遺伝子導入剤
【課題】癌細胞への遺伝子導入が可能な遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させてなる遺伝子導入剤。前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなる。前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖である。ヒアルロン酸は癌細胞の多くが発現しているマーカーＣＤ４４のリガンドして働くところから、本発明の遺伝子導入剤は癌細胞に容易に侵入し得る。分岐鎖は、好ましくはベンゼン環に４〜６個導入されている。
【解決手段】芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させてなる遺伝子導入剤。前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなる。前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖である。ヒアルロン酸は癌細胞の多くが発現しているマーカーＣＤ４４のリガンドして働くところから、本発明の遺伝子導入剤は癌細胞に容易に侵入し得る。分岐鎖は、好ましくはベンゼン環に４〜６個導入されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に、癌細胞への指向性を有した遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
従来、細胞へ遺伝子を導入する技術としては次のようなものが知られているが、いずれも以下に述べるような欠点がある。
【０００４】
（１）ウイルスベクター法
（２）エレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等
（３）リポフェクチン法、ポリカチオン法等
【０００５】
（１）ウイルスベクター法
ウイルス全般については、合成工程が複雑で感染の危険性がある；ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない（例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。）；といった欠点がある。
【０００６】
また、レセプターを介して細胞へ侵入するタイプのウイルスの場合、レセプターが発現されていない細胞へは導入できない；遺伝子治療を目指して研究をする場合に、マウスなど小動物での実験が必須であるが、ヒト細胞に存在するレセプターがマウスに存在しなければ実験が成立しない；細胞の種類によってレセプター発現量が異なり、これが導入効率に影響してしまう；アデノウイルスの設計には主としてＣＡＲ（コサッキーアデノウイルスレセプター）を利用するが、疾病によってＣＡＲの発現量が少ない患者も多く、遺伝子治療への応用に制約を受けることもある；といった欠点がある。
【０００７】
（２） 細胞膜に一時的に孔を開けるマイクロインジェクション、エレクトロポーション、遺伝子銃、マイクロジェット等による方法は、細胞膜が不可逆的な損傷を受け、溶解してしまうため、生存率も５０％以下と低い。神経細胞など増殖性の低い細胞の場合、生存率が低いことは大きな問題となる。即ち、遺伝子を導入できても、細胞が死滅してしまえば遺伝子導入の意味がない。
【０００８】
（３） 細胞のエンドサイトーシスを利用するリポフェクチン法、りん酸カルシウム法、Ｎａｋｅｄプラスミド法、ポリカチオン法は、一般的に遺伝子導入効率が低い。
【０００９】
なお、ＷＯ２００４／０９２３８８には、スター型分岐ポリマーよりなるベクターが記載されているが、癌細胞に効率よく遺伝子導入することについては記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、癌細胞への指向性を有した遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させてなるものである。
【００１２】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、ヒアルロン酸の分子量が５千〜５００万であることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項８において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖を導入してなるスター型分岐ポリマーと核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させたものである。
【００２３】
ヒアルロン酸は癌細胞の多くが発現しているマーカーＣＤ４４のリガンドして働くことが知られている。遺伝子治療において、非ウイルス性ベクターとしてのカチオン性高分子とＤＮＡのイオン複合体へ該ベクターのＤＮＡ発現活性を失活させることなくヒアルロン酸を複合化することができれば生体内でイオン複合体を癌細胞への指向性を付与させ、癌細胞への選択的な遺伝子導入が行える可能性がある。
【００２４】
一方、ヒアルロン酸はｐＫａの高いカルボキシル基を有するためマイナスチャージを有しており、これに対してカチオン性ポリマーとＤＮＡのイオン複合体は、通常、正電荷リッチな状態で混合される（所謂ＣＡ比やＰＡ比が５〜２０程度）ため、形成されるイオン複合体も通常プラスに帯電している。従って、プラスに帯電するイオン複合体へのヒアルロン酸の接近はカチオン性高分子とＤＮＡの結合を弛緩させたり場合によって破壊し、イオン複合体微粒子の凝集などを促進させる働きがあると考えられる。
【００２５】
本発明のカチオン性高分子／ＤＮＡ／ヒアルロン酸から形成されるイオン性複合体において使用されるカチオン性高分子は、ベンゼン等の芳香環から放射状にポリマー鎖が伸延する分岐構造を有するために、電荷密度を集中させることが可能であり、ＤＮＡとの形成されたイオン複合体の安定性が線形のカチオン性高分子と形成させたものよりも高い。
【００２６】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子導入剤では、核酸をスター型分岐ポリマーとの凝集体とすることにより、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。即ち、本発明で使用するスター型分岐ポリマーは、その独自の分子構造によるイオン強度・電荷密度がポリプレックスの形成に至適と考えられ、水溶液中で安定して分散するポリプレックスが得られる。ポリプレックスへ包埋された遺伝子は、酵素の作用に対しても安定である。
