遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体
【課題】遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法を提供する。
【解決手段】芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて分岐型重合体とし、該分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体とした遺伝子導入剤。
【解決手段】芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて分岐型重合体とし、該分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体とした遺伝子導入剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて得られる分岐型重合体の、前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体よりなることを特徴とする。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させたことを特徴とする。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項２又は３において、前記分岐型重合体をハロゲン化炭化水素溶液中で光照射することにより架橋反応させたことを特徴とする。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とする。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記非イオン性モノマーが、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか1項において、前記分岐型重合体の分子量が１０，０００〜５００，０００であることを特徴とする。
【００１３】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーブロックの分子量が５，０００〜１５０，０００であることを特徴とする。
【００１４】
本発明（請求項１０）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックを架橋反応させて架橋体よりなる遺伝子導入剤を得る工程と、を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明（請求項１１）の核酸複合体は、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を有する芳香族化合物をイニファクターとし、これにカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーをリビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて合成した、芳香環を核として、基端側がカチオン性ポリマーブロックで先端側が非イオン性ポリマーブロックで構成される分岐鎖が、放射状に伸延する分岐型重合体（以下「第１次分岐型重合体」ということがある。）に光を照射するなどして、該第１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分を架橋させて得た架橋体よりなるものである。
【００１７】
この遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体の末端の少なくとも一部のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活していることにより、その第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロック同士が架橋してなる架橋体であると推察されるが、本発明者らによる種々の研究の結果、この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。
【００１８】
即ち、この遺伝子導入剤は、カチオン性の第１次分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個のカチオン性分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べて、その分岐鎖が入り組んだ複雑な３Ｄ構造により、ＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【００１９】
しかも、この第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロックの先端側に非イオン性ポリマーブロックが形成されているため、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた核酸複合体微粒子の粒子外周面にこの非イオン性ポリマーブロックが存在することにより、核酸複合体微粒子への血清タンパクの吸着が抑制される。即ち、カチオン性ポリマーブロックを内郭に配置してその外層へ非イオン性ポリマーブロックを配置することで、陽電荷を遮蔽し、水溶液中で斥力を働かせる分子設計がなされる。
【００２０】
なお、分岐鎖の基端側にカチオン性ポリマーブロックを有し、先端側に非イオン性ポリマーブロックを有する分岐型重合体の、先端側を架橋反応させて架橋体とすることによっても分岐鎖が入り組んだ複雑な３Ｄ構造の架橋体を構成して、核酸を高密度に凝縮することが可能であると考えられるが、この場合には、次のような不具合が考えられる。
(1) 非イオン性ポリマーブロックの先端が架橋点になるため、この非イオン性ポリマーブロックの内郭側に遮蔽したカチオン性ポリマーブロックが一部露出することになり、両ポリマーブロックを兼備することによる効果を両立させることができない。
(2) 架橋により、おそらくはカチオン性ポリマーブロックの配置が非イオン性ポリマーブロックを介して複雑に点在するようになることによって、陽電荷密度が低くなり、架橋前よりも活性が低下してしまうおそれがある。
【００２１】
本発明において、イニファターが有するＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としてはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましく（請求項３）、特にイニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項５）。また、イニファターの分岐鎖に光照射リビング重合させるカチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドが好ましく（請求項６）、一方、非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい（請求項７）。
【００２２】
また、第1次分岐型重合体の分子量は１０，０００〜５００，０００であることが好ましく（請求項８）、カチオン性ポリマーブロックの分子量は５，０００〜１５０，０００であることが好ましい（請求項９）。
【００２３】
本発明においては、第１次分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、カチオン性ポリマーブロック部分を架橋反応させて架橋体を得ることが好ましく（請求項２）、この場合において、第１次分岐型重合体をクロロホルム等の連鎖移動性の溶媒を用いた溶液中で光照射することにより架橋反応させることが好ましい（請求項４）。
【００２４】
このように、クロロホルム等の連鎖移動性の溶媒を用いた溶液中で第１次分岐型重合体に光照射することにより、おそらくは、第１次分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に光照射によって生じるラジカルがクロロホルム等の連鎖移動性の溶媒へ移動し、分岐鎖末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が脱離し、この分岐鎖先端の光反応性（架橋性）が消失する。そして、この結果、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、脱離前のものの該吸収ピークよりも減少したものとなる。このように分岐鎖先端の光反応性（架橋性）が消失した第１次分岐型重合体であれば、光照射を行った際に、この分岐鎖先端での光架橋は起こらず、基端側の、光に感光して自己架橋する性質を有するカチオン性ポリマーブロック、好ましくは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロック部分で架橋反応を起こし、複雑な３Ｄ構造を有する高次架橋体が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させてなる第１次分岐型重合体の、カチオン性ポリマーブロック部位を架橋反応させてなる架橋体よりなる。
【００２７】
即ち、第１次分岐型重合体に光を照射するなどして架橋反応させると、複数の第１次分岐型重合体が分子間架橋ないし分子内架橋して、分子量の異なる様々な分子間架橋体が生成するが、この架橋に先立ち、分岐鎖の先端に存在するＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を、脱離、除去、消失、失活、ないしは減量（本発明においては、このように脱離、除去、消失、失活、ないしは減量させることを「失活」と称す。）させて、この分岐鎖先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基に起因する光反応性（光架橋性）を消失ないしは低減することにより、この第１次分岐型重合体は、分岐鎖の先端ではなく、基端側のカチオン性ポリマーブロック部分で架橋反応するようになり、第１次分岐型重合体の分岐鎖のカチオン性ポリマーブロック部分で架橋された架橋体よりなる本発明の遺伝子導入剤が得られる。
【００２８】
この第１次分岐型重合体の分岐鎖の先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活したことは、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基のジチオカルバミル基に由来する特異的な波長２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収ピーク（以下「ＵＶ２８０ｎｍピーク」と称す。）が消失しているか、或いは、失活前に比べてＵＶ２８０ｎｍピークが大幅に減少していることから確認することができる。
【００２９】
＜第１次分岐型重合体＞
