連続培養装置および化学品の製造方法
【課題】長時間にわたり安定して高生産性を維持する培養法による化学品を製造するためのコンパクトな連続培養装置を提供する。
【解決手段】本発明は、微生物もしくは培養細胞を培養するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段とを具備し、前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有するものであることを特徴とする連続培養装置で構成されている。
【解決手段】本発明は、微生物もしくは培養細胞を培養するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段とを具備し、前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有するものであることを特徴とする連続培養装置で構成されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物または培養細胞の培養に用いられる培養装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、培養によって生産された物質を含む液を微生物または培養細胞の培養液から分離膜を通して効率よく濾過・回収する、高い生産性で化学品等を製造することが可能な連続培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法では、大きく（１）回分培養法（Ｂａｔｃｈ培養法）および流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh培養法）と、（２）連続培養法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）の回分培養法と流加培養法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点があり、従来より、微生物や培養細胞を用いた物質生産方法として用いられてきた。しかしながら、これらの方法は時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのためこれらの培養法は、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続培養法は、培養反応槽内で生産物が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。
【０００５】
例えば、Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照）やＬ−リジン（非特許文献１参照）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、培養液へ栄養素等原料の連続的な供給を行うものの、微生物や培養細胞を含んだ培養液を抜き出すために培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００６】
このことから、連続培養法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることにより、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００７】
例えば、分離膜を用いた連続培養装置により、連続培養する技術が提案されている（特許文献２参照）。本提案では、微生物や培養細胞を培養するための槽と培養液から目的生産物と微生物や培養細胞の膜分離を行うための槽を有した連続培養装置をもちいることで様々な化学品を回分培養法と流加培養法と比較して高い生産速度で生産している。しかしながらこの例では、培養する槽に対し膜分離を行う槽の容積が大きいことから、培養槽と膜分離槽間の培養液循環に必要な動力費が高い上に、連続培養装置全体としての化学品の生産速度が低い。また、培養槽で化学品の生産に適した培養条件に調節するが、膜分離槽の容積が大きいと膜分離槽内での培養液の滞留時間が長くなり、膜分離槽では培養条件の調節ができないことから化学品に適した培養条件から逸脱して更に生産性の低下が懸念される。このように、従来の連続培養装置では運転動力の浪費、低生産速度、ならびに装置運転管理の煩雑さ等の不具合を内包しており、依然として連続培養技術の向上が望まれていた。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】国際公開第０７／０９７２６０号パンフレット
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラオ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、運転動力の浪費、低生産速度、ならびに装置運転管理の煩雑さ等の不具合を解決できるコンパクトな連続培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、分離膜を利用した連続培養装置において、装置規模の縮小を目的として鋭意研究した結果、以下の（１）〜（３）のいずれかの構成により、装置のコンパクト化が実現するすると同時に化学品の生産効率が向上ことを見いだし、本発明を完成した。
（１）微生物もしくは培養細胞を培養するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段とを具備し、前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有するものであることを特徴とする連続培養装置。
（２）前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記培養液容積比が１５以上１００以下となる容積を有するものである、前記（１）記載の連続培養装置。
（３）培養反応槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、連続的に培養液を前記培養反応槽から膜分離槽へ供給して分離膜で濾過し生産物を回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流するにあたり、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比を５以上１００以下とすることを特徴とする化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の連続培養装置によれば、連続培養装置規模のコンパクト化が実現されるとともに、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の生産物の高生産性を維持する連続培養が実現し、生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが可能となる
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の連続培養装置は、連続培養によって化学品等を製造するための装置であって、基本構造として、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の培養液に保持または還流する手段を有する。具体的には、微生物もしくは培養細胞を培養させるための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段を具備する。そして、本発明において、膜分離槽および培養反応槽は、膜分離槽における培養液に対する培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有する。該培養液容積比を５以上１００以下とすることで装置のコンパクト化が実現するとともに、培養液の培養反応槽滞留時間を長くなり適切な培養条件への調節が実現し、動力費の低減、化学品の生産速度の向上、ならびに容易な装置運転管理が可能となる。
【００１２】
以下、本発明の連続培養装置の基本構成と特徴について具体的に図示して説明する。図１に、本発明の一実施形態を示す連続培養装置の概略側面図を示す。図１に示す連続培養装置は、微生物もしくは培養細胞の連続培養を行う培養反応槽１と、該培養反応槽１に培養液循環手段（配管および培養液循環ポンプ５）を介して接続され内部に培養液を濾過するための分離膜３を備えた膜分離槽１２で構成される。
【００１３】
培養反応槽１は微生物もしくは培養細胞を連続的に培養できる機能を有し、培養液循環手段を接続できればよく、従来、化学品の生産に用いられてきたジャーファーメンターを用いることができる。膜分離槽１２は、内部に分離膜３を設置することができ、培養反応槽１同様、培養液循環手段を接続できれば、その形状等は問わない。また、本発明で用いる分離膜の素材としては、無機、有機の素材を問わず用いることが可能であるが、好ましい分離膜について後に詳述する。
【００１４】
そして、本発明において、かかる培養反応槽１と膜分離槽１２とは、膜分離槽における培養液に対する培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有する。なお、本発明においてかかる培養液容積比とは、培養運転時に膜分離槽ならびに培養反応槽に満たされるそれぞれの培養液量の比として定義し、各々の槽中の培養液で満たされないヘッドスペース等の容積は考慮に入れない。
【００１５】
また、図１に示す装置において、培養反応槽１は、培地供給ポンプ８に接続されるとともに、攪拌機２を備えており、培地供給ポンプ８によって培地を培養反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機２で培養反応槽１内の培養液を攪拌することができるように構成されている。さらに、気体供給装置１１も接続されており、必要に応じて、当該気体供給装置１１によって必要とする気体が供給される。このとき、供給した気体を回収・リサイクルして再び気体供給装置１１によって供給することができるように、例えば、培養反応槽１のヘッドスペースと気体供給装置１１の間に配管を接続し、ヘッドスペース、配管、気体供給装置１１の順で供給気体を流すことで回収・リサイクルすることも好ましい。
【００１６】
また、培養反応槽１には、必要に応じて、培養液のｐＨを調整することができるように、ｐＨセンサ・制御装置１０およびｐＨ調整溶液供給ポンプ９が設けられている。さらに、必要に応じて、培養液の温度を調節して生産性の高い化学品の生産を行うことができるように、温度調節器７も設けられている。ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装・制御装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００１７】
そして、図１に示す装置においては、分離膜３における濾過速度および培養反応槽内の培養液量を調節するために、レベルセンサ６が培養反応槽１に設けられているとともに、水頭差圧制御装置４も設けられている。
【００１８】
以上のような構成の連続培養装置において、培養は例えば次のように行われる。すなわち、培養反応槽１において微生物もしくは培養細胞を培養し、連続的に培養液を培養反応槽１から膜分離槽１２へ供給して分離膜３で濾過し乳酸等の生産物を回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を膜分離槽１２よりも上流側の培養液へ還流するにあたり、膜分離槽１２における培養液に対する培養反応槽における培養液の培養液容積比を５以上１００以下とする。
【００１９】
より具体的に説明すると、まず、微生物と培養原料（培地）を培養反応槽１に貯留し、適宜中和剤を添加することによってかかる培養反応槽１の内部をｐＨ４〜８の範囲内に維持するとともに温度２０〜５０℃の範囲に維持する。これによって、微生物の培養が行われ、その際にアルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など、所望する物質（化学品等の生産物）が生産される。
【００２０】
この間、連続的に培養が行われ所望する生産物が得られるように、培養に使用される栄養素を含む培地を、培地供給ポンプ８を介して培養反応槽１に連続的または間欠的に供給する。また、培養反応槽１内の培養液を、培養液循環ポンプ５によって、連続的に培養反応槽１と膜分離槽１２との間を循環させ、膜分離槽１２において、生産物を含む培養液を、分離膜によって微生物と生産物を含む濾液とに濾過・分離する。その結果、生産物を含む濾液は装置系から取り出され、一方濾過・分離された微生物および培養細胞は、培養反応槽１内に留まることから、微生物濃度を高く維持することができ、化学品の生産性が高い培養を可能としている。
【００２１】
培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、微生物または培養細胞の増殖が不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度を乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００２２】
培養液をかかる適切な濃度に維持するためには、必要に応じて培養反応槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことも好ましい。そして、培養反応槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合もあるが、引き抜いて適当な濃度に維持することにより、分離膜の閉塞を回避することもできる。また、培養反応槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあるが、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００２３】
また、本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物または培養細胞の濃度を高くした後に連続培養を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。
【００２４】
