遺伝子導入剤
【課題】遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものである。
【解決手段】芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものであることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ａ）〜（ｃ）
（ａ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（ｂ） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（ｃ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ｄ）〜（ｆ）
（ｄ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超１００ｍＭ以下である、
（ｅ） ビニル系モノマーの濃度が０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下である、
（ｆ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上２．０未満である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記多官能性イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として２個以上の前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記ビニル系モノマーが、カチオン性モノマーであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋スター型分岐型重合体の分子量が、３，０００〜３００，０００であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記重合が光照射によるものであること特徴とするものである。
【００１４】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記光照射の光が、２５０〜４００ｎｍの混合紫外線であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものであるため、効率よく細胞へ遺伝子を導入することができる。
【００１６】
本発明においては、前記リビング規則の範囲外となる（ａ）〜（ｃ）の条件のうち少なくとも１つを満たすことが好ましい。（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを満たす場合、重合反応が停止反応を伴うため、低分子量のスター型分岐型重合体同士が複雑に架橋した架橋スター型分岐型重合体、即ち、活性の高い遺伝子導入剤になる。
【００１７】
本発明のように、スター型分岐型重合体同士を架橋するためには、スター型分岐型重合体を、貧溶媒をエーテルとする再沈殿により精製し単離した後、架橋する必要があるが、スター型分岐型重合体の低分子量体は、エーテルに可溶であるため単離が困難であった。
【００１８】
即ち、従来の架橋スター型分岐型重合体は、分子量１５０００以上の高分子量スター型分岐型重合体を出発原料として用いていたが、このような高分子量体を架橋すると、架橋体がゲルを形成したり、代謝、排泄の観点から遺伝子導入剤としての使用に不適な分子量１５０，０００の超高分子量体になる場合があった。
【００１９】
本発明によれば、リビング規則の範囲外、即ち、ポリマー成長核が小さい重合開始の初期に、ポリマー成長反応と拮抗しやすい分岐鎖ω末端同士の衝突結合による成長停止反応が優先して起こりやすい条件下で重合を行うため、分岐鎖末端の成長停止反応による複雑な多分岐構造の成長核に対してさらに重合が起こりネットワーク状の架橋スター型分岐型重合体が得られると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものである。
【００２１】
なお、本明細書において、多官能性イニファター（以下、単にイニファターと称す場合がある。）とは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２２】
また、本明細書において、多官能性イニファター濃度とは、核である芳香環に結合するＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基のモル濃度を指す。
例えば、４官能性イニファター濃度は、下記計算式、
[(４官能性イニファターの重量／４官能性イニファターの分子量)×４]／溶媒の体積
により算出することができ、６官能性イニファター濃度は、下記計算式、
[(６官能性イニファターの重量／６官能性イニファターの分子量)×６]／溶媒の体積
により算出することができる。
【００２３】
本発明におけるリビング規則とは、通常のリビング重合において成立する、
重合開始剤のモル濃度×得られたポリマーの分子量＝収量
という関係を指す。
【００２４】
本発明に用いる原料の重合反応にあっては、イニファターの濃度が１〜１０ｍＭ、かつビニル系モノマーの濃度が０．５超〜１．５Ｍであり、さらに連鎖移動成分及び酸素が含まれない条件において、上記の関係が成立する。
【００２５】
本発明の遺伝子導入剤は、特に、溶液中のイニファターの濃度、及びビニル系モノマーの濃度を調整することにより、上記リビング規則が成立しないように重合した架橋スター型分岐型重合体よりなるものである。
【００２６】
なお、上記連鎖移動成分とは、具体的にはクロロホルム、塩化ベンゼン、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素、システインなどの還元性硫黄化合物、ブトキシヒドロキシトルエン、クレゾールなどのフェノール類化合物などであり、酸素が含まれない条件とは、溶存酸素濃度が１００ｐｐｍ以下程度であることをいう。
【００２７】
前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（１）〜（６）
（１） 多官能イニファターの濃度が１ｍＭ未満である、
（２） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（３） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（４） ビニル系モノマーの濃度が５．０Ｍ超である、
（５） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．００２未満である、
（６） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも一つの条件を満たす場合であるが、本発明においては、停止反応を積極的に起させるために、多官能イニファターの濃度を高く、および／またはビニル系モノマーの濃度を低く設定した、下記（ａ）〜（ｃ）