本発明に係る第１次分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロックを形成すると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させてなるものである。
【００３０】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３１】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３２】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００３３】
このイニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のカチオン性モノマーが好適なものとして挙げられるが、本発明においては、このカチオン性モノマーにより形成されるカチオン性ポリマーブロックが、架橋性を有すること、好ましくは光に感光して自己架橋（光解裂性官能基非由来性の架橋）する性質のものであることが重要であり、そのために、このカチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の自己架橋性カチオン性ビニル系モノマーが好ましい。
【００３４】
即ち、本発明者らは、カチオン性モノマーである３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド等のポリマーブロックは、非常に温和な条件である近紫外線の低照射強度（例えば、波長３７０ｎｍ，照射強度１ｍＷ／ｃｍ２程度）の光照射で自己架橋することを見出した。一般的に高分子材料の光架橋に関して当業者に周知のものは、γ線や電子線などの放射線によるポリマーの光分解（ポリプロピレン）や光架橋（ポリフッ化ビニリデン）であり、このようなカチオン性ポリマーブロックの光架橋は新規知見である。
【００３５】
この近紫外光での架橋反応のメカニズムは、現時点では推測でしかないが、側鎖のジメチルアミノ基の脱離が関与している可能性がある。すなわち、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドのジメチルアミノ基のｐＫａは約１０と非常に高く、このモノマーを加熱すると通常は４級アミンで起こるホフマン脱離反応が３級アミンでも起こり、結果、ジビニル体を形成して架橋が起こることが知られている。光照射でも同様の現象が起こっている可能性があり、言い換えれば、カチオン性モノマーでもｐＫａの高いもの（例えば９以上）であれば本発明へ使用できる可能性があると考えられる。
【００３６】
これらのカチオン性モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３７】
一方、非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル（このアルキル基の炭素数は１〜５が好ましい。）アクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。
【００３８】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びカチオン性モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しカチオン性モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００３９】
該原料溶液中のカチオン性モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。また、原料溶液中のイニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００４０】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００４１】
この光照射により、反応液中に分岐鎖にカチオン性ポリマーブロックが形成されたカチオン性分岐型重合体（カチオン性ホモポリマー）が生成するので、必要に応じ精製して目的物を得る。
【００４２】
このようにして得られたカチオン性ホモポリマーに対し、非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて目的とする第１次分岐型重合体とする。
【００４３】
ここで、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させる方法としては、
(1) アルカリ触媒の存在下に加水分解させることによりＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を除去する方法
(2) 非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に、反応溶媒としてクロロホルム、塩化メチレンなどの連鎖移動性の溶媒を用い、光照射時にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(3) Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチルベンゼンの存在下で希薄溶液で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(4) アスコルビン酸、ジアルキルアミン、システイン、メルカプトエタノール、安息香酸、酸素ガスなどラジカル補足剤として当業者に周知の化合物の水溶液中で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
などが挙げられるが、非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に併せてＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基の失活も行えることから、上記(2)の方法を採用することが好ましい。
【００４４】
上記(2)の方法を採用して、前述のカチオン性ホモポリマーに非イオン性モノマーを光照射リビング重合によりブロック共重合させると共に、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させるには、上記のようにして得られたカチオン性ホモポリマーを、クロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素のような連鎖移動性の溶媒に溶解させ、これに非イオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、非イオン性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４５】
このようにして、イニファターに対してまずカチオン性モノマーを光照射リビング重合させ、次いで非イオン性モノマーを光照射リビングブロック共重合させると共にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させることにより、基端側がカチオン性ポリマーブロック、先端側が非イオン性ポリマーブロックで構成され、かつ先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活することにより、分岐鎖の先端部分の光架橋性が消失ないしは低減されたブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する第1次分岐型重合体（ブロックコポリマー）を得ることができる。
【００４６】
本発明において、このブロックコポリマーよりなる第1次分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の数、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及び非イオン性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、１０，０００〜５００，０００、特に３０，０００〜１５０，０００であることが好ましい。第1次分岐型重合体の分子量が小さ過ぎると、本発明に好適な分岐型重合体の分子設計を十分に行うことができず、第1次分岐型重合体の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。また、第1次分岐型重合体を構成する前述のカチオン性ポリマーブロックの分子量及び、このカチオン性ホモポリマーに導入される非イオン性ポリマーブロックについても、分岐鎖の数や各々のポリマーブロックを構成するモノマーの種類等によって異なり、一概には言えないが、カチオン性ポリマーブロックの分子量は５，０００〜１５０，０００、特に１５，０００〜８０，０００で、非イオン性ポリマーブロックの分子量は１０，０００〜１５０，０００、特に３０，０００〜１００，０００であることが好ましい。カチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると核酸の吸着効果が低く、大き過ぎると細胞障害性が高くあり好ましくない。また、非イオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると非イオン性ポリマーブロックを導入したことによる陽電荷の遮蔽効果を十分に得ることができず、大き過ぎると必要以上に陽電荷を遮蔽して核酸とのイオン複合体（ポリプレックス）を形成しなくなってしまう。
【００４７】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４８】
＜第１次分岐型重合体の架橋＞
本発明では、上記のようにして得られた第１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分を架橋反応させて架橋体を得る。この架橋反応は、第1次分岐型重合体に光照射することによる光架橋反応で行うことが好ましい。
この第1次分岐型重合体の光架橋を行うには、次のｉ）又はii）の方法を採用することができる。
【００４９】
ｉ)第１次分岐型重合体を、その極性が高く、カチオン性ポリマーブロック中の側鎖のＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基と強い水素結合を形成して該ポリマーブロックの自己架橋を妨げる性質のある水およびメタノール以外の、例えば、ベンゼン、トルエン及びエタノール並びにこれらの混合溶媒など適宜の溶媒に溶解させ、光を照射することにより、第1次分岐型重合体を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は１〜２０重量％程度が好適である。
【００５０】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【００５１】
