遺伝子フィンガープリンティング及び同定方法
本開示は、生物の特徴付け及び同定のための分子フィンガープリンティング方法を提供する。より詳細には、一局面において、本発明はサンプル中の生物を同定する方法を提供し、該方法は:（ａ） 生物を含むサンプルを提供すること[該生物は少なくとも１つの核酸を含む］；（ｂ） 該サンプル又は該サンプル由来の少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅ミックスと混合すること；（ｃ） 該少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するヌクレオチド増幅技術を使用して、該生物の少なくとも１つの核酸から少なくとも１つの標識された増幅生成物を生成すること；（ｄ） 該少なくとも１つの標識された増幅生成物をＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合して分離ミックスを作製すること；及び（ｅ） オリゴヌクレオチド長に基づいて蛍光ＤＮＡ配列決定機器で該分離ミックスを分離して、該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを生成することを含む。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６１／２３５，９９９号（２００９年８月２１日出願、これは参照により全体として本明細書に加入される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関し、より詳細には、生物の特徴付け及び同定のための分子フィンガープリンティングの方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
微生物学の分野の中心は、微生物を属、種又は血清型のレベルで確実に同定する能力である。正確な同定は、研究所における必須のツールであるだけでなく、食料品の加工、農産物の製造、及び地下水のような環境媒体のモニタリングにおける微生物混入の管理において重要な役割を果たす。病原性微生物の検出及び管理に最も関心が持たれる。典型的には、病原体同定は表現形の特徴、例えば増殖又は運動性の特徴、並びに免疫学的及び血清学的な特徴について識別するための方法に依存する。選択的増殖手順及び免疫学的方法は、細菌同定に一般的に好まれる伝統的方法であり、そしてこれらは特定の属内の多数の種の推定検出には有効であり得る。しかし、これらの方法は時間を消費し、そして誤りやすい。選択的増殖法は選択培地での培養及び継代培養、続いて経験を積んだ研究者による主観的分析を必要とする。免疫学的検出（例えばＥＬＩＳＡ）はより迅速で特異的であるが、これは生物の相当量の集団及び関連する抗原の単離を必要とする。これらの理由から、核酸配列に基づく細菌性病原体の検出に関心が向けられている。
【０００４】
核酸多型性は、それらの遺伝子構成（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｋｅ ｕｐ）における差異に基づいて種、血清型、系統、変種、品種又は個体を同定するための手段を提供する。核酸多型はヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失により引き起こされ得る。遺伝子多型を決定する能力は、ゲノムマッピング、遺伝的連鎖研究、医療診断、疫学研究、法医学、及び農芸のような分野で幅広い応用を有する。ＤＮＡの相同セグメントを比較して多型が存在するか否かを決定するためのいくつかの方法が開発されている。
【０００５】
遺伝子多型を決定するための１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡを増幅するために任意の配列のプライマーを使用する（非特許文献１；特許文献１、参照により本明細書に加入される）。プライマーは特定の配列を増幅するように設計されていないので、この技術は多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）又は任意プライムＰＣＲ（ＡＰＰＣＲ）と呼ばれる。使用されるプライマーは少なくとも７ヌクレオチド長をである。適切な条件下で、単一のヌクレオチドほどの小さな差異がテンプレートＤＮＡへのプライマーの結合に影響を及ぼし得、その結果、産生された増幅生成物の分布における差異がゲノム間で生じる。
【０００６】
遺伝子多型を同定及びマッピングするための別の方法は増幅断片長多型と呼ばれている（ＡＦＬＰ；特許文献２、参照により本明細書に加入される）。ＡＦＬＰは制限酵素の使用をＰＣＲの使用と組み合わせる。手短には、単一又は一対の制限酵素を用いてゲノムＤＮＡの消化により制限フラグメントを産生させる。一対の酵素が使用される場合、制限酵素の一方が「頻繁なカッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｃｕｔｔｅｒ）」であり、残りの酵素が「稀なカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）」となるように酵素はゲノム中の制限部位の頻度の差異に基づいて対にされる。２つの酵素の使用は単一又は二重の消化フラグメン
トの産生を生じる。次に、１０〜３０塩基の二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプタが生成したフラグメント上に連結される。次いでプライマーをアダプタ及び制限部位の配列に基づいて設計する。制限酵素の対が使用される場合、両方の酵素の作用に起因して生じたフラグメント（二重切断フラグメント）のみが増幅されるように、制限部位に及ぶヌクレオチドをプライマーの３’末端に加える。この方法を使用して、制限部位に又は制限部位の近傍に存在する多型はプライマーの結合に影響を及ぼし、従って増幅生成物の分布に影響を及ぼす。さらに、プライマーに隣接する領域におけるヌクレオチド配列の差異も検出される。ＡＦＬＰは複数のフラグメントの同時共増幅（ｃｏ-ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能にする。
【０００７】
さらなる方法は直接的線形解析（Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＤＬＡ）であり、これは配列特異的タグと結合した個々のＤＮＡ分子を分析する（非特許文献２；特許文献３を参照のこと、参照により本明細書に加入される）。この方法はＤＮＡ中の反復情報を同定することを意図され、これは少なくとも１つのステーションを通して移動され、そこでＤＮＡの標識された単位がステーションと相互作用してＤＮＡ依存性インパルスを生じる。伸長した対象物（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｏｂｊｅｃｔｓ）は類似しているか又は好ましくは同一であり、そして類似しているか又は好ましくは同一の、標識された単位のパターンを含み、相互作用の特徴的なシグナチャーはそれぞれの伸長した対象物が１つ又は複数のステーションを通って移動するにつれて繰り返される。この反復情報は自己相関関数を用いて全体の未加工データから抽出され、次いでＤＮＡについての構造情報を決定するために使用される。
【０００８】
別の方法は反復要素の増幅（ＲＥＰ-ＰＣＲ）である。この技術は、多様な細菌種のゲノム全体にわたって存在する反復ＤＮＡ配列のファミリーに基づくものである（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃらによる総説、非特許文献３）。反復性遺伝子外パリンドローム（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）（ＲＥＰ）配列は細菌ゲノムの構築において重要な役割を果たすと考えられる。ゲノム構築は選択により形作られると考えられており、そして密接に関連する細菌系統のゲノム内のこれらの要素の異なった分散が系統間を区別するために使用され得る（例えば非特許文献４を参照のこと）。ＲＥＰ-ＰＣＲは、これらの反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、それらの間にある可変的なサイズのＤＮＡフラグメントを増幅するために利用する。得られた生成物を電気泳動により分離して各系統に対するＤＮＡ「フィンガープリント」を確立する。
【０００９】
これらのフィンガープリンティングシステムの出力データは一般的に、バンドサイズを割り当てることにより測定されるが、これらの割り当ては、比較のために使用されるサイズ分類ラダー（ｓｉｚｉｎｇ ｌａｄｄｅｒ）に依存していくらか不正確である。さらに、出力データを研究所間で比較することは困難であり得、しばしばデータを扱うために高価な専用のソフトウェアプログラム（例えばＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の使用に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，１２６，２３９号
【特許文献２】米国特許第５，８７４，２１５号
【特許文献３】米国特許第６，２６３，２８６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：６５３１-３５ （１９９０）
【非特許文献２】Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：１１３７-４６ （２００４）
【非特許文献３】Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：２５-４０ （１９９４）
【非特許文献４】Ｌｏｕｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ６０：２２８６-９５ （１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