（ａ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（ｂ） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（ｃ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることが好ましく（請求項２）、特に、
下記（ｄ）〜（ｆ）
（ｄ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超１００ｍＭ以下である、
（ｅ） ビニル系モノマーの濃度が０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下である、
（ｆ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上２．０未満である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることが好ましい（請求項３）。
【００２８】
これらの条件を少なくとも１つ満たすことにより、分子量が小さく遺伝子導入活性が高い架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を得ることができる。
【００２９】
上記イニファターの濃度が極端に低い場合、イニファターの反応性が低いためにスター型分岐型重合体の収率が悪くなる。また、ビニル系モノマーの濃度が極端に低くてもスター型分岐型重合体の収率が悪くなる。
【００３０】
このような濃度範囲及びモル濃度比の範囲内で停止反応を伴った重合反応を行うことで、架橋スター型分岐型重合体の分岐構造を複雑なネットワーク状にすることができ、遺伝子導入活性を向上させることができる。また、スター型分岐型重合体を合成後に単離して光架橋する方法と異なり、ワンポットでの重合が可能である。
【００３１】
Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に２個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が２個以上分岐鎖として結合しているものが好適である。例えば、２分岐鎖としては、１，４−ジ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，４−ジ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３２】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００３３】
本発明に用いるビニル系モノマーとしては、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、特に、カチオン性モノマーであることが好ましい。
【００３４】
さらに本発明においては、上記ビニル系モノマーの他に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。
【００３５】
本発明の遺伝子導入剤は、上記の通り、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合したスター型分岐型重合体が生成し、さらにこのスター型分岐型重合体同士が架橋してなるものである。
【００３６】
光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、特に、２５０〜４００ｎｍの混合紫外線が好適である。照射時間は、１分〜３０，０００時間、照射強度は、０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３７】
本発明の遺伝子導入剤である架橋スター型分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、３，０００〜３００，０００、特に１５，０００〜１５０，０００、とりわけ２０，０００〜１００，０００程度が好ましい。また、分散（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜３．０程度が好ましい。
【００３８】
なお、本明細書中において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００３９】
上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００４０】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００４１】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４８】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００４９】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００５０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００５６】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００５７】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００５８】
【化１】
【００５９】
＜実施例１〜３＞
ii)カチオン性ホモポリマーの非リビング重合的光重合
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６０】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを９１ｍｇ（実施例１）、１８２ｍｇ（実施例２）及び２７４ｍｇ（実施例３）を３０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を４０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た。
【００６１】
重合率はそれぞれ、３５％（実施例１：イニファター９１ｍｇ）、２６％（実施例２：イニファター１８２ｍｇ）、１８％（実施例３：イニファター２７４ｍｇ）となった。分子量はＧＰＣにより、２６，０００（実施例１）、２６，０００（実施例２）または１５，０００（実施例３）と測定された。重合収率と分子量との間に相関は見出せず、リビング規則で重合が進行していないことが確認された。実施例１〜３の重合体の分散は、それぞれ、１．８（実施例１）、１．７（実施例２）、１．７（実施例３）であった。
【００６２】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６３】
＜比較例１〜４＞
