遺伝子発現方法
【課題】新規な遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌の提供。特に、従来技術と比較し更に効率的かつ簡便な遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌の提供。
【解決手段】宿主として枯草菌を使用し、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子の発現量が培養フェーズに応じて制御されうる組換え枯草菌を用いる、目的遺伝子の発現量が効率的に制御される方法。
【解決手段】宿主として枯草菌を使用し、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子の発現量が培養フェーズに応じて制御されうる組換え枯草菌を用いる、目的遺伝子の発現量が効率的に制御される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた有用物質の工業的生産における一つの重要課題として、当該有用物質の生産性向上が挙げられる。従来、当該課題を解決するため、突然変異等の遺伝学的手法による高生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いた、より効率的な高生産菌の育種が行われている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受け、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用する試みもなされている。
【０００３】
近年、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が成育に必須であることが報告されている（非特許文献１）。また、枯草菌等の細菌の胞子形成初期に機能する遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁若しくは細胞膜中のテイコ酸へのＤ−アラニン付加に関与する遺伝子、更にはサーファクチンの生合成若しくは分泌に関与する遺伝子が単独に欠失又は不活性化された菌株が作製されている（特許文献１〜８参照）。
【０００４】
また、本出願人は、枯草菌の遺伝子破壊株を網羅的に解析し、枯草菌ゲノムの大領域を欠失させ、各種酵素の生産性に優れた変異株の創出に成功している（特許文献９）。
【０００５】
ＲｏｃＧタンパク質は、アルギニン分解経路の最下流において、グルタミン酸をアンモニアと２−オキソグルタル酸に分解する異化性のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を触媒する機能、並びにグルタミン酸合成酵素ＧｌｔＡＢの発現を抑制する機能を有し（非特許文献２）、ＴＣＡ回路及びグルタミン酸合成経路を複雑に制御する重要なタンパク質であることが報告されている。
【０００６】
更に最近、本発明者らは、タンパク質やポリペプチドの生産性向上にとりｒｏｃＧ遺伝子の適度な発現が重要であることを見出している。すなわち、ＩＰＴＧの添加量によるｒｏｃＧ遺伝子発現制御が可能な枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４変異株）を作製し、組み換えタンパク質の生産性を解析した結果、ある特定の範囲のＩＰＴＧ濃度においてＭＧＢ８７４親株よりも高い組み換えタンパク質の生産性を示すことを報告している（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５８−１９０３９０号公報
【特許文献２】特開昭６１−１３８１号公報
【特許文献３】国際公開第８９／０４８６６号パンフレット
【特許文献４】特表平１１−５０９０９６号公報
【特許文献５】特許第３２１０３１５号公報
【特許文献６】特表２００１−５２７４０１号公報
【特許文献７】特表２００２−５２００１７号公報
【特許文献８】特表２００１−５０３６４１号公報
【特許文献９】特開２００７−１３００１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，４６７８−４６８３，２００３
【非特許文献２】Ｂ．Ｒ．Ｂｅｌｉｔｓｋｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，１０３５（Ｆｅｂ，１９９７）
【非特許文献３】日本農芸化学会２００９年度大会 発表要旨
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規な遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌の提供に関し、特に、従来技術と比較し更に効率的かつ簡便な遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主として枯草菌を使用し、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子の発現量が培養フェーズに応じて制御されうる組換え枯草菌を構築し、それを用いることにより、目的遺伝子の発現量を効率的に制御することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の１）〜１２）に係るものである。
１） 枯草菌を宿主として用いる目的遺伝子の発現方法であって、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子を、対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御することを特徴とする前記発現方法。
２） 前記ｒｏｃＧ遺伝子の発現量が、当該ｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結された、培養フェーズにより遺伝子発現量を変化させる異種プロモーターにより制御される、前記１）に記載の方法。
３） 前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記２）に記載の方法。
４） 前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記２）に記載の方法。
５） 前記枯草菌が、枯草菌ＭＧＢ８７４株に由来する枯草菌変異株である、前記１）から４）のいずれか１つに記載の方法。
６） 前記目的遺伝子が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝子である、前記１）から５）のいずれか１つに記載の方法。
７） 前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、前記６）に記載の方法。
８） 前記６）に記載の方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
９） 前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、前記８）に記載の製造方法。
１０） 目的遺伝子を導入した枯草菌であって、ｒｏｃＧ遺伝子が作動可能に連結された異種プロモーターにより対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御されることを特徴とする組換え枯草菌。
１１） 前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記１０）に記載の組換え枯草菌。
１２） 前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記１０）に記載の組換え枯草菌。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、目的遺伝子を効率的かつ簡便に発現させることにより、例えば目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上が可能となり、有用タンパク質、特にセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の工業的生産の実現が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】時間経過（横軸）に伴うｒｏｃＧ、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒの発現（転写）量の変化を示す、ＭＧＢ８７４株のタイリングアレイ解析結果。
【図２】（Ａ）ｐＤＬＮＴｙｒｂＧの構築方法を模式的に示す図。（Ｂ）ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製方法を模式的に示す図。
【図３】変異株の細胞増殖を示すグラフ（折れ線グラフ）、及びセルラーゼ生産量を示すグラフ（棒グラフ）。左縦軸は枯草菌の増殖を示し、右縦軸はセルラーゼ生産量（相対値）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的遺伝子の発現方法は、宿主として枯草菌を用い、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子を、対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御するものである。
【００１５】
枯草菌とは、好気性のグラム陽性桿菌で、芽胞を形成する真正細菌の一種である。本発明において宿主として用いられる枯草菌は、野生株でも変異株でもよいが、例えば枯草菌ＭＧＢ８７４株に由来する枯草菌変異株を用いるのが好ましい。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株とは、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）を野生株とし、そのゲノムの大領域、すなわちｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失させて構築した株である（前記特許文献９）。下表に当該欠失領域を示すが、当該欠失領域は、言い換えると、同表に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域である。
【表１】
【００１６】
本願発明における目的遺伝子とは、上記宿主細胞内で当該遺伝子によりコードされるタンパク質を発現させようとする遺伝子を指し、上記宿主細胞に元来存在する遺伝子あってもよく、あるいは上記宿主細胞に元来存在しない外来の遺伝子であってもよい。
【００１７】
遺伝子の発現とは、広義には、遺伝情報が細胞内において何らかの構造及び機能に変換される過程をいうが、具体的には、目的遺伝子に基づいてタンパク質が合成されるか、又はｍＲＮＡが合成されることを指す。本発明における具体例としては、細胞内において、目的遺伝子がその配列に基づきｍＲＮＡに転写されること、又はその転写産物の配列に基づきタンパク質又はポリペプチドに翻訳されることが挙げられる。したがって、本発明の一態様には、後述するような、上記の遺伝子発現方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法が包含される。
【００１８】
ｒｏｃＧ遺伝子とは、ＲｏｃＧタンパク質をコードするＤＮＡ配列のことを指す。ＲｏｃＧタンパク質とは、アルギニン分解経路の最下流において機能し、グルタミン酸をアンモニアと２−オキソグルタル酸に分解する異化性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する他、転写因子ＧｌｔＣと相互作用することでグルタミン酸合成酵素ＧｌｔＡＢの発現を抑制する機能を有するタンパク質のことを指し（前記非特許文献２）、細胞内の主要な代謝経路であるＴＣＡ回路及びグルタミン酸合成経路を複雑に制御する重要なタンパクである。
【００１９】
本発明においては、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量が、培養中に特別な操作を行わなくても対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御される。ここで、対数増殖期とは、枯草菌細胞の生育曲線において、細胞数が対数的に増加する時期のことを指す。一方、定常期とは、対数増殖期が過ぎ、細胞の分裂・増殖が停止し、細胞数の増加が見られなくなる時期のことを指す。
【００２０】