第１次分岐型重合体の形状としてフィルム状を採用した場合、フィルムの厚さは１０μｍ〜２０００μｍ程度、特に５０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましい。極端にフィルムが薄いと架橋効率が悪く、また極端にフィルムが厚いと光照射の効果が十分に得られない。
【００５２】
また、第１次分岐型重合体の形状を粉末状にした場合、粉末の粒径は０．１〜１０００μｍ程度特に１００〜５００μｍ程度が好ましい。粒径を極端に小さくすることは困難であるが、逆に粒径を大きくした場合は光照射の効果及び光架橋効率が低下する。
【００５３】
光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３００分、照射強度０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００５４】
このような光照射により、第１次分岐型重合体に含まれる自己架橋性のカチオン性ポリマーブロックが架橋反応を起こし架橋体が得られる。
【００５５】
なお、この架橋反応で得られる架橋体の分子量（重量平均分子量）には特に制限はないが、通常３０，０００〜３００，０００程度である。この分子量が小さ過ぎると第１次分岐型重合体を架橋したことによる本発明の効果を十分に得ることができず、大き過ぎると代謝性、生分解性などが劣るものとなる。
【００５６】
＜核酸複合体＞
上述のようにして第１次分岐型重合体を架橋反応させて得られた架橋体よりなる本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００５７】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーブロックを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５８】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５９】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６０】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６１】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６２】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６３】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６４】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６５】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６６】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６７】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６８】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６９】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００７０】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００７１】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００７２】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００７３】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００７５】
［実験例１］
ｉ）３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドのラジカル重合によるホモポリマーの合成
再結晶で精製したα,α'−アゾビスイソブチロニトリル０．１ｇをトルエン３０ｍＬへ溶解した。３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドは減圧蒸留で精製した（ｂ．ｐ．１０６℃−１１０℃，０．３ｍｍＨｇ）後に、１０ｇを分取し、トルエン２０ｍＬへ溶解した。トルエンは脱水溶媒グレードを使用し、使用前に２０分間の高純度窒素ガス（Ｇ１グレード）によるバブリング（２リットル／分）を行った。
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド溶液へα,α'−アゾビスイソブチロニトリル溶液を加えて混合し、窒素封管して５０℃で７２時間振盪した。開封後、エバポレーターで約１０ｍＬ容まで濃縮後に５００ｍＬのジエチルエーテルへ滴下し、ポリマー成分を回収した。その後、クロロホルム／ジエチエルエーテル系で６回再沈殿して精製した。エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマーを得た。
【００７６】
このものの分子量はＧＰＣにより４５，３００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５４）と測定された。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００７７】
ii）３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマーの近紫外光による光架橋
ｉ）で合成した３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマー０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へいれ、土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２リットル／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながら３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長３５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して１．０ｍＷ／ｃｍ２に調整した。照射終了後、得られた粉末を５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成した。この溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
【００７８】
このものの分子量はＧＰＣにより６５，５００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．７８）と測定され、光架橋により分子量の増大と分散のブロード化が確認された。
【００７９】
以上より、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマーが温和な近紫外光で光架橋が行えることが分かった。このような温和な光照射条件で架橋が可能なのは、このポリマーの側鎖のジメチルアミノ基のｐＫａが約１０ほどもある特殊性（例えば、側鎖の炭素数が１個少ない２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）エチルメタクリレートのｐＫａは７）に起因していると推定される。
【００８０】
［実験例２］
非イオン性モノマーであるＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドについて、上記実験例１のｉ），ii）に準拠してホモポリマーを合成し、近紫外線の光照射を行ったが、光照射を行っても分子量に変化は確認されず、架橋性のポリマーでないことが分かった。
【００８１】
［実施例１］
＜（ａ）イニファターの合成＞
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８２】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下にて室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００８３】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００８４】
【化１】
【００８５】
＜（ｂ）４分岐型スター形重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成＞
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性ビニル系モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８６】
即ち、上記（ａ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。この液を３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を４０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。
【００８７】
このカチオン性ホモポリマーの分子量はＧＰＣにより、５８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３３）と測定された。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００８８】
【化２】
【００８９】
＜（ｃ）ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの合成＞
（ｂ）で合成した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー３．５ｇを開始剤とし、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド７．４ｇを非イオン性モノマーとして４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの合成を行った。溶媒をクロロホルムとし、重合中の窒素パージを行わず、光照射時間を１０分間とした以外はすべて（ｂ）に準拠して合成を行った。精製も同様に行った。
【００９０】
得られた４分岐型スター型カチオン／非イオン性ブロックコポリマー（重合率３２％）は、ＧＰＣにより分子量８８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．２２）となった。
