遺伝子ホモ改変哺乳動物細胞、遺伝子ホモ改変非ヒト哺乳動物、及びそれらの樹立、作出方法。
【課題】 マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）に対しても適用可能な、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞、及び、ホモ改変非ヒト哺乳動物を効率的に作出する方法、及び、該方法によって樹立或いは作出されたホモ改変哺乳動物細胞或いはホモ改変非ヒト哺乳動物を提供すること。
【解決手段】 耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行い、ヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第２のターゲッティング操作を行って、体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を樹立する。該樹立細胞を用いて、任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を作出する。
【解決手段】 耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行い、ヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第２のターゲッティング操作を行って、体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を樹立する。該樹立細胞を用いて、任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を作出する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変された、ホモ改変哺乳動物細胞の効率的な樹立方法；該方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞；及び、該ホモ改変哺乳動物細胞を用いたゲノム中においてホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の効率的作出方法；該方法により作出されたホモ改変非ヒト哺乳動物に関する。更に詳細には、本発明は、遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを用いて、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変された、ホモ改変哺乳動物細胞を効率的に樹立する方法、及び、ホモ改変哺乳動物細胞を用いて、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を効率的に作出する方法、及び、該方法により樹立或いは作出された、ホモ改変哺乳動物細胞又はホモ改変非ヒト哺乳動物に関する。また、具体例としては、本発明の方法を体細胞を用いたゲノム上の任意遺伝子のノックアウト（不活化：以下、「ＫＯ」という）に用いて、ゲノム上の任意遺伝子が双方のゲノムにおいてＫＯされたホモＫＯ哺乳動物細胞及びホモＫＯ非ヒト哺乳動物、すなわち、任意遺伝子が双方のゲノムにおいてＫＯされた正常クローン哺乳動物細胞及び正常クローン非ヒト哺乳動物を、効率的に作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
相同遺伝子組換えを利用してゲノム上の任意の遺伝子を改変（ＫＯ等）する遺伝子ターゲッティング技術は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が樹立されているマウスでは一般的な手法として広く用いられており、種々の遺伝子ＫＯマウスの作製に貢献している。すなわち、動物細胞の体細胞は二倍体であるため、ＫＯ動物の作製の目的を達成するためには少なくても２度同一の方法を実施して、双方のゲノムの目的遺伝子をＫＯする必要がある。しかし、このこの双方のゲノムの目的遺伝子をＫＯするのは極めて困難である。
【０００３】
そこでマウスにおいては、半数体である生殖細胞にキメラマウスを通して分化することができる胚幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて、実施されている。具体的には、マウスＥＳ細胞に特定遺伝子を導入し、突然変異体ＥＳ細胞を選択する。この細胞を正常胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスの生殖細胞を通して子孫へ突然変異がヘテロに伝達され、ヘテロ型の雌雄の交配によって二倍体の対立遺伝子をホモ型の突然変異を有するマウスを作出することができる。この方法を用いて特定遺伝子が破壊されたＫＯマウスが作製されている。
【０００４】
遺伝子ターゲッティング技術が、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）においても可能となれば、各種産業分野への貢献度は非常に大きなものになると期待されている。しかし、家畜等においては有効なマウスのように、ＥＳ細胞が樹立されていないこと、及び、マウスと同様の作製方法では遺伝子改変個体を得るために非常に長期間を要することなどから、この技術の活用はほとんど進展がなかった。
【０００５】
一方、１９９７年にWilmutらにより、ヒツジ体細胞を用いた核移植クローン技術が報告された(Nature, 385，810-813，1997)。この体細胞クローン技術とドナー体細胞に対する遺伝子ターゲッティング技術を組み合わせることにより、家畜等での遺伝子ターゲッティング手法による遺伝子改変動物作製が現実化してきた。実際、これまでにヒツジおよびブタにおいて体細胞に対し遺伝子ターゲッティング操作を行い、クローン個体を作製した例が数例報告されている（McCreathら； Nature, 405, 1066-1069, 2000; Dai ら；Nat Biotechnol., 20, 251-255, 2002）。本発明者らも、ウシにおいて体細胞を用いた遺伝子ターゲッティング（ヘテロＫＯ：１染色体上の遺伝子をＫＯ）を成功させている(特開２００２−１７３６０号公報；Sendaiら、Transplantation, 76, 900-903, 2003)。
【０００６】
しかし、体細胞を用いた遺伝子ターゲッティング技術は多くの不確定要素があり、相同遺伝子組換えを起こした細胞の樹立効率は極めて低く、解決すべき課題も多い。具体的には、遺伝子ターゲッティングに使用する体細胞の種類、培養法、ターゲッティングベクター(以下「ＴＶ」という)の構築、遺伝子導入・選別法など各段階での最適条件の確立が必要とされる。特に、体細胞を用いて任意遺伝子を完全にＫＯ(ホモＫＯ)するためには、１対の染色体上それぞれに存在する対象遺伝子をターゲッティングする必要があるため、２回ターゲッティング操作が必要であり、それぞれの操作には選別用耐性遺伝子を変えた２種類のＴＶを構築・使用する必要がある。しかしここで、構築した２種類のＴＶが同程度に相同組換えを起こすという保証は無く、これはホモＫＯ細胞を効率的に取得する上で非常に大きな課題となっている。
【０００７】
本願発明者らは、既報(特開２００２−１７３６０号公報；Sendaiら、Transplantation, 76, 900-903, 2003)においてα１，３ＧＴ遺伝子(以下「α１，３ＧＴ」という)の遺伝子ターゲッティング（ヘテロＫＯ）を実施しており、先に述べたいくつかの基本的課題を解決している。しかし、ホモＫＯ細胞樹立のため選別用耐性遺伝子を変更したＴＶを構築・使用し、ターゲッティング操作を実施したが、ホモＫＯ細胞は樹立出来ず、ＴＶの違いによるターゲッティング効率の違いを確認するに至った。
【０００８】
したがって、これまで、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）においても、確実かつ効率的にゲノム上の特定遺伝子をホモに改変できる（例えば、ホモＫＯが可能な）遺伝子ターゲッティング技術は開発されておらず、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）については、その遺伝的な改変が要望されつつも、その現実的な実現が難しい状況にあった。そこで、該技術が開発されれば、各種産業分野への貢献度は非常に大きなものになると期待される。
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１７３６０号公報。
【非特許文献１】Nature, 385，810-813，1997。
【非特許文献２】Nature, 405, 1066-1069, 2000。
【非特許文献３】Nat Biotechnol., 20, 251-255, 2002。
【非特許文献４】Transplantation, 76, 900-903, 2003。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）に対しても適用可能な、哺乳動物体細胞を用いた任意遺伝子の遺伝子ターゲッティングを効率的に達成し、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を効率的に樹立する方法、該ホモ改変哺乳動物細胞を用いてゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を効率的に作出する方法、及び、該ホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法或いはホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法により樹立或いは作出された、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞、或いは、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、哺乳動物体細胞を用いた任意遺伝子（α１，３ＧＴ：α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ ）の遺伝子ターゲッティングを効率的に達成する方法を提供することを目的とし、更に、任意遺伝子の改変として、該遺伝子のＫＯを題材として、該遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモにＫＯされたホモＫＯ哺乳動物細胞の効率的な取得方法の開発を目指して鋭意検討した結果、相同組換えが高頻度で起きたＴＶをもとに、ヘテロＫＯ及びホモＫＯ化のターゲッティング操作の両方に使用できるＴＶを構築すれば、この問題点を解決できると考えた。
【００１２】
具体的には、ゲノム中の任意の領域を特異的に改変するＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを利用し、ターゲッティングが成功したＴＶの耐性遺伝子ユニットを挟むように２個のｌｏｘＰ配列を挿入したＴＶを構築した。ここで、ｌｏｘＰ配列に挟まれた耐性遺伝子ユニットは、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理により組換え体ゲノム中より除去される。１回目のターゲッティング操作で得られたヘテロＫＯ細胞に対してＣｒｅ組換え酵素発現処理をすることにより耐性遺伝子ユニットを除去し、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロＫＯ胎子を作製し胎子由来線維芽細胞を取得、続いて、このヘテロＫＯ胎子由来線維芽細胞に対して同様のＴＶを使用し２回目のターゲッティング操作を行うことにより、２本の染色体中に存在するα１，３ＧＴを完全にＫＯしたウシ線維芽細胞を樹立することに成功した。
【００１３】
この方法により、同じＴＶを用いて２回のターゲッティング操作を行うことが可能となり、ターゲッティング操作における相同組換えの確実性を増して、確実かつ効率的にホモ改変哺乳動物細胞の取得が可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明で樹立される組換え体ゲノム中においてホモに改変された哺乳動物細胞は、これを用いて、マウスのようにＥＳ細胞が樹立されていないような哺乳動物（家畜）においても、ゲノム中において遺伝子がホモに改変された非ヒト哺乳動物を確実かつ効率的に作出することができる。本発明の方法は、哺乳動物細胞における任意遺伝子の改変、「ノックアウト」及び「ノックイン」の場合に適用することができる。
【００１４】
すなわち、本発明は、遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することからなる体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法からなる。
【００１５】
また、本発明は、該ホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法によって樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を包含する。更に、本発明は、本発明の方法によって樹立されたホモ改変哺乳動物細胞を用いて、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト動物の作出方法及び該方法により作出されたホモ改変非ヒト動物を包含する。
【００１６】
