍に対する有効性が高く且つ副作用の少ない治療法の開発が期待されている。
【０００５】
悪性腫瘍に対する治療法の１つとして免疫療法が開発されている。例えば、腫瘍抗原ペプチドを用いた特異的免疫療法は、悪性腫瘍、特に悪性黒色腫においてその有効性が報告されている（非特許文献１〜６）。例えば欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。
【０００６】
造血器腫瘍に対する免疫療法としては数種の治療方法が提案されている。例えば、放射線照射した自己白血病細胞によるワクチン療法が知られている。また、Ｂｃｒ／ａｂｌ変異抗原およびＰＭＬ／ＲＡＲα変異抗原はそれぞれ慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬと略称することもある）および急性前骨髄球性白血病に対するＴ細胞免疫療法の標的と見られている（非特許文献７および８）。Ｂ細胞腫瘍細胞由来の免疫グロブリン由来ペプチドは腫瘍細胞に対するＴ細胞反応の標的になり得ると考えられている（非特許文献１および９）。白血病関連抗原、例えば、ＣＭＬにおけるプロテイナーゼ３（非特許文献１０）、リンパ腫におけるＡＬＫ、および白血病におけるウイルムス抑制遺伝子ＷＴ１等についても特異的免疫療法への利用可能性が報告されている（非特許文献８および１１）。
【０００７】
造血器腫瘍に対する免疫療法においては数例の腫瘍退縮が報告されているのみであり、ほとんどの癌患者においては腫瘍特異的免疫応答は得られず、現在のところその臨床効果は限られたものである。
【０００８】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／０１１０４４号パンフレット。
【非特許文献１】ベンダンディら（Ｂｅｎｄａｎｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９９年、第５巻、ｐ．１１７１−１１７７。
【非特許文献２】トロージャンら（Ｔｒｏｊａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０００年、第６巻、ｐ．６６７−６７２。
【非特許文献３】キクチら（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「インターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９９年、第８１巻、ｐ．４５９−４６６。
【非特許文献４】ヤングら（Ｙａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９９年、第５９巻、ｐ．４０５６−４０６３。
【非特許文献５】ナカオら（Ｎａｋａｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２０００年、第１６４巻、ｐ．２５６５−２５７４。
【非特許文献６】ニシザカら（Ｎｉｓｈｉｚａｋａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第６０巻、ｐ．４８３０−４８３７。
【非特許文献７】ピニッラら（Ｐｉｎｉｌｌａ−Ｉｂａｒｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、２０００年、第９５巻、ｐ．１７８１−１７８７。
【非特許文献８】アッペルバウム（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｆ．Ｒ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．３８５−３８９。
【非特許文献９】スーら（Ｈｓｕ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９６年、第８９巻、ｐ．３１２９−３１３５。
【非特許文献１０】モルドレムら（Ｍｏｌｌｄｒｅｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９７年、第８８巻、ｐ．２４５０−２４５７。
【非特許文献１１】パソーニら（Ｐａｓｓｏｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、２００２年、第９９巻、ｐ．２１００−２１０６。
【非特許文献１２】ハラシマら（Ｈａｒａｓｈｉｍａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．）、「ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第３１巻、ｐ．３２３−３３２。
【非特許文献１３】ミヤギら（Ｍｉｙａｇｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、「クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第７巻、ｐ．３９５０−３９６２。
【非特許文献１４】イトウら（Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第６１巻、ｐ．２０３８−２０４６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、造血器腫瘍の免疫療法に有用な標的分子を見出し、造血器腫瘍の予防および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ペプチド特異的であり且つ腫瘍反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を上皮癌患者の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、以下ＰＢＭＣと略称する）から誘導し得る一連の上皮癌関連抗原および該抗原由来のペプチドを同定し既に報告している（特許文献１、非特許文献３〜６および１２）。さらに、これらペプチドを用いたワクチン接種が、種々の上皮癌患者において免疫能の亢進および臨床効果に有効であることを明らかにした（非特許文献１３）。
【００１１】
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究を重ね、既に報告した上皮癌関連抗原のいくつかが造血器腫瘍細胞株で発現していること、さらに該抗原由来ペプチドのワクチン接種により造血器腫瘍患者において悪性腫瘍細胞反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得ることを見出し、本発明を完成した。造血器腫瘍患者由来ＰＢＭＣからの白血病関連抗原による細胞傷害性Ｔ細胞誘導について報告があるが（非特許文献１０）、造血器腫瘍患者における上皮癌関連抗原による細胞傷害性Ｔ細胞誘導およびペプチドワクチンの効果については今まで報告されていない。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１３】
また本発明は、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１４】
さらに本発明は、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に、さらに配列表の配列番号３、６、７および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号１、２および４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１６】
また本発明は、配列表の配列番号２、４および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１７】
さらに本発明は、配列表の配列番号５および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、アジュバントをさらに含む上記造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１９】
また本発明は、造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍である上記予防および／または治療剤に関する。
【００２０】
さらに本発明は、造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有し且つ予防および／または治療剤の有効成分であるペプチドを含む蛋白質を発現している造血器腫瘍である上記予防および／または治療剤に関する。
【００２１】
さらにまた本発明は、造血器腫瘍用癌ワクチンとして用いることを特徴とする上記造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００２２】
また本発明は、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つとアジュバントとを含有する、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防および／または治療に用いる医薬に関する。
【００２３】
さらに本発明は、治療に有効な用量の配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つをアジュバントとともに投与することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、上皮癌関連抗原由来のペプチドを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤を提供可能である。本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、その使用の一態様として癌ワクチンとして用いることができる。本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、造血器腫瘍患者において腫瘍を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるため、造血器腫瘍の特異的免疫療法に用いることができる。例えばＨＬＡ−Ａ２４陽性造血器腫瘍、さらにＨＬＡ−Ａ２４陽性であり且つ予防および／または治療剤の有効成分であるペプチドを含む蛋白質を発現する造血器腫瘍の予防および／または治療に有用である。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子は多くの人種において頻度高くみられる遺伝子であり、アジア人の人口の約６０％、白人の約２０％、ラテンアメリカ人および黒人の約４０％がこの対立遺伝子を有する。したがって、本発明は多数の造血器腫瘍患者においてその有用性が期待できる。また、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は副作用が少ないかほとんど観察されず、この観点からも有効な予防手段および／または治療手段である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−Ａ】一連の細胞株におけるｐ５６ｌｃｋ蛋白質の発現を、抗ｐ５６ｌｃｋモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した結果を示す図である。成人Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴおよび骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７において高い発現が認められた。正常細胞であるＰＢＭＣおよびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化Ｔ細胞においても発現が認められた。（実施例２）
【図１−Ｂ】一連の細胞株におけるｌｃｋ遺伝子の２つの異なったプロモーター転写物の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す図である。成人Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴおよびＰＥＥＲ並びに骨髄性白血病細胞株ＭＬ−２では、Ｉ型およびＩＩ型の両方のプロモーター転写物が認められた。バーキットリンパ腫細胞株ＲＡＪＩ、Ｂ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、リンパ腫細胞株ＢＨＬ−８９および多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６ではＩ型のプロモーター転写物のみが認められた。一方、正常細胞であるＰＢＭＣではＩＩ型のプロモーター転写物のみが検出された。ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現は、ＲＴ−ＰＣＲのコントロールとして測定した。（実施例２）
【図２−Ａ】成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者（表２における患者＃８）由来ＰＢＭＣが、ペプチドＬｃｋ４８６（配列番号３）を用いたインビトロ刺激後、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＡＴＬ細胞株ＰＥＥＲに対して細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞株および正常細胞であるＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図（右パネル）である。一方、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ペプチド（配列番号１１）で刺激したＰＢＭＣは細胞傷害活性を示さなかった（左パネル）。（実施例３）
【図２−Ｂ】慢性リンパ球性白血病患者（表２における患者＃２）由来ＰＢＭＣが、ペプチドＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）を用いたインビトロ刺激後、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＡＴＬ細胞株ＲＥＨに対して細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞株および正常細胞であるＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図（右パネル）である。一方、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（配列番号１２）で刺激したＰＢＭＣは細胞傷害活性を示さなかった（左パネル）。（実施例３）
【図２−Ｃ】非ホジキンリンパ腫患者（表２における患者＃４）由来ＰＢＭＣが、ペプチドＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）を用いたインビトロ刺激後、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＡＴＬ細胞株ＲＥＨに対して細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞株および正常細胞であるＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図（右パネル）である。一方、ＥＢＶ由来ペプチド（配列番号１２）で刺激したＰＢＭＣは細胞傷害活性を示さなかった（左パネル）。（実施例３）
【図３−Ａ】多発性骨髄腫患者（表２における患者＃６）由来ＰＢＭＣにおいて、Ｌｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）またはＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）とインキュベーションすることにより誘導される、対応する各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対する細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）がペプチドワクチン接種の回数に従って増強されたことを説明する図である。（実施例４）
【図３−Ｂ】多発性骨髄腫患者（表２における患者＃６）由来ＰＢＭＣにおいて、ＨＬＡ−Ａ２４＋多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１１およびＭＩＫ−１に対する細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）がペプチドワクチン接種の回数に従って増強されたことを説明する図である。一方、ペプチドワクチン接種によっても、ＨＬＡ−Ａ２４−多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６に対する細胞傷害活性は認められなかった。（実施例４）
【図４−Ａ】慢性リンパ球性白血病患者（表２における患者＃１）由来ＰＢＭＣにおいて、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）またはＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対する反応におけるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生促進がペプチドワクチン接種の回数に従って増強されたことを説明する図である。（実施例５）
【図４−Ｂ】慢性リンパ球性白血病患者（表２における患者＃１）由来ＰＢＭＣが、ワクチン接種後に、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）またはＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対してＨＩＶ由来ペプチドをパルスした細胞に対するよりも高い細胞傷害活性を示したことを説明する図である。（実施例５）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００３−２８７２０８号からの優先権を請求するものである。
【００２７】
本発明の一態様は、被検体における造血器腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答を誘発することを機能的特徴とする造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００２８】
造血器腫瘍とは、骨髄やリンパ組織等の造血器官に発生する腫瘍をいう。造血器腫瘍には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫等の悪性腫瘍が含まれる。
【００２９】
ここで被検体には、造血器腫瘍患者、造血器腫瘍患者から採取した血液、および造血器腫瘍患者の血液から調製した白血球画分等が含まれる。
【００３０】
抗腫瘍免疫応答とは、腫瘍に対して惹起される免疫応答を意味し、主に細胞傷害性Ｔ細胞が関与する。すなわち、本発明においては、被検体において造血器腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを機能的特徴とする造血器腫瘍の予防および／または治療剤を提供する。
【００３１】
造血器腫瘍の予防および／または治療剤とは、例えば、造血器腫瘍の発生または再発を予防する作用を有する医薬、造血器腫瘍の進行・増悪を抑制する作用を有する医薬、および血中白血球数の減少等造血器腫瘍の病態を改善するまたは治癒させる効果を示す医薬を意味する。