【００９１】
なお、この重合条件の元では、これ以上重合時間を延長しても分子量の増大は確認されず、リビング規則が崩壊していることが示唆された。また、ポリマーのＵＶ吸収スペクトルからは（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマーでは確認された、ジチオカルバミル基由来のＵＶ２８０ｎｍピークの強い吸収がほぼ消失しており、先のリビング規則崩壊の事実からも、溶媒であるクロロホルムへのラジカル連鎖移動反応により、ポリマー末端のジチオカルバミル基が脱離し、ポリマー末端の光反応性が消失したことが分かる。
【００９２】
【化３】
【００９３】
＜（ｄ）ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの光架橋＞
上記（ｃ）で得たポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの粉末０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２Ｌ／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながら（ｂ）と同じ光照射装置で光照射による重合を行った。照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射時間は２４０分で行った。照射終了後、得られた粉末は淡い黄褐色を帯びていた。この粉末を５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成した。この溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
【００９４】
得られた光架橋体の分子量はＧＰＣにより９６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５６）と測定され、光架橋により分子量の増大と分散のブロード化が確認された。
【００９５】
前掲の実験例１，２の結果から、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドのホモポリマーは架橋性であるが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドのホモポリマーは架橋性のポリマーでないことから、ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの光照射によって、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックのみが選択的に架橋されたことが分かる。
【００９６】
＜（ｅ）遺伝子導入活性の評価＞
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
上記（ｄ）で合成した、ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの光架橋体を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はＮＭＲによるカチオン性ポリマーブロックと非イオン性ポリマーブロックのモノマー単位比とカチオン性モノマーの分子量１５６および非イオン性モノマーの分子量９９．５とから計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【００９７】
［比較例１］
実施例１の（ｂ）で合成した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１の（ｅ）と同様にしてプロトコールで遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【００９８】
［比較例２］
＜（ｆ）ポリマー末端反応性の４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの合成およびその光架橋＞
溶媒にトルエンを用い、窒素パージを重合中にも継続して行うこと以外はすべて実施例１の（ｄ）に準拠して合成を行った。精製も同様に行った。得られた４分岐型スター型カチオン／非イオン性ブロックコポリマー（重合率３３％）は、ＧＰＣにより分子量７６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９２）となった。この系では、重合時間を延長すると分子量が増大し（１５分でＭｎ＝８９，０００となり２０分でＭｎ＝１００，３０００となった）、また、ポリマーのＵＶスペクトルからはジチオカルバミル基由来のＵＶ２８０ｎｍピークの強い吸収が確認され、ポリマー末端にジチオカルバミル基が残存していること、すなわち、ポリマー末端が光解裂性であることが確認された。
【００９９】
上記（ｆ）で合成した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマー（分子量８９，０００のもの）を遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１の（ｅ）と同様にしてプロトコールで遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【０１００】
［比較例３］
比較例２の（ｆ）において、引き続き、同様の手法でポリマーへ光架橋を行うと不溶性のゲルはより一層多量に生成し、ＧＰＣによる分子量測定結果は、１５６，３００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．１６）と計算された。
【０１０１】
このようにして得られた４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマー（分子量１５６，３００のもの）を遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１の（ｅ）と同様にしてプロトコールで遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【０１０２】
図１より、次のことが分かる。
比較例１と比較例２との比較により、非イオン性ポリマーブロック鎖導入の効果が確認できる。
比較例３は、光架橋による活性の増強を目的として行った処理であるが、比較例２のものよりも活性が低くなっている（ただし、比較例２と同等かもしくはやや高いこともあり、活性は不安定であった）。
これに対して、本発明による実施例１では、内郭のカチオン性ポリマーブロック同士の架橋を優先させ、外層（分岐鎖の先端）の非イオン性ポリマーブロック部分を介した結合を抑制したことにより、カチオン部の架橋構造の効果とそれを遮蔽する非イオン部の効果を両立させることが可能となり、高い遺伝子導入活性を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】実施例１、及び比較例１〜３の遺伝子導入剤による遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法並びに核酸複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを見出し、先に特許出願した（下記特許文献１，２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合し、エンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【特許文献２】特開２００７−７０５７９
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤及びその製造方法と、この遺伝子導入剤を用いた核酸複合体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて得られる分岐型重合体の、前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体よりなることを特徴とする。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させたことを特徴とする。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１又は２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項２又は３において、前記分岐型重合体をハロゲン化炭化水素溶液中で光照射することにより架橋反応させたことを特徴とする。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とする。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記非イオン性モノマーが、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか1項において、前記分岐型重合体の分子量が１０，０００〜５００，０００であることを特徴とする。
【００１３】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーブロックの分子量が５，０００〜１５０，０００であることを特徴とする。
【００１４】
本発明（請求項１０）の遺伝子導入剤の製造方法は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて分岐型重合体を製造する工程と、得られた分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックを架橋反応させて架橋体よりなる遺伝子導入剤を得る工程と、を有することを特徴とする。
【００１５】
本発明（請求項１１）の核酸複合体は、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなるものである。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の遺伝子導入剤は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を有する芳香族化合物をイニファクターとし、これにカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーをリビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて合成した、芳香環を核として、基端側がカチオン性ポリマーブロックで先端側が非イオン性ポリマーブロックで構成される分岐鎖が、放射状に伸延する分岐型重合体（以下「第１次分岐型重合体」ということがある。）に光を照射するなどして、該第１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分を架橋させて得た架橋体よりなるものである。