すなわち具体的には本発明は、（１）遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することを特徴とする体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（２）耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたターゲッティングベクターが、耐性遺伝子ユニットがｌｏｘＰ配列に挟まれて組込まれたターゲッティングベクターであることを特徴とする前記（１）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（３）耐性遺伝子ユニット脱離操作が、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニットの組換体ゲノム中よりの除去操作であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（４）第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得する操作が、第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第２のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（５）哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（６）哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞が、ウシ、ブタ、又はヒツジのホモ改変線維芽細胞であることを特徴とする前記（４）又は（５）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（７）前記（１）〜（６）のいずれか記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞からなる。
【００１７】
また本発明は、（８）哺乳動物体細胞の任意遺伝子として、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトしたことを特徴とする前記（７）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞や、（９）前記（７）記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することを特徴とする任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法や、（１０）前記（７）記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産が、前記（７）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後飼養して産子を出産することにより行われることを特徴とする前記（９）記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法や、（１１）哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法や、（１２）ホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物が、ウシ、ブタ、又はヒツジであることを特徴とする前記（９）〜（１１）のいずれか記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法からなる。
【００１８】
更に本発明は、（１３）前記（９）〜（１２）のいずれか記載のホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法により作出された任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動や、（１４） ホモ改変非ヒト哺乳動物が、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトされたホモ改変非ヒト哺乳動物であることを特徴とする前記（１３）記載のホモ改変非ヒト哺乳動物からなる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、胎子由来線維芽細胞のような体細胞を用いて任意遺伝子を効率的にターゲッティングする方法が提供される。すなわち、本発明の方法により、胎子由来線維芽細胞のような体細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより遺伝子改変哺乳動物細胞を樹立するに際して、同じＴＶを用いて２回のターゲッティング操作を行うことが可能となり、ターゲッティング操作における相同組換えの確実性を増して、確実かつ効率的にホモ改変哺乳動物細胞の取得が可能となった。この本発明のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法は、体細胞クローン生産技術と併用することにより、マウス、ヒト以外の哺乳動物でも任意遺伝子を自由に改変した個体を効率的に作製する基盤技術として展開することができる。すなわち、この遺伝子改変哺乳動物細胞を用いて、ゲノム中において遺伝子がホモに改変された非ヒト哺乳動物を確実かつ効率的に作出することができ、マウスのようにＥＳ細胞が樹立されていないウシ、ブタ、ヒツジのような哺乳動物（家畜）に適用して、従来、その遺伝的な改変が困難であった、これらの哺乳動物についても、確実かつ効率的にゲノム上の特定遺伝子がホモに改変されたホモ改変哺乳動物を作出することを可能にした。
【００２０】
本発明の方法は、上記のとおり、マウス以外の哺乳動物（家畜）においても、哺乳動物細胞における任意遺伝子の「ノックアウト」及び「ノックイン」の改変を行って、有用な特性を有する遺伝的に改変された哺乳動物を作出することができる。したがって、本発明の方法は、その遺伝的な改変が要望されていた、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）について、その遺伝的な改変の現実的な手法を提示し、該手法の開発によって、各種産業分野への大きな貢献が期待されるものである。また、本発明の実施例で樹立したα１，３ＧＴ−ＫＯ細胞は、該ＫＯ細胞を用いて体細胞クローニングを行い、得られたホモにＫＯされたα１，３ＧＴ−ＫＯ動物は、全ての組織・臓器においてそれを構成する細胞表面の糖鎖構造が変化しヒトに類似したものとなり、これらの哺乳動物の組織・臓器をヒトに移植しても超急性拒絶反応が起きず、異種臓器移植の有効なドナーとなる。従って、本発明は、ヒトにとって有用な遺伝子改変動物を作製する上で大いに威力を発揮するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたＴＶ（ターゲッティングベクター）を構築し、該ＴＶを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたＴＶを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することからなる。
【００２２】
本発明において、対象とされる哺乳動物体細胞は、特に限定はされないが、本発明においてその作出を目的とするホモ改変非ヒト動物との関連において、従来、ＥＳ細胞を用いての遺伝子のホモ改変が既に行われているマウス以外の哺乳動物（家畜）の体細胞の場合が、特に有益に利用できる対象として挙げることができる。特に、入手の容易性や体細胞クローン技術が比較的安定化している家畜が好ましく、とりわけ、ウシ、ブタ、ヒツジ等が好ましい。また、本発明の体細胞の種類は特に限定されるものではないが、増殖能力の高さおよび遺伝子導入の容易さから線維芽細胞が好ましく、特に胎子に由来する線維芽細胞が最も好ましい。
【００２３】
本発明において、本発明のＴＶの構築に用いられるＴＶとしては、動物細胞のターゲッティング操作に用いられている公知のＴＶを適宜用いることができるが、
本発明の実施例においては、ウシα１，３ＧＴゲノミックＤＮＡの触媒領域をコードしている部位を含んだクローンを用いた（Transplantation, 76, 900-903, 2003；特開２００２−１７３６０号公報）。本発明において用いられるＴＶの構築に際しては、構築されたＴＶの耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能なように組込まれる。耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたＴＶとしては、耐性遺伝子ユニットがｌｏｘＰ配列に挟まれて組込まれた構造を採用することができる。
【００２４】
本発明の方法において、該耐性遺伝子ユニットは、第１のターゲッティング操作を行ってヘテロ改変哺乳動物細胞を取得した後に、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニット脱離操作によって、組換体ゲノム中より除去される。これらのターゲッティング操作やＣｒｅ組換え酵素発現処理は、いずれも公知の操作手段にしたがって実施することができる。
【００２５】
本発明において、任意遺伝子のホモ改変動物細胞を構築するには次のような操作によって実施することができる：すなわち、ターゲッティング操作用のＴＶを構築した後、第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変された哺乳動物細胞を取得する。該ヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第２のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得する。この方法によれば、同じＴＶを用いて２度のターゲッティング操作が可能となり、相同組換えの確率を上げて、確実にかつ効率的に任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変された哺乳動物細胞を取得することができる。
【００２６】
本発明の方法により、マウス以外の哺乳動物（家畜）においても、哺乳動物細胞における任意遺伝子の「ノックアウト」及び「ノックイン」の改変を行い、任意遺伝子が、組換え体ゲノム中においてホモに改変された哺乳動物細胞を取得することができるが、特に、任意遺伝子のＫＯされた哺乳動物細胞の樹立に用いて、任意遺伝子のＫＯされたホモ改変哺乳動物細胞の取得に有利に用いることができる。
【００２７】
本発明のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法の具体的方法について、遺伝子のＫＯの場合例示して、説明すると：本発明のα１，３ＧＴを用いた効率的ターゲッティングの具体的方法は、以下の実施例に記述されており、その原理は図１に模式的に示されている。以下の実施例では、ウシα１，３ＧＴゲノム遺伝子の２領域(エクソン８を含む６．３ｋｂ ＥｃｏＲＶ断片及び酵素触媒領域のエクソン９中の０．８ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片)が５´側及び３´側に位置するように、ｌｏｘＰ配列に挟まれた選別用耐性遺伝子ユニット(ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ)を配して構築した１種類のＴＶを使用してターゲッティング操作(１回目)を行い、正しく相同組換えが起きたヘテロＫＯ細胞株に対してＣｒｅ組換え酵素発現処理（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え）をして選別用耐性遺伝子ユニットをゲノム中より除去し、再度同様のTVを用いて最終的なホモＫＯ細胞株取得のためのターゲッティング操作(２回目)を行うことにより、ウシ胎子由来線維芽細胞のウシα１，３ＧＴを効率的に完全ＫＯした。この細胞は活発に増殖し、凍結保存可能な細胞であり、更に、体細胞クローン個体作製のためのドナーとして使用することができる。
【００２８】
本発明においては、本発明において樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変動物細胞を用いて、任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト動物を作出することができる。該ホモ改変非ヒト動物を作出するには、該ホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することにより行うことができる。該ホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産は、該ホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後養育して産子を出産することにより行うことができる。これらの操作における、細胞の処理方法及び核移植は、公知の方法を用いて実施することができる（Theriogenology 62, 714-728,2004;特開２００３−５２３３６９号公報）。
【００２９】
本発明のホモに改変された哺乳動物細胞の作出方法は、ＥＳ細胞の樹立されていないウシ、ブタ、又はヒツジのようなマウス以外の哺乳動物（家畜）の遺伝的に改変された哺乳動物の作出に適用して、任意遺伝子がゲノム中においてホモに改変された哺乳動物を、確実かつ効率的に作出することができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［１．ターゲッティングベクター(ＴＶ)の構築］