【００３２】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤はその一態様において、有効成分として配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上をその有効量含有してなる。より好ましくは、配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤である。配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上に、さらに配列番号３、６、７および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤であることもできる。さらに好ましくは、配列番号１、２および４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤である。また、配列番号２、４および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤であり得る。さらに、配列番号５および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤であり得る。
【００３３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、いずれも上皮癌関連抗原に由来するペプチド（以下、上皮癌関連抗原ペプチドと称する）である。配列番号１、２および３に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、ｐ５６ｌｃｋ蛋白質由来のペプチドであり、以下、それぞれＬｃｋ２０８、Ｌｃｋ４８８およびＬｃｋ４８６と称することがある（非特許文献１２）。配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＡＲＴ−１由来のペプチドであり、以下、ＳＡＲＴ−１６９０と称することがある（非特許文献３）。配列番号５、６および７に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＡＲＴ−２由来のペプチドであり、以下、それぞれＳＡＲＴ−２９３、ＳＡＲＴ−２１６１およびＳＡＲＴ−２８９９と称することがある（非特許文献５）。配列番号８および９に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＡＲＴ−３由来のペプチドであり、以下、それぞれＳＡＲＴ−３１０９およびＳＡＲＴ−３３１５と称することがある（非特許文献４）。配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＡＲＴ−１由来のペプチドであり、以下、ＡＲＴ−１１７０と称することがある（非特許文献６）。ここで、各ペプチドは、各ペプチドが由来した蛋白質の呼称と該蛋白質のアミノ酸配列における該ペプチドのＮ末アミノ酸残基の位置を示す数字で表される。例えば、Ｌｃｋ２０８は、Ｌｃｋ蛋白質由来のペプチドであり、該ペプチドのＮ末アミノ酸残基は該蛋白質のアミノ酸配列において第２０８番目のアミノ酸残基であることを意味する。
【００３４】
本発明においては、造血器腫瘍患者に上記ペプチドをワクチン接種することにより、該患者において造血器腫瘍細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導することができ、さらに腫瘍細胞の減少を伴う臨床効果を得ることができることを見出した。上記ペプチドについては、上皮癌患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導することが既に報告されている（非特許文献３〜６および１２）。しかしながら、これらペプチドが造血器腫瘍患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することは報告されていない。
【００３５】
ペプチドをワクチン接種するとは、ワクチン接種される対象において、ペプチドに対する特異的免疫応答の誘導および／または増強を目的として、ペプチドを投与することを意味する。
【００３６】
「ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導する」とは、「細胞表面上に発現された主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）分子によって提示されたあるペプチドを認識するが、同様に提示されたそれ以外のペプチドはほとんどあるいは全く認識しない細胞傷害性Ｔ細胞」を、「ＨＬＡクラスＩ表現型がＡ２４であるＨＬＡクラスＩ分子によるペプチドの提示により誘導する」ことを意味する。
【００３７】
ワクチン接種は、具体的には、多発性骨髄腫患者例（実施例４参照）において、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）およびＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）の各ペプチドそれぞれをアジュバントと混合して調製した３種のワクチンを組合せ使用して６回行った。ついでＬｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）の各ペプチドそれぞれをアジュバントと混合して調製した３種のワクチンを組合せ使用してワクチン接種を続行した。ワクチン接種はペプチドを組合せ使用して行ったが、ワクチン接種回数に従って各ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が患者由来ＰＢＭＣにおいて増加した（図３−Ａ参照）。
【００３８】
別の臨床試験例である慢性リンパ球性白血病患者例（実施例６参照）においては、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）の各ペプチドそれぞれをアジュバントと混合して調製した２種のワクチンを接種した。本臨床例においても、ワクチン接種回数に従って各ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が患者由来ＰＢＭＣにおいて増加した（図４−Ａおよび図４−Ｂ参照）。
【００３９】
ペプチドを組合せ使用してワクチン接種したときにおいても各ペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が増加したことから、各ペプチドを単独でワクチン接種しても同様にペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導でき、さらには臨床効果を得ることができると考える。
【００４０】
ワクチン接種においてペプチドとともにワクチンに含有させたアジュバントは、ペプチドによる抗腫瘍免疫応答の誘発をさらに増強することを目的として用いた。抗腫瘍免疫応答を誘発する有効成分はペプチドであり、ペプチドのみの使用によってもインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できたことから、ペプチドのみを含む医薬も造血器腫瘍の予防および／または治療剤として有効である。アジュバントをともに含有させることによりさらに高い抗腫瘍効果が得られるため、アジュバントの使用がより好ましい。
【００４１】
ワクチン接種に用いた配列番号１、２、４、５、８および１０に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドはいずれも、ワクチン接種前の様々な種類の造血器腫瘍患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。これらペプチドの他、Ｌｃｋ４８６（配列番号３）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）、ＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）およびＳＡＲＴ−３３１５（配列番号９）が、造血器腫瘍患者由来のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。このことから、配列番号３、６、７および９に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドも造血器腫瘍に対する予防および／または治療剤の有効成分として使用できると考えた。
【００４２】
このように、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドは単独であるいは２種以上を組合せて本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤の有効成分として使用できる。
【００４３】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、その使用の一態様において癌ワクチンとして用いることができる。ここでいう癌ワクチンとは、腫瘍細胞に対する特異的免疫応答の誘導および／または増強により、癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させて腫瘍細胞を選択的に傷害する薬物を意味する。
【００４４】
上記ペプチドを例えば癌ワクチンとして用いる場合、選択した数種のペプチドを全て含有する癌ワクチンをワクチン接種に用いることの他、各ペプチドを単独で含有する癌ワクチンを複数種類用いてワクチン接種を実施することが可能である。
【００４５】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、抗腫瘍免疫応答を増強可能な補助剤を含むことができる。かかる補助剤として例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖に有効なインターロイキン２等が挙げられる。また、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤を癌ワクチンとして用いるときは、補助剤として例えばアジュバントや担体等を含むことにより高い抗腫瘍効果が得られる。アジュバントは１種または２種以上を組合せて用いることができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、ミョウバン、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）等の細菌製剤、ツベルクリン等の細菌成分製剤、キーホールリンペットヘモシアニンや酵母マンナン等の天然高分子物質、ムラミルトリペプチドまたはムラミルジペプチドまたはそれらの誘導体、アラム（ａｌｕｍ）、非イオン性ブロックコポリマー等を挙げることができる。本実施例においてはモンタニドＩＳＡ−５１（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）を用いた。使用できるアジュバントはこれら具体例に限定されることは無く、抗腫瘍免疫応答を増強可能な物質である限りにおいていずれを用いてもよい。アジュバントを用いるか否かは、例えばワクチン接種局所の炎症性反応の強さ、あるいはワクチン接種による抗腫瘍効果や被検体由来の末梢血単核細胞の細胞傷害活性の強さを指標にして判断できる。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさず且つ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。
【００４６】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤のより具体的な例として、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上とアジュバントとを含む造血器腫瘍の予防および／または治療剤を挙げることができる。
【００４７】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、上記ペプチドの他、造血器腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答を誘発し得る他の抗腫瘍ペプチドをその有効量含むことも可能である。添加する他の抗腫瘍ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであることができ、ＨＬＡ−Ａ２４以外の表現型のＨＬＡクラスＩ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであってもよい。好ましくは、本予防および／または治療剤を適用する患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る抗腫瘍ペプチドが好ましい。ペプチドによるＰＢＭＣからの特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は、ＰＢＭＣとペプチドとを適当な期間培養した後、対応するペプチドをパルスしたＨＬＡクラスＩ分子を細胞表面に有する細胞と反応させて、産生されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）量を測定することにより評価できる（実施例３参照）。例えば、ＩＦＮ−γ産生量が、ペプチド非存在下で培養したＰＢＭＣと比較して多ければ、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたと判断できる。
【００４８】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤を適用し得る造血器腫瘍は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の造血器腫瘍が好ましく、さらにその有効成分であるペプチドを含む蛋白質、例えばｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３およびＡＲＴ−１のうちの１種以上の発現が認められる造血器腫瘍がより好ましい。「ＨＬＡ−Ａ２４陽性（ＨＬＡ−Ａ２４＋と称することもある）」とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に発現していることを意味する。腫瘍は何らかの原因で異常増殖性を獲得した自己細胞である。そのため、ほとんどの場合、ＨＬＡクラスＩ表現型がＨＬＡ−Ａ２４であるヒトにおいては、正常細胞および腫瘍細胞の区別なく、細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２４分子が発現している。ＨＬＡクラスＩ表現型の決定は、造血器腫瘍患者から採取した末梢血単核細胞または造血器腫瘍の一部等を用いて、自体公知の方法に従って行うことができる（非特許文献５）。あるいは簡便には、造血器腫瘍患者から採取した血液を用いて、慣用の血清学的方法により判定することも可能である（非特許文献１４）。造血器腫瘍における各種蛋白質の発現の検出は、造血器腫瘍患者から採取した一部の造血器腫瘍について、例えば検出目的の蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により、あるいは目的の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター転写物の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による検出等により実施可能である。
【００４９】
造血器腫瘍の具体例としては、成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＴＬと略称することもある）；Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｔ−ＡＬＬと略称することもある）；Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）；多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭと略称することもある）；骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＤＳと略称することもある）；急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）；Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｂ−ＡＬＬと略称することもある）；Ｂ細胞リンパ腫（Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；慢性リンパ球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬと略称することもある）；マントル細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＭＣＬと略称することもある）；および非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＮＨＬと略称することもある）等が例示できるが、これら具体例に制限されることはない。好ましくは、ＭＭ、ＭＤＳ、ＡＴＬ、Ｔ−ＡＬＬまたはＣＬＬに、より好ましくはＭＭまたはＣＬＬに、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤が適用される。
【００５０】
ペプチドの製造は、一般的なアミノ酸の化学合成法により実施できる。化学合成法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法が包含される。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするペプチドを回収することにより製造可能である。
【００５１】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、有効成分であるペプチドの他に、アジュバント等の補助剤を含んでなるものであることができ、さらに１種または２種以上の医薬担体を含有することもできる。利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、無痛化剤、希釈剤あるいは賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００５２】
製剤形態は投与形態に応じて選択することができる。代表的な製剤形態としては、溶液剤、乳剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体、けん濁剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤丸剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の作製も可能であるが、これらに限定されない。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤等に分類され、それぞれに適した通常の方法に従い、調合、成形ないし調製することができる。また、溶液製剤として使用できる他に、凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００５３】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００５４】
リポソーム製剤は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、有効成分および／または補助剤や医薬担体等を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより調製できる。
【００５５】