【００１７】
この遺伝子導入剤は、第１次分岐型重合体の末端の少なくとも一部のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活していることにより、その第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロック同士が架橋してなる架橋体であると推察されるが、本発明者らによる種々の研究の結果、この遺伝子導入剤は、その構造上の利点により、第１次分岐型重合体よりもＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができることが認められた。
【００１８】
即ち、この遺伝子導入剤は、カチオン性の第１次分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、１個のカチオン性分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べて、その分岐鎖が入り組んだ複雑な３Ｄ構造により、ＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【００１９】
しかも、この第１次分岐型重合体の分岐鎖の基端側のカチオン性ポリマーブロックの先端側に非イオン性ポリマーブロックが形成されているため、この遺伝子導入剤と核酸とを複合させた核酸複合体微粒子の粒子外周面にこの非イオン性ポリマーブロックが存在することにより、核酸複合体微粒子への血清タンパクの吸着が抑制される。即ち、カチオン性ポリマーブロックを内郭に配置してその外層へ非イオン性ポリマーブロックを配置することで、陽電荷を遮蔽し、水溶液中で斥力を働かせる分子設計がなされる。
【００２０】
なお、分岐鎖の基端側にカチオン性ポリマーブロックを有し、先端側に非イオン性ポリマーブロックを有する分岐型重合体の、先端側を架橋反応させて架橋体とすることによっても分岐鎖が入り組んだ複雑な３Ｄ構造の架橋体を構成して、核酸を高密度に凝縮することが可能であると考えられるが、この場合には、次のような不具合が考えられる。
(1) 非イオン性ポリマーブロックの先端が架橋点になるため、この非イオン性ポリマーブロックの内郭側に遮蔽したカチオン性ポリマーブロックが一部露出することになり、両ポリマーブロックを兼備することによる効果を両立させることができない。
(2) 架橋により、おそらくはカチオン性ポリマーブロックの配置が非イオン性ポリマーブロックを介して複雑に点在するようになることによって、陽電荷密度が低くなり、架橋前よりも活性が低下してしまうおそれがある。
【００２１】
本発明において、イニファターが有するＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基としてはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が好ましく（請求項３）、特にイニファターは、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合しているものが好ましい（請求項５）。また、イニファターの分岐鎖に光照射リビング重合させるカチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドが好ましく（請求項６）、一方、非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種が好ましい（請求項７）。
【００２２】
また、第1次分岐型重合体の分子量は１０，０００〜５００，０００であることが好ましく（請求項８）、カチオン性ポリマーブロックの分子量は５，０００〜１５０，０００であることが好ましい（請求項９）。
【００２３】
本発明においては、第１次分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、カチオン性ポリマーブロック部分を架橋反応させて架橋体を得ることが好ましく（請求項２）、この場合において、第１次分岐型重合体をクロロホルム等の連鎖移動性の溶媒を用いた溶液中で光照射することにより架橋反応させることが好ましい（請求項４）。
【００２４】
このように、クロロホルム等の連鎖移動性の溶媒を用いた溶液中で第１次分岐型重合体に光照射することにより、おそらくは、第１次分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に光照射によって生じるラジカルがクロロホルム等の連鎖移動性の溶媒へ移動し、分岐鎖末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が脱離し、この分岐鎖先端の光反応性（架橋性）が消失する。そして、この結果、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジチオカルバミル基に由来する紫外線吸収ピークが実質的に不検出であるか、脱離前のものの該吸収ピークよりも減少したものとなる。このように分岐鎖先端の光反応性（架橋性）が消失した第１次分岐型重合体であれば、光照射を行った際に、この分岐鎖先端での光架橋は起こらず、基端側の、光に感光して自己架橋する性質を有するカチオン性ポリマーブロック、好ましくは、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロック部分で架橋反応を起こし、複雑な３Ｄ構造を有する高次架橋体が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下に本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００２６】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させてなる第１次分岐型重合体の、カチオン性ポリマーブロック部位を架橋反応させてなる架橋体よりなる。
【００２７】
即ち、第１次分岐型重合体に光を照射するなどして架橋反応させると、複数の第１次分岐型重合体が分子間架橋ないし分子内架橋して、分子量の異なる様々な分子間架橋体が生成するが、この架橋に先立ち、分岐鎖の先端に存在するＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を、脱離、除去、消失、失活、ないしは減量（本発明においては、このように脱離、除去、消失、失活、ないしは減量させることを「失活」と称す。）させて、この分岐鎖先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基に起因する光反応性（光架橋性）を消失ないしは低減することにより、この第１次分岐型重合体は、分岐鎖の先端ではなく、基端側のカチオン性ポリマーブロック部分で架橋反応するようになり、第１次分岐型重合体の分岐鎖のカチオン性ポリマーブロック部分で架橋された架橋体よりなる本発明の遺伝子導入剤が得られる。
【００２８】
この第１次分岐型重合体の分岐鎖の先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活したことは、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基のジチオカルバミル基に由来する特異的な波長２８０ｎｍの紫外線（ＵＶ）吸収ピーク（以下「ＵＶ２８０ｎｍピーク」と称す。）が消失しているか、或いは、失活前に比べてＵＶ２８０ｎｍピークが大幅に減少していることから確認することができる。
【００２９】
＜第１次分岐型重合体＞
本発明に係る第１次分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させて非イオン性ポリマーブロックを形成すると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させてなるものである。
【００３０】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００３１】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００３２】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化炭化水素が好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン、中でも特にトルエンが好適である。
【００３３】
このイニファターに重合させるカチオン性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のカチオン性モノマーが好適なものとして挙げられるが、本発明においては、このカチオン性モノマーにより形成されるカチオン性ポリマーブロックが、架橋性を有すること、好ましくは光に感光して自己架橋（光解裂性官能基非由来性の架橋）する性質のものであることが重要であり、そのために、このカチオン性モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の自己架橋性カチオン性ビニル系モノマーが好ましい。
【００３４】
即ち、本発明者らは、カチオン性モノマーである３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド等のポリマーブロックは、非常に温和な条件である近紫外線の低照射強度（例えば、波長３７０ｎｍ，照射強度１ｍＷ／ｃｍ２程度）の光照射で自己架橋することを見出した。一般的に高分子材料の光架橋に関して当業者に周知のものは、γ線や電子線などの放射線によるポリマーの光分解（ポリプロピレン）や光架橋（ポリフッ化ビニリデン）であり、このようなカチオン性ポリマーブロックの光架橋は新規知見である。
【００３５】
この近紫外光での架橋反応のメカニズムは、現時点では推測でしかないが、側鎖のジメチルアミノ基の脱離が関与している可能性がある。すなわち、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドのジメチルアミノ基のｐＫａは約１０と非常に高く、このモノマーを加熱すると通常は４級アミンで起こるホフマン脱離反応が３級アミンでも起こり、結果、ジビニル体を形成して架橋が起こることが知られている。光照射でも同様の現象が起こっている可能性があり、言い換えれば、カチオン性モノマーでもｐＫａの高いもの（例えば９以上）であれば本発明へ使用できる可能性があると考えられる。
【００３６】
これらのカチオン性モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３７】