具体的には、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量を、当該ｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結された、培養フェーズにより遺伝子発現量を変化させる異種プロモーターにより制御すればよい。ここで、異種プロモーターとは、下記で説明される固有のプロモーター以外の、当該遺伝子と作動可能に連結されているプロモーターであり、本発明においては、遺伝子操作方法により人為的に導入される。ここで、作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）とは、制御配列が機能してコード配列によりコードされたタンパク質の発現が制御されうる位置関係で、当該制御配列と当該コード配列とが配置していることを指す。具体例としては、プロモーターとそれに隣接する遺伝子とが、当該プロモーターの方向に沿って、当該遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。特に本願においては、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター以外の異種プロモーターとｒｏｃＧ遺伝子とが、当該異種プロモーターの制御下で当該ｒｏｃＧ遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。なお、本発明における一般的な遺伝子操作方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）等に記載の公知の方法に従い実施される。
【００２１】
一方、固有のプロモーターとは、下記の異種プロモーターに相対する意味で用いられる用語であり、下記の方法で遺伝子操作されていない宿主のゲノムに存在する遺伝子が元来、その制御下において発現するプロモーターのことを指し、言い換えると、元来、当該遺伝子と作動可能に連結されているプロモーターのことである。
【００２２】
上記のｒｏｃＧ遺伝子の発現量の制御を実施するための具体的な手段としては、前記異種プロモーターとして、そのプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子を、対数増殖期において発現させ、かつ、定常期において発現を抑制するプロモーター（以下「培養後半抑制型プロモーター」と称する）を採用し、それをゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結することが挙げられる。
【００２３】
培養後半抑制型プロモーターは、例えば、上記Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文に記載の方法に基づき、枯草菌において、培養初期において発現し、かつ定常期に発現量が低下する遺伝子を選抜することにより選抜できる。具体的には、対数増殖期（例えば培養開始後１〜５時間）においてある一定値以上の発現量を示し、かつ、定常期（例えば培養開始後２０〜６０時間）においてある一定値以下の発現量を示す遺伝子群が選抜される。
【００２４】
なお、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量は、遺伝子からのｍＲＮＡへの転写量や、ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質又はポリペプチドの生産量を測定することで把握できる。ｍＲＮＡの転写量の測定方法としては、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼ活性保護法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。あるいは、タイリングアレイ法（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用いてもよい。タイリングアレイ法とは、解読済みのゲノムデータから等間隔に抜き出した塩基配列を検出用プローブとしてタイル状に並べたＤＮＡチップ（タイリングアレイ）を用いた遺伝子発現解析方法のことを指し、これに、ｉｎ ｖｉｖｏで転写されたＲＮＡを鋳型として作った標識ｃＤＮＡをハイブリダイズさせると、ＲＮＡに相補的なプローブからシグナルを検出できるため、未知遺伝子の塩基配列の解析・存在の推定、既知遺伝子との比較、各種遺伝子発現量の検出・比較、遺伝的多型の検出などに使用できる。また、タンパク質又はポリペプチドの生産量の測定方法としては、分光光度計を用いた光学的方法、酵素活性を指標にした生化学的方法、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティングなどの免疫学的方法などが挙げられる。
【００２５】
例えば、上記培養後半抑制型プロモーターを選抜する際、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量の測定をタイリングアレイにより行い、またその選抜基準を、対数増殖期において全遺伝子の平均値以上の発現量を示し、かつ、定常期において全遺伝子の平均値の半分以下の発現量を示すこと、としてもよい。ここで、全遺伝子とは、Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文（ＤＮＡ Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８）のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄａｔａに列挙されている全ての遺伝子のことを指し、また当該全遺伝子の発現量の平均値とは、当該全遺伝子の発現量の相加平均値のことを指す。
【００２６】
このようにして選抜された異種プロモーターとしては、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターが挙げられ、このうち、好適には、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである。これら遺伝子又はこれら遺伝子を含むオペロンのプロモーター領域の推定は、枯草菌の転写制御因子に関するデーターベースＤＢＴＢＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８，３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３−Ｄ９６）にその塩基配列が記載されており、それらを固有のプロモーターとして利用できる。
【００２７】
なお、上記選抜基準を、枯草菌変異株に求められる性能や使用目的等に応じて適宜調整することも可能である。
【００２８】
本発明に係る枯草菌株（又は組換え枯草菌ともいう）の構築は、枯草菌の親株のｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター（ＰｒｏｃＧ）の下流に他のＤＮＡ断片を挿入し、更にその下流に、上記培養後半抑制型プロモーターを作動可能に連結される状態で挿入することにより行う。すなわち、上記他のＤＮＡ断片（以下「介在ＤＮＡ断片」と称する）の介在により、ＰｒｏｃＧとその下流のｒｏｃＧ遺伝子とが作動可能に連結された状態ではなくなり、更に、当該介在ＤＮＡ断片の下流に上記培養後半抑制型プロモーターを挿入して、当該培養後半抑制型プロモーターとｒｏｃＧ遺伝子とが作動可能に連結されることにより、ｒｏｃＧ遺伝子の発現が当該培養後半抑制型プロモーターの制御下に置かれることとなる。ここで、当該介在ＤＮＡ断片としては、ＰｒｏｃＧとその下流のｒｏｃＧ遺伝子との作動可能に連結された状態を解消するものであれば特に限定されないが、例えば他の遺伝子及びそれと作動可能に連結されたプロモーター、遺伝子の転写を終結させるターミネーター又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。上記ターミネーターとしては、そのステム・ループ構造のギブス自由エネルギーが高いターミネーターが好ましく、特に限定されないが、例えば機能未知遺伝子ｙｒｂＧのターミネーター（ＴｙｒｂＧ）等が挙げられる。その他、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １（３）：ｅ２５（２００５）にて枯草菌のターミネーターに関して推定され、またその結果がｗｅｂ上で公開されており（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｎｓａｉ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／〜ｍｄｅｈｏｏｎ／ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ／ＮＣ＿０００９６４．ｔｒｍｓ）、それらをターミネーターとして利用してもよい。
【００２９】
目的遺伝子を細胞内で発現させるためには、当該目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを宿主に導入して形質転換する必要がある。当該発現ベクターとしては、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。
【００３０】
本願発明に係る、ゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子欠失株が異種プロモーターに作動可能に連結されている枯草菌株は、ゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子欠失株がｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーターに作動可能に連結されている枯草菌株と比較し、前記目的遺伝子の発現量が大きい。好適には、前者の当該発現量は、後者の当該発現量と比較し２０〜２５％、より好適には２５〜３０％、より好適には３０〜３５％大きい。
【００３１】
具体的な一実施形態は、前記目的遺伝子が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝子である。ここで、ポリペプチドとは一般に、直鎖状に連結したアミノ酸の鎖であって、３０〜アミノ酸以下の長さの鎖のことを指し、一方タンパク質とは一般に、５０以上のアミノ酸からなる１つ以上のポリペプチド鎖のことを指すが、本願においてはこれらの用語は交換可能に用いられるものとする。
【００３２】
本発明に係るタンパク質又はポリペプチドは特に限定されず、洗浄剤用、食品用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、より好ましくはセルラーゼが挙げられる。
【００３３】
セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ（配列番号５）又はＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、あるいは、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。
【００３４】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、あるいは、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。
【００３５】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、バチルス クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３７６）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、あるいは、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００３６】
なお、本発明におけるアミノ酸配列及び塩基配列の相同性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）により算出される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発社製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００３７】
また、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、また、当該付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００３８】