【００２７】
また、本発明の遺伝子導入剤は、たんぱく質を吸着しても遺伝子導入活性を失わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に本発明の遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２９】
［高分子化合物］
まず、本発明の遺伝子導入剤において用いられる高分子化合物について説明する。
【００３０】
この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された化合物である。
【００３１】
この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。
【００３２】
核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２、３、４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。
【００３３】
高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。
【００３４】
即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３５】
芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、ビニル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖、特に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。
【００３６】
また、１本の高分子鎖を構成する単量体の数は、その単量体の種類や反応性等によっても異なるが、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００程度であることが好ましい。
【００３７】
芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる高分子化合物、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述のベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物（ホモポリマー）を製造する。
【００３８】
本発明では、このホモポリマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド重合鎖に対し、さらにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドをブロック共重合させてもよい。このＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドブロックの数平均分子量は１０００〜１００，０００程度が好ましい。Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドをブロック共重合させるには、上記ホモポリマーと共にメタノールなどのアルコール溶媒あるいはクロロホルムなどの低極性溶媒に溶解させ、光重合反応させればよい。
【００３９】
このようにして合成されたホモポリマー又はブロックコポリマーよりなる高分子化合物の分子量は５千〜５０万、特に１万〜２０万、とりわけ１万〜１０万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。
【００４０】
［核酸］
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４２】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００４３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４４】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００４５】
［ポリプレックスの形成］
上記高分子化合物と核酸とを複合させてポリプレックスを形成するには、この高分子化合物の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して高分子化合物を過剰量添加し、高分子化合物を核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４６】
高分子化合物と核酸とを複合させた複合体は、微粒状のポリプレックスとなる。その粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、ポリプレックス内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４７】
［ヒアルロン酸］
ヒアルロン酸としては、分子量が５千〜５００万、好ましくは５千〜５万のものが用いられる。
【００４８】
ヒアルロン酸をポリプレックスに吸着させるには、上記の分散液にヒアルロン酸の水溶液を添加し、混合すればよい。ポリプレックスの形成膜にヒアルロン酸を添加して、ポリプレックスの形成膜にヒアルロン酸を併せて吸着させてもよい。ヒアルロン酸の吸着量は、吸着前後におけるポリプレックスの粒子径変化率が５０％以下となるようにすることが好ましい。
【００４９】
［生体への投与］
上述のような高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と核酸とのポリプレックスにヒアルロン酸を吸着させてなる遺伝子導入剤は、生体内へ投与される。
【００５０】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」は癌細胞である。即ち、上記の通り、ヒアルロン酸は癌細胞の多くが発現しているマーカーＣＤ４４のリガンドして働くところから、本発明の遺伝子導入剤は癌細胞への指向性を有しており、肝細胞に容易に進入することができるものと考えられる。
【００５１】
本発明の遺伝子導入剤は任意の方法で生体に投与することができる。
【００５２】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