一方、非イオン性モノマーとしては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド等のＮ，Ｎ−ジアルキル（このアルキル基の炭素数は１〜５が好ましい。）アクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、ポリビニルピロリドンなどを用いることができる。これらの非イオン性モノマーは、１種を単独で用いても良く、２種以上を併用しても良い。
【００３８】
イニファターと上記カチオン性モノマーとを反応させるには、イニファター及びカチオン性モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しカチオン性モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００３９】
該原料溶液中のカチオン性モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適である。また、原料溶液中のイニファターの濃度は０．１〜１００ｍＭ程度が好適である。
【００４０】
照射する光の波長は３００〜４００ｎｍが好適であり、例えば低圧水銀灯や高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜６０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１分〜３０分程度が特に好適である。
【００４１】
この光照射により、反応液中に分岐鎖にカチオン性ポリマーブロックが形成されたカチオン性分岐型重合体（カチオン性ホモポリマー）が生成するので、必要に応じ精製して目的物を得る。
【００４２】
このようにして得られたカチオン性ホモポリマーに対し、非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて目的とする第１次分岐型重合体とする。
【００４３】
ここで、分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させる方法としては、
(1) アルカリ触媒の存在下に加水分解させることによりＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を除去する方法
(2) 非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に、反応溶媒としてクロロホルム、塩化メチレンなどの連鎖移動性の溶媒を用い、光照射時にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(3) Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチルベンゼンの存在下で希薄溶液で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
(4) アスコルビン酸、ジアルキルアミン、システイン、メルカプトエタノール、安息香酸、酸素ガスなどラジカル補足剤として当業者に周知の化合物の水溶液中で光照射を行ってＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を脱離させる方法
などが挙げられるが、非イオン性モノマーの光照射リビング重合時に併せてＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基の失活も行えることから、上記(2)の方法を採用することが好ましい。
【００４４】
上記(2)の方法を採用して、前述のカチオン性ホモポリマーに非イオン性モノマーを光照射リビング重合によりブロック共重合させると共に、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させるには、上記のようにして得られたカチオン性ホモポリマーを、クロロホルム、塩化メチレン、クロロベンゼン、ジクロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素のような連鎖移動性の溶媒に溶解させ、これに非イオン性モノマーを混合し、光を照射して重合させればよい。この重合反応を開始する際の溶液中におけるカチオン性ホモポリマーの濃度は０．０１〜１０重量％程度が好適であり、非イオン性モノマーの濃度は０．３〜３０重量％程度が好適である。光の照射条件は、光波長２５０〜４００ｎｍ、照射時間１〜１５０分、照射強度１００〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００４５】
このようにして、イニファターに対してまずカチオン性モノマーを光照射リビング重合させ、次いで非イオン性モノマーを光照射リビングブロック共重合させると共にＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させることにより、基端側がカチオン性ポリマーブロック、先端側が非イオン性ポリマーブロックで構成され、かつ先端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基が失活することにより、分岐鎖の先端部分の光架橋性が消失ないしは低減されたブロックコポリマー鎖よりなる分岐鎖を有する第1次分岐型重合体（ブロックコポリマー）を得ることができる。
【００４６】
本発明において、このブロックコポリマーよりなる第1次分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の数、これを構成するイニファター、カチオン性モノマー、及び非イオン性モノマーの種類等によっても異なり、一概には言えないが、１０，０００〜５００，０００、特に３０，０００〜１５０，０００であることが好ましい。第1次分岐型重合体の分子量が小さ過ぎると、本発明に好適な分岐型重合体の分子設計を十分に行うことができず、第1次分岐型重合体の分子量が大き過ぎると、代謝性、生分解性などが劣る傾向にあり、好ましくない。また、第1次分岐型重合体を構成する前述のカチオン性ポリマーブロックの分子量及び、このカチオン性ホモポリマーに導入される非イオン性ポリマーブロックについても、分岐鎖の数や各々のポリマーブロックを構成するモノマーの種類等によって異なり、一概には言えないが、カチオン性ポリマーブロックの分子量は５，０００〜１５０，０００、特に１５，０００〜８０，０００で、非イオン性ポリマーブロックの分子量は１０，０００〜１５０，０００、特に３０，０００〜１００，０００であることが好ましい。カチオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると核酸の吸着効果が低く、大き過ぎると細胞障害性が高くあり好ましくない。また、非イオン性ポリマーブロックの分子量が小さ過ぎると非イオン性ポリマーブロックを導入したことによる陽電荷の遮蔽効果を十分に得ることができず、大き過ぎると必要以上に陽電荷を遮蔽して核酸とのイオン複合体（ポリプレックス）を形成しなくなってしまう。
【００４７】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００４８】
＜第１次分岐型重合体の架橋＞
本発明では、上記のようにして得られた第１次分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロック部分を架橋反応させて架橋体を得る。この架橋反応は、第1次分岐型重合体に光照射することによる光架橋反応で行うことが好ましい。
この第1次分岐型重合体の光架橋を行うには、次のｉ）又はii）の方法を採用することができる。
【００４９】
ｉ)第１次分岐型重合体を、その極性が高く、カチオン性ポリマーブロック中の側鎖のＮ，Ｎ−ジメチルアミノ基と強い水素結合を形成して該ポリマーブロックの自己架橋を妨げる性質のある水およびメタノール以外の、例えば、ベンゼン、トルエン及びエタノール並びにこれらの混合溶媒など適宜の溶媒に溶解させ、光を照射することにより、第1次分岐型重合体を架橋する。この架橋反応を開始させる際の溶液中の第１次分岐型重合体の濃度は１〜２０重量％程度が好適である。
【００５０】
ii）第１次分岐型重合体へ直接光照射を行うことによって分岐型重合体を架橋させる。この場合、ｉ)の溶媒へ溶解した溶液への処理と相違して、分岐型重合体の主鎖及び又は側鎖へ発生したラジカルが溶媒によって捕捉され、分岐型重合体の架橋反応が阻害されることを抑制することが可能となる。直接光照射を行う場合は、凍結乾燥粉末を霧状に攪拌して、ここへ光を照射することで均質な処理が可能となる。なお、第１次分岐型重合体をフィルム状に加工し、このフィルムへ処理を行うことも均質な架橋体を得る方法として好ましい。具体的には、ガラス板、金属板などの上へ第１次分岐型重合体の溶液、例えば、クロロホルム溶液を流延させ、ドクターナイフなどで液切りして均一な厚みとし、これを乾燥させることで均質なフィルムを形成させることが可能である。この場合の溶媒としては揮発性が高いメタノール、クロロホルムが好適である。
【００５１】
第１次分岐型重合体の形状としてフィルム状を採用した場合、フィルムの厚さは１０μｍ〜２０００μｍ程度、特に５０μｍ〜１０００μｍ程度が好ましい。極端にフィルムが薄いと架橋効率が悪く、また極端にフィルムが厚いと光照射の効果が十分に得られない。
【００５２】
また、第１次分岐型重合体の形状を粉末状にした場合、粉末の粒径は０．１〜１０００μｍ程度特に１００〜５００μｍ程度が好ましい。粒径を極端に小さくすることは困難であるが、逆に粒径を大きくした場合は光照射の効果及び光架橋効率が低下する。
【００５３】
光の照射条件は、光波長３００〜４００ｎｍ、照射時間１〜３００分、照射強度０．１〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００５４】
このような光照射により、第１次分岐型重合体に含まれる自己架橋性のカチオン性ポリマーブロックが架橋反応を起こし架橋体が得られる。
【００５５】
なお、この架橋反応で得られる架橋体の分子量（重量平均分子量）には特に制限はないが、通常３０，０００〜３００，０００程度である。この分子量が小さ過ぎると第１次分岐型重合体を架橋したことによる本発明の効果を十分に得ることができず、大き過ぎると代謝性、生分解性などが劣るものとなる。
【００５６】
＜核酸複合体＞