そして、培養原料の供給および培養液の引き抜きは、適当な時期から行えばよい。すなわち、培養原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、培養原料の供給と培養液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。分離膜による培養液の濾過・分離は、膜分離槽１２の培養液液面と濾液との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力は必要ないが、必要に応じて、ポンプによる吸引濾過あるいは気体・液体等で装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。すなわち、膜間差圧を制御するための手段として、培養液と濾液の液位差を制御する水頭差圧制御装置４や、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプを用いることができ、また、気体または液体の圧力によって膜間差圧を制御することができる。これらの手段を適宜併用することにより、長期間安定して培養することが可能となる。
【００２５】
また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置４によって、分離膜３の濾過速度および培養反応槽内の培養液量を適当に調節することも好ましい。培養反応槽内の培養液量の調節には、培養反応槽内の培養液液位ではなく培養液重量を測定し調節することも可能である。
【００２６】
ここで、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過する際の膜間差圧、濾過速度について説明する。膜間差圧と濾過速度は相関関係があり、濾過速度を高くすると膜間差圧も上昇する。すなわち連続培養運転中の膜間差圧を制御することで濾過速度も制御することが可能であるとともに、膜間差圧が重要な運転パラメータである。連続培養運転に於いては、高い膜間差圧、濾過速度条件で運転すれば、目的とする化学品の生産速度向上が可能となる一方で、分離膜の細孔への微生物もしくは培養細胞および培地成分の目詰まりが発生しやすくなり、連続培養運転に不具合が生じる。従って、膜間差圧は、濾過速度が微生物もしくは培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であることが好ましい。具体的には、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが好ましく、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲である。上記膜間差圧の範囲を外れた場合、微生物もしくは培養細胞および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過液量の低下を招き、連続培養運転に不具合を生じることがある。
【００２７】
なお、本発明において、培養液とは、培養原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、培養原料とは、培養する微生物または培養細胞の生育を促し、目的とする生産物である化学品等を良好に生産させ得るものをいう。培養原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の培養原料組成から適宜変更しても良い。
【００２８】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、工業的によく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。これらの微生物や培養細胞のうち、目的とする化学品の生産能力が高いものを選択して用いることが好ましい。なお、本発明においては微生物の培養を「発酵」または「発酵培養」と称することがある。
【００２９】
培養原料としては、前述の目的を達成し得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。
【００３１】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種培養菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００３２】
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００３３】
また、培養液は、糖類濃度が５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。その理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物または培養細胞の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜５０℃の範囲で行われることが多い。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００３４】
そして、連続培養操作は、通常、培養管理上単一の培養反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、微生物、培養細胞を培養して生産物を生成する連続培養法であれば、培養反応槽の数は問わない。培養反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の培養反応槽を用いることも好ましい。この場合、複数の培養反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても生産物の高生産性は得られる。
【００３５】
また本発明では、予め別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養反応槽に供給し、連続培養することも好ましい。すなわち、別途用意された培養能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養反応槽に供給することにより、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【００３６】
次に、本発明で用いることができる分離膜について説明する。
【００３７】
分離膜としては、被処理液の性状や用途に応じた分離性能と透過性能を有する多孔性膜であることが好ましい。多孔性膜としては、セラミクスなどの無機材料、樹脂などの有機材料を素材とした多孔性膜を用いることが可能であるが、好ましくは多孔質樹脂層を含む多孔性の分離膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００３８】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００３９】
多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００４０】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００４１】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を説明する。まず、前記の多孔質基材の表面に、前記の樹脂と溶媒を含む製膜原液の被膜を形成するとともに、その製膜原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。製膜原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の温度の範囲内で選定することが好ましい。
【００４２】
ここで、製膜原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、多孔性樹脂層の細孔の平均細孔径の大きさの制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００４３】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯが好ましく用いられる。
【００４４】
さらに、製膜原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００４５】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、多孔質樹脂層の平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００４６】
上述のように、本発明で用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００４７】
また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、そのうち多孔質樹脂層の膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００４８】
分離膜は平均細孔径が０．０１μｍ以上２μｍ以下の範囲内にあると、微生物触媒がリークしにくい高い排除率と、高い透過性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透過性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。微生物として細菌類を用いた場合、分離膜の平均細孔径は、好ましくは０.４μｍ以下であり、０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径は、小さすぎると透過液量が低下することがあるので、本発明では、０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００４９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００５０】
本発明で用いることができる分離膜は、細孔径の標準偏差σが小さいほど、すなわち細孔径の大きさの分布が狭い方が良い。細孔径の大きさの分布を狭くし、標準偏差を０．１μｍ以下とすることが好ましい。細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が、均一な特性の透過液を得ることができるとともに、装置の運転管理が容易になる。
【００５１】
細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００５２】
【数１】
【００５３】
本発明で用いられる分離膜においては、化学品を含む反応液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、１×１０−10ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過液量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上２×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００５４】
本発明で用いられる分離膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。分離膜の膜表面粗さが好ましくは０.１μｍ以下のときに、分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で化学品等の製造が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより、安定した化学品等の製造が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００５５】
また、分離膜の膜表面粗さを低くすることにより、微生物触媒の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物の破壊が抑制され、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００５６】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製：測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００５７】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００５８】
【数２】
【００５９】
上述のような分離膜は、膜分離槽の形状に合わせて形状を適宜加工して用いることができる。例えば、平膜形態の分離膜を別に用意された支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持板の少なくとも片面に（膜面積を大きくすることが困難であったり透過性を高めるためには支持板の両面に）、分離膜を配したこの分離膜エレメントは、本発明における分離膜の好適な使用形態の一つであり、このような分離膜エレメントが膜分離槽に設置される。以下、図面を用いてその概略を説明する。
【００６０】
図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図２に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と分離膜１５とをこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた生産物を含む透過液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集液パイプ１７を経て連続培養装置外部に取り出される。ここで、水頭差圧をはじめとして、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を、透過液を取り出すための動力として用いることができる。
また、分離膜が中空糸膜の場合、図３に示すような、別の形態の分離膜エレメントに加工される。図３は、分離膜エレメントの概略斜視図であって、主に支持板１３と、中空糸形態の分離膜１５と、上部樹脂封止層１８および下部樹脂封止層１９とによって構成される。分離膜１５は、上部樹脂封止層１８および下部樹脂封止層１９よって束状にかつ支持板１３に接着・固定化されている。下部樹脂封止層１９による接着・固定化は、中空糸形態の分離膜１５の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１８は、中空糸形態分離膜１５の中空部を封止しておらず、中空部と集液パイプ１７とが連通している。この分離膜エレメントは、支持板１３を介して連続培養装置内に設置することが可能である。分離膜１５によって濾過された透過液は、中空糸膜の中空部を通り、集液パイプ１７を介して連続培養装置外部に取り出される。透過液を取り出すための動力としては、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００６１】