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
【００５６】
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
【００５７】
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００５８】
その他の剤形についても、通常用いられる方法により調製可能である。
【００５９】
製剤中に含有される有効成分の量およびその用量範囲は、特に限定されないが、ペプチドの有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。一般的には、適当な用量範囲は、例えば１用量当り約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度、さらに好ましくは１μｇ〜１ｍｇ程度とするのが望ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれら用量の変更を行うことができる。
【００６０】
投与形態は、局所投与または全身投与のいずれも選択することができる。いずれにおいても、疾患、症状等に応じた適当な投与形態を選択する。全身投与は例えば、経口、静脈内、動脈内等への投与により実施できる。局所投与は例えば、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。
【００６１】
その他、患者の末梢血より単核細胞画分を採取して、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤とともに培養した後に、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導および／または活性化が認められた該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な抗腫瘍効果が得られる。培養するときの単核細胞濃度、造血器腫瘍の予防および／または治療剤の濃度、培養期間等の培養条件は、簡単な繰り返し実験により決定できる。培養時に、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
【００６２】
ワクチン接種を行う場合、皮内、皮下および筋肉内等に注射により局所投与することが好ましい。投与は上記用量を１日１回〜数回に分けて行うことができる。ワクチン接種は単回のみ行ってもよいが、同一局所あるいは別の局所に投与を繰り返し行うことが好ましい。例えば、週に１回の割合、あるいは１ヶ月〜数ヶ月に１回の割合での間欠的な投与が可能である。より具体的には、２週に１回の割合で１年以上の長期に亘って投与することができる。癌ワクチンがアジュバントを含まないものである場合、癌ワクチンのみを投与してもよいが、アジュバントを同一局所に投与することが可能である。癌ワクチンがアジュバントを含むものであれば、そのまま局所投与に用いることができる。ワクチン接種のプロトコルは、被検体の症状に応じてワクチン接種の効果を確認しつつ適切な投与量と投与期間を勘案して、個々に適したプロトコルを実施し得る。
【００６３】
本発明の別の一態様は、治療に有効な用量の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を投与することを特徴とする、造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法である。投与するペプチドは、より好ましくは、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドである。これら各ペプチドは、アジュバントとともに投与することがさらに好ましい。またこれらペプチドは、その２つ以上を組合せてアジュバントとともに投与することもできる。本発明に係る造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法を適用し得る造血器腫瘍は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の造血器腫瘍が好ましく、さらに該方法において投与するペプチドを含む蛋白質、例えばｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３およびＡＲＴ−１のうちの１種以上の発現が認められる造血器腫瘍がより好ましい。
【００６４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例に記載した全ての実験は、試料提供者である患者のインフォームドコンセントを得て行なった。ペプチドワクチン療法の臨床検討は、久留米大学倫理委員会の承認を受けた臨床プロトコール（プロトコール番号：２０３１）に従い、患者のインフォームドコンセントを得て実施した。
【実施例１】
【００６５】
（ワクチン接種に用いたペプチドの調製１）
臨床検討に用いたペプチドは、ｐ５６ｌｃｋ蛋白質由来のペプチドであるＬｃｋ２０８（配列番号１）およびＬｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１由来のペプチドであるＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、並びにＡＲＴ−１由来のペプチドであるＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）である。これらペプチドは、マルチプルペプチドシステム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ）社のグッドマニュファクチャリングプラックティス（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）の条件に基づいて調製した。
【００６６】
アジュバントは、モンタニド ＩＳＡ−５１（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）アジュバント（セピック社製）を用いた。
【００６７】
各ペプチドについて、その３ｍｇを滅菌生理食塩水とともにＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１に１：１容量で添加し、ボルテックスミキサーで撹拌し、乳剤を調製した。かくして、Ｌｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）またはＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）を含む４種類の乳剤を得た。
【実施例２】
【００６８】
（造血器腫瘍における上皮癌関連抗原発現の測定）
上皮癌関連抗原であるｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２およびＳＡＲＴ−３の発現を、一連の造血器腫瘍細胞株について検討した。検討には次の細胞株を用いた：Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）細胞株であるＲＥＨ、ＨＡＬＬ１、ＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ１６、ＫＯＰＮ−Ｋ、ＢＡＬＭ１−２およびＢＡＬＬ−１；Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞株であるＫＯＰＴ、ＲＰＭＩ−８４０２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２およびＰＥＥＲ；急性骨髄性白血病細胞株であるＭＬ１、ＭＬ２、ＭＬ３およびＫＧ１；急性単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１およびＵ−９３７；バーキットリンパ腫細胞株であるＲＡＪＩおよびＮＡＭＡＬＷＡ；慢性骨髄性白血病細胞株であるＮＡＬＭ１およびＫ５６２；多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株であるＡＲＨ−７７、Ｕ−２６６、ＫＨＭ−１１、ＭＩＫ−１およびＲＰＭＩ−８２２６；それぞれＢ細胞リンパ腫細胞株、Ｔ細胞リンパ腫細胞株および赤白血病細胞株であるＢＨＬ−８９、ＨｕＴ−１０２およびＨＥＬ；並びに成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴ。これら細胞株は全て、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）中で維持培養した。
【００６９】
各細胞株におけるｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１およびＳＡＲＴ−２の発現を、抗ｐ５６ｌｃｋ蛋白質モノクローナル抗体（Ｌｃｋ３Ａ５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、抗ＳＡＲＴ−１ポリクローナル抗体および抗ＳＡＲＴ−２ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法により検出した。さらに、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いてフローサイトメトリーによりｐ５６ｌｃｋ蛋白質およびＳＡＲＴ−３の発現を分析した。細胞内染色は、細胞を４％パラホルムアルデヒドと０．１％サポニンで前処理し、ついで抗ｐ５６ｌｃｋ蛋白質モノクローナル抗体および抗ＳＡＲＴ−３モノクローナル抗体を添加することにより行った。二次抗体として、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を用いた。
【００７０】
ｌｃｋ遺伝子プロモーターには異なった２つの型が知られており、腫瘍細胞および正常末梢血単核細胞においてはそれぞれＩ型およびＩＩ型が主に使用されている（非特許文献１２）。そこで、ｌｃｋ遺伝子の２つのプロモーターの検出を、特異的プライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲにより常法に従って行った（非特許文献１２）。試料として用いた総ＲＮＡは、細胞からＲＮＡ−Ｂｅｅ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ社製）を用いて抽出した。ｃＤＮＡはスーパースクリプトファーストストランドシンセシスシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調製した。ＰＣＲはタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてＤＮＡサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）中で３０サイクル（９４℃で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間）実施した。
【００７１】
ＡＲＴ−１遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出は、常法に従ってノザンブロット分析により行った（非特許文献６）。コントロールプローブとしてヒトβアクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。
【００７２】
ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の発現は、ウェスタンブロット法による分析において、ＨＰＢ−ＭＬＴ白血病細胞株およびＡＲＨ−７７骨髄腫細胞株、並びにＰＢＭＣおよびＰＨＡ芽球化Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔｏｉｄ Ｔ ｃｅｌｌ）で認められた（図１−Ａ）。また、ｌｃｋ遺伝子プロモーターの分析により、ＨＰＢ−ＭＬＴ、ＰＥＥＲおよびＭＬ−２は両方のプロモーターを用いており、一方ＢＡＬＬ−１、ＢＨＬ−８９およびＲＡＪＩはＩ型プロモーターのみを使用していることが判明した（図１−Ｂ）。検討に用いた造血器腫瘍細胞株のほとんどがｐ５６ｌｃｋｍＲＮＡを発現していることが明らかになった。
【００７３】
ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２およびＳＡＲＴ−３はいずれも試験した全ての造血器腫瘍細胞株において発現していたが、ＰＢＭＣでは発現が認められなかった。
【００７４】
ＡＲＴ−１は試験した全ての造血器腫瘍細胞株およびＰＢＭＣで発現しており、ほとんどの細胞株でＰＢＭＣより高い発現が認められた。
【００７５】
これら蛋白質の造血器腫瘍株における発現検討結果を表１に示した。表中、ＮＴとは検討を行わなかったことを示す。
【００７６】
【表１】
【実施例３】
【００７７】
（上皮癌関連抗原ペプチドによる造血器腫瘍患者ＰＢＭＣからの細胞傷害性Ｔ細胞誘導）
造血器腫瘍患者ＰＢＭＣからのペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を、既報に従って行った（非特許文献５）。
【００７８】
細胞傷害性Ｔ細胞の誘導には次のペプチドを用いた：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質由来ペプチドであるＬｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＬｃｋ４８６（配列番号３）；ＳＡＲＴ−１由来ペプチドであるＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）；ＳＡＲＴ−２由来ペプチドであるＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）およびＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）；ＳＡＲＴ−３由来ペプチドであるＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）およびＳＡＲＴ−３３１５（配列番号９）；並びにＡＲＴ−１由来ペプチドであるＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）。これらはいずれも上皮癌関連抗原由来ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を上皮癌患者のＰＢＭＣから誘導する能力を有する（非特許文献３〜６および１２）。ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有する陰性コントロールペプチドおよび陽性コントロールペプチドとして、それぞれヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ペプチド（配列番号１１）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（配列番号１２）を用いた。ペプチド（純度９５％以上）は全てサワディーラボラトリーから購入し、それぞれジメチルスルホキシドに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して使用した。
【００７９】
ＰＢＭＣは、造血器腫瘍患者から採取した末梢血より、フィコールコンレイ密度勾配遠心法を用いて調製した。ＰＢＭＣ上のＨＬＡ−Ａ２４分子発現の測定は、フローサイトメトリーを用いて公知方法に従って行った（非特許文献５）。
【００８０】
ＰＢＭＣからの細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は、以下の様に実施した。まず、ＰＢＭＣ（細胞数１×１０５／ｗｅｌｌ）を各ペプチド１０μＭとともに９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）において２００μｌの培養培地中でインキュベーションした。培養培地の組成は、４５％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）、および０．１ｍＭ ＭＥＭノンエッセンシャルアミノアシッドソリューション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）からなる。培養３日目、６日目および９日目に、培地の半量を除去し、対応するペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含む新鮮培地と交換した。培養１２日目に細胞を回収し、対応するペプチドまたは陰性コントロールであるＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）を前もってパルスしたＨＬＡ−Ａ２４発現Ｃ１Ｒ細胞（Ｃ１Ｒ−Ａ２４と呼称する）に対する反応におけるＩＦＮ−γの産生能を試験した。ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）に対する反応において産生されたＩＦＮ−γをバックグランドとして、データの値から減算した。対応するペプチドに対する反応においてペプチドで刺激されたＰＢＭＣにより産生されたＩＦＮ−γの平均値が、ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）に対する反応において産生されたものより高い場合、ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞前駆体がＰＢＭＣに存在し、ペプチドによりペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたと判定した。
【００８１】
細胞傷害性Ｔ細胞誘導の検討は、ＨＬＡ−Ａ２４＋造血器腫瘍患者１０例（ＣＬＬ２例、ＭＣＬ１例、ＮＨＬ１例、Ｂ−ＡＬＬ１例、ＭＭ１例、ＭＤＳ１例、ＡＴＬ２例、およびＴ−ＡＬＬ１例）のＰＢＭＣについて、ｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３およびＡＲＴ−１由来のペプチドを用いて行った。用いたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４＋上皮癌患者のＰＢＭＣからペプチド特異的腫瘍反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導したペプチドであり、現在、上皮癌患者に対するワクチンとして臨床試験を行っている。該ペプチドでインビトロにてＰＢＭＣを刺激し、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生を測定した結果を表２に示した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
Ｌｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８６（配列番号３）およびＬｃｋ４８８（配列番号２）により刺激したＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生の促進が、それぞれ１０例中２例、３例および４例で認められた。Ｌｃｋ２０８（配列番号１）は、ＡＴＬ１例およびＴ−ＡＬＬ１例のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を促進した。Ｌｃｋ４８６（配列番号３）はＡＴＬ２例およびＴ−ＡＬＬ１例のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を促進した。Ｌｃｋ４８８（配列番号２）はＭＭ１例、ＭＤＳ１例、およびＡＴＬ２例のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、陽性コントロールであるＥＢＶ由来ペプチド（配列番号１２）による刺激では１０例中６例でＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生の促進が認められたが、陰性コントロールであるＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）では全ての例でＩＦＮ−γ産生が認められなかった。