【００５３】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５４】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５５】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５６】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５７】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、肝臓がん、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、線維化症、脂肪肝などが挙げられる。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５９】
［実施例１の分岐型カチオン性ホモポリマーの合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
【００６３】
ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなる分岐型カチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、減圧蒸留により精製してある３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）１９．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を３５分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）よりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより５０，０００と測定された。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
【化２】
【００６７】
[比較例１の直線型カチオン性ホモポリマーの合成]
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）の代わりに（ブロモメチル）ベンゼンを使用したこと以外は実施例１と同様にして（Ｎ、Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。精製物は無色液体で、収率は約９３％であった。
【００６８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はσ７．４１〜７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、σ４．５４ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、Ａｒ−ＣＨ２−Ｓ−）、σ４．０８〜４．０１ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−）、σ３．７２ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−）、σ１．２５−１．３１ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ３）となった。
【００６９】
次いで、実施例１のii)の手法に準じて、１本の直鎖のみを有した直線型のカチオン性ホモポリマーであるモノ［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンを合成した。分子量は実施例と同等の約５３，０００へ調整した。
[実施例１及び比較例１におけるカチオン性ポリマー／ＤＮＡ／ヒアルロン酸からなるイオン複合体の合成]
ｉ）カチオン性ポリマー／ＤＮＡ複合体の合成
ＤＮＡはホタルルシフェラーゼをコードするプラスミド（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロール）を使用した。実施例１の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍポリマー又は比較例１の直線型ｐＤＭＡＰＰＡｍポリマーを生理食塩水へ溶解し、それぞれ１．０μｇ／μＬ濃度の溶液を調製した。各溶液６０μＬに対し、０．０５μｇ／μＬのＤＮＡの２０ｍＭトリス・ＥＤＴＡ緩衝溶液９０μＬを混合してタッピングしてポリプレックスを形成させた。
【００７０】
形成されたイオン複合体は、いずれのカチオン性高分子で形成させても約１７０ｎｍ〜２００ｎｍの粒子径の微粒子であったが、比較例１の直線型ｐＤＭＡＰＰＡｍポリマーから形成されたイオン複合体の微粒子は経時性に凝集して粒子径が増大し、２４時間後には完全に沈殿して動的光散乱のシグナルが消滅した。一方、実施例１の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍポリマーから形成されたイオン複合体の微粒子は２４時間後にも形成直後の粒子径を維持しており、イオン複合体が安定であることが確認された。
ii）ヒアルロン酸の複合化
ｉ)で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍポリマー又は直線型ｐＤＭＡＰＰＡｍポリマーとＤＮＡとの複合体を約２０分間室温でインキュベートした後、ヒアルロン酸の生理食塩水溶液１μｇ／μＬを混合し、３０分間静置した。
【００７１】
ヒアルロン酸の添加量は、ポリマーに対し５％相当量である。ヒアルロン酸の吸着前後におけるポリプレックスの粒子径変化率は１０〜２０％である。
【００７２】
３０分後、アクリルアミドゲルを使用してサブマリン式電気泳動を行い（アトー社、ＡＥ６１１）、臭化エチジウムで発光させた。
【００７３】
その結果、比較例１ではイオン複合体が破壊され、スポット位置にイオン複合体が残っていないことが認められた。これに対し、実施例１では、プラスに帯電したイオン複合体の一部が泳動せずにスポット位置に留まりＤＮＡインターカレンによる発色が確認された。
【００７４】
以上より、本発明の遺伝子ベクターは、マイナスに帯電したヒアルロン酸を複合化させてもＤＮＡとカチオン性ポリマーのイオン結合を維持し、複合体へ導入されたヒアルロン酸によりＣＤ４４を発現する細胞を認識することで癌細胞へ指向性を持ち、特異的に遺伝子導入できる可能性が示唆された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に係り、特に、癌細胞への指向性を有した遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ヒト疾患の分子遺伝学的要因が明らかになるにつれ、遺伝子治療研究がますます重要視されている。遺伝子治療法は標的とする部位でのＤＮＡの発現を目的としており、いかにＤＮＡを標的部位に到達させるか、いかにＤＮＡを標的部位に効率的に導入し、当該部位で機能的に発現させるかということが重要となる。