ＴＶ（ｐＧＴ−２２）の構築はSendaiらの方法(Transplantation, 76, 900-903, 2003)により、黒毛和牛α１，３ＧＴゲノムＤＮＡ（clone−ＪＡ８）からベクター構築に必要な領域をサブクローニングして行った。ｐＧＴ−２２ベクターはＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット(ＩＲＥＳ配列を持つβガラクトシダーゼ結合ネオマイシン耐性遺伝子)（pBIKS(-)IresBgeopAベクター(理化学研究所)由来）の５´側及び３´側にα１，３ＧＴゲノムＤＮＡが位置するように構築した。５´側には、α１，３ＧＴゲノムＤＮＡのエクソン８(Ｅ８)領域を含むＥｃｏＲＶ(タカラバイオ社製)消化断片（６．３ｋｂ）を使用し、３´側には、α１，３ＧＴの酵素触媒領域のエクソン９(Ｅ９)のＨｉｎｄIII(タカラバイオ社製)−ＢａｍＨＩ(タカラバイオ社製)消化断片（０．８ｋｂ）を使用した（図１）。
【００３２】
更に、ＴＶはＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを挟むようにｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ：ｐＢＳ２４６ベクター(ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製)由来）を２箇所に挿入した。ＴＶを導入し正しく相同組換えが起こった場合、ウシα１，３ＧＴゲノムＤＮＡ中の酵素触媒領域(Ｅ９)のＲＮＡ転写が阻害され、α１，３ＧＴは不活化する。また、ＴＶのｌｏｘＰ配列に挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットは、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理により組換え体ゲノムＤＮＡより除去される（図１）。ここでＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット除去後のα１，３ＧＴも、酵素触媒領域(Ｅ９)のＲＮＡ転写が阻害され（フレームシフト等によるタンパク質合成阻害）、不活化状態を維持する。
【００３３】
［２．ウシ胎子由来線維芽細胞株の樹立］
全農ＥＴセンター所有の黒毛和種の雌牛(ふくみ)に凍結精液（黒毛和牛，第７糸桜）を人工授精し、７日後に得られた受精卵４卵を発情を同期化させた受卵牛に移植した。胎齢４９日目、胎子を無菌的に回収し、頭部および消化器官を除去した後、解剖バサミで細かく切り刻み、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO BRL社製）処理(４℃、１２時間)して細胞を分散・分離し、培養して増殖してくる線維芽細胞を初代培養(３７℃、５％Ｃ０２／９５％空気)して細胞株とした(＃９０６株)。この株を用いＴＶの導入・選別培養を実施した。
【００３４】
［３．ウシ胎子由来線維芽細胞へのＴＶの導入および選別培養］
胎子由来線維芽細胞を１０％ ＦＣＳを含むＭＥＭα培地（GIBCO BRL社製）２ｍｌを培養液とし、２万細胞／穴となるよう６穴細胞培養プレート(greiner社製)４枚に播種した。播種後２日目、制限酵素Ｎｏｔ Ｉ(タカラバイオ社製)消化し、直線化したＴＶを導入した。導入方法は、以下の通りである。まず、培養プレートより培養液を除去した後、そこへ１ｍｌ（１穴当たり）の遺伝子導入用培地（TransFast試薬（Promega社製）使用時：１ｍｌ ＭＥＭα培地に２μｇのＴＶ、６μｌのTransFast試薬を使用、Lipofectamine−ＰＬＵＳ試薬（GIBCO BRL社製）使用時：１ｍｌ ＭＥＭα培地に２μｇのＴＶ、８μｌのLipofectamine試薬、１２μｌのＰＬＵＳ試薬を使用）を添加し、インキュベーター（タバイエスペック社製）(３７℃、５％ ＣＯ２／９５％空気)内で６０分(TransFast試薬使用時)若しくは１８０分（Lipofectamine-PLUS試薬使用時）間培養した。
【００３５】
その後、１０％ ＦＣＳを含むＭＥＭα培地、1穴当たり２ｍｌを上記に加え、インキュベーター(３７℃、５％ ＣＯ２／９５％空気)内で培養した。２４時間後、０．４ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにネオマイシン（商品名 Geneticin，GIBCO BRL社製）を各穴に加えた。更に、２４時間後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO BRL社製）処理（５分）し、６穴細胞培養プレートより細胞を剥がして４８穴細胞培養プレート(greiner社製)８枚に播き直した。播き直し後、３日目、６日目に培養液を交換し、１０日目前後になるとネオマイシン耐性コロニーが出現するので、それぞれをトリプシン処理により剥がし４８穴細胞培養プレート２枚に分割し継代した（１枚目をＰＣＲ解析、２枚目をサザンブロット解析及び凍結保存用に使用）。４８穴細胞培養プレートでの培養に用いる培養液量は４００μｌ／穴、その他の条件は６穴細胞培養プレート使用時と同じである。
【００３６】
［４．ＰＣＲ解析による相同組換え体の判定］
４８穴細胞培養プレート２枚に分割して継代したネオマイシン耐性細胞は、２〜３日後にコンフレントとなり、１枚をＰＣＲ法による相同組換え体の判定に使用した。４８穴細胞培養プレートにＤＮＡ抽出バッファー（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４５％ ＮＰ−４０、０．４５％ Tween−２０）を１穴当たり５０μｌ加えた。そこにProteinase Ｋ(ナカライテクス社製)(１００μｇ／ｍｌ)を加え、５５℃で７０分間インキュベートし、さらに１００℃で１０分間インキュベートした。インキュベート終了後、ＤＮＡサンプルは４℃で保持し、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲは１サンプル当たり、テンプレート(ＤＮＡ抽出サンプル)５μｌ、anti-Taq high用１０×ＰＣＲ buffer（TOYOBO社製）２．５μｌ、センスプライマー（１０pmoles／μｌ）０．２５μｌ、アンチセンスプライマー(１０pmoles／μｌ)０．２５μｌ、ｄＮＴＰｓ mixture (２ｍＭ each) ２μｌ、anti-Taq high(TOYOBO社製)＋ ｒＴａq ＤＮＡポリメラーゼ(TOYOBO社製)混合液０．２５μｌ、滅菌蒸留水にて計２５μｌになるように調整し実施した。
【００３７】
解析に用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。センスプライマー(Ｐ１)：5’-ACCGCTATCA GGACATAGCG TTGG-3’、アンチセンスプライマー(Ｐ２)：5’-CTGGAGACCA CCCACACTGC CTGG-3’（図１）。また、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理後のＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット除去の確認に用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。センスプライマー(Ｐ３)：5’-AGTAGTTGCC AAGGGTCGGC-3‘、アンチセンスプライマー(Ｐ２)（図１）。ＰＣＲの条件は、９４℃ ２分を１回の後、９４℃ １分、５７℃ １分３０秒、７２℃ ２分を３５回、その後，７２℃ １０分を１回行った。反応終了後，１％ アガロースゲルを用いて，電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色により相同組換えの判定をおこなった。正しく相同組換えが起きている場合は、約１．６ｋｂのＰＣＲ産物が増幅される。また、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理によりＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットが除去された場合、約１．４ｋｂのＰＣＲ産物が増幅される。
【００３８】
［５．Ｃｒｅ組換え酵素発現処理によるＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去］
ヘテロ相同組換え細胞及びホモ相同組換え細胞のゲノム中からのＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを使用することにより行った。ＰＣＲ陽性となった細胞と同一クローン由来の細胞を継代していく段階で、Ｃｒｅ組換え酵素を一過的に発現する組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ：理研ジーンバンク、ＲＤＢ Ｎｏ．１７４８）を定法に従い感染処理することにより、細胞内にＣｒｅ組換え酵素を発現し、ｌｏｘＰ配列に挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを除去した。ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去確認はＰＣＲ解析およびサザンブロット解析により行った（図２）。
【００３９】
［６．サザンブロット解析による相同組換え体の判定］
ＰＣＲ陽性となった細胞と同一クローン由来の細胞を、４８穴細胞培養プレートから回収し、１２穴細胞培養プレート(greiner社製) に継代、４８時間後更に６穴細胞培養プレートの２穴に継代、その４８時間後に７５ｃｍ２細胞培養フラスコ(greiner社製)に継代してコンフルエントになった段階で一部を凍結保存，一部をサザンブロット解析のゲノム調整での確認用に７５ｃｍ２細胞培養フラスコ２本に継代した。サザンブロット解析用ゲノムＤＮＡの調整は、定法に従い行った。サザンブロット解析は、細胞より調整したゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ(タカラバイオ社製)で充分消化後、０．８％アガロース電気泳動、ナイロンメンブレンへの転写、プローブハイブリダイゼーション、ＢＡＳ５０００（富士フイルム社製）による視覚化の手順で行われた。
【００４０】
プローブはＴＶの短椀領域(０．８ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ消化断片)を３２Ｐ−標識して使用した。正しく相同組換えが起こった場合は，ヘテロ相同組換え体においては１３ｋｂ(野生型アレル由来)と７ｋｂ(組換え体アレル由来)の二本バンドが確認できる（図１，２）。また、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理によりＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットが除去された場合、組換え体アレル由来の７ｋｂのバンドは、ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット中のＸｂａＩ切断部位が消失することにより１０．５ｋｂへシフトする（図１，２）。
【００４１】
［７．遺伝子改変体細胞クローン胚作製と胎子回収、及びＫＯクローン牛の生産］
と蓄場由来のウシ卵胞卵子を体外成熟培養(５％ウシ胎子血清添加ＴＣＭ１９９培地（GIBCO BRL社製）、５％ＣＯ２／９５％空気、３８℃)し、培養開始１９〜２０時間目に卵丘細胞を除去した後、第１極体側から卵細胞質を約１／３取り除き除核した。ＰＣＲ及びサザンブロット解析でヘテロまたはホモKOが確定した細胞(＃３−４６Ｃｒｅ又は＃Ｈ１−３８Ｃｒｅ)を１０％ウシ胎子血清添加Ｄ−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）（５％ＣＯ２／９５％空気、３８℃）で３日間培養して核移植に使用した。細胞の処理方法及び核移植は、浦川らの方法（Theriogenology 62, 714-728, 2004：特開２００３−５２３３６９号公報）に従って行った。
【００４２】
細胞融合は、除核卵子の囲卵腔に樹立したヘテロまたはホモＫＯ細胞(＃３−４６Ｃｒｅ又は＃Ｈ１−３８Ｃｒｅ、又は＃２７０)を挿入し、微少電極で直流パルス（Bex社製、２５Ｖ／１５０μｍ、１０μ秒）を1回負荷した。その後，ステンレスチャンバー中で再度電気負荷を１回与えた（ＥＣＦ−２００１:理工化学研究所、１００Ｖ／ｍｍ、６０μ秒）後、５μＭ Ｃａ−イオノホア(SIGMA社製，Ｃ−７５２２)及び１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（SIGMA社製，Ｃ−７６９８）で活性化を行った（Aoyagi ら； Thriogenology 41，Abstr. 157，1994）。核移植の翌日、核移植胚は５％ウシ血清添加ＣＲ１ａａ培地でウシ卵管上皮細胞と共培養を行い、６日目に移植可能胚を発情後７日目の受卵牛（ホルスタイン種）１頭に３胚移植し、４１日齢の遺伝子改変胎子を回収した。
【００４３】
＃Ｂ２７０細胞をドナーとしたクローン胚は、受卵牛に移植し妊娠確定後、胎子回収はせず産子の作出試験に供した。受卵牛への核移植胚の移植から胎子回収及び出産までの飼養管理は全農ETセンター所有閉鎖系牛舎内で「組換えＤＮＡ実験指針」および「遺伝子組換え生物等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」に則って実施された。胎子を回収した後のと体および糞便は焼却処理した。回収した遺伝子改変胎子は細断し、線維芽細胞の初代培養を行った。培養開始数日後、増殖中の細胞の一部よりゲノムＤＮＡを調整しＰＣＲ及びサザンブロット解析でヘテロ相同組換えおよびホモ相同組換えの確認を行った。
【００４４】
［８．細胞表面αＧａｌ糖鎖解析］
細胞表面のαＧａｌ糖鎖の解析は、αＧａｌ糖鎖を特異的に認識するバンデリアマメレクチン(BS-I Isolectin Ｂ４)を用いた蛍光標識レクチン−ＦＡＣＳ解析により行った。培地を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理により単離・浮遊化する。浮遊化した細胞を、ＦＩＴＣ標識−ＢＳ−Ｉ(Ｂ４)(SIGMA社製, L2895)で処理し、結合性をＦＡＣＳ解析装置(ベクトン・デッキンソン社製)で調べた。
