遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キット
【課題】 迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法を提供する。
【解決手段】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に、遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し、ついでこの試料に表面増強ラマン散乱生起基質を供給して遺伝子に結合しなかった遺伝子結合性ラマン活性物質を捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定して遺伝子を分析する。分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡの場合、前記遺伝子結合性ラマン活性物質としては、４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）がある。また、前記表面増強ラマン散乱生起基質としては銀コロイドがある。図１のグラフの曲線（ａ）に示すように、ＤＮＡが存在すると表面増強ラマン散乱光が微弱になる。
【解決手段】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に、遺伝子結合性ラマン活性物質を供給し、ついでこの試料に表面増強ラマン散乱生起基質を供給して遺伝子に結合しなかった遺伝子結合性ラマン活性物質を捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定して遺伝子を分析する。分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡの場合、前記遺伝子結合性ラマン活性物質としては、４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）がある。また、前記表面増強ラマン散乱生起基質としては銀コロイドがある。図１のグラフの曲線（ａ）に示すように、ＤＮＡが存在すると表面増強ラマン散乱光が微弱になる。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子、すなわちデオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」という）およびリボ核酸（以下「ＲＮＡ」という）の分析方法に関し、詳しくは、表面増強ラマン散乱（以下「ＳＥＲＳ」という）測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学に関する技術の革新は目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法の開発により、目的とするＤＮＡの大量複製が可能となった。
【０００３】ＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーなしでは働かないという原理に基づくものであり、試料中のＤＮＡを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成するという、一連のサイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡを大量に増幅させるものである。したがって、特定のプライマーを予め化学合成等により準備して用いれば、目的とするＤＮＡを大量に調製することができる。ここで、目的とするＤＮＡが調製されたか否かの判断は、従来、ＰＣＲを行った試料を電気泳動にかけて目的とするＤＮＡのバンドの確認により行われることが一般的であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、電気泳動による分析は、その操作に時間がかかり、かつ煩雑であるという問題があった。すなわち、電気泳動の担体となるゲルを予め調製する作業があり、ＰＣＲを行った試料を、ＤＮＡの大きさにより予め選択する必要がある。また、電気泳動法は、通常、約７５分の長時間を必要とし、迅速性に欠ける。そして、遺伝子を迅速かつ簡単に検出し測定することは、ＰＣＲ法のみならず、ＤＮＡ等の遺伝子を分析する分野に共通する課題となっている。
【０００５】そこで、本発明は、前記従来の問題を解決し、迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットの提供をその目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するために、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に、前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質により捕捉し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定するという構成をとる。
【０００７】このように、本発明は、遺伝子結合性ラマン活性物質が発生するＳＥＲＳ光を測定することにより、迅速かつ簡単な遺伝子の分析を可能にするものである。ラマン活性物質の中には、ＤＮＡ等の遺伝子に特異的に結合するものがある。この遺伝子結合性ラマン活性物質を、分析対象試料に添加すると、前記試料中に遺伝子が存在すれば、これに前記ラマン活性物質が結合することになる。そして、この試料にＳＥＲＳ生起基質を添加すれば、遺伝子と結合していない前記ラマン活性物質のみが、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉されることとなる。この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射すれば、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉された前記ラマン活性物質だけがＳＥＲＳ光を発し、遺伝子に結合した前記ラマン活性物質は、ＳＥＲＳ光を生じない。したがって、分析対象試料中の遺伝子量に反比例したＳＥＲＳ光が検出でき、これにより前記試料中の遺伝子の検出およびその量を測定することができる。
【０００８】なお、本発明の遺伝子の分析方法において、前記試料に対する前記遺伝子結合性ラマン活性物質および表面増強ラマン散乱生起基質の供給順序は特に限定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよく、若しくは前記遺伝子結合性ラマン活性物質を供給した後、前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給してもよい。
【０００９】そして、この分析方法では、前記ラマン活性物質および前記ＳＥＲＳ生起基質の添加、励起光の照射およびＳＥＲＳ光の測定という単純な操作により構成されているため、簡単な分析方法となっている。また、遺伝子への前記ラマン活性物質の結合および前記ＳＥＲＳ生起基質による前記ラマン活性物質の捕捉は、極めて短時間で起り、またＳＥＲＳ光の測定も、約１〜２秒の極めて短い時間で行うことができるため、本発明の遺伝子の分析方法は、分析操作全体を短時間に行うことができる。
【００１０】なお、本発明において、「ラマン活性」とは、励起光を照射すればラマン散乱若しくはＳＥＲＳが生じることをいい、「遺伝子結合性ラマン活性物質」とは前記ラマン活性を有する物質のなかで、遺伝子に結合する性質を有するものをいう。また、「表面増強ラマン散乱生起基質」とは、その表面に物質を捕捉してラマン散乱を増強させる性質を有する物質をいう。前記捕捉の手段としては、例えば、吸着現象を利用する方法や、電位をかけて電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と反応結合する官能基を備えたＳＥＲＳ生起基質に反応させる方法がある。