上記の遺伝子発現方法を用いてタンパク質又はポリペプチドを製造する場合、上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には、配列番号６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号６９で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ若しくは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結していることが望ましい。ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。また、ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート液及び１００ｍｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブと共に６５℃で８〜１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００３９】
上記の遺伝子発現方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造は、上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を上記枯草菌株に導入して得られる菌株を、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってもよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から目的のタンパク質又はポリペプチドを、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い抽出・精製することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドを得ることができる。
【００４０】
本発明の方法によれば、下記の実施例に示すように、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株を宿主とした場合と比較し、目的遺伝子の発現、又は当該目的遺伝子がコードするタンパク質若しくはポリペプチドの生産性が有意に向上する。特に、本発明の遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法では、目的遺伝子発現の増加のための、ＩＰＴＧ添加などの遺伝子発現誘導を行う必要がないため、操作が簡便である。
【００４１】
以下の実施例において、本発明の枯草菌株の構築及び当該枯草菌を用いた目的タンパク質の製造方法について具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
［実施例］
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。
【００４３】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。
【００４４】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）としてインターネットで公開された枯草菌ゲノムデータ（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／２００４年３月１０日更新）に基づき記載する。
【００４５】
枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％ 硫酸アンモニウム、１．４０％ リン酸水素二カリウム、０．６０％ リン酸二水素カリウム、０．１０％ クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％ グルコース、０．０２％ カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．２５μＭ 塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬ トリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％ 硫酸アンモニウム、１．４０％ リン酸水素二カリウム、０．６０％ リン酸二水素カリウム、０．１０％ クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％ グルコース、０．０１％ カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．４０μＭ 塩化マンガン、５μｇ／ｍＬ トリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００４６】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、１．５％ 寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００４７】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））により行った。組換え微生物によるタンパク質生産用の培養として、ＬＢ培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ）、及び２×Ｌ−マルトース培地（２％ トリプトン、１％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、７．５％ マルトース、７．５ｐｐｍ 硫酸マンガン４〜５水和物）を用いた。
【００４８】
（実施例１：培養後半抑制型プロモーターの選抜）
Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文情報（ＤＮＡ Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８））に基づき、培養初期において発現し、かつ定常期に発現量が低下する遺伝子の選抜を行った。当該論文に記載されているデータは、プローブを高密度に用いたタイリングアレイを使用して得られたものであり、各遺伝子のシグナルは数十個のシグナルの平均値として検出されるため、従来判定不可能であった遺伝子間の発現量比較が可能である。そこで、タイリングアレイ解析のデータを基に、枯草菌ＭＧＢ８７４株（ＤＮＡ Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８））において、対数増殖期で発現し、かつ定常期において発現が抑制される遺伝子群の抽出を行った。対数増殖期（培養開始後１時間）において全遺伝子の平均値（５００）以上の発現量を示し、かつ、定常期（培養開始後２６時間、４０時間及び６０時間）において全遺伝子の平均値の半分（２５０）以下の発現量を示す遺伝子群を抽出した（表２）。
【００４９】
（表２：ＯＮ／ＯＦＦプロモーターの選抜）
【００５０】
【表２−１】
【００５１】
【表２−２】
【００５２】
実施例２では、これらの遺伝子のうちａｒｇＣ遺伝子、ｆａｂＨ２遺伝子及びｍｄｒ遺伝子を選択し（図１）、推定プロモーター領域ＰａｒｇＣ、ＰｆａｂＨ２、Ｐｍｄｒ（配列番号１〜３）を用いて、ｒｏｃＧの発現が培養後半において抑制される株の構築を行った。推定プロモーター領域は、枯草菌の転写制御因子に関するデーターベースＤＢＴＢＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８，３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３−Ｄ９６）記載の転写制御領域を含む塩基配列を用いた。図１にＭＧＢ８７４株のｒｏｃＧ発現パターンを示す。
【００５３】
（実施例２：菌株の構築）
ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター（ＰｒｏｃＧ）の下流にｙｒｂＧ遺伝子のターミネーターＴｙｒｂＧ（配列番号４）を挿入したＲ−１１０２株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ）、並びに、ＴｙｒｂＧの下流に遺伝子発現が培養後半で抑制されるプロモーターＰａｒｇＣ、ＰｆａｂＨ２及びＰｍｄｒをそれぞれ挿入した、Ｒ−１１７５株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ−ＰａｒｇＣ）、Ｒ−１１８６株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ−ＰｆａｂＨ２）及びＲ−１４５５株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ−Ｐｍｄｒ）を、以下の方法により構築した。
【００５４】
（プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧの構築）
ネオマイシン耐性遺伝子及びターミネーターＴｙｒｂＧが挿入されたプラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧを、表２に示すプライマーを用い、図２Ａに示す方法により構築した。ＴｙｒｂＧは、ＤＢＴＢＳ（ｈｔｔｐ：／／ｄｂｔｂｓ．ｈｇｃ．ｊｐ／）のデーターベース情報（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １：ｅ２５．（２００５））中の、枯草菌における推定ターミネーターのうち、ステム・ループのギブス自由エネルギーが最も高いターミネーターである（配列番号４）。最初に、枯草菌ゲノムを鋳型として、表２に示すプライマーＴｙｒｂＧ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びＴｙｒｂＧ−ｎｅｏｒ．ｒを用いて、ターミネーターＴｙｒｂＧ領域を合成した。更に、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ １５：９３−１０３．（１９８６））を鋳型として、プライマーＴｙｒｂＧ−ｎｅｏｒ．ｆ及びｎｅｏｒ．ｒ．ＳｐｈＩを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を増幅した。増幅した２断片にはオーバーラップする遺伝子領域が存在する。これらの遺伝子断片を鋳型として、プライマーＴｙｒｂＧ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びｎｅｏｒ．ｒ．ＳｐｈＩを用いて、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ ７７：６１−６６．（１９８９））により、ＴｙｒｂＧにネオマイシン耐性遺伝子が連結したＤＮＡ断片を合成した。この合成ＤＮＡ断片を、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びｌａｃＺを有するベクターｐＤＬ２（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６（Ｐｔ７）：１５７３−１５８３（２０００））のＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位に挿入し、目的のプラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧを構築した。
【００５５】
（表３：プラスミド及び変異株の構築に使用したプライマー）
【００５６】
【表３】
【００５７】
（プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒの構築）
ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒの推定プロモーター領域が挿入された、プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒの構築は、以下の手順で行った。最初に、表３に示すプライマー（ａｒｇＣ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びａｒｇＣ．ｒ．ＢａｍＨＩ、ｆａｂＨ２．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びｆａｂＨ２．ｒ．ＢａｍＨＩ、並びに、ｍｄｒ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びｍｄｒ．ｒ．ＢａｍＨＩ）を用いて、ＰＣＲにより枯草菌ゲノムからａｒｇＣ遺伝子、ｆａｂＨ２遺伝子及びｍｄｒ遺伝子の推定プロモーター領域を増幅した（配列番号１〜３）。その後、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位に挿入し、各プロモーター領域がＴｙｒｂＧ及びネオマイシン耐性遺伝子と連結されたプラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒを構築した。