分離膜を備えた膜分離槽１２は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましく、このようにすることにより雑菌からの汚染回避を可能となる。本発明の高圧蒸気滅菌とは、蒸気によって膜分離槽を加熱・加圧することによって槽内に存在する微生物もしくは培養細胞を滅菌させることである。加熱・加圧条件としては例えば１２１．１℃、蒸気圧１気圧の条件で２０分以上加圧・加温することが好ましい。従って、本発明の連続培養装置の膜分離槽１２、および該膜分離槽１２に配設される分離膜、エレメント構成部材には、かかる条件での高圧蒸気滅菌操作に耐性のある部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む培養反応槽内を滅菌可能とすることができる。培養反応槽内が滅菌可能であれば、連続培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき、安定した連続培養が可能となる。
【００６２】
分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持板等の部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である例えば１２１．１℃、蒸気圧１気圧の条件で２０分以上という条件に耐性であれば、分離膜ならびにエレメント構成部材の種類は特に限定されない。かかる耐性を有する分離膜の素材としては上述の多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持板等のエレメント構成部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。
【００６３】
本発明の連続培養装置で製造される化学品は、上記の微生物や培養細胞が培養液中に生産する物質であれば特に制限はないが、例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など工業的に大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロールなどが挙げられる。また有機酸としては、例えば、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸が挙げられ、核酸としては、イノシンやグアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチドが挙げられる。また、化学品のその他の例としては、カダベリンなどのジアミン化合物、抗生物質、酵素、組換えタンパク質が挙げられる。本発明の連続培養装置を用いることにより、上記化学品の高い生産性を得ることができる。
【００６４】
ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
【００６５】
【数３】
【００６６】
また、バッチ培養での化学品の生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明の連続培養装置を、実施例を挙げて詳細に説明する。具体的には、化学品としてＬ−乳酸、微生物もしくは培養細胞にＬ―乳酸生産能力を持つ酵母（参考例１）、分離膜に多孔性膜（参考例２：平膜、参考例３：中空糸膜）を選定し、図１に示す連続培養装置を用い、連続培養装置の膜分離槽に対する培養反応槽の培養液容積比を５から１００の範囲で変化させた連続的な化学品の製造について、実施例を挙げて説明する。
【００６８】
（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株（ＳＷ−１株）の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００６９】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを、続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００７０】
上記の操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【００７１】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片と１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で、出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００７２】
得られた形質転換細胞が、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のようにして行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることにより確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することにより確認した。
【００７３】
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【００７４】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００７５】
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度：３０℃。
【００７６】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【００７７】
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００７８】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を、酵母ＳＷ−１株として、実施例に用いた。
【００７９】
（参考例２）多孔性平膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
【００８０】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔質性膜を得た。
【００８１】
・水：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。
【００８２】
この多孔質性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【００８３】
（参考例３）多孔性中空糸膜の作製
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【００８４】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる多孔性中空糸膜を製作した。得られた多孔性中空糸膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である多孔性中空糸膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透過液量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【００８５】
（実施例１）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その１）
酵母ＳＷ−１株、図１の概要図に示した連続培養装置、表１に示す組成の乳酸生産培地を用い、連続培養を行うことによるＬ−乳酸の製造を行った。実施例１では２Ｌ容の培養反応槽、１５０ｍｌ容の膜分離槽を用い、分離膜エレメントには参考例２で作製した多孔性平膜を装着した図２に示す分離膜エレメントを用いた。
【００８６】
なお、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、１００ｍＬ（培養液容積比１５）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．６Ｌとなるように連続培養を行った。乳酸生産培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。
【００８７】
また、実施例１における運転条件は、下記のとおりとした。
・培養反応槽容量：２（Ｌ）（運転時培養液量として１．５Ｌ）
・膜分離槽容量：１５０（ｍＬ）（運転時培養液量として１００ｍＬ）
・使用分離膜：平膜（参考例２参照）
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・培養反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸生産培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・培養液循ポンプによる循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過液量制御：膜間差圧による流量制御
（連続培養開始後〜１００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
より具体的には、まず、試験管中で５ｍｌの乳酸生産培地を用いＳＷ−１株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸生産培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した膜分離型連続培養装置の１．５Ｌの乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機２によって４００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行いながら、培養液循環ポンプ５を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、培養液循環ポンプ５を稼働させた。前培養時の運転条件に加え、培地の連続供給を行い、連続培養装置における全培養液量が２Ｌとなるように膜透過液量の制御を行いながら連続培養し、連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。
【００８８】
連続培養を行うときの膜透過液量の制御は、水頭差圧制御装置４により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過液量制御条件で変化させることで行った。連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過培養液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。なお、Ｌ−乳酸の濃度の評価には参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【００８９】
以上の条件で３００時間の連続培養を行った結果を表２に示す。その結果、図１の連続培養装置を用いることにより、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることを確認することができた。
【００９０】
【表１】
【００９１】
（実施例２）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様の連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。但し、実施例２では２Ｌ容の培養反応槽、４００ｍｌ容の膜分離槽を用い、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、３００ｍＬ（培養液容積比５）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．８Ｌとなるように連続培養を行った。実施例２においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることを確認することができた。
【００９２】
（実施例３）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様の連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。但し、実施例３では２Ｌ容の培養反応槽、１００ｍｌ容の膜分離槽を用い、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５０ｍＬ（培養液容積比３０）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．５５Ｌとなるように連続培養を行った。実施例３においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表２に示す。その結果、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることが確認できた。
【００９３】
（比較例１）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その１）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様の連続培養を行った。但し、比較例１では２Ｌ容の培養反応槽、５００ｍｌ容の膜分離槽を用い、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５００ｍＬ（培養液容積比３）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が２Ｌとなるように連続培養を行った。比較例１においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表２に示す。
【００９４】