【００４５】
［９．細胞の増殖能力試験］
樹立した細胞株(＃２７０)の増殖能力の解析は、一定期間培養後の細胞数を＃９０６株（オリジナル株）と比較することにより行った。２４穴細胞培養プレートに、＃Ｂ２７０細胞及び＃９０６細胞をそれぞれ１穴あたり４０００細胞播種し、播種後２日目、及び４日目の細胞数をトリプシン−ＥＤＴＡ処理で分散させた後、コールターカウンター(ベックマン-コールター社製)で算出した。
【００４６】
［結果］
１．＃９０６株(α１，３ＧＴ＋／＋)に対して４回のヘテロＫＯ化の導入実験（TransFast試薬、２回：Lipofectamine−ＰＬＵＳ試薬、２回）をした結果、４個(４／１１５２)のＰＣＲ陽性細胞が得られた（表１）。順調な細胞増殖を示した細胞株に対してサザンブロット解析を行い、相同組換え体(＃３−４６株:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)を同定した（図２：レーン２）。
【００４７】
【表１】
（表１に、この実施例で行った、胎子線維芽細胞(＃９０６株)及びα１，３ＧＴヘテロＫＯ胎子線維芽細胞(＃３−４６ＣｒＮ株)に対してｐＧＴ−２２ベクターを用いてヘテロＫＯ化及びホモＫＯ化を実施した結果をまとめた。）
【００４８】
２．ウシ胎子由来線維芽細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにおいて、相同組換え体取得にはLipofectamine−ＰＬＵＳ試薬よりTransFast試薬の方が相同組換えを起こす頻度が高く組換え体取得が効率的あることが示唆された（表１）。
【００４９】
３．＃３−４６株に対して組換えアデノウイルス導入系Ｃｒｅ組換え酵素を一過的に発現することにより、ｌｏｘＰ配列で挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを除去した（＃３−４６Ｃｒｅ株:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−）（図２：レーン３）。組換えアデノウイルス導入系Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムがウシ体細胞においても有効に機能することが確認できた。
【００５０】
４．＃３−４６Ｃｒｅ細胞を用いて核移植を行い３５個の核移植胚を作製した。核移植後３日目に２２個(６２．９％)の核移植胚が卵割し、６日目に４個(１１．４％)の核移植胚が小型化桑実胚以降のステージに発生した（表２）。小型化桑実胚以降に発育した３個の移植可能胚を１頭の受卵牛に移植し、胎齢４１日目に胎子回収を試みた結果、1個体が回収できた。
【００５１】
【表２】
（表２に、この実施例で行った、α１，３ＧＴヘテロＫＯ細胞(＃３−４６Ｃｒｅ株)及びα１，３ＧＴホモＫＯ細胞(＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ株)を用いた核移植試験の結果をまとめた。）
【００５２】
５．回収したクローン胎子(＃３−４６Ｃｒｅ細胞由来)より線維芽細胞株（＃３−４６ＣｒＮ株）を樹立し、増殖細胞の一部でヘテロ相同組替えの確認をサザンブロット解析により行った結果、ヘテロ相同組換え体(α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)であることが確認できた（図２：レーン４）。
【００５３】
６．ｐＧＴ−２２ベクターを使用し、＃３−４６ＣｒＮ株に対して３回のホモＫＯ化の導入実験をした結果、２７個(２７／５０８)のＰＣＲ陽性細胞が得られた。順調な細胞増殖を示した細胞株に対してサザンブロット解析を行い、相同組換え体(＃Ｈｌ−３８株:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)を同定した（図２：レーン５）。また、Ｃｒｅ組換え酵素を発現しｌｏｘＰ配列で挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを除去した（＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ株: α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−）（図２：レーン６）。
【００５４】
７．＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ細胞を用いて核移植を行い３６個の核移植胚を作製した。核移植後３日目に２３個(６３．９％)の核移植胚が卵割し、６日目に７個(１９．４％)の核移植胚が小型化桑実胚以降のステージに発生した（表２）。小型化桑実胚以降に発育した３個の移植可能胚を１頭の受卵牛に移植し、胎齢４１日目に胎子回収を試みた結果、１個体が回収でき、胎子は正常な発育形態を示していた（図３）。
【００５５】
８．回収したクローン胎子(＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ細胞由来)より線維芽細胞株（＃Ｂ２７０株）を樹立し、増殖細胞の一部でホモ相同組換えの確認を行った結果、サザンブロット解析でホモ相同組換え体(α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)であることが確認できた（図２：レーン７）。
【００５６】
９．＃Ｂ２７０株の細胞表面αＧａｌ糖鎖を調べる目的で、αＧａｌ糖鎖を特異的に認識するレクチン（ＢＳ−Ｉ Isolectin Ｂ４）の結合性をＦＡＣＳ解析で調べた結果、α１，３ＧＴホモ相同組換え細胞（＃Ｂ２７０株）は、α１，３ＧＴが不活化し、細胞表面のαＧａｌ糖鎖が消失していることが確認できた(図４)。
【００５７】
１０．＃Ｂ２７０株の細胞増殖能力を調べた結果、＃Ｂ２７０株は遺伝子改変前のオリジナル株である＃９０６株と同等の増殖能力を持つことが確認できた（図５−Ａ）。また、＃Ｂ２７０株は凍結・融解後においても高い細胞増殖能力を保持していることが確認できた（図５−Ｂ）。
【００５８】
１１．＃Ｂ２７０細胞をドナーとしてクローン個体の作製を検討した結果、借り親牛３頭にクローン胚移植を行い、その内１頭は妊娠を継続し、分娩まで至った。産子は分娩後まもなく死亡したが(生後直死)、形態的異常は見られなかった（図６−Ａ）。死因としては、誘起分娩を実施した時期が少し早かったため肺機能等が未発達状態であったことが考えられる。また、産子の腎臓組織より細胞を分離し、細胞表面のαＧａｌ糖鎖の解析を実施した結果、細胞表面のαＧａｌ糖鎖が消失していることが確認できた(図６−Ｂ)。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の実施例で使用したα１，３ＧＴ−ＫＯ用ＴＶ（ｐＧＴ−２２ベクター）、相同組換え、及びＣｒｅ組換え酵素発現処理によるＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施例の各段階で樹立した相同組換え体(細胞)のサザンブロット解析を示した図である。レーン１：＃９０６株(野生株:α１，３ＧＴ＋／＋)、レーン２：＃３−４６株(ヘテロＫＯ:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)、レーン３：＃３−４６Ｃｒｅ株(ヘテロＫＯ:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)、レーン４：＃３−４６ＣｒＮ株(ヘテロＫＯ:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)、レーン５：＃Ｈｌ−３８株(ホモＫＯ:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)、レーン６：＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ株(ホモＫＯ:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)、レーン７：＃Ｂ２７０株(ホモＫＯ:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)＊：α１，３−ＧＴとは関連のない、プローブと反応する遺伝子断片。
【図３】本発明の実施例で回収した＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ由来核移植胎子（４１日齢）の写真である。胎子は羊膜に包まれた状態で、正常な発育形態を示している。この胎子から＃Ｂ２７０株を樹立した。
【図４】本発明の実施例で樹立した細胞の表面糖鎖をαＧａｌ糖鎖結合性レクチン(ＢＳ−Ｉ(Ｂ４))を用いてＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。実線：蛍光色素標識レクチン染色細胞、点線：非染色細胞。
【図５】本発明の実施例で樹立した細胞(＃Ｂ２７０株)の増殖能力(Ａ)および凍結保存の影響(Ｂ)を解析した結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例で樹立した細胞(＃Ｂ２７０株)をドナーとして生産されたα１，３ＧＴ−ＫＯクローン子牛(Ａ)及び産子腎臓組織由来細胞の表面糖鎖をαＧａｌ糖鎖結合性レクチン(ＢＳ−Ｉ(Ｂ４))を用いてＦＡＣＳ解析した結果(Ｂ)を示す図である。実線：蛍光色素標識レクチン染色細胞、点線：非染色細胞。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変された、ホモ改変哺乳動物細胞の効率的な樹立方法；該方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞；及び、該ホモ改変哺乳動物細胞を用いたゲノム中においてホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の効率的作出方法；該方法により作出されたホモ改変非ヒト哺乳動物に関する。更に詳細には、本発明は、遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを用いて、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変された、ホモ改変哺乳動物細胞を効率的に樹立する方法、及び、ホモ改変哺乳動物細胞を用いて、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を効率的に作出する方法、及び、該方法により樹立或いは作出された、ホモ改変哺乳動物細胞又はホモ改変非ヒト哺乳動物に関する。また、具体例としては、本発明の方法を体細胞を用いたゲノム上の任意遺伝子のノックアウト（不活化：以下、「ＫＯ」という）に用いて、ゲノム上の任意遺伝子が双方のゲノムにおいてＫＯされたホモＫＯ哺乳動物細胞及びホモＫＯ非ヒト哺乳動物、すなわち、任意遺伝子が双方のゲノムにおいてＫＯされた正常クローン哺乳動物細胞及び正常クローン非ヒト哺乳動物を、効率的に作出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
相同遺伝子組換えを利用してゲノム上の任意の遺伝子を改変（ＫＯ等）する遺伝子ターゲッティング技術は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が樹立されているマウスでは一般的な手法として広く用いられており、種々の遺伝子ＫＯマウスの作製に貢献している。すなわち、動物細胞の体細胞は二倍体であるため、ＫＯ動物の作製の目的を達成するためには少なくても２度同一の方法を実施して、双方のゲノムの目的遺伝子をＫＯする必要がある。しかし、このこの双方のゲノムの目的遺伝子をＫＯするのは極めて困難である。
【０００３】
そこでマウスにおいては、半数体である生殖細胞にキメラマウスを通して分化することができる胚幹細胞（ＥＳ細胞）を用いて、実施されている。具体的には、マウスＥＳ細胞に特定遺伝子を導入し、突然変異体ＥＳ細胞を選択する。この細胞を正常胚盤胞に注入し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスの生殖細胞を通して子孫へ突然変異がヘテロに伝達され、ヘテロ型の雌雄の交配によって二倍体の対立遺伝子をホモ型の突然変異を有するマウスを作出することができる。この方法を用いて特定遺伝子が破壊されたＫＯマウスが作製されている。
【０００４】
遺伝子ターゲッティング技術が、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）においても可能となれば、各種産業分野への貢献度は非常に大きなものになると期待されている。しかし、家畜等においては有効なマウスのように、ＥＳ細胞が樹立されていないこと、及び、マウスと同様の作製方法では遺伝子改変個体を得るために非常に長期間を要することなどから、この技術の活用はほとんど進展がなかった。
【０００５】
一方、１９９７年にWilmutらにより、ヒツジ体細胞を用いた核移植クローン技術が報告された(Nature, 385，810-813，1997)。この体細胞クローン技術とドナー体細胞に対する遺伝子ターゲッティング技術を組み合わせることにより、家畜等での遺伝子ターゲッティング手法による遺伝子改変動物作製が現実化してきた。実際、これまでにヒツジおよびブタにおいて体細胞に対し遺伝子ターゲッティング操作を行い、クローン個体を作製した例が数例報告されている（McCreathら； Nature, 405, 1066-1069, 2000; Dai ら；Nat Biotechnol., 20, 251-255, 2002）。本発明者らも、ウシにおいて体細胞を用いた遺伝子ターゲッティング（ヘテロＫＯ：１染色体上の遺伝子をＫＯ）を成功させている(特開２００２−１７３６０号公報；Sendaiら、Transplantation, 76, 900-903, 2003)。