iii)４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス[(Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル)−ポリ−(３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)−メチル]ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記i)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）へ単色光ＨＱＢＰフィルター（３７０ｎｍ）を装着して３７０ｎｍの単色紫外線を２０分間（比較例１）、３０分間（比較例２）、４０分間（比較例３）、及び５０分間（比較例４）照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して１．０ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た。得られたポリマーの重合率と分子量の関係は図１の通りであり、リビング規則に従って重合が進行したことが確認された。分散（Ｍｗ／Ｍｎ）はいずれも１．２〜１．３程度と狭いものであった。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
iv) 遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００６７】
上記ii)またはiii）にて合成したカチオン性ポリマーを遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【００６８】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図２及び図３に示す。
【００６９】
図３より、リビング規則に従って得たカチオン性ポリマー（比較例１〜４）では、分子量と遺伝子導入活性が相関し、高分子量のカチオン性ポリマー程、高い遺伝子導入活性が得られることが分かる。ただし分子量があまりにも大きいと細胞毒性が強く発現されるため、遺伝子導入活性は低くなる。従って、４分岐型カチオン性ホモポリマーの場合、分子量が約４０，０００〜６０，０００付近が遺伝子導入活性のピークになる。高分子量のカチオン性ポリマー程、高い遺伝子導入活性が得られるは、カチオン性ポリマーの分子量とＤＮＡ、ＲＮＡのコンデンス力の関係による効果である。
【００７０】
これに対し、図２より明らかな通り、実施例３（分子量１５，０００）の遺伝子導入活性が実施例１，２（分子量２６，０００）の遺伝子導入活性よりも高くなっている。即ち、分子量が大きいほど遺伝子導入活性が高くなる比較例（図３）と結果が逆転している。また、同じ分子量である実施例１、２では、イニファターの濃度が高い実施例２（２０ｍＭ）の系から合成した遺伝子導入剤のほうが、イニファター濃度の薄い実施例１（１０ｍＭ）の系から合成した遺伝子導入剤より高い遺伝子導入活性を示している。これは、イニファターの濃度が高い方が、成長停止反応の確率が高くなり、重合と同時に起こる分子間架橋による複雑なネットワーク構造のポリマーが形成されるためだと考えられる。さらに、実施例３（分子量１５，０００）と比較例１（分子量１５，０００）との間、及び実施例１，２（分子量２６，０００）と比較例３（分子量２７，０００）との間に数倍の遺伝子導入活性の差がある。この遺伝子導入活性の差は、架橋点の有無による構造的な差であると推測される。
【００７１】
＜比較例５〜７＞
v)カチオン性ホモポリマーの光架橋
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンの光架橋を行った。
【００７２】
即ち、上記iii）で合成した比較例１（分子量１５，０００）の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ，土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２L／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながらii)と同じ光照射装置で光照射重合を行った。照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射は２４０分間行った。照射終了後、得られた粉末は淡い黄褐色を帯びていた。５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成していた。溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。分子量はＧＰＣにより３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）と測定され、分子量の増大と分散のブロード化が確認された（比較例５）。
【００７３】
続いて、比較例３（分子量２７，０００）と比較例４（分子量４０，０００）の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーに関しても同様の方法で光架橋を行った結果、比較例３は、分子量が４６，０００、分散（Ｍｗ／Ｍｎ）が２．６まで増大し（比較例６）、比較例４のスター型分岐型重合体はほとんどが不溶性のゲルとなった（比較例７）。
【００７４】
次に、比較例５，６の光架橋体に関しても、iv）と同様に遺伝子導入活性を評価を行い、その結果を図４に示した。
【００７５】
図４より、光照射することによる遺伝子導入活性効果は向上したが実施例よりも劣っていた。また、本発明のイニファターから成長する低分子量の核同士の衝突による停止反応を利用した遺伝子導入剤は、精製及び単離操作が必要ないため、ワンポットで合成が可能であり、所要時間、合成に消費した溶媒量などの製造面においても有利である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】比較例の結果を示すグラフである。
【図２】実施例の結果を示すグラフである。
【図３】比較例の結果を示すグラフである。
【図４】実施例及び比較例の結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとしてベンゼンなど芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターがＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子導入効率がさらに向上した遺伝子導入剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものであることを特徴とするものである。
【０００６】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ａ）〜（ｃ）
（ａ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（ｂ） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（ｃ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とするものである。
【０００７】
請求項３の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ｄ）〜（ｆ）
（ｄ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超１００ｍＭ以下である、
（ｅ） ビニル系モノマーの濃度が０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下である、