（実施例４）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その４）
酵母ＳＷ−１株、図１の概要図に示した連続培養装置、表２に示す組成の酵母乳酸生産培地を用い、連続培養を行った。なお、実施例４では２Ｌ容の培養反応槽、１５０ｍｌ容の膜分離槽を用い、分離膜エレメントには参考例３で作製した多孔性中空糸膜を装着した図３に示す分離膜エレメントを用いた。
【００９５】
なお、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、１００ｍＬ（培養液容積比１５）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．６Ｌとなるように連続培養試験を行った。該酵母乳酸生産培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。
【００９６】
また、実施例４における運転条件は、下記のとおりとした。
・培養反応槽容量：２（Ｌ）（運転時培養液量として１．５Ｌ）
・膜分離槽容量：１５０（ｍＬ）（運転時培養液量として１００ｍＬ）
・使用分離膜：中空糸膜（参考例３参照）
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・培養反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸生産培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・培養液循環ポンプによる循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過液量制御：膜間差圧による流量制御
（連続培養開始後〜１００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
より具体的には、まず、試験管中で５ｍｌの乳酸生産培地を用いＳＷ−１株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸生産培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続培養装置の１．５Ｌの乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機２によって４００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行いながら、培養液循環ポンプ５を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、培養液循環ポンプ５を稼働させた。前培養時の運転条件に加え、乳酸生産培地の連続供給を行い、連続培養装置における全培養液量が２Ｌとなるように膜透過液量の制御を行いながら連続培養し、連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。
【００９７】
連続培養を行うときの膜透過液量の制御は、水頭差圧制御装置４により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過液量制御条件で変化させることで行った。連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過培養液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。なお、化学品であるＬ−乳酸の濃度の評価には参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【００９８】
以上の条件で３００時間の連続培養を行った結果を表３に示す。その結果、図１の連続培養装置を用いることにより、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることを確認することができた。
【００９９】
（実施例５）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その５）
分離膜として参考例３で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例４と同様の連続培養を行った。但し、実施例５では２Ｌ容の培養反応槽、１００ｍｌ容の膜分離槽を用い、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５０ｍＬ（培養液容積比３０）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．５５Ｌとなるように連続培養を行った。実施例５においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表３に示す。その結果、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることが確認できた。
【０１００】
（実施例６）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その６）
分離膜として参考例３で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例４と同様の連続培養を行った。但し、実施例６では２Ｌ容の培養反応槽、５０ｍｌ容の膜分離槽を用い、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、１５ｍＬ（培養液容積比１００）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．５１５Ｌとなるように連続培養を行った。実施例６においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表３に示す。その結果、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることが確認できた。
【０１０１】
（比較例２）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例３で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例４と同様の連続培養を行った。但し、比較例２では２Ｌ容の培養反応槽、５００ｍｌ容の膜分離槽を用い、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５００ｍＬ（培養液容積比３）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が２Ｌとなるように連続培養を行った。比較例２においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表３に示す。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
実施例１〜６ならびに比較例１、２の連続培養結果から、従来の連続培養装置と比較して膜分離槽に対する培養反応槽の培養液容積比を５〜１００の範囲にすることで、装置のコンパクト化を実現しつつも、培養液の培養反応槽滞留時間が長くなり適切な培養条件への調節が実現し、化学品の生産速度が向上することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【図４】図４は、実施例で用いた酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１ 培養反応槽
２ 攪拌機
３ 分離膜（エレメント）
４ 水頭差圧制御装置
５ 培養液循環ポンプ
６ レベルセンサ
７ 温度調節器
８ 培地供給ポンプ
９ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
１０ ｐＨセンサ・制御装置
１１ 気体供給装置
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集液パイプ
１８ 上部樹脂封止層
１９ 下部樹脂封止層
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物または培養細胞の培養に用いられる培養装置に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、培養を行いながら、培養によって生産された物質を含む液を微生物または培養細胞の培養液から分離膜を通して効率よく濾過・回収する、高い生産性で化学品等を製造することが可能な連続培養装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
微生物や培養細胞の培養を伴う物質生産方法では、大きく（１）回分培養法（Ｂａｔｃｈ培養法）および流加培養法（Ｆｅｄ−Ｂａｔｃh培養法）と、（２）連続培養法に分類することができる。
【０００３】
上記（１）の回分培養法と流加培養法は、設備的には簡素であり短時間で培養が終了し、雑菌汚染による被害が少ないという利点があり、従来より、微生物や培養細胞を用いた物質生産方法として用いられてきた。しかしながら、これらの方法は時間の経過とともに培養液中の生産物濃度が高くなり、浸透圧あるいは生産物阻害等の影響により生産性および収率が低下してくる。そのためこれらの培養法は、長時間にわたり安定して高収率かつ高生産性を維持することが困難である。
【０００４】
一方、上記（２）の連続培養法は、培養反応槽内で生産物が高濃度に蓄積することを回避することによって、長時間にわたって高収率かつ高生産性を維持できるという特徴がある。
【０００５】
例えば、Ｌ−グルタミン酸（特許文献１参照）やＬ−リジン（非特許文献１参照）の発酵について連続培養法が開示されている。しかしながら、これらの例では、培養液へ栄養素等原料の連続的な供給を行うものの、微生物や培養細胞を含んだ培養液を抜き出すために培養液中の微生物や培養細胞が希釈されることから、生産効率の向上は限定されたものであった。
【０００６】
このことから、連続培養法において、微生物や培養細胞を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収すると同時に濾過された微生物や培養細胞を培養液に保持または還流させることにより、培養液中の微生物や細胞濃度を高く維持する方法が提案されている。
【０００７】
例えば、分離膜を用いた連続培養装置により、連続培養する技術が提案されている（特許文献２参照）。本提案では、微生物や培養細胞を培養するための槽と培養液から目的生産物と微生物や培養細胞の膜分離を行うための槽を有した連続培養装置をもちいることで様々な化学品を回分培養法と流加培養法と比較して高い生産速度で生産している。しかしながらこの例では、培養する槽に対し膜分離を行う槽の容積が大きいことから、培養槽と膜分離槽間の培養液循環に必要な動力費が高い上に、連続培養装置全体としての化学品の生産速度が低い。また、培養槽で化学品の生産に適した培養条件に調節するが、膜分離槽の容積が大きいと膜分離槽内での培養液の滞留時間が長くなり、膜分離槽では培養条件の調節ができないことから化学品に適した培養条件から逸脱して更に生産性の低下が懸念される。このように、従来の連続培養装置では運転動力の浪費、低生産速度、ならびに装置運転管理の煩雑さ等の不具合を内包しており、依然として連続培養技術の向上が望まれていた。
【特許文献１】特開平１０−１５０９９６号公報
【特許文献２】国際公開第０７／０９７２６０号パンフレット
【非特許文献１】Toshihiko Hirao et. al.（ヒラオ・トシヒコ ら）、 Appl. Microbiol. Biotechnol.（アプライド マイクロバイアル アンド マイクロバイオロジー），３２，２６９−２７３（１９８９）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
そこで本発明の目的は、運転動力の浪費、低生産速度、ならびに装置運転管理の煩雑さ等の不具合を解決できるコンパクトな連続培養装置を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願発明者らは、分離膜を利用した連続培養装置において、装置規模の縮小を目的として鋭意研究した結果、以下の（１）〜（３）のいずれかの構成により、装置のコンパクト化が実現するすると同時に化学品の生産効率が向上ことを見いだし、本発明を完成した。
（１）微生物もしくは培養細胞を培養するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段とを具備し、前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有するものであることを特徴とする連続培養装置。
（２）前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記培養液容積比が１５以上１００以下となる容積を有するものである、前記（１）記載の連続培養装置。
（３）培養反応槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、連続的に培養液を前記培養反応槽から膜分離槽へ供給して分離膜で濾過し生産物を回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流するにあたり、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比を５以上１００以下とすることを特徴とする化学品の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の連続培養装置によれば、連続培養装置規模のコンパクト化が実現されるとともに、簡便な操作条件で、長時間にわたり安定して所望の生産物の高生産性を維持する連続培養が実現し、生産物である各種化学品を低コストで安定に生産することが可能となる