【００８４】
上記試験においてペプチドとのインキュベーションにより該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４に対するＩＦＮ−γ産生を促進したＰＢＭＣについて、さらにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）のみの存在下で２週間培養した後に、造血器腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性を標準的な５１Ｃｒ遊離試験（非特許文献５）により検討した。具体的には、得られたＰＢＭＣをエフェクターとして用い、５１Ｃｒ標識した標的細胞（以下、ターゲットと称する）と、エフェクター／ターゲット比３、１０または３０で混合して６時間インキュベーションした後に、上清中に遊離された５１Ｃｒの放射活性を測定した。得られた結果は、ターゲットを完全に溶解したときの放射活性を１００％として算出した％溶解（％ｌｙｓｉｓ）で表した。ターゲットとして、ＨＬＡ−Ａ２４＋造血器腫瘍細胞株であるＰＥＥＲ、ＨＬＡ−Ａ２４−造血器腫瘍細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴおよびＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞を用いた。
【００８５】
代表的な結果を図２−Ａ、図２−Ｂおよび図２−Ｃに示す。Ｌｃｋ４８６（配列番号３）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）またはＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）で刺激し、さらにＩＬ−２存在下で培養したＰＢＭＣ（それぞれ表２における患者＃８、患者＃２、患者＃４）はいずれも、ＨＬＡ−Ａ２４＋造血器腫瘍株に対して有意に細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−造血器腫瘍株またはＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった（それぞれ図２−Ａ、図２−Ｂ、図２−Ｃ）。かかる細胞傷害活性は、ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）またはＥＢＶ由来ペプチド（配列番号１２）で培養したＰＢＭＣには認められなかった。
【００８６】
Ｌｃｋ４８６（配列番号３）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）およびＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）は造血器腫瘍患者のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得ることが明らかになった。
【実施例４】
【００８７】
（造血器腫瘍患者における癌ワクチン接種の検討１）
臨床試験を実施した患者（表２における患者＃６）は、７４歳のＨＬＡ−Ａ２４＋男性患者であり、デュリーアンドサーモン分類法（Ｄｕｒｉｅ＆Ｓａｌｍｏｎ’ｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりステージＩＩＩに分類されたＩｇＡタイプ多発性骨髄腫を罹患していた。該患者は、本臨床試験参加以前に一連の化学療法を多回数受け、化学療法耐性を獲得していた。しかし、ペプチドワクチン接種以前の４週間は、化学療法、またはステロイドや他の如何なる免疫抑制剤の投与も受けていない。
【００８８】
患者骨髄由来ＣＤ３８＋多発性骨髄腫細胞（ＭＭ細胞）上にＨＬＡ−Ａ２４分子が発現していることは、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した。さらに、これらＣＤ３８＋ＭＭ細胞がＬｃｋ蛋白質を発現していることは、抗Ｌｃｋ抗体を用いて同様に確認した。
【００８９】
ワクチン接種に用いたペプチドは、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）およびＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）である。これらペプチドはワクチン接種前の該患者由来のＰＢＭＣにおいてインビトロで細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。したがって、該患者のＰＢＭＣには、これらペプチドに対して反応し得るペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞前駆体が存在していると考えた。
【００９０】
これら各ペプチドとアジュバントとを含む３種類の乳剤を実施例１記載の方法に従って調製し、患者の大腿側面のそれぞれ別の部位に皮下注射することによりワクチン接種を行った。ワクチン接種は、患者がペプチドに対する即時型過敏反応を示さないことを皮膚試験により確認した後に実施した。皮膚試験は、生理食塩水中５０μｇの各ペプチドを皮内注射することにより行い、注射２０分後または２４時間後に即時型過敏反応または遅延型過敏反応をそれぞれ観察した。
【００９１】
ワクチン接種は、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）を用いて、２週間隔で７回行った。６回目のワクチン接種後に得たＰＢＭＣの細胞障害活性を実施例３記載のインビトロ試験に従って測定した。その結果、該ＰＢＭＣにおいて、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＬｃｋ２０８（配列番号１）それぞれに対するペプチド特異的細胞傷害活性が認められた。そこで、８回目以降のワクチン接種には、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）またはＬｃｋ２０８（配列番号１）とアジュバントとを含む３種の乳剤を実施例１記載の方法に従って調製し使用した。
【００９２】
ワクチン接種後、患者由来のＰＢＭＣの、用いたペプチド特異的な細胞傷害活性を、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を用いて５１Ｃｒ遊離試験により測定した。その結果、ワクチン接種回数に従ってペプチド特異的な細胞傷害活性が増強されたことが明らかになった（図３−Ａ）。３回目、６回目および９回目のワクチン接種の後にＰＢＭＣを採取し、骨髄腫細胞株に対する細胞傷害活性を試験したところ、該ＰＢＭＣはＨＬＡ−Ａ２４＋骨髄細胞株ＫＨＭ−１１およびＭＩＫ−１に対して有意なレベルの細胞傷害活性を示した（図３−Ｂ）。一方、ＨＬＡ−Ａ２４−骨髄細胞株ＲＰＭＩ−８２２６に対する細胞傷害活性は非常に低かった。これら細胞傷害活性は抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８抗体（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ａ１１．１、ＩｇＧ３）により有意に阻害されたが、抗ＣＤ１４抗体（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）によっては阻害されなかった。
【００９３】
ペプチドのワクチン接種により多発性骨髄腫患者の血液中において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたことが明らかになった。
【００９４】
臨床反応については、骨髄検査により形質細胞が４６％減少したことが判明し（ワクチン接種前４６．６×１０４／μｌから６回目のワクチン接種後２１．５×１０４／μｌに減少した）、安定状態（ｓｔａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は９ヶ月以上継続した。
【００９５】
ワクチン接種の副作用は、投与部位において局所的反応が認められたのみ（グレードＩＩ）であり、これに対する治療の必要がない程度であった。ワクチン接種に用いたペプチドに対する遅延型過敏反応は全く観察されなかった。また、本例においては、自己免疫反応を示す症状は認められなかった。
【００９６】
これらから、上記ペプチドのワクチン接種が、造血器腫瘍の治療に有効であり、副作用も極めて少ないことが明らかになった。
【実施例５】
【００９７】
（ワクチン接種に用いたペプチドの調製２）
ＳＡＲＴ−２由来のペプチドであるＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３由来のペプチドであるＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）について、実施例１と同様のアジュバントを用いて同様の方法で２種類の乳剤を調製した。
【実施例６】
【００９８】
（造血器腫瘍患者における癌ワクチン接種の検討２）
臨床試験を実施した患者（表２における患者＃１）は、６３歳のＨＬＡ−Ａ２４＋女性患者であり、バーネット分類法（Ｂｅｒｎｅｔ’ｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりステージＡに分類された慢性リンパ球性白血病を罹患していた。該患者は、本臨床試験開始時に、白血球数増加および血小板数減少の進行が認められた。
【００９９】
患者ＰＢＭＣ由来ＣＤ１９＋慢性リンパ球性白血病細胞（ＣＬＬ細胞）上にＨＬＡ−Ａ２４分子が発現していることは、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した。
【０１００】
ワクチン接種前の該患者由来のＰＢＭＣにおいてインビトロで細胞傷害性Ｔ細胞を誘導したペプチドであるＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）は、ワクチン接種前に行った皮膚試験（実施例４参照）において即時型過敏反応を惹起した。そのため、ワクチン接種には、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）を用いた。これらぺプチドに対して反応するイムノグロブリンＧ抗体がワクチン前の血清中に有意に高いレベルで検出されたことから、該患者においてワクチン接種前にこれらペプチドに対する液性免疫が惹起されていることが判明した。上皮癌患者におけるペプチドワクチンの臨床試験において、患者の生存率とワクチンに用いたペプチドに対する液性免疫応答の亢進との間に相関が認められている。このことから、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）が本患者に有効に作用すると考えた。
【０１０１】
これらペプチドを用いて実施例５で調製した２種類の乳剤を患者の大腿側面のそれぞれ別の部位に皮下注射することによりワクチン接種を行った。
【０１０２】
ワクチン接種後に毎回、患者由来のＰＢＭＣについて、用いたペプチド特異的な細胞傷害Ｔ細胞の誘導を、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対するＩＦＮ−γの産生量を指標にして測定した（実施例３参照）。その結果、ワクチン接種回数に従ってＩＦＮ−γ産生量が増加した（図４−Ａ）。ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生は、抗ＣＤ８抗体（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ａ１１．１、ＩｇＧ３）により有意に阻害されたが、抗ＣＤ１４抗体（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）によっては阻害されなかった。
【０１０３】
これら結果から、ワクチン接種により、ペプチド反応性細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたことが明らかになった。さらに、これらペプチド反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）またはＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対して、ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）をパルスした細胞に対するよりも高い細胞傷害活性を示すことが５１Ｃｒ遊離試験により判明した（図４−Ｂ）。
【０１０４】
ペプチドのワクチン接種により慢性リンパ球性白血病患者の血液中において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたことが明らかになった。
【０１０５】
臨床反応については、ワクチン接種前２０×１０３／μｌであった血中リンパ球数が、６回目のワクチン接種後に一時的ではあるが１２．８×１０３／μｌに著しく減少した。血小板数は、ワクチン接種前には１０×１０４／μｌと低かったが、６回目のワクチン接種後には増加し、１７回のワクチン接種期間を通して正常範囲内に保たれていた。
【０１０６】
ワクチン接種の副作用は、投与部位において局所的反応が認められたが治療不要であった（グレードＩ）。また、３回目のワクチン接種後にＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）に対する免疫反応の指標の１つである遅延型過敏反応が観察された。副作用は極めて少なかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、造血器腫瘍の特異的免疫療法に用いることができ、医薬分野における利用可能性が非常に高く有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号１：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号２：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号３：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号４：ＳＡＲＴ−１の部分ペプチド。
配列番号５：ＳＡＲＴ−２の部分ペプチド。
配列番号６：ＳＡＲＴ−２の部分ペプチド。
配列番号７：ＳＡＲＴ−２の部分ペプチド。
配列番号８：ＳＡＲＴ−３の部分ペプチド。
配列番号９：ＳＡＲＴ−３の部分ペプチド。
配列番号１０：ＡＲＴ−１の部分ペプチド。
配列番号１１：ヒト免疫不全ウイルス由来ペプチド。
配列番号１２：エプスタインバーウイルス由来ペプチド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。より詳しくは、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。また、造血器腫瘍用癌ワクチンとして使用する上記造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。さらに、細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るペプチドを投与することを特徴とする造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
造血器腫瘍の治療には従来、非特異的な化学療法が行われてきた。また、同種骨髄移植や自己末梢血幹細胞移植等による治療も実施されている。しかし、化学療法には合併する有害事象の問題があり、同種骨髄移植や自己末梢血幹細胞移植には合併症および拒絶反応の問題やドナー確保の問題がある。また、これらの療法は、若年者においては高い効果が得られているが、癌の多発年齢層である中高齢者では、副作用の影響により必ずしも高い効果を得られていない。
【０００３】
近年、より副作用の少ない治療法として悪性腫瘍の分子メカニズムに基づく分子標的療法が注目されている。この療法によれば、分子標的剤が癌細胞に選択的且つ効率的に作用し、正常細胞への影響が少ないため、副作用が少なく且つ高い効果が得られることが多い。しかし、腫瘍細胞が薬剤耐性を獲得する場合もあり、必ずしも高い効果が得られない。
【０００４】
かかる現状において、造血器腫瘍に対する有効性が高く且つ副作用の少ない治療法の開発が期待されている。
【０００５】
悪性腫瘍に対する治療法の１つとして免疫療法が開発されている。例えば、腫瘍抗原ペプチドを用いた特異的免疫療法は、悪性腫瘍、特に悪性黒色腫においてその有効性が報告されている（非特許文献１〜６）。例えば欧米では、腫瘍抗原投与により癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させる癌ワクチン療法の開発がなされつつあり、メラノーマ特異的腫瘍抗原については臨床試験における成果が報告されている。
【０００６】
造血器腫瘍に対する免疫療法としては数種の治療方法が提案されている。例えば、放射線照射した自己白血病細胞によるワクチン療法が知られている。また、Ｂｃｒ／ａｂｌ変異抗原およびＰＭＬ／ＲＡＲα変異抗原はそれぞれ慢性骨髄性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＭＬと略称することもある）および急性前骨髄球性白血病に対するＴ細胞免疫療法の標的と見られている（非特許文献７および８）。Ｂ細胞腫瘍細胞由来の免疫グロブリン由来ペプチドは腫瘍細胞に対するＴ細胞反応の標的になり得ると考えられている（非特許文献１および９）。白血病関連抗原、例えば、ＣＭＬにおけるプロテイナーゼ３（非特許文献１０）、リンパ腫におけるＡＬＫ、および白血病におけるウイルムス抑制遺伝子ＷＴ１等についても特異的免疫療法への利用可能性が報告されている（非特許文献８および１１）。
【０００７】
造血器腫瘍に対する免疫療法においては数例の腫瘍退縮が報告されているのみであり、ほとんどの癌患者においては腫瘍特異的免疫応答は得られず、現在のところその臨床効果は限られたものである。
【０００８】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【特許文献１】国際公開ＷＯ０１／０１１０４４号パンフレット。
【非特許文献１】ベンダンディら（Ｂｅｎｄａｎｄｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、１９９９年、第５巻、ｐ．１１７１−１１７７。
【非特許文献２】トロージャンら（Ｔｒｏｊａｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．）、「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２０００年、第６巻、ｐ．６６７−６７２。
【非特許文献３】キクチら（Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「インターナショナル ジャーナル オブ キャンサー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９９年、第８１巻、ｐ．４５９−４６６。
【非特許文献４】ヤングら（Ｙａｎｇ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．）、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、１９９９年、第５９巻、ｐ．４０５６−４０６３。