【００１１】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体がある。そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料として、ＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料（ＰＣＲ産物）またはＤＮＡ試料を用いる場合に有効な分析方法となる。先に述べたように、ＰＣＲ法は目的とするＤＮＡを増幅する方法であるが、試料中に目的とするＤＮＡがない場合にはＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は微量なものとなる。したがって、ＰＣＲ産物を分析対象試料として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＳＥＲＳ光を測定することにより、短時間で簡単に目的ＤＮＡが増幅されたか否かが確認できる。また、予め検量線を作成しておけば、増幅されたＤＮＡ量を測定することもできる。
【００１２】この他に、ストランド ディスプレースメント アンプリフィケーション法（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、リガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行った試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＰＣＲ法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
【００１３】なお、前記ＳＤＡ法としては、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０．Ｎｏ．７ １６９１−１６９６に記載の方法があげられる。
【００１４】また、前記ＬＣＲ法とは、９４℃でも熱変性しない耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用することに特徴を有するＤＮＡ増幅法であり、この方法は、ミスマッチをもたない正常人のＤＮＡ試料の場合には用いた２種類のオリゴヌクレオチドがＤＮＡリガーゼによって接続され、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅されるのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないためそこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
【００１５】また、前記Ｑβ法は、ＲＮＡレプリカーゼの一種で基質となるＲＮＡと特異性が高いＱβレプリカーゼを用いてＲＮＡを増幅する方法である。具体的には、まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの下流にＭＤＶ−１・ＲＮＡ（ＤＮＡ化したもの）をつないだプラスミドベクターを据え、増幅したいＤＮＡ断片をＭＤＶ−１の間に挿入する（２０〜８００ｂｐ程度が挿入可能）。つぎに、制限酵素で切断してからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを働かせ、これをＲＮＡ化する。挿入断片を含んだＭＤＶ−１・ＲＮＡは、以後のＱβレプリカーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅させることができる。
【００１６】さらに、本発明の遺伝子の分析方法の適用範囲はこれらの試料に限定されず、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＣＰＲ法、ＳＩＲ法等によりＤＮＡあるいはＲＮＡの増幅操作を行った試料についてもＰＣＲ法と同様に適用することができる。なお、ＮＡＳＢＡ法はＲＮＡの増幅方法であり、その他の方法はＤＮＡの増幅方法である。
【００１７】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡ（前記二本鎖ＤＮＡ増幅試料を含む）である場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、下記の式（化１）で表される４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、チアゾールオレンジ、下記の式（化２）で表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）およびアクリジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ I（商品名、モレキュラープローブス社製）があげられる、このなかでも、ＤＡＰＩが好ましい。これは、ＤＡＰＩが二本鎖ＤＮＡとより選択的に複合体を形成し、他の物質、例えばＲＮＡには結合しにくいという性質を持ち、このため、ＲＮＡ等の他の物質が混在する試料であっても、二本鎖ＤＮＡを選択的に検出できるからである。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子がＲＮＡの場合（前記ＲＮＡ増幅試料を含む）、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、ＥｔＢｒ、チアゾールオレンジ、前記式（化２）で表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）、アクリジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II （商品名、モレキュラープローブス社製）もあげられる。このなかで、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II が、よりＲＮＡと選択的に複合体を形成する。
【００２１】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子が一本鎖ＤＮＡの場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、前記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II があげられる。
【００２２】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子がＲＮＡとＤＮＡの複合体の場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、先に述べた、ＤＮＡ結合性ラマン活性物質、ＲＮＡ結合性ラマン活性物質を使用できる。
【００２３】本発明の遺伝子の分析方法において、ＳＥＲＳ生起基質としては、例えば、銀コロイド、金コロイド、銅コロイド、電極、金属板があげられ、このなかでも、作製が簡単で取扱いが容易であることから、銀コロイド、金コロイド等の金属コロイドが好ましい。
【００２４】そして、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１と、ＳＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２とを備える。このキットを用いれば、本発明の遺伝子の分析が、さらに迅速かつ簡単に実施できるようになる。
【００２５】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明の遺伝子の分析方法の実施の形態について説明する。
【００２６】図７に、本発明を、ＰＣＲを行った試料に適用した例を示す。この図では、右側にターゲットＤＮＡが存在しない試料についてＰＣＲを行った例を、左側にターゲットＤＮＡを含む試料についてＰＣＲを行った例をそれぞれ示す。
【００２７】まず、同図（ａ）に示すように、ＤＮＡ試料を準備する。この試料には、ＤＮＡの他に、２つのプライマー１、２と、ＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）およびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ、図示せず）が添加されている。そして、この試料を加熱すると、ＤＮＡが熱変性して一本鎖ＤＮＡに解離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットＤＮＡにはプライマー１、２が相補的に結合するが、ターゲットＤＮＡ以外には結合しない。そして、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡでは伸長反応が起るが、ターゲットＤＮＡ以外では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起らない。そして、前記の一連の操作を約２０〜３０回繰り返すと同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡは大量に増幅されるが、ターゲットＤＮＡを含まない系では全く増幅されない。
【００２８】そして、同図（ｃ）に示すように、試料に遺伝子結合性ラマン活性物質（ＳＥＲＳ活性物質）を加えると、２本鎖ＤＮＡ中にインターカレートされて結合する。したがって、図示のように、ターゲットＤＮＡの試料では、二本鎖ＤＮＡが多数存在し、これに前記ラマン活性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、二本鎖ＤＮＡがほとんど存在しないため、前記ラマン活性物質の大部分は、試料中において遊離状態で存在している。そして、同図（ｄ）に示すように、ＳＥＲＳ生起基質の一つである銀コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、ターゲットＤＮＡ試料では、前記ラマン活性物質がＤＮＡに結合しているため、前記銀コロイドに捕捉されるものがなく、あってもわずかであり無視できる。これに対し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、ほとんどの前記ラマン活性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀コロイドに捕捉される。
【００２９】そして、この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射すると、ターゲットＤＮＡ試料では、ＳＥＲＳ光が微弱あるいは観測されず、一方、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、強いＳＥＲＳ光が観測される。
【００３０】換言すると、強いＳＥＲＳ光が観測された試料中には、ターゲットＤＮＡが存在しないと判断でき、ＳＥＲＳ光が微弱あるいは観測されない試料中には、ターゲットＤＮＡが存在すると判断できる。
【００３１】このように、本発明によれば、従来の電気泳動法のように、泳動ゲルや緩衝液の調製等の繁雑な操作を必要とせず、短時間で遺伝子の分析を行うことができる。
【００３２】なお、前記励起光の照射およびＳＥＲＳ光の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用いて行うことができる。また、測定条件は、用いるラマン活性物質およびその添加量並びに遺伝子の濃度等により適宜決定されるが、アルゴンイオンレーザーの強度は、通常、５ｍＷ〜１００ｍＷである。また、ＳＥＲＳ生起基質は、ラマン活性物質よりも過剰であることが好ましい。
【００３３】そして、本発明の遺伝子の分析方法では、遺伝子と前記ラマン活性物質との重量比について予め検討をおこない、目的とする遺伝子が存在する場合のＳＥＲＳ光強度と存在しない場合の強度とが明確に区別できるようにすることが好ましい。前記重量比は、分析対象となる遺伝子および前記ラマン活性物質の種類等により適宜決定されるものである。例えば、分析対象の遺伝子が二本鎖ＤＮＡであり前記ラマン活性物質がＤＡＰＩである場合、その重量比は、通常、ＤＮＡ／ＤＡＰＩ＝０．１〜０．５である。
【００３４】つぎに、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１およびＳＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２を備える。
【００３５】前記試薬Ｒ１は、前記ラマン活性物質の他に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬Ｒ２も、前記ＳＥＲＳ生起基質の他に、例えば、ポリリン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、界面活性剤等の安定化剤を含有してもよい。
【００３６】本発明の遺伝子分析用キットの使用方法は、前述の方法と同様である。このキットを用いれば、予め必要な成分が適量配合されているため、従来のように分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
【００３７】なお、以上の説明において、ＰＣＲにより増幅された二本鎖ＤＮＡを分析対象遺伝子とした例をとりあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、この他、ＳＤＡ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＬＣＲ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｑβ法により増幅されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析する場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性ラマン活性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なＲＮＡ等の遺伝子の分析ができる。
【００３８】
【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
【００３９】（実施例１）まず、以下に示す成分を精製水に溶解してＰＣＲバッファーを調製した。
【００４０】（ＰＣＲバッファー組成）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １００ｍＭＫＣｌ ５００ｍＭＭｇＣｌ2 １５ｍＭ
【００４１】そして、このＰＣＲバッファー１０μｌに下記に示す成分を添加して、ＰＣＲ反応液を調製した。なお、下記のプライマー１、２は、下記のλＤＮＡに対し相補的配列を持つものである。
【００４２】
（配合成分）
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、２．５ｍＭ）：８μｌ プライマー１（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：１μｌ 配列：5´−GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT−3´ プライマー２（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：１μｌ 配列：5´−CCACATCCATACCGGGTTTCAC−3´ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／μｌ）：０．５μｌ ＤＮＡ（λＤＮＡ、１μｇ／ｍｌ）：１μｌ 蒸留水：７８．５μｌ
【００４３】そして、このＰＣＲ反応液を用い、以下のサイクルでＰＣＲを行った。
【００４４】（ＰＣＲサイクル）
ステップａ（９４℃１０分）：１サイクルステップｂ（９４℃１分）→ステップｃ（６８℃４分）：３０サイクルステップｄ（６８℃７分）：１サイクル
【００４５】つぎに、ＤＮＡ精製を行った。すなわち、まず、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１５０ｍＡ，２時間）にかけ、目的のＤＮＡ画分を分離した。そして、目的とするＤＮＡのバンドがあるゲル部分を切り出した。切り出したゲルを、ＴＢＥバッファーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシーラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽内をＴＢＥバッファーで満たし、通電した（１５０ｍＡ、３時間）。通電終了後、透析チューブ内のＴＢＥバッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、これを精製ＤＮＡ試料とした。
【００４６】つぎに、得られた精製ＤＮＡ試料２５μｌにＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）１５μｌを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測定試料を調製した。そして、この測定試料について、アルゴンイオンレーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用い、励起波長５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図１のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００４７】なお、図１において、グラフの縦軸のＳＥＲＳ強度は、ＳＥＲＳ光の強度を示し、横軸の波数は、ＳＥＲＳ光の波数を示す。図２、図３、図４および図６のグラフも同様である。
【００４８】（比較例１）ＤＮＡに代えて、蒸留水１μｌを用いた他は、実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、実施例１と同様にして、ＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図１のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００４９】（対照１，２）前記混合液に代えて、ＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-5ｍｏｌ／ｌ）４０μｌを用いた例を対照１とし、また二本鎖ＤＮＡ水溶液４０μｌのみを用いた例を対照２とした。これら対照１、２のその他の条件および操作は、前記実施例と同様である。前記対照１の結果を図３のグラフに、前記対照２の結果を図４R>４のグラフに示す。
【００５０】以上の実施例１、比較例１、対照１、２からつぎのことがいえる。まず、図１のグラフの曲線（ａ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された実施例１では、ほぼ全部のＤＡＰＩがＤＮＡにインターカレートされて極微量のＤＡＰＩしか銀コロイドに捕捉されないため、ＳＥＲＳ光が弱かった。これに対し、同図のグラフの曲線（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されなかった比較例１では、ほぼ全部のＤＡＰＩが銀コロイドに捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定できた。なお、この比較例１のＳＥＲＳ光のピークは、図３のグラフに示す対照１のピークと一致した。また、図４のグラフに示すように、ＤＮＡのみの場合（対照２）では、ＳＥＲＳ光が測定できなかった。これらの結果から、本発明の遺伝子の分析方法により、ＰＣＲ法によりＤＮＡが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別できるといえる。
【００５１】（実施例２）実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物についてＤＮＡ精製を行った。そして、得られた精製ＤＮＡ試料３５μｌにＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）５μｌを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測定試料を調製した。そして、この測定試料について、アルゴンイオンレーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用い、励起波長５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００５２】（比較例２）ＤＮＡに代えて、蒸留水１μｌを用いた他は、実施例２と同様にしてＰＣＲおよびＤＮＡ精製を行い、ついで実施例２と同様にしてＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００５３】以上の実施例２および比較例２の結果からつぎのことがいえる。まず、図２のグラフの曲線（ａ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された実施例２では、ＤＡＰＩがＤＮＡにほぼ完全にインターカレートされて銀コロイドに捕捉されないため、ＳＥＲＳ光が検出できなかった。これに対し、同図のグラフの曲線（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されなかった比較例２では、ほぼ全部のＤＡＰＩが銀コロイドに捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定できた。
【００５４】（実施例３）混合液として、種々濃度のＤＮＡ水溶液２５μｌにＤＡＰＩ水溶液１５μｌを加えて混合したものを用いた他は、実施例１と同様にしてＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を図５のグラフに示す。なお、この図において、縦軸のＳＥＲＳ強度はＳＥＲＳ光の強度であり、横軸はＤＮＡ濃度である。
【００５５】図５のグラフに示すように、ＤＮＡの濃度が増加するにしたがいＳＥＲＳ光の強度が直線的に低下した。このグラフは、検量線として使用できるため、これを用いれば、例えば、ＰＣＲ法において目的ＤＮＡの増幅の判別のみならず、ＰＣＲ産物中のＤＮＡ濃度も測定することが可能となる。
【００５６】（実施例４、比較例２）実施例４では、ＤＮＡの精製を行わないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の測定を行った他は、実施例１と同じ条件で同じ操作を行った。その結果を、図６のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００５７】他方、比較例２では、ＤＮＡの精製を行わないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の測定を行った他は、比較例１と同じ条件で同じ操作を行った。その結果を、図６のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００５８】図６のグラフに示すように、ＤＮＡが大量に存在する実施例４のＳＥＲＳ光とＤＮＡがほとんど存在しない比較例２のＳＥＲＳ光とを明確に区別することができる。このことから、本発明の遺伝子の分析方法によれば、ＤＮＡ精製を行わないＰＣＲ産物であっても、遺伝子（ＤＮＡ）の分析が可能であるといえる。
【００５９】
【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の分析方法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比べて、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができる。このため、本発明の分析方法を、例えば、ＰＣＲ法に適用すれば、目的とするＤＮＡの増幅を短時間で簡単に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判断することができる。また、本発明の分析方法は、精製を行わないＰＣＲ産物のように、他の物質が混在している試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そして、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、分析を自動化することが可能であり、これによりさらに迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例のＳＥＲＳ光のグラフである。
【図２】本発明のその他の実施例のＳＥＲＳ光のグラフである。
【図３】ＤＡＰＩのみのＳＥＲＳ光のグラフである。
【図４】ＤＮＡのみのＳＥＲＳ光のグラフである。
【図５】本発明のさらにその他の実施例におけるＳＥＲＳ光とＤＮＡ濃度の関係を示すグラフである。
【図６】本発明のさらにその他の実施例のＳＥＲＳ光のグラフである。
【図７】図（ａ）〜（ｂ）は、本発明の遺伝子の分析方法をＰＣＲに適用した場合の実施例の一連の操作を示す説明図である。
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子、すなわちデオキシリボ核酸（以下「ＤＮＡ」という）およびリボ核酸（以下「ＲＮＡ」という）の分析方法に関し、詳しくは、表面増強ラマン散乱（以下「ＳＥＲＳ」という）測定により短時間で簡単に遺伝子の分析を行うことが可能な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学に関する技術の革新は目覚ましく、特に、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法の開発により、目的とするＤＮＡの大量複製が可能となった。
【０００３】ＰＣＲ法は、ＤＮＡポリメラーゼがプライマーなしでは働かないという原理に基づくものであり、試料中のＤＮＡを熱で変性させて一本鎖とし、ついで温度を下げてプライマーを結合させ、この状態で耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡ合成するという、一連のサイクルを繰り返すことにより、ＤＮＡを大量に増幅させるものである。したがって、特定のプライマーを予め化学合成等により準備して用いれば、目的とするＤＮＡを大量に調製することができる。ここで、目的とするＤＮＡが調製されたか否かの判断は、従来、ＰＣＲを行った試料を電気泳動にかけて目的とするＤＮＡのバンドの確認により行われることが一般的であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、電気泳動による分析は、その操作に時間がかかり、かつ煩雑であるという問題があった。すなわち、電気泳動の担体となるゲルを予め調製する作業があり、ＰＣＲを行った試料を、ＤＮＡの大きさにより予め選択する必要がある。また、電気泳動法は、通常、約７５分の長時間を必要とし、迅速性に欠ける。そして、遺伝子を迅速かつ簡単に検出し測定することは、ＰＣＲ法のみならず、ＤＮＡ等の遺伝子を分析する分野に共通する課題となっている。
【０００５】そこで、本発明は、前記従来の問題を解決し、迅速かつ簡単な遺伝子の分析方法およびそれに用いる遺伝子分析用キットの提供をその目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記目的を達成するために、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に、前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質により捕捉し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定するという構成をとる。
【０００７】このように、本発明は、遺伝子結合性ラマン活性物質が発生するＳＥＲＳ光を測定することにより、迅速かつ簡単な遺伝子の分析を可能にするものである。ラマン活性物質の中には、ＤＮＡ等の遺伝子に特異的に結合するものがある。この遺伝子結合性ラマン活性物質を、分析対象試料に添加すると、前記試料中に遺伝子が存在すれば、これに前記ラマン活性物質が結合することになる。そして、この試料にＳＥＲＳ生起基質を添加すれば、遺伝子と結合していない前記ラマン活性物質のみが、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉されることとなる。この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射すれば、前記ＳＥＲＳ生起基質に捕捉された前記ラマン活性物質だけがＳＥＲＳ光を発し、遺伝子に結合した前記ラマン活性物質は、ＳＥＲＳ光を生じない。したがって、分析対象試料中の遺伝子量に反比例したＳＥＲＳ光が検出でき、これにより前記試料中の遺伝子の検出およびその量を測定することができる。
【０００８】なお、本発明の遺伝子の分析方法において、前記試料に対する前記遺伝子結合性ラマン活性物質および表面増強ラマン散乱生起基質の供給順序は特に限定するものではなく、前記両者を同時に供給してもよく、若しくは前記遺伝子結合性ラマン活性物質を供給した後、前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給してもよい。
【０００９】そして、この分析方法では、前記ラマン活性物質および前記ＳＥＲＳ生起基質の添加、励起光の照射およびＳＥＲＳ光の測定という単純な操作により構成されているため、簡単な分析方法となっている。また、遺伝子への前記ラマン活性物質の結合および前記ＳＥＲＳ生起基質による前記ラマン活性物質の捕捉は、極めて短時間で起り、またＳＥＲＳ光の測定も、約１〜２秒の極めて短い時間で行うことができるため、本発明の遺伝子の分析方法は、分析操作全体を短時間に行うことができる。
【００１０】なお、本発明において、「ラマン活性」とは、励起光を照射すればラマン散乱若しくはＳＥＲＳが生じることをいい、「遺伝子結合性ラマン活性物質」とは前記ラマン活性を有する物質のなかで、遺伝子に結合する性質を有するものをいう。また、「表面増強ラマン散乱生起基質」とは、その表面に物質を捕捉してラマン散乱を増強させる性質を有する物質をいう。前記捕捉の手段としては、例えば、吸着現象を利用する方法や、電位をかけて電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と反応結合する官能基を備えたＳＥＲＳ生起基質に反応させる方法がある。
【００１１】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子としては、例えば、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体がある。そして、本発明の遺伝子の分析方法は、分析対象試料として、ＰＣＲ法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料（ＰＣＲ産物）またはＤＮＡ試料を用いる場合に有効な分析方法となる。先に述べたように、ＰＣＲ法は目的とするＤＮＡを増幅する方法であるが、試料中に目的とするＤＮＡがない場合にはＰＣＲ産物中のＤＮＡ量は微量なものとなる。したがって、ＰＣＲ産物を分析対象試料として本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＳＥＲＳ光を測定することにより、短時間で簡単に目的ＤＮＡが増幅されたか否かが確認できる。また、予め検量線を作成しておけば、増幅されたＤＮＡ量を測定することもできる。
【００１２】この他に、ストランド ディスプレースメント アンプリフィケーション法（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、リガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行った試料にも、本発明の遺伝子の分析方法を適用すれば、ＰＣＲ法の場合と同様に、好結果を得ることができる。
【００１３】なお、前記ＳＤＡ法としては、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２０．Ｎｏ．７ １６９１−１６９６に記載の方法があげられる。
【００１４】また、前記ＬＣＲ法とは、９４℃でも熱変性しない耐熱性ＤＮＡリガーゼを使用することに特徴を有するＤＮＡ増幅法であり、この方法は、ミスマッチをもたない正常人のＤＮＡ試料の場合には用いた２種類のオリゴヌクレオチドがＤＮＡリガーゼによって接続され、つぎの反応サイクルの基質となって次々と増幅されるのに対し、ミスマッチをもつ場合は接続されないためそこで反応が止まってしまうという原理に基づく。
【００１５】また、前記Ｑβ法は、ＲＮＡレプリカーゼの一種で基質となるＲＮＡと特異性が高いＱβレプリカーゼを用いてＲＮＡを増幅する方法である。具体的には、まず、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターの下流にＭＤＶ−１・ＲＮＡ（ＤＮＡ化したもの）をつないだプラスミドベクターを据え、増幅したいＤＮＡ断片をＭＤＶ−１の間に挿入する（２０〜８００ｂｐ程度が挿入可能）。つぎに、制限酵素で切断してからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを働かせ、これをＲＮＡ化する。挿入断片を含んだＭＤＶ−１・ＲＮＡは、以後のＱβレプリカーゼによる複製サイクルを繰り返すことにより増幅させることができる。
【００１６】さらに、本発明の遺伝子の分析方法の適用範囲はこれらの試料に限定されず、３ＳＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＣＰＲ法、ＳＩＲ法等によりＤＮＡあるいはＲＮＡの増幅操作を行った試料についてもＰＣＲ法と同様に適用することができる。なお、ＮＡＳＢＡ法はＲＮＡの増幅方法であり、その他の方法はＤＮＡの増幅方法である。
【００１７】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子が二本鎖ＤＮＡ（前記二本鎖ＤＮＡ増幅試料を含む）である場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、下記の式（化１）で表される４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、エチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）、チアゾールオレンジ、下記の式（化２）で表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）およびアクリジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ I（商品名、モレキュラープローブス社製）があげられる、このなかでも、ＤＡＰＩが好ましい。これは、ＤＡＰＩが二本鎖ＤＮＡとより選択的に複合体を形成し、他の物質、例えばＲＮＡには結合しにくいという性質を持ち、このため、ＲＮＡ等の他の物質が混在する試料であっても、二本鎖ＤＮＡを選択的に検出できるからである。
【００１８】
【化１】
【００１９】
【化２】
【００２０】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象となる遺伝子がＲＮＡの場合（前記ＲＮＡ増幅試料を含む）、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、ＥｔＢｒ、チアゾールオレンジ、前記式（化２）で表されるビスベンゾイミド（ヘキスト３３２５８、ヘキスト社製）、アクリジンオレンジがあげられる。この他に、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II （商品名、モレキュラープローブス社製）もあげられる。このなかで、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II が、よりＲＮＡと選択的に複合体を形成する。
【００２１】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子が一本鎖ＤＮＡの場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、前記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ II があげられる。
【００２２】本発明の遺伝子の分析方法において、分析対象の遺伝子がＲＮＡとＤＮＡの複合体の場合、遺伝子結合性ラマン活性物質としては、例えば、先に述べた、ＤＮＡ結合性ラマン活性物質、ＲＮＡ結合性ラマン活性物質を使用できる。
【００２３】本発明の遺伝子の分析方法において、ＳＥＲＳ生起基質としては、例えば、銀コロイド、金コロイド、銅コロイド、電極、金属板があげられ、このなかでも、作製が簡単で取扱いが容易であることから、銀コロイド、金コロイド等の金属コロイドが好ましい。
【００２４】そして、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１と、ＳＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２とを備える。このキットを用いれば、本発明の遺伝子の分析が、さらに迅速かつ簡単に実施できるようになる。
【００２５】
【発明の実施の形態】つぎに、本発明の遺伝子の分析方法の実施の形態について説明する。
【００２６】図７に、本発明を、ＰＣＲを行った試料に適用した例を示す。この図では、右側にターゲットＤＮＡが存在しない試料についてＰＣＲを行った例を、左側にターゲットＤＮＡを含む試料についてＰＣＲを行った例をそれぞれ示す。
【００２７】まず、同図（ａ）に示すように、ＤＮＡ試料を準備する。この試料には、ＤＮＡの他に、２つのプライマー１、２と、ＤＮＡポリメラーゼ（図示せず）およびデオキシリボヌクレオチドトリフォスフェート（ｄＮＴＰ、図示せず）が添加されている。そして、この試料を加熱すると、ＤＮＡが熱変性して一本鎖ＤＮＡに解離する。そして、試料を冷却すると、ターゲットＤＮＡにはプライマー１、２が相補的に結合するが、ターゲットＤＮＡ以外には結合しない。そして、ＤＮＡポリメラーゼの作用により、同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡでは伸長反応が起るが、ターゲットＤＮＡ以外では、プライマーが結合していないため、伸長反応は起らない。そして、前記の一連の操作を約２０〜３０回繰り返すと同図（ｂ）に示すように、ターゲットＤＮＡは大量に増幅されるが、ターゲットＤＮＡを含まない系では全く増幅されない。
【００２８】そして、同図（ｃ）に示すように、試料に遺伝子結合性ラマン活性物質（ＳＥＲＳ活性物質）を加えると、２本鎖ＤＮＡ中にインターカレートされて結合する。したがって、図示のように、ターゲットＤＮＡの試料では、二本鎖ＤＮＡが多数存在し、これに前記ラマン活性物質がほぼ全部結合する。これに対し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、二本鎖ＤＮＡがほとんど存在しないため、前記ラマン活性物質の大部分は、試料中において遊離状態で存在している。そして、同図（ｄ）に示すように、ＳＥＲＳ生起基質の一つである銀コロイドを試料に添加する。すると、図示のように、ターゲットＤＮＡ試料では、前記ラマン活性物質がＤＮＡに結合しているため、前記銀コロイドに捕捉されるものがなく、あってもわずかであり無視できる。これに対し、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、ほとんどの前記ラマン活性物質が遊離状態で存在し、これが前記銀コロイドに捕捉される。
【００２９】そして、この状態で、前記ラマン活性物質に励起光を照射すると、ターゲットＤＮＡ試料では、ＳＥＲＳ光が微弱あるいは観測されず、一方、ターゲットＤＮＡを含まない試料では、強いＳＥＲＳ光が観測される。
【００３０】換言すると、強いＳＥＲＳ光が観測された試料中には、ターゲットＤＮＡが存在しないと判断でき、ＳＥＲＳ光が微弱あるいは観測されない試料中には、ターゲットＤＮＡが存在すると判断できる。
【００３１】このように、本発明によれば、従来の電気泳動法のように、泳動ゲルや緩衝液の調製等の繁雑な操作を必要とせず、短時間で遺伝子の分析を行うことができる。
【００３２】なお、前記励起光の照射およびＳＥＲＳ光の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用いて行うことができる。また、測定条件は、用いるラマン活性物質およびその添加量並びに遺伝子の濃度等により適宜決定されるが、アルゴンイオンレーザーの強度は、通常、５ｍＷ〜１００ｍＷである。また、ＳＥＲＳ生起基質は、ラマン活性物質よりも過剰であることが好ましい。
【００３３】そして、本発明の遺伝子の分析方法では、遺伝子と前記ラマン活性物質との重量比について予め検討をおこない、目的とする遺伝子が存在する場合のＳＥＲＳ光強度と存在しない場合の強度とが明確に区別できるようにすることが好ましい。前記重量比は、分析対象となる遺伝子および前記ラマン活性物質の種類等により適宜決定されるものである。例えば、分析対象の遺伝子が二本鎖ＤＮＡであり前記ラマン活性物質がＤＡＰＩである場合、その重量比は、通常、ＤＮＡ／ＤＡＰＩ＝０．１〜０．５である。
【００３４】つぎに、本発明の遺伝子分析用キットは、遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１およびＳＥＲＳ生起基質を含有する試薬Ｒ２を備える。
【００３５】前記試薬Ｒ１は、前記ラマン活性物質の他に、他の成分を含有してもよい。また、前記試薬Ｒ２も、前記ＳＥＲＳ生起基質の他に、例えば、ポリリン酸、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、界面活性剤等の安定化剤を含有してもよい。
【００３６】本発明の遺伝子分析用キットの使用方法は、前述の方法と同様である。このキットを用いれば、予め必要な成分が適量配合されているため、従来のように分析の度に試薬を調製する必要がなくなり、さらに迅速かつ簡単な遺伝子の分析が可能となる。
【００３７】なお、以上の説明において、ＰＣＲにより増幅された二本鎖ＤＮＡを分析対象遺伝子とした例をとりあげたが、本発明はこれに限定するものではなく、この他、ＳＤＡ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＬＣＲ法により増幅された二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、Ｑβ法により増幅されたＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡとＤＮＡの複合体にも適用が可能である。これらの遺伝子を分析する場合も、分析対象の遺伝子に合わせて遺伝子結合性ラマン活性物質を適宜選択して使用する他は、前述と同様の操作を行えばよく、これにより迅速かつ簡単なＲＮＡ等の遺伝子の分析ができる。
【００３８】
【実施例】つぎに、実施例について比較例と併せて説明する。
【００３９】（実施例１）まず、以下に示す成分を精製水に溶解してＰＣＲバッファーを調製した。
【００４０】（ＰＣＲバッファー組成）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３） １００ｍＭＫＣｌ ５００ｍＭＭｇＣｌ2 １５ｍＭ
【００４１】そして、このＰＣＲバッファー１０μｌに下記に示す成分を添加して、ＰＣＲ反応液を調製した。なお、下記のプライマー１、２は、下記のλＤＮＡに対し相補的配列を持つものである。
【００４２】
（配合成分）
ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ、２．５ｍＭ）：８μｌ プライマー１（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：１μｌ 配列：5´−GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT−3´ プライマー２（２０ｐｍｏｌ／μｌ）：１μｌ 配列：5´−CCACATCCATACCGGGTTTCAC−3´ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／μｌ）：０．５μｌ ＤＮＡ（λＤＮＡ、１μｇ／ｍｌ）：１μｌ 蒸留水：７８．５μｌ
【００４３】そして、このＰＣＲ反応液を用い、以下のサイクルでＰＣＲを行った。
【００４４】（ＰＣＲサイクル）
ステップａ（９４℃１０分）：１サイクルステップｂ（９４℃１分）→ステップｃ（６８℃４分）：３０サイクルステップｄ（６８℃７分）：１サイクル
【００４５】つぎに、ＤＮＡ精製を行った。すなわち、まず、得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動（１５０ｍＡ，２時間）にかけ、目的のＤＮＡ画分を分離した。そして、目的とするＤＮＡのバンドがあるゲル部分を切り出した。切り出したゲルを、ＴＢＥバッファーとともに透析チューブに入れてチューブの両端をシーラーで閉じた。この透析チューブを、その長軸が電場の方向と直角方向になるように電気泳動槽内に設置し、槽内をＴＢＥバッファーで満たし、通電した（１５０ｍＡ、３時間）。通電終了後、透析チューブ内のＴＢＥバッファーを回収し、これを遠心管に移し、エタノール沈殿を行った。そして得られた沈殿を蒸留水に溶解し、これを精製ＤＮＡ試料とした。
【００４６】つぎに、得られた精製ＤＮＡ試料２５μｌにＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）１５μｌを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測定試料を調製した。そして、この測定試料について、アルゴンイオンレーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用い、励起波長５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図１のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００４７】なお、図１において、グラフの縦軸のＳＥＲＳ強度は、ＳＥＲＳ光の強度を示し、横軸の波数は、ＳＥＲＳ光の波数を示す。図２、図３、図４および図６のグラフも同様である。
【００４８】（比較例１）ＤＮＡに代えて、蒸留水１μｌを用いた他は、実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、実施例１と同様にして、ＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図１のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００４９】（対照１，２）前記混合液に代えて、ＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-5ｍｏｌ／ｌ）４０μｌを用いた例を対照１とし、また二本鎖ＤＮＡ水溶液４０μｌのみを用いた例を対照２とした。これら対照１、２のその他の条件および操作は、前記実施例と同様である。前記対照１の結果を図３のグラフに、前記対照２の結果を図４R>４のグラフに示す。
【００５０】以上の実施例１、比較例１、対照１、２からつぎのことがいえる。まず、図１のグラフの曲線（ａ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された実施例１では、ほぼ全部のＤＡＰＩがＤＮＡにインターカレートされて極微量のＤＡＰＩしか銀コロイドに捕捉されないため、ＳＥＲＳ光が弱かった。これに対し、同図のグラフの曲線（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されなかった比較例１では、ほぼ全部のＤＡＰＩが銀コロイドに捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定できた。なお、この比較例１のＳＥＲＳ光のピークは、図３のグラフに示す対照１のピークと一致した。また、図４のグラフに示すように、ＤＮＡのみの場合（対照２）では、ＳＥＲＳ光が測定できなかった。これらの結果から、本発明の遺伝子の分析方法により、ＰＣＲ法によりＤＮＡが複製されたか否かが、迅速かつ簡単に判別できるといえる。
【００５１】（実施例２）実施例１と同様にしてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物についてＤＮＡ精製を行った。そして、得られた精製ＤＮＡ試料３５μｌにＤＡＰＩ水溶液（濃度：１０-4ｍｏｌ／ｌ）５μｌを加えて混合した。この混合液に、銀コロイド水溶液（濃度：０．１７ｍｇ／ｍｌ）３６０μｌを加えて、測定試料を調製した。そして、この測定試料について、アルゴンイオンレーザー（レーザー強度：５０ｍＷ）を用い、励起波長５１４．５ｎｍ、露光時間５秒の条件でＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００５２】（比較例２）ＤＮＡに代えて、蒸留水１μｌを用いた他は、実施例２と同様にしてＰＣＲおよびＤＮＡ精製を行い、ついで実施例２と同様にしてＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を、図２のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００５３】以上の実施例２および比較例２の結果からつぎのことがいえる。まず、図２のグラフの曲線（ａ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅された実施例２では、ＤＡＰＩがＤＮＡにほぼ完全にインターカレートされて銀コロイドに捕捉されないため、ＳＥＲＳ光が検出できなかった。これに対し、同図のグラフの曲線（ｂ）に示すように、ＰＣＲによりＤＮＡが増幅されなかった比較例２では、ほぼ全部のＤＡＰＩが銀コロイドに捕捉されて、強いＳＥＲＳ光が測定できた。
【００５４】（実施例３）混合液として、種々濃度のＤＮＡ水溶液２５μｌにＤＡＰＩ水溶液１５μｌを加えて混合したものを用いた他は、実施例１と同様にしてＳＥＲＳ光の測定を行った。その結果を図５のグラフに示す。なお、この図において、縦軸のＳＥＲＳ強度はＳＥＲＳ光の強度であり、横軸はＤＮＡ濃度である。
【００５５】図５のグラフに示すように、ＤＮＡの濃度が増加するにしたがいＳＥＲＳ光の強度が直線的に低下した。このグラフは、検量線として使用できるため、これを用いれば、例えば、ＰＣＲ法において目的ＤＮＡの増幅の判別のみならず、ＰＣＲ産物中のＤＮＡ濃度も測定することが可能となる。
【００５６】（実施例４、比較例２）実施例４では、ＤＮＡの精製を行わないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の測定を行った他は、実施例１と同じ条件で同じ操作を行った。その結果を、図６のグラフの曲線（ａ）に示す。
【００５７】他方、比較例２では、ＤＮＡの精製を行わないＰＣＲ産物についてＳＥＲＳ光の測定を行った他は、比較例１と同じ条件で同じ操作を行った。その結果を、図６のグラフの曲線（ｂ）に示す。
【００５８】図６のグラフに示すように、ＤＮＡが大量に存在する実施例４のＳＥＲＳ光とＤＮＡがほとんど存在しない比較例２のＳＥＲＳ光とを明確に区別することができる。このことから、本発明の遺伝子の分析方法によれば、ＤＮＡ精製を行わないＰＣＲ産物であっても、遺伝子（ＤＮＡ）の分析が可能であるといえる。
【００５９】
【発明の効果】以上のように、本発明の遺伝子の分析方法は、電気泳動法等による従来の遺伝子の検出方法と比べて、迅速かつ簡単に遺伝子の分析を行うことができる。このため、本発明の分析方法を、例えば、ＰＣＲ法に適用すれば、目的とするＤＮＡの増幅を短時間で簡単に確認することができ、つぎの段階の実験への移行を判断することができる。また、本発明の分析方法は、精製を行わないＰＣＲ産物のように、他の物質が混在している試料であっても、遺伝子の分析が可能である。そして、本発明の分析方法は、その操作が単純であるため、分析を自動化することが可能であり、これによりさらに迅速かつ簡単に遺伝子の分析ができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施例のＳＥＲＳ光のグラフである。
【図２】本発明のその他の実施例のＳＥＲＳ光のグラフである。
【図３】ＤＡＰＩのみのＳＥＲＳ光のグラフである。
【図４】ＤＮＡのみのＳＥＲＳ光のグラフである。
【図５】本発明のさらにその他の実施例におけるＳＥＲＳ光とＤＮＡ濃度の関係を示すグラフである。
【図６】本発明のさらにその他の実施例のＳＥＲＳ光のグラフである。
【図７】図（ａ）〜（ｂ）は、本発明の遺伝子の分析方法をＰＣＲに適用した場合の実施例の一連の操作を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質で捕捉し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定する遺伝子の分析方法。
【請求項２】 分析対象となる遺伝子が二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項３】 分析対象試料が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、ストランド ディスプレースメントアンプリフィケーション法（ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料およびリガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料から選択された少なくとも一つの試料である請求項１または２記載の遺伝子の分析方法。
【請求項４】 分析対象となる遺伝子が、リボ核酸（ＲＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項５】 分析対象試料が、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行った試料である請求項１または４記載の遺伝子の分析方法。
【請求項６】 分析対象となる遺伝子が、一本鎖ＤＮＡである請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項７】 分析対象となる遺伝子が、ＲＮＡとＤＮＡの複合体である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項８】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、エチジウムブロマイド、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
【請求項９】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された少なくとも一つである請求項１、４および５のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
【請求項１０】 表面増強ラマン散乱生起基質が、銀コロイド、金コロイド、銅コロイド、電極および金属板からなる群から選択された少なくとも一つの基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
【請求項１１】 遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１と、表面増強ラマン散乱生起基質を含有する試薬Ｒ２とを備える遺伝子分析用キット。
【請求項１】 分析対象試料と、遺伝子結合性ラマン活性物質と、表面増強ラマン散乱生起基質とを準備し、前記試料に前記遺伝子結合性ラマン活性物質および前記表面増強ラマン散乱生起基質を供給し、遺伝子に結合しなかった前記遺伝子結合性ラマン活性物質を前記表面増強ラマン散乱生起基質で捕捉し、この状態で前記遺伝子結合性ラマン活性物質に励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱光を測定する遺伝子の分析方法。
【請求項２】 分析対象となる遺伝子が二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項３】 分析対象試料が、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料、ストランド ディスプレースメントアンプリフィケーション法（ＳＤＡ法）によりＤＮＡの増幅操作を行った試料およびリガーゼチェーンリアクション（ＬＣＲ）法によりＤＮＡの増幅操作を行った試料から選択された少なくとも一つの試料である請求項１または２記載の遺伝子の分析方法。
【請求項４】 分析対象となる遺伝子が、リボ核酸（ＲＮＡ）である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項５】 分析対象試料が、Ｑβレプリカーゼを用いたＲＮＡの増幅方法（Ｑβ法）によりＲＮＡの増幅操作を行った試料である請求項１または４記載の遺伝子の分析方法。
【請求項６】 分析対象となる遺伝子が、一本鎖ＤＮＡである請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項７】 分析対象となる遺伝子が、ＲＮＡとＤＮＡの複合体である請求項１記載の遺伝子の分析方法。
【請求項８】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、エチジウムブロマイド、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された少なくとも一つの物質である請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
【請求項９】 遺伝子結合性ラマン活性物質が、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、ビスベンゾイミドおよびアクリジンオレンジからなる群から選択された少なくとも一つである請求項１、４および５のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
【請求項１０】 表面増強ラマン散乱生起基質が、銀コロイド、金コロイド、銅コロイド、電極および金属板からなる群から選択された少なくとも一つの基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子の分析方法。
【請求項１１】 遺伝子結合性ラマン活性物質を含有する試薬Ｒ１と、表面増強ラマン散乱生起基質を含有する試薬Ｒ２とを備える遺伝子分析用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開平１０−１１７７９７
【公開日】平成１０年（１９９８）５月１２日
【国際特許分類】
【出願番号】特願平８−２８４１５３
【出願日】平成８年（１９９６）１０月２５日
【出願人】（０００１４１８９７）株式会社京都第一科学 (288)
【公開日】平成１０年（１９９８）５月１２日
【国際特許分類】
【出願日】平成８年（１９９６）１０月２５日
【出願人】（０００１４１８９７）株式会社京都第一科学 (288)
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