遺伝子転写制御方法
【課題】標的遺伝子の発現を制御するための方法の提供、ならびに目的遺伝子産物を効率的に生産するための組み換え微生物および当該微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法の提供。
【解決手段】微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
【解決手段】微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現を制御するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、食品、医薬や、洗剤、化粧品等の原料、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野で行われている。微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。その手法として、近年、遺伝子工学技術により微生物の遺伝子やプロモーターを改変して目的物質の発現を制御する方法が注目されている。
【０００３】
遺伝子の転写に必要なプロモーターに関する研究は数多く行なわれており、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合、ｌａｃプロモーター、キシロースプロモーター、アラビノースプロモーター等が遺伝子の発現誘導に用いられている。これらのプロモーターは、リプレッサーが制御配列から外れることによって活性化されて遺伝子の発現を誘導する、ネガティブレギュレーターによって制御される系である。
【０００４】
一方、枯草菌には、ポジティブレギュレーターに制御されるプロモーター系もまた存在する。枯草菌ＬｉａＲ及びＬｉａＳ（あるいはＹｖｑＣ及びＹｖｑＥ）は、細胞壁ストレスに応答する二成分制御系であることが示唆されている。二成分制御系とは、刺激に対するレセプター且つヒスチジンキナーゼとして働くセンサータンパク質と、そのセンサーからのリン酸シグナルを受けて活性化し、遺伝子発現を制御するレギュレータータンパク質とで構成される環境応答機構である。従来の研究では、ＬｉａＲＳ二成分制御系においてＬｉａＳは細胞壁に作用するいくつかの抗生物質に応答してＬｉａＲをリン酸化し、リン酸化されたＬｉａＲは、ｌｉａＩＨ上流とｙｈｃＹ上流に結合してその発現を制御すること（図１）、二成分制御系ＬｉａＲＳは、これらの遺伝子を活性化させるポジティブレギュレーターとして働くことが提唱されていた（非特許文献１〜５）。
【０００５】
ＬｉａＲＳ等の二成分制御系は、特定の遺伝子に対して強いポジティブレギュレーションを及ぼし得ることが報告されている（特許文献１、非特許文献６）。当該二成分制御系を利用した抗生物質の探索方法や抗生物質に対する耐性の探索方法が提唱されている（特許文献１）。しかし、二成分制御系が実際にプロモーターにどのように作用し、遺伝子発現を制御するのかについての詳細な解析は行われていなかった。また、有用物質の工業的生産のために二成分制御系を利用する試みも、これまでなされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第7,309,484号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jordanら，Microbiology, 2007, 153:2530-2540
【非特許文献２】Jordanら，Journal of Bacteriology, 2006, 188(14):5133-5166
【非特許文献３】Mascherら，Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(8):2888-2896
【非特許文献４】Jordanら，FEMS Microbiology reviews, 2008, 32:107-146
【非特許文献５】Mascherら，Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006, 70(4):910-938
【非特許文献６】Mascherら，Molecular Microbiology, 2003, 50(5):1591-1604
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、標的遺伝子の発現を特異的に制御するための方法を提供することに関する。また本発明は、目的遺伝子産物を効率的に生産するための組み換え微生物、および当該微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、枯草菌二成分制御系ＬｉａＲ及びＬｉａＳの系が、驚くべきことに、ｌｉａＩＨ遺伝子プロモーターに対して非常に特異的に結合していることを見出した。また本発明者らは、このＬｉａＲＳ系による遺伝子発現誘導が、特定の抗生物質によってさらに顕著に向上することを見出した。これらの知見に基づき、本発明らは、ｌｉａＩＨプロモーターの下流に標的遺伝子を作動可能に連結させ、そして二成分制御系ＬｉａＲＳを抗生物質によって活性化することで、当該標的遺伝子の発現を極めて特異的に誘導することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
（２）細胞壁ストレスが抗生物質である、（１）記載の方法。
（３）抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、（２）記載の方法。
（４）微生物がバチルス属細菌である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、（４）に記載の方法。
（６）標的遺伝子が異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、且つ該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が作動可能に連結されている組換え微生物。
（８）前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とが組み込まれた発現ベクターを有する（７）記載の組換え微生物。
（９）前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とがゲノムに組み込まれている（７）記載の組換え微生物。
（１０）微生物がバチルス属細菌である、（７）〜（９）のいずれか１に記載の組換え微生物。
（１１）バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、（１０）に記載の組換え微生物。
（１２）（７）〜（１１）のいずれか１に記載の組換え微生物に細胞壁ストレスを負荷する工程を特徴とする、目的遺伝子産物の生産方法。
（１３）細胞壁ストレスが抗生物質である、（１２）記載の方法。
（１４）抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、（１３）記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、目的タンパク質又はポリペプチド等の標的遺伝子産物の発現を強力且つ特異的に誘導し、それらを高効率で生産することが可能になる。さらに、本発明によれば、目的遺伝子産物の発現を極めて特異的に誘導することができ、目的以外の遺伝子産物が無駄に生産されることがないため、高純度の目的物質を得ることができるとともに、目的物質の生産に要するコストや労力を削減することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】二成分系ＬｉａＲＳによる転写誘導の模式図。Ａ：細胞壁ストレスによるアクティブレギュレーションの概念図、Ｂ：転写誘導経路の概念図。
【図２】ｌｉａＩノーマーカー削除株の作製手順。
【図３】ＢＡＢ７株の作製手順。
【図４】ＢＡＢ８株の作製手順。
【図５】ＢＡＢ９株の作製手順。
【図６】ＢＡＢ１０株の作製手順。
【図７】ｐＧＥＸ ４．１−ｌｉａＲ株の作製手順。
【図８】抗生物質による転写誘導。
【図９】異なるストレス因子による転写誘導を示す、ＬａｃＺアッセイデータ。
【図１０】異なるプロモーター間での転写誘導比較。
【図１１】レギュレーターＬｉａＲの枯草菌ゲノム結合領域を示す、ゲルシフトアッセイデータ。
【図１２】ＬｉａＲのＰｌｉａＩＨへの結合特異性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載される枯草菌遺伝子のＩＤ番号、名称、塩基配列、及びゲノム上での配置は、特に記載されない限り、ＮＣＢＩ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide)に基づく。
【００１４】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
ＬｉａＲ（ＢＳＵ３３０８０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５７）及びＬｉａＳ（ＢＳＵ３３０９０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９６７）は、枯草菌二成分制御系を構成するタンパク質であり、各々ＹｖｑＣ及びＹｖｑＥとも称され、また本明細書において集合的にＬｉａＲＳとも記載される。ＬｉａＳはヒスチジンキナーゼであって、二成分制御系のセンサーとして働き、一方ＬｉａＲは二成分制御系のレギュレーターとして働くと考えられている。また、ＬｉａＩ（ＢＳＵ３３１３０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５８）及びＬｉａＨ（ＢＳＵ３３１２０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３８５８５）は、各々ＹｖｑＩ及びＹｖｑＨとも称され、また本明細書において集合的にＬｉａＩＨとも記載される。ＬｉａＩＨは、それらの遺伝子の上流領域にＬｉａＲが結合することによって発現がアップレギュレートされることが知られている。ＬｉａＩは膜タンパク質と考えられており、一方ＬｉａＨはファージショックタンパク質と類似する。
【００１６】
本明細書において「ＬｉａＳをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＳをコードする遺伝子（ｌｉａＳ又はｙｖｑＥ）の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＳと同様に二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＳと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ＬｉａＳをコードする遺伝子に相当する遺伝子」である。
【００１７】
本明細書において「ＬｉａＲをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＲをコードする遺伝子（ｌｉａＲ又はｙｖｑＣ）の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲと同様に二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＲと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ＬｉａＲをコードする遺伝子に相当する遺伝子」である。
【００１８】
本明細書において「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ」とは、ＬｉａＩＨをコードする遺伝子（ｌｉａＩ及びｌｉａＩＨ又はｙｖｑＩ及びｙｖｑＨ）の発現を制御するプロモーター領域のＤＮＡを指す。好ましくは、「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ」とは、ＬｉａＩをコードする遺伝子の転写開始点（＋１）の上流−１２０〜＋８４領域の塩基配列を含むＤＮＡを指し、より好ましくは−９５〜＋２５領域、さらに好ましくは−９５〜＋１（転写開始点）領域を含むＤＮＡを指す。さらにより好ましくは、ＬｉａＩをコードする遺伝子の転写開始点（＋１）の上流−１２０〜＋８４領域の塩基配列からなるＤＮＡを指し、なお好ましくは−９５〜＋２５領域、なおより好ましくは−９５〜＋１（転写開始点）領域の塩基配列からなるＤＮＡを指す。
【００１９】
本明細書において「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡ」とは、上述のｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する、さらになお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲに結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡを指す。あるいは「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡ」とは、ＬｉａＩＨをコードする遺伝子に相当する遺伝子のプロモーターＤＮＡ又は当該プロモーターＤＮＡの塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する、さらになお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡであって、且つＬｉａＲ又はｌｉａＲ遺伝子に相当する遺伝子の発現産物に結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡを指す。ここで、「ＬｉａＩＨをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＩＨをコードする遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子、又はｌｉａＩＨをコードする遺伝子と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子である。
【００２０】
ＬｉａＳ及びＬｉａＲをコードする遺伝子（ｌｉａＲＳ）の各々に相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡとしては、例えば、下記表１に記載の遺伝子及びＤＮＡが挙げられる。表１は、各バクテリア種の代表的な菌株とそのｌｉａＲＳ相同遺伝子を挙げたものである。表１の菌がさらに有する別の相同遺伝子及びその発現産物が結合するプロモーターＤＮＡ、ならびに表１と同種の異なる菌株が有する表１と同じ相同遺伝子又は別の相同遺伝子、及びそれらの発現産物が結合するプロモーターＤＮＡも、本発明におけるＬｉａＳ及びＬｉａＲをコードする遺伝子の各々に相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡに含まれる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明の方法においては、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に標的遺伝子を作動可能に連結させ、またこの微生物に細胞壁ストレスを負荷することによって二成分制御系ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる。これによってｌｉａＩＨプロモーター又はこれに相当するプロモーターＤＮＡがアップレギュレートされ、結果として当該プロモーターの下流に連結された該標的遺伝子の転写が促進される。微生物は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。