【非特許文献５】ナカオら（Ｎａｋａｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２０００年、第１６４巻、ｐ．２５６５−２５７４。
【非特許文献６】ニシザカら（Ｎｉｓｈｉｚａｋａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．）、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第６０巻、ｐ．４８３０−４８３７。
【非特許文献７】ピニッラら（Ｐｉｎｉｌｌａ−Ｉｂａｒｚ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、２０００年、第９５巻、ｐ．１７８１−１７８７。
【非特許文献８】アッペルバウム（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ，Ｆ．Ｒ．）、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、２００１年、第４１１巻、ｐ．３８５−３８９。
【非特許文献９】スーら（Ｈｓｕ，Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９６年、第８９巻、ｐ．３１２９−３１３５。
【非特許文献１０】モルドレムら（Ｍｏｌｌｄｒｅｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、１９９７年、第８８巻、ｐ．２４５０−２４５７。
【非特許文献１１】パソーニら（Ｐａｓｓｏｎｉ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、「ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）」、２００２年、第９９巻、ｐ．２１００−２１０６。
【非特許文献１２】ハラシマら（Ｈａｒａｓｈｉｍａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．）、「ヨーロピアン ジャーナル オブ イムノロジー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第３１巻、ｐ．３２３−３３２。
【非特許文献１３】ミヤギら（Ｍｉｙａｇｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．）、「クリニカル キャンサー リサーチ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第７巻、ｐ．３９５０−３９６２。
【非特許文献１４】イトウら（Ｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．）、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００１年、第６１巻、ｐ．２０３８−２０４６。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、造血器腫瘍の免疫療法に有用な標的分子を見出し、造血器腫瘍の予防および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ペプチド特異的であり且つ腫瘍反応性の細胞傷害性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）を上皮癌患者の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、以下ＰＢＭＣと略称する）から誘導し得る一連の上皮癌関連抗原および該抗原由来のペプチドを同定し既に報告している（特許文献１、非特許文献３〜６および１２）。さらに、これらペプチドを用いたワクチン接種が、種々の上皮癌患者において免疫能の亢進および臨床効果に有効であることを明らかにした（非特許文献１３）。
【００１１】
本発明者らは、上記課題解決のため鋭意研究を重ね、既に報告した上皮癌関連抗原のいくつかが造血器腫瘍細胞株で発現していること、さらに該抗原由来ペプチドのワクチン接種により造血器腫瘍患者において悪性腫瘍細胞反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得ることを見出し、本発明を完成した。造血器腫瘍患者由来ＰＢＭＣからの白血病関連抗原による細胞傷害性Ｔ細胞誘導について報告があるが（非特許文献１０）、造血器腫瘍患者における上皮癌関連抗原による細胞傷害性Ｔ細胞誘導およびペプチドワクチンの効果については今まで報告されていない。
【００１２】
すなわち、本発明は、配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１３】
また本発明は、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１４】
さらに本発明は、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に、さらに配列表の配列番号３、６、７および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、配列表の配列番号１、２および４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１６】
また本発明は、配列表の配列番号２、４および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１７】
さらに本発明は、配列表の配列番号５および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、アジュバントをさらに含む上記造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００１９】
また本発明は、造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍である上記予防および／または治療剤に関する。
【００２０】
さらに本発明は、造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有し且つ予防および／または治療剤の有効成分であるペプチドを含む蛋白質を発現している造血器腫瘍である上記予防および／または治療剤に関する。
【００２１】
さらにまた本発明は、造血器腫瘍用癌ワクチンとして用いることを特徴とする上記造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００２２】
また本発明は、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つとアジュバントとを含有する、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防および／または治療に用いる医薬に関する。
【００２３】
さらに本発明は、治療に有効な用量の配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つをアジュバントとともに投与することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法に関する。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、上皮癌関連抗原由来のペプチドを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤を提供可能である。本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、その使用の一態様として癌ワクチンとして用いることができる。本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、造血器腫瘍患者において腫瘍を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができるため、造血器腫瘍の特異的免疫療法に用いることができる。例えばＨＬＡ−Ａ２４陽性造血器腫瘍、さらにＨＬＡ−Ａ２４陽性であり且つ予防および／または治療剤の有効成分であるペプチドを含む蛋白質を発現する造血器腫瘍の予防および／または治療に有用である。ＨＬＡ−Ａ２４対立遺伝子は多くの人種において頻度高くみられる遺伝子であり、アジア人の人口の約６０％、白人の約２０％、ラテンアメリカ人および黒人の約４０％がこの対立遺伝子を有する。したがって、本発明は多数の造血器腫瘍患者においてその有用性が期待できる。また、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は副作用が少ないかほとんど観察されず、この観点からも有効な予防手段および／または治療手段である。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１−Ａ】一連の細胞株におけるｐ５６ｌｃｋ蛋白質の発現を、抗ｐ５６ｌｃｋモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法で検出した結果を示す図である。成人Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴおよび骨髄腫細胞株であるＡＲＨ−７７において高い発現が認められた。正常細胞であるＰＢＭＣおよびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球化Ｔ細胞においても発現が認められた。（実施例２）
【図１−Ｂ】一連の細胞株におけるｌｃｋ遺伝子の２つの異なったプロモーター転写物の発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより検出した結果を示す図である。成人Ｔ細胞白血病細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴおよびＰＥＥＲ並びに骨髄性白血病細胞株ＭＬ−２では、Ｉ型およびＩＩ型の両方のプロモーター転写物が認められた。バーキットリンパ腫細胞株ＲＡＪＩ、Ｂ細胞白血病細胞株ＢＡＬＬ−１、リンパ腫細胞株ＢＨＬ−８９および多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６ではＩ型のプロモーター転写物のみが認められた。一方、正常細胞であるＰＢＭＣではＩＩ型のプロモーター転写物のみが検出された。ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）の発現は、ＲＴ−ＰＣＲのコントロールとして測定した。（実施例２）
【図２−Ａ】成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）患者（表２における患者＃８）由来ＰＢＭＣが、ペプチドＬｃｋ４８６（配列番号３）を用いたインビトロ刺激後、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＡＴＬ細胞株ＰＥＥＲに対して細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞株および正常細胞であるＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図（右パネル）である。一方、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ペプチド（配列番号１１）で刺激したＰＢＭＣは細胞傷害活性を示さなかった（左パネル）。（実施例３）
【図２−Ｂ】慢性リンパ球性白血病患者（表２における患者＃２）由来ＰＢＭＣが、ペプチドＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）を用いたインビトロ刺激後、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＡＴＬ細胞株ＲＥＨに対して細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞株および正常細胞であるＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図（右パネル）である。一方、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（配列番号１２）で刺激したＰＢＭＣは細胞傷害活性を示さなかった（左パネル）。（実施例３）
【図２−Ｃ】非ホジキンリンパ腫患者（表２における患者＃４）由来ＰＢＭＣが、ペプチドＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）を用いたインビトロ刺激後、ＨＬＡ−Ａ２４＋ＡＴＬ細胞株ＲＥＨに対して細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−腫瘍細胞株および正常細胞であるＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対して細胞傷害活性を示さなかったことを説明する図（右パネル）である。一方、ＥＢＶ由来ペプチド（配列番号１２）で刺激したＰＢＭＣは細胞傷害活性を示さなかった（左パネル）。（実施例３）
【図３−Ａ】多発性骨髄腫患者（表２における患者＃６）由来ＰＢＭＣにおいて、Ｌｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）またはＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）とインキュベーションすることにより誘導される、対応する各ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対する細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）がペプチドワクチン接種の回数に従って増強されたことを説明する図である。（実施例４）
【図３−Ｂ】多発性骨髄腫患者（表２における患者＃６）由来ＰＢＭＣにおいて、ＨＬＡ−Ａ２４＋多発性骨髄腫細胞株ＫＨＭ−１１およびＭＩＫ−１に対する細胞傷害活性（図中、％ｌｙｓｉｓで表示）がペプチドワクチン接種の回数に従って増強されたことを説明する図である。一方、ペプチドワクチン接種によっても、ＨＬＡ−Ａ２４−多発性骨髄腫細胞株ＲＰＭＩ−８２２６に対する細胞傷害活性は認められなかった。（実施例４）
【図４−Ａ】慢性リンパ球性白血病患者（表２における患者＃１）由来ＰＢＭＣにおいて、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）またはＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対する反応におけるインターフェロン（ＩＦＮ）−γ産生促進がペプチドワクチン接種の回数に従って増強されたことを説明する図である。（実施例５）
【図４−Ｂ】慢性リンパ球性白血病患者（表２における患者＃１）由来ＰＢＭＣが、ワクチン接種後に、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）またはＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対してＨＩＶ由来ペプチドをパルスした細胞に対するよりも高い細胞傷害活性を示したことを説明する図である。（実施例５）
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００３−２８７２０８号からの優先権を請求するものである。
【００２７】
本発明の一態様は、被検体における造血器腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答を誘発することを機能的特徴とする造血器腫瘍の予防および／または治療剤に関する。
【００２８】
造血器腫瘍とは、骨髄やリンパ組織等の造血器官に発生する腫瘍をいう。造血器腫瘍には、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫等の悪性腫瘍が含まれる。
【００２９】
ここで被検体には、造血器腫瘍患者、造血器腫瘍患者から採取した血液、および造血器腫瘍患者の血液から調製した白血球画分等が含まれる。
【００３０】
抗腫瘍免疫応答とは、腫瘍に対して惹起される免疫応答を意味し、主に細胞傷害性Ｔ細胞が関与する。すなわち、本発明においては、被検体において造血器腫瘍に対する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することを機能的特徴とする造血器腫瘍の予防および／または治療剤を提供する。
【００３１】
造血器腫瘍の予防および／または治療剤とは、例えば、造血器腫瘍の発生または再発を予防する作用を有する医薬、造血器腫瘍の進行・増悪を抑制する作用を有する医薬、および血中白血球数の減少等造血器腫瘍の病態を改善するまたは治癒させる効果を示す医薬を意味する。
【００３２】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤はその一態様において、有効成分として配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上をその有効量含有してなる。より好ましくは、配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤である。配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上に、さらに配列番号３、６、７および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤であることもできる。さらに好ましくは、配列番号１、２および４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤である。また、配列番号２、４および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤であり得る。さらに、配列番号５および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を有効成分としてその有効量含有してなる造血器腫瘍の予防および／または治療剤であり得る。
【００３３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、いずれも上皮癌関連抗原に由来するペプチド（以下、上皮癌関連抗原ペプチドと称する）である。配列番号１、２および３に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、ｐ５６ｌｃｋ蛋白質由来のペプチドであり、以下、それぞれＬｃｋ２０８、Ｌｃｋ４８８およびＬｃｋ４８６と称することがある（非特許文献１２）。配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＡＲＴ−１由来のペプチドであり、以下、ＳＡＲＴ−１６９０と称することがある（非特許文献３）。配列番号５、６および７に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＡＲＴ−２由来のペプチドであり、以下、それぞれＳＡＲＴ−２９３、ＳＡＲＴ−２１６１およびＳＡＲＴ−２８９９と称することがある（非特許文献５）。配列番号８および９に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドは、ＳＡＲＴ−３由来のペプチドであり、以下、それぞれＳＡＲＴ−３１０９およびＳＡＲＴ−３３１５と称することがある（非特許文献４）。配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、ＡＲＴ−１由来のペプチドであり、以下、ＡＲＴ−１１７０と称することがある（非特許文献６）。ここで、各ペプチドは、各ペプチドが由来した蛋白質の呼称と該蛋白質のアミノ酸配列における該ペプチドのＮ末アミノ酸残基の位置を示す数字で表される。例えば、Ｌｃｋ２０８は、Ｌｃｋ蛋白質由来のペプチドであり、該ペプチドのＮ末アミノ酸残基は該蛋白質のアミノ酸配列において第２０８番目のアミノ酸残基であることを意味する。