【００５８】
（Ｒ−１１０２株、Ｒ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株の構築）
各変異株の構築は、図２Ｂに示す方法を参考に、形質転換用ＤＮＡ断片を合成し、枯草菌ＭＧＢ８７４株を形質転換することにより行った。なお、図２ＢはＲ−１１７５株の構築の際に用いた方法を示す。
【００５９】
形質転換用ＤＮＡ断片の合成は、以下の手順で行った。最初に、プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒを鋳型に、表２に示すプライマーｐｄｌｎｔ．ｆ及びｐｄｌｎｔ．ｒを用いて、ＰＣＲにより、ＴｙｒｂＧ、ネオマイシン及び必要に応じて培養後半抑制型プロモーター領域を含むＤＮＡ断片（断片Ｉ）を合成した。更に、枯草菌ゲノムを鋳型として、プライマーｒｏｃＧ．ｒ及びｒｏｃＧ−ｌｉｎｋｅｒ．ｆを用いて、遺伝子挿入部位の上流領域（断片ＩＩ）を増幅し、プライマーｒｏｃＧ−ｌｉｎｋｅｒ．ｒ及びｒｏｃＧ．ｆを用いて、遺伝子挿入部位の下流領域（断片ＩＩＩ）を増幅した。挿入部位の上流及び下流のＤＮＡ断片（断片ＩＩ及びＩＩＩ）と断片Ｉは、オーバーラップする遺伝子領域を有する。これらのＤＮＡ断片（断片Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）を鋳型として、プライマーｒｏｃＧ．ｆ及びｒｏｃＧ．ｒを用いて、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））を行い、ネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーターＴｙｒｂＧ及び必要に応じて培養後半抑制型プロモーター領域を有する遺伝子領域をｒｏｃＧの固有のプロモーター領域の下流に挿入するためのＤＮＡ断片（断片ＩＶ）を合成した。
【００６０】
このＤＮＡ断片ＩＶを用い、コンピテントセル法によりＭＧＢ８７４株の形質転換を行い、ネオマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に、当該形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子及びターミネーターＴｙｒｂＧが挿入された株（Ｒ−１１０２株）、並びに、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーターＴｙｒｂＧ及び各推定プロモーター領域が挿入された株（Ｒ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株）が構築されていることを確認した。
【００６１】
（実施例３：各変異株のタンパク質生産性評価）
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼの生産性を指標として、実施例２にて得られた各変異株のタンパク質生産性評価を行った。
【００６２】
（アルカリセルラーゼＳ２３７発現ベクターの構築）
アルカリセルラーゼの生産性評価を行うため、最初に、枯草菌での大量発現に必要な発現ベクターの構築を行った。具体的には、バチルス属細菌 ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号６の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表４に示すＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆプライマー及びＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒプライマーのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素部位に挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築した。
【００６３】
（表４：セルラーゼ遺伝子の導入に使用したプライマー）
【表４】
【００６４】
（ＭＧＢ８７４株及び構築した変異株のアルカリセルラーゼ生産性評価）
プロトプラスト形質転換法を用いて、親株であるＭＧＢ８７４株及び実施例２で得られたＲ−１１０２株、Ｒ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株に、プラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を導入した。１５ｐｐｍ テトラサイクリンを含むＬＢ培地に得られた菌株を植菌し、３０℃で１５時間振盪培養した。更にこの培養液０．６ｍＬを、３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％ トリプトン、１％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム、７．５％ マルトース、７．５ｐｐｍ 硫酸マンガン４〜５水和物、１５ｐｐｍ テトラサイクリン）に接種し、３０℃で４日間振盪培養した。なお、培養において、ＩＰＴＧの添加等の、遺伝子発現を誘導するための特別な操作を行わなかった。測定誤差を考慮し、各々３回ずつ培養を行った。菌体の生育度は、分光光度計ＤＵ６５０（ベックマンコールター社製）を用いて、培養液濁度（ＯＤ６００）により測定した。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を算出した。セルラーゼ活性測定は、１／７．５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４ 和光純薬工業社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ添加して混合し、３０℃にて反応させた際に遊離するｐ−ニトロフェノールの量を、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量することにより行った。セルラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして定義した。培養結果を図３に示す。
【００６５】
親株であるＭＧＢ８７４株と比較し、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーターの下流にターミネーターＴｙｒｂＧを挿入した株（Ｒ−１１０２株）では、細胞増殖は増加するが、セルラーゼ生産量は減少することが判明した（図３）。一方、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーターＴｙｒｂＧ及び培養後半抑制型プロモーター領域（ａｒｇＣ遺伝子、ｆａｂＨ２遺伝子及びｍｄｒ遺伝子のプロモーターのいずれか）が挿入されたＲ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株では、親株であるＭＧＢ８７４株と比較し、細胞増殖は減少するにもかかわらず、セルラーゼ生産量は増加することが判明した。すなわち、セルラーゼ生産量は、ＭＧＢ８７４株の培養終了時の生産量を１００％とした場合に、Ｒ−１１７５株では１２７％、Ｒ−１１８６株では１３５％、Ｒ−１４５５株では１２６％と、良好な生産性を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物を用いた有用物質の工業的生産における一つの重要課題として、当該有用物質の生産性向上が挙げられる。従来、当該課題を解決するため、突然変異等の遺伝学的手法による高生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いた、より効率的な高生産菌の育種が行われている。更に、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受け、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用する試みもなされている。
【０００３】
近年、枯草菌ゲノムに存在する約４１００種類の遺伝子の破壊株が網羅的に研究され、２７１個の遺伝子が成育に必須であることが報告されている（非特許文献１）。また、枯草菌等の細菌の胞子形成初期に機能する遺伝子やプロテアーゼ遺伝子、又は細胞壁若しくは細胞膜中のテイコ酸へのＤ−アラニン付加に関与する遺伝子、更にはサーファクチンの生合成若しくは分泌に関与する遺伝子が単独に欠失又は不活性化された菌株が作製されている（特許文献１〜８参照）。
【０００４】
また、本出願人は、枯草菌の遺伝子破壊株を網羅的に解析し、枯草菌ゲノムの大領域を欠失させ、各種酵素の生産性に優れた変異株の創出に成功している（特許文献９）。
【０００５】
ＲｏｃＧタンパク質は、アルギニン分解経路の最下流において、グルタミン酸をアンモニアと２−オキソグルタル酸に分解する異化性のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を触媒する機能、並びにグルタミン酸合成酵素ＧｌｔＡＢの発現を抑制する機能を有し（非特許文献２）、ＴＣＡ回路及びグルタミン酸合成経路を複雑に制御する重要なタンパク質であることが報告されている。
【０００６】
更に最近、本発明者らは、タンパク質やポリペプチドの生産性向上にとりｒｏｃＧ遺伝子の適度な発現が重要であることを見出している。すなわち、ＩＰＴＧの添加量によるｒｏｃＧ遺伝子発現制御が可能な枯草菌変異株（ＭＧＢ８７４変異株）を作製し、組み換えタンパク質の生産性を解析した結果、ある特定の範囲のＩＰＴＧ濃度においてＭＧＢ８７４親株よりも高い組み換えタンパク質の生産性を示すことを報告している（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭５８−１９０３９０号公報
【特許文献２】特開昭６１−１３８１号公報
【特許文献３】国際公開第８９／０４８６６号パンフレット
【特許文献４】特表平１１−５０９０９６号公報
【特許文献５】特許第３２１０３１５号公報
【特許文献６】特表２００１−５２７４０１号公報
【特許文献７】特表２００２−５２００１７号公報
【特許文献８】特表２００１−５０３６４１号公報
【特許文献９】特開２００７−１３００１３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００，４６７８−４６８３，２００３
【非特許文献２】Ｂ．Ｒ．Ｂｅｌｉｔｓｋｙら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９，１０３５（Ｆｅｂ，１９９７）
【非特許文献３】日本農芸化学会２００９年度大会 発表要旨
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規な遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌の提供に関し、特に、従来技術と比較し更に効率的かつ簡便な遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法、並びにそれらの方法に用いられる組換え枯草菌の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、鋭意研究の結果、宿主として枯草菌を使用し、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子の発現量が培養フェーズに応じて制御されうる組換え枯草菌を構築し、それを用いることにより、目的遺伝子の発現量を効率的に制御することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、以下の１）〜１２）に係るものである。
１） 枯草菌を宿主として用いる目的遺伝子の発現方法であって、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子を、対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御することを特徴とする前記発現方法。
２） 前記ｒｏｃＧ遺伝子の発現量が、当該ｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結された、培養フェーズにより遺伝子発現量を変化させる異種プロモーターにより制御される、前記１）に記載の方法。
３） 前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記２）に記載の方法。
４） 前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記２）に記載の方法。
５） 前記枯草菌が、枯草菌ＭＧＢ８７４株に由来する枯草菌変異株である、前記１）から４）のいずれか１つに記載の方法。
６） 前記目的遺伝子が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝子である、前記１）から５）のいずれか１つに記載の方法。
７） 前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、前記６）に記載の方法。
８） 前記６）に記載の方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
９） 前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、前記８）に記載の製造方法。
１０） 目的遺伝子を導入した枯草菌であって、ｒｏｃＧ遺伝子が作動可能に連結された異種プロモーターにより対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御されることを特徴とする組換え枯草菌。
１１） 前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記１０）に記載の組換え枯草菌。
１２） 前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、前記１０）に記載の組換え枯草菌。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、目的遺伝子を効率的かつ簡便に発現させることにより、例えば目的タンパク質又はポリペプチドの生産性向上が可能となり、有用タンパク質、特にセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の工業的生産の実現が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】時間経過（横軸）に伴うｒｏｃＧ、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒの発現（転写）量の変化を示す、ＭＧＢ８７４株のタイリングアレイ解析結果。
【図２】（Ａ）ｐＤＬＮＴｙｒｂＧの構築方法を模式的に示す図。（Ｂ）ＳＯＥ−ＰＣＲによる遺伝子欠失用ＤＮＡ断片の調製方法を模式的に示す図。
【図３】変異株の細胞増殖を示すグラフ（折れ線グラフ）、及びセルラーゼ生産量を示すグラフ（棒グラフ）。左縦軸は枯草菌の増殖を示し、右縦軸はセルラーゼ生産量（相対値）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の目的遺伝子の発現方法は、宿主として枯草菌を用い、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子を、対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御するものである。
【００１５】
枯草菌とは、好気性のグラム陽性桿菌で、芽胞を形成する真正細菌の一種である。本発明において宿主として用いられる枯草菌は、野生株でも変異株でもよいが、例えば枯草菌ＭＧＢ８７４株に由来する枯草菌変異株を用いるのが好ましい。枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株とは、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）を野生株とし、そのゲノムの大領域、すなわちｐｒｏｐｈａｇｅ６（ｙｏａＶ−ｙｏｂＯ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ１（ｙｂｂＵ−ｙｂｄＥ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ４（ｙｊｃＭ−ｙｊｄＪ）領域、ＰＢＳＸ（ｙｋｄＡ−ｘｌｙＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ５（ｙｎｘＢ−ｄｕｔ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ３（ｙｄｉＭ−ｙｄｊＣ）領域、ｓｐｂ（ｙｏｄＵ−ｙｐｑＰ）領域、ｐｋｓ（ｐｋｓＡ−ｙｍａＣ）領域、ｓｋｉｎ（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｓｐｏＩＩＩＣ）領域、ｐｐｓ（ｐｐｓＥ−ｐｐｓＡ）領域、ｐｒｏｐｈａｇｅ２（ｙｄｃＬ−ｙｄｅＪ）領域、ｙｄｃＬ−ｙｄｅＫ−ｙｄｈＵ領域、ｙｉｓＢ−ｙｉｔＤ領域、ｙｕｎＡ−ｙｕｒＴ領域、ｃｇｅＥ−ｙｐｍＱ領域、ｙｅｅＫ−ｙｅｓＸ領域、ｐｄｐ−ｒｏｃＲ領域、ｙｃｘＢ−ｓｉｐＵ領域、ＳＫＩＮ−Ｐｒｏ７（ｓｐｏＩＶＣＢ−ｙｒａＫ）領域、ｓｂｏ−ｙｗｈＨ領域、ｙｙｂＰ−ｙｙａＪ領域及びｙｎｃＭ−ｆｏｓＢ領域を欠失させて構築した株である（前記特許文献９）。下表に当該欠失領域を示すが、当該欠失領域は、言い換えると、同表に示す一対のオリゴヌクレオチドセットにより挟み込まれる領域である。
【表１】
【００１６】
本願発明における目的遺伝子とは、上記宿主細胞内で当該遺伝子によりコードされるタンパク質を発現させようとする遺伝子を指し、上記宿主細胞に元来存在する遺伝子あってもよく、あるいは上記宿主細胞に元来存在しない外来の遺伝子であってもよい。
【００１７】
遺伝子の発現とは、広義には、遺伝情報が細胞内において何らかの構造及び機能に変換される過程をいうが、具体的には、目的遺伝子に基づいてタンパク質が合成されるか、又はｍＲＮＡが合成されることを指す。本発明における具体例としては、細胞内において、目的遺伝子がその配列に基づきｍＲＮＡに転写されること、又はその転写産物の配列に基づきタンパク質又はポリペプチドに翻訳されることが挙げられる。したがって、本発明の一態様には、後述するような、上記の遺伝子発現方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法が包含される。
【００１８】
ｒｏｃＧ遺伝子とは、ＲｏｃＧタンパク質をコードするＤＮＡ配列のことを指す。ＲｏｃＧタンパク質とは、アルギニン分解経路の最下流において機能し、グルタミン酸をアンモニアと２−オキソグルタル酸に分解する異化性グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性を有する他、転写因子ＧｌｔＣと相互作用することでグルタミン酸合成酵素ＧｌｔＡＢの発現を抑制する機能を有するタンパク質のことを指し（前記非特許文献２）、細胞内の主要な代謝経路であるＴＣＡ回路及びグルタミン酸合成経路を複雑に制御する重要なタンパクである。
【００１９】
本発明においては、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量が、培養中に特別な操作を行わなくても対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御される。ここで、対数増殖期とは、枯草菌細胞の生育曲線において、細胞数が対数的に増加する時期のことを指す。一方、定常期とは、対数増殖期が過ぎ、細胞の分裂・増殖が停止し、細胞数の増加が見られなくなる時期のことを指す。
【００２０】
具体的には、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量を、当該ｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結された、培養フェーズにより遺伝子発現量を変化させる異種プロモーターにより制御すればよい。ここで、異種プロモーターとは、下記で説明される固有のプロモーター以外の、当該遺伝子と作動可能に連結されているプロモーターであり、本発明においては、遺伝子操作方法により人為的に導入される。ここで、作動可能に連結されている（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）とは、制御配列が機能してコード配列によりコードされたタンパク質の発現が制御されうる位置関係で、当該制御配列と当該コード配列とが配置していることを指す。具体例としては、プロモーターとそれに隣接する遺伝子とが、当該プロモーターの方向に沿って、当該遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。特に本願においては、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター以外の異種プロモーターとｒｏｃＧ遺伝子とが、当該異種プロモーターの制御下で当該ｒｏｃＧ遺伝子が発現しうる状態で配置していることを指す。なお、本発明における一般的な遺伝子操作方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第３版）等に記載の公知の方法に従い実施される。
【００２１】
一方、固有のプロモーターとは、下記の異種プロモーターに相対する意味で用いられる用語であり、下記の方法で遺伝子操作されていない宿主のゲノムに存在する遺伝子が元来、その制御下において発現するプロモーターのことを指し、言い換えると、元来、当該遺伝子と作動可能に連結されているプロモーターのことである。
【００２２】
上記のｒｏｃＧ遺伝子の発現量の制御を実施するための具体的な手段としては、前記異種プロモーターとして、そのプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子を、対数増殖期において発現させ、かつ、定常期において発現を抑制するプロモーター（以下「培養後半抑制型プロモーター」と称する）を採用し、それをゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結することが挙げられる。
【００２３】
培養後半抑制型プロモーターは、例えば、上記Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文に記載の方法に基づき、枯草菌において、培養初期において発現し、かつ定常期に発現量が低下する遺伝子を選抜することにより選抜できる。具体的には、対数増殖期（例えば培養開始後１〜５時間）においてある一定値以上の発現量を示し、かつ、定常期（例えば培養開始後２０〜６０時間）においてある一定値以下の発現量を示す遺伝子群が選抜される。
【００２４】
なお、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量は、遺伝子からのｍＲＮＡへの転写量や、ｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質又はポリペプチドの生産量を測定することで把握できる。ｍＲＮＡの転写量の測定方法としては、ノーザンブロット法、リボヌクレアーゼ活性保護法又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ法等が挙げられる。あるいは、タイリングアレイ法（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ社）を用いてもよい。タイリングアレイ法とは、解読済みのゲノムデータから等間隔に抜き出した塩基配列を検出用プローブとしてタイル状に並べたＤＮＡチップ（タイリングアレイ）を用いた遺伝子発現解析方法のことを指し、これに、ｉｎ ｖｉｖｏで転写されたＲＮＡを鋳型として作った標識ｃＤＮＡをハイブリダイズさせると、ＲＮＡに相補的なプローブからシグナルを検出できるため、未知遺伝子の塩基配列の解析・存在の推定、既知遺伝子との比較、各種遺伝子発現量の検出・比較、遺伝的多型の検出などに使用できる。また、タンパク質又はポリペプチドの生産量の測定方法としては、分光光度計を用いた光学的方法、酵素活性を指標にした生化学的方法、ＥＬＩＳＡやウェスタンブロッティングなどの免疫学的方法などが挙げられる。
【００２５】