【００２３】
標的遺伝子は特に限定されず、内在性の遺伝子であっても、異種遺伝子であってもよい。例えば、標的遺伝子としては、収縮タンパク質、輸送タンパク質、シグナルタンパク質、生体防御タンパク質、受容体タンパク質、構造タンパク質、遺伝子調節タンパク質、酵素、及び貯蔵タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子、ならびに機能性ＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子が挙げられる。
【００２４】
一態様において、標的遺伝子は、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である。異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子としては、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断、研究などの各種分野において有用なあらゆるタンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素、生理活性ペプチド、マーカー、シグナル伝達物質、構造タンパク質、各種調節などをコードする遺伝子が挙げられる。また、上記酵素としては、機能別に列挙すると、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ／Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等が挙げられるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００２５】
上記酵素の具体的な例としては、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。さらに具体的な例として、配列番号５３及び配列番号５４で示されるアミノ酸配列からなる、それぞれバチルス エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）又はバチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００２６】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピーＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。
【００２７】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号５６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号５６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２８】
好ましくは、上記異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、さらに分泌用シグナルペプチド領域と作動可能に連結されている。例えば、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）やＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子の分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号５３で示される塩基配列の塩基番号６０９〜６９９の塩基配列や配列番号５４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号５７３〜６６２の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが好ましい。
【００２９】
別の一態様において、標的遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子である。ノンコーディングＲＮＡは、ＤＮＡから転写された後タンパク質に翻訳されないＲＮＡである。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ，例えば、制御配列を含む非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ Ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等が挙げられる。これらのノンコーディングＲＮＡは、細胞の発現制御、発生、分化、その他生命活動に関わる多種多様なメカニズムを担っており、研究、医療、診断、創薬、品種改良や農薬生産等の農業、水産及び畜産分野、化学品製造等において利用可能である。
【００３０】
細胞壁ストレスとしては、バチルス属細菌等の微生物に対する細胞壁ストレスとして当該分野で知られている因子が挙げられ、例えばＳＤＳ等の界面活性剤、エタノール等のアルコール、ＮａＣｌ、キシロース等の浸透圧変化に関わる物質、細胞壁合成阻害剤、及び細胞膜や細胞壁に障害を与える抗生物質等が挙げられ、好ましくは抗生物質である。抗生物質としては、バチルス属等のグラム陽性細菌の細胞壁に障害を与える抗生物質であれば特に限定されないが、例えばｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、ｓｕｒｆａｃｔｉｎ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ｄｕｒａｍｙｃｉｎ、ｎｉｓｉｎ、ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ、ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが挙げられる。このうち、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが好ましく、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎがより好ましい。
【００３１】
本発明はまた、組換え微生物を提供する。本発明の組換え微生物は、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、ここで該ｌｉａＩプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流には標的遺伝子が作動可能に連結されている。微生物は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。
【００３２】
本明細書において、プロモーターと遺伝子、又は遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」とは、プロモーターが遺伝子の転写を誘導し得るように、又は遺伝子にコードされたタンパク質が分泌シグナルにより分泌されるように、連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子、又は遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００３３】
標的遺伝子とｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡとの連結、あるいはさらに分泌用シグナルペプチド領域との連結は、当該分野で通常用いられる方法により行うことができる。例えば、ＰＣＲ法により制限酵素切断部位を含むｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ及び標的遺伝子ＤＮＡ、または必要に応じて分泌シグナル領域ＤＮＡを増幅した後、それらを制限酵素法により互いに連結することができる。または、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１−６８）により、ｌｉａＩＨプロモーター領域下流のｌｉａ遺伝子領域と標的遺伝子、または必要に応じて分泌シグナル領域とを置換することによって、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの下流に標的遺伝子が連結したＤＮＡを構築することができる。
【００３４】
本発明の組換え微生物においては、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと標的遺伝子とは、発現ベクターに組み込まれていてもよい。発現ベクターに組み込む場合、標的遺伝子とプロモーターＤＮＡとの連結、又はさらに分泌シグナルペプチド領域との連結は、ベクター導入前に行われてもよく、あるいはベクター上で行われてもよい。構築した発現ベクターを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を作製することができる。
【００３５】
ベクターへのＤＮＡの導入は、当該分野で通常使用される任意の方法に従って行うことができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、上記で構築した制限酵素切断配列を端部に有するプロモーターＤＮＡを添加することによって、プロモーターＤＮＡをベクターに導入することができる（制限酵素法）。導入のためのベクターとしては、特に限定されないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）等が好ましい。
【００３６】
あるいは本発明の組換え微生物においては、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと標的遺伝子とは、当該微生物のゲノム上に存在していてもよい。これらの領域、又はこれらにさらに分泌シグナルペプチド領域を連結させて構築したＤＮＡ断片と、宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合させたＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法等によって作製し、これを相同組み換えによって宿主微生物のゲノムに直接組み込むことによって、本発明の組換え微生物を作製することができる。
【００３７】
本発明の組換え微生物を用いることにより、標的遺伝子にコードされた目的遺伝子産物を効率的に生産することができる。従って、本発明はまた、当該組換え微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法を提供する。本方法においては、当該微生物を培養するとともに、当該微生物に細胞壁ストレスを負荷する。細胞壁ストレスに応じて活性化された当該微生物中のＬｉａＲＳ二成分制御系又はこれに相当する二成分制御系によってｌｉａＩＨプロモーター又はこれに相当するプロモーターがアップレギュレートされ、それによって当該プロモーターの下流に連結された標的遺伝子の転写が促進されて当該遺伝子にコードされた目的遺伝子産物が発現する。培養終了後、目的遺伝子産物を採取する。必要に応じて、採取した遺伝子産物をさらに精製してもよい。
【００３８】
上記方法で使用する組換え微生物の培養のための培地は、同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む、当該組換え微生物の親微生物の培養に通常使用される培地であればよい。細胞壁ストレスとしては、上述したような、微生物に対する細胞壁ストレスとして当該分野で知られている因子が挙げられる。好ましくは、細胞壁ストレスは、上述したような抗生物質である。このうち、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが好ましく、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎがより好ましい。
【００３９】
従来の報告では、ＬｉａＲはｌｉａＩＨプロモーターのみならずｙｈｃＹプロモーターにも結合するとされてきた（例えば、特許文献３）。しかし、本発明者らの研究から、下記参考例２に示されるように、ＬｉａＲはｌｉａＩＨプロモーターと極めて特異的に結合することが新たに見出された。さらに、後記実施例に示すように、二成分制御系ＬｉａＲＳによるｌｉａＩＨプロモーターのアップレギュレーションは、従来知られたｌａｃプロモーターやｘｙｌｏｓｅプロモーターと比較して非常に強力である。従って、ＬｉａＲとｌｉａＩＨプロモーターとを組み合わせて利用することによって、標的遺伝子の転写を極めて特異的且つ強力に誘導することが可能となる。ＬｉａＲＳ−ｌｉａＩＨプロモーター系は、発現制御のためのツールとして非常に有用である。
【００４０】
従って、本発明によれば、標的遺伝子の転写を高度に特異的且つ強力に促進することができる。または本発明によれば、目的の遺伝子産物を、高度に特異的且つ高効率に生産することが可能となる。本発明の目的遺伝子産物の生産方法においては、遺伝子発現を高度且つ遺伝子特異的に制御することができるため、実質的に目的以外の遺伝子産物を生産することがなく、目的産物のみを効率よく生産することが可能となる。従って、本発明の生産方法によれば、目的産物を経済的且つ高純度で生産することが可能になる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例で使用したプライマー及び菌株の一覧を下記表２−１〜２−２及び表３に示す。
【００４２】
【表２−１】
【００４３】
【表２−２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
実施例１ プラスミド作製
（１）ｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３７と３８（配列番号３７及び３８）によって増幅したｌｉａＩの３’末端領域のＰＣＲ断片を、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ（Ishikawa et al., Mol. Microbiol., 2006, 60(6):1364-80）のＳａｌＩ、ＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって、ｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲ（図３参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４６】
（２）ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３９と４０（配列番号３９及び４０）によって増幅したＰｌｉａＩ (-120 to +84)のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＤＬ２（Fukuchi et al., Microbiology, 2000, 146(Pt 7):1573-83）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)（図４参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４７】
（３）ｐＸ−ｌｉａＨ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４１と４２（配列番号４１及び４２）によって増幅したｌｉａＨのＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＸ（Kim et al., Gene, 1996, 181:71-76）のＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＸ−ｌｉａＨ（図５参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４８】
（４）ｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４３と４４（配列番号４３及び４４）によって増幅したＰＣＲ断片を、ｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢＰリアクションによる組み替えによって挿入した。構築されたプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ株に導入し、導入株をＫｍ耐性マーカーにより選択し、選択株からｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨ（図６参照）を得た。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４９】
（５）ｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨ
ｐＡＰＮＣ２１３（Morimoto et al., Microbiology, 2002, 148(Pt 11):3539-52）のマルチクローニングサイトに、ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）をＧａｔｅｗａｙベクターコンバージョンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって導入し、ｐＡＰＮＣＧＷ（図６参照）を作製した。このｐＡＰＮＣＧＷと上記ｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨとの間で、ＬＲリアクションによる組み換え反応を行い、得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ株に導入した。導入株をＡｍｐ耐性マーカーにより選択し、選択株からｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨ（図６参照）を得た。得られたクローンについてはＰＣＲにより目的配列の挿入を確認した。
【００５０】
（６）ｐＧＥＸ−ｌｉａＲ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４９と５０（配列番号４９及び５０）によって増幅したｌｉａＩコーディング領域のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩにより消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍａｒｓｈａｍ）のＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位にクローニングすることによって、ｐＧＥＸ−ｌｉａＲ（図７参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００５１】
実施例２ 菌株作製
（１）ＢＡＢ１〜ＢＡＢ６：ｌｉａＩＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株
ノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）に従って、下記のとおりＢＡＢ１〜ＢＡＢ６株を作製した。
【００５２】
（ＢＡＢ１：ｌｉａＩノーマーカー削除株）
枯草菌１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＰＮＣ−Ｆプライマー（５１）とｃｈｐＡ−Ｒプライマー（５２）（配列番号５１及び５２）を用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。また、枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、欠失対象領域の５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）を、それぞれプライマー１と２（配列番号１及び２）、３と４（配列番号３及び４）及び５と６（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲにより増幅した。
次に、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）、ならびにプライマー１と６（配列番号１及び６）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77(1):61-68）を行った。これにより、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡ断片（図２）を取得することができた。
上述のように取得された供与体ＤＮＡを用いて、コンピテントセル形質転換方法（J. Bacteriol., 1967, 93(6):1925-1937）に従って、枯草菌１６８株を形質転換した。形質転換は、ＰＣＲ産物を２０μｇ以上用いて行った。
得られた形質転換体を、供与体ＤＮＡに含まれるスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。すなわち、上記形質転換処理後の細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、コロニーを得た。この培養によれば、第１相同組み換え（図２）によって供与体ＤＮＡが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をＬＢ液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を１ｍＭ ＩＰＴＧを入れたＬＢ寒天プレートに塗布した。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換え（図２）によって、欠失対象領域とともに供与体ＤＮＡが宿主ＤＮＡから欠失したｌｉａＩノーマーカー削除株である。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＩ遺伝子の欠失を確認した。
【００５３】
（ＢＡＢ２〜ＢＡＢ６：ｌｉａＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株）
上記（１）の選択マーカー遺伝子カセット及び表２−１〜２−２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株ＢＡＢ２〜ＢＡＢ６を作製した。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＨＧＦＳＲ各遺伝子の欠失を確認した。
【００５４】
（２）ＢＡＢ７（１６８，ｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ）株
枯草菌１６８野生株を、実施例１（１）で作製したｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲにより形質転換し、０．５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株として取得した。得られたｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株は、シークエンシングによりＬｉａＲのＣ末端に１２個のＨｉｓタグが付加していることを確認した（図３）。
【００５５】
（３）ＢＡＢ８（１６８，ａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株
実施例２（１）で作製したＢＡＢ２株（ｌｉａＨ削除株）を実施例１（２）で作製したｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)により形質転換し、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ株として取得した。得られたａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ株は、ＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺが挿入されていることを確認した（図４）。
【００５６】
（４）ＢＡＢ９（ＢＡＢ２，ａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ）株
実施例２（１）で作製したＢＡＢ２株（ｌｉａＨ削除株）を実施例１（３）で作製したｐＸ−ｌｉａＨにより形質転換し、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ株として取得した。得られたａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ株はＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にＰｘｙｌが挿入されていることを確認した（図５）。
【００５７】
（５）ＢＡＢ１０（ＢＡＢ２，ａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ）株
枯草菌１６８野生株を実施例１（５）で作製したｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨにより形質転換し、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ株として取得した。得られたａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ株はＰＣＲにより枯草菌ａｐｒＥ領域にＰｓｐａｃ−ｌｉａＨが挿入されていることを確認した（図６）。
【００５８】
実施例３ ＬｉａＲＳによる標的遺伝子転写誘導
（１）ｌｉａＩ転写誘導の抗生物質間での比較
（方法）
ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの調製： Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を付加したプライマー４７、４８（配列番号４７、４８）を作製し、これらプライマー４７、４８を用いて枯草菌野生株ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｌｉａＩ配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片をＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）のマニュアルに従いジゴキシゲニン標識を行った。
抗生物質ストレス負荷： 枯草菌野生株１６８、ならびに実施例２で作製したＢＡＢ６（ΔｌｉａＲ）及びＢＡＢ２（ΔｌｉａＨ）の各菌株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養した。次いで最終濃度０．０２５μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、５０μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎをそれぞれ添加して、１５分後に菌を採取し、トータルＲＮＡを調製した。対照として、それぞれの株について抗生物質非添加条件でＲＮＡを調製した。トータルＲＮＡの調製はIgo & Losick （J. Mol. Biol., 1986, 191, 615-624.）の方法に従って行った。
ノーザンハイブリダイゼーション： 調製したトータルＲＮＡ １μｇを１％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｇａｒｏｓｅゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ）にブロッティングを行った。ブロッティング後のメンブランはＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてクロスリンク後、上記で調製したジゴキシゲニンラベルしたＲＮＡプローブを用いて６８℃で１０時間ハイブリダイゼーションを行った。シグナルの検出にはＣＳＰＤ（登録商標）ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
ウエスタンブロッティング： 実施例２で作製したｌｉａＲ−１２ｈｉｓ株（ＢＡＢ７）をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２になるまで培養し、次いで最終濃度０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎをそれぞれ加えた後、０、１５、３０、４５、６０、７５分後に培養液を採取し、集菌した菌体のＯＤ＝６００が、１０ ＯＤ／ｍｌになるように０．５ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを加えた１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、３７℃で１０分間処理した。その後、１／４量の５×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃で５分間処理した。得られたサンプル２μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロッティングし、その後、一次抗体Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体、次いで二次抗体Ａｎｔｉ−Ｒａｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）を膜に反応させ、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてシグナルを検出した。
【００５９】
（結果）
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図８Ａに示す。抗生物質非添加の対照群及びｌｉａＲ削除株（ＢＡＢ６:レーン２）、ではｌｉａＩ遺伝子の転写誘導は見られなかった。一方、構成物質を添加した野生株及びｌｉａＨ削除株（ＢＡＢ２:レーン３）では強い転写誘導が観察された。さらに、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、２０００分の１の添加濃度にもかかわらず、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ添加群と同等以上の転写が観察されたことから、ＬｉａＲＳ系によるｌｉａＩＨオペロンの転写誘導はｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎにより顕著に活性化されることが示された。
【００６０】
ウエスタンブロッティングの結果を図８Ｂに示す。ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、１０００分の１の添加濃度にもかかわらず、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ添加群と同等以上のＬｉａＲ−Ｈｉｓタンパク質の誘導が観察された。また、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎによる転写活性化がストレス負荷後６０分程度で終息するのに対し、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、ストレス負荷後７５分を経過してもなお高いＬｉａＲ−Ｈｉｓタンパク質の誘導が観察された。
【００６１】
（２）異なるストレス因子間での転写誘導の比較
（方法）
細胞壁ストレス負荷： 実施例２で作製したＢＡＢ８株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養し、次いで様々な細胞壁ストレスを加え、３０分後に集菌した。細胞ストレスは０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、２μｇ／ｍｌ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、４％エタノール、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ならびに３０℃および４０℃の熱ショックをそれぞれ行った。対照として抗生物質非添加群を調製した。
ＬａｃＺアッセイ： ＬａｃＺアッセイはYoungman et al.（In Molecular Biology of Microbial Differentation. 1985, American Society for Microbiology Washington D.C., pp47-54）の方法に従った。細胞を１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１００μｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む、２００μｌ Ｚ ｂｕｆｆｅｒ（０．０６Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ４、０．０４Ｍ ＮａＨ2ＰＯ４、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００１Ｍ ＭｇＳＯ4、０．００１Ｍ ＤＴＴ）に懸濁し、３７℃で２０分インキュベートして細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍ、２分間、４℃で遠心を行い、得られた上清５０μｌに０．４ｍｇ／ｍｌ ＭＵＧ１０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、９５℃で１０分間処理して反応を停止させた。４ＭＵの蛍光はＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。また、上清のタンパク質量はＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、サンプル間の補正に使用した。
【００６２】
（結果）
ＬａｃＺアッセイの結果を図９に示す。ＢＡＢ８株において、ＰｌｉａＩＨの転写量のレポーターであるＬａｃＺの活性が抗生物質によって顕著に向上した。特に、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎの１０００分の１、及びｖａｎｃｏｍｙｃｉｎの２０分の１の濃度で高い効果を示した。またエタノールによって僅かにＰｌｉａＩＨからの転写の誘導が観察された。
【００６３】
（３）異なるプロモーター間での転写誘導の比較
（方法）
野生株１６８株、実施例２で作製したＢＡＢ９株及びＢＡＢ１０株をそれぞれＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養した。次いで、１６８株の培地には０．０５μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを、ＢＡＢ９株の培地には２％ ｘｙｌｏｓｅを、ＢＡＢ１０株には１ｍＭ ＩＰＴＧをそれぞれ添加した。１５分後に菌を採取し、トータルＲＮＡを調製し、（１）と同様の手順でノーザンハイブリダイゼーションを行った。
結果を図１０に示す。ＬｉａＲＳ系による転写誘導は、ＩＰＴＧやキシロースによる誘導と比較して顕著に強力であった。
【００６４】
参考例１ ＬｉａＲ結合領域の同定
（１）方法
（ＧＳＴ−ＬｉａＲ融合タンパク質の精製）
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に実施例１で作製したｐＧＥＸ ４．１−ｌｉａＲを導入し、ＬＢ培地で３０℃にて一晩培養した培養液を８００ｍｌのＬＢ培地にＯＤ０．０１になるように殖菌し、３０℃でＯＤ０．５まで培養した。この培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに３時間培養した。この細胞を遠心機により集菌し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．３）２０ｍｌに再懸濁し、超音波により破砕した。この細胞破砕液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心を行い、ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＧＥ）を用い、添付マニュアルに従い精製を行った。
（ゲルシフトアッセイ）
ＤＮＡ断片はｌｉａＩの転写開始点の−９５から＋２５までの１２１ｂｐを、プライマー４５、４６（配列番号４５、４６）を用いてＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）と［γ32Ｐ］ＡＴＰとを３７℃で３０分反応させることにより標識した。標識したＤＮＡはＮｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。ＤＮＡとタンパク質の結合反応は２５ｐｍｏｌ（５０００ｃｐｍ）のｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ、１μｌ Ｐｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ、５×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）とＧＳＴ−ＹｖｑＣ ｐｒｏｔｅｉｎ（０−５０ｐｍｏｌ）と水をトータル１５μｌになるように混ぜ、３０℃で１５分間インキュベーションを行ったあと、５％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。シグナルはイメージングプレートとＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ ｆｉｌｍ）を用いて検出を行った。
【００６５】
（２）結果
ゲルシフトアッセイの結果を図１１に示す。ｌｉａＩの転写開始点の−９５から＋２５領域（図１１Ｂ）とＬｉａＲタンパク質との結合量は、ＬｉａＲタンパク質の濃度とともに増加した（図１１Ａ）。よって当該−９５から＋２５領域とＬｉａＲタンパク質とが能動的に結合していることが示された。
【００６６】
参考例２ ＬｉａＲとｌｉａＩＨプロモーターとの結合の特異性
（１）方法
（ＣｈＡＰ−ｃｈｉｐアッセイ）
ＣｈＡＰ法によるＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質の精製は、Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法（Ishikawa et al., DNA Res. 2007, 14(4) 155-168）の方法を改変して行った。ＬＢ液体培地、３７℃で一晩培養した１６８ ｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株を４００ｍｌのＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１になるように殖菌し、Ｏ．Ｄ６００＝０．２まで培養した後に最終濃度０．０２５μｇ／ｍｌのｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを加えた。対照として、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ非添加群を作製した。さらに３０分培養後、最終濃度１％のホルムアルデヒドを加え、３７℃で３０分間クロスリンク処理を行った。その後、細胞を遠心して集菌し、３ｍｌのＵＴ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、超音波により破砕した。この細胞液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、上清からＮｉビーズを用いてＬｉａＲ−１２Ｈｉｓの精製を行った。その後、上記Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法に従い、枯草菌用に作られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（ＢＳＴＩＬＥ２ｂ520515F）を用いてＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質の枯草菌ＤＮＡ結合部位の解析を行い、結果をＩＭＣ ＡＥ（Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｂｉｏｌｏｇｙ）プログラムにより視覚化した。
【００６７】
（２）結果
ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを負荷した場合、ｙｖｑＩ（ｌｉａＩ）から下流において遺伝子の転写が強力に誘導された。一方、対照群においてはｙｖｑ（ｌｉａ）遺伝子の転写誘導は見られなかった（図１２Ａ）。これらの結果は、上記ノーザンハイブリダイゼーション及びＬａｃＺ解析の結果と一致する。また、ＣｈＡＰ−ｃｈｉｐ解析（図１２Ｂ）により、ＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質が枯草菌ｌｉａＩＨプロモーター領域に特異的に結合することが示された。ゲノム全体における解析において、ＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質が結合する箇所は上記ｌｉａＩＨプロモーター領域のみであった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現を制御するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物による有用物質の工業的生産は、食品、医薬や、洗剤、化粧品等の原料、あるいは各種化成品原料に至るまで、幅広い分野で行われている。微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つである。その手法として、近年、遺伝子工学技術により微生物の遺伝子やプロモーターを改変して目的物質の発現を制御する方法が注目されている。
【０００３】
遺伝子の転写に必要なプロモーターに関する研究は数多く行なわれており、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の場合、ｌａｃプロモーター、キシロースプロモーター、アラビノースプロモーター等が遺伝子の発現誘導に用いられている。これらのプロモーターは、リプレッサーが制御配列から外れることによって活性化されて遺伝子の発現を誘導する、ネガティブレギュレーターによって制御される系である。
【０００４】
一方、枯草菌には、ポジティブレギュレーターに制御されるプロモーター系もまた存在する。枯草菌ＬｉａＲ及びＬｉａＳ（あるいはＹｖｑＣ及びＹｖｑＥ）は、細胞壁ストレスに応答する二成分制御系であることが示唆されている。二成分制御系とは、刺激に対するレセプター且つヒスチジンキナーゼとして働くセンサータンパク質と、そのセンサーからのリン酸シグナルを受けて活性化し、遺伝子発現を制御するレギュレータータンパク質とで構成される環境応答機構である。従来の研究では、ＬｉａＲＳ二成分制御系においてＬｉａＳは細胞壁に作用するいくつかの抗生物質に応答してＬｉａＲをリン酸化し、リン酸化されたＬｉａＲは、ｌｉａＩＨ上流とｙｈｃＹ上流に結合してその発現を制御すること（図１）、二成分制御系ＬｉａＲＳは、これらの遺伝子を活性化させるポジティブレギュレーターとして働くことが提唱されていた（非特許文献１〜５）。
【０００５】
ＬｉａＲＳ等の二成分制御系は、特定の遺伝子に対して強いポジティブレギュレーションを及ぼし得ることが報告されている（特許文献１、非特許文献６）。当該二成分制御系を利用した抗生物質の探索方法や抗生物質に対する耐性の探索方法が提唱されている（特許文献１）。しかし、二成分制御系が実際にプロモーターにどのように作用し、遺伝子発現を制御するのかについての詳細な解析は行われていなかった。また、有用物質の工業的生産のために二成分制御系を利用する試みも、これまでなされていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第7,309,484号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jordanら，Microbiology, 2007, 153:2530-2540
【非特許文献２】Jordanら，Journal of Bacteriology, 2006, 188(14):5133-5166
【非特許文献３】Mascherら，Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48(8):2888-2896
【非特許文献４】Jordanら，FEMS Microbiology reviews, 2008, 32:107-146
【非特許文献５】Mascherら，Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2006, 70(4):910-938
【非特許文献６】Mascherら，Molecular Microbiology, 2003, 50(5):1591-1604
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、標的遺伝子の発現を特異的に制御するための方法を提供することに関する。また本発明は、目的遺伝子産物を効率的に生産するための組み換え微生物、および当該微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法の提供に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、枯草菌二成分制御系ＬｉａＲ及びＬｉａＳの系が、驚くべきことに、ｌｉａＩＨ遺伝子プロモーターに対して非常に特異的に結合していることを見出した。また本発明者らは、このＬｉａＲＳ系による遺伝子発現誘導が、特定の抗生物質によってさらに顕著に向上することを見出した。これらの知見に基づき、本発明らは、ｌｉａＩＨプロモーターの下流に標的遺伝子を作動可能に連結させ、そして二成分制御系ＬｉａＲＳを抗生物質によって活性化することで、当該標的遺伝子の発現を極めて特異的に誘導することができることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は以下を提供する。
（１）微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
（２）細胞壁ストレスが抗生物質である、（１）記載の方法。
（３）抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、（２）記載の方法。
（４）微生物がバチルス属細菌である、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、（４）に記載の方法。
（６）標的遺伝子が異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、且つ該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が作動可能に連結されている組換え微生物。
（８）前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とが組み込まれた発現ベクターを有する（７）記載の組換え微生物。
（９）前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とがゲノムに組み込まれている（７）記載の組換え微生物。
（１０）微生物がバチルス属細菌である、（７）〜（９）のいずれか１に記載の組換え微生物。
（１１）バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、（１０）に記載の組換え微生物。
（１２）（７）〜（１１）のいずれか１に記載の組換え微生物に細胞壁ストレスを負荷する工程を特徴とする、目的遺伝子産物の生産方法。
（１３）細胞壁ストレスが抗生物質である、（１２）記載の方法。
（１４）抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、（１３）記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、目的タンパク質又はポリペプチド等の標的遺伝子産物の発現を強力且つ特異的に誘導し、それらを高効率で生産することが可能になる。さらに、本発明によれば、目的遺伝子産物の発現を極めて特異的に誘導することができ、目的以外の遺伝子産物が無駄に生産されることがないため、高純度の目的物質を得ることができるとともに、目的物質の生産に要するコストや労力を削減することが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】二成分系ＬｉａＲＳによる転写誘導の模式図。Ａ：細胞壁ストレスによるアクティブレギュレーションの概念図、Ｂ：転写誘導経路の概念図。
【図２】ｌｉａＩノーマーカー削除株の作製手順。
【図３】ＢＡＢ７株の作製手順。
【図４】ＢＡＢ８株の作製手順。
【図５】ＢＡＢ９株の作製手順。
【図６】ＢＡＢ１０株の作製手順。
【図７】ｐＧＥＸ ４．１−ｌｉａＲ株の作製手順。
【図８】抗生物質による転写誘導。
【図９】異なるストレス因子による転写誘導を示す、ＬａｃＺアッセイデータ。
【図１０】異なるプロモーター間での転写誘導比較。
【図１１】レギュレーターＬｉａＲの枯草菌ゲノム結合領域を示す、ゲルシフトアッセイデータ。
【図１２】ＬｉａＲのＰｌｉａＩＨへの結合特異性を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書に記載される枯草菌遺伝子のＩＤ番号、名称、塩基配列、及びゲノム上での配置は、特に記載されない限り、ＮＣＢＩ Ｄａｔａｂａｓｅ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=nucleotide)に基づく。
【００１４】
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
【００１５】
ＬｉａＲ（ＢＳＵ３３０８０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５７）及びＬｉａＳ（ＢＳＵ３３０９０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９６７）は、枯草菌二成分制御系を構成するタンパク質であり、各々ＹｖｑＣ及びＹｖｑＥとも称され、また本明細書において集合的にＬｉａＲＳとも記載される。ＬｉａＳはヒスチジンキナーゼであって、二成分制御系のセンサーとして働き、一方ＬｉａＲは二成分制御系のレギュレーターとして働くと考えられている。また、ＬｉａＩ（ＢＳＵ３３１３０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３５９５８）及びＬｉａＨ（ＢＳＵ３３１２０，ＮＣＢＩ−ＧｅｎｅＩＤ：９３８５８５）は、各々ＹｖｑＩ及びＹｖｑＨとも称され、また本明細書において集合的にＬｉａＩＨとも記載される。ＬｉａＩＨは、それらの遺伝子の上流領域にＬｉａＲが結合することによって発現がアップレギュレートされることが知られている。ＬｉａＩは膜タンパク質と考えられており、一方ＬｉａＨはファージショックタンパク質と類似する。
【００１６】
本明細書において「ＬｉａＳをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＳをコードする遺伝子（ｌｉａＳ又はｙｖｑＥ）の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＳと同様に二成分制御系のセンサーとして機能するヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＳと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ＬｉａＳをコードする遺伝子に相当する遺伝子」である。
【００１７】
本明細書において「ＬｉａＲをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＲをコードする遺伝子（ｌｉａＲ又はｙｖｑＣ）の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲと同様に二成分制御系のレギュレーターとして機能するタンパク質をコードする遺伝子を指す。あるいは、ｌｉａＲと相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子も、「ＬｉａＲをコードする遺伝子に相当する遺伝子」である。
【００１８】
本明細書において「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ」とは、ＬｉａＩＨをコードする遺伝子（ｌｉａＩ及びｌｉａＩＨ又はｙｖｑＩ及びｙｖｑＨ）の発現を制御するプロモーター領域のＤＮＡを指す。好ましくは、「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ」とは、ＬｉａＩをコードする遺伝子の転写開始点（＋１）の上流−１２０〜＋８４領域の塩基配列を含むＤＮＡを指し、より好ましくは−９５〜＋２５領域、さらに好ましくは−９５〜＋１（転写開始点）領域を含むＤＮＡを指す。さらにより好ましくは、ＬｉａＩをコードする遺伝子の転写開始点（＋１）の上流−１２０〜＋８４領域の塩基配列からなるＤＮＡを指し、なお好ましくは−９５〜＋２５領域、なおより好ましくは−９５〜＋１（転写開始点）領域の塩基配列からなるＤＮＡを指す。
【００１９】
本明細書において「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡ」とは、上述のｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する、さらになお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有し、且つＬｉａＲに結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡを指す。あるいは「ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡ」とは、ＬｉａＩＨをコードする遺伝子に相当する遺伝子のプロモーターＤＮＡ又は当該プロモーターＤＮＡの塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する、さらになお好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列を有するＤＮＡであって、且つＬｉａＲ又はｌｉａＲ遺伝子に相当する遺伝子の発現産物に結合されてプロモーターとしての機能を発揮するＤＮＡを指す。ここで、「ＬｉａＩＨをコードする遺伝子に相当する遺伝子」とは、ＮＣＢＩデータベースに記載のＬｉａＩＨをコードする遺伝子の塩基配列に対して７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、なお好ましくは９５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子、又はｌｉａＩＨをコードする遺伝子と相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）又は類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）を有する遺伝子である。
【００２０】
ＬｉａＳ及びＬｉａＲをコードする遺伝子（ｌｉａＲＳ）の各々に相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡとしては、例えば、下記表１に記載の遺伝子及びＤＮＡが挙げられる。表１は、各バクテリア種の代表的な菌株とそのｌｉａＲＳ相同遺伝子を挙げたものである。表１の菌がさらに有する別の相同遺伝子及びその発現産物が結合するプロモーターＤＮＡ、ならびに表１と同種の異なる菌株が有する表１と同じ相同遺伝子又は別の相同遺伝子、及びそれらの発現産物が結合するプロモーターＤＮＡも、本発明におけるＬｉａＳ及びＬｉａＲをコードする遺伝子の各々に相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡに相当するＤＮＡに含まれる。
【００２１】
【表１】
【００２２】
本発明の方法においては、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に標的遺伝子を作動可能に連結させ、またこの微生物に細胞壁ストレスを負荷することによって二成分制御系ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる。これによってｌｉａＩＨプロモーター又はこれに相当するプロモーターＤＮＡがアップレギュレートされ、結果として当該プロモーターの下流に連結された該標的遺伝子の転写が促進される。微生物は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。
【００２３】
標的遺伝子は特に限定されず、内在性の遺伝子であっても、異種遺伝子であってもよい。例えば、標的遺伝子としては、収縮タンパク質、輸送タンパク質、シグナルタンパク質、生体防御タンパク質、受容体タンパク質、構造タンパク質、遺伝子調節タンパク質、酵素、及び貯蔵タンパク質等のタンパク質をコードする遺伝子、ならびに機能性ＲＮＡ等のノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子が挙げられる。
【００２４】
一態様において、標的遺伝子は、異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である。異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子としては、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断、研究などの各種分野において有用なあらゆるタンパク質又はポリペプチド、例えば、酵素、生理活性ペプチド、マーカー、シグナル伝達物質、構造タンパク質、各種調節などをコードする遺伝子が挙げられる。また、上記酵素としては、機能別に列挙すると、酸化還元酵素（Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、転移酵素（Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、加水分解酵素（Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、脱離酵素（Ｌｙａｓｅ）、異性化酵素（Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）、合成酵素（Ｌｉｇａｓｅ／Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等が挙げられるが、好適にはセルラーゼ、α−アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。
【００２５】
上記酵素の具体的な例としては、多糖加水分解酵素の分類（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２８０，３０９，１９９１）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。さらに具体的な例として、配列番号５３及び配列番号５４で示されるアミノ酸配列からなる、それぞれバチルス エスピーＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）又はバチルス エスピーＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のアルカリセルラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるセルラーゼが挙げられる。
【００２６】
α−アミラーゼの具体例としては、微生物由来のα−アミラーゼが挙げられ、特にバチルス属細菌由来の液化型アミラーゼが好ましい。より具体的な例として、配列番号５５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピーＫＳＭ−Ｋ３８株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６９４６）由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。
【００２７】
プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。より具体的な例として、配列番号５６で示されるアミノ酸配列からなるバチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼ、あるいは当該アミノ酸配列と７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号５６で示されるアミノ酸配列において１〜数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなりプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
【００２８】
好ましくは、上記異種タンパク質又はポリペプチド遺伝子は、さらに分泌用シグナルペプチド領域と作動可能に連結されている。例えば、ＫＳＭ−６４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−２８８６）やＫＳＭ−Ｓ２３７株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７８７５）由来のセルラーゼ遺伝子の分泌用シグナルペプチド領域、より具体的には配列番号５３で示される塩基配列の塩基番号６０９〜６９９の塩基配列や配列番号５４で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号５７３〜６６２の塩基配列、また当該塩基配列に対して７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるＤＮＡ断片が、目的タンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と作動可能に連結されていることが好ましい。
【００２９】
別の一態様において、標的遺伝子は、ノンコーディングＲＮＡをコードする遺伝子である。ノンコーディングＲＮＡは、ＤＮＡから転写された後タンパク質に翻訳されないＲＮＡである。ノンコーディングＲＮＡとしては、機能性ＲＮＡ，例えば、制御配列を含む非翻訳領域、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ型ｎｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ−ｌｉｋｅ ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、ｓｔＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ Ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）等が挙げられる。これらのノンコーディングＲＮＡは、細胞の発現制御、発生、分化、その他生命活動に関わる多種多様なメカニズムを担っており、研究、医療、診断、創薬、品種改良や農薬生産等の農業、水産及び畜産分野、化学品製造等において利用可能である。
【００３０】
細胞壁ストレスとしては、バチルス属細菌等の微生物に対する細胞壁ストレスとして当該分野で知られている因子が挙げられ、例えばＳＤＳ等の界面活性剤、エタノール等のアルコール、ＮａＣｌ、キシロース等の浸透圧変化に関わる物質、細胞壁合成阻害剤、及び細胞膜や細胞壁に障害を与える抗生物質等が挙げられ、好ましくは抗生物質である。抗生物質としては、バチルス属等のグラム陽性細菌の細胞壁に障害を与える抗生物質であれば特に限定されないが、例えばｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ、ｓｕｒｆａｃｔｉｎ、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、ｄｕｒａｍｙｃｉｎ、ｎｉｓｉｎ、ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ、ｒａｍｏｐｌａｎｉｎ、ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが挙げられる。このうち、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが好ましく、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎがより好ましい。
【００３１】
本発明はまた、組換え微生物を提供する。本発明の組換え微生物は、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、ここで該ｌｉａＩプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流には標的遺伝子が作動可能に連結されている。微生物は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。
【００３２】
本明細書において、プロモーターと遺伝子、又は遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」とは、プロモーターが遺伝子の転写を誘導し得るように、又は遺伝子にコードされたタンパク質が分泌シグナルにより分泌されるように、連結されていることをいう。プロモーターと遺伝子、又は遺伝子と分泌シグナルとの「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
【００３３】
標的遺伝子とｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡとの連結、あるいはさらに分泌用シグナルペプチド領域との連結は、当該分野で通常用いられる方法により行うことができる。例えば、ＰＣＲ法により制限酵素切断部位を含むｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ及び標的遺伝子ＤＮＡ、または必要に応じて分泌シグナル領域ＤＮＡを増幅した後、それらを制限酵素法により互いに連結することができる。または、ＳＯＥ−ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：６１−６８）により、ｌｉａＩＨプロモーター領域下流のｌｉａ遺伝子領域と標的遺伝子、または必要に応じて分泌シグナル領域とを置換することによって、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡの下流に標的遺伝子が連結したＤＮＡを構築することができる。
【００３４】
本発明の組換え微生物においては、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと標的遺伝子とは、発現ベクターに組み込まれていてもよい。発現ベクターに組み込む場合、標的遺伝子とプロモーターＤＮＡとの連結、又はさらに分泌シグナルペプチド領域との連結は、ベクター導入前に行われてもよく、あるいはベクター上で行われてもよい。構築した発現ベクターを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を作製することができる。
【００３５】
ベクターへのＤＮＡの導入は、当該分野で通常使用される任意の方法に従って行うことができる。例えば、ベクターを制限酵素で切断し、そこに、上記で構築した制限酵素切断配列を端部に有するプロモーターＤＮＡを添加することによって、プロモーターＤＮＡをベクターに導入することができる（制限酵素法）。導入のためのベクターとしては、特に限定されないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）等が好ましい。
【００３６】
あるいは本発明の組換え微生物においては、ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと標的遺伝子とは、当該微生物のゲノム上に存在していてもよい。これらの領域、又はこれらにさらに分泌シグナルペプチド領域を連結させて構築したＤＮＡ断片と、宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合させたＤＮＡ断片をＳＯＥ−ＰＣＲ法等によって作製し、これを相同組み換えによって宿主微生物のゲノムに直接組み込むことによって、本発明の組換え微生物を作製することができる。
【００３７】
本発明の組換え微生物を用いることにより、標的遺伝子にコードされた目的遺伝子産物を効率的に生産することができる。従って、本発明はまた、当該組換え微生物を用いた目的遺伝子産物の生産方法を提供する。本方法においては、当該微生物を培養するとともに、当該微生物に細胞壁ストレスを負荷する。細胞壁ストレスに応じて活性化された当該微生物中のＬｉａＲＳ二成分制御系又はこれに相当する二成分制御系によってｌｉａＩＨプロモーター又はこれに相当するプロモーターがアップレギュレートされ、それによって当該プロモーターの下流に連結された標的遺伝子の転写が促進されて当該遺伝子にコードされた目的遺伝子産物が発現する。培養終了後、目的遺伝子産物を採取する。必要に応じて、採取した遺伝子産物をさらに精製してもよい。
【００３８】
上記方法で使用する組換え微生物の培養のための培地は、同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む、当該組換え微生物の親微生物の培養に通常使用される培地であればよい。細胞壁ストレスとしては、上述したような、微生物に対する細胞壁ストレスとして当該分野で知られている因子が挙げられる。好ましくは、細胞壁ストレスは、上述したような抗生物質である。このうち、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ及びｂａｃｉｔｒａｃｉｎが好ましく、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎがより好ましい。
【００３９】
従来の報告では、ＬｉａＲはｌｉａＩＨプロモーターのみならずｙｈｃＹプロモーターにも結合するとされてきた（例えば、特許文献３）。しかし、本発明者らの研究から、下記参考例２に示されるように、ＬｉａＲはｌｉａＩＨプロモーターと極めて特異的に結合することが新たに見出された。さらに、後記実施例に示すように、二成分制御系ＬｉａＲＳによるｌｉａＩＨプロモーターのアップレギュレーションは、従来知られたｌａｃプロモーターやｘｙｌｏｓｅプロモーターと比較して非常に強力である。従って、ＬｉａＲとｌｉａＩＨプロモーターとを組み合わせて利用することによって、標的遺伝子の転写を極めて特異的且つ強力に誘導することが可能となる。ＬｉａＲＳ−ｌｉａＩＨプロモーター系は、発現制御のためのツールとして非常に有用である。
【００４０】
従って、本発明によれば、標的遺伝子の転写を高度に特異的且つ強力に促進することができる。または本発明によれば、目的の遺伝子産物を、高度に特異的且つ高効率に生産することが可能となる。本発明の目的遺伝子産物の生産方法においては、遺伝子発現を高度且つ遺伝子特異的に制御することができるため、実質的に目的以外の遺伝子産物を生産することがなく、目的産物のみを効率よく生産することが可能となる。従って、本発明の生産方法によれば、目的産物を経済的且つ高純度で生産することが可能になる。
【実施例】
【００４１】
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明する。以下の実施例で使用したプライマー及び菌株の一覧を下記表２−１〜２−２及び表３に示す。
【００４２】
【表２−１】
【００４３】
【表２−２】
【００４４】
【表３】
【００４５】
実施例１ プラスミド作製
（１）ｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３７と３８（配列番号３７及び３８）によって増幅したｌｉａＩの３’末端領域のＰＣＲ断片を、ＳａｌＩ、ＸｈｏＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ（Ishikawa et al., Mol. Microbiol., 2006, 60(6):1364-80）のＳａｌＩ、ＸｈｏＩ部位にクローニングすることによって、ｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲ（図３参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４６】
（２）ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー３９と４０（配列番号３９及び４０）によって増幅したＰｌｉａＩ (-120 to +84)のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＤＬ２（Fukuchi et al., Microbiology, 2000, 146(Pt 7):1573-83）のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)（図４参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４７】
（３）ｐＸ−ｌｉａＨ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４１と４２（配列番号４１及び４２）によって増幅したｌｉａＨのＰＣＲ断片を、ＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩにより消化し、ＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＸ（Kim et al., Gene, 1996, 181:71-76）のＳｐｅＩ、ＢａｍＨＩ切断部位にクローニングすることによって、ｐＸ−ｌｉａＨ（図５参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４８】
（４）ｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４３と４４（配列番号４３及び４４）によって増幅したＰＣＲ断片を、ｐＤＯＮＲ２０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＢＰリアクションによる組み替えによって挿入した。構築されたプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ株に導入し、導入株をＫｍ耐性マーカーにより選択し、選択株からｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨ（図６参照）を得た。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００４９】
（５）ｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨ
ｐＡＰＮＣ２１３（Morimoto et al., Microbiology, 2002, 148(Pt 11):3539-52）のマルチクローニングサイトに、ｇａｔｅｗａｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）をＧａｔｅｗａｙベクターコンバージョンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって導入し、ｐＡＰＮＣＧＷ（図６参照）を作製した。このｐＡＰＮＣＧＷと上記ｐＤＯＮＲ−ｌｉａＨとの間で、ＬＲリアクションによる組み換え反応を行い、得られたプラスミドを大腸菌ＤＨ５ａ株に導入した。導入株をＡｍｐ耐性マーカーにより選択し、選択株からｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨ（図６参照）を得た。得られたクローンについてはＰＣＲにより目的配列の挿入を確認した。
【００５０】
（６）ｐＧＥＸ−ｌｉａＲ
枯草菌１６８株のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてプライマー４９と５０（配列番号４９及び５０）によって増幅したｌｉａＩコーディング領域のＰＣＲ断片を、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩにより消化し、得られたＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍａｒｓｈａｍ）のＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ部位にクローニングすることによって、ｐＧＥＸ−ｌｉａＲ（図７参照）を作製した。得られたクローンについてはシークエンシングによって挿入塩基配列の確認を行った。
【００５１】
実施例２ 菌株作製
（１）ＢＡＢ１〜ＢＡＢ６：ｌｉａＩＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株
ノーマーカー削除法（特願２００９−０４４１９３）に従って、下記のとおりＢＡＢ１〜ＢＡＢ６株を作製した。
【００５２】
（ＢＡＢ１：ｌｉａＩノーマーカー削除株）
枯草菌１６８（aprE::spec, lacI, Pspac-chpA）株の染色体ＤＮＡを鋳型として、ＡＰＮＣ−Ｆプライマー（５１）とｃｈｐＡ−Ｒプライマー（５２）（配列番号５１及び５２）を用いてＰＣＲを行った。増幅したＤＮＡ断片を選択マーカー遺伝子カセットと称する。また、枯草菌１６８株の染色体ＤＮＡを鋳型として、欠失対象領域の５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）を、それぞれプライマー１と２（配列番号１及び２）、３と４（配列番号３及び４）及び５と６（配列番号５及び６）を用いてＰＣＲにより増幅した。
次に、これらＰＣＲによって得られた選択マーカー遺伝子カセット、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）、ならびにプライマー１と６（配列番号１及び６）を用いてＳＯＥ−ＰＣＲ法（Gene, 1989, 77(1):61-68）を行った。これにより、５’外側領域（断片Ａ）、３’外側領域（断片Ｂ）、選択マーカー遺伝子カセット及び第１相同組み換え領域上流（断片Ｃ）がこの順で配置した供与体ＤＮＡ断片（図２）を取得することができた。
上述のように取得された供与体ＤＮＡを用いて、コンピテントセル形質転換方法（J. Bacteriol., 1967, 93(6):1925-1937）に従って、枯草菌１６８株を形質転換した。形質転換は、ＰＣＲ産物を２０μｇ以上用いて行った。
得られた形質転換体を、供与体ＤＮＡに含まれるスペクチノマイシン耐性遺伝子を用いて選択した。すなわち、上記形質転換処理後の細胞を、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、コロニーを得た。この培養によれば、第１相同組み換え（図２）によって供与体ＤＮＡが組み込まれてスペクチノマイシン耐性を示す枯草菌のみが生育することとなる。
次に、スペクチノマイシン耐性を指標として選択された形質転換体をＬＢ液体培地で一晩培養し、希釈した培養液を１ｍＭ ＩＰＴＧを入れたＬＢ寒天プレートに塗布した。ＩＰＴＧ含有ＬＢ寒天プレート上に生育した形質転換枯草菌は、第２相同組み換え（図２）によって、欠失対象領域とともに供与体ＤＮＡが宿主ＤＮＡから欠失したｌｉａＩノーマーカー削除株である。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＩ遺伝子の欠失を確認した。
【００５３】
（ＢＡＢ２〜ＢＡＢ６：ｌｉａＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株）
上記（１）の選択マーカー遺伝子カセット及び表２−１〜２−２に記載のプライマーを用いて、上記と同様の手順を行うことによって、ｌｉａＨＧＦＳＲ各ノーマーカー削除株ＢＡＢ２〜ＢＡＢ６を作製した。得られた株について、ＰＣＲ法によりｌｉａＨＧＦＳＲ各遺伝子の欠失を確認した。
【００５４】
（２）ＢＡＢ７（１６８，ｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ）株
枯草菌１６８野生株を、実施例１（１）で作製したｐＭｕｔｉｎ１２Ｈｉｓ−ｌｉａＲにより形質転換し、０．５μｇ／ｍｌエリスロマイシンを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株として取得した。得られたｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株は、シークエンシングによりＬｉａＲのＣ末端に１２個のＨｉｓタグが付加していることを確認した（図３）。
【００５５】
（３）ＢＡＢ８（１６８，ａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ）株
実施例２（１）で作製したＢＡＢ２株（ｌｉａＨ削除株）を実施例１（２）で作製したｐＤＬ２−ｌｉａＩ (-120 to +84)により形質転換し、５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ株として取得した。得られたａｍｙＥ：：ＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺ株は、ＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にＰｌｉａＩ (-120 to +84)−ｌａｃＺが挿入されていることを確認した（図４）。
【００５６】
（４）ＢＡＢ９（ＢＡＢ２，ａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ）株
実施例２（１）で作製したＢＡＢ２株（ｌｉａＨ削除株）を実施例１（３）で作製したｐＸ−ｌｉａＨにより形質転換し、５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天平板培地で、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ株として取得した。得られたａｍｙＥ：：Ｐｘｙｌ−ｌｉａＨ株はＰＣＲにより枯草菌ａｍｙＥ領域にＰｘｙｌが挿入されていることを確認した（図５）。
【００５７】
（５）ＢＡＢ１０（ＢＡＢ２，ａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ）株
枯草菌１６８野生株を実施例１（５）で作製したｐＡＰＮＣＧＷ−ｌｉａＨにより形質転換し、１００μｇ／ｍｌスペクチノマイシンを含むＬＢ寒天平板培地、３７℃で一晩培養し、得られたコロニーをａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ株として取得した。得られたａｐｒＥ：：Ｐｓｐａｃ−ｌｉａＨ株はＰＣＲにより枯草菌ａｐｒＥ領域にＰｓｐａｃ−ｌｉａＨが挿入されていることを確認した（図６）。
【００５８】
実施例３ ＬｉａＲＳによる標的遺伝子転写誘導
（１）ｌｉａＩ転写誘導の抗生物質間での比較
（方法）
ＲＮＡハイブリダイゼーションプローブの調製： Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を付加したプライマー４７、４８（配列番号４７、４８）を作製し、これらプライマー４７、４８を用いて枯草菌野生株ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、ｌｉａＩ配列を増幅した。得られたＰＣＲ断片をＤＩＧ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）のマニュアルに従いジゴキシゲニン標識を行った。
抗生物質ストレス負荷： 枯草菌野生株１６８、ならびに実施例２で作製したＢＡＢ６（ΔｌｉａＲ）及びＢＡＢ２（ΔｌｉａＨ）の各菌株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養した。次いで最終濃度０．０２５μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、５０μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎをそれぞれ添加して、１５分後に菌を採取し、トータルＲＮＡを調製した。対照として、それぞれの株について抗生物質非添加条件でＲＮＡを調製した。トータルＲＮＡの調製はIgo & Losick （J. Mol. Biol., 1986, 191, 615-624.）の方法に従って行った。
ノーザンハイブリダイゼーション： 調製したトータルＲＮＡ １μｇを１％ ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ−ａｇａｒｏｓｅゲルで電気泳動し、ナイロンメンブラン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ+、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｈｉａ）にブロッティングを行った。ブロッティング後のメンブランはＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ １８００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてクロスリンク後、上記で調製したジゴキシゲニンラベルしたＲＮＡプローブを用いて６８℃で１０時間ハイブリダイゼーションを行った。シグナルの検出にはＣＳＰＤ（登録商標）ｒｅａｄｙ ｔｏ ｕｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。
ウエスタンブロッティング： 実施例２で作製したｌｉａＲ−１２ｈｉｓ株（ＢＡＢ７）をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２になるまで培養し、次いで最終濃度０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎをそれぞれ加えた後、０、１５、３０、４５、６０、７５分後に培養液を採取し、集菌した菌体のＯＤ＝６００が、１０ ＯＤ／ｍｌになるように０．５ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを加えた１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に懸濁し、３７℃で１０分間処理した。その後、１／４量の５×ＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加え、９５℃で５分間処理した。得られたサンプル２μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にブロッティングし、その後、一次抗体Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体、次いで二次抗体Ａｎｔｉ−Ｒａｂｉｔ ＩｇＧ ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）を膜に反応させ、ＥＣＬ ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてシグナルを検出した。
【００５９】
（結果）
ノーザンハイブリダイゼーションの結果を図８Ａに示す。抗生物質非添加の対照群及びｌｉａＲ削除株（ＢＡＢ６:レーン２）、ではｌｉａＩ遺伝子の転写誘導は見られなかった。一方、構成物質を添加した野生株及びｌｉａＨ削除株（ＢＡＢ２:レーン３）では強い転写誘導が観察された。さらに、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、２０００分の１の添加濃度にもかかわらず、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ添加群と同等以上の転写が観察されたことから、ＬｉａＲＳ系によるｌｉａＩＨオペロンの転写誘導はｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎにより顕著に活性化されることが示された。
【００６０】
ウエスタンブロッティングの結果を図８Ｂに示す。ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、１０００分の１の添加濃度にもかかわらず、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ添加群と同等以上のＬｉａＲ−Ｈｉｓタンパク質の誘導が観察された。また、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎによる転写活性化がストレス負荷後６０分程度で終息するのに対し、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ添加群では、ストレス負荷後７５分を経過してもなお高いＬｉａＲ−Ｈｉｓタンパク質の誘導が観察された。
【００６１】
（２）異なるストレス因子間での転写誘導の比較
（方法）
細胞壁ストレス負荷： 実施例２で作製したＢＡＢ８株をＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養し、次いで様々な細胞壁ストレスを加え、３０分後に集菌した。細胞ストレスは０．１μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ、１００μｇ／ｍｌ ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ、２μｇ／ｍｌ ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ、４％エタノール、０．６Ｍ ＮａＣｌ、ならびに３０℃および４０℃の熱ショックをそれぞれ行った。対照として抗生物質非添加群を調製した。