出願人らは、サイズの小さな差が分解可能であるようにいずれかの増幅ベースのフィンガープリント法からのフィンガープリントバンドをＤＮＡ配列内に埋め込むことにより上述の問題を解決した。フィンガープリント出力はテキストファイル形式で提供され、次いでこれを強力なフリーウェアのバイオインフォマティクスツールにより解析することができる。
【００１３】
一局面は、サンプル中の生物を同定する方法に関するものであり、該方法は：（ａ）生物を含むサンプルを提供すること[該生物は少なくとも１つの核酸を含む］；（ｂ）該サンプル又は該サンプル由来の少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅ミックスと混合すること；（ｃ）該少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するヌクレオチド増幅技術を使用して、該生物の少なくとも１つの核酸から少なくとも１つの標識された増幅生成物を生成すること；（ｄ）該少なくとも１つの標識された増幅生成物をＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合して分離ミックスを作製すること；及び（ｅ）オリゴヌクレオチド長に基づいて蛍光ＤＮＡ配列決定機器で該分離ミックスを分離して、該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを生成することを含む。
【００１４】
いくつかの局面において、本方法は、工程（ｅ）の後に：（ｆ）該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを、既知の生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを含むデータベースと比較すること；及び（ｇ）該データベースとの比較の相関関係（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で該生物を同定することのさらなる工程を含む。
【００１５】
別の局面は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関するものである。
【００１６】
他の目的及び利点は、本明細書以下の詳細な説明を参照すれば当業者に明らかとなるだろう。
【００１７】
配列の概要
配列番号１〜４及び２５は、本発明において有用なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。各プライマーは単独で、又は１つ若しくはそれ以上の他のプライマーとともに使用され得る。例えば、配列番号１〜４はＦＢ１Ｄ１プライマーミックスを生成するために一緒に使用され得、配列番号２５はＦＰ５プライマーとして単独で使用され得る。
【００１８】
配列番号５〜７、１３、及び１４は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセットを使用して得られたネガティブコントロールＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号８〜１２は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセット及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実行によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号１５〜１９は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセット及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実行によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２０〜２４は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセット及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実行によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号２６〜３０は、ＦＰ５プライマーを使用して得られたネガティブコントロールＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号３１〜３５は、ＦＰ５プライマー及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３６〜４０は、ＦＰ５プライマー及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号４１〜４５は、ＦＰ５プライマー及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号４６は、配列番号２１〜２３の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号４７は、配列番号３３〜３５の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号４８は、配列番号９〜１１の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号４９は、配列番号４１、４３、及び４５の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号５０は、配列番号１７〜１９の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号５１は、配列番号３６〜３８の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３２】
これらの配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１-１．８２５（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件-配列規則」）に従っており、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２及び４９．５（ａ-ｂｉｓ）、及び実施細則の細則２０８号及び付属書Ｃ）に従う。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに使用される記号及
び形式は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】実施例１のプライマーミックスＦＢ１Ｄ１からの全ての配列読み込みのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ整列から生じた系統樹を示す。
【図１Ｂ】実施例１の単一プライマーＦＰ５からの全ての配列読み込みのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ整列から生じた系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
出願人らは、本開示における全ての引用される参考文献の内容全体を具体的に組み込む。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、又は最大の好ましい値及び最小の好ましい値のリストのいずれかとして示される場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかに関わらず、いずれかの範囲の上限又は最大の好ましい値といずれかの範囲の下限又は最小の好ましい値との対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。数値の範囲が本明細書に記載される場合、別の記載がなければ、その範囲はその終点、並びにその範囲内の全ての整数及び分数を含むことを意図される。本発明の範囲が範囲を規定する場合に記載される特定の値に限定されるということは意図されない。
【００３５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｏｆ）」により包含される具体的表現を含むことを意図される。同様に、用語「本質的に〜からなる」は、用語「〜からなる」により包含される具体的表現を含むことを意図される。
【００３６】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子を指す。
【００３７】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、精製された制限消化物におけるような天然に存在するものであっても合成的に製造されたものであっても、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及び重合のための薬剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下でかつ適切な温度及びｐＨに置かれた場合に合成の開始点として作用することができる、任意の配列のオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、プライマー又は配列の他のコピーと塩基対合することにより「ヘアピン」構造を形成する二次構造を形成しない配列であることが好ましい。配列は、コンピューターにより都合よく生成することができるか、遺伝子バンクから無作為に選択することができる。プライマーは好ましくは増幅における最大の効率のために一本鎖であるが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物を製造するために使用される前にその鎖を分離するために最初に処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００３８】