例えば、上記培養後半抑制型プロモーターを選抜する際、ｒｏｃＧ遺伝子の発現量の測定をタイリングアレイにより行い、またその選抜基準を、対数増殖期において全遺伝子の平均値以上の発現量を示し、かつ、定常期において全遺伝子の平均値の半分以下の発現量を示すこと、としてもよい。ここで、全遺伝子とは、Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文（ＤＮＡ Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８）のＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄａｔａに列挙されている全ての遺伝子のことを指し、また当該全遺伝子の発現量の平均値とは、当該全遺伝子の発現量の相加平均値のことを指す。
【００２６】
このようにして選抜された異種プロモーターとしては、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターが挙げられ、このうち、好適には、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである。これら遺伝子又はこれら遺伝子を含むオペロンのプロモーター領域の推定は、枯草菌の転写制御因子に関するデーターベースＤＢＴＢＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８，３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３−Ｄ９６）にその塩基配列が記載されており、それらを固有のプロモーターとして利用できる。
【００２７】
なお、上記選抜基準を、枯草菌変異株に求められる性能や使用目的等に応じて適宜調整することも可能である。
【００２８】
本発明に係る枯草菌株（又は組換え枯草菌ともいう）の構築は、枯草菌の親株のｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター（ＰｒｏｃＧ）の下流に他のＤＮＡ断片を挿入し、更にその下流に、上記培養後半抑制型プロモーターを作動可能に連結される状態で挿入することにより行う。すなわち、上記他のＤＮＡ断片（以下「介在ＤＮＡ断片」と称する）の介在により、ＰｒｏｃＧとその下流のｒｏｃＧ遺伝子とが作動可能に連結された状態ではなくなり、更に、当該介在ＤＮＡ断片の下流に上記培養後半抑制型プロモーターを挿入して、当該培養後半抑制型プロモーターとｒｏｃＧ遺伝子とが作動可能に連結されることにより、ｒｏｃＧ遺伝子の発現が当該培養後半抑制型プロモーターの制御下に置かれることとなる。ここで、当該介在ＤＮＡ断片としては、ＰｒｏｃＧとその下流のｒｏｃＧ遺伝子との作動可能に連結された状態を解消するものであれば特に限定されないが、例えば他の遺伝子及びそれと作動可能に連結されたプロモーター、遺伝子の転写を終結させるターミネーター又はそれらの組み合わせ等が挙げられる。上記ターミネーターとしては、そのステム・ループ構造のギブス自由エネルギーが高いターミネーターが好ましく、特に限定されないが、例えば機能未知遺伝子ｙｒｂＧのターミネーター（ＴｙｒｂＧ）等が挙げられる。その他、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １（３）：ｅ２５（２００５）にて枯草菌のターミネーターに関して推定され、またその結果がｗｅｂ上で公開されており（ｈｔｔｐ：／／ｂｏｎｓａｉ．ｉｍｓ．ｕ−ｔｏｋｙｏ．ａｃ．ｊｐ／〜ｍｄｅｈｏｏｎ／ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ／ＮＣ＿０００９６４．ｔｒｍｓ）、それらをターミネーターとして利用してもよい。
【００２９】
目的遺伝子を細胞内で発現させるためには、当該目的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、適切なベクターに挿入した発現プラスミドを構築し、当該発現プラスミドを宿主に導入して形質転換する必要がある。当該発現ベクターとしては、枯草菌体内で自立複製可能なベクターが好適であり、例えばシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ等が挙げられるが、特に限定されない。
【００３０】
本願発明に係る、ゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子欠失株が異種プロモーターに作動可能に連結されている枯草菌株は、ゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子欠失株がｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーターに作動可能に連結されている枯草菌株と比較し、前記目的遺伝子の発現量が大きい。好適には、前者の当該発現量は、後者の当該発現量と比較し２０〜２５％、より好適には２５〜３０％、より好適には３０〜３５％大きい。
【００３１】
具体的な一実施形態は、前記目的遺伝子が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝子である。ここで、ポリペプチドとは一般に、直鎖状に連結したアミノ酸の鎖であって、３０〜アミノ酸以下の長さの鎖のことを指し、一方タンパク質とは一般に、５０以上のアミノ酸からなる１つ以上のポリペプチド鎖のことを指すが、本願においてはこれらの用語は交換可能に用いられるものとする。
【００３２】
本発明に係るタンパク質又はポリペプチドは特に限定されず、洗浄剤用、食品用、繊維処理用、飼料処理用、化粧品用、医薬品用、診断薬用など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれる。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素（オキシドレダクターゼ）、転移酵素（トランスフェラーゼ）、加水分解酵素（ヒドロラーゼ）、脱離酵素（リアーゼ）、異性化酵素（イソメラーゼ）、合成酵素（リガーゼ／シンセターゼ）等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられ、より好ましくはセルラーゼが挙げられる。
【００３３】
セルラーゼとしては、例えば、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。より具体的な例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼ（配列番号５）又はＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のアルカリセルラーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼ、あるいは、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼが挙げられる。
【００３４】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属細菌ＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼ、あるいは、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリアミラーゼが挙げられる。
【００３５】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にＢａｃｉｌｌｕｓ属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、バチルス クラウジ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｌａｕｓｉｉ）ＫＳＭ−Ｋ１６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−３３７６）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、あるいは、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼが挙げられる。
【００３６】
なお、本発明におけるアミノ酸配列及び塩基配列の相同性は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）により算出される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発社製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００３７】
また、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列としては、１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が好ましく、また、当該付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
【００３８】
上記の遺伝子発現方法を用いてタンパク質又はポリペプチドを製造する場合、上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子の上流に、当該遺伝子の転写、翻訳、分泌を制御する制御領域を、適切な形で結合させるのが望ましい。かかる制御領域としては、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域などが挙げられる。特に転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始制御領域及び翻訳開始制御領域が当該セルラーゼ遺伝子の開始コドンから始まる長さ０．６〜１ｋｂの上流領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開２０００−２１００８１号公報や特開平４−１９０７９３号公報等に記載されているバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、すなわちＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には、配列番号６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６５９の塩基配列、配列番号６９で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号１〜６９６の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、又は上記いずれかの塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を有するＤＮＡ若しくは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結していることが望ましい。ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているＤＮＡ断片を意味する。また、ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）］に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート液及び１００ｍｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡを含む溶液中で、プローブと共に６５℃で８〜１６時間インキュベートし、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００３９】
上記の遺伝子発現方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造は、上記目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子を上記枯草菌株に導入して得られる菌株を、例えば同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種して培養して行うことができる。培養方法は、原則的には一般的な微生物の培養方法であってもよく、通常、液体培養による振盪培養、通気撹拌培養等の好気的条件下で実施するのが好ましい。培養終了後、培養液を遠心分離し、得られる上清又は菌体から目的のタンパク質又はポリペプチドを、硫安沈殿やクロマトグラフィなどを適宜組み合わせ、常法に従い抽出・精製することにより、目的のタンパク質又はポリペプチドを得ることができる。
【００４０】
本発明の方法によれば、下記の実施例に示すように、枯草菌変異株ＭＧＢ８７４株を宿主とした場合と比較し、目的遺伝子の発現、又は当該目的遺伝子がコードするタンパク質若しくはポリペプチドの生産性が有意に向上する。特に、本発明の遺伝子発現方法及びそれを用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法では、目的遺伝子発現の増加のための、ＩＰＴＧ添加などの遺伝子発現誘導を行う必要がないため、操作が簡便である。
【００４１】
以下の実施例において、本発明の枯草菌株の構築及び当該枯草菌を用いた目的タンパク質の製造方法について具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００４２】
［実施例］
以下の実施例におけるＤＮＡ断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）と付属の試薬類を用いた、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（アプライドバイオシステムズ社製）によるＤＮＡ増幅により行った。ＰＣＲ反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センス及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ添加し、更に総反応液量を５０μＬとすることにより調製した。ＰＣＲ反応条件は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は１ｋｂあたり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応、とした。
【００４３】
また、以下の実施例において、遺伝子の上流及び下流とは、複製開始点からの位置を指すのではなく、上流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の開始コドンの５’側に続く領域を指し、一方下流とは各操作・工程において対象となる遺伝子の終止コドンの３’側に続く領域を指すものとする。
【００４４】
更に、以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Ｎａｔｕｒｅ，３９０，２４９−２５６，（１９９７）で報告され、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）としてインターネットで公開された枯草菌ゲノムデータ（ｈｔｔｐ：／／ｂａｃｉｌｌｕｓ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／２００４年３月１０日更新）に基づき記載する。
【００４５】
枯草菌の形質転換は、コンピテントセル法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．９３，１９２５（１９６７））により行った。すなわち、枯草菌株をＳＰＩ培地（０．２０％ 硫酸アンモニウム、１．４０％ リン酸水素二カリウム、０．６０％ リン酸二水素カリウム、０．１０％ クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％ グルコース、０．０２％ カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．２５μＭ 塩化マンガン、５０μｇ／ｍＬ トリプトファン）中で、３７℃で、生育度（ＯＤ６００）の値が約１となるまで振盪培養し、振盪培養後、培養液の一部を９倍量のＳＰＩＩ培地（０．２０％ 硫酸アンモニウム、１．４０％ リン酸水素二カリウム、０．６０％ リン酸二水素カリウム、０．１０％ クエン酸三ナトリウム二水和物、０．５０％ グルコース、０．０１％ カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）、５ｍＭ 硫酸マグネシウム、０．４０μＭ 塩化マンガン、５μｇ／ｍＬ トリプトファン）に接種し、更に生育度（ＯＤ６００）の値が約０．４となるまで振盪培養することにより、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。
【００４６】
次いで調製したコンピテントセル懸濁液（ＳＰＩＩ培地における培養液）１００μＬに、各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）を５μＬ添加し、３７℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、１．５％ 寒天）に全量を塗沫した。３７℃での静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、目的とするゲノム構造の改変がなされたことを確認した。
【００４７】
目的のタンパク質を発現するプラスミドの宿主微生物への導入は、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６８，１１１（１９７９））により行った。組換え微生物によるタンパク質生産用の培養として、ＬＢ培地（１％ トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ）、及び２×Ｌ−マルトース培地（２％ トリプトン、１％ 酵母エキス、１％ ＮａＣｌ、７．５％ マルトース、７．５ｐｐｍ 硫酸マンガン４〜５水和物）を用いた。
【００４８】
（実施例１：培養後半抑制型プロモーターの選抜）
Ｍｏｒｉｍｏｔｏらの論文情報（ＤＮＡ Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８））に基づき、培養初期において発現し、かつ定常期に発現量が低下する遺伝子の選抜を行った。当該論文に記載されているデータは、プローブを高密度に用いたタイリングアレイを使用して得られたものであり、各遺伝子のシグナルは数十個のシグナルの平均値として検出されるため、従来判定不可能であった遺伝子間の発現量比較が可能である。そこで、タイリングアレイ解析のデータを基に、枯草菌ＭＧＢ８７４株（ＤＮＡ Ｒｅｓ１５：７３−８１（２００８））において、対数増殖期で発現し、かつ定常期において発現が抑制される遺伝子群の抽出を行った。対数増殖期（培養開始後１時間）において全遺伝子の平均値（５００）以上の発現量を示し、かつ、定常期（培養開始後２６時間、４０時間及び６０時間）において全遺伝子の平均値の半分（２５０）以下の発現量を示す遺伝子群を抽出した（表２）。
【００４９】
（表２：ＯＮ／ＯＦＦプロモーターの選抜）
【００５０】
【表２−１】
【００５１】
【表２−２】
【００５２】
実施例２では、これらの遺伝子のうちａｒｇＣ遺伝子、ｆａｂＨ２遺伝子及びｍｄｒ遺伝子を選択し（図１）、推定プロモーター領域ＰａｒｇＣ、ＰｆａｂＨ２、Ｐｍｄｒ（配列番号１〜３）を用いて、ｒｏｃＧの発現が培養後半において抑制される株の構築を行った。推定プロモーター領域は、枯草菌の転写制御因子に関するデーターベースＤＢＴＢＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８，３６（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ９３−Ｄ９６）記載の転写制御領域を含む塩基配列を用いた。図１にＭＧＢ８７４株のｒｏｃＧ発現パターンを示す。
【００５３】
（実施例２：菌株の構築）
ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター（ＰｒｏｃＧ）の下流にｙｒｂＧ遺伝子のターミネーターＴｙｒｂＧ（配列番号４）を挿入したＲ−１１０２株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ）、並びに、ＴｙｒｂＧの下流に遺伝子発現が培養後半で抑制されるプロモーターＰａｒｇＣ、ＰｆａｂＨ２及びＰｍｄｒをそれぞれ挿入した、Ｒ−１１７５株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ−ＰａｒｇＣ）、Ｒ−１１８６株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ−ＰｆａｂＨ２）及びＲ−１４５５株（ＭＧＢ８７４ ΔＰｒｏｃＧ：：ＴｙｒｂＧ−ｎｅｏ−Ｐｍｄｒ）を、以下の方法により構築した。
【００５４】
（プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧの構築）
ネオマイシン耐性遺伝子及びターミネーターＴｙｒｂＧが挿入されたプラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧを、表２に示すプライマーを用い、図２Ａに示す方法により構築した。ＴｙｒｂＧは、ＤＢＴＢＳ（ｈｔｔｐ：／／ｄｂｔｂｓ．ｈｇｃ．ｊｐ／）のデーターベース情報（ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １：ｅ２５．（２００５））中の、枯草菌における推定ターミネーターのうち、ステム・ループのギブス自由エネルギーが最も高いターミネーターである（配列番号４）。最初に、枯草菌ゲノムを鋳型として、表２に示すプライマーＴｙｒｂＧ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びＴｙｒｂＧ−ｎｅｏｒ．ｒを用いて、ターミネーターＴｙｒｂＧ領域を合成した。更に、ネオマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドｐＵＢ１１０（Ｐｌａｓｍｉｄ １５：９３−１０３．（１９８６））を鋳型として、プライマーＴｙｒｂＧ−ｎｅｏｒ．ｆ及びｎｅｏｒ．ｒ．ＳｐｈＩを用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を増幅した。増幅した２断片にはオーバーラップする遺伝子領域が存在する。これらの遺伝子断片を鋳型として、プライマーＴｙｒｂＧ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びｎｅｏｒ．ｒ．ＳｐｈＩを用いて、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ ７７：６１−６６．（１９８９））により、ＴｙｒｂＧにネオマイシン耐性遺伝子が連結したＤＮＡ断片を合成した。この合成ＤＮＡ断片を、クロラムフェニコール耐性遺伝子及びｌａｃＺを有するベクターｐＤＬ２（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４６（Ｐｔ７）：１５７３−１５８３（２０００））のＥｃｏＲＩ及びＳｐｈＩ部位に挿入し、目的のプラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧを構築した。
【００５５】
（表３：プラスミド及び変異株の構築に使用したプライマー）
【００５６】
【表３】
【００５７】
（プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒの構築）
ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒの推定プロモーター領域が挿入された、プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒの構築は、以下の手順で行った。最初に、表３に示すプライマー（ａｒｇＣ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びａｒｇＣ．ｒ．ＢａｍＨＩ、ｆａｂＨ２．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びｆａｂＨ２．ｒ．ＢａｍＨＩ、並びに、ｍｄｒ．ｆ．ＥｃｏＲＩ及びｍｄｒ．ｒ．ＢａｍＨＩ）を用いて、ＰＣＲにより枯草菌ゲノムからａｒｇＣ遺伝子、ｆａｂＨ２遺伝子及びｍｄｒ遺伝子の推定プロモーター領域を増幅した（配列番号１〜３）。その後、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ部位に挿入し、各プロモーター領域がＴｙｒｂＧ及びネオマイシン耐性遺伝子と連結されたプラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒを構築した。
【００５８】
（Ｒ−１１０２株、Ｒ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株の構築）
各変異株の構築は、図２Ｂに示す方法を参考に、形質転換用ＤＮＡ断片を合成し、枯草菌ＭＧＢ８７４株を形質転換することにより行った。なお、図２ＢはＲ−１１７５株の構築の際に用いた方法を示す。
【００５９】
形質転換用ＤＮＡ断片の合成は、以下の手順で行った。最初に、プラスミドｐＤＬＮＴｙｒｂＧ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ａｒｇＣ、ｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｆａｂＨ２及びｐＤＬＮＴｙｒｂＧ−ｍｄｒを鋳型に、表２に示すプライマーｐｄｌｎｔ．ｆ及びｐｄｌｎｔ．ｒを用いて、ＰＣＲにより、ＴｙｒｂＧ、ネオマイシン及び必要に応じて培養後半抑制型プロモーター領域を含むＤＮＡ断片（断片Ｉ）を合成した。更に、枯草菌ゲノムを鋳型として、プライマーｒｏｃＧ．ｒ及びｒｏｃＧ−ｌｉｎｋｅｒ．ｆを用いて、遺伝子挿入部位の上流領域（断片ＩＩ）を増幅し、プライマーｒｏｃＧ−ｌｉｎｋｅｒ．ｒ及びｒｏｃＧ．ｆを用いて、遺伝子挿入部位の下流領域（断片ＩＩＩ）を増幅した。挿入部位の上流及び下流のＤＮＡ断片（断片ＩＩ及びＩＩＩ）と断片Ｉは、オーバーラップする遺伝子領域を有する。これらのＤＮＡ断片（断片Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ）を鋳型として、プライマーｒｏｃＧ．ｆ及びｒｏｃＧ．ｒを用いて、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，７７，６１，（１９８９））を行い、ネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーターＴｙｒｂＧ及び必要に応じて培養後半抑制型プロモーター領域を有する遺伝子領域をｒｏｃＧの固有のプロモーター領域の下流に挿入するためのＤＮＡ断片（断片ＩＶ）を合成した。
【００６０】
このＤＮＡ断片ＩＶを用い、コンピテントセル法によりＭＧＢ８７４株の形質転換を行い、ネオマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地上で生育したコロニーを形質転換体として分離した。更に、当該形質転換体からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲを行い、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子及びターミネーターＴｙｒｂＧが挿入された株（Ｒ−１１０２株）、並びに、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーターＴｙｒｂＧ及び各推定プロモーター領域が挿入された株（Ｒ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株）が構築されていることを確認した。
【００６１】
（実施例３：各変異株のタンパク質生産性評価）
配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるアルカリセルラーゼの生産性を指標として、実施例２にて得られた各変異株のタンパク質生産性評価を行った。
【００６２】
（アルカリセルラーゼＳ２３７発現ベクターの構築）
アルカリセルラーゼの生産性評価を行うため、最初に、枯草菌での大量発現に必要な発現ベクターの構築を行った。具体的には、バチルス属細菌 ＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のＳ２３７セルラーゼ遺伝子（特開２０００−２１００８１号公報参照）をコードするＤＮＡ断片（３．１ｋｂ；配列番号６の塩基番号１３〜３１２４）を鋳型として、表４に示すＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｆプライマー及びＥｇｌ−Ｓ２３７．Ｒプライマーのプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、増幅されたＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫのＢａｍＨＩ制限酵素部位に挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を構築した。
【００６３】
（表４：セルラーゼ遺伝子の導入に使用したプライマー）
【表４】
【００６４】
（ＭＧＢ８７４株及び構築した変異株のアルカリセルラーゼ生産性評価）
プロトプラスト形質転換法を用いて、親株であるＭＧＢ８７４株及び実施例２で得られたＲ−１１０２株、Ｒ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株に、プラスミドｐＨＹ−Ｓ２３７を導入した。１５ｐｐｍ テトラサイクリンを含むＬＢ培地に得られた菌株を植菌し、３０℃で１５時間振盪培養した。更にこの培養液０．６ｍＬを、３０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％ トリプトン、１％ 酵母エキス、１％ 塩化ナトリウム、７．５％ マルトース、７．５ｐｐｍ 硫酸マンガン４〜５水和物、１５ｐｐｍ テトラサイクリン）に接種し、３０℃で４日間振盪培養した。なお、培養において、ＩＰＴＧの添加等の、遺伝子発現を誘導するための特別な操作を行わなかった。測定誤差を考慮し、各々３回ずつ培養を行った。菌体の生育度は、分光光度計ＤＵ６５０（ベックマンコールター社製）を用いて、培養液濁度（ＯＤ６００）により測定した。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリセルラーゼ活性を測定し、菌体外に分泌生産されたアルカリセルラーゼの量を算出した。セルラーゼ活性測定は、１／７．５Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．４ 和光純薬工業社製）で適宜希釈したサンプル溶液５０μＬに０．４ｍＭ ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−セロトリオシド（生化学工業社製）を５０μＬ添加して混合し、３０℃にて反応させた際に遊離するｐ−ニトロフェノールの量を、４２０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ４２０ｎｍ）変化により定量することにより行った。セルラーゼ活性は、１分間に１μｍｏｌのｐ−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を１Ｕとして定義した。培養結果を図３に示す。
【００６５】
親株であるＭＧＢ８７４株と比較し、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーターの下流にターミネーターＴｙｒｂＧを挿入した株（Ｒ−１１０２株）では、細胞増殖は増加するが、セルラーゼ生産量は減少することが判明した（図３）。一方、ｒｏｃＧ遺伝子の固有のプロモーター領域の下流にネオマイシン耐性遺伝子、ターミネーターＴｙｒｂＧ及び培養後半抑制型プロモーター領域（ａｒｇＣ遺伝子、ｆａｂＨ２遺伝子及びｍｄｒ遺伝子のプロモーターのいずれか）が挿入されたＲ−１１７５株、Ｒ−１１８６株及びＲ−１４５５株では、親株であるＭＧＢ８７４株と比較し、細胞増殖は減少するにもかかわらず、セルラーゼ生産量は増加することが判明した。すなわち、セルラーゼ生産量は、ＭＧＢ８７４株の培養終了時の生産量を１００％とした場合に、Ｒ−１１７５株では１２７％、Ｒ−１１８６株では１３５％、Ｒ−１４５５株では１２６％と、良好な生産性を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌を宿主として用いる目的遺伝子の発現方法であって、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子を、対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御することを特徴とする前記発現方法。
【請求項２】
前記ｒｏｃＧ遺伝子の発現量が、当該ｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結された、培養フェーズにより遺伝子発現量を変化させる異種プロモーターにより制御される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記枯草菌が、枯草菌ＭＧＢ８７４株に由来する枯草菌変異株である、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記目的遺伝子が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝子である、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
目的遺伝子を導入した枯草菌であって、ｒｏｃＧ遺伝子が作動可能に連結された異種プロモーターにより対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御されることを特徴とする組換え枯草菌。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項１０記載の組換え枯草菌。
【請求項１２】
前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項１０記載の組換え枯草菌。
【請求項１】
枯草菌を宿主として用いる目的遺伝子の発現方法であって、当該枯草菌のゲノム中のｒｏｃＧ遺伝子を、対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御することを特徴とする前記発現方法。
【請求項２】
前記ｒｏｃＧ遺伝子の発現量が、当該ｒｏｃＧ遺伝子に作動可能に連結された、培養フェーズにより遺伝子発現量を変化させる異種プロモーターにより制御される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記枯草菌が、枯草菌ＭＧＢ８７４株に由来する枯草菌変異株である、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記目的遺伝子が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝子である、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
請求項６記載の方法を用いたタンパク質又はポリペプチドの製造方法。
【請求項９】
前記タンパク質又はポリペプチドが、セルラーゼである、請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
目的遺伝子を導入した枯草菌であって、ｒｏｃＧ遺伝子が作動可能に連結された異種プロモーターにより対数増殖期において発現し定常期において発現が抑制されるように制御されることを特徴とする組換え枯草菌。
【請求項１１】
前記異種プロモーターが、ｙｂｅＣ、ｐｕｒＴ、ｇａｍＡ、ｍｄｒ、ｈｘｌＡ、ｔｈｉＬ、ｙｅｂＡ、ｙｆｎＡ、ｙｆｊＮ、ｙｆｈＯ、ｙｈｄＨ、ｎｈａＣ、ｆａｂＨ２、ｙｉｔＹ、ｙｉｔＺ、ａｒｇＣ、ｍｏｂＡ、ａｌｓＴ、ｙｏｃＪ、ｙｏｃＲ、ｙｐｕＧ、ｍｌｅＮ、ｙｑｉＸ、ｙｒｒＬ、ａｒｇＧ、ｂｒａＢ、ｙｔｍＱ、ｙｕａＣ、ｙｕｂＥ、ｐａｔＢ、ｙｕｆＫ、ｍａｅＮ、ｙｕｘＨ、ｙｕｉＦ、ｄａｐＦ、ｙｕｔＫ、ｙｕｓＣ、ｙｖｒＤ、ｙｖｓＨ、ｓａｃＢ、ｔａｇＧ、ｙｗｐＢ、ｙｗｎＣ、ｙｗｊＧ及びｙｘｉＦから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項１０記載の組換え枯草菌。
【請求項１２】
前記異種プロモーターが、ａｒｇＣ、ｆａｂＨ２及びｍｄｒから選ばれる遺伝子の固有のプロモーターである、請求項１０記載の組換え枯草菌。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１２−１９７２１（Ｐ２０１２−１９７２１Ａ）
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１５９１５５（Ｐ２０１０−１５９１５５）
【出願日】平成２２年７月１３日（２０１０．７．１３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年２月２日（２０１２．２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年７月１３日（２０１０．７．１３）
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【Ｆターム（参考）】
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