（ｆ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上２．０未満である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とするものである。
【０００８】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項１ないし３のいずれか１項において、前記多官能性イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として２個以上の前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることを特徴とするものである。
【０００９】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項１ないし４のいずれか１項において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１０】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項５において、前記ビニル系モノマーが、カチオン性モノマーであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋スター型分岐型重合体の分子量が、３，０００〜３００，０００であることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項９の遺伝子導入剤は、請求項１ないし８のいずれか１項において、前記重合が光照射によるものであること特徴とするものである。
【００１４】
請求項１０の遺伝子導入剤は、請求項９において、前記光照射の光が、２５０〜４００ｎｍの混合紫外線であることを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものであるため、効率よく細胞へ遺伝子を導入することができる。
【００１６】
本発明においては、前記リビング規則の範囲外となる（ａ）〜（ｃ）の条件のうち少なくとも１つを満たすことが好ましい。（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つを満たす場合、重合反応が停止反応を伴うため、低分子量のスター型分岐型重合体同士が複雑に架橋した架橋スター型分岐型重合体、即ち、活性の高い遺伝子導入剤になる。
【００１７】
本発明のように、スター型分岐型重合体同士を架橋するためには、スター型分岐型重合体を、貧溶媒をエーテルとする再沈殿により精製し単離した後、架橋する必要があるが、スター型分岐型重合体の低分子量体は、エーテルに可溶であるため単離が困難であった。
【００１８】
即ち、従来の架橋スター型分岐型重合体は、分子量１５０００以上の高分子量スター型分岐型重合体を出発原料として用いていたが、このような高分子量体を架橋すると、架橋体がゲルを形成したり、代謝、排泄の観点から遺伝子導入剤としての使用に不適な分子量１５０，０００の超高分子量体になる場合があった。
【００１９】
本発明によれば、リビング規則の範囲外、即ち、ポリマー成長核が小さい重合開始の初期に、ポリマー成長反応と拮抗しやすい分岐鎖ω末端同士の衝突結合による成長停止反応が優先して起こりやすい条件下で重合を行うため、分岐鎖末端の成長停止反応による複雑な多分岐構造の成長核に対してさらに重合が起こりネットワーク状の架橋スター型分岐型重合体が得られると考えられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものである。
【００２１】
なお、本明細書において、多官能性イニファター（以下、単にイニファターと称す場合がある。）とは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００２２】
また、本明細書において、多官能性イニファター濃度とは、核である芳香環に結合するＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基のモル濃度を指す。
例えば、４官能性イニファター濃度は、下記計算式、
[(４官能性イニファターの重量／４官能性イニファターの分子量)×４]／溶媒の体積
により算出することができ、６官能性イニファター濃度は、下記計算式、
[(６官能性イニファターの重量／６官能性イニファターの分子量)×６]／溶媒の体積
により算出することができる。
【００２３】
本発明におけるリビング規則とは、通常のリビング重合において成立する、
重合開始剤のモル濃度×得られたポリマーの分子量＝収量
という関係を指す。
【００２４】
本発明に用いる原料の重合反応にあっては、イニファターの濃度が１〜１０ｍＭ、かつビニル系モノマーの濃度が０．５超〜１．５Ｍであり、さらに連鎖移動成分及び酸素が含まれない条件において、上記の関係が成立する。
【００２５】
本発明の遺伝子導入剤は、特に、溶液中のイニファターの濃度、及びビニル系モノマーの濃度を調整することにより、上記リビング規則が成立しないように重合した架橋スター型分岐型重合体よりなるものである。
【００２６】
なお、上記連鎖移動成分とは、具体的にはクロロホルム、塩化ベンゼン、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素、システインなどの還元性硫黄化合物、ブトキシヒドロキシトルエン、クレゾールなどのフェノール類化合物などであり、酸素が含まれない条件とは、溶存酸素濃度が１００ｐｐｍ以下程度であることをいう。
【００２７】
前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（１）〜（６）
（１） 多官能イニファターの濃度が１ｍＭ未満である、
（２） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（３） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（４） ビニル系モノマーの濃度が５．０Ｍ超である、
（５） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．００２未満である、
（６） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも一つの条件を満たす場合であるが、本発明においては、停止反応を積極的に起させるために、多官能イニファターの濃度を高く、および／またはビニル系モノマーの濃度を低く設定した、下記（ａ）〜（ｃ）
（ａ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（ｂ） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（ｃ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることが好ましく（請求項２）、特に、
下記（ｄ）〜（ｆ）
（ｄ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超１００ｍＭ以下である、
（ｅ） ビニル系モノマーの濃度が０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下である、