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の連続培養装置は、連続培養によって化学品等を製造するための装置であって、基本構造として、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過し、濾液から生産物を回収するとともに未濾過液を前記の培養液に保持または還流する手段を有する。具体的には、微生物もしくは培養細胞を培養させるための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段を具備する。そして、本発明において、膜分離槽および培養反応槽は、膜分離槽における培養液に対する培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有する。該培養液容積比を５以上１００以下とすることで装置のコンパクト化が実現するとともに、培養液の培養反応槽滞留時間を長くなり適切な培養条件への調節が実現し、動力費の低減、化学品の生産速度の向上、ならびに容易な装置運転管理が可能となる。
【００１２】
以下、本発明の連続培養装置の基本構成と特徴について具体的に図示して説明する。図１に、本発明の一実施形態を示す連続培養装置の概略側面図を示す。図１に示す連続培養装置は、微生物もしくは培養細胞の連続培養を行う培養反応槽１と、該培養反応槽１に培養液循環手段（配管および培養液循環ポンプ５）を介して接続され内部に培養液を濾過するための分離膜３を備えた膜分離槽１２で構成される。
【００１３】
培養反応槽１は微生物もしくは培養細胞を連続的に培養できる機能を有し、培養液循環手段を接続できればよく、従来、化学品の生産に用いられてきたジャーファーメンターを用いることができる。膜分離槽１２は、内部に分離膜３を設置することができ、培養反応槽１同様、培養液循環手段を接続できれば、その形状等は問わない。また、本発明で用いる分離膜の素材としては、無機、有機の素材を問わず用いることが可能であるが、好ましい分離膜について後に詳述する。
【００１４】
そして、本発明において、かかる培養反応槽１と膜分離槽１２とは、膜分離槽における培養液に対する培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有する。なお、本発明においてかかる培養液容積比とは、培養運転時に膜分離槽ならびに培養反応槽に満たされるそれぞれの培養液量の比として定義し、各々の槽中の培養液で満たされないヘッドスペース等の容積は考慮に入れない。
【００１５】
また、図１に示す装置において、培養反応槽１は、培地供給ポンプ８に接続されるとともに、攪拌機２を備えており、培地供給ポンプ８によって培地を培養反応槽１に投入し、必要に応じて、攪拌機２で培養反応槽１内の培養液を攪拌することができるように構成されている。さらに、気体供給装置１１も接続されており、必要に応じて、当該気体供給装置１１によって必要とする気体が供給される。このとき、供給した気体を回収・リサイクルして再び気体供給装置１１によって供給することができるように、例えば、培養反応槽１のヘッドスペースと気体供給装置１１の間に配管を接続し、ヘッドスペース、配管、気体供給装置１１の順で供給気体を流すことで回収・リサイクルすることも好ましい。
【００１６】
また、培養反応槽１には、必要に応じて、培養液のｐＨを調整することができるように、ｐＨセンサ・制御装置１０およびｐＨ調整溶液供給ポンプ９が設けられている。さらに、必要に応じて、培養液の温度を調節して生産性の高い化学品の生産を行うことができるように、温度調節器７も設けられている。ここでは、計装・制御装置による培養液の物理化学的条件の調節に、ｐＨおよび温度の調節を例示したが、必要に応じて、溶存酸素やＯＲＰの制御を行うことができ、更にはオンラインケミカルセンサーなどの分析装置により培養液中の微生物の濃度を測定し、それを指標とした物理化学的条件の制御を行うことができる。また、培地の連続的もしくは断続的投入の形態に関しては、特に限定されるものではないが、上記の計装・制御装置による培養液の物理化学的環境の測定値を指標として、培地投入量および速度を適宜調節することができる。
【００１７】
そして、図１に示す装置においては、分離膜３における濾過速度および培養反応槽内の培養液量を調節するために、レベルセンサ６が培養反応槽１に設けられているとともに、水頭差圧制御装置４も設けられている。
【００１８】
以上のような構成の連続培養装置において、培養は例えば次のように行われる。すなわち、培養反応槽１において微生物もしくは培養細胞を培養し、連続的に培養液を培養反応槽１から膜分離槽１２へ供給して分離膜３で濾過し乳酸等の生産物を回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を膜分離槽１２よりも上流側の培養液へ還流するにあたり、膜分離槽１２における培養液に対する培養反応槽における培養液の培養液容積比を５以上１００以下とする。
【００１９】
より具体的に説明すると、まず、微生物と培養原料（培地）を培養反応槽１に貯留し、適宜中和剤を添加することによってかかる培養反応槽１の内部をｐＨ４〜８の範囲内に維持するとともに温度２０〜５０℃の範囲に維持する。これによって、微生物の培養が行われ、その際にアルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など、所望する物質（化学品等の生産物）が生産される。
【００２０】
この間、連続的に培養が行われ所望する生産物が得られるように、培養に使用される栄養素を含む培地を、培地供給ポンプ８を介して培養反応槽１に連続的または間欠的に供給する。また、培養反応槽１内の培養液を、培養液循環ポンプ５によって、連続的に培養反応槽１と膜分離槽１２との間を循環させ、膜分離槽１２において、生産物を含む培養液を、分離膜によって微生物と生産物を含む濾液とに濾過・分離する。その結果、生産物を含む濾液は装置系から取り出され、一方濾過・分離された微生物および培養細胞は、培養反応槽１内に留まることから、微生物濃度を高く維持することができ、化学品の生産性が高い培養を可能としている。
【００２１】
培養液中の微生物または培養細胞の濃度は、微生物または培養細胞の増殖が不適切となって死滅する比率が高くならない範囲で、高い状態で維持することが効率よい生産性を得るのに好ましい。一例として、濃度を乾燥重量として５ｇ／Ｌ以上に維持することにより良好な生産効率が得られる。
【００２２】
培養液をかかる適切な濃度に維持するためには、必要に応じて培養反応槽内から微生物または培養細胞を引き抜くことも好ましい。そして、培養反応槽内の微生物または培養細胞濃度が高くなりすぎると、分離膜の閉塞が発生しやすくなる場合もあるが、引き抜いて適当な濃度に維持することにより、分離膜の閉塞を回避することもできる。また、培養反応槽内の微生物または培養細胞濃度によって化学品の生産性能が変化することがあるが、生産性能を指標として微生物または培養細胞を引き抜くことで生産性能を維持させることも可能である。
【００２３】
また、本発明では、培養初期にＢａｔｃｈ培養またはＦｅｄ−Ｂａｔｃｈ培養を行って微生物または培養細胞の濃度を高くした後に連続培養を開始しても良いし、高濃度の菌体をシードし、培養開始とともに連続培養を行っても良い。
【００２４】
そして、培養原料の供給および培養液の引き抜きは、適当な時期から行えばよい。すなわち、培養原料の供給と培養液の引き抜きの開始時期は必ずしも同じである必要はない。また、培養原料の供給と培養液の引き抜きは連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。分離膜による培養液の濾過・分離は、膜分離槽１２の培養液液面と濾液との水頭差圧によって行うことができ、特別な動力は必要ないが、必要に応じて、ポンプによる吸引濾過あるいは気体・液体等で装置系内を加圧することにより濾過・分離することもできる。すなわち、膜間差圧を制御するための手段として、培養液と濾液の液位差を制御する水頭差圧制御装置４や、加圧ポンプまたは／および吸引ポンプを用いることができ、また、気体または液体の圧力によって膜間差圧を制御することができる。これらの手段を適宜併用することにより、長期間安定して培養することが可能となる。
【００２５】
また、必要に応じて、レベルセンサ６および水頭差圧制御装置４によって、分離膜３の濾過速度および培養反応槽内の培養液量を適当に調節することも好ましい。培養反応槽内の培養液量の調節には、培養反応槽内の培養液液位ではなく培養液重量を測定し調節することも可能である。
【００２６】
ここで、微生物もしくは培養細胞の培養液を分離膜で濾過する際の膜間差圧、濾過速度について説明する。膜間差圧と濾過速度は相関関係があり、濾過速度を高くすると膜間差圧も上昇する。すなわち連続培養運転中の膜間差圧を制御することで濾過速度も制御することが可能であるとともに、膜間差圧が重要な運転パラメータである。連続培養運転に於いては、高い膜間差圧、濾過速度条件で運転すれば、目的とする化学品の生産速度向上が可能となる一方で、分離膜の細孔への微生物もしくは培養細胞および培地成分の目詰まりが発生しやすくなり、連続培養運転に不具合が生じる。従って、膜間差圧は、濾過速度が微生物もしくは培養細胞および培地成分が容易に目詰まりしない条件であることが好ましい。具体的には、膜間差圧を０.１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下の範囲にして濾過処理することが好ましく、さらに好ましくは０.１ｋＰａ以上１０ｋＰａ以下の範囲である。上記膜間差圧の範囲を外れた場合、微生物もしくは培養細胞および培地成分の目詰まりが急速に発生し、透過液量の低下を招き、連続培養運転に不具合を生じることがある。
【００２７】
なお、本発明において、培養液とは、培養原料に微生物または培養細胞が増殖した結果得られる液のことを言い、培養原料とは、培養する微生物または培養細胞の生育を促し、目的とする生産物である化学品等を良好に生産させ得るものをいう。培養原料の組成は、目的とする化学品の生産性が高くなるように、培養開始時の培養原料組成から適宜変更しても良い。
【００２８】
本発明で使用される微生物や培養細胞としては、例えば、工業的によく使用されるパン酵母などの酵母、大腸菌、コリネ型細菌などのバクテリア、糸状菌、放線菌、動物細胞および昆虫細胞などが挙げられる。使用する微生物や細胞は、自然環境から単離されたものでもよく、また、突然変異や遺伝子組換えによって一部性質が改変されたものであってもよい。これらの微生物や培養細胞のうち、目的とする化学品の生産能力が高いものを選択して用いることが好ましい。なお、本発明においては微生物の培養を「発酵」または「発酵培養」と称することがある。
【００２９】
培養原料としては、前述の目的を達成し得るものであればよいが、炭素源、窒素源、無機塩類、および必要に応じてアミノ酸、ビタミンなどの有機微量栄養素を適宜含有する通常の液体培地が好ましく用いられる。
【００３０】
炭素源としては、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラクトースおよびラクトース等の糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセス、更には酢酸等の有機酸、エタノールなどのアルコール類、およびグリセリンなども使用される。
【００３１】
窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種培養菌体およびその加水分解物などが使用される。
【００３２】
無機塩類としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加することができる。微生物が生育のために特定の栄養素を必要とする場合には、その栄養物を標品もしくはそれを含有する天然物として添加することができる。また、消泡剤も必要に応じて使用することができる。
【００３３】
また、培養液は、糖類濃度が５ｇ／ｌ以下に保持されることが好ましい。その理由は、培養液の引き抜きによる糖類の流失を最小限にするためである。微生物または培養細胞の培養は、通常ｐＨ４〜８、温度２０〜５０℃の範囲で行われることが多い。培養液のｐＨは、無機の酸あるいは有機の酸、アルカリ性物質、さらには尿素、炭酸カルシウムおよびアンモニアガスなどによって、上記範囲内のあらかじめ定められた値に調節することができる。酸素の供給速度を上げる必要があれば、空気に酸素を加えて酸素濃度を２１％以上に保つ、あるいは培養を加圧する、攪拌速度を上げる、通気量を上げるなどの手段を用いることができる。
【００３４】
そして、連続培養操作は、通常、培養管理上単一の培養反応槽で行うことが好ましい。しかしながら、微生物、培養細胞を培養して生産物を生成する連続培養法であれば、培養反応槽の数は問わない。培養反応槽の容量が小さい等の理由から、複数の培養反応槽を用いることも好ましい。この場合、複数の培養反応槽を配管で並列または直列に接続して連続培養を行っても生産物の高生産性は得られる。
【００３５】
また本発明では、予め別の培養槽で微生物もしくは培養細胞を培養し、培養されたフレッシュな微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養反応槽に供給し、連続培養することも好ましい。すなわち、別途用意された培養能力が高い状態の微生物もしくは培養細胞を含む培養液を培養反応槽に供給することにより、常に高い化学品の生産性能を維持させることができる。
【００３６】
次に、本発明で用いることができる分離膜について説明する。
【００３７】
分離膜としては、被処理液の性状や用途に応じた分離性能と透過性能を有する多孔性膜であることが好ましい。多孔性膜としては、セラミクスなどの無機材料、樹脂などの有機材料を素材とした多孔性膜を用いることが可能であるが、好ましくは多孔質樹脂層を含む多孔性の分離膜であることが好ましい。このような多孔性膜は、多孔質基材の表面に、分離機能層として作用とする多孔質樹脂層を有している。多孔質基材は、多孔質樹脂層を支持して分離膜に強度を与えるものである。
【００３８】
多孔質基材の材質は、有機材料および／または無機材料等からなり、中でも有機繊維が望ましく用いられる。好ましい多孔質基材は、セルロース繊維、セルローストリアセテート繊維、ポリエステル繊維、ポリプロピレン繊維およびポリエチレン繊維などの有機繊維を用いてなる織布や不織布等である。中でも、密度の制御が比較的容易であり製造も容易で安価な不織布が好ましく用いられる。
【００３９】