本開示において、増幅ベースのフィンガープリント法に使用されるプライマーを蛍光（ｆｌｕｏｒ）で標識する。増幅によるフィンガープリント生成物の生成後に、フィンガープリントアンプリコンを以前に行ったＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合する。次いで混合した生成物を、ＤＮＡ配列を生じさせるために蛍光ＤＮＡ配列決定機器から流す。配列出力は、フィンガープリント生成物がサイズの似ているＤＮＡ配列決定フラグメントと共に移動している位置において摂動を受ける。これらの摂動は、機器からの変更されたＤＮＡ配列出力を生じる。これらの変更は再現性があり、そして出力配列の比較を使用して、そのＤＮＡがフィンガープリンティング方法の影響を受けた生物を特徴付け及び／又は同定することができる。
【００３９】
本明細書に記載される方法により分析しようとする核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、そしてＤＮＡ又はＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。いずれかの供給源の核酸を精製された形態又は未精製の形態で出発核酸として利用することができる。例えば核酸は、ウイルス、細菌、及びより高等な生物、例えば植物、動物、及び微生物を含むいずれかの供給源由来の天然のＤＮＡ又はＲＮＡ由来であっても、クローン化されたＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。さらに、核酸は核酸全体を構成していても、核酸の複雑な混合物の一部であってもよい。好ましくは、核酸はデオキシリボ核酸である。
【００４０】
本明細書に記載される方法は、食物及び同類製品、ワクチン及びウイルス又は細菌に感染したミルク、全血、血清、バフィコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織、並びに細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物）を含む任意の核酸含有出発物質に適用可能である。本方法は、核酸を回収するための別の方法の比較的純粋な入力材料、例えばＰＣＲの生成物又はさらに精製しようとする生成物にも適用可能である。
【００４１】
増幅された核酸生成物を生成する工程は、例えばＲＡＰＤ ＰＣＲ、ＡＦＬＰ ＰＣＲ、ＲＥＰ-ＰＣＲ、又はＤＬＡにより行われ得る。例としてＲＡＰＤを使用して、伸長反応において使用される核酸ポリメラーゼの選択は、テンプレートの性質に依存する。ＤＮＡテンプレート鎖について、適切な市販のＤＮＡポリメラーゼとしては、好熱性細菌サームス・エクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑポリメラーゼ）又は他の耐熱性ポリメラーゼから得られるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。このＤＮＡポリメラーゼ及び他のＤＮＡポリメラーゼの構造変異体及び改変された形態もまた本発明の方法において有用であると期待されるだろう。ＲＮＡテンプレートについては、逆転写酵素も有用であると期待されるＤＮＡポリメラーゼの一例である。ヌクレオシド三リン酸基質（天然又はアナログ）の存在下で、ポリメラーゼはプライマー長を３’方向に伸長する。伸長生成物の配列は、一般的にはテンプレート鎖の対応する配列に対して相補的である。
【００４２】
ヌクレオシド三リン酸基質は、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．-Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ及びＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、ｐｐ．３-１２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（これは参照により加入される）、並びに米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号（両方とも参照により加入される）に記載されるように使用される。基質は種々の実験目的のために当業者に公知の方法で改変され得る。例としては、天然ヌクレオシド三リン酸基質の少なくとも１つを、米国特許第４，８７９，２１４号（参照により加入される）において教示される移動度シフト（ｍｏｂｉｌｉｔｙ-ｓｈｉｆｔｉｎｇ）アナログで置き換えてもよい。
【００４３】
具体的には、Ｍｕｌｌｉｓへの米国特許第４，６８３，２０２号は、核酸又はそれらの混合物中に含有されるいずれかの所望の特定の核酸配列を増幅するための方法に関する。Ｍｕｌｌｉｓの方法は、核酸の別々の相補鎖をモル過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理すること、及びこれらプライマーを伸長して相補的プライマー伸長生成物を形成することを含み、これらは所望の核酸配列を合成するためのテンプレートして作用する。Ｍｕｌｌｉｓのプライマーは、増幅しようとするそれぞれの特定の配列の異なる鎖に対して十分相補的であるように設計される。反応工程は段階的に行われても同時に行われてもよく、そして望まれるだけ頻繁に繰り返してもよい。
【００４４】
一実施態様において、７つのヌクレオチドより長い少なくとも１つのプライマーが提供される。プライマーは当業者に公知の標準的な技術により合成することができる。いくつ
かの実施態様において、９〜１０ヌクレオチド長の少なくとも１つのプライマーが使用される。１つのプライマーが都合よく使用される。少なくとも１つのプライマーが好ましくはフルオロフォアで標識され、このフルオロフォアは、例えばｄＲ６Ｇ、ｄＲ１１０、ｄＴＡＭＲＡ、ｄＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＬＩＺ、６-ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＤｙｅＭｅｒ４８８／６１５、ＤｙｅＭｅｒ４８８／６３０、ＰＥ-ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＥＣＤ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０ＲＰＥ、ＦＩＴＣ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、又はＱｄｏｔ５２５であり得る。他のフルオロフォアも使用され得る。
【００４５】
いくつかの実施態様において、核酸を本明細書に記載されるような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる。伸長生成物を、そこで伸長生成物が合成された相補的でランダムな核酸から解離させて一本鎖分子を生成させ；そして、テンプレートとして産生された一本鎖（すなわち、解離した伸長生成物）を使用して増幅伸長生成物が合成されるように、例えばＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ及び米国特許第４，６８３，２０２号に開示される条件下で上記からのプライマーと一本鎖伸長生成物を接触させることにより、ランダムな核酸セグメントを増幅する。
【００４６】
次いで混合された生成物を蛍光ＤＮＡ配列決定機器から流してＤＮＡ配列を生成させる。配列出力は、フィンガープリント生成物がサイズの似ているＤＮＡ配列決定フラグメントと共に移動している位置において摂動を受ける。これらの摂動は、機器からの変更されたＤＮＡ配列出力を生じる。これらの変更は再現性があり、そして出力配列の比較を使用して、そのＤＮＡがフィンガープリンティング方法の影響を受けた生物を強力なフリーウェアの配列解析ツール（例えばＢＬＡＳＴ及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗ）を使用して特徴付け及び／又は同定することができる。
【００４７】
本明細書に開示される方法を使用して核酸「フィンガープリント」を構築することができる。このようなフィンガープリントは個々の生物に特異的であり、そして個々の生物の同定又は識別の問題に適用され得る。ちょうどＪｅｆｆｒｅｙｓ，Ａ．Ｊ．，「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ-Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ‘Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ’ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ」， Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７６-７９（１９８５）（参照により本明細書に加入される）においてフィンガープリントを作製するために多型が使用されるように、このようなフィンガープリントは、異なるプライマーにより生成された複数の多型を使用して構築され、そして本発明により検出されるだろう。すなわち、ゲノムを多型の欠如の存在について比較する。
【００４８】
いくつかの実施態様において、増幅生成物を生成する工程及び増幅生成物をオリゴヌクレオチドサイズラダー（ｓｉｚｅ ｌａｄｄｅｒ）と混合した後に増幅プロフィールを生成させる工程は、最初の実施により生成されたものと比較して異なる増幅プロフィールを生じさせるように、この過程を経る最初の実施の条件と比較して異なるストリンジェンシー条件で繰り返すことができる。複数回の反復は当然のことながら可能である。