【０００６】
しかし、体細胞を用いた遺伝子ターゲッティング技術は多くの不確定要素があり、相同遺伝子組換えを起こした細胞の樹立効率は極めて低く、解決すべき課題も多い。具体的には、遺伝子ターゲッティングに使用する体細胞の種類、培養法、ターゲッティングベクター(以下「ＴＶ」という)の構築、遺伝子導入・選別法など各段階での最適条件の確立が必要とされる。特に、体細胞を用いて任意遺伝子を完全にＫＯ(ホモＫＯ)するためには、１対の染色体上それぞれに存在する対象遺伝子をターゲッティングする必要があるため、２回ターゲッティング操作が必要であり、それぞれの操作には選別用耐性遺伝子を変えた２種類のＴＶを構築・使用する必要がある。しかしここで、構築した２種類のＴＶが同程度に相同組換えを起こすという保証は無く、これはホモＫＯ細胞を効率的に取得する上で非常に大きな課題となっている。
【０００７】
本願発明者らは、既報(特開２００２−１７３６０号公報；Sendaiら、Transplantation, 76, 900-903, 2003)においてα１，３ＧＴ遺伝子(以下「α１，３ＧＴ」という)の遺伝子ターゲッティング（ヘテロＫＯ）を実施しており、先に述べたいくつかの基本的課題を解決している。しかし、ホモＫＯ細胞樹立のため選別用耐性遺伝子を変更したＴＶを構築・使用し、ターゲッティング操作を実施したが、ホモＫＯ細胞は樹立出来ず、ＴＶの違いによるターゲッティング効率の違いを確認するに至った。
【０００８】
したがって、これまで、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）においても、確実かつ効率的にゲノム上の特定遺伝子をホモに改変できる（例えば、ホモＫＯが可能な）遺伝子ターゲッティング技術は開発されておらず、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）については、その遺伝的な改変が要望されつつも、その現実的な実現が難しい状況にあった。そこで、該技術が開発されれば、各種産業分野への貢献度は非常に大きなものになると期待される。
【０００９】
【特許文献１】特開２００２−１７３６０号公報。
【非特許文献１】Nature, 385，810-813，1997。
【非特許文献２】Nature, 405, 1066-1069, 2000。
【非特許文献３】Nat Biotechnol., 20, 251-255, 2002。
【非特許文献４】Transplantation, 76, 900-903, 2003。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）に対しても適用可能な、哺乳動物体細胞を用いた任意遺伝子の遺伝子ターゲッティングを効率的に達成し、体細胞の任意遺伝子が組換体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を効率的に樹立する方法、該ホモ改変哺乳動物細胞を用いてゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を効率的に作出する方法、及び、該ホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法或いはホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法により樹立或いは作出された、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞、或いは、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、哺乳動物体細胞を用いた任意遺伝子（α１，３ＧＴ：α１，３ガラクトシルトランスフェラーゼ ）の遺伝子ターゲッティングを効率的に達成する方法を提供することを目的とし、更に、任意遺伝子の改変として、該遺伝子のＫＯを題材として、該遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモにＫＯされたホモＫＯ哺乳動物細胞の効率的な取得方法の開発を目指して鋭意検討した結果、相同組換えが高頻度で起きたＴＶをもとに、ヘテロＫＯ及びホモＫＯ化のターゲッティング操作の両方に使用できるＴＶを構築すれば、この問題点を解決できると考えた。
【００１２】
具体的には、ゲノム中の任意の領域を特異的に改変するＣｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを利用し、ターゲッティングが成功したＴＶの耐性遺伝子ユニットを挟むように２個のｌｏｘＰ配列を挿入したＴＶを構築した。ここで、ｌｏｘＰ配列に挟まれた耐性遺伝子ユニットは、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理により組換え体ゲノム中より除去される。１回目のターゲッティング操作で得られたヘテロＫＯ細胞に対してＣｒｅ組換え酵素発現処理をすることにより耐性遺伝子ユニットを除去し、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロＫＯ胎子を作製し胎子由来線維芽細胞を取得、続いて、このヘテロＫＯ胎子由来線維芽細胞に対して同様のＴＶを使用し２回目のターゲッティング操作を行うことにより、２本の染色体中に存在するα１，３ＧＴを完全にＫＯしたウシ線維芽細胞を樹立することに成功した。
【００１３】
この方法により、同じＴＶを用いて２回のターゲッティング操作を行うことが可能となり、ターゲッティング操作における相同組換えの確実性を増して、確実かつ効率的にホモ改変哺乳動物細胞の取得が可能となることを見い出し、本発明を完成するに至った。本発明で樹立される組換え体ゲノム中においてホモに改変された哺乳動物細胞は、これを用いて、マウスのようにＥＳ細胞が樹立されていないような哺乳動物（家畜）においても、ゲノム中において遺伝子がホモに改変された非ヒト哺乳動物を確実かつ効率的に作出することができる。本発明の方法は、哺乳動物細胞における任意遺伝子の改変、「ノックアウト」及び「ノックイン」の場合に適用することができる。
【００１４】
すなわち、本発明は、遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することからなる体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法からなる。
【００１５】
また、本発明は、該ホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法によって樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を包含する。更に、本発明は、本発明の方法によって樹立されたホモ改変哺乳動物細胞を用いて、ゲノム中において任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト動物の作出方法及び該方法により作出されたホモ改変非ヒト動物を包含する。
【００１６】
すなわち具体的には本発明は、（１）遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することを特徴とする体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（２）耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたターゲッティングベクターが、耐性遺伝子ユニットがｌｏｘＰ配列に挟まれて組込まれたターゲッティングベクターであることを特徴とする前記（１）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（３）耐性遺伝子ユニット脱離操作が、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニットの組換体ゲノム中よりの除去操作であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（４）第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得する操作が、第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第２のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得することを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（５）哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（６）哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞が、ウシ、ブタ、又はヒツジのホモ改変線維芽細胞であることを特徴とする前記（４）又は（５）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法や、（７）前記（１）〜（６）のいずれか記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞からなる。
【００１７】
また本発明は、（８）哺乳動物体細胞の任意遺伝子として、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトしたことを特徴とする前記（７）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞や、（９）前記（７）記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することを特徴とする任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法や、（１０）前記（７）記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産が、前記（７）記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後飼養して産子を出産することにより行われることを特徴とする前記（９）記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法や、（１１）哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする前記（９）又は（１０）記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法や、（１２）ホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物が、ウシ、ブタ、又はヒツジであることを特徴とする前記（９）〜（１１）のいずれか記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法からなる。
【００１８】
更に本発明は、（１３）前記（９）〜（１２）のいずれか記載のホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法により作出された任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動や、（１４） ホモ改変非ヒト哺乳動物が、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトされたホモ改変非ヒト哺乳動物であることを特徴とする前記（１３）記載のホモ改変非ヒト哺乳動物からなる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、胎子由来線維芽細胞のような体細胞を用いて任意遺伝子を効率的にターゲッティングする方法が提供される。すなわち、本発明の方法により、胎子由来線維芽細胞のような体細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにより遺伝子改変哺乳動物細胞を樹立するに際して、同じＴＶを用いて２回のターゲッティング操作を行うことが可能となり、ターゲッティング操作における相同組換えの確実性を増して、確実かつ効率的にホモ改変哺乳動物細胞の取得が可能となった。この本発明のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法は、体細胞クローン生産技術と併用することにより、マウス、ヒト以外の哺乳動物でも任意遺伝子を自由に改変した個体を効率的に作製する基盤技術として展開することができる。すなわち、この遺伝子改変哺乳動物細胞を用いて、ゲノム中において遺伝子がホモに改変された非ヒト哺乳動物を確実かつ効率的に作出することができ、マウスのようにＥＳ細胞が樹立されていないウシ、ブタ、ヒツジのような哺乳動物（家畜）に適用して、従来、その遺伝的な改変が困難であった、これらの哺乳動物についても、確実かつ効率的にゲノム上の特定遺伝子がホモに改変されたホモ改変哺乳動物を作出することを可能にした。
【００２０】