【００３４】
本発明においては、造血器腫瘍患者に上記ペプチドをワクチン接種することにより、該患者において造血器腫瘍細胞を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導することができ、さらに腫瘍細胞の減少を伴う臨床効果を得ることができることを見出した。上記ペプチドについては、上皮癌患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導することが既に報告されている（非特許文献３〜６および１２）。しかしながら、これらペプチドが造血器腫瘍患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することは報告されていない。
【００３５】
ペプチドをワクチン接種するとは、ワクチン接種される対象において、ペプチドに対する特異的免疫応答の誘導および／または増強を目的として、ペプチドを投与することを意味する。
【００３６】
「ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞をＨＬＡ−Ａ２４拘束性に誘導する」とは、「細胞表面上に発現された主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）分子によって提示されたあるペプチドを認識するが、同様に提示されたそれ以外のペプチドはほとんどあるいは全く認識しない細胞傷害性Ｔ細胞」を、「ＨＬＡクラスＩ表現型がＡ２４であるＨＬＡクラスＩ分子によるペプチドの提示により誘導する」ことを意味する。
【００３７】
ワクチン接種は、具体的には、多発性骨髄腫患者例（実施例４参照）において、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）およびＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）の各ペプチドそれぞれをアジュバントと混合して調製した３種のワクチンを組合せ使用して６回行った。ついでＬｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）の各ペプチドそれぞれをアジュバントと混合して調製した３種のワクチンを組合せ使用してワクチン接種を続行した。ワクチン接種はペプチドを組合せ使用して行ったが、ワクチン接種回数に従って各ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が患者由来ＰＢＭＣにおいて増加した（図３−Ａ参照）。
【００３８】
別の臨床試験例である慢性リンパ球性白血病患者例（実施例６参照）においては、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）の各ペプチドそれぞれをアジュバントと混合して調製した２種のワクチンを接種した。本臨床例においても、ワクチン接種回数に従って各ペプチドに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が患者由来ＰＢＭＣにおいて増加した（図４−Ａおよび図４−Ｂ参照）。
【００３９】
ペプチドを組合せ使用してワクチン接種したときにおいても各ペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞が増加したことから、各ペプチドを単独でワクチン接種しても同様にペプチド特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導でき、さらには臨床効果を得ることができると考える。
【００４０】
ワクチン接種においてペプチドとともにワクチンに含有させたアジュバントは、ペプチドによる抗腫瘍免疫応答の誘発をさらに増強することを目的として用いた。抗腫瘍免疫応答を誘発する有効成分はペプチドであり、ペプチドのみの使用によってもインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞傷害性Ｔ細胞を誘導できたことから、ペプチドのみを含む医薬も造血器腫瘍の予防および／または治療剤として有効である。アジュバントをともに含有させることによりさらに高い抗腫瘍効果が得られるため、アジュバントの使用がより好ましい。
【００４１】
ワクチン接種に用いた配列番号１、２、４、５、８および１０に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドはいずれも、ワクチン接種前の様々な種類の造血器腫瘍患者由来のＰＢＭＣから、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。これらペプチドの他、Ｌｃｋ４８６（配列番号３）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）、ＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）およびＳＡＲＴ−３３１５（配列番号９）が、造血器腫瘍患者由来のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。このことから、配列番号３、６、７および９に記載の各アミノ酸配列を有するペプチドも造血器腫瘍に対する予防および／または治療剤の有効成分として使用できると考えた。
【００４２】
このように、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドは単独であるいは２種以上を組合せて本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤の有効成分として使用できる。
【００４３】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、その使用の一態様において癌ワクチンとして用いることができる。ここでいう癌ワクチンとは、腫瘍細胞に対する特異的免疫応答の誘導および／または増強により、癌患者の体内の細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させて腫瘍細胞を選択的に傷害する薬物を意味する。
【００４４】
上記ペプチドを例えば癌ワクチンとして用いる場合、選択した数種のペプチドを全て含有する癌ワクチンをワクチン接種に用いることの他、各ペプチドを単独で含有する癌ワクチンを複数種類用いてワクチン接種を実施することが可能である。
【００４５】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、抗腫瘍免疫応答を増強可能な補助剤を含むことができる。かかる補助剤として例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の増殖に有効なインターロイキン２等が挙げられる。また、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤を癌ワクチンとして用いるときは、補助剤として例えばアジュバントや担体等を含むことにより高い抗腫瘍効果が得られる。アジュバントは１種または２種以上を組合せて用いることができる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、ミョウバン、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）等の細菌製剤、ツベルクリン等の細菌成分製剤、キーホールリンペットヘモシアニンや酵母マンナン等の天然高分子物質、ムラミルトリペプチドまたはムラミルジペプチドまたはそれらの誘導体、アラム（ａｌｕｍ）、非イオン性ブロックコポリマー等を挙げることができる。本実施例においてはモンタニドＩＳＡ−５１（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）を用いた。使用できるアジュバントはこれら具体例に限定されることは無く、抗腫瘍免疫応答を増強可能な物質である限りにおいていずれを用いてもよい。アジュバントを用いるか否かは、例えばワクチン接種局所の炎症性反応の強さ、あるいはワクチン接種による抗腫瘍効果や被検体由来の末梢血単核細胞の細胞傷害活性の強さを指標にして判断できる。担体は、それ自体が人体に対して有害な作用を及ぼさず且つ抗原性を増強せしめるものであれば特に限定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等が例示される。
【００４６】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤のより具体的な例として、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上とアジュバントとを含む造血器腫瘍の予防および／または治療剤を挙げることができる。
【００４７】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、上記ペプチドの他、造血器腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答を誘発し得る他の抗腫瘍ペプチドをその有効量含むことも可能である。添加する他の抗腫瘍ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであることができ、ＨＬＡ−Ａ２４以外の表現型のＨＬＡクラスＩ拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得るものであってもよい。好ましくは、本予防および／または治療剤を適用する患者のＰＢＭＣからペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得る抗腫瘍ペプチドが好ましい。ペプチドによるＰＢＭＣからの特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は、ＰＢＭＣとペプチドとを適当な期間培養した後、対応するペプチドをパルスしたＨＬＡクラスＩ分子を細胞表面に有する細胞と反応させて、産生されるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）量を測定することにより評価できる（実施例３参照）。例えば、ＩＦＮ−γ産生量が、ペプチド非存在下で培養したＰＢＭＣと比較して多ければ、細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたと判断できる。
【００４８】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤を適用し得る造血器腫瘍は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の造血器腫瘍が好ましく、さらにその有効成分であるペプチドを含む蛋白質、例えばｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３およびＡＲＴ−１のうちの１種以上の発現が認められる造血器腫瘍がより好ましい。「ＨＬＡ−Ａ２４陽性（ＨＬＡ−Ａ２４＋と称することもある）」とは、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に発現していることを意味する。腫瘍は何らかの原因で異常増殖性を獲得した自己細胞である。そのため、ほとんどの場合、ＨＬＡクラスＩ表現型がＨＬＡ−Ａ２４であるヒトにおいては、正常細胞および腫瘍細胞の区別なく、細胞表面上にＨＬＡ−Ａ２４分子が発現している。ＨＬＡクラスＩ表現型の決定は、造血器腫瘍患者から採取した末梢血単核細胞または造血器腫瘍の一部等を用いて、自体公知の方法に従って行うことができる（非特許文献５）。あるいは簡便には、造血器腫瘍患者から採取した血液を用いて、慣用の血清学的方法により判定することも可能である（非特許文献１４）。造血器腫瘍における各種蛋白質の発現の検出は、造血器腫瘍患者から採取した一部の造血器腫瘍について、例えば検出目的の蛋白質に対する抗体を用いたウエスタンブロット法により、あるいは目的の蛋白質をコードする遺伝子のプロモーター転写物の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による検出等により実施可能である。
【００４９】
造血器腫瘍の具体例としては、成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＴＬと略称することもある）；Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｔ−ＡＬＬと略称することもある）；Ｔ細胞リンパ腫（Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；骨髄性白血病（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ ｌｅｕｋｅｍｉａ）；多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭと略称することもある）；骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＤＳと略称することもある）；急性単球性白血病（ａｃｕｔｅ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）；Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、Ｂ−ＡＬＬと略称することもある）；Ｂ細胞リンパ腫（Ｂ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ ｌｙｍｐｈｏｍａ）；慢性リンパ球性白血病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＣＬＬと略称することもある）；マントル細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＭＣＬと略称することもある）；および非ホジキンリンパ腫（ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ、ＮＨＬと略称することもある）等が例示できるが、これら具体例に制限されることはない。好ましくは、ＭＭ、ＭＤＳ、ＡＴＬ、Ｔ−ＡＬＬまたはＣＬＬに、より好ましくはＭＭまたはＣＬＬに、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤が適用される。
【００５０】
ペプチドの製造は、一般的なアミノ酸の化学合成法により実施できる。化学合成法には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法が包含される。または市販のアミノ酸合成装置を用いて製造可能である。あるいは遺伝子工学的手法により取得することもできる。例えば目的とするペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換えＤＮＡ（発現ベクター）を作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするペプチドを回収することにより製造可能である。
【００５１】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、有効成分であるペプチドの他に、アジュバント等の補助剤を含んでなるものであることができ、さらに１種または２種以上の医薬担体を含有することもできる。利用できる医薬担体としては、製剤の使用形態に応じて通常使用される、安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、無痛化剤、希釈剤あるいは賦形剤等を例示でき、これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択使用される。
【００５２】
製剤形態は投与形態に応じて選択することができる。代表的な製剤形態としては、溶液剤、乳剤、リポソーム製剤、脂肪乳剤、シクロデキストリン等の包接体、けん濁剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤丸剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、細粒剤、シロップ剤等の作製も可能であるが、これらに限定されない。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤、経鼻剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、吸入剤、点眼剤、点耳剤等に分類され、それぞれに適した通常の方法に従い、調合、成形ないし調製することができる。また、溶液製剤として使用できる他に、凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することも可能である。
【００５３】
注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。
【００５４】
リポソーム製剤は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロロホルム等）に溶解した溶液に、有効成分および／または補助剤や医薬担体等を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理および遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより調製できる。
【００５５】
脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油、オリーブ油等の植物油、ＭＣＴ等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳化・均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンや糖類（例えばブドウ糖、ソルビトール、果糖等）が例示される。
【００５６】
シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。このとき、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、β、γ型）を適宜選択すればよい。
【００５７】
懸濁剤は、水、シュークロース、ソルビトール、フラクトース等の糖類、ポリエチレングリコール等のグリコール類、油類を使用して製造できる。
【００５８】
その他の剤形についても、通常用いられる方法により調製可能である。
【００５９】
製剤中に含有される有効成分の量およびその用量範囲は、特に限定されないが、ペプチドの有効性、投与形態、疾病の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断により適宜選択することが望ましい。一般的には、適当な用量範囲は、例えば１用量当り約０．０１μｇ〜１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ〜１０ｍｇ程度、さらに好ましくは１μｇ〜１ｍｇ程度とするのが望ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれら用量の変更を行うことができる。
