部位−特異的ヌクレアーゼを用いた標的ゲノムの再配列
本発明は、ゲノムＤＮＡを再配列させる方法に関し、より詳細にはゲノムの２つの部位またはそれ以上を標的する部位−特異的ヌクレアーゼの対を使用してゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換、または再配列させる方法、前記方法によってゲノムＤＮＡが欠失、重複、逆位、置換、または再配列された細胞、前記部位−特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。また、本発明はゲノムの予定された部位を標的する部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムに合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法、前記方法によってＤＮＡ挿入が発生した細胞、及び前記部位−特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はゲノムＤＮＡを再配列させる方法に関し、より詳細にはゲノムの２つまたはそれ以上の部位を標的する部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換、または再配列させる方法、前記方法によってゲノムＤＮＡが欠失、重複、逆位、置換、または再配列された細胞、前記部位−特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。また、本発明はゲノム内の特定の部位を標的する部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムに合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法、前記方法によってＤＮＡ挿入が発生した細胞、及び前記部位−特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の遺伝子工学で広く使用されているＤＮＡ組換え技術は、生命科学(life science)発展に中枢的な役割を果たしたし、生命工学(biotechnology)産業の誕生に直接的な動機として作用した。制限エンドヌクレアーゼ(restriction endonuclease)は、ＤＮＡ組換え技術の主要成分であり、試験管内でＤＮＡ断片を切って貼り付けるのに使用される。しかし、この制限酵素はＤＮＡをあまりにも頻繁に切断するから細胞内でゲノムスクリプト(script)の操作に使用できない。したがって、ＤＮＡ組換え技術は、生体内ではなく、試験管内での制限酵素(restriction enzyme)の使用に制限される。次世代ＤＮＡ配列分析技術によって多くの生物のゲノムは、加速相で配列分析され、急速な進歩がポストゲノム(post-genomic)時代でゲノムエンジニアリングのために要求される。新規なゲノムエンジニアリングアプローチとして本願で定義された、細胞内ＤＮＡ組換え技術は、ｉ）高等真核細胞及び生物のゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失、ｉｉ）ゲノムの予定された部位内への合成オリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)カセットの標的された挿入、及びｉｉｉ）合成されたＤＮＡ分子などによるゲノムＤＮＡ断片の置換を許容し、新しい次元の生物学、医学、及び生命工学に追加され得る。
【０００３】
現在のゲノムエンジニアリング方法は、細胞内ＤＮＡ組換え技術として多目的ツールになるのに不足である。例えば、ゲノムエンジニアリングのために最も普遍的に使用されるゲノム内への外来ＤＮＡ断片のランダム組込みの方法は、外因性(exogenous) 断片と係わるