遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物
【課題】ＢｉＰの遺伝子欠損マウスの提供を試みＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にすることを提供する。
【解決手段】ＢｉＰゲノム遺伝子に変異を有するノックイン非人哺乳動物であって、該変異によってＫＤＥＬ受容体によるＢｉＰ蛋白質の小胞体への局在機構が機能しないノックイン非ヒト哺乳動物とする。また、前記ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸残基をコードする部分のＢｉＰ遺伝子が欠失したノックイン非ヒト哺乳動物とすることからなる。
【解決手段】ＢｉＰゲノム遺伝子に変異を有するノックイン非人哺乳動物であって、該変異によってＫＤＥＬ受容体によるＢｉＰ蛋白質の小胞体への局在機構が機能しないノックイン非ヒト哺乳動物とする。また、前記ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸残基をコードする部分のＢｉＰ遺伝子が欠失したノックイン非ヒト哺乳動物とすることからなる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物に関し、特に小胞体分子シャペロンＢｉＰ変異体遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
分泌蛋白や膜蛋白は、小胞体膜上で合成された後小胞体に挿入され、小胞体に局在するＢｉＰ、ｃａｒｌｅｔｉｃｕｌｉｎ、ＰＤＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＧＲＰ９４
（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ９４）などの分子シャペロンと相互作用して折り畳み構造となり、糖鎖付加、複合体形成がなされ、機能的にも成熟し、小胞体から分泌されていく。
【０００３】
しかし上記の過程が虚血、再灌流、低栄養、低酸素、スーパーオキシド、毒物などの外界からの侵襲や遺伝子変異によって阻害されると、小胞体内に折り畳み構造の異常な蛋白質が蓄積し、分子シャペロンの産生増加、蛋白合成の抑制、異常蛋白質の分解、細胞死といった小胞体ストレス反応が起こることが知られている。そして近年、こうした小胞体ストレス反応がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患や躁鬱病、糖尿病を始めとする種々の疾患に関与しているのではないかとの研究も行われている。
【０００４】
また分子シャペロンの一つであるＢｉＰは、折り畳み構造の異常な蛋白質と結合してその増加を感知し、小胞体ストレス反応を開始する機構にも重要な働きをしていると考えられている。具体的には、安静時においてＢｉＰはＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６などの小胞体膜蛋白質と会合してそれらの小胞体膜蛋白質を不活性な状態に保持しているが、異常な蛋白質が増加した場合はその小胞体膜蛋白質から離れて異常蛋白質と結合するため、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６を活性化し、小胞体ストレス反応を起こすと考えられている。
【０００５】
また単細胞生物である酵母の研究から、ＢｉＰ（酵母ではＫａｒ２）が欠損すると細胞は生存することは出来ないことが分ってきており、ＢｉＰは小胞体分子シャペロンの中でも最も重要な蛋白質の一つであると考えられる。Ｋａｒ２のカルボキシ末端にはヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＨＤＥＬ）アミノ酸配列があり、Ｋａｒ２は小胞体に局在する。この配列を除いた変異Ｋａｒ２のみが発現する酵母では、変異Ｋａｒ２は小胞体から分泌されるが、代償性に小胞体ストレス反応が起こることによってＫａｒ２の産生が増大し、酵母は生存することができる（例えば下記非特許文献１参照）。哺乳類のＢｉＰではカルボキシ末端のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸配列が同様な機能を持つ。
【０００６】
哺乳類でも培養細胞の実験から遺伝子導入によってＢｉＰを予め多く発現させておくと細胞は侵襲に強くなることが示されている（例えば下記非特許文献２参照）。ヒト、ラット、マウスなど個体レベルでも、侵襲を加えるとＢｉＰの発現が増大することから、ＢｉＰが個体レベルでも侵襲に対して保護的に働いていると推測されているが、分子生物学的な裏付けに乏しい。特に、神経系や免疫系などの高次機能や神経変性疾患などの諸疾患との関わりについては推測の域を出ない。
【非特許文献１】Ｂｅｈ，Ｃ．Ｔ． ａｎｄ Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．、“Ｔｗｏ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ ｍａｉｎｔａｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｅｎｄｐｌａｓｔｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ”、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９５、９２、ｐｐ９８２０−９８２３
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．、Ｄｏｒｎｅｒ，Ａ．Ｊ．、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ａ．、Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｌ．Ｍ． ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢｉＰ） ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９７、２７２、ｐｐ４３２７−４３３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通りＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にしてそれを臨床応用することが今後の課題であり、そのために遺伝子導入マウス（トランスジェニックマウス）が広く用いられている。
【０００８】
しかしながら、トランスジェニックマウスでは元々ある内在性のその蛋白質が存在している上に、さらにその蛋白質を人工的に発現誘導することになり、発現量、発現時期、発現組織が本来のその蛋白質固有のものとは異なり、表現型の評価は複雑で、必ずしも一定の結論が得られない。これに対して、遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）では相同組換えによって