【実施例】
【００４９】
本発明は以下の実施例においてさらに明確にされる。当然のことながら、これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、例としてのみ示される。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確認することができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途及び条件に適合させるために種々の変更及び改変を行うことができる。
【００５０】
実施例１
本発明の手段により、標識された増幅ベースのフィンガープリンティング生成物を検出し、そしてＤＮＡ配列内に再現性良く配置することができるという仮説を、多型ＤＮＡの
ランダム増幅（ＲＡＰＤ）フィンガープリンティングを使用し、フィンガープリンティング生成物を生成させて試験した。５’末端をＦＡＭ蛍光（ｆｌｕｏｒ）で標識された４つのプライマーの混合物（集合的にプライマーミックスＦＢ１Ｄ１として知られる）及び単一プライマーＦＰ５を使用してＰＣＲを行った（表１を参照のこと）。
【００５１】
【表１】
【００５２】
プライマーミックスＦＢ１Ｄ１について、各プライマーは、３０μｌの総反応体積でポリメラーゼ連鎖反応を行うために必要な他の成分（ヌクレオチド、ポリメラーゼ、緩衝液）の存在下で０．２５μＭの濃度で反応中に存在した；単一プライマーＦＰ５については、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な他の成分の存在下で、３０μｌの総反応体積にて０．１μＭの濃度で反応中に存在した。
【００５３】
反応あたり３０ｎｇの濃度で３つの様々な生物（１つの酵母、１つのグラム陽性菌及び１つのグラム陰性菌（表２））からの精製された微生物ＤＮＡを加えて、又は加えずに（ネガティブコントロール）、いずれかで反応を行った。ネガティブコントロール及び微生物ＤＮＡの各々についてそれぞれ５回反復して実行した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
２分９５℃で保持、続いて９５℃で１５秒、４０℃で５分、そして７０℃で１分を１０サイクル、続いて９５℃で１５秒及び７０℃で３分を３０サイクルを使用してＰＣＲを行った。
【００５６】
ＰＣＲ反応生成物をキャピラリー電気泳動配列装置にロードする前にＤＮＡ配列反応のために必要に応じて浄化し、そのときにＰＣＲ生成物を１５μｌ体積のＨ2Ｏ中に回収した。
【００５７】
次いで２μｌアリコートのＰＣＲ生成物を脱イオン水２０μｌに加えた。市販の配列標準（ｈｓｐ ６０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を以下のように準備した。１μｌアリコートの配列標準をホルムアミド９μｌ（ＨｉＤｉ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合した。次いで希釈したＰＣＲ生成物１．５μｌを配列標準／ホルムアミド溶液１０μｌに加えた。次いでサンプルを混合し、標準配列決定反応に関して変性し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ配列決定装置にロードし、そして標準的なＤＮＡ配列決定条件を使用して実行した。次いで標準的なＤＮＡ配列解析ツールを使用して出力配列ファイルを解析した。
【００５８】
ある群に属するとして生物を特徴付けする（キャラクタリゼーション）本発明の能力を試験するために、これらの配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ウェブサーバー）を使用して調べた。実施例１のプライマーミックスＦＢ１Ｄ１及び単一プライマーＦＰ５から生じた配列の二組の整列を表３Ａ及び３Ｂに示し、そして得られた系統樹を図１Ａ及び１Ｂに示す。仮定したとおり、ＲＡＰＤフィンガープリンティング反応からのＰＣＲ生成物の混合に起因する配列の摂動が、機器からの配列出力における変化として検出された。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ整列は、単一の生物クラスターからの複製サンプルを一緒に示し、非同一微生物についてのクラスターとは別々にされている。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
【表７】
【００６４】
【表８】
【００６５】
【表９】
【００６６】
【表１０】
【００６７】
【表１１】
【００６８】
【表１２】
【００６９】
【表１３】
【００７０】
【表１４】
【００７１】
【表１５】
【００７２】
【表１６】
【００７３】
【表１７】
【００７４】
【表１８】
【００７５】
【表１９】
【００７６】
データベースとの比較により同定の手段を提供する本発明の能力を試験するために、各微生物について生成された配列に埋め込まれたフィンガープリントの最初の３つ（番号１〜３）を、その生物についてのコンセンサスフィンガープリント配列を製造するために使用した（表４〜６）。次いでこれらのコンセンサス配列を、ＢＬＡＳＴデータベース（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェブサーバー）を作製するために使用した。各生物についての第五の配列に埋め込まれたフィンガープリント（番号５）をデータベースにクエリーを行うために使用した。得られたｂｌａｓｔスコア（表７〜９）は、ＢＬＡＳＴプログラムの比較により、各微生物の配列に埋め込まれたフィンガープリントが正しい種に属すると同定される（最も高い総スコア）ということを示す。
【００７７】
【表２０】
【００７８】
【表２１】
【００７９】
【表２２】
【００８０】
【表２３】
【００８１】
【表２４】
【００８２】
【表２５】
【００８３】
【表２６】
【００８４】
【表２７】
【００８５】
【表２８】
【００８６】
【表２９】
【００８７】
【表３０】
【００８８】
【表３１】
【００８９】
【表３２】
【００９０】
【表３３】
【００９１】
【表３４】
【００９２】
【表３５】
【００９３】
【表３６】
【００９４】
【表３７】
【００９５】
【表３８】
【００９６】
【表３９】
【００９７】
【表４０】
【００９８】
【表４１】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願第６１／２３５，９９９号（２００９年８月２１日出願、これは参照により全体として本明細書に加入される）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は分子生物学の分野に関し、より詳細には、生物の特徴付け及び同定のための分子フィンガープリンティングの方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
微生物学の分野の中心は、微生物を属、種又は血清型のレベルで確実に同定する能力である。正確な同定は、研究所における必須のツールであるだけでなく、食料品の加工、農産物の製造、及び地下水のような環境媒体のモニタリングにおける微生物混入の管理において重要な役割を果たす。病原性微生物の検出及び管理に最も関心が持たれる。典型的には、病原体同定は表現形の特徴、例えば増殖又は運動性の特徴、並びに免疫学的及び血清学的な特徴について識別するための方法に依存する。選択的増殖手順及び免疫学的方法は、細菌同定に一般的に好まれる伝統的方法であり、そしてこれらは特定の属内の多数の種の推定検出には有効であり得る。しかし、これらの方法は時間を消費し、そして誤りやすい。選択的増殖法は選択培地での培養及び継代培養、続いて経験を積んだ研究者による主観的分析を必要とする。免疫学的検出（例えばＥＬＩＳＡ）はより迅速で特異的であるが、これは生物の相当量の集団及び関連する抗原の単離を必要とする。これらの理由から、核酸配列に基づく細菌性病原体の検出に関心が向けられている。
【０００４】
核酸多型性は、それらの遺伝子構成（ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｋｅ ｕｐ）における差異に基づいて種、血清型、系統、変種、品種又は個体を同定するための手段を提供する。核酸多型はヌクレオチドの置換、挿入、又は欠失により引き起こされ得る。遺伝子多型を決定する能力は、ゲノムマッピング、遺伝的連鎖研究、医療診断、疫学研究、法医学、及び農芸のような分野で幅広い応用を有する。ＤＮＡの相同セグメントを比較して多型が存在するか否かを決定するためのいくつかの方法が開発されている。
【０００５】
遺伝子多型を決定するための１つの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＤＮＡを増幅するために任意の配列のプライマーを使用する（非特許文献１；特許文献１、参照により本明細書に加入される）。プライマーは特定の配列を増幅するように設計されていないので、この技術は多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）又は任意プライムＰＣＲ（ＡＰＰＣＲ）と呼ばれる。使用されるプライマーは少なくとも７ヌクレオチド長をである。適切な条件下で、単一のヌクレオチドほどの小さな差異がテンプレートＤＮＡへのプライマーの結合に影響を及ぼし得、その結果、産生された増幅生成物の分布における差異がゲノム間で生じる。
【０００６】
遺伝子多型を同定及びマッピングするための別の方法は増幅断片長多型と呼ばれている（ＡＦＬＰ；特許文献２、参照により本明細書に加入される）。ＡＦＬＰは制限酵素の使用をＰＣＲの使用と組み合わせる。手短には、単一又は一対の制限酵素を用いてゲノムＤＮＡの消化により制限フラグメントを産生させる。一対の酵素が使用される場合、制限酵素の一方が「頻繁なカッター（ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｃｕｔｔｅｒ）」であり、残りの酵素が「稀なカッター（ｒａｒｅ ｃｕｔｔｅｒ）」となるように酵素はゲノム中の制限部位の頻度の差異に基づいて対にされる。２つの酵素の使用は単一又は二重の消化フラグメン