ＬａｃＺアッセイ： ＬａｃＺアッセイはYoungman et al.（In Molecular Biology of Microbial Differentation. 1985, American Society for Microbiology Washington D.C., pp47-54）の方法に従った。細胞を１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、１００μｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅを含む、２００μｌ Ｚ ｂｕｆｆｅｒ（０．０６Ｍ Ｎａ2ＨＰＯ４、０．０４Ｍ ＮａＨ2ＰＯ４、０．０１Ｍ ＫＣｌ、０．００１Ｍ ＭｇＳＯ4、０．００１Ｍ ＤＴＴ）に懸濁し、３７℃で２０分インキュベートして細胞を溶解し、１４０００ｒｐｍ、２分間、４℃で遠心を行い、得られた上清５０μｌに０．４ｍｇ／ｍｌ ＭＵＧ１０μｌを加え、３７℃で１０分間反応させた後、９５℃で１０分間処理して反応を停止させた。４ＭＵの蛍光はＦｌｕｏｒｏｓｃａｎ ＩＩ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。また、上清のタンパク質量はＰｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて定量し、サンプル間の補正に使用した。
【００６２】
（結果）
ＬａｃＺアッセイの結果を図９に示す。ＢＡＢ８株において、ＰｌｉａＩＨの転写量のレポーターであるＬａｃＺの活性が抗生物質によって顕著に向上した。特に、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎは、ｂａｃｉｔｒａｃｉｎの１０００分の１、及びｖａｎｃｏｍｙｃｉｎの２０分の１の濃度で高い効果を示した。またエタノールによって僅かにＰｌｉａＩＨからの転写の誘導が観察された。
【００６３】
（３）異なるプロモーター間での転写誘導の比較
（方法）
野生株１６８株、実施例２で作製したＢＡＢ９株及びＢＡＢ１０株をそれぞれＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１で殖菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．２まで培養した。次いで、１６８株の培地には０．０５μｇ／ｍｌ ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを、ＢＡＢ９株の培地には２％ ｘｙｌｏｓｅを、ＢＡＢ１０株には１ｍＭ ＩＰＴＧをそれぞれ添加した。１５分後に菌を採取し、トータルＲＮＡを調製し、（１）と同様の手順でノーザンハイブリダイゼーションを行った。
結果を図１０に示す。ＬｉａＲＳ系による転写誘導は、ＩＰＴＧやキシロースによる誘導と比較して顕著に強力であった。
【００６４】
参考例１ ＬｉａＲ結合領域の同定
（１）方法
（ＧＳＴ−ＬｉａＲ融合タンパク質の精製）
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株に実施例１で作製したｐＧＥＸ ４．１−ｌｉａＲを導入し、ＬＢ培地で３０℃にて一晩培養した培養液を８００ｍｌのＬＢ培地にＯＤ０．０１になるように殖菌し、３０℃でＯＤ０．５まで培養した。この培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに３時間培養した。この細胞を遠心機により集菌し、ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ；１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０．１ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4、１．８ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、ｐＨ７．３）２０ｍｌに再懸濁し、超音波により破砕した。この細胞破砕液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心を行い、ＧＳＴ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＧＥ）を用い、添付マニュアルに従い精製を行った。
（ゲルシフトアッセイ）
ＤＮＡ断片はｌｉａＩの転写開始点の−９５から＋２５までの１２１ｂｐを、プライマー４５、４６（配列番号４５、４６）を用いてＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ産物を、Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）と［γ32Ｐ］ＡＴＰとを３７℃で３０分反応させることにより標識した。標識したＤＮＡはＮｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製した。ＤＮＡとタンパク質の結合反応は２５ｐｍｏｌ（５０００ｃｐｍ）のｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ、１μｌ Ｐｏｌｙ ｄＩ−ｄＣ、５×ｂｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４、２５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２５０ｍＭ ＫＣｌ、２５０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ ｓａｌｍｏｎ ｓｐｅｒｍ ＤＮＡ、５０％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）とＧＳＴ−ＹｖｑＣ ｐｒｏｔｅｉｎ（０−５０ｐｍｏｌ）と水をトータル１５μｌになるように混ぜ、３０℃で１５分間インキュベーションを行ったあと、５％ ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。シグナルはイメージングプレートとＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ ｆｉｌｍ）を用いて検出を行った。
【００６５】
（２）結果
ゲルシフトアッセイの結果を図１１に示す。ｌｉａＩの転写開始点の−９５から＋２５領域（図１１Ｂ）とＬｉａＲタンパク質との結合量は、ＬｉａＲタンパク質の濃度とともに増加した（図１１Ａ）。よって当該−９５から＋２５領域とＬｉａＲタンパク質とが能動的に結合していることが示された。
【００６６】
参考例２ ＬｉａＲとｌｉａＩＨプロモーターとの結合の特異性
（１）方法
（ＣｈＡＰ−ｃｈｉｐアッセイ）
ＣｈＡＰ法によるＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質の精製は、Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法（Ishikawa et al., DNA Res. 2007, 14(4) 155-168）の方法を改変して行った。ＬＢ液体培地、３７℃で一晩培養した１６８ ｌｉａＲ−１２Ｈｉｓ株を４００ｍｌのＬＢ培地にＯＤ６００＝０．０１になるように殖菌し、Ｏ．Ｄ６００＝０．２まで培養した後に最終濃度０．０２５μｇ／ｍｌのｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを加えた。対照として、ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎ非添加群を作製した。さらに３０分培養後、最終濃度１％のホルムアルデヒドを加え、３７℃で３０分間クロスリンク処理を行った。その後、細胞を遠心して集菌し、３ｍｌのＵＴ ｂｕｆｆｅｒに懸濁し、超音波により破砕した。この細胞液を８０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心し、上清からＮｉビーズを用いてＬｉａＲ−１２Ｈｉｓの精製を行った。その後、上記Ｉｓｈｉｋａｗａらの方法に従い、枯草菌用に作られたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（ＢＳＴＩＬＥ２ｂ520515F）を用いてＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質の枯草菌ＤＮＡ結合部位の解析を行い、結果をＩＭＣ ＡＥ（Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｂｉｏｌｏｇｙ）プログラムにより視覚化した。
【００６７】
（２）結果
ｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎを負荷した場合、ｙｖｑＩ（ｌｉａＩ）から下流において遺伝子の転写が強力に誘導された。一方、対照群においてはｙｖｑ（ｌｉａ）遺伝子の転写誘導は見られなかった（図１２Ａ）。これらの結果は、上記ノーザンハイブリダイゼーション及びＬａｃＺ解析の結果と一致する。また、ＣｈＡＰ−ｃｈｉｐ解析（図１２Ｂ）により、ＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質が枯草菌ｌｉａＩＨプロモーター領域に特異的に結合することが示された。ゲノム全体における解析において、ＬｉａＲ−１２Ｈｉｓタンパク質が結合する箇所は上記ｌｉａＩＨプロモーター領域のみであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
【請求項２】
細胞壁ストレスが抗生物質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
微生物がバチルス属細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的遺伝子が異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、且つ該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が作動可能に連結されている組換え微生物。
【請求項８】
前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とが組み込まれた発現ベクターを有する請求項７記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とがゲノムに組み込まれている請求項７記載の組換え微生物。
【請求項１０】
微生物がバチルス属細菌である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組換え微生物に細胞壁ストレスを負荷する工程を特徴とする、目的遺伝子産物の生産方法。
【請求項１３】
細胞壁ストレスが抗生物質である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、請求項１３記載の方法。
【請求項１】
微生物において標的遺伝子の転写を促進する方法であって、ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有する微生物において、該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に該標的遺伝子を作動可能に連結させる工程、ならびに該微生物に細胞壁ストレスを負荷して該ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子の発現を活性化させる工程を含む、方法。
【請求項２】
細胞壁ストレスが抗生物質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
微生物がバチルス属細菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
標的遺伝子が異種タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ＬｉａＲ及びＬｉａＳをコードする遺伝子又はこれらに相当する遺伝子、ならびにｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡを有し、且つ該ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡの下流に目的遺伝子産物をコードする遺伝子が作動可能に連結されている組換え微生物。
【請求項８】
前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とが組み込まれた発現ベクターを有する請求項７記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記ｌｉａＩＨプロモーターＤＮＡ又はこれに相当するＤＮＡと前記目的遺伝子産物をコードする遺伝子とがゲノムに組み込まれている請求項７記載の組換え微生物。
【請求項１０】
微生物がバチルス属細菌である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
バチルス属細菌が枯草菌又はその変異株である、請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組換え微生物に細胞壁ストレスを負荷する工程を特徴とする、目的遺伝子産物の生産方法。
【請求項１３】
細胞壁ストレスが抗生物質である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
抗生物質がｅｎｄｕｒａｃｉｄｉｎである、請求項１３記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１１−９２０５６（Ｐ２０１１−９２０５６Ａ）
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２４７８９０（Ｐ２００９−２４７８９０）
【出願日】平成２１年１０月２８日（２００９．１０．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月８日「国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学の博士論文公聴会」において文書をもって発表
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年５月１２日（２０１１．５．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月２８日（２００９．１０．２８）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２１年９月８日「国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学の博士論文公聴会」において文書をもって発表
【出願人】（００００００９１８）花王株式会社 (8,290)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【Ｆターム（参考）】
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