多孔質樹脂層は、上述したように分離機能層として作用するものであり、有機高分子膜を好適に使用することができる。有機高分子膜の材質としては、例えば、ポリエチレン系樹脂、ポリプロピレン系樹脂、ポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂、ポリオレフィン系樹脂、セルロース系樹脂およびセルローストリアセテート系樹脂等が挙げられる。有機高分子膜は、これらの樹脂を主成分とする樹脂の混合物からなるものであってもよい。ここで主成分とは、その成分が５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上含有することをいう。中でも、多孔質樹脂層を構成する膜素材としては、溶液による製膜が容易で物理的耐久性や耐薬品性にも優れているポリ塩化ビニル系樹脂、ポリフッ化ビニリデン系樹脂、ポリスルホン系樹脂、ポリエーテルスルホン系樹脂、ポリアクリロニトリル系樹脂またはポリオレフィン系樹脂が好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはポリオレフィン系樹脂がより好ましく、ポリフッ化ビニリデン系樹脂またはそれを主成分とする樹脂が最も好ましく用いられる。
【００４０】
ここで、ポリフッ化ビニリデン系樹脂としては、フッ化ビニリデンの単独重合体が好ましいが、フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体との共重合体も好ましく用いられる。フッ化ビニリデンと共重合可能なビニル系単量体としては、テトラフルオロエチレン、ヘキサフルオロプロピレンおよび三塩化フッ化エチレンなどが例示される。また、ポリオレフィン系樹脂としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、塩素化ポリエチレンまたは塩素化ポリプロピレンが挙げられるが、塩素化ポリエチレンが好ましく用いられる。
【００４１】
本発明で用いられる多孔性膜の作成法の概要を説明する。まず、前記の多孔質基材の表面に、前記の樹脂と溶媒を含む製膜原液の被膜を形成するとともに、その製膜原液を多孔質基材に含浸させる。その後、被膜を有する多孔質基材の被膜側表面のみを、非溶媒を含む凝固浴と接触させて樹脂を凝固させると共に多孔質基材の表面に多孔質樹脂層を形成する。製膜原液の温度は、製膜性の観点から、通常、１５〜１２０℃の温度の範囲内で選定することが好ましい。
【００４２】
ここで、製膜原液には、開孔剤を添加することもできる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤を添加することにより、多孔性樹脂層の細孔の平均細孔径の大きさの制御することができる。開孔剤は、凝固浴に浸漬された際に抽出されて、樹脂層を多孔質にする作用を持つものである。開孔剤は、凝固浴への溶解性の高いものであることが好ましい。開孔剤としては、例えば、塩化カルシウムや炭酸カルシウムなどの無機塩を用いることができる。また、開孔剤として、ポリエチレングリコールやポリプロピレングリコールなどのポリオキシアルキレン類や、ポリビニルアルコール、ポリビニルブチラールおよびポリアクリル酸などの水溶性高分子化合物や、グリセリンを用いることができる。
【００４３】
また、溶媒は、樹脂を溶解するものである。溶媒は、樹脂および開孔剤に作用してそれらが多孔質樹脂層を形成するのを促す。このような溶媒としては、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトンおよびメチルエチルケトンなどを用いることができる。中でも、樹脂の溶解性の高いＮＭＰ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦおよびＤＭＳＯが好ましく用いられる。
【００４４】
さらに、製膜原液には、非溶媒を添加することもできる。非溶媒は、樹脂を溶解しない液体である。非溶媒は、樹脂の凝固の速度を制御して細孔の大きさを制御するように作用する。非溶媒としては、水やメタノールおよびエタノールなどのアルコール類を用いることができる。中でも、価格の点から水やメタノールが好ましい。非溶媒は、これらの混合物であってもよい。
【００４５】
本発明で用いられる多孔性膜は、平膜であっても中空糸膜であっても良い。平膜の場合、多孔質樹脂層の平均厚みは用途に応じて選択されるが、好ましくは２０μｍ以上５０００μｍ以下であり、より好ましくは５０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００４６】
上述のように、本発明で用いられる多孔性膜は、多孔質基材と多孔質樹脂層とから形成されている多孔性膜であることが望ましい。その際、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していても、多孔質基材に多孔質樹脂層が浸透していなくてもどちらでも良く、用途に応じて選択される。多孔質基材の平均厚みは、好ましくは５０μｍ以上３０００μｍ以下の範囲で選択される。
【００４７】
また、多孔性膜が中空糸膜の場合、中空糸の内径は好ましくは２００μｍ以上５０００μｍ以下の範囲で選択され、そのうち多孔質樹脂層の膜厚は好ましくは２０μｍ以上２０００μｍ以下の範囲で選択される。また、有機繊維または無機繊維を筒状にした織物や編物を中空糸の内部に含んでいても良い。
【００４８】
分離膜は平均細孔径が０．０１μｍ以上２μｍ以下の範囲内にあると、微生物触媒がリークしにくい高い排除率と、高い透過性を両立させることができ、さらに目詰まりをしにくく、透過性を長時間保持することが、より高い精度と再現性を持って実施することができる。微生物として細菌類を用いた場合、分離膜の平均細孔径は、好ましくは０.４μｍ以下であり、０.２μｍ未満であればなお好適に実施することが可能である。平均細孔径は、小さすぎると透過液量が低下することがあるので、本発明では、０.０１μｍ以上であり、好ましくは０．０２μｍ以上であり、さらに好ましくは０．０４μｍ以上である。
【００４９】
ここで、平均細孔径は、倍率１０，０００倍の走査型電子顕微鏡観察における、９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔すべての直径を測定し、平均することにより求めることができる。
【００５０】
本発明で用いることができる分離膜は、細孔径の標準偏差σが小さいほど、すなわち細孔径の大きさの分布が狭い方が良い。細孔径の大きさの分布を狭くし、標準偏差を０．１μｍ以下とすることが好ましい。細孔径の標準偏差が小さい、すなわち細孔径の大きさが揃っている方が、均一な特性の透過液を得ることができるとともに、装置の運転管理が容易になる。
【００５１】
細孔径の標準偏差σは、上述の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内で観察できる細孔数をＮとして、測定した各々の直径をＸｋとし、細孔直径の平均をＸ（ａｖｅ）とした下記の（式１）により算出される。
【００５２】
【数１】
【００５３】
本発明で用いられる分離膜においては、化学品を含む反応液の透過性が重要点の一つであり、透過性の指標として、使用前の分離膜の純水透過係数を用いることができる。本発明において、分離膜の純水透過係数は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで透水量を測定し算出したとき、１×１０−10ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上であることが好ましい。純水透過係数が２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上６×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下であれば、実用的に十分な透過液量が得られる。より好ましい純水透過係数は、２×１０−９ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以上２×１０−７ｍ３／ｍ２／ｓ／ｐａ以下である。
【００５４】
本発明で用いられる分離膜の膜表面粗さは、分離膜の目詰まりに影響を与える因子である。分離膜の膜表面粗さが好ましくは０.１μｍ以下のときに、分離膜の剥離係数や膜抵抗を好適に低下させることができ、より低い膜間差圧で化学品等の製造が実施可能である。従って、目詰まりを抑えることにより、安定した化学品等の製造が可能になることから、表面粗さは小さければ小さいほど好ましい。
【００５５】
また、分離膜の膜表面粗さを低くすることにより、微生物触媒の濾過において、膜表面で発生する剪断力を低下させることが期待でき、微生物の破壊が抑制され、分離膜の目詰まりも抑制されることにより、長期間安定な濾過が可能になると考えられる。
【００５６】
ここで、膜表面粗さは、下記の原子間力顕微鏡装置（ＡＦＭ）を使用して、下記の装置と条件で測定することができる。
・装置：原子間力顕微鏡装置(Digital Instruments（株）製Nanoscope IIIa)
・条件：探針 SiNカンチレバー(Digital Instruments（株）製)
：走査モード コンタクトモード（気中測定）
水中タッピングモード（水中測定）
：走査範囲 １０μm、２５μm 四方（気中測定）
５μm、１０μm 四方（水中測定）
：走査解像度 ５１２×５１２
・試料調製：測定に際し膜サンプルは、常温でエタノールに１５分浸漬後、ＲＯ水中に２４時間浸漬し洗浄した後、風乾し用いた。ＲＯ水とは、ろ過膜の一種である逆浸透膜（ＲＯ膜）を用いてろ過し、イオンや塩類などの不純物を排除した水を指す。ＲＯ膜の孔の大きさは、概ね２ｎｍ以下である。
【００５７】
膜表面粗さｄｒｏｕｇｈは、上記ＡＦＭにより各ポイントのＺ軸方向の高さから、下記の（式２）により算出する。
【００５８】
【数２】
【００５９】
上述のような分離膜は、膜分離槽の形状に合わせて形状を適宜加工して用いることができる。例えば、平膜形態の分離膜を別に用意された支持体と組み合わせることによって分離膜エレメントとすることができる。支持板の少なくとも片面に（膜面積を大きくすることが困難であったり透過性を高めるためには支持板の両面に）、分離膜を配したこの分離膜エレメントは、本発明における分離膜の好適な使用形態の一つであり、このような分離膜エレメントが膜分離槽に設置される。以下、図面を用いてその概略を説明する。
【００６０】
図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。分離膜エレメントは、図２に示すように、剛性を有する支持板１３の両面に、流路材１４と分離膜１５とをこの順序で配し構成されている。支持板１３は、両面に凹部１６を有している。分離膜１５は培養液を濾過する。流路材１４は、分離膜１５で濾過された透過液を効率よく支持板１３に流すためのものである。支持板１３に流れた生産物を含む透過液は、支持板１３の凹部１６を通り、排出手段である集液パイプ１７を経て連続培養装置外部に取り出される。ここで、水頭差圧をはじめとして、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を、透過液を取り出すための動力として用いることができる。
また、分離膜が中空糸膜の場合、図３に示すような、別の形態の分離膜エレメントに加工される。図３は、分離膜エレメントの概略斜視図であって、主に支持板１３と、中空糸形態の分離膜１５と、上部樹脂封止層１８および下部樹脂封止層１９とによって構成される。分離膜１５は、上部樹脂封止層１８および下部樹脂封止層１９よって束状にかつ支持板１３に接着・固定化されている。下部樹脂封止層１９による接着・固定化は、中空糸形態の分離膜１５の中空部を封止しており、培養液の漏出を防ぐ構造になっている。一方、上部樹脂封止層１８は、中空糸形態分離膜１５の中空部を封止しておらず、中空部と集液パイプ１７とが連通している。この分離膜エレメントは、支持板１３を介して連続培養装置内に設置することが可能である。分離膜１５によって濾過された透過液は、中空糸膜の中空部を通り、集液パイプ１７を介して連続培養装置外部に取り出される。透過液を取り出すための動力としては、水頭差圧、ポンプ、液体や気体等による吸引濾過、あるいは装置系内を加圧するなどの方法を用いることができる。
【００６１】
分離膜を備えた膜分離槽１２は、高圧蒸気滅菌可能なことが望ましく、このようにすることにより雑菌からの汚染回避を可能となる。本発明の高圧蒸気滅菌とは、蒸気によって膜分離槽を加熱・加圧することによって槽内に存在する微生物もしくは培養細胞を滅菌させることである。加熱・加圧条件としては例えば１２１．１℃、蒸気圧１気圧の条件で２０分以上加圧・加温することが好ましい。従って、本発明の連続培養装置の膜分離槽１２、および該膜分離槽１２に配設される分離膜、エレメント構成部材には、かかる条件での高圧蒸気滅菌操作に耐性のある部材を用いることが好ましい。これにより分離膜エレメントを含む培養反応槽内を滅菌可能とすることができる。培養反応槽内が滅菌可能であれば、連続培養時に好ましくない微生物による汚染の危険を回避でき、安定した連続培養が可能となる。
【００６２】
分離膜エレメントを構成する分離膜ならびに支持板等の部材は、高圧蒸気滅菌操作の条件である例えば１２１．１℃、蒸気圧１気圧の条件で２０分以上という条件に耐性であれば、分離膜ならびにエレメント構成部材の種類は特に限定されない。かかる耐性を有する分離膜の素材としては上述の多孔性膜の素材を用いることが可能である。また、支持板等のエレメント構成部材としては、例えば、ステンレスやアルミニウムなどの金属、あるいはポリアミド系樹脂、フッ素系樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリアセタール系樹脂、ポリブチレンテレフタレート系樹脂、ＰＶＤＦ、変性ポリフェニレンエーテル系樹脂およびポリサルホン系樹脂等を好ましく選定することができる。
【００６３】
本発明の連続培養装置で製造される化学品は、上記の微生物や培養細胞が培養液中に生産する物質であれば特に制限はないが、例えば、アルコール、有機酸、アミノ酸および核酸など工業的に大量生産されている物質を挙げることができる。アルコールとしては、例えば、エタノール、１，３−プロパンジオール、１,４−ブタンジオールおよびグリセロールなどが挙げられる。また有機酸としては、例えば、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸が挙げられ、核酸としては、イノシンやグアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチドが挙げられる。また、化学品のその他の例としては、カダベリンなどのジアミン化合物、抗生物質、酵素、組換えタンパク質が挙げられる。本発明の連続培養装置を用いることにより、上記化学品の高い生産性を得ることができる。