本発明の方法は、上記のとおり、マウス以外の哺乳動物（家畜）においても、哺乳動物細胞における任意遺伝子の「ノックアウト」及び「ノックイン」の改変を行って、有用な特性を有する遺伝的に改変された哺乳動物を作出することができる。したがって、本発明の方法は、その遺伝的な改変が要望されていた、マウス以外の他種哺乳動物（家畜等）について、その遺伝的な改変の現実的な手法を提示し、該手法の開発によって、各種産業分野への大きな貢献が期待されるものである。また、本発明の実施例で樹立したα１，３ＧＴ−ＫＯ細胞は、該ＫＯ細胞を用いて体細胞クローニングを行い、得られたホモにＫＯされたα１，３ＧＴ−ＫＯ動物は、全ての組織・臓器においてそれを構成する細胞表面の糖鎖構造が変化しヒトに類似したものとなり、これらの哺乳動物の組織・臓器をヒトに移植しても超急性拒絶反応が起きず、異種臓器移植の有効なドナーとなる。従って、本発明は、ヒトにとって有用な遺伝子改変動物を作製する上で大いに威力を発揮するものと期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたＴＶ（ターゲッティングベクター）を構築し、該ＴＶを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたＴＶを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することからなる。
【００２２】
本発明において、対象とされる哺乳動物体細胞は、特に限定はされないが、本発明においてその作出を目的とするホモ改変非ヒト動物との関連において、従来、ＥＳ細胞を用いての遺伝子のホモ改変が既に行われているマウス以外の哺乳動物（家畜）の体細胞の場合が、特に有益に利用できる対象として挙げることができる。特に、入手の容易性や体細胞クローン技術が比較的安定化している家畜が好ましく、とりわけ、ウシ、ブタ、ヒツジ等が好ましい。また、本発明の体細胞の種類は特に限定されるものではないが、増殖能力の高さおよび遺伝子導入の容易さから線維芽細胞が好ましく、特に胎子に由来する線維芽細胞が最も好ましい。
【００２３】
本発明において、本発明のＴＶの構築に用いられるＴＶとしては、動物細胞のターゲッティング操作に用いられている公知のＴＶを適宜用いることができるが、
本発明の実施例においては、ウシα１，３ＧＴゲノミックＤＮＡの触媒領域をコードしている部位を含んだクローンを用いた（Transplantation, 76, 900-903, 2003；特開２００２−１７３６０号公報）。本発明において用いられるＴＶの構築に際しては、構築されたＴＶの耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能なように組込まれる。耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたＴＶとしては、耐性遺伝子ユニットがｌｏｘＰ配列に挟まれて組込まれた構造を採用することができる。
【００２４】
本発明の方法において、該耐性遺伝子ユニットは、第１のターゲッティング操作を行ってヘテロ改変哺乳動物細胞を取得した後に、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニット脱離操作によって、組換体ゲノム中より除去される。これらのターゲッティング操作やＣｒｅ組換え酵素発現処理は、いずれも公知の操作手段にしたがって実施することができる。
【００２５】
本発明において、任意遺伝子のホモ改変動物細胞を構築するには次のような操作によって実施することができる：すなわち、ターゲッティング操作用のＴＶを構築した後、第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変された哺乳動物細胞を取得する。該ヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第２のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得する。この方法によれば、同じＴＶを用いて２度のターゲッティング操作が可能となり、相同組換えの確率を上げて、確実にかつ効率的に任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変された哺乳動物細胞を取得することができる。
【００２６】
本発明の方法により、マウス以外の哺乳動物（家畜）においても、哺乳動物細胞における任意遺伝子の「ノックアウト」及び「ノックイン」の改変を行い、任意遺伝子が、組換え体ゲノム中においてホモに改変された哺乳動物細胞を取得することができるが、特に、任意遺伝子のＫＯされた哺乳動物細胞の樹立に用いて、任意遺伝子のＫＯされたホモ改変哺乳動物細胞の取得に有利に用いることができる。
【００２７】
本発明のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法の具体的方法について、遺伝子のＫＯの場合例示して、説明すると：本発明のα１，３ＧＴを用いた効率的ターゲッティングの具体的方法は、以下の実施例に記述されており、その原理は図１に模式的に示されている。以下の実施例では、ウシα１，３ＧＴゲノム遺伝子の２領域(エクソン８を含む６．３ｋｂ ＥｃｏＲＶ断片及び酵素触媒領域のエクソン９中の０．８ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ断片)が５´側及び３´側に位置するように、ｌｏｘＰ配列に挟まれた選別用耐性遺伝子ユニット(ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ)を配して構築した１種類のＴＶを使用してターゲッティング操作(１回目)を行い、正しく相同組換えが起きたヘテロＫＯ細胞株に対してＣｒｅ組換え酵素発現処理（Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換え）をして選別用耐性遺伝子ユニットをゲノム中より除去し、再度同様のTVを用いて最終的なホモＫＯ細胞株取得のためのターゲッティング操作(２回目)を行うことにより、ウシ胎子由来線維芽細胞のウシα１，３ＧＴを効率的に完全ＫＯした。この細胞は活発に増殖し、凍結保存可能な細胞であり、更に、体細胞クローン個体作製のためのドナーとして使用することができる。
【００２８】
本発明においては、本発明において樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変動物細胞を用いて、任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト動物を作出することができる。該ホモ改変非ヒト動物を作出するには、該ホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することにより行うことができる。該ホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産は、該ホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後養育して産子を出産することにより行うことができる。これらの操作における、細胞の処理方法及び核移植は、公知の方法を用いて実施することができる（Theriogenology 62, 714-728,2004;特開２００３−５２３３６９号公報）。
【００２９】
本発明のホモに改変された哺乳動物細胞の作出方法は、ＥＳ細胞の樹立されていないウシ、ブタ、又はヒツジのようなマウス以外の哺乳動物（家畜）の遺伝的に改変された哺乳動物の作出に適用して、任意遺伝子がゲノム中においてホモに改変された哺乳動物を、確実かつ効率的に作出することができる。
【００３０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
［１．ターゲッティングベクター(ＴＶ)の構築］
ＴＶ（ｐＧＴ−２２）の構築はSendaiらの方法(Transplantation, 76, 900-903, 2003)により、黒毛和牛α１，３ＧＴゲノムＤＮＡ（clone−ＪＡ８）からベクター構築に必要な領域をサブクローニングして行った。ｐＧＴ−２２ベクターはＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット(ＩＲＥＳ配列を持つβガラクトシダーゼ結合ネオマイシン耐性遺伝子)（pBIKS(-)IresBgeopAベクター(理化学研究所)由来）の５´側及び３´側にα１，３ＧＴゲノムＤＮＡが位置するように構築した。５´側には、α１，３ＧＴゲノムＤＮＡのエクソン８(Ｅ８)領域を含むＥｃｏＲＶ(タカラバイオ社製)消化断片（６．３ｋｂ）を使用し、３´側には、α１，３ＧＴの酵素触媒領域のエクソン９(Ｅ９)のＨｉｎｄIII(タカラバイオ社製)−ＢａｍＨＩ(タカラバイオ社製)消化断片（０．８ｋｂ）を使用した（図１）。
【００３２】
更に、ＴＶはＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを挟むようにｌｏｘＰ配列（３４ｂｐ：ｐＢＳ２４６ベクター(ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製)由来）を２箇所に挿入した。ＴＶを導入し正しく相同組換えが起こった場合、ウシα１，３ＧＴゲノムＤＮＡ中の酵素触媒領域(Ｅ９)のＲＮＡ転写が阻害され、α１，３ＧＴは不活化する。また、ＴＶのｌｏｘＰ配列に挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットは、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理により組換え体ゲノムＤＮＡより除去される（図１）。ここでＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット除去後のα１，３ＧＴも、酵素触媒領域(Ｅ９)のＲＮＡ転写が阻害され（フレームシフト等によるタンパク質合成阻害）、不活化状態を維持する。
【００３３】
［２．ウシ胎子由来線維芽細胞株の樹立］
全農ＥＴセンター所有の黒毛和種の雌牛(ふくみ)に凍結精液（黒毛和牛，第７糸桜）を人工授精し、７日後に得られた受精卵４卵を発情を同期化させた受卵牛に移植した。胎齢４９日目、胎子を無菌的に回収し、頭部および消化器官を除去した後、解剖バサミで細かく切り刻み、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO BRL社製）処理(４℃、１２時間)して細胞を分散・分離し、培養して増殖してくる線維芽細胞を初代培養(３７℃、５％Ｃ０２／９５％空気)して細胞株とした(＃９０６株)。この株を用いＴＶの導入・選別培養を実施した。
【００３４】
［３．ウシ胎子由来線維芽細胞へのＴＶの導入および選別培養］
胎子由来線維芽細胞を１０％ ＦＣＳを含むＭＥＭα培地（GIBCO BRL社製）２ｍｌを培養液とし、２万細胞／穴となるよう６穴細胞培養プレート(greiner社製)４枚に播種した。播種後２日目、制限酵素Ｎｏｔ Ｉ(タカラバイオ社製)消化し、直線化したＴＶを導入した。導入方法は、以下の通りである。まず、培養プレートより培養液を除去した後、そこへ１ｍｌ（１穴当たり）の遺伝子導入用培地（TransFast試薬（Promega社製）使用時：１ｍｌ ＭＥＭα培地に２μｇのＴＶ、６μｌのTransFast試薬を使用、Lipofectamine−ＰＬＵＳ試薬（GIBCO BRL社製）使用時：１ｍｌ ＭＥＭα培地に２μｇのＴＶ、８μｌのLipofectamine試薬、１２μｌのＰＬＵＳ試薬を使用）を添加し、インキュベーター（タバイエスペック社製）(３７℃、５％ ＣＯ２／９５％空気)内で６０分(TransFast試薬使用時)若しくは１８０分（Lipofectamine-PLUS試薬使用時）間培養した。
【００３５】
その後、１０％ ＦＣＳを含むＭＥＭα培地、1穴当たり２ｍｌを上記に加え、インキュベーター(３７℃、５％ ＣＯ２／９５％空気)内で培養した。２４時間後、０．４ｍｇ／ｍｌの濃度となるようにネオマイシン（商品名 Geneticin，GIBCO BRL社製）を各穴に加えた。更に、２４時間後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（GIBCO BRL社製）処理（５分）し、６穴細胞培養プレートより細胞を剥がして４８穴細胞培養プレート(greiner社製)８枚に播き直した。播き直し後、３日目、６日目に培養液を交換し、１０日目前後になるとネオマイシン耐性コロニーが出現するので、それぞれをトリプシン処理により剥がし４８穴細胞培養プレート２枚に分割し継代した（１枚目をＰＣＲ解析、２枚目をサザンブロット解析及び凍結保存用に使用）。４８穴細胞培養プレートでの培養に用いる培養液量は４００μｌ／穴、その他の条件は６穴細胞培養プレート使用時と同じである。
【００３６】
［４．ＰＣＲ解析による相同組換え体の判定］
４８穴細胞培養プレート２枚に分割して継代したネオマイシン耐性細胞は、２〜３日後にコンフレントとなり、１枚をＰＣＲ法による相同組換え体の判定に使用した。４８穴細胞培養プレートにＤＮＡ抽出バッファー（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ(ｐＨ８．５)、５０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４５％ ＮＰ−４０、０．４５％ Tween−２０）を１穴当たり５０μｌ加えた。そこにProteinase Ｋ(ナカライテクス社製)(１００μｇ／ｍｌ)を加え、５５℃で７０分間インキュベートし、さらに１００℃で１０分間インキュベートした。インキュベート終了後、ＤＮＡサンプルは４℃で保持し、ＰＣＲに使用した。ＰＣＲは１サンプル当たり、テンプレート(ＤＮＡ抽出サンプル)５μｌ、anti-Taq high用１０×ＰＣＲ buffer（TOYOBO社製）２．５μｌ、センスプライマー（１０pmoles／μｌ）０．２５μｌ、アンチセンスプライマー(１０pmoles／μｌ)０．２５μｌ、ｄＮＴＰｓ mixture (２ｍＭ each) ２μｌ、anti-Taq high(TOYOBO社製)＋ ｒＴａq ＤＮＡポリメラーゼ(TOYOBO社製)混合液０．２５μｌ、滅菌蒸留水にて計２５μｌになるように調整し実施した。
【００３７】