トの産生を生じる。次に、１０〜３０塩基の二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプタが生成したフラグメント上に連結される。次いでプライマーをアダプタ及び制限部位の配列に基づいて設計する。制限酵素の対が使用される場合、両方の酵素の作用に起因して生じたフラグメント（二重切断フラグメント）のみが増幅されるように、制限部位に及ぶヌクレオチドをプライマーの３’末端に加える。この方法を使用して、制限部位に又は制限部位の近傍に存在する多型はプライマーの結合に影響を及ぼし、従って増幅生成物の分布に影響を及ぼす。さらに、プライマーに隣接する領域におけるヌクレオチド配列の差異も検出される。ＡＦＬＰは複数のフラグメントの同時共増幅（ｃｏ-ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を可能にする。
【０００７】
さらなる方法は直接的線形解析（Ｄｉｒｅｃｔ Ｌｉｎｅａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＤＬＡ）であり、これは配列特異的タグと結合した個々のＤＮＡ分子を分析する（非特許文献２；特許文献３を参照のこと、参照により本明細書に加入される）。この方法はＤＮＡ中の反復情報を同定することを意図され、これは少なくとも１つのステーションを通して移動され、そこでＤＮＡの標識された単位がステーションと相互作用してＤＮＡ依存性インパルスを生じる。伸長した対象物（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｏｂｊｅｃｔｓ）は類似しているか又は好ましくは同一であり、そして類似しているか又は好ましくは同一の、標識された単位のパターンを含み、相互作用の特徴的なシグナチャーはそれぞれの伸長した対象物が１つ又は複数のステーションを通って移動するにつれて繰り返される。この反復情報は自己相関関数を用いて全体の未加工データから抽出され、次いでＤＮＡについての構造情報を決定するために使用される。
【０００８】
別の方法は反復要素の増幅（ＲＥＰ-ＰＣＲ）である。この技術は、多様な細菌種のゲノム全体にわたって存在する反復ＤＮＡ配列のファミリーに基づくものである（Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃらによる総説、非特許文献３）。反復性遺伝子外パリンドローム（Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｔｒａｇｅｎｉｃ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ）（ＲＥＰ）配列は細菌ゲノムの構築において重要な役割を果たすと考えられる。ゲノム構築は選択により形作られると考えられており、そして密接に関連する細菌系統のゲノム内のこれらの要素の異なった分散が系統間を区別するために使用され得る（例えば非特許文献４を参照のこと）。ＲＥＰ-ＰＣＲは、これらの反復配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、それらの間にある可変的なサイズのＤＮＡフラグメントを増幅するために利用する。得られた生成物を電気泳動により分離して各系統に対するＤＮＡ「フィンガープリント」を確立する。
【０００９】
これらのフィンガープリンティングシステムの出力データは一般的に、バンドサイズを割り当てることにより測定されるが、これらの割り当ては、比較のために使用されるサイズ分類ラダー（ｓｉｚｉｎｇ ｌａｄｄｅｒ）に依存していくらか不正確である。さらに、出力データを研究所間で比較することは困難であり得、しばしばデータを扱うために高価な専用のソフトウェアプログラム（例えばＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈｓ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）の使用に依存する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第５，１２６，２３９号
【特許文献２】米国特許第５，８７４，２１５号
【特許文献３】米国特許第６，２６３，２８６号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：６５３１-３５ （１９９０）
【非特許文献２】Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １４：１１３７-４６ （２００４）
【非特許文献３】Ｖｅｒｓａｌｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：２５-４０ （１９９４）
【非特許文献４】Ｌｏｕｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏ． ６０：２２８６-９５ （１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
出願人らは、サイズの小さな差が分解可能であるようにいずれかの増幅ベースのフィンガープリント法からのフィンガープリントバンドをＤＮＡ配列内に埋め込むことにより上述の問題を解決した。フィンガープリント出力はテキストファイル形式で提供され、次いでこれを強力なフリーウェアのバイオインフォマティクスツールにより解析することができる。
【００１３】
一局面は、サンプル中の生物を同定する方法に関するものであり、該方法は：（ａ）生物を含むサンプルを提供すること[該生物は少なくとも１つの核酸を含む］；（ｂ）該サンプル又は該サンプル由来の少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅ミックスと混合すること；（ｃ）該少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するヌクレオチド増幅技術を使用して、該生物の少なくとも１つの核酸から少なくとも１つの標識された増幅生成物を生成すること；（ｄ）該少なくとも１つの標識された増幅生成物をＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合して分離ミックスを作製すること；及び（ｅ）オリゴヌクレオチド長に基づいて蛍光ＤＮＡ配列決定機器で該分離ミックスを分離して、該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを生成することを含む。
【００１４】
いくつかの局面において、本方法は、工程（ｅ）の後に：（ｆ）該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを、既知の生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを含むデータベースと比較すること；及び（ｇ）該データベースとの比較の相関関係（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）で該生物を同定することのさらなる工程を含む。
【００１５】
別の局面は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチドに関するものである。
【００１６】
他の目的及び利点は、本明細書以下の詳細な説明を参照すれば当業者に明らかとなるだろう。
【００１７】
配列の概要
配列番号１〜４及び２５は、本発明において有用なオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。各プライマーは単独で、又は１つ若しくはそれ以上の他のプライマーとともに使用され得る。例えば、配列番号１〜４はＦＢ１Ｄ１プライマーミックスを生成するために一緒に使用され得、配列番号２５はＦＰ５プライマーとして単独で使用され得る。
【００１８】
配列番号５〜７、１３、及び１４は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセットを使用して得られたネガティブコントロールＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００１９】
配列番号８〜１２は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセット及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実行によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２０】
配列番号１５〜１９は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセット及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実行によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２１】
配列番号２０〜２４は、ＦＢ１Ｄ１プライマーセット及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実行によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号２６〜３０は、ＦＰ５プライマーを使用して得られたネガティブコントロールＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号３１〜３５は、ＦＰ５プライマー及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号３６〜４０は、ＦＰ５プライマー及びサルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２５】