【００６０】
投与形態は、局所投与または全身投与のいずれも選択することができる。いずれにおいても、疾患、症状等に応じた適当な投与形態を選択する。全身投与は例えば、経口、静脈内、動脈内等への投与により実施できる。局所投与は例えば、皮下、皮内、筋肉内等に投与することができる。
【００６１】
その他、患者の末梢血より単核細胞画分を採取して、本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤とともに培養した後に、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導および／または活性化が認められた該単核細胞画分を患者の血液中に戻すことによっても、有効な抗腫瘍効果が得られる。培養するときの単核細胞濃度、造血器腫瘍の予防および／または治療剤の濃度、培養期間等の培養条件は、簡単な繰り返し実験により決定できる。培養時に、インターロイキン−２等のリンパ球増殖能を有する物質を添加してもよい。
【００６２】
ワクチン接種を行う場合、皮内、皮下および筋肉内等に注射により局所投与することが好ましい。投与は上記用量を１日１回〜数回に分けて行うことができる。ワクチン接種は単回のみ行ってもよいが、同一局所あるいは別の局所に投与を繰り返し行うことが好ましい。例えば、週に１回の割合、あるいは１ヶ月〜数ヶ月に１回の割合での間欠的な投与が可能である。より具体的には、２週に１回の割合で１年以上の長期に亘って投与することができる。癌ワクチンがアジュバントを含まないものである場合、癌ワクチンのみを投与してもよいが、アジュバントを同一局所に投与することが可能である。癌ワクチンがアジュバントを含むものであれば、そのまま局所投与に用いることができる。ワクチン接種のプロトコルは、被検体の症状に応じてワクチン接種の効果を確認しつつ適切な投与量と投与期間を勘案して、個々に適したプロトコルを実施し得る。
【００６３】
本発明の別の一態様は、治療に有効な用量の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの１つまたは２つ以上を投与することを特徴とする、造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法である。投与するペプチドは、より好ましくは、配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドである。これら各ペプチドは、アジュバントとともに投与することがさらに好ましい。またこれらペプチドは、その２つ以上を組合せてアジュバントとともに投与することもできる。本発明に係る造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法を適用し得る造血器腫瘍は、ＨＬＡ−Ａ２４陽性の造血器腫瘍が好ましく、さらに該方法において投与するペプチドを含む蛋白質、例えばｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３およびＡＲＴ−１のうちの１種以上の発現が認められる造血器腫瘍がより好ましい。
【００６４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
実施例に記載した全ての実験は、試料提供者である患者のインフォームドコンセントを得て行なった。ペプチドワクチン療法の臨床検討は、久留米大学倫理委員会の承認を受けた臨床プロトコール（プロトコール番号：２０３１）に従い、患者のインフォームドコンセントを得て実施した。
【実施例１】
【００６５】
（ワクチン接種に用いたペプチドの調製１）
臨床検討に用いたペプチドは、ｐ５６ｌｃｋ蛋白質由来のペプチドであるＬｃｋ２０８（配列番号１）およびＬｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１由来のペプチドであるＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、並びにＡＲＴ−１由来のペプチドであるＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）である。これらペプチドは、マルチプルペプチドシステム（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍ）社のグッドマニュファクチャリングプラックティス（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）の条件に基づいて調製した。
【００６６】
アジュバントは、モンタニド ＩＳＡ−５１（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１）アジュバント（セピック社製）を用いた。
【００６７】
各ペプチドについて、その３ｍｇを滅菌生理食塩水とともにＭｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ−５１に１：１容量で添加し、ボルテックスミキサーで撹拌し、乳剤を調製した。かくして、Ｌｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）またはＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）を含む４種類の乳剤を得た。
【実施例２】
【００６８】
（造血器腫瘍における上皮癌関連抗原発現の測定）
上皮癌関連抗原であるｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２およびＳＡＲＴ−３の発現を、一連の造血器腫瘍細胞株について検討した。検討には次の細胞株を用いた：Ｂ細胞急性リンパ球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）細胞株であるＲＥＨ、ＨＡＬＬ１、ＮＡＬＭ６、ＮＡＬＭ１６、ＫＯＰＮ−Ｋ、ＢＡＬＭ１−２およびＢＡＬＬ−１；Ｔ細胞急性リンパ球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）細胞株であるＫＯＰＴ、ＲＰＭＩ−８４０２、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、ＭＯＬＴ−４、ＣＣＲＦ−ＨＳＢ−２およびＰＥＥＲ；急性骨髄性白血病細胞株であるＭＬ１、ＭＬ２、ＭＬ３およびＫＧ１；急性単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１およびＵ−９３７；バーキットリンパ腫細胞株であるＲＡＪＩおよびＮＡＭＡＬＷＡ；慢性骨髄性白血病細胞株であるＮＡＬＭ１およびＫ５６２；多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株であるＡＲＨ−７７、Ｕ−２６６、ＫＨＭ−１１、ＭＩＫ−１およびＲＰＭＩ−８２２６；それぞれＢ細胞リンパ腫細胞株、Ｔ細胞リンパ腫細胞株および赤白血病細胞株であるＢＨＬ−８９、ＨｕＴ−１０２およびＨＥＬ；並びに成人Ｔ細胞白血病（ＡＴＬ）細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴ。これら細胞株は全て、１０％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）中で維持培養した。
【００６９】
各細胞株におけるｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１およびＳＡＲＴ−２の発現を、抗ｐ５６ｌｃｋ蛋白質モノクローナル抗体（Ｌｃｋ３Ａ５、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ社製）、抗ＳＡＲＴ−１ポリクローナル抗体および抗ＳＡＲＴ−２ポリクローナル抗体を用いてウエスタンブロット法により検出した。さらに、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いてフローサイトメトリーによりｐ５６ｌｃｋ蛋白質およびＳＡＲＴ−３の発現を分析した。細胞内染色は、細胞を４％パラホルムアルデヒドと０．１％サポニンで前処理し、ついで抗ｐ５６ｌｃｋ蛋白質モノクローナル抗体および抗ＳＡＲＴ−３モノクローナル抗体を添加することにより行った。二次抗体として、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社製）を用いた。
【００７０】
ｌｃｋ遺伝子プロモーターには異なった２つの型が知られており、腫瘍細胞および正常末梢血単核細胞においてはそれぞれＩ型およびＩＩ型が主に使用されている（非特許文献１２）。そこで、ｌｃｋ遺伝子の２つのプロモーターの検出を、特異的プライマー対を用いてＲＴ−ＰＣＲにより常法に従って行った（非特許文献１２）。試料として用いた総ＲＮＡは、細胞からＲＮＡ−Ｂｅｅ（ＴＥＬ−ＴＥＳＴ社製）を用いて抽出した。ｃＤＮＡはスーパースクリプトファーストストランドシンセシスシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて調製した。ＰＣＲはタックＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用いてＤＮＡサイクラー（ｉＣｙｃｌｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）中で３０サイクル（９４℃で１分間、６０℃で２分間および７２℃で１分間）実施した。
【００７１】
ＡＲＴ−１遺伝子のｍＲＮＡ発現の検出は、常法に従ってノザンブロット分析により行った（非特許文献６）。コントロールプローブとしてヒトβアクチンｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いた。
【００７２】
ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の発現は、ウェスタンブロット法による分析において、ＨＰＢ−ＭＬＴ白血病細胞株およびＡＲＨ−７７骨髄腫細胞株、並びにＰＢＭＣおよびＰＨＡ芽球化Ｔ細胞（ＰＨＡ−ｂｌａｓｔｏｉｄ Ｔ ｃｅｌｌ）で認められた（図１−Ａ）。また、ｌｃｋ遺伝子プロモーターの分析により、ＨＰＢ−ＭＬＴ、ＰＥＥＲおよびＭＬ−２は両方のプロモーターを用いており、一方ＢＡＬＬ−１、ＢＨＬ−８９およびＲＡＪＩはＩ型プロモーターのみを使用していることが判明した（図１−Ｂ）。検討に用いた造血器腫瘍細胞株のほとんどがｐ５６ｌｃｋｍＲＮＡを発現していることが明らかになった。
【００７３】
ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２およびＳＡＲＴ−３はいずれも試験した全ての造血器腫瘍細胞株において発現していたが、ＰＢＭＣでは発現が認められなかった。
【００７４】
ＡＲＴ−１は試験した全ての造血器腫瘍細胞株およびＰＢＭＣで発現しており、ほとんどの細胞株でＰＢＭＣより高い発現が認められた。
【００７５】
これら蛋白質の造血器腫瘍株における発現検討結果を表１に示した。表中、ＮＴとは検討を行わなかったことを示す。
【００７６】
【表１】
【実施例３】
【００７７】
（上皮癌関連抗原ペプチドによる造血器腫瘍患者ＰＢＭＣからの細胞傷害性Ｔ細胞誘導）
造血器腫瘍患者ＰＢＭＣからのペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞の誘導を、既報に従って行った（非特許文献５）。
【００７８】
細胞傷害性Ｔ細胞の誘導には次のペプチドを用いた：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質由来ペプチドであるＬｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＬｃｋ４８６（配列番号３）；ＳＡＲＴ−１由来ペプチドであるＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）；ＳＡＲＴ−２由来ペプチドであるＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）およびＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）；ＳＡＲＴ−３由来ペプチドであるＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）およびＳＡＲＴ−３３１５（配列番号９）；並びにＡＲＴ−１由来ペプチドであるＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）。これらはいずれも上皮癌関連抗原由来ペプチドであり、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を上皮癌患者のＰＢＭＣから誘導する能力を有する（非特許文献３〜６および１２）。ＨＬＡ−Ａ２４結合モチーフを有する陰性コントロールペプチドおよび陽性コントロールペプチドとして、それぞれヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来ペプチド（配列番号１１）およびエプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（配列番号１２）を用いた。ペプチド（純度９５％以上）は全てサワディーラボラトリーから購入し、それぞれジメチルスルホキシドに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解して使用した。
【００７９】
ＰＢＭＣは、造血器腫瘍患者から採取した末梢血より、フィコールコンレイ密度勾配遠心法を用いて調製した。ＰＢＭＣ上のＨＬＡ−Ａ２４分子発現の測定は、フローサイトメトリーを用いて公知方法に従って行った（非特許文献５）。
【００８０】
ＰＢＭＣからの細胞傷害性Ｔ細胞の誘導は、以下の様に実施した。まず、ＰＢＭＣ（細胞数１×１０５／ｗｅｌｌ）を各ペプチド１０μＭとともに９６ウエルＵ底型マイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ社製）において２００μｌの培養培地中でインキュベーションした。培養培地の組成は、４５％ＲＰＭＩ−１６４０、４５％ＡＩＭ−Ｖ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、１０％ＦＣＳ、１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン２（ＩＬ−２）、および０．１ｍＭ ＭＥＭノンエッセンシャルアミノアシッドソリューション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）からなる。培養３日目、６日目および９日目に、培地の半量を除去し、対応するペプチド（２０μｇ／ｍｌ）を含む新鮮培地と交換した。培養１２日目に細胞を回収し、対応するペプチドまたは陰性コントロールであるＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）を前もってパルスしたＨＬＡ−Ａ２４発現Ｃ１Ｒ細胞（Ｃ１Ｒ−Ａ２４と呼称する）に対する反応におけるＩＦＮ−γの産生能を試験した。ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）に対する反応において産生されたＩＦＮ−γをバックグランドとして、データの値から減算した。対応するペプチドに対する反応においてペプチドで刺激されたＰＢＭＣにより産生されたＩＦＮ−γの平均値が、ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）に対する反応において産生されたものより高い場合、ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞前駆体がＰＢＭＣに存在し、ペプチドによりペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたと判定した。
【００８１】
細胞傷害性Ｔ細胞誘導の検討は、ＨＬＡ−Ａ２４＋造血器腫瘍患者１０例（ＣＬＬ２例、ＭＣＬ１例、ＮＨＬ１例、Ｂ−ＡＬＬ１例、ＭＭ１例、ＭＤＳ１例、ＡＴＬ２例、およびＴ−ＡＬＬ１例）のＰＢＭＣについて、ｐ５６ｌｃｋ蛋白質、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−２、ＳＡＲＴ−３およびＡＲＴ−１由来のペプチドを用いて行った。用いたペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４＋上皮癌患者のＰＢＭＣからペプチド特異的腫瘍反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導したペプチドであり、現在、上皮癌患者に対するワクチンとして臨床試験を行っている。該ペプチドでインビトロにてＰＢＭＣを刺激し、ペプチド特異的ＩＦＮ−γ産生を測定した結果を表２に示した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
Ｌｃｋ２０８（配列番号１）、Ｌｃｋ４８６（配列番号３）およびＬｃｋ４８８（配列番号２）により刺激したＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生の促進が、それぞれ１０例中２例、３例および４例で認められた。Ｌｃｋ２０８（配列番号１）は、ＡＴＬ１例およびＴ−ＡＬＬ１例のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を促進した。Ｌｃｋ４８６（配列番号３）はＡＴＬ２例およびＴ−ＡＬＬ１例のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を促進した。Ｌｃｋ４８８（配列番号２）はＭＭ１例、ＭＤＳ１例、およびＡＴＬ２例のＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生を促進した。一方、陽性コントロールであるＥＢＶ由来ペプチド（配列番号１２）による刺激では１０例中６例でＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生の促進が認められたが、陰性コントロールであるＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）では全ての例でＩＦＮ−γ産生が認められなかった。
【００８４】
上記試験においてペプチドとのインキュベーションにより該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４に対するＩＦＮ−γ産生を促進したＰＢＭＣについて、さらにＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）のみの存在下で２週間培養した後に、造血器腫瘍細胞株に対する細胞傷害活性を標準的な５１Ｃｒ遊離試験（非特許文献５）により検討した。具体的には、得られたＰＢＭＣをエフェクターとして用い、５１Ｃｒ標識した標的細胞（以下、ターゲットと称する）と、エフェクター／ターゲット比３、１０または３０で混合して６時間インキュベーションした後に、上清中に遊離された５１Ｃｒの放射活性を測定した。得られた結果は、ターゲットを完全に溶解したときの放射活性を１００％として算出した％溶解（％ｌｙｓｉｓ）で表した。ターゲットとして、ＨＬＡ−Ａ２４＋造血器腫瘍細胞株であるＰＥＥＲ、ＨＬＡ−Ａ２４−造血器腫瘍細胞株であるＨＰＢ−ＭＬＴおよびＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞を用いた。
【００８５】