解析に用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。センスプライマー(Ｐ１)：5’-ACCGCTATCA GGACATAGCG TTGG-3’、アンチセンスプライマー(Ｐ２)：5’-CTGGAGACCA CCCACACTGC CTGG-3’（図１）。また、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理後のＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット除去の確認に用いたプライマーの塩基配列は次の通りである。センスプライマー(Ｐ３)：5’-AGTAGTTGCC AAGGGTCGGC-3‘、アンチセンスプライマー(Ｐ２)（図１）。ＰＣＲの条件は、９４℃ ２分を１回の後、９４℃ １分、５７℃ １分３０秒、７２℃ ２分を３５回、その後，７２℃ １０分を１回行った。反応終了後，１％ アガロースゲルを用いて，電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色により相同組換えの判定をおこなった。正しく相同組換えが起きている場合は、約１．６ｋｂのＰＣＲ産物が増幅される。また、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理によりＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットが除去された場合、約１．４ｋｂのＰＣＲ産物が増幅される。
【００３８】
［５．Ｃｒｅ組換え酵素発現処理によるＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去］
ヘテロ相同組換え細胞及びホモ相同組換え細胞のゲノム中からのＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去は、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムを使用することにより行った。ＰＣＲ陽性となった細胞と同一クローン由来の細胞を継代していく段階で、Ｃｒｅ組換え酵素を一過的に発現する組換えアデノウイルス（ＡｘＣＡＮＣｒｅ：理研ジーンバンク、ＲＤＢ Ｎｏ．１７４８）を定法に従い感染処理することにより、細胞内にＣｒｅ組換え酵素を発現し、ｌｏｘＰ配列に挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを除去した。ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去確認はＰＣＲ解析およびサザンブロット解析により行った（図２）。
【００３９】
［６．サザンブロット解析による相同組換え体の判定］
ＰＣＲ陽性となった細胞と同一クローン由来の細胞を、４８穴細胞培養プレートから回収し、１２穴細胞培養プレート(greiner社製) に継代、４８時間後更に６穴細胞培養プレートの２穴に継代、その４８時間後に７５ｃｍ２細胞培養フラスコ(greiner社製)に継代してコンフルエントになった段階で一部を凍結保存，一部をサザンブロット解析のゲノム調整での確認用に７５ｃｍ２細胞培養フラスコ２本に継代した。サザンブロット解析用ゲノムＤＮＡの調整は、定法に従い行った。サザンブロット解析は、細胞より調整したゲノムＤＮＡを制限酵素ＸｂａＩ(タカラバイオ社製)で充分消化後、０．８％アガロース電気泳動、ナイロンメンブレンへの転写、プローブハイブリダイゼーション、ＢＡＳ５０００（富士フイルム社製）による視覚化の手順で行われた。
【００４０】
プローブはＴＶの短椀領域(０．８ｋｂ ＨｉｎｄIII−ＢａｍＨＩ消化断片)を３２Ｐ−標識して使用した。正しく相同組換えが起こった場合は，ヘテロ相同組換え体においては１３ｋｂ(野生型アレル由来)と７ｋｂ(組換え体アレル由来)の二本バンドが確認できる（図１，２）。また、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理によりＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットが除去された場合、組換え体アレル由来の７ｋｂのバンドは、ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニット中のＸｂａＩ切断部位が消失することにより１０．５ｋｂへシフトする（図１，２）。
【００４１】
［７．遺伝子改変体細胞クローン胚作製と胎子回収、及びＫＯクローン牛の生産］
と蓄場由来のウシ卵胞卵子を体外成熟培養(５％ウシ胎子血清添加ＴＣＭ１９９培地（GIBCO BRL社製）、５％ＣＯ２／９５％空気、３８℃)し、培養開始１９〜２０時間目に卵丘細胞を除去した後、第１極体側から卵細胞質を約１／３取り除き除核した。ＰＣＲ及びサザンブロット解析でヘテロまたはホモKOが確定した細胞(＃３−４６Ｃｒｅ又は＃Ｈ１−３８Ｃｒｅ)を１０％ウシ胎子血清添加Ｄ−ＭＥＭ培地（GIBCO BRL社製）（５％ＣＯ２／９５％空気、３８℃）で３日間培養して核移植に使用した。細胞の処理方法及び核移植は、浦川らの方法（Theriogenology 62, 714-728, 2004：特開２００３−５２３３６９号公報）に従って行った。
【００４２】
細胞融合は、除核卵子の囲卵腔に樹立したヘテロまたはホモＫＯ細胞(＃３−４６Ｃｒｅ又は＃Ｈ１−３８Ｃｒｅ、又は＃２７０)を挿入し、微少電極で直流パルス（Bex社製、２５Ｖ／１５０μｍ、１０μ秒）を1回負荷した。その後，ステンレスチャンバー中で再度電気負荷を１回与えた（ＥＣＦ−２００１:理工化学研究所、１００Ｖ／ｍｍ、６０μ秒）後、５μＭ Ｃａ−イオノホア(SIGMA社製，Ｃ−７５２２)及び１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（SIGMA社製，Ｃ−７６９８）で活性化を行った（Aoyagi ら； Thriogenology 41，Abstr. 157，1994）。核移植の翌日、核移植胚は５％ウシ血清添加ＣＲ１ａａ培地でウシ卵管上皮細胞と共培養を行い、６日目に移植可能胚を発情後７日目の受卵牛（ホルスタイン種）１頭に３胚移植し、４１日齢の遺伝子改変胎子を回収した。
【００４３】
＃Ｂ２７０細胞をドナーとしたクローン胚は、受卵牛に移植し妊娠確定後、胎子回収はせず産子の作出試験に供した。受卵牛への核移植胚の移植から胎子回収及び出産までの飼養管理は全農ETセンター所有閉鎖系牛舎内で「組換えＤＮＡ実験指針」および「遺伝子組換え生物等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」に則って実施された。胎子を回収した後のと体および糞便は焼却処理した。回収した遺伝子改変胎子は細断し、線維芽細胞の初代培養を行った。培養開始数日後、増殖中の細胞の一部よりゲノムＤＮＡを調整しＰＣＲ及びサザンブロット解析でヘテロ相同組換えおよびホモ相同組換えの確認を行った。
【００４４】
［８．細胞表面αＧａｌ糖鎖解析］
細胞表面のαＧａｌ糖鎖の解析は、αＧａｌ糖鎖を特異的に認識するバンデリアマメレクチン(BS-I Isolectin Ｂ４)を用いた蛍光標識レクチン−ＦＡＣＳ解析により行った。培地を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ処理により単離・浮遊化する。浮遊化した細胞を、ＦＩＴＣ標識−ＢＳ−Ｉ(Ｂ４)(SIGMA社製, L2895)で処理し、結合性をＦＡＣＳ解析装置(ベクトン・デッキンソン社製)で調べた。
【００４５】
［９．細胞の増殖能力試験］
樹立した細胞株(＃２７０)の増殖能力の解析は、一定期間培養後の細胞数を＃９０６株（オリジナル株）と比較することにより行った。２４穴細胞培養プレートに、＃Ｂ２７０細胞及び＃９０６細胞をそれぞれ１穴あたり４０００細胞播種し、播種後２日目、及び４日目の細胞数をトリプシン−ＥＤＴＡ処理で分散させた後、コールターカウンター(ベックマン-コールター社製)で算出した。
【００４６】
［結果］
１．＃９０６株(α１，３ＧＴ＋／＋)に対して４回のヘテロＫＯ化の導入実験（TransFast試薬、２回：Lipofectamine−ＰＬＵＳ試薬、２回）をした結果、４個(４／１１５２)のＰＣＲ陽性細胞が得られた（表１）。順調な細胞増殖を示した細胞株に対してサザンブロット解析を行い、相同組換え体(＃３−４６株:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)を同定した（図２：レーン２）。
【００４７】
【表１】
（表１に、この実施例で行った、胎子線維芽細胞(＃９０６株)及びα１，３ＧＴヘテロＫＯ胎子線維芽細胞(＃３−４６ＣｒＮ株)に対してｐＧＴ−２２ベクターを用いてヘテロＫＯ化及びホモＫＯ化を実施した結果をまとめた。）
【００４８】
２．ウシ胎子由来線維芽細胞を用いた遺伝子ターゲッティングにおいて、相同組換え体取得にはLipofectamine−ＰＬＵＳ試薬よりTransFast試薬の方が相同組換えを起こす頻度が高く組換え体取得が効率的あることが示唆された（表１）。
【００４９】
３．＃３−４６株に対して組換えアデノウイルス導入系Ｃｒｅ組換え酵素を一過的に発現することにより、ｌｏｘＰ配列で挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを除去した（＃３−４６Ｃｒｅ株:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−）（図２：レーン３）。組換えアデノウイルス導入系Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換えシステムがウシ体細胞においても有効に機能することが確認できた。
【００５０】
４．＃３−４６Ｃｒｅ細胞を用いて核移植を行い３５個の核移植胚を作製した。核移植後３日目に２２個(６２．９％)の核移植胚が卵割し、６日目に４個(１１．４％)の核移植胚が小型化桑実胚以降のステージに発生した（表２）。小型化桑実胚以降に発育した３個の移植可能胚を１頭の受卵牛に移植し、胎齢４１日目に胎子回収を試みた結果、1個体が回収できた。
【００５１】
【表２】
（表２に、この実施例で行った、α１，３ＧＴヘテロＫＯ細胞(＃３−４６Ｃｒｅ株)及びα１，３ＧＴホモＫＯ細胞(＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ株)を用いた核移植試験の結果をまとめた。）
【００５２】
５．回収したクローン胎子(＃３−４６Ｃｒｅ細胞由来)より線維芽細胞株（＃３−４６ＣｒＮ株）を樹立し、増殖細胞の一部でヘテロ相同組替えの確認をサザンブロット解析により行った結果、ヘテロ相同組換え体(α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)であることが確認できた（図２：レーン４）。
【００５３】
６．ｐＧＴ−２２ベクターを使用し、＃３−４６ＣｒＮ株に対して３回のホモＫＯ化の導入実験をした結果、２７個(２７／５０８)のＰＣＲ陽性細胞が得られた。順調な細胞増殖を示した細胞株に対してサザンブロット解析を行い、相同組換え体(＃Ｈｌ−３８株:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)を同定した（図２：レーン５）。また、Ｃｒｅ組換え酵素を発現しｌｏｘＰ配列で挟まれたＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットを除去した（＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ株: α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−）（図２：レーン６）。
【００５４】
７．＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ細胞を用いて核移植を行い３６個の核移植胚を作製した。核移植後３日目に２３個(６３．９％)の核移植胚が卵割し、６日目に７個(１９．４％)の核移植胚が小型化桑実胚以降のステージに発生した（表２）。小型化桑実胚以降に発育した３個の移植可能胚を１頭の受卵牛に移植し、胎齢４１日目に胎子回収を試みた結果、１個体が回収でき、胎子は正常な発育形態を示していた（図３）。
【００５５】
８．回収したクローン胎子(＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ細胞由来)より線維芽細胞株（＃Ｂ２７０株）を樹立し、増殖細胞の一部でホモ相同組換えの確認を行った結果、サザンブロット解析でホモ相同組換え体(α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)であることが確認できた（図２：レーン７）。
【００５６】
９．＃Ｂ２７０株の細胞表面αＧａｌ糖鎖を調べる目的で、αＧａｌ糖鎖を特異的に認識するレクチン（ＢＳ−Ｉ Isolectin Ｂ４）の結合性をＦＡＣＳ解析で調べた結果、α１，３ＧＴホモ相同組換え細胞（＃Ｂ２７０株）は、α１，３ＧＴが不活化し、細胞表面のαＧａｌ糖鎖が消失していることが確認できた(図４)。
【００５７】
１０．＃Ｂ２７０株の細胞増殖能力を調べた結果、＃Ｂ２７０株は遺伝子改変前のオリジナル株である＃９０６株と同等の増殖能力を持つことが確認できた（図５−Ａ）。また、＃Ｂ２７０株は凍結・融解後においても高い細胞増殖能力を保持していることが確認できた（図５−Ｂ）。
【００５８】