配列番号４１〜４５は、ＦＰ５プライマー及び出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＤＮＡを使用して得られたＰＣＲ反応を用いた本発明の方法の実施によって生じたヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号４６は、配列番号２１〜２３の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２７】
配列番号４７は、配列番号３３〜３５の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号４８は、配列番号９〜１１の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列番号４９は、配列番号４１、４３、及び４５の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号５０は、配列番号１７〜１９の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列番号５１は、配列番号３６〜３８の配列比較により得られたコンセンサスヌクレオチド配列である。
【００３２】
これらの配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§§１．８２１-１．８２５（「ヌクレオチド配列及び／又はアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件-配列規則」）に従っており、そして世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）並びにＥＰＯ及びＰＣＴの配列リスト要件（規則５．２及び４９．５（ａ-ｂｉｓ）、及び実施細則の細則２０８号及び付属書Ｃ）に従う。ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列データに使用される記号及
び形式は３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載される規則に従う。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】実施例１のプライマーミックスＦＢ１Ｄ１からの全ての配列読み込みのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ整列から生じた系統樹を示す。
【図１Ｂ】実施例１の単一プライマーＦＰ５からの全ての配列読み込みのＣｌｕｓｔａｌ Ｗ整列から生じた系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
出願人らは、本開示における全ての引用される参考文献の内容全体を具体的に組み込む。さらに、量、濃度又は他の値若しくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、又は最大の好ましい値及び最小の好ましい値のリストのいずれかとして示される場合、これは、範囲が別々に開示されているかどうかに関わらず、いずれかの範囲の上限又は最大の好ましい値といずれかの範囲の下限又は最小の好ましい値との対から形成される全ての範囲を具体的に開示すると理解されるべきである。数値の範囲が本明細書に記載される場合、別の記載がなければ、その範囲はその終点、並びにその範囲内の全ての整数及び分数を含むことを意図される。本発明の範囲が範囲を規定する場合に記載される特定の値に限定されるということは意図されない。
【００３５】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｏｆ）」により包含される具体的表現を含むことを意図される。同様に、用語「本質的に〜からなる」は、用語「〜からなる」により包含される具体的表現を含むことを意図される。
【００３６】
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ又はそれ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから構成される分子を指す。
【００３７】
本明細書で使用される用語「プライマー」は、精製された制限消化物におけるような天然に存在するものであっても合成的に製造されたものであっても、核酸鎖に対して相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわちヌクレオチド及び重合のための薬剤（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の存在下でかつ適切な温度及びｐＨに置かれた場合に合成の開始点として作用することができる、任意の配列のオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、プライマー又は配列の他のコピーと塩基対合することにより「ヘアピン」構造を形成する二次構造を形成しない配列であることが好ましい。配列は、コンピューターにより都合よく生成することができるか、遺伝子バンクから無作為に選択することができる。プライマーは好ましくは増幅における最大の効率のために一本鎖であるが、あるいは二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは伸長生成物を製造するために使用される前にその鎖を分離するために最初に処理される。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。
【００３８】
本開示において、増幅ベースのフィンガープリント法に使用されるプライマーを蛍光（ｆｌｕｏｒ）で標識する。増幅によるフィンガープリント生成物の生成後に、フィンガープリントアンプリコンを以前に行ったＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合する。次いで混合した生成物を、ＤＮＡ配列を生じさせるために蛍光ＤＮＡ配列決定機器から流す。配列出力は、フィンガープリント生成物がサイズの似ているＤＮＡ配列決定フラグメントと共に移動している位置において摂動を受ける。これらの摂動は、機器からの変更されたＤＮＡ配列出力を生じる。これらの変更は再現性があり、そして出力配列の比較を使用して、そのＤＮＡがフィンガープリンティング方法の影響を受けた生物を特徴付け及び／又は同定することができる。
【００３９】
本明細書に記載される方法により分析しようとする核酸はＤＮＡでもＲＮＡでもよく、そしてＤＮＡ又はＲＮＡは二本鎖でも一本鎖でもよい。いずれかの供給源の核酸を精製された形態又は未精製の形態で出発核酸として利用することができる。例えば核酸は、ウイルス、細菌、及びより高等な生物、例えば植物、動物、及び微生物を含むいずれかの供給源由来の天然のＤＮＡ又はＲＮＡ由来であっても、クローン化されたＤＮＡ又はＲＮＡであってもよい。さらに、核酸は核酸全体を構成していても、核酸の複雑な混合物の一部であってもよい。好ましくは、核酸はデオキシリボ核酸である。
【００４０】
本明細書に記載される方法は、食物及び同類製品、ワクチン及びウイルス又は細菌に感染したミルク、全血、血清、バフィコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織、並びに細胞培養物（例えば哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物）を含む任意の核酸含有出発物質に適用可能である。本方法は、核酸を回収するための別の方法の比較的純粋な入力材料、例えばＰＣＲの生成物又はさらに精製しようとする生成物にも適用可能である。
【００４１】
増幅された核酸生成物を生成する工程は、例えばＲＡＰＤ ＰＣＲ、ＡＦＬＰ ＰＣＲ、ＲＥＰ-ＰＣＲ、又はＤＬＡにより行われ得る。例としてＲＡＰＤを使用して、伸長反応において使用される核酸ポリメラーゼの選択は、テンプレートの性質に依存する。ＤＮＡテンプレート鎖について、適切な市販のＤＮＡポリメラーゼとしては、好熱性細菌サームス・エクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（Ｔａｑポリメラーゼ）又は他の耐熱性ポリメラーゼから得られるＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。このＤＮＡポリメラーゼ及び他のＤＮＡポリメラーゼの構造変異体及び改変された形態もまた本発明の方法において有用であると期待されるだろう。ＲＮＡテンプレートについては、逆転写酵素も有用であると期待されるＤＮＡポリメラーゼの一例である。ヌクレオシド三リン酸基質（天然又はアナログ）の存在下で、ポリメラーゼはプライマー長を３’方向に伸長する。伸長生成物の配列は、一般的にはテンプレート鎖の対応する配列に対して相補的である。
【００４２】
ヌクレオシド三リン酸基質は、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓ，Ｄ．Ｈ．Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｊ．-Ｊ．Ｓｎｉｎｓｋｙ及びＴ．Ｊ．Ｗｈｉｔｅ編、ｐｐ．３-１２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（これは参照により加入される）、並びに米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号（両方とも参照により加入される）に記載されるように使用される。基質は種々の実験目的のために当業者に公知の方法で改変され得る。例としては、天然ヌクレオシド三リン酸基質の少なくとも１つを、米国特許第４，８７９，２１４号（参照により加入される）において教示される移動度シフト（ｍｏｂｉｌｉｔｙ-ｓｈｉｆｔｉｎｇ）アナログで置き換えてもよい。