上述のようにして第１次分岐型重合体を架橋反応させて得られた架橋体よりなる本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００５７】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーブロックを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００５８】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００５９】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６０】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６１】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６２】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６３】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６４】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６５】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００６６】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００６７】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００６８】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００６９】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【００７０】
また、この核酸を複合した遺伝子導入剤の水溶液を基材に塗布などにより付着させ、必要に応じ乾燥させることにより、核酸を担持したポリマーのコーティング等が形成される。
【００７１】
上記の核酸複合遺伝子導入剤を基材に付着させる場合、基材としてはシート状のものが好適である。このシート状基材の厚さは０．０５〜１０ｍｍ程度であることが好ましく、シート面の大きさは、方形の場合、一辺が１〜２０ｍｍであり他辺が１〜２０ｍｍであり、円形又は楕円形の場合、径は１〜２０ｍｍ程度が好ましい。基材の材料としては、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリエステル、ポリアミド、ポリウレタン、シリコン樹脂、フッ素樹脂などの合成樹脂が好適である。この基材は多孔質であってもよい。
【００７２】
この基材に対する核酸複合遺伝子導入剤の付着量は、基材表面１ｃｍ２当り０．００１〜１０ｍｇ程度が好ましい。
【００７３】
核酸複合遺伝子導入剤を担持させた基材よりなる遺伝子導入材料は、皮下組織、心筋組織、病変組織、病変血管を包囲するようにシート状基材を配置したり、カバードステントのフィルムへ塗布することによって生体内に配置したり、生体外面に粘着テープを用いて貼り付けたりするようにして用いられる。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００７５】
［実験例１］
ｉ）３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドのラジカル重合によるホモポリマーの合成
再結晶で精製したα,α'−アゾビスイソブチロニトリル０．１ｇをトルエン３０ｍＬへ溶解した。３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドは減圧蒸留で精製した（ｂ．ｐ．１０６℃−１１０℃，０．３ｍｍＨｇ）後に、１０ｇを分取し、トルエン２０ｍＬへ溶解した。トルエンは脱水溶媒グレードを使用し、使用前に２０分間の高純度窒素ガス（Ｇ１グレード）によるバブリング（２リットル／分）を行った。
３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミド溶液へα,α'−アゾビスイソブチロニトリル溶液を加えて混合し、窒素封管して５０℃で７２時間振盪した。開封後、エバポレーターで約１０ｍＬ容まで濃縮後に５００ｍＬのジエチルエーテルへ滴下し、ポリマー成分を回収した。その後、クロロホルム／ジエチエルエーテル系で６回再沈殿して精製した。エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマーを得た。
【００７６】
このものの分子量はＧＰＣにより４５，３００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５４）と測定された。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００７７】
ii）３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマーの近紫外光による光架橋
ｉ）で合成した３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマー０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へいれ、土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２リットル／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながら３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長３５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を３０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して１．０ｍＷ／ｃｍ２に調整した。照射終了後、得られた粉末を５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成した。この溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
【００７８】
このものの分子量はＧＰＣにより６５，５００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．７８）と測定され、光架橋により分子量の増大と分散のブロード化が確認された。
【００７９】
以上より、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドホモポリマーが温和な近紫外光で光架橋が行えることが分かった。このような温和な光照射条件で架橋が可能なのは、このポリマーの側鎖のジメチルアミノ基のｐＫａが約１０ほどもある特殊性（例えば、側鎖の炭素数が１個少ない２−（Ｎ，Ｎ−ジメチル）エチルメタクリレートのｐＫａは７）に起因していると推定される。
【００８０】
［実験例２］
非イオン性モノマーであるＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドについて、上記実験例１のｉ），ii）に準拠してホモポリマーを合成し、近紫外線の光照射を行ったが、光照射を行っても分子量に変化は確認されず、架橋性のポリマーでないことが分かった。
【００８１】
［実施例１］
＜（ａ）イニファターの合成＞
イニファターとしての１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００８２】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下にて室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００８３】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００８４】
【化１】
【００８５】
＜（ｂ）４分岐型スター形重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成＞
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性ビニル系モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８６】
即ち、上記（ａ）により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。この液を３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で波長２５０ｎｍ〜４００ｎｍの混合紫外線を４０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。
【００８７】
このカチオン性ホモポリマーの分子量はＧＰＣにより、５８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．３３）と測定された。
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００８８】
【化２】
【００８９】
＜（ｃ）ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの合成＞
（ｂ）で合成した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー３．５ｇを開始剤とし、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド７．４ｇを非イオン性モノマーとして４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの合成を行った。溶媒をクロロホルムとし、重合中の窒素パージを行わず、光照射時間を１０分間とした以外はすべて（ｂ）に準拠して合成を行った。精製も同様に行った。
【００９０】
得られた４分岐型スター型カチオン／非イオン性ブロックコポリマー（重合率３２％）は、ＧＰＣにより分子量８８，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．２２）となった。
【００９１】
なお、この重合条件の元では、これ以上重合時間を延長しても分子量の増大は確認されず、リビング規則が崩壊していることが示唆された。また、ポリマーのＵＶ吸収スペクトルからは（ｂ）で合成したカチオン性ホモポリマーでは確認された、ジチオカルバミル基由来のＵＶ２８０ｎｍピークの強い吸収がほぼ消失しており、先のリビング規則崩壊の事実からも、溶媒であるクロロホルムへのラジカル連鎖移動反応により、ポリマー末端のジチオカルバミル基が脱離し、ポリマー末端の光反応性が消失したことが分かる。
【００９２】
【化３】
【００９３】
＜（ｄ）ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの光架橋＞