ゲノム遺伝子を改変しその蛋白質の遺伝子発現をなくしてしまうので、少なくとも個体レベルで現れた表現型がその蛋白質がないことに起因すると結論付けることができる。小胞体分子シャペロンｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎの遺伝子が欠損したマウスは致死となるが、胎生期のある時期までは生存することが示されている。だがこれに対し細胞レベルで必須の蛋白質であると考えられているＢｉＰの遺伝子欠損では、おそらく細胞としてさえ生存できず、胎児発生にも至らないと考えられ、遺伝子欠損マウスの報告もない。
【０００９】
ＢｉＰの様な小胞体分子シャペロンは小胞体ストレス反応によって産生が誘導されることから、トランスジェニックマウスの様に人工的な発現ではなく、内在性の発現誘導機構を残した状態でないと個体レベルでの上記機能評価は困難である。
【００１０】
そこで本発明は、ＢｉＰの遺伝子欠損マウスの提供を試み、このマウスを提供することでＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にすることを更なる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記を鑑み、本発明は以下の具体的な手段を採用する。
第一の手段として、ＢｉＰゲノム遺伝子に変異を有するノックイン非人哺乳動物であって、該変異によってＫＤＥＬ受容体によるＢｉＰ蛋白質の小胞体への局在機構が機能しないノックイン非ヒト哺乳動物を採用する。ここで「機能しない」とは、ＢｉＰ蛋白質が小胞体から分泌された場合に、ゴルジ体でＫＤＥＬ受容体に認識され小胞体に逆輸送される機序が働かない場合をいう。この手段において、ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端の第６５２から６５５までのリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸残基をコードする部分のＢｉＰ遺伝子が欠失している態様もある。また、カルボキシ末端のＫＤＥＬアミノ酸配列が欠失した変異ＢｉＰが産生される態様もある。また、この手段において、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加される態様もある。またこの手段において、非ヒト哺乳動物はノックインマウスとする態様もある。また、この手段において、非ヒト哺乳動物はノックインホモマウス若しくはノックインへテロマウスであるとする態様もある。
【００１２】
また第二の手段として、配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作製用遺伝子断片を採用する。
【００１３】
また、第三の手段として、配列番号３に記載の塩基配列のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された遺伝子断片を採用する。また、この手段において、ＢｉＰゲノム遺伝子が選択的に欠失するような変異が導入される態様もある。またこの手段において、変異は、ＨＡ ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）をコードする遺伝子による置換とする態様もある。
【００１４】
また、第四の手段として、配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作成用遺伝子断片を含有するノックインベクターを採用する。またこの手段において、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ｌｏｘＰ遺伝子を含んでなる態様もある。
【発明の効果】
【００１５】
以上により、ＢｉＰの遺伝子欠損マウスの提供が可能となり、ＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にすることに寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の一実施形態に係る遺伝子組換えノックインマウスの作製及び評価について説明する。
【００１７】
（ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインベクターおよびノックインマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス系統のλＦＩＸＩＩゲノム遺伝子ライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）に対して、ラットＢｉＰｃＤＮＡ全コード断片とのハイブリダイゼーションを行い、ＢｉＰ遺伝子の全ｅｘｏｎを含むＢｉＰゲノム遺伝子を得た。なお表１にゲノム遺伝子におけるｅｘｏｎとｉｎｔｒｏｎの境界を、図１にＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子の図を、配列番号１にＢｉＰ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ示す。
【表１】
【００１８】
また、ＰＣＲ反応を用いて、ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端部分を含むが最後のＫＤＥＬ配列の代わりにＨＡ ｔａｇをコードする遺伝子を含む約０．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（配列番号２）を得、更にこれをＢｉＰゲノム遺伝子の３’側の最後の４つのｅｘｏｎを含む遺伝子断片（配列番号３）のＳＴＯＰコドンより５’側において入れ替えた約２．１ｋｂの遺伝子断片を得た。
【００１９】
また、ＰＣＲ反応を用いた、ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎから３’側の約０．５ｋｂを含むＸｂａｌ−ＫｐｎＩ遺伝子断片（配列番号４）を得た。
【００２０】
そして上記の２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片を含む遺伝子断片、ｌｏｘＰ遺伝子配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＸｂａＩ遺伝子断片、上記Ｘｂａｌ−ＫｐｎＩ遺伝子断片、この３’側の２．５ｋｂ遺伝子断片、チミジンキナーゼ遺伝子を含む２．７ｋｂ遺伝子断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋プラスミドベクターに順次サブクローニングし、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインベクターを作製した。図１にマウスのＢｉＰゲノム遺伝子、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインマウス作製用の遺伝子断片、及び相同組み換え後のＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子の図をそれぞれ示す。
【００２１】
次に、ノックインベクターを電気穿孔法によってＥＳ細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン、ガンシクロビル存在下で培養し、変異ＥＳ細胞を樹立した。
【００２２】
そして、この樹立した変異ＥＳ細胞を用いて凝集法（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｃｈｉｍｅｒａ）によりキメラマウスを作製し、これとＣ５７ＢＬ／６系統の野生マウスとを交配させることで第一世代のヘテロマウスを得た。
【００２３】
更に、このヘテロマウスと、Ｃｒｅ遺伝子を発現するＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスとを交配させ、ゲノム遺伝子に組込まれていたｌｏｘＰ遺伝子配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が欠失しＢｉＰゲノム遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を含まないヘテロマウスを得た。そして更にこのヘテロマウス同士の交配によって第二世代のホモマウスを得た。
【００２４】
ＥＳ細胞の遺伝子型はサザンブロット法によって、マウスの遺伝子型はＰＣＲ法によって分析した（ＰＣＲ法におけるＢｉＰゲノム検出用の５’側プライマーの塩基配列を配列番号５に、３’側プライマーの塩基配列を配列番号６に、ＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子検出用の５’側プライマーの塩基配列を配列番号７に、３’側のプライマーの塩基配列を配列番号８にそれぞれ示す。）。図２（ａ）にサザンブロット法の分析結果を、図２（ｂ）にＰＣＲ法による分析結果を示す。なお図２（ａ）の結果は、ノックインベクターの５’側、３’側両側においてマウス胚性幹細胞での相同組み換えが起こっていることを示し、図２（ｂ）の結果は、野生型（＋／＋）、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインへテロマウス（Ｂ／＋）、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインホモマウス（Ｂ／Ｂ）の存在を示しており、いずれも所望の結果を得ることができている。
【００２５】
（胚性線維芽細胞の調整）
胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）は胎生１３．５日の胚から調整し、１５％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地中で培養し、ツニカマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）により１２時間刺激した。
【００２６】
（初代培養神経細胞の調整）
初代培養神経細胞は胎生１８．５日の胚から調整し、１０％ウシ胎仔血清を含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２、ＤＭＥＭ混合培地中で培養し、ツニカマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）により１２時間刺激した。
【００２７】
（胚性線維芽細胞、マウス胎児の解析）
ウエスタンブロット、３５Ｓメチオニンによる蛋白質アイソトープ標識は、公知の方法（Ｙａｍａｍｏｔｏら、“Ｔｈｅ ＫＤＥＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅｓ”、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００３、２７８、ｐｐ３４５２５−３４５３２を参照）により行った。なおこの検討には、抗アミノ末端ＢｉＰ抗体、抗ＫＤＥＬ抗体、抗ＨＡ ｔａｇ抗体、抗γ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を用いた。
【００２８】
（ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインヘテロマウスの飼育、解析）
ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインヘテロマウスはＳＰＦ条件下で飼育し、ｒｏｔｅｎｏｎｅ（１μｇ／ｇ体重）の腹腔内注入を１日１回で３０日間行った。
【００２９】
上記胚性線維芽細胞をツニカマイシンで刺激し、細胞を回収してサンプルを調整し、ウエスタンブロット法によって蛋白質の発現を解析したところ、野生型マウスではＢｉＰの発現増加が見られ、ノックインホモマウスでもＢｉＰ変異体ＨＡの発現増加が見られた。即ち、変異のないアミノ末端に対する抗体では認識されるが、変異のあるカルボキシ末端は抗ＫＤＥＬ抗体では認識されず、抗ＨＡ ｔａｇ抗体によって認識されるＢｉＰ変異体ＨＡを発現していた。図３にこの結果を示す。なおこの結果は、ノックインへテロマウスにもＢｉＰ変異体ＨＡが存在することも示している。
【００３０】
また、このＢｉＰ変異体ＨＡにはＫＤＥＬ受容体による認識部位がないので、安静状態でも小胞体に分布できないＢｉＰ変異体ＨＡが培養液に分泌される。これを胚性線維芽細胞に対し３５Ｓメチオニンによる蛋白質アイソトープ標識を行ない、細胞成分と培養液から免疫沈降によって、野生型ＢｉＰとＢｉＰ変異体ＨＡを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで確認した。図４にこの結果を示す。即ち安静時（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、野生型ＢｉＰは細胞内（ｃｈａｓａｅ ｃ）に分布するのに対してＢｉＰ変異体ＨＡは培養液に分泌される（ｃｈａｓｅ ｍ）。
【００３１】
また、生後４週後にマウスの遺伝子型を調べたところ、ノックインホモマウスは存在しなかった。検討の結果、ホモマウスは胎生期には生存し生まれてくるが、生後一日で死亡することが判った。生下時体重はノックインホモマウスが有意に軽く、全般的な成長障害が示唆された。図５（ａ）にノックインホモマウスを、図５（ｂ）に野生型マウス、ノックインホモマウス、ノックインへテロマウスの体重についての測定結果（生後１８．５日後）を示す。
【００３２】
また、ＢｉＰはマウスの全組織、全細胞に発現していると考えられ、ウエスタンブロット解析を行ったところ、ノックインホモマウスの脳にも野生型ＢｉＰに替わって、ＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることが確認できた。また、ホモマウス胎児由来の神経細胞を初代培養したところ、神経細胞にＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることが形態学的にも確認された。図６にその結果を示す。なおこの結果は、ノックインへテロマウスにおいてもＢｉＰ変異体ＨＡが存在していることを示している。
【００３３】
また、ノックインマウス胎児１８．５日から調整した初代培養神経細胞を神経細胞に特異的に発現するＭＡＰ２に対する抗体と抗ＨＡ抗体によって免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡によって観察を行った。この結果を図７に示す。これによりノックインホモマウス胎児の神経細胞にＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
近年小胞体ストレスが各種疾患の発症に関与するとの知見が集積しつつある。アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患や糖尿病、さらに我々は最近心筋症発症にも小胞体ストレスが関与することを報告した。本発明におけるＢｉＰ変異体ＨＡノックインホモマウスは生後間もなく死亡したがヘテロマウスは成長した。
【００３５】
ＢｉＰは小胞体分子シャペロンであるとともに、小胞体ストレス反応の制御分子でもあり、ＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスでも、侵襲に対する小胞体ストレス反応の異常が期待され、それに伴う疾患の発症が予測される。ＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスは小胞体ストレスに感受性が高いことが予測され、小胞体ストレス病の発症因子の検索や、小胞体ストレス病発症モデルに用いられることが期待される。
【００３６】
ヒト成人の神経変性疾患で２番目に頻度が高いパーキンソン病の動物モデル誘発物質として有機リン系の農薬の一種であるｒｏｔｅｎｏｎｅが知られている。ｒｏｔｅｎｏｎｅは黒質線状体のドーパミン産生神経細胞に作用して、ミトコンドリアと小胞体の機能を障害し、神経細胞変性、細胞死を起こし、パーキンソン病類似の病態を誘発することがラットの実験で明らかになっている。
【００３７】
そこでｒｏｔｅｎｏｎｅをＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスに投与（腹腔内投与１μｇ／ｇ体重１日１回を３０日）したところ、野生型マウスに比べて、ＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスではより黒質に神経細胞死（ＴＵＮＥＬ染色陽性）が起こっていた（図８参照）。このように、小胞体ストレス関連疾患と考えられる疾患発症に関与すると推測される物質をＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスに投与し、その疾患を誘発し易いかどうかを検討することは、その疾患の成因、治療法を考える上で有用である。
【００３８】
ＢｉＰ変異体ＨＡノックインホモマウスは生後間もなく死亡するが、胎児由来の細胞を培養する事は可能である（図３胚性線維芽細胞、図８初代培養神経細胞）。このように各組織、臓器由来の培養細胞を用いて、その細胞に特異的に作用する物質の効果を検討することは、小胞体ストレスと様々な疾患との関係を検討する上で有用であり、疾患を誘発する物質の検索や治療に結びつく可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マウスのＢｉＰゲノム遺伝子、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインマウス作製用の遺伝子断片、及び相同組み換え後のＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子の図
【図２】ＥＳ細胞の遺伝子型の分析結果に関する図。図２（ａ）はサザンブロット法によって得た結果を示す図、図２（ｂ）はＰＣＲ法によって得た結果を示す図。
【図３】胚性線維芽細胞をツニカマイシンで刺激した結果をウエスタンブロット法により確認した図。
【図４】胚性線維芽細胞に対し３５Ｓメチオニンによる蛋白質アイソトープ標識を行い、細胞成分と培養液から免疫沈降によって、野生型ＢｉＰとＢｉＰ変異体ＨＡを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った場合の結果を示す図。
【図５】図５（ａ）は野生型マウス、ノックインホモマウスを示す図。図５（ｂ）は野生型マウス、ノックインホモマウス、ノックインへテロマウスの体重についての測定結果（生後１８．５日後）を示す図。
【図６】ノックインホモマウスの脳にも野生型ＢｉＰに替わって、ＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることをウエスタンブロット解析によって確認した図。
【図７】ノックインマウス胎児１８．５日から調整した初代培養神経細胞を神経細胞に特異的に発現するＭＡＰ２に対する抗体と抗ＨＡ抗体によって免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡によって観察を行った場合の結果を示す図。
【図８】ＢｉＰ変異体ＨＡノックインホモマウス胎児由来の初代培養神経細胞を示す図。
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物に関し、特に小胞体分子シャペロンＢｉＰ変異体遺伝子組換えノックイン非ヒト哺乳動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
分泌蛋白や膜蛋白は、小胞体膜上で合成された後小胞体に挿入され、小胞体に局在するＢｉＰ、ｃａｒｌｅｔｉｃｕｌｉｎ、ＰＤＩ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｉｓｌｆｉｄｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、ＧＲＰ９４
（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ９４）などの分子シャペロンと相互作用して折り畳み構造となり、糖鎖付加、複合体形成がなされ、機能的にも成熟し、小胞体から分泌されていく。
【０００３】
しかし上記の過程が虚血、再灌流、低栄養、低酸素、スーパーオキシド、毒物などの外界からの侵襲や遺伝子変異によって阻害されると、小胞体内に折り畳み構造の異常な蛋白質が蓄積し、分子シャペロンの産生増加、蛋白合成の抑制、異常蛋白質の分解、細胞死といった小胞体ストレス反応が起こることが知られている。そして近年、こうした小胞体ストレス反応がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患や躁鬱病、糖尿病を始めとする種々の疾患に関与しているのではないかとの研究も行われている。
【０００４】