１１．＃Ｂ２７０細胞をドナーとしてクローン個体の作製を検討した結果、借り親牛３頭にクローン胚移植を行い、その内１頭は妊娠を継続し、分娩まで至った。産子は分娩後まもなく死亡したが(生後直死)、形態的異常は見られなかった（図６−Ａ）。死因としては、誘起分娩を実施した時期が少し早かったため肺機能等が未発達状態であったことが考えられる。また、産子の腎臓組織より細胞を分離し、細胞表面のαＧａｌ糖鎖の解析を実施した結果、細胞表面のαＧａｌ糖鎖が消失していることが確認できた(図６−Ｂ)。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明の実施例で使用したα１，３ＧＴ−ＫＯ用ＴＶ（ｐＧＴ−２２ベクター）、相同組換え、及びＣｒｅ組換え酵素発現処理によるＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏユニットの除去を模式的に示す図である。
【図２】本発明の実施例の各段階で樹立した相同組換え体(細胞)のサザンブロット解析を示した図である。レーン１：＃９０６株(野生株:α１，３ＧＴ＋／＋)、レーン２：＃３−４６株(ヘテロＫＯ:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)、レーン３：＃３−４６Ｃｒｅ株(ヘテロＫＯ:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)、レーン４：＃３−４６ＣｒＮ株(ヘテロＫＯ:α１，３ＧＴ＋／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)、レーン５：＃Ｈｌ−３８株(ホモＫＯ:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ＋)、レーン６：＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ株(ホモＫＯ:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)、レーン７：＃Ｂ２７０株(ホモＫＯ:α１，３ＧＴ−／−・ＩＲＥＳ／ｌａｃＺ−ｎｅｏ−)＊：α１，３−ＧＴとは関連のない、プローブと反応する遺伝子断片。
【図３】本発明の実施例で回収した＃Ｈｌ−３８Ｃｒｅ由来核移植胎子（４１日齢）の写真である。胎子は羊膜に包まれた状態で、正常な発育形態を示している。この胎子から＃Ｂ２７０株を樹立した。
【図４】本発明の実施例で樹立した細胞の表面糖鎖をαＧａｌ糖鎖結合性レクチン(ＢＳ−Ｉ(Ｂ４))を用いてＦＡＣＳ解析した結果を示す図である。実線：蛍光色素標識レクチン染色細胞、点線：非染色細胞。
【図５】本発明の実施例で樹立した細胞(＃Ｂ２７０株)の増殖能力(Ａ)および凍結保存の影響(Ｂ)を解析した結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例で樹立した細胞(＃Ｂ２７０株)をドナーとして生産されたα１，３ＧＴ−ＫＯクローン子牛(Ａ)及び産子腎臓組織由来細胞の表面糖鎖をαＧａｌ糖鎖結合性レクチン(ＢＳ−Ｉ(Ｂ４))を用いてＦＡＣＳ解析した結果(Ｂ)を示す図である。実線：蛍光色素標識レクチン染色細胞、点線：非染色細胞。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することを特徴とする体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項２】
耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたターゲッティングベクターが、耐性遺伝子ユニットがｌｏｘＰ配列に挟まれて組込まれたターゲッティングベクターであることを特徴とする請求項１記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項３】
耐性遺伝子ユニット脱離操作が、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニットの組換体ゲノム中よりの除去操作であることを特徴とする請求項１又は２記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項４】
第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得する操作が、第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第２のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項５】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項６】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞が、ウシ、ブタ、又はヒツジのホモ改変線維芽細胞であることを特徴とする請求項４又は５記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞。
【請求項８】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子として、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトしたことを特徴とする請求項７記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞。
【請求項９】
請求項７記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することを特徴とする任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１０】
請求項７記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産が、請求項７記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後飼養して産子を出産することにより行われることを特徴とする請求項９記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１１】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする請求項９又は１０記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１２】
ホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物が、ウシ、ブタ、又はヒツジであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか記載のホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法により作出された任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
ホモ改変非ヒト哺乳動物が、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトされたホモ改変非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項１２記載のホモ改変非ヒト哺乳動物。
【請求項１】
遺伝子ターゲッティングを用いた哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変において、耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組み込まれたターゲッティングベクターを構築し、該ターゲッティングベクターを用いて第１のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてヘテロに改変されたヘテロ改変哺乳動物細胞を取得し、該ヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得することを特徴とする体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項２】
耐性遺伝子ユニットがターゲッティング操作後に脱離可能に組込まれたターゲッティングベクターが、耐性遺伝子ユニットがｌｏｘＰ配列に挟まれて組込まれたターゲッティングベクターであることを特徴とする請求項１記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項３】
耐性遺伝子ユニット脱離操作が、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理による耐性遺伝子ユニットの組換体ゲノム中よりの除去操作であることを特徴とする請求項１又は２記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項４】
第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞から、耐性遺伝子ユニットを耐性遺伝子ユニット脱離操作によって脱離させた後、第１のターゲッティング操作に用いたターゲッティングベクターを用いて第２のターゲッティング操作を行って、任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変哺乳動物細胞を取得する操作が、第１のターゲッティング操作を行って取得したヘテロ改変哺乳動物細胞に対して、Ｃｒｅ組換え酵素発現処理を行って耐性遺伝子ユニットを除去した後、この細胞を用いて体細胞核移植を行い、ヘテロ改変胎子を作成し、該胎子由来線維芽細胞を取得し、続いて該胎子由来線維芽細胞に対して第２のターゲッティング操作を行うことにより任意遺伝子が組換え体ゲノム中においてホモに改変されたホモ改変線維芽細胞を取得することを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項５】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項６】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞が、ウシ、ブタ、又はヒツジのホモ改変線維芽細胞であることを特徴とする請求項４又は５記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞の樹立方法により樹立された体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞。
【請求項８】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子として、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトしたことを特徴とする請求項７記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞。
【請求項９】
請求項７記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとし、クローン胚を形成した後、受卵動物に移植し、産子を出産することを特徴とする任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１０】
請求項７記載の哺乳動物体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞をドナーとするクローン胚の形成、該クローン胚の受卵動物への移植、及び、産子の出産が、請求項７記載の体細胞の任意遺伝子のホモ改変哺乳動物細胞を、除核卵子に挿入することにより核移植を行い、該核移植胚を培養後、受卵哺乳動物に胚移植し、妊娠確定後飼養して産子を出産することにより行われることを特徴とする請求項９記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１１】
哺乳動物体細胞の任意遺伝子の改変が、任意遺伝子のノックアウトであることを特徴とする請求項９又は１０記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１２】
ホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物が、ウシ、ブタ、又はヒツジであることを特徴とする請求項９〜１１のいずれか記載の任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか記載のホモ改変非ヒト哺乳動物の作出方法により作出された任意遺伝子がホモに改変されたホモ改変非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】
ホモ改変非ヒト哺乳動物が、α１，３ガラクトース転移酵素遺伝子についてノックアウトされたホモ改変非ヒト哺乳動物であることを特徴とする請求項１２記載のホモ改変非ヒト哺乳動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００６−２８８２８３（Ｐ２００６−２８８２８３Ａ）
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−１１３６７４（Ｐ２００５−１１３６７４）
【出願日】平成１７年４月１１日（２００５．４．１１）
【出願人】（５９１０３８９２３）株式会社機能性ペプチド研究所 (6)
【出願人】（０００２０１６４１）全国農業協同組合連合会 (69)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１１日（２００５．４．１１）
【出願人】（５９１０３８９２３）株式会社機能性ペプチド研究所 (6)
【出願人】（０００２０１６４１）全国農業協同組合連合会 (69)
【Ｆターム（参考）】
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