【００６４】
ここで、連続培養における生産速度は、次の式（３）で計算される。
【００６５】
【数３】
【００６６】
また、バッチ培養での化学品の生産速度は、原料炭素源をすべて消費した時点の生産物量（ｇ）を、炭素源の消費に要した時間（ｈ）とその時点の培養液量（Ｌ）で除して求められる。
【実施例】
【００６７】
以下、本発明の連続培養装置を、実施例を挙げて詳細に説明する。具体的には、化学品としてＬ−乳酸、微生物もしくは培養細胞にＬ―乳酸生産能力を持つ酵母（参考例１）、分離膜に多孔性膜（参考例２：平膜、参考例３：中空糸膜）を選定し、図１に示す連続培養装置を用い、連続培養装置の膜分離槽に対する培養反応槽の培養液容積比を５から１００の範囲で変化させた連続的な化学品の製造について、実施例を挙げて説明する。
【００６８】
（参考例１）乳酸生産能力を持つ酵母株（ＳＷ−１株）の作製
乳酸生産能力を持つ酵母株を、下記のように造成した。具体的には、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結することにより、Ｌ−乳酸生産能力を持つ酵母株を造成する。ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）には、Ｌａ−Ｔａｑ（宝酒造社製）あるいはKOD-Plus-polymerase（東洋紡社製）を用い、付属の取扱説明に従って行った。
【００６９】
ヒト乳ガン株化細胞（ＭＣＦ−７）を培養回収後、TRIZOL Reagent（Invitrogen）を用いてtotal ＲＮＡを抽出し、得られたtotal ＲＮＡを鋳型としてSuperScript Choice System（Invitrogen）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡの合成を行った。これらの操作の詳細は、それぞれ付属のプロトコールに従った。得られたｃＤＮＡを、続くＰＣＲの増幅鋳型とした。
【００７０】
上記の操作で得られたｃＤＮＡを増幅鋳型とし、配列番号１および配列番号２で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたKOD-Plus-polymeraseによるＰＣＲによりＬ−ｌｄｈ遺伝子のクローニングを行った。各ＰＣＲ増幅断片を精製し末端をT4 Polynucleotide Kinase（TAKARA社製）によりリン酸化後、ｐＵＣ１１８ベクター（制限酵素HincIIで切断し、切断面を脱リン酸化処理したもの）にライゲーションした。ライゲーションは、DNA Ligation Kit Ver.2（TAKARA社製）を用いて行った。ライゲーションプラスミド産物で大腸菌DH５αを形質転換し、プラスミドＤＮＡを回収することにより、各種Ｌ−ｌｄｈ遺伝子（配列番号３）がサブクローニングされたプラスミドを得た。得られたＬ−ｌｄｈ遺伝子が挿入されたｐＵＣ１１８プラスミドを制限酵素ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を酵母発現用ベクターｐＴＲＳ１１（図４）のＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断部位に挿入した。このようにして、ヒト由来Ｌ−ｌｄｈ遺伝子発現プラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を得た。ヒト由来のＬ−ｌｄｈ遺伝子発現ベクターである上記ｐＬ−ｌｄｈ５は、プラスミド単独で独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）にＦＥＲＭ ＡＰ−２０４２１として寄託した（寄託日：平成１７年２月２１日）。
【００７１】
ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を含むプラスミドｐＬ−ｌｄｈ５を増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号５で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．３ｋｂのヒト由来ＬＤＨ遺伝子、及びサッカロミセス・セレビセ由来のＴＤＨ３遺伝子のターミネーター配列含むＤＮＡ断片を増幅した。また、プラスミドｐＲＳ４２４を増幅鋳型として、配列番号６および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより、１．２ｋｂのサッカロミセス・セレビセ由来のＴＲＰ１遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。それぞれのＤＮＡ断片を、１．５％アガロースゲル電気泳動により分離し、常法に従い精製した。ここで得られた１．３ｋｂ断片と１．２ｋｂ断片を混合したものを増幅鋳型とし、配列番号４および配列番号７で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲ法によって得られた産物を１．５％アガロースゲル電気泳動して、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子およびＴＲＰ１遺伝子が連結された２．５ｋｂのＤＮＡ断片を、常法に従い調整した。この２．５ｋｂのＤＮＡ断片で、出芽酵母ＮＢＲＣ１０５０５株を常法に従いトリプトファン非要求性に形質転換した。
【００７２】
得られた形質転換細胞が、ヒト由来ＬＤＨ遺伝子を酵母ゲノム上のＰＤＣ１プロモーターの下流に連結されている細胞であることの確認は、下記のようにして行った。まず、形質転換細胞のゲノムＤＮＡを常法に従って調製し、これを増幅鋳型とした配列番号８および配列番号９で表されるオリゴヌクレオチドをプライマーセットとしたＰＣＲにより０．７ｋｂの増幅ＤＮＡ断片が得られることにより確認した。また、形質転換細胞が乳酸生産能力を持つかどうかは、ＳＣ培地（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＹＥＡＳＴ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ２０００ ＥＤＩＴＩＯＮ、 ＣＳＨＬ ＰＲＥＳＳ）で形質転換細胞を培養した培養上澄に乳酸が含まれていることを、下記に示す条件でＨＰＬＣ法により乳酸量を測定することにより確認した。
【００７３】
・カラム：Shim-Pack SPR-H（島津社製）
・移動相：５mM ｐ−トルエンスルホン酸（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・反応液：５mM ｐ−トルエンスルホン酸、２０mM ビストリス、０．１mM EDTA・２Na（流速０．８ｍＬ／ｍｉｎ）
・検出方法：電気伝導度
・温度：４５℃。
【００７４】
また、Ｌ−乳酸の光学純度測定は以下の条件でＨＰＬＣ法により測定した。
【００７５】
・カラム：TSK-gel Enantio L1（東ソー社製）
・移動相：１ｍＭ 硫酸銅水溶液
・流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
・検出方法：ＵＶ２５４ｎｍ
・温度：３０℃。
【００７６】
また、Ｌ−乳酸の光学純度は次式で計算される。
【００７７】
・光学純度（％）＝１００×（Ｌ−Ｄ）／（Ｌ＋Ｄ）
ここで、ＬはＬ−乳酸の濃度を表し、ＤはＤ−乳酸の濃度を表す。
【００７８】
ＨＰＬＣ分析の結果、４ｇ／ＬのＬ−乳酸が検出され、Ｄ−乳酸は検出限界以下であった。以上の検討により、この形質転換体がＬ−乳酸生産能力を持つことが確認された。得られた形質転換細胞を、酵母ＳＷ−１株として、実施例に用いた。
【００７９】
（参考例２）多孔性平膜の作製（その１）
樹脂としてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）樹脂を、また溶媒としてＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）をそれぞれ用い、これらを９０℃の温度下に十分に攪拌し、次の組成の原液を得た。
【００８０】
・ＰＶＤＦ：１３．０重量％
・ＤＭＡｃ：８７．０重量％
次に、上記原液を２５℃の温度に冷却した後、あらかじめガラス板上に貼り付けて置いた、密度が０．４８ｇ／ｃｍ3で、厚みが２２０μｍのポリエステル繊維製不織布（多孔質基材）に塗布し、直ちに次の組成を有する２５℃の温度の凝固浴中に５分間浸漬して、多孔質基材に多孔質樹脂層が形成された多孔質性膜を得た。
【００８１】
・水：３０．０重量％
・ＤＭＡｃ：７０．０重量％。
【００８２】
この多孔質性膜をガラス板から剥がした後、８０℃の温度の熱水に３回浸漬してＤＭＡｃを洗い出し、分離膜（多孔性膜）を得た。多孔質樹脂層表面の９．２μｍ×１０．４μｍの範囲内を、倍率１０，０００倍で走査型電子顕微鏡観察を行ったところ、観察できる細孔すべての直径の平均は０．１μｍであった。次に、上記の分離膜について純水透過係数を評価したところ、５０×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。純水透水量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、細孔径の標準偏差 は０．０３５μｍで、膜表面粗さは０．０６μｍであった。
【００８３】
（参考例３）多孔性中空糸膜の作製
重量平均分子量４１．７万のフッ化ビニリデンホモポリマーとγ-ブチロラクトンとを、それぞれ３８重量％と６２重量％の割合で１７０℃の温度で溶解し原液を作製した。この原液をγ-ブチロラクトンを中空部形成液体として随拌させながら口金から吐出し、温度２０℃のγ-ブチロラクトン８０重量％水溶液からなる冷却浴中で固化して中空糸膜を作製した。
【００８４】
次いで、重量平均分子量２８．４万のフッ化ビニリデンホモポリマーを１４重量％、セルロースアセテートプロピオネート（イーストマンケミカル社、ＣＡＰ４８２−０．５）を１重量％、Ｎ-メチル-２-ピロリドンを７７重量％、ポリオキシエチレンヤシ油脂肪酸ソルビタン（三洋化成株式会社、商品名イオネットＴ−２０Ｃ）を５重量％、水を３重量％の割合で９５℃の温度で混合溶解して原液を調整した。この原液を、上記で得られた中空糸膜の表面に均一に塗布し、すぐに水浴中で凝固させた本発明で用いる多孔性中空糸膜を製作した。得られた多孔性中空糸膜の被処理水側表面の平均細孔径は、０．０５μｍであった。次に、上記の分離膜である多孔性中空糸膜について純水透水量を評価したところ、５．５×１０-9ｍ3／ｍ2・ｓ・Ｐａであった。透過液量の測定は、逆浸透膜による２５℃の温度の精製水を用い、ヘッド高さ１ｍで行った。また、細孔径の標準偏差 は０．００６μｍであった。
【００８５】
（実施例１）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その１）
酵母ＳＷ−１株、図１の概要図に示した連続培養装置、表１に示す組成の乳酸生産培地を用い、連続培養を行うことによるＬ−乳酸の製造を行った。実施例１では２Ｌ容の培養反応槽、１５０ｍｌ容の膜分離槽を用い、分離膜エレメントには参考例２で作製した多孔性平膜を装着した図２に示す分離膜エレメントを用いた。
【００８６】
なお、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、１００ｍＬ（培養液容積比１５）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．６Ｌとなるように連続培養を行った。乳酸生産培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。
【００８７】
また、実施例１における運転条件は、下記のとおりとした。
・培養反応槽容量：２（Ｌ）（運転時培養液量として１．５Ｌ）
・膜分離槽容量：１５０（ｍＬ）（運転時培養液量として１００ｍＬ）
・使用分離膜：平膜（参考例２参照）
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・培養反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸生産培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・培養液循ポンプによる循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過液量制御：膜間差圧による流量制御
（連続培養開始後〜１００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
より具体的には、まず、試験管中で５ｍｌの乳酸生産培地を用いＳＷ−１株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸生産培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した膜分離型連続培養装置の１．５Ｌの乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機２によって４００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行いながら、培養液循環ポンプ５を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、培養液循環ポンプ５を稼働させた。前培養時の運転条件に加え、培地の連続供給を行い、連続培養装置における全培養液量が２Ｌとなるように膜透過液量の制御を行いながら連続培養し、連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。
【００８８】
連続培養を行うときの膜透過液量の制御は、水頭差圧制御装置４により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過液量制御条件で変化させることで行った。連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過培養液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。なお、Ｌ−乳酸の濃度の評価には参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【００８９】