上記（ｃ）で得たポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの粉末０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２Ｌ／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながら（ｂ）と同じ光照射装置で光照射による重合を行った。照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射時間は２４０分で行った。照射終了後、得られた粉末は淡い黄褐色を帯びていた。この粉末を５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成した。この溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。
【００９４】
得られた光架橋体の分子量はＧＰＣにより９６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５６）と測定され、光架橋により分子量の増大と分散のブロード化が確認された。
【００９５】
前掲の実験例１，２の結果から、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）プロピルアクリルアミドのホモポリマーは架橋性であるが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドのホモポリマーは架橋性のポリマーでないことから、ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの光照射によって、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのポリマーブロックのみが選択的に架橋されたことが分かる。
【００９６】
＜（ｅ）遺伝子導入活性の評価＞
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
上記（ｄ）で合成した、ポリマー末端が失活した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの光架橋体を遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はＮＭＲによるカチオン性ポリマーブロックと非イオン性ポリマーブロックのモノマー単位比とカチオン性モノマーの分子量１５６および非イオン性モノマーの分子量９９．５とから計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【００９７】
［比較例１］
実施例１の（ｂ）で合成した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１の（ｅ）と同様にしてプロトコールで遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【００９８】
［比較例２］
＜（ｆ）ポリマー末端反応性の４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマーの合成およびその光架橋＞
溶媒にトルエンを用い、窒素パージを重合中にも継続して行うこと以外はすべて実施例１の（ｄ）に準拠して合成を行った。精製も同様に行った。得られた４分岐型スター型カチオン／非イオン性ブロックコポリマー（重合率３３％）は、ＧＰＣにより分子量７６，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．９２）となった。この系では、重合時間を延長すると分子量が増大し（１５分でＭｎ＝８９，０００となり２０分でＭｎ＝１００，３０００となった）、また、ポリマーのＵＶスペクトルからはジチオカルバミル基由来のＵＶ２８０ｎｍピークの強い吸収が確認され、ポリマー末端にジチオカルバミル基が残存していること、すなわち、ポリマー末端が光解裂性であることが確認された。
【００９９】
上記（ｆ）で合成した４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマー（分子量８９，０００のもの）を遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１の（ｅ）と同様にしてプロトコールで遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【０１００】
［比較例３］
比較例２の（ｆ）において、引き続き、同様の手法でポリマーへ光架橋を行うと不溶性のゲルはより一層多量に生成し、ＧＰＣによる分子量測定結果は、１５６，３００（Ｍｗ／Ｍｎ＝３．１６）と計算された。
【０１０１】
このようにして得られた４分岐型スター型共重合体よりなるカチオン／非イオン性ブロックコポリマー（分子量１５６，３００のもの）を遺伝子導入剤として使用する以外は、実施例１の（ｅ）と同様にしてプロトコールで遺伝子導入活性を評価した。結果を図１に示す。
【０１０２】
図１より、次のことが分かる。
比較例１と比較例２との比較により、非イオン性ポリマーブロック鎖導入の効果が確認できる。
比較例３は、光架橋による活性の増強を目的として行った処理であるが、比較例２のものよりも活性が低くなっている（ただし、比較例２と同等かもしくはやや高いこともあり、活性は不安定であった）。
これに対して、本発明による実施例１では、内郭のカチオン性ポリマーブロック同士の架橋を優先させ、外層（分岐鎖の先端）の非イオン性ポリマーブロック部分を介した結合を抑制したことにより、カチオン部の架橋構造の効果とそれを遮蔽する非イオン部の効果を両立させることが可能となり、高い遺伝子導入活性を得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】実施例１、及び比較例１〜３の遺伝子導入剤による遺伝子導入活性の評価結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて得られる分岐型重合体の、
前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させたことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項２又は３において、前記分岐型重合体をハロゲン化炭化水素溶液中で光照射することにより架橋反応させたことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記非イオン性モノマーが、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか1項において、前記分岐型重合体の分子量が１０，０００〜５００，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーブロックの分子量が５，０００〜１５０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて分岐型重合体を製造する工程と、
得られた分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックを架橋反応させて架橋体よりなる遺伝子導入剤を得る工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【請求項１】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて得られる分岐型重合体の、
前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させてなる架橋体よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記分岐型重合体の分岐鎖に光照射することにより、前記カチオン性ポリマーブロックを架橋反応させたことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１又は２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基がＮ，Ｎ−ジアルキル−ジチオカルバミルメチル基であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項２又は３において、前記分岐型重合体をハロゲン化炭化水素溶液中で光照射することにより架橋反応させたことを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、前記イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項１ないし５のいずれか１項において、前記カチオン性モノマーが、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記非イオン性モノマーが、Ｎ，Ｎ−ジアルキルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールアルキルエステル（メタ）アクリレート、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか1項において、前記分岐型重合体の分子量が１０，０００〜５００，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記カチオン性ポリマーブロックの分子量が５，０００〜１５０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
芳香環に、分岐鎖としてのＮ，Ｎ−ジ置換−ジチオカルバミルメチル基が３個以上導入された芳香族化合物をイニファターとし、このイニファターの分岐鎖にカチオン性モノマーを光照射リビング重合させてカチオン性ポリマーブロックを形成し、さらに非イオン性モノマーを光照射リビング重合させると共に、少なくとも一部の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミル基を失活させて分岐型重合体を製造する工程と、
得られた分岐型重合体のカチオン性ポリマーブロックを架橋反応させて架橋体よりなる遺伝子導入剤を得る工程と、
を有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤と核酸とを複合させてなる核酸複合体。
【図１】
【公開番号】特開２００９−２７４９９５（Ｐ２００９−２７４９９５Ａ）
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１２８５６３（Ｐ２００８−１２８５６３）
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１１月２６日（２００９．１１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月１５日（２００８．５．１５）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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