（ｆ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上２．０未満である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることが好ましい（請求項３）。
【００２８】
これらの条件を少なくとも１つ満たすことにより、分子量が小さく遺伝子導入活性が高い架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤を得ることができる。
【００２９】
上記イニファターの濃度が極端に低い場合、イニファターの反応性が低いためにスター型分岐型重合体の収率が悪くなる。また、ビニル系モノマーの濃度が極端に低くてもスター型分岐型重合体の収率が悪くなる。
【００３０】
このような濃度範囲及びモル濃度比の範囲内で停止反応を伴った重合反応を行うことで、架橋スター型分岐型重合体の分岐構造を複雑なネットワーク状にすることができ、遺伝子導入活性を向上させることができる。また、スター型分岐型重合体を合成後に単離して光架橋する方法と異なり、ワンポットでの重合が可能である。
【００３１】
Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基を同一分子内に２個以上有する化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が２個以上分岐鎖として結合しているものが好適である。例えば、２分岐鎖としては、１，４−ジ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，４−ジ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、３分岐鎖としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジチオカルバミル酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとナトリウムＮ，Ｎ−ジチオカルバメートとをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジチオカルバミルメチル）ベンゼンである。
【００３２】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００３３】
本発明に用いるビニル系モノマーとしては、例えば、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましく、特に、カチオン性モノマーであることが好ましい。
【００３４】
さらに本発明においては、上記ビニル系モノマーの他に、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。また、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させて温度感応性ポリマーブロックを導入してもよい。
【００３５】
本発明の遺伝子導入剤は、上記の通り、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合したスター型分岐型重合体が生成し、さらにこのスター型分岐型重合体同士が架橋してなるものである。
【００３６】
光の照射条件は、光波長１８０〜７００ｎｍ、特に、２５０〜４００ｎｍの混合紫外線が好適である。照射時間は、１分〜３０，０００時間、照射強度は、０．００１〜１０，０００μＷ／ｃｍ２程度が好適である。
【００３７】
本発明の遺伝子導入剤である架橋スター型分岐型重合体の分子量は分岐鎖の鎖数によるが、３，０００〜３００，０００、特に１５，０００〜１５０，０００、とりわけ２０，０００〜１００，０００程度が好ましい。また、分散（Ｍｗ／Ｍｎ）は、１．１〜３．０程度が好ましい。
【００３８】
なお、本明細書中において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００３９】
上記の通り、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド又はその誘導体をブロック共重合させた遺伝子導入剤は、約３０℃よりも高い温度で疎水性であり、約３０℃よりも低い温度で親水性である。従って、３０℃よりも低い温度で核酸と遺伝子導入剤の水溶液とを混合して遺伝子導入剤に核酸を複合させることができる。
【００４０】
約３０℃よりも高い温度では、核酸を複合した遺伝子導入剤は、温度感応性核酸よりなる疎水性部分を有し、水不溶性となる。
【００４１】
このようにして生成した遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００４２】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００４３】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００４４】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００４５】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００４６】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００４７】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００４８】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００４９】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００５０】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００５１】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００５２】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００５３】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００５４】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ−Ｎジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００５６】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下で室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３リットルのメタノールへ投入して３０分間攪拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ、結晶を濾別後に大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して、白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００５７】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００５８】
【化１】
【００５９】
＜実施例１〜３＞
ii)カチオン性ホモポリマーの非リビング重合的光重合
下記反応式に従い、次のようにして、１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６０】
即ち、上記ｉ)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを９１ｍｇ（実施例１）、１８２ｍｇ（実施例２）及び２７４ｍｇ（実施例３）を３０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド３．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０ｎｍ−４００ｎｍの混合紫外線を４０分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た。
【００６１】
重合率はそれぞれ、３５％（実施例１：イニファター９１ｍｇ）、２６％（実施例２：イニファター１８２ｍｇ）、１８％（実施例３：イニファター２７４ｍｇ）となった。分子量はＧＰＣにより、２６，０００（実施例１）、２６，０００（実施例２）または１５，０００（実施例３）と測定された。重合収率と分子量との間に相関は見出せず、リビング規則で重合が進行していないことが確認された。実施例１〜３の重合体の分散は、それぞれ、１．８（実施例１）、１．７（実施例２）、１．７（実施例３）であった。
【００６２】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６３】
＜比較例１〜４＞
iii)４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス[(Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル)−ポリ−(３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)−メチル]ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００６４】
即ち、上記i)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）へ単色光ＨＱＢＰフィルター（３７０ｎｍ）を装着して３７０ｎｍの単色紫外線を２０分間（比較例１）、３０分間（比較例２）、４０分間（比較例３）、及び５０分間（比較例４）照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して１．０ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型ホモポリマーｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た。得られたポリマーの重合率と分子量の関係は図１の通りであり、リビング規則に従って重合が進行したことが確認された。分散（Ｍｗ／Ｍｎ）はいずれも１．２〜１．３程度と狭いものであった。
【００６５】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００６６】
iv) 遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００６７】
上記ii)またはiii）にて合成したカチオン性ポリマーを遺伝子導入剤として使用した。遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【００６８】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図２及び図３に示す。
【００６９】
図３より、リビング規則に従って得たカチオン性ポリマー（比較例１〜４）では、分子量と遺伝子導入活性が相関し、高分子量のカチオン性ポリマー程、高い遺伝子導入活性が得られることが分かる。ただし分子量があまりにも大きいと細胞毒性が強く発現されるため、遺伝子導入活性は低くなる。従って、４分岐型カチオン性ホモポリマーの場合、分子量が約４０，０００〜６０，０００付近が遺伝子導入活性のピークになる。高分子量のカチオン性ポリマー程、高い遺伝子導入活性が得られるは、カチオン性ポリマーの分子量とＤＮＡ、ＲＮＡのコンデンス力の関係による効果である。
【００７０】
これに対し、図２より明らかな通り、実施例３（分子量１５，０００）の遺伝子導入活性が実施例１，２（分子量２６，０００）の遺伝子導入活性よりも高くなっている。即ち、分子量が大きいほど遺伝子導入活性が高くなる比較例（図３）と結果が逆転している。また、同じ分子量である実施例１、２では、イニファターの濃度が高い実施例２（２０ｍＭ）の系から合成した遺伝子導入剤のほうが、イニファター濃度の薄い実施例１（１０ｍＭ）の系から合成した遺伝子導入剤より高い遺伝子導入活性を示している。これは、イニファターの濃度が高い方が、成長停止反応の確率が高くなり、重合と同時に起こる分子間架橋による複雑なネットワーク構造のポリマーが形成されるためだと考えられる。さらに、実施例３（分子量１５，０００）と比較例１（分子量１５，０００）との間、及び実施例１，２（分子量２６，０００）と比較例３（分子量２７，０００）との間に数倍の遺伝子導入活性の差がある。この遺伝子導入活性の差は、架橋点の有無による構造的な差であると推測される。
【００７１】
＜比較例５〜７＞
v)カチオン性ホモポリマーの光架橋
１，２，４，５−テトラキス［（Ｎ,Ｎ−ジエチルジチオカルバミル）−ポリ−（３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド）−メチル］ベンゼンの光架橋を行った。
【００７２】
即ち、上記iii）で合成した比較例１（分子量１５，０００）の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマー０．３ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ，土星型回転子で激しく攪拌しながら高純度窒素ガス（２L／分）で３０分間パージして均質な粉末状態へ粉砕した。ここへ窒素パージ及び激しい攪拌を続けながらii)と同じ光照射装置で光照射重合を行った。照射強度は１．０ｍＷ／ｃｍ２、光照射は２４０分間行った。照射終了後、得られた粉末は淡い黄褐色を帯びていた。５０ｍＬのメタノールを投入すると少量の不溶性のゲル状成分が生成していた。溶液を＃２の濾紙で濾過した後、エバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルへ滴下してポリマー成分を沈殿させた。その後、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿処理を行って精製した。分子量はＧＰＣにより３５，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）と測定され、分子量の増大と分散のブロード化が確認された（比較例５）。
【００７３】
続いて、比較例３（分子量２７，０００）と比較例４（分子量４０，０００）の４分岐型ｐＤＭＡＰＡＡｍホモポリマーに関しても同様の方法で光架橋を行った結果、比較例３は、分子量が４６，０００、分散（Ｍｗ／Ｍｎ）が２．６まで増大し（比較例６）、比較例４のスター型分岐型重合体はほとんどが不溶性のゲルとなった（比較例７）。
【００７４】
次に、比較例５，６の光架橋体に関しても、iv）と同様に遺伝子導入活性を評価を行い、その結果を図４に示した。
【００７５】
図４より、光照射することによる遺伝子導入活性効果は向上したが実施例よりも劣っていた。また、本発明のイニファターから成長する低分子量の核同士の衝突による停止反応を利用した遺伝子導入剤は、精製及び単離操作が必要ないため、ワンポットで合成が可能であり、所要時間、合成に消費した溶媒量などの製造面においても有利である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】比較例の結果を示すグラフである。
【図２】実施例の結果を示すグラフである。
【図３】比較例の結果を示すグラフである。
【図４】実施例及び比較例の結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、
前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ａ）〜（ｃ）
（ａ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（ｂ） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（ｃ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ｄ）〜（ｆ）
（ｄ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超１００ｍＭ以下である、
（ｅ） ビニル系モノマーの濃度が０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下である、
（ｆ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上２．０未満である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記多官能性イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として２個以上の前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記ビニル系モノマーが、カチオン性モノマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋スター型分岐型重合体の分子量が、３，０００〜３００，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記重合が光照射によるものであること特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項９において、前記光照射の光が、２５０〜４００ｎｍの混合紫外線であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１】
芳香環を核とし、この核に分岐鎖として複数のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合している多官能性イニファターと、ビニル系モノマーとを溶液中で重合することにより得られるスター型分岐型重合体同士が架橋した架橋スター型分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤であって、
前記架橋スター型分岐型重合体は、前記溶液中の多官能性イニファターの濃度、ビニル系モノマーの濃度、及び多官能性イニファターとビニル系モノマーとのモル濃度の比をこの重合反応におけるリビング規則の範囲外となるような条件で重合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ａ）〜（ｃ）
（ａ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超である、
（ｂ） ビニル系モノマーの濃度が０．５Ｍ以下である、
（ｃ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項１において、前記リビング規則の範囲外となる条件は、下記（ｄ）〜（ｆ）
（ｄ） 多官能イニファターの濃度が１０ｍＭ超１００ｍＭ以下である、
（ｅ） ビニル系モノマーの濃度が０．０５Ｍ以上０．５Ｍ以下である、
（ｆ） 多官能イニファター／ビニル系モノマーのモル比が０．０２以上２．０未満である、
の少なくとも１つの条件を満たすものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項において、前記多官能性イニファターが、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として２個以上の前記Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項５において、前記ビニル系モノマーが、カチオン性モノマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、分岐型重合体の分岐鎖のＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が架橋点として寄与していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋スター型分岐型重合体の分子量が、３，０００〜３００，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項において、前記重合が光照射によるものであること特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項１０】
請求項９において、前記光照射の光が、２５０〜４００ｎｍの混合紫外線であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２９０９０（Ｐ２０１０−２９０９０Ａ）
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１９３５９０（Ｐ２００８−１９３５９０）
【出願日】平成２０年７月２８日（２００８．７．２８）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１２日（２０１０．２．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月２８日（２００８．７．２８）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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