以上の条件で３００時間の連続培養を行った結果を表２に示す。その結果、図１の連続培養装置を用いることにより、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることを確認することができた。
【００９０】
【表１】
【００９１】
（実施例２）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様の連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。但し、実施例２では２Ｌ容の培養反応槽、４００ｍｌ容の膜分離槽を用い、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、３００ｍＬ（培養液容積比５）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．８Ｌとなるように連続培養を行った。実施例２においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表２に示す。その結果、安定したＬ−乳酸の連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることを確認することができた。
【００９２】
（実施例３）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その３）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様の連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。但し、実施例３では２Ｌ容の培養反応槽、１００ｍｌ容の膜分離槽を用い、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５０ｍＬ（培養液容積比３０）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．５５Ｌとなるように連続培養を行った。実施例３においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表２に示す。その結果、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることが確認できた。
【００９３】
（比較例１）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その１）
分離膜として参考例２で作製した多孔性膜を用い、実施例１と同様の連続培養を行った。但し、比較例１では２Ｌ容の培養反応槽、５００ｍｌ容の膜分離槽を用い、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５００ｍＬ（培養液容積比３）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が２Ｌとなるように連続培養を行った。比較例１においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表２に示す。
【００９４】
（実施例４）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その４）
酵母ＳＷ−１株、図１の概要図に示した連続培養装置、表２に示す組成の酵母乳酸生産培地を用い、連続培養を行った。なお、実施例４では２Ｌ容の培養反応槽、１５０ｍｌ容の膜分離槽を用い、分離膜エレメントには参考例３で作製した多孔性中空糸膜を装着した図３に示す分離膜エレメントを用いた。
【００９５】
なお、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、１００ｍＬ（培養液容積比１５）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．６Ｌとなるように連続培養試験を行った。該酵母乳酸生産培地は、１２１℃の温度で１５分間、高圧蒸気滅菌して用いた。分離膜エレメントの基材部材には、ステンレスおよびポリサルホン樹脂の成型品を用いた。
【００９６】
また、実施例４における運転条件は、下記のとおりとした。
・培養反応槽容量：２（Ｌ）（運転時培養液量として１．５Ｌ）
・膜分離槽容量：１５０（ｍＬ）（運転時培養液量として１００ｍＬ）
・使用分離膜：中空糸膜（参考例３参照）
・膜分離エレメント有効濾過面積：１２０平方ｃｍ
・温度調整：３０（℃）
・培養反応槽通気量：０．０５（Ｌ／ｍｉｎ）
・培養反応槽攪拌速度：１００（ｒｐｍ）
・ｐＨ調整：１Ｎ ＮａＯＨによりｐＨ５に調整
・乳酸生産培地供給速度：５０〜３００ｍｌ／ｈｒ．の範囲で可変制御
・培養液循環ポンプによる循環液量：０．１（Ｌ／ｍｉｎ）
・膜透過液量制御：膜間差圧による流量制御
（連続培養開始後〜１００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上５ｋＰａ以下で制御
１００時間〜２００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２ｋＰａ以下で制御
２００時間〜３００時間：膜間差圧０．１ｋＰａ以上２０ｋＰａ以下で制御）
より具体的には、まず、試験管中で５ｍｌの乳酸生産培地を用いＳＷ−１株を一晩振とう培養した（前々々培養）。得られた培養液を新鮮な乳酸生産培地１００ｍｌに植菌し、５００ｍｌ容坂口フラスコ中で２４時間、３０℃の温度で振とう培養した（前々培養）。前々培養液を、図１に示した連続培養装置の１．５Ｌの乳酸生産培地に植菌し、培養反応槽１を付属の攪拌機２によって４００ｒｐｍで攪拌し、培養反応槽１の通気量の調整、温度調整およびｐＨ調整を行いながら、培養液循環ポンプ５を稼働させることなく、２４時間培養を行った（前培養）。前培養完了後直ちに、培養液循環ポンプ５を稼働させた。前培養時の運転条件に加え、乳酸生産培地の連続供給を行い、連続培養装置における全培養液量が２Ｌとなるように膜透過液量の制御を行いながら連続培養し、連続培養によるＬ−乳酸の製造を行った。
【００９７】
連続培養を行うときの膜透過液量の制御は、水頭差圧制御装置４により水頭差を膜間差圧として測定し、上記の膜透過液量制御条件で変化させることで行った。連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。適宜、膜透過培養液中の生産されたＬ−乳酸濃度および残存グルコース濃度を測定した。なお、化学品であるＬ−乳酸の濃度の評価には参考例１に示したＨＰＬＣを用い、グルコース濃度の測定には“グルコーステストワコーＣ”（登録商標）（和光純薬社製）を用いた。
【００９８】
以上の条件で３００時間の連続培養を行った結果を表３に示す。その結果、図１の連続培養装置を用いることにより、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることを確認することができた。
【００９９】
（実施例５）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その５）
分離膜として参考例３で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例４と同様の連続培養を行った。但し、実施例５では２Ｌ容の培養反応槽、１００ｍｌ容の膜分離槽を用い、培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５０ｍＬ（培養液容積比３０）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．５５Ｌとなるように連続培養を行った。実施例５においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表３に示す。その結果、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることが確認できた。
【０１００】
（実施例６）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その６）
分離膜として参考例３で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例４と同様の連続培養を行った。但し、実施例６では２Ｌ容の培養反応槽、５０ｍｌ容の膜分離槽を用い、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、１５ｍＬ（培養液容積比１００）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が１．５１５Ｌとなるように連続培養を行った。実施例６においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表３に示す。その結果、連続培養による安定したＬ−乳酸の製造が可能であることが確認できた。
【０１０１】
（比較例２）連続培養によるＬ−乳酸の製造（その２）
分離膜として参考例３で作製した多孔性中空糸膜を用い、実施例４と同様の連続培養を行った。但し、比較例２では２Ｌ容の培養反応槽、５００ｍｌ容の膜分離槽を用い、連続培養運転時に培養反応槽ならびに膜分離槽に満たされる培養液量をそれぞれ１．５Ｌ、５００ｍＬ（培養液容積比３）とし、連続培養装置内（配管内は除く）の培養液量が２Ｌとなるように連続培養を行った。比較例２においても連続培養の期間中の膜間差圧は、結果的に２ｋＰａ以下で推移した。その結果を表３に示す。
【０１０２】
【表２】
【０１０３】
【表３】
【０１０４】
実施例１〜６ならびに比較例１、２の連続培養結果から、従来の連続培養装置と比較して膜分離槽に対する培養反応槽の培養液容積比を５〜１００の範囲にすることで、装置のコンパクト化を実現しつつも、培養液の培養反応槽滞留時間が長くなり適切な培養条件への調節が実現し、化学品の生産速度が向上することが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】図１は、本発明で用いられる膜分離型の連続培養装置の一つの実施の形態を説明するための概略側面図である。
【図２】図２は、本発明で用いられる分離膜エレメントの一つの実施の形態を説明するための概略斜視図である。
【図３】図３は、本発明で用いられる他の分離膜エレメントの例を説明するための断面説明図である。
【図４】図４は、実施例で用いた酵母用発現ベクターｐＴＲＳ１１のフィジカルマップを示す図である。
【符号の説明】
【０１０６】
１ 培養反応槽
２ 攪拌機
３ 分離膜（エレメント）
４ 水頭差圧制御装置
５ 培養液循環ポンプ
６ レベルセンサ
７ 温度調節器
８ 培地供給ポンプ
９ ｐＨ調整溶液供給ポンプ
１０ ｐＨセンサ・制御装置
１１ 気体供給装置
１２ 膜分離槽
１３ 支持板
１４ 流路材
１５ 分離膜
１６ 凹部
１７ 集液パイプ
１８ 上部樹脂封止層
１９ 下部樹脂封止層
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞を培養するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段とを具備し、前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有するものであることを特徴とする連続培養装置。
【請求項２】
前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記培養液容積比が１５以上１００以下となる容積を有するものである、請求項１記載の連続培養装置。
【請求項３】
培養反応槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、連続的に培養液を前記培養反応槽から膜分離槽へ供給して分離膜で濾過し生産物を回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流するにあたり、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比を５以上１００以下とすることを特徴とする化学品の製造方法。
【請求項１】
微生物もしくは培養細胞を培養するための培養反応槽と、該培養反応槽から連続的に供給される培養液を濾過する分離膜が配置される膜分離槽と、前記培養液を前記培養反応槽から前記膜分離槽へ供給するとともに濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流する培養液循環手段とを具備し、前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比が５以上１００以下となる容積を有するものであることを特徴とする連続培養装置。
【請求項２】
前記膜分離槽および前記培養反応槽は、前記培養液容積比が１５以上１００以下となる容積を有するものである、請求項１記載の連続培養装置。
【請求項３】
培養反応槽において微生物もしくは培養細胞を培養し、連続的に培養液を前記培養反応槽から膜分離槽へ供給して分離膜で濾過し生産物を回収するとともに、濾過されなかった未濾過培養液を前記膜分離槽よりも上流側の前記培養液へ還流するにあたり、前記膜分離槽における培養液に対する前記培養反応槽における培養液の培養液容積比を５以上１００以下とすることを特徴とする化学品の製造方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−２９６９２１（Ｐ２００９−２９６９２１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５３８４６（Ｐ２００８−１５３８４６）
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１２日（２００８．６．１２）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２０年度新エネルギー・産業技術総合開発機構、「微生物機能を活用した環境調和型製造基盤技術開発／微生物機能を活用した高度製造基盤技術開発」に係る委託研究、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（０００００３１５９）東レ株式会社 (7,677)
【Ｆターム（参考）】
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