また分子シャペロンの一つであるＢｉＰは、折り畳み構造の異常な蛋白質と結合してその増加を感知し、小胞体ストレス反応を開始する機構にも重要な働きをしていると考えられている。具体的には、安静時においてＢｉＰはＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６などの小胞体膜蛋白質と会合してそれらの小胞体膜蛋白質を不活性な状態に保持しているが、異常な蛋白質が増加した場合はその小胞体膜蛋白質から離れて異常蛋白質と結合するため、ＩＲＥ１、ＰＥＲＫ、ＡＴＦ６を活性化し、小胞体ストレス反応を起こすと考えられている。
【０００５】
また単細胞生物である酵母の研究から、ＢｉＰ（酵母ではＫａｒ２）が欠損すると細胞は生存することは出来ないことが分ってきており、ＢｉＰは小胞体分子シャペロンの中でも最も重要な蛋白質の一つであると考えられる。Ｋａｒ２のカルボキシ末端にはヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＨＤＥＬ）アミノ酸配列があり、Ｋａｒ２は小胞体に局在する。この配列を除いた変異Ｋａｒ２のみが発現する酵母では、変異Ｋａｒ２は小胞体から分泌されるが、代償性に小胞体ストレス反応が起こることによってＫａｒ２の産生が増大し、酵母は生存することができる（例えば下記非特許文献１参照）。哺乳類のＢｉＰではカルボキシ末端のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸配列が同様な機能を持つ。
【０００６】
哺乳類でも培養細胞の実験から遺伝子導入によってＢｉＰを予め多く発現させておくと細胞は侵襲に強くなることが示されている（例えば下記非特許文献２参照）。ヒト、ラット、マウスなど個体レベルでも、侵襲を加えるとＢｉＰの発現が増大することから、ＢｉＰが個体レベルでも侵襲に対して保護的に働いていると推測されているが、分子生物学的な裏付けに乏しい。特に、神経系や免疫系などの高次機能や神経変性疾患などの諸疾患との関わりについては推測の域を出ない。
【非特許文献１】Ｂｅｈ，Ｃ．Ｔ． ａｎｄ Ｒｏｓｅ，Ｍ．Ｄ．、“Ｔｗｏ ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ ｍａｉｎｔａｉｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｅｎｄｐｌａｓｔｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ”、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ、ＵＳＡ、１９９５、９２、ｐｐ９８２０−９８２３
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ａ．、Ｄｏｒｎｅｒ，Ａ．Ｊ．、Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｃ．Ａ．、Ｈｅｎｄｅｒｓｈｏｔ，Ｌ．Ｍ． ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．Ｊ．、“Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢｉＰ） ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｐｒｏｔｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９７、２７２、ｐｐ４３２７−４３３４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通りＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にしてそれを臨床応用することが今後の課題であり、そのために遺伝子導入マウス（トランスジェニックマウス）が広く用いられている。
【０００８】
しかしながら、トランスジェニックマウスでは元々ある内在性のその蛋白質が存在している上に、さらにその蛋白質を人工的に発現誘導することになり、発現量、発現時期、発現組織が本来のその蛋白質固有のものとは異なり、表現型の評価は複雑で、必ずしも一定の結論が得られない。これに対して、遺伝子欠損マウス（ノックアウトマウス）では相同組換えによって
ゲノム遺伝子を改変しその蛋白質の遺伝子発現をなくしてしまうので、少なくとも個体レベルで現れた表現型がその蛋白質がないことに起因すると結論付けることができる。小胞体分子シャペロンｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎの遺伝子が欠損したマウスは致死となるが、胎生期のある時期までは生存することが示されている。だがこれに対し細胞レベルで必須の蛋白質であると考えられているＢｉＰの遺伝子欠損では、おそらく細胞としてさえ生存できず、胎児発生にも至らないと考えられ、遺伝子欠損マウスの報告もない。
【０００９】
ＢｉＰの様な小胞体分子シャペロンは小胞体ストレス反応によって産生が誘導されることから、トランスジェニックマウスの様に人工的な発現ではなく、内在性の発現誘導機構を残した状態でないと個体レベルでの上記機能評価は困難である。
【００１０】
そこで本発明は、ＢｉＰの遺伝子欠損マウスの提供を試み、このマウスを提供することでＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にすることを更なる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記を鑑み、本発明は以下の具体的な手段を採用する。
第一の手段として、ＢｉＰゲノム遺伝子に変異を有するノックイン非人哺乳動物であって、該変異によってＫＤＥＬ受容体によるＢｉＰ蛋白質の小胞体への局在機構が機能しないノックイン非ヒト哺乳動物を採用する。ここで「機能しない」とは、ＢｉＰ蛋白質が小胞体から分泌された場合に、ゴルジ体でＫＤＥＬ受容体に認識され小胞体に逆輸送される機序が働かない場合をいう。この手段において、ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端の第６５２から６５５までのリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸残基をコードする部分のＢｉＰ遺伝子が欠失している態様もある。また、カルボキシ末端のＫＤＥＬアミノ酸配列が欠失した変異ＢｉＰが産生される態様もある。また、この手段において、配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加される態様もある。またこの手段において、非ヒト哺乳動物はノックインマウスとする態様もある。また、この手段において、非ヒト哺乳動物はノックインホモマウス若しくはノックインへテロマウスであるとする態様もある。
【００１２】
また第二の手段として、配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作製用遺伝子断片を採用する。
【００１３】
また、第三の手段として、配列番号３に記載の塩基配列のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された遺伝子断片を採用する。また、この手段において、ＢｉＰゲノム遺伝子が選択的に欠失するような変異が導入される態様もある。またこの手段において、変異は、ＨＡ ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）をコードする遺伝子による置換とする態様もある。
【００１４】
また、第四の手段として、配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作成用遺伝子断片を含有するノックインベクターを採用する。またこの手段において、ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ｌｏｘＰ遺伝子を含んでなる態様もある。
【発明の効果】
【００１５】
以上により、ＢｉＰの遺伝子欠損マウスの提供が可能となり、ＢｉＰの個体レベルでの機能評価と疾患との関係をより明確にすることに寄与する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
以下、本発明の一実施形態に係る遺伝子組換えノックインマウスの作製及び評価について説明する。
【００１７】
（ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインベクターおよびノックインマウスの作製）
１２９／ＳｖＪマウス系統のλＦＩＸＩＩゲノム遺伝子ライブラリー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社）に対して、ラットＢｉＰｃＤＮＡ全コード断片とのハイブリダイゼーションを行い、ＢｉＰ遺伝子の全ｅｘｏｎを含むＢｉＰゲノム遺伝子を得た。なお表１にゲノム遺伝子におけるｅｘｏｎとｉｎｔｒｏｎの境界を、図１にＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子の図を、配列番号１にＢｉＰ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列を、それぞれ示す。
【表１】
【００１８】
また、ＰＣＲ反応を用いて、ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端部分を含むが最後のＫＤＥＬ配列の代わりにＨＡ ｔａｇをコードする遺伝子を含む約０．６ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片（配列番号２）を得、更にこれをＢｉＰゲノム遺伝子の３’側の最後の４つのｅｘｏｎを含む遺伝子断片（配列番号３）のＳＴＯＰコドンより５’側において入れ替えた約２．１ｋｂの遺伝子断片を得た。
【００１９】
また、ＰＣＲ反応を用いた、ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎから３’側の約０．５ｋｂを含むＸｂａｌ−ＫｐｎＩ遺伝子断片（配列番号４）を得た。
【００２０】
そして上記の２．１ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片を含む遺伝子断片、ｌｏｘＰ遺伝子配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＸｂａＩ遺伝子断片、上記Ｘｂａｌ−ＫｐｎＩ遺伝子断片、この３’側の２．５ｋｂ遺伝子断片、チミジンキナーゼ遺伝子を含む２．７ｋｂ遺伝子断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ＋プラスミドベクターに順次サブクローニングし、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインベクターを作製した。図１にマウスのＢｉＰゲノム遺伝子、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインマウス作製用の遺伝子断片、及び相同組み換え後のＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子の図をそれぞれ示す。
【００２１】
次に、ノックインベクターを電気穿孔法によってＥＳ細胞に遺伝子導入し、ネオマイシン、ガンシクロビル存在下で培養し、変異ＥＳ細胞を樹立した。
【００２２】
そして、この樹立した変異ＥＳ細胞を用いて凝集法（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｃｈｉｍｅｒａ）によりキメラマウスを作製し、これとＣ５７ＢＬ／６系統の野生マウスとを交配させることで第一世代のヘテロマウスを得た。
【００２３】
更に、このヘテロマウスと、Ｃｒｅ遺伝子を発現するＣＡＧ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスとを交配させ、ゲノム遺伝子に組込まれていたｌｏｘＰ遺伝子配列に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が欠失しＢｉＰゲノム遺伝子にネオマイシン耐性遺伝子を含まないヘテロマウスを得た。そして更にこのヘテロマウス同士の交配によって第二世代のホモマウスを得た。
【００２４】
ＥＳ細胞の遺伝子型はサザンブロット法によって、マウスの遺伝子型はＰＣＲ法によって分析した（ＰＣＲ法におけるＢｉＰゲノム検出用の５’側プライマーの塩基配列を配列番号５に、３’側プライマーの塩基配列を配列番号６に、ＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子検出用の５’側プライマーの塩基配列を配列番号７に、３’側のプライマーの塩基配列を配列番号８にそれぞれ示す。）。図２（ａ）にサザンブロット法の分析結果を、図２（ｂ）にＰＣＲ法による分析結果を示す。なお図２（ａ）の結果は、ノックインベクターの５’側、３’側両側においてマウス胚性幹細胞での相同組み換えが起こっていることを示し、図２（ｂ）の結果は、野生型（＋／＋）、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインへテロマウス（Ｂ／＋）、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインホモマウス（Ｂ／Ｂ）の存在を示しており、いずれも所望の結果を得ることができている。
【００２５】
（胚性線維芽細胞の調整）
胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）は胎生１３．５日の胚から調整し、１５％ウシ胎仔血清を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地中で培養し、ツニカマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）により１２時間刺激した。
【００２６】
（初代培養神経細胞の調整）
初代培養神経細胞は胎生１８．５日の胚から調整し、１０％ウシ胎仔血清を含むＨａｍ’ｓ Ｆ−１２、ＤＭＥＭ混合培地中で培養し、ツニカマイシン（２．５μｇ／ｍｌ）により１２時間刺激した。
【００２７】
（胚性線維芽細胞、マウス胎児の解析）
ウエスタンブロット、３５Ｓメチオニンによる蛋白質アイソトープ標識は、公知の方法（Ｙａｍａｍｏｔｏら、“Ｔｈｅ ＫＤＥＬ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅ ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅｓ”、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２００３、２７８、ｐｐ３４５２５−３４５３２を参照）により行った。なおこの検討には、抗アミノ末端ＢｉＰ抗体、抗ＫＤＥＬ抗体、抗ＨＡ ｔａｇ抗体、抗γ−ｔｕｂｕｌｉｎ抗体を用いた。
【００２８】
（ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインヘテロマウスの飼育、解析）
ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組換えノックインヘテロマウスはＳＰＦ条件下で飼育し、ｒｏｔｅｎｏｎｅ（１μｇ／ｇ体重）の腹腔内注入を１日１回で３０日間行った。
【００２９】
上記胚性線維芽細胞をツニカマイシンで刺激し、細胞を回収してサンプルを調整し、ウエスタンブロット法によって蛋白質の発現を解析したところ、野生型マウスではＢｉＰの発現増加が見られ、ノックインホモマウスでもＢｉＰ変異体ＨＡの発現増加が見られた。即ち、変異のないアミノ末端に対する抗体では認識されるが、変異のあるカルボキシ末端は抗ＫＤＥＬ抗体では認識されず、抗ＨＡ ｔａｇ抗体によって認識されるＢｉＰ変異体ＨＡを発現していた。図３にこの結果を示す。なおこの結果は、ノックインへテロマウスにもＢｉＰ変異体ＨＡが存在することも示している。
【００３０】
また、このＢｉＰ変異体ＨＡにはＫＤＥＬ受容体による認識部位がないので、安静状態でも小胞体に分布できないＢｉＰ変異体ＨＡが培養液に分泌される。これを胚性線維芽細胞に対し３５Ｓメチオニンによる蛋白質アイソトープ標識を行ない、細胞成分と培養液から免疫沈降によって、野生型ＢｉＰとＢｉＰ変異体ＨＡを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことで確認した。図４にこの結果を示す。即ち安静時（ｃｏｎｔｒｏｌ）には、野生型ＢｉＰは細胞内（ｃｈａｓａｅ ｃ）に分布するのに対してＢｉＰ変異体ＨＡは培養液に分泌される（ｃｈａｓｅ ｍ）。
【００３１】
また、生後４週後にマウスの遺伝子型を調べたところ、ノックインホモマウスは存在しなかった。検討の結果、ホモマウスは胎生期には生存し生まれてくるが、生後一日で死亡することが判った。生下時体重はノックインホモマウスが有意に軽く、全般的な成長障害が示唆された。図５（ａ）にノックインホモマウスを、図５（ｂ）に野生型マウス、ノックインホモマウス、ノックインへテロマウスの体重についての測定結果（生後１８．５日後）を示す。
【００３２】
また、ＢｉＰはマウスの全組織、全細胞に発現していると考えられ、ウエスタンブロット解析を行ったところ、ノックインホモマウスの脳にも野生型ＢｉＰに替わって、ＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることが確認できた。また、ホモマウス胎児由来の神経細胞を初代培養したところ、神経細胞にＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることが形態学的にも確認された。図６にその結果を示す。なおこの結果は、ノックインへテロマウスにおいてもＢｉＰ変異体ＨＡが存在していることを示している。
【００３３】
また、ノックインマウス胎児１８．５日から調整した初代培養神経細胞を神経細胞に特異的に発現するＭＡＰ２に対する抗体と抗ＨＡ抗体によって免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡によって観察を行った。この結果を図７に示す。これによりノックインホモマウス胎児の神経細胞にＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００３４】
近年小胞体ストレスが各種疾患の発症に関与するとの知見が集積しつつある。アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患や糖尿病、さらに我々は最近心筋症発症にも小胞体ストレスが関与することを報告した。本発明におけるＢｉＰ変異体ＨＡノックインホモマウスは生後間もなく死亡したがヘテロマウスは成長した。
【００３５】
ＢｉＰは小胞体分子シャペロンであるとともに、小胞体ストレス反応の制御分子でもあり、ＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスでも、侵襲に対する小胞体ストレス反応の異常が期待され、それに伴う疾患の発症が予測される。ＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスは小胞体ストレスに感受性が高いことが予測され、小胞体ストレス病の発症因子の検索や、小胞体ストレス病発症モデルに用いられることが期待される。
【００３６】
ヒト成人の神経変性疾患で２番目に頻度が高いパーキンソン病の動物モデル誘発物質として有機リン系の農薬の一種であるｒｏｔｅｎｏｎｅが知られている。ｒｏｔｅｎｏｎｅは黒質線状体のドーパミン産生神経細胞に作用して、ミトコンドリアと小胞体の機能を障害し、神経細胞変性、細胞死を起こし、パーキンソン病類似の病態を誘発することがラットの実験で明らかになっている。
【００３７】
そこでｒｏｔｅｎｏｎｅをＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスに投与（腹腔内投与１μｇ／ｇ体重１日１回を３０日）したところ、野生型マウスに比べて、ＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスではより黒質に神経細胞死（ＴＵＮＥＬ染色陽性）が起こっていた（図８参照）。このように、小胞体ストレス関連疾患と考えられる疾患発症に関与すると推測される物質をＢｉＰ変異体ＨＡノックインヘテロマウスに投与し、その疾患を誘発し易いかどうかを検討することは、その疾患の成因、治療法を考える上で有用である。
【００３８】
ＢｉＰ変異体ＨＡノックインホモマウスは生後間もなく死亡するが、胎児由来の細胞を培養する事は可能である（図３胚性線維芽細胞、図８初代培養神経細胞）。このように各組織、臓器由来の培養細胞を用いて、その細胞に特異的に作用する物質の効果を検討することは、小胞体ストレスと様々な疾患との関係を検討する上で有用であり、疾患を誘発する物質の検索や治療に結びつく可能性がある。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マウスのＢｉＰゲノム遺伝子、ＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックインマウス作製用の遺伝子断片、及び相同組み換え後のＢｉＰ変異体ＨＡゲノム遺伝子の図
【図２】ＥＳ細胞の遺伝子型の分析結果に関する図。図２（ａ）はサザンブロット法によって得た結果を示す図、図２（ｂ）はＰＣＲ法によって得た結果を示す図。
【図３】胚性線維芽細胞をツニカマイシンで刺激した結果をウエスタンブロット法により確認した図。
【図４】胚性線維芽細胞に対し３５Ｓメチオニンによる蛋白質アイソトープ標識を行い、細胞成分と培養液から免疫沈降によって、野生型ＢｉＰとＢｉＰ変異体ＨＡを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を行った場合の結果を示す図。
【図５】図５（ａ）は野生型マウス、ノックインホモマウスを示す図。図５（ｂ）は野生型マウス、ノックインホモマウス、ノックインへテロマウスの体重についての測定結果（生後１８．５日後）を示す図。
【図６】ノックインホモマウスの脳にも野生型ＢｉＰに替わって、ＢｉＰ変異体ＨＡが発現していることをウエスタンブロット解析によって確認した図。
【図７】ノックインマウス胎児１８．５日から調整した初代培養神経細胞を神経細胞に特異的に発現するＭＡＰ２に対する抗体と抗ＨＡ抗体によって免疫染色し、共焦点レーザー顕微鏡によって観察を行った場合の結果を示す図。
【図８】ＢｉＰ変異体ＨＡノックインホモマウス胎児由来の初代培養神経細胞を示す図。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＢｉＰゲノム遺伝子に変異を有するノックイン非人哺乳動物であって、該変異によってＫＤＥＬ受容体によるＢｉＰ蛋白質の小胞体への局在機構が機能しないノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸残基をコードする部分のＢｉＰ遺伝子が欠失した請求項１記載のノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
カルボキシ末端のＫＤＥＬアミノ酸配列が欠失した変異ＢｉＰが産生されるノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された請求項１記載のノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作製用遺伝子断片。
【請求項６】
配列番号３に記載の塩基配列のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された遺伝子断片。
【請求項７】
ＢｉＰゲノム遺伝子が選択的に欠失するような変異が導入された請求項６記載の遺伝子断片。
【請求項８】
前記変異は、ＨＡ ｔａｇをコードする遺伝子による置換であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子断片。
【請求項９】
配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作成用遺伝子断片を含有するノックインベクター。
【請求項１０】
ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ｌｏｘＰ遺伝子を含んでなる請求項８記載のノックインベクター。
【請求項１１】
前記非ヒト哺乳動物はノックインマウスである請求項１記載のノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
前記非ヒト哺乳動物はノックインホモマウスであることを特徴とする請求項１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
前記非ヒト哺乳動物はノックインへテロマウスであることを特徴とする請求項１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１】
ＢｉＰゲノム遺伝子に変異を有するノックイン非人哺乳動物であって、該変異によってＫＤＥＬ受容体によるＢｉＰ蛋白質の小胞体への局在機構が機能しないノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記ＢｉＰ蛋白質のカルボキシ末端のリジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン（ＫＤＥＬ）アミノ酸残基をコードする部分のＢｉＰ遺伝子が欠失した請求項１記載のノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
カルボキシ末端のＫＤＥＬアミノ酸配列が欠失した変異ＢｉＰが産生されるノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された請求項１記載のノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作製用遺伝子断片。
【請求項６】
配列番号３に記載の塩基配列のうち一又は複数の塩基が欠失、置換若しくは付加された遺伝子断片。
【請求項７】
ＢｉＰゲノム遺伝子が選択的に欠失するような変異が導入された請求項６記載の遺伝子断片。
【請求項８】
前記変異は、ＨＡ ｔａｇをコードする遺伝子による置換であることを特徴とする請求項７記載の遺伝子断片。
【請求項９】
配列番号２に記載のＢｉＰ変異体ＨＡ遺伝子組み換えノックイン非ヒト哺乳動物作成用遺伝子断片を含有するノックインベクター。
【請求項１０】
ネオマイシン耐性遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ｌｏｘＰ遺伝子を含んでなる請求項８記載のノックインベクター。
【請求項１１】
前記非ヒト哺乳動物はノックインマウスである請求項１記載のノックイン非ヒト哺乳動物。
【請求項１２】
前記非ヒト哺乳動物はノックインホモマウスであることを特徴とする請求項１記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１３】
前記非ヒト哺乳動物はノックインへテロマウスであることを特徴とする請求項１記載の非ヒト哺乳動物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００６−１１５７７０（Ｐ２００６−１１５７７０Ａ）
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３０７５５２（Ｐ２００４−３０７５５２）
【出願日】平成１６年１０月２２日（２００４．１０．２２）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年５月１１日（２００６．５．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１０月２２日（２００４．１０．２２）
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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