【０００３】
従来、細胞へ遺伝子を導入する技術としては次のようなものが知られているが、いずれも以下に述べるような欠点がある。
【０００４】
（１）ウイルスベクター法
（２）エレクトロポーション法、マイクロインジェクション法等
（３）リポフェクチン法、ポリカチオン法等
【０００５】
（１）ウイルスベクター法
ウイルス全般については、合成工程が複雑で感染の危険性がある；ウイルス内には挿入できないような大きな核酸が導入できない（例えばアデノウイルスでは、導入サイズは９０００ｂ以下である。）；といった欠点がある。
【０００６】
また、レセプターを介して細胞へ侵入するタイプのウイルスの場合、レセプターが発現されていない細胞へは導入できない；遺伝子治療を目指して研究をする場合に、マウスなど小動物での実験が必須であるが、ヒト細胞に存在するレセプターがマウスに存在しなければ実験が成立しない；細胞の種類によってレセプター発現量が異なり、これが導入効率に影響してしまう；アデノウイルスの設計には主としてＣＡＲ（コサッキーアデノウイルスレセプター）を利用するが、疾病によってＣＡＲの発現量が少ない患者も多く、遺伝子治療への応用に制約を受けることもある；といった欠点がある。
【０００７】
（２） 細胞膜に一時的に孔を開けるマイクロインジェクション、エレクトロポーション、遺伝子銃、マイクロジェット等による方法は、細胞膜が不可逆的な損傷を受け、溶解してしまうため、生存率も５０％以下と低い。神経細胞など増殖性の低い細胞の場合、生存率が低いことは大きな問題となる。即ち、遺伝子を導入できても、細胞が死滅してしまえば遺伝子導入の意味がない。
【０００８】
（３） 細胞のエンドサイトーシスを利用するリポフェクチン法、りん酸カルシウム法、Ｎａｋｅｄプラスミド法、ポリカチオン法は、一般的に遺伝子導入効率が低い。
【０００９】
なお、ＷＯ２００４／０９２３８８には、スター型分岐ポリマーよりなるベクターが記載されているが、癌細胞に効率よく遺伝子導入することについては記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記従来の実状に鑑みてなされたものであって、癌細胞への指向性を有した遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
請求項１の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させてなるものである。
【００１２】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して６個導入されていることを特徴とするものである。
【００１８】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とするものである。
【００１９】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、ヒアルロン酸の分子量が５千〜５００万であることを特徴とするものである。
【００２０】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項１ないし９のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とするものである。
【００２１】
請求項１１の遺伝子導入剤は、請求項８において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環に複数の高分子鎖を導入してなるスター型分岐ポリマーと核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させたものである。
【００２３】
ヒアルロン酸は癌細胞の多くが発現しているマーカーＣＤ４４のリガンドして働くことが知られている。遺伝子治療において、非ウイルス性ベクターとしてのカチオン性高分子とＤＮＡのイオン複合体へ該ベクターのＤＮＡ発現活性を失活させることなくヒアルロン酸を複合化することができれば生体内でイオン複合体を癌細胞への指向性を付与させ、癌細胞への選択的な遺伝子導入が行える可能性がある。
【００２４】
一方、ヒアルロン酸はｐＫａの高いカルボキシル基を有するためマイナスチャージを有しており、これに対してカチオン性ポリマーとＤＮＡのイオン複合体は、通常、正電荷リッチな状態で混合される（所謂ＣＡ比やＰＡ比が５〜２０程度）ため、形成されるイオン複合体も通常プラスに帯電している。従って、プラスに帯電するイオン複合体へのヒアルロン酸の接近はカチオン性高分子とＤＮＡの結合を弛緩させたり場合によって破壊し、イオン複合体微粒子の凝集などを促進させる働きがあると考えられる。
【００２５】
本発明のカチオン性高分子／ＤＮＡ／ヒアルロン酸から形成されるイオン性複合体において使用されるカチオン性高分子は、ベンゼン等の芳香環から放射状にポリマー鎖が伸延する分岐構造を有するために、電荷密度を集中させることが可能であり、ＤＮＡとの形成されたイオン複合体の安定性が線形のカチオン性高分子と形成させたものよりも高い。
【００２６】
核酸は一般に生体内においてあまり安定ではなく、ある種の酵素によって分解される。本発明の遺伝子導入剤では、核酸をスター型分岐ポリマーとの凝集体とすることにより、少なくとも凝集体内部の核酸を生体内で正常に機能させることができる。即ち、本発明で使用するスター型分岐ポリマーは、その独自の分子構造によるイオン強度・電荷密度がポリプレックスの形成に至適と考えられ、水溶液中で安定して分散するポリプレックスが得られる。ポリプレックスへ包埋された遺伝子は、酵素の作用に対しても安定である。
【００２７】
また、本発明の遺伝子導入剤は、たんぱく質を吸着しても遺伝子導入活性を失わない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下に本発明の遺伝子導入剤の実施の形態を詳細に説明する。
【００２９】
［高分子化合物］
まず、本発明の遺伝子導入剤において用いられる高分子化合物について説明する。
【００３０】
この高分子化合物は、芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された化合物である。
【００３１】