代表的な結果を図２−Ａ、図２−Ｂおよび図２−Ｃに示す。Ｌｃｋ４８６（配列番号３）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）またはＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）で刺激し、さらにＩＬ−２存在下で培養したＰＢＭＣ（それぞれ表２における患者＃８、患者＃２、患者＃４）はいずれも、ＨＬＡ−Ａ２４＋造血器腫瘍株に対して有意に細胞傷害活性を示したが、ＨＬＡ−Ａ２４−造血器腫瘍株またはＨＬＡ−Ａ２４＋ＰＨＡ芽球化Ｔ細胞に対しては細胞傷害活性を示さなかった（それぞれ図２−Ａ、図２−Ｂ、図２−Ｃ）。かかる細胞傷害活性は、ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）またはＥＢＶ由来ペプチド（配列番号１２）で培養したＰＢＭＣには認められなかった。
【００８６】
Ｌｃｋ４８６（配列番号３）、ＳＡＲＴ−２１６１（配列番号６）およびＳＡＲＴ−２８９９（配列番号７）は造血器腫瘍患者のＰＢＭＣからＨＬＡ−Ａ２４拘束性に腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得ることが明らかになった。
【実施例４】
【００８７】
（造血器腫瘍患者における癌ワクチン接種の検討１）
臨床試験を実施した患者（表２における患者＃６）は、７４歳のＨＬＡ−Ａ２４＋男性患者であり、デュリーアンドサーモン分類法（Ｄｕｒｉｅ＆Ｓａｌｍｏｎ’ｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりステージＩＩＩに分類されたＩｇＡタイプ多発性骨髄腫を罹患していた。該患者は、本臨床試験参加以前に一連の化学療法を多回数受け、化学療法耐性を獲得していた。しかし、ペプチドワクチン接種以前の４週間は、化学療法、またはステロイドや他の如何なる免疫抑制剤の投与も受けていない。
【００８８】
患者骨髄由来ＣＤ３８＋多発性骨髄腫細胞（ＭＭ細胞）上にＨＬＡ−Ａ２４分子が発現していることは、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した。さらに、これらＣＤ３８＋ＭＭ細胞がＬｃｋ蛋白質を発現していることは、抗Ｌｃｋ抗体を用いて同様に確認した。
【００８９】
ワクチン接種に用いたペプチドは、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）およびＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）である。これらペプチドはワクチン接種前の該患者由来のＰＢＭＣにおいてインビトロで細胞傷害性Ｔ細胞を誘導した。したがって、該患者のＰＢＭＣには、これらペプチドに対して反応し得るペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞前駆体が存在していると考えた。
【００９０】
これら各ペプチドとアジュバントとを含む３種類の乳剤を実施例１記載の方法に従って調製し、患者の大腿側面のそれぞれ別の部位に皮下注射することによりワクチン接種を行った。ワクチン接種は、患者がペプチドに対する即時型過敏反応を示さないことを皮膚試験により確認した後に実施した。皮膚試験は、生理食塩水中５０μｇの各ペプチドを皮内注射することにより行い、注射２０分後または２４時間後に即時型過敏反応または遅延型過敏反応をそれぞれ観察した。
【００９１】
ワクチン接種は、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）を用いて、２週間隔で７回行った。６回目のワクチン接種後に得たＰＢＭＣの細胞障害活性を実施例３記載のインビトロ試験に従って測定した。その結果、該ＰＢＭＣにおいて、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）およびＬｃｋ２０８（配列番号１）それぞれに対するペプチド特異的細胞傷害活性が認められた。そこで、８回目以降のワクチン接種には、ＳＡＲＴ−１６９０（配列番号４）、Ｌｃｋ４８８（配列番号２）またはＬｃｋ２０８（配列番号１）とアジュバントとを含む３種の乳剤を実施例１記載の方法に従って調製し使用した。
【００９２】
ワクチン接種後、患者由来のＰＢＭＣの、用いたペプチド特異的な細胞傷害活性を、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞を用いて５１Ｃｒ遊離試験により測定した。その結果、ワクチン接種回数に従ってペプチド特異的な細胞傷害活性が増強されたことが明らかになった（図３−Ａ）。３回目、６回目および９回目のワクチン接種の後にＰＢＭＣを採取し、骨髄腫細胞株に対する細胞傷害活性を試験したところ、該ＰＢＭＣはＨＬＡ−Ａ２４＋骨髄細胞株ＫＨＭ−１１およびＭＩＫ−１に対して有意なレベルの細胞傷害活性を示した（図３−Ｂ）。一方、ＨＬＡ−Ａ２４−骨髄細胞株ＲＰＭＩ−８２２６に対する細胞傷害活性は非常に低かった。これら細胞傷害活性は抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ８抗体（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ａ１１．１、ＩｇＧ３）により有意に阻害されたが、抗ＣＤ１４抗体（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）によっては阻害されなかった。
【００９３】
ペプチドのワクチン接種により多発性骨髄腫患者の血液中において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性腫瘍特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたことが明らかになった。
【００９４】
臨床反応については、骨髄検査により形質細胞が４６％減少したことが判明し（ワクチン接種前４６．６×１０４／μｌから６回目のワクチン接種後２１．５×１０４／μｌに減少した）、安定状態（ｓｔａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）は９ヶ月以上継続した。
【００９５】
ワクチン接種の副作用は、投与部位において局所的反応が認められたのみ（グレードＩＩ）であり、これに対する治療の必要がない程度であった。ワクチン接種に用いたペプチドに対する遅延型過敏反応は全く観察されなかった。また、本例においては、自己免疫反応を示す症状は認められなかった。
【００９６】
これらから、上記ペプチドのワクチン接種が、造血器腫瘍の治療に有効であり、副作用も極めて少ないことが明らかになった。
【実施例５】
【００９７】
（ワクチン接種に用いたペプチドの調製２）
ＳＡＲＴ−２由来のペプチドであるＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３由来のペプチドであるＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）について、実施例１と同様のアジュバントを用いて同様の方法で２種類の乳剤を調製した。
【実施例６】
【００９８】
（造血器腫瘍患者における癌ワクチン接種の検討２）
臨床試験を実施した患者（表２における患者＃１）は、６３歳のＨＬＡ−Ａ２４＋女性患者であり、バーネット分類法（Ｂｅｒｎｅｔ’ｓ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によりステージＡに分類された慢性リンパ球性白血病を罹患していた。該患者は、本臨床試験開始時に、白血球数増加および血小板数減少の進行が認められた。
【００９９】
患者ＰＢＭＣ由来ＣＤ１９＋慢性リンパ球性白血病細胞（ＣＬＬ細胞）上にＨＬＡ−Ａ２４分子が発現していることは、抗ＨＬＡ−Ａ２４モノクローナル抗体を用いてフローサイトメトリーにより確認した。
【０１００】
ワクチン接種前の該患者由来のＰＢＭＣにおいてインビトロで細胞傷害性Ｔ細胞を誘導したペプチドであるＡＲＴ−１１７０（配列番号１０）は、ワクチン接種前に行った皮膚試験（実施例４参照）において即時型過敏反応を惹起した。そのため、ワクチン接種には、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）を用いた。これらぺプチドに対して反応するイムノグロブリンＧ抗体がワクチン前の血清中に有意に高いレベルで検出されたことから、該患者においてワクチン接種前にこれらペプチドに対する液性免疫が惹起されていることが判明した。上皮癌患者におけるペプチドワクチンの臨床試験において、患者の生存率とワクチンに用いたペプチドに対する液性免疫応答の亢進との間に相関が認められている。このことから、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）およびＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）が本患者に有効に作用すると考えた。
【０１０１】
これらペプチドを用いて実施例５で調製した２種類の乳剤を患者の大腿側面のそれぞれ別の部位に皮下注射することによりワクチン接種を行った。
【０１０２】
ワクチン接種後に毎回、患者由来のＰＢＭＣについて、用いたペプチド特異的な細胞傷害Ｔ細胞の誘導を、該ペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対するＩＦＮ−γの産生量を指標にして測定した（実施例３参照）。その結果、ワクチン接種回数に従ってＩＦＮ−γ産生量が増加した（図４−Ａ）。ＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ産生は、抗ＣＤ８抗体（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）または抗ＨＬＡ−Ａ２４抗体（Ａ１１．１、ＩｇＧ３）により有意に阻害されたが、抗ＣＤ１４抗体（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）によっては阻害されなかった。
【０１０３】
これら結果から、ワクチン接種により、ペプチド反応性細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたことが明らかになった。さらに、これらペプチド反応性細胞傷害性Ｔ細胞は、ＳＡＲＴ−２９３（配列番号５）またはＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）をパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に対して、ＨＩＶ由来ペプチド（配列番号１１）をパルスした細胞に対するよりも高い細胞傷害活性を示すことが５１Ｃｒ遊離試験により判明した（図４−Ｂ）。
【０１０４】
ペプチドのワクチン接種により慢性リンパ球性白血病患者の血液中において、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性のペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞が誘導されたことが明らかになった。
【０１０５】
臨床反応については、ワクチン接種前２０×１０３／μｌであった血中リンパ球数が、６回目のワクチン接種後に一時的ではあるが１２．８×１０３／μｌに著しく減少した。血小板数は、ワクチン接種前には１０×１０４／μｌと低かったが、６回目のワクチン接種後には増加し、１７回のワクチン接種期間を通して正常範囲内に保たれていた。
【０１０６】
ワクチン接種の副作用は、投与部位において局所的反応が認められたが治療不要であった（グレードＩ）。また、３回目のワクチン接種後にＳＡＲＴ−３１０９（配列番号８）に対する免疫反応の指標の１つである遅延型過敏反応が観察された。副作用は極めて少なかった。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明に係る造血器腫瘍の予防および／または治療剤は、造血器腫瘍の特異的免疫療法に用いることができ、医薬分野における利用可能性が非常に高く有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１０８】
配列番号１：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号２：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号３：ｐ５６ｌｃｋ蛋白質の部分ペプチド。
配列番号４：ＳＡＲＴ−１の部分ペプチド。
配列番号５：ＳＡＲＴ−２の部分ペプチド。
配列番号６：ＳＡＲＴ−２の部分ペプチド。
配列番号７：ＳＡＲＴ−２の部分ペプチド。
配列番号８：ＳＡＲＴ−３の部分ペプチド。
配列番号９：ＳＡＲＴ−３の部分ペプチド。
配列番号１０：ＡＲＴ−１の部分ペプチド。
配列番号１１：ヒト免疫不全ウイルス由来ペプチド。
配列番号１２：エプスタインバーウイルス由来ペプチド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項３】
配列表の配列番号３、６、７および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分としてさらに含有する請求項２に記載の造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項４】
配列表の配列番号１、２および４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項５】
配列表の配列番号２、４および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項６】
配列表の配列番号５および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む請求項１から６のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項８】
造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍である請求項１から７のいずれか１項に記載の予防および／または治療剤。
【請求項９】
造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有し且つ予防および／または治療剤の有効成分であるペプチドを含む蛋白質を発現している造血器腫瘍である請求項１から７のいずれか１項に記載の予防および／または治療剤。
【請求項１０】
造血器腫瘍用癌ワクチンとして用いることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項１１】
配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つとアジュバントとを含有する、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防および／または治療に用いる医薬。
【請求項１２】
治療に有効な用量の配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つをアジュバントとともに投与することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法。
【請求項１】
配列表の配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項２】
配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項３】
配列表の配列番号３、６、７および９からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分としてさらに含有する請求項２に記載の造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項４】
配列表の配列番号１、２および４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項５】
配列表の配列番号２、４および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項６】
配列表の配列番号５および８からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つを有効成分として含有する造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項７】
アジュバントをさらに含む請求項１から６のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項８】
造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍である請求項１から７のいずれか１項に記載の予防および／または治療剤。
【請求項９】
造血器腫瘍がＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有し且つ予防および／または治療剤の有効成分であるペプチドを含む蛋白質を発現している造血器腫瘍である請求項１から７のいずれか１項に記載の予防および／または治療剤。
【請求項１０】
造血器腫瘍用癌ワクチンとして用いることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の造血器腫瘍の予防および／または治療剤。
【請求項１１】
配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つとアジュバントとを含有する、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防および／または治療に用いる医薬。
【請求項１２】
治療に有効な用量の配列表の配列番号１、２、４、５、８および１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するペプチドの少なくとも１つをアジュバントとともに投与することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ２４分子を細胞表面上に有する造血器腫瘍の予防方法および／または治療方法。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図１−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１１７２３
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【発行日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２５７４（Ｐ２００５−５１２５７４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１２３２
【国際出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（３０４０５８２４０）株式会社グリーンペプタイド (10)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月１０日（２００５．２．１０）
【発行日】平成１９年１０月４日（２００７．１０．４）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１２３２
【国際出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（３０４０５８２４０）株式会社グリーンペプタイド (10)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]