【００４３】
具体的には、Ｍｕｌｌｉｓへの米国特許第４，６８３，２０２号は、核酸又はそれらの混合物中に含有されるいずれかの所望の特定の核酸配列を増幅するための方法に関する。Ｍｕｌｌｉｓの方法は、核酸の別々の相補鎖をモル過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーで処理すること、及びこれらプライマーを伸長して相補的プライマー伸長生成物を形成することを含み、これらは所望の核酸配列を合成するためのテンプレートして作用する。Ｍｕｌｌｉｓのプライマーは、増幅しようとするそれぞれの特定の配列の異なる鎖に対して十分相補的であるように設計される。反応工程は段階的に行われても同時に行われてもよく、そして望まれるだけ頻繁に繰り返してもよい。
【００４４】
一実施態様において、７つのヌクレオチドより長い少なくとも１つのプライマーが提供される。プライマーは当業者に公知の標準的な技術により合成することができる。いくつ
かの実施態様において、９〜１０ヌクレオチド長の少なくとも１つのプライマーが使用される。１つのプライマーが都合よく使用される。少なくとも１つのプライマーが好ましくはフルオロフォアで標識され、このフルオロフォアは、例えばｄＲ６Ｇ、ｄＲ１１０、ｄＴＡＭＲＡ、ｄＲＯＸ、ＶＩＣ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＬＩＺ、６-ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＤｙｅＭｅｒ４８８／６１５、ＤｙｅＭｅｒ４８８／６３０、ＰＥ-ＴｅｘａｓＲｅｄ、ＥＣＤ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０ＲＰＥ、ＦＩＴＣ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８、又はＱｄｏｔ５２５であり得る。他のフルオロフォアも使用され得る。
【００４５】
いくつかの実施態様において、核酸を本明細書に記載されるような少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる。伸長生成物を、そこで伸長生成物が合成された相補的でランダムな核酸から解離させて一本鎖分子を生成させ；そして、テンプレートとして産生された一本鎖（すなわち、解離した伸長生成物）を使用して増幅伸長生成物が合成されるように、例えばＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ及び米国特許第４，６８３，２０２号に開示される条件下で上記からのプライマーと一本鎖伸長生成物を接触させることにより、ランダムな核酸セグメントを増幅する。
【００４６】
次いで混合された生成物を蛍光ＤＮＡ配列決定機器から流してＤＮＡ配列を生成させる。配列出力は、フィンガープリント生成物がサイズの似ているＤＮＡ配列決定フラグメントと共に移動している位置において摂動を受ける。これらの摂動は、機器からの変更されたＤＮＡ配列出力を生じる。これらの変更は再現性があり、そして出力配列の比較を使用して、そのＤＮＡがフィンガープリンティング方法の影響を受けた生物を強力なフリーウェアの配列解析ツール（例えばＢＬＡＳＴ及びＣｌｕｓｔａｌ Ｗ）を使用して特徴付け及び／又は同定することができる。
【００４７】
本明細書に開示される方法を使用して核酸「フィンガープリント」を構築することができる。このようなフィンガープリントは個々の生物に特異的であり、そして個々の生物の同定又は識別の問題に適用され得る。ちょうどＪｅｆｆｒｅｙｓ，Ａ．Ｊ．，「Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ-Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ‘Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ’ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ＤＮＡ」， Ｎａｔｕｒｅ ３１６：７６-７９（１９８５）（参照により本明細書に加入される）においてフィンガープリントを作製するために多型が使用されるように、このようなフィンガープリントは、異なるプライマーにより生成された複数の多型を使用して構築され、そして本発明により検出されるだろう。すなわち、ゲノムを多型の欠如の存在について比較する。
【００４８】
いくつかの実施態様において、増幅生成物を生成する工程及び増幅生成物をオリゴヌクレオチドサイズラダー（ｓｉｚｅ ｌａｄｄｅｒ）と混合した後に増幅プロフィールを生成させる工程は、最初の実施により生成されたものと比較して異なる増幅プロフィールを生じさせるように、この過程を経る最初の実施の条件と比較して異なるストリンジェンシー条件で繰り返すことができる。複数回の反復は当然のことながら可能である。
【実施例】
【００４９】
本発明は以下の実施例においてさらに明確にされる。当然のことながら、これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、例としてのみ示される。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の好ましい特徴を確認することができ、そしてその精神及び範囲から逸脱することなく、本発明を種々の用途及び条件に適合させるために種々の変更及び改変を行うことができる。
【００５０】
実施例１
本発明の手段により、標識された増幅ベースのフィンガープリンティング生成物を検出し、そしてＤＮＡ配列内に再現性良く配置することができるという仮説を、多型ＤＮＡの
ランダム増幅（ＲＡＰＤ）フィンガープリンティングを使用し、フィンガープリンティング生成物を生成させて試験した。５’末端をＦＡＭ蛍光（ｆｌｕｏｒ）で標識された４つのプライマーの混合物（集合的にプライマーミックスＦＢ１Ｄ１として知られる）及び単一プライマーＦＰ５を使用してＰＣＲを行った（表１を参照のこと）。
【００５１】
【表１】
【００５２】
プライマーミックスＦＢ１Ｄ１について、各プライマーは、３０μｌの総反応体積でポリメラーゼ連鎖反応を行うために必要な他の成分（ヌクレオチド、ポリメラーゼ、緩衝液）の存在下で０．２５μＭの濃度で反応中に存在した；単一プライマーＦＰ５については、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な他の成分の存在下で、３０μｌの総反応体積にて０．１μＭの濃度で反応中に存在した。
【００５３】
反応あたり３０ｎｇの濃度で３つの様々な生物（１つの酵母、１つのグラム陽性菌及び１つのグラム陰性菌（表２））からの精製された微生物ＤＮＡを加えて、又は加えずに（ネガティブコントロール）、いずれかで反応を行った。ネガティブコントロール及び微生物ＤＮＡの各々についてそれぞれ５回反復して実行した。
【００５４】
【表２】
【００５５】
２分９５℃で保持、続いて９５℃で１５秒、４０℃で５分、そして７０℃で１分を１０サイクル、続いて９５℃で１５秒及び７０℃で３分を３０サイクルを使用してＰＣＲを行った。
【００５６】
ＰＣＲ反応生成物をキャピラリー電気泳動配列装置にロードする前にＤＮＡ配列反応のために必要に応じて浄化し、そのときにＰＣＲ生成物を１５μｌ体積のＨ2Ｏ中に回収した。
【００５７】
次いで２μｌアリコートのＰＣＲ生成物を脱イオン水２０μｌに加えた。市販の配列標準（ｈｓｐ ６０，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を以下のように準備した。１μｌアリコートの配列標準をホルムアミド９μｌ（ＨｉＤｉ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合した。次いで希釈したＰＣＲ生成物１．５μｌを配列標準／ホルムアミド溶液１０μｌに加えた。次いでサンプルを混合し、標準配列決定反応に関して変性し、そしてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ ＤＮＡ配列決定装置にロードし、そして標準的なＤＮＡ配列決定条件を使用して実行した。次いで標準的なＤＮＡ配列解析ツールを使用して出力配列ファイルを解析した。
【００５８】
ある群に属するとして生物を特徴付けする（キャラクタリゼーション）本発明の能力を試験するために、これらの配列をＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラム（欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ウェブサーバー）を使用して調べた。実施例１のプライマーミックスＦＢ１Ｄ１及び単一プライマーＦＰ５から生じた配列の二組の整列を表３Ａ及び３Ｂに示し、そして得られた系統樹を図１Ａ及び１Ｂに示す。仮定したとおり、ＲＡＰＤフィンガープリンティング反応からのＰＣＲ生成物の混合に起因する配列の摂動が、機器からの配列出力における変化として検出された。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ整列は、単一の生物クラスターからの複製サンプルを一緒に示し、非同一微生物についてのクラスターとは別々にされている。
【００５９】
【表３】
【００６０】
【表４】
【００６１】
【表５】
【００６２】
【表６】
【００６３】
【表７】
【００６４】
【表８】
【００６５】
【表９】
【００６６】
【表１０】
【００６７】
【表１１】
【００６８】
【表１２】
【００６９】
【表１３】
【００７０】
【表１４】
【００７１】
【表１５】
【００７２】
【表１６】