この高分子鎖の核となる芳香環としては、炭素数５〜８の芳香環、特に炭素数６の芳香環（即ちベンゼン環）の、単環又は２〜６個の縮合環、例えば、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環、ピレン環が挙げられ、好ましくはベンゼン環である。
【００３２】
核となる芳香環に導入される高分子鎖の数は、ベンゼン環であれば２〜６個、ナフタレン環の場合２〜８個、アントラセン環、ピレン環の場合２〜１０個であるが、多い程効果的であり、例えばベンゼン環であれば２、３、４又は６個、特に４又は６個、とりわけ６個であることが好ましい。
【００３３】
高分子鎖を導入するための原料となる芳香環化合物としては、例えば芳香環がベンゼン環の場合、次のようなベンゼン誘導体が挙げられる。
【００３４】
即ち、３分岐鎖用としては、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる２，４，６−トリス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）メシチレンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３５】
芳香環に導入された高分子鎖のうちの少なくとも一つ、好ましくはそのすべてがその先端側に活性高分子ブロック鎖を有するものである。この高分子鎖は、ビニル系単量体の単独又は異なるビニル系単量体の共重合体よりなるビニル系高分子ブロック鎖、特に３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２等の重合体よりなるポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖であることが好ましい。
【００３６】
また、１本の高分子鎖を構成する単量体の数は、その単量体の種類や反応性等によっても異なるが、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖を構成する単量体数は５〜１０００程度であることが好ましい。
【００３７】
芳香環にこのような高分子鎖を導入してなる高分子化合物、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体よりなる高分子ブロック鎖を導入した高分子化合物を合成するには、まず、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドと前述のベンゼン誘導体とをメタノールなどのアルコール溶液あるいは溶解性を考慮してクロロホルムなどの低極性溶媒の溶液として混合し、光重合反応させることにより、ベンゼン環に対し上記ベンゼン誘導体由来の−ＣＨ２−等を介して３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドの重合体が結合した高分子化合物（ホモポリマー）を製造する。
【００３８】
本発明では、このホモポリマーの３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド重合鎖に対し、さらにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドをブロック共重合させてもよい。このＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドブロックの数平均分子量は１０００〜１００，０００程度が好ましい。Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミドをブロック共重合させるには、上記ホモポリマーと共にメタノールなどのアルコール溶媒あるいはクロロホルムなどの低極性溶媒に溶解させ、光重合反応させればよい。
【００３９】
このようにして合成されたホモポリマー又はブロックコポリマーよりなる高分子化合物の分子量は５千〜５０万、特に１万〜２０万、とりわけ１万〜１０万程度であることが好ましい。この分子量が過度に大きいと、高分子化合物及び核酸で複合体を形成させた際の複合体のサイズが大きくなったり、溶解性が低くなったり、生体内へ使用する場合に、排泄に不利になることが考えられる。逆に過度に小さいと低分子量有機化合物としての性質が強く発生して細胞毒性、高浸透圧、など生物学的な弊害が出てしまう。
【００４０】
［核酸］
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４１】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４２】
この核酸としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）のようなポリヌクレオチド特にＤＮＡが好適であるが、リボ核タンパク質であってもよい。
【００４３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子）、ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子、ＩＬ−２遺伝子、ＩＬ−４遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子、ＩＬ−７遺伝子、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子、ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００、ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４４】
また、アンチセンスによるリプレッシングの他に、２１〜２３塩基の二本鎖ＲＮＡを使用したＲＮＡ干渉によるｍＲＮＡ破壊などに利用することも可能である。
【００４５】
［ポリプレックスの形成］
上記高分子化合物と核酸とを複合させてポリプレックスを形成するには、この高分子化合物の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の分散液に対し、常温にて核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して高分子化合物を過剰量添加し、高分子化合物を核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４６】
高分子化合物と核酸とを複合させた複合体は、微粒状のポリプレックスとなる。その粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。これよりも小さいと、ポリプレックス内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４７】
［ヒアルロン酸］
ヒアルロン酸としては、分子量が５千〜５００万、好ましくは５千〜５万のものが用いられる。
【００４８】
ヒアルロン酸をポリプレックスに吸着させるには、上記の分散液にヒアルロン酸の水溶液を添加し、混合すればよい。ポリプレックスの形成膜にヒアルロン酸を添加して、ポリプレックスの形成膜にヒアルロン酸を併せて吸着させてもよい。ヒアルロン酸の吸着量は、吸着前後におけるポリプレックスの粒子径変化率が５０％以下となるようにすることが好ましい。
【００４９】
［生体への投与］
上述のような高分子化合物（スター型分岐ポリマー）と核酸とのポリプレックスにヒアルロン酸を吸着させてなる遺伝子導入剤は、生体内へ投与される。
【００５０】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」は癌細胞である。即ち、上記の通り、ヒアルロン酸は癌細胞の多くが発現しているマーカーＣＤ４４のリガンドして働くところから、本発明の遺伝子導入剤は癌細胞への指向性を有しており、肝細胞に容易に進入することができるものと考えられる。
【００５１】
本発明の遺伝子導入剤は任意の方法で生体に投与することができる。
【００５２】
体内へ挿入するデバイスとしては、経皮的に患部付近の組織へ刺入するものや、血管カテーテル、ステントグラフトのように血管内へ留置するものなどがあるが、この限りではない。
【００５３】
当該投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５４】
この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤、安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５５】
また、この核酸含有複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５６】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５７】
この核酸含有複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、肝臓がん、Ｃ型肝炎、Ｂ型肝炎、劇症肝炎、アルコール性肝炎、線維化症、脂肪肝などが挙げられる。
【実施例】
【００５８】
以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をより具体的に説明する。
【００５９】
［実施例１の分岐型カチオン性ホモポリマーの合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００６０】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）１．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、減圧乾燥後、クロロホルム２００ｍＬへ溶解し、１５０ｍＬの水を加えて抽出分離し、臭化ナトリウムを除去した。この操作を３回繰り返した後、クロロホルム層を硫酸マグネシウムで２４時間乾燥させて、濾過後、ｎ−ヘキサンを加え、再結晶を行って精製し、白色の１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００６１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００６２】
【化１】
【００６３】
ii)光重合による４分岐型スター型重合体よりなる分岐型カチオン性ホモポリマーの合成
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラサキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、減圧蒸留により精製してある３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（以下、３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）１９．０ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。石英セル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、２００Ｗ高圧水銀灯で紫外光を３５分間照射した。照射強度は照度計（ＵＶＲ−１，ＴＯＰＣＯＮ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して１ｍＷ／ｃｍ２（２５０ｎｍ）に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させて精製し、少量の水へ溶解し、0.2μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマー１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（ｐＤＭＡＰＡＡｍ）よりなるカチオン性ポリマーを得た（重合率４０％）。分子量はＧＰＣにより５０，０００と測定された。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
【化２】
【００６７】
[比較例１の直線型カチオン性ホモポリマーの合成]
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）の代わりに（ブロモメチル）ベンゼンを使用したこと以外は実施例１と同様にして（Ｎ、Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを合成した。精製物は無色液体で、収率は約９３％であった。
【００６８】
１Ｈ−ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はσ７．４１〜７．２７ｐｐｍ（ｍ、５Ｈ、Ａｒ−Ｈ）、σ４．５４ｐｐｍ（ｓ、２Ｈ、Ａｒ−ＣＨ２−Ｓ−）、σ４．０８〜４．０１ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−）、σ３．７２ｐｐｍ（ｑ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−）、σ１．２５−１．３１ｐｐｍ（ｍ、６Ｈ、−ＣＨ２−ＣＨ３）となった。
【００６９】