【００７３】
【表１７】
【００７４】
【表１８】
【００７５】
【表１９】
【００７６】
データベースとの比較により同定の手段を提供する本発明の能力を試験するために、各微生物について生成された配列に埋め込まれたフィンガープリントの最初の３つ（番号１〜３）を、その生物についてのコンセンサスフィンガープリント配列を製造するために使用した（表４〜６）。次いでこれらのコンセンサス配列を、ＢＬＡＳＴデータベース（ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴウェブサーバー）を作製するために使用した。各生物についての第五の配列に埋め込まれたフィンガープリント（番号５）をデータベースにクエリーを行うために使用した。得られたｂｌａｓｔスコア（表７〜９）は、ＢＬＡＳＴプログラムの比較により、各微生物の配列に埋め込まれたフィンガープリントが正しい種に属すると同定される（最も高い総スコア）ということを示す。
【００７７】
【表２０】
【００７８】
【表２１】
【００７９】
【表２２】
【００８０】
【表２３】
【００８１】
【表２４】
【００８２】
【表２５】
【００８３】
【表２６】
【００８４】
【表２７】
【００８５】
【表２８】
【００８６】
【表２９】
【００８７】
【表３０】
【００８８】
【表３１】
【００８９】
【表３２】
【００９０】
【表３３】
【００９１】
【表３４】
【００９２】
【表３５】
【００９３】
【表３６】
【００９４】
【表３７】
【００９５】
【表３８】
【００９６】
【表３９】
【００９７】
【表４０】
【００９８】
【表４１】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生物を同定する方法であって：
（ａ） 生物を含むサンプルを提供すること［該生物は少なくとも１つの核酸を含む］；
（ｂ） 該サンプル又は該サンプル由来の少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅ミックスと混合すること；
（ｃ） 該少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するヌクレオチド増幅技術を使用して、該生物の少なくとも１つの核酸から少なくとも１つの標識された増幅生成物を生成すること；
（ｄ） 該少なくとも１つの標識された増幅生成物をＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合して分離ミックスを作製すること；及び
（ｅ） オリゴヌクレオチド長に基づいて蛍光ＤＮＡ配列決定機器で該分離ミックスを分離して、該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを生成すること
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ｅ）の後に：
（ｆ） 該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを、既知の生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを含むデータベースと比較すること；及び
（ｇ） 該データベースとの比較の相関関係で該生物を同定すること
のさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物が微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生物が未知のものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチド増幅技術が多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの核酸がＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）の後に、工程（ｃ）〜（ｅ）を経る最初の実施のストリンジェンシー条件と比較して異なるストリンジェンシー条件で工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返して、工程（ｃ）〜（ｅ）を経る最初の実施により生じた増幅プロフィールと異なる増幅プロフィールを生じるさらなる工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）がキャピラリーゲル電気泳動により行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）〜（ｃ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又はそれらの組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む１つ又はそれ以上のプライマーにより行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むプライマー。
【請求項１】
サンプル中の生物を同定する方法であって：
（ａ） 生物を含むサンプルを提供すること［該生物は少なくとも１つの核酸を含む］；
（ｂ） 該サンプル又は該サンプル由来の少なくとも１つの核酸を、少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを含む増幅ミックスと混合すること；
（ｃ） 該少なくとも１つの標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するヌクレオチド増幅技術を使用して、該生物の少なくとも１つの核酸から少なくとも１つの標識された増幅生成物を生成すること；
（ｄ） 該少なくとも１つの標識された増幅生成物をＤＮＡ配列決定反応の生成物と混合して分離ミックスを作製すること；及び
（ｅ） オリゴヌクレオチド長に基づいて蛍光ＤＮＡ配列決定機器で該分離ミックスを分離して、該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを生成すること
を含む、方法。
【請求項２】
工程（ｅ）の後に：
（ｆ） 該生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを、既知の生物についての配列に埋め込まれたフィンガープリントパターンを含むデータベースと比較すること；及び
（ｇ） 該データベースとの比較の相関関係で該生物を同定すること
のさらなる工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物が微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生物が未知のものである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ヌクレオチド増幅技術が多型ＤＮＡのランダム増幅（ＲＡＰＤ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの核酸がＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）の後に、工程（ｃ）〜（ｅ）を経る最初の実施のストリンジェンシー条件と比較して異なるストリンジェンシー条件で工程（ｃ）〜（ｅ）を繰り返して、工程（ｃ）〜（ｅ）を経る最初の実施により生じた増幅プロフィールと異なる増幅プロフィールを生じるさらなる工程を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｅ）がキャピラリーゲル電気泳動により行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）〜（ｃ）が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５又はそれらの組み合わせからなる群より選択される核酸配列を含む１つ又はそれ以上のプライマーにより行われる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、又は配列番号５に示される核酸配列を含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項１０に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むプライマー。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｂ】
【公表番号】特表２０１３−５０２２２２（Ｐ２０１３−５０２２２２Ａ）
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５２５６８５（Ｐ２０１２−５２５６８５）
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６００４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４９６６９
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年１月２４日（２０１３．１．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４６００４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０４９６６９
【国際公開日】平成２３年４月２８日（２０１１．４．２８）
【出願人】（３９００２３６７４）イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー (2,692)
【氏名又は名称原語表記】Ｅ．Ｉ．ＤＵ ＰＯＮＴ ＤＥ ＮＥＭＯＵＲＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]