次いで、実施例１のii)の手法に準じて、１本の直鎖のみを有した直線型のカチオン性ホモポリマーであるモノ［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンを合成した。分子量は実施例と同等の約５３，０００へ調整した。
[実施例１及び比較例１におけるカチオン性ポリマー／ＤＮＡ／ヒアルロン酸からなるイオン複合体の合成]
ｉ）カチオン性ポリマー／ＤＮＡ複合体の合成
ＤＮＡはホタルルシフェラーゼをコードするプラスミド（プロメガ社、ｐＧＬ３コントロール）を使用した。実施例１の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍポリマー又は比較例１の直線型ｐＤＭＡＰＰＡｍポリマーを生理食塩水へ溶解し、それぞれ１．０μｇ／μＬ濃度の溶液を調製した。各溶液６０μＬに対し、０．０５μｇ／μＬのＤＮＡの２０ｍＭトリス・ＥＤＴＡ緩衝溶液９０μＬを混合してタッピングしてポリプレックスを形成させた。
【００７０】
形成されたイオン複合体は、いずれのカチオン性高分子で形成させても約１７０ｎｍ〜２００ｎｍの粒子径の微粒子であったが、比較例１の直線型ｐＤＭＡＰＰＡｍポリマーから形成されたイオン複合体の微粒子は経時性に凝集して粒子径が増大し、２４時間後には完全に沈殿して動的光散乱のシグナルが消滅した。一方、実施例１の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍポリマーから形成されたイオン複合体の微粒子は２４時間後にも形成直後の粒子径を維持しており、イオン複合体が安定であることが確認された。
ii）ヒアルロン酸の複合化
ｉ)で合成した４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍポリマー又は直線型ｐＤＭＡＰＰＡｍポリマーとＤＮＡとの複合体を約２０分間室温でインキュベートした後、ヒアルロン酸の生理食塩水溶液１μｇ／μＬを混合し、３０分間静置した。
【００７１】
ヒアルロン酸の添加量は、ポリマーに対し５％相当量である。ヒアルロン酸の吸着前後におけるポリプレックスの粒子径変化率は１０〜２０％である。
【００７２】
３０分後、アクリルアミドゲルを使用してサブマリン式電気泳動を行い（アトー社、ＡＥ６１１）、臭化エチジウムで発光させた。
【００７３】
その結果、比較例１ではイオン複合体が破壊され、スポット位置にイオン複合体が残っていないことが認められた。これに対し、実施例１では、プラスに帯電したイオン複合体の一部が泳動せずにスポット位置に留まりＤＮＡインターカレンによる発色が確認された。
【００７４】
以上より、本発明の遺伝子ベクターは、マイナスに帯電したヒアルロン酸を複合化させてもＤＮＡとカチオン性ポリマーのイオン結合を維持し、複合体へ導入されたヒアルロン酸によりＣＤ４４を発現する細胞を認識することで癌細胞へ指向性を持ち、特異的に遺伝子導入できる可能性が示唆された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させてなる遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、ヒアルロン酸の分子量が５千〜５００万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１０において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１】
芳香環に複数の高分子鎖が置換基として導入された高分子化合物と核酸とのポリプレックスに対しヒアルロン酸を吸着させてなる遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記芳香環が炭素数５〜８の芳香環の、単環又は縮合環よりなることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記芳香環が、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、ビフェニル環、ビフェニレン環、ピリジン環、ピロール環、フラン環又はピレン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項３において、前記芳香環がベンゼン環であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項４において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して２〜６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個又は６個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項６において、前記高分子鎖はベンゼン環に対して４個導入されていることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記高分子鎖は、ポリアクリルアミド系高分子ブロック鎖又はポリアクリレート系高分子ブロック鎖であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、ヒアルロン酸の分子量が５千〜５００万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１項において、前記高分子化合物の分子量が５千〜５０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１１】
請求項１０において、前記高分子化合物の分子量が５千〜１０万であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【公開番号】特開２００８−２２２６６１（Ｐ２００８−２２２６６１Ａ）
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−６５２４１（Ｐ２００７−６５２４１）
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月２５日（２００８．９．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月１４日（２００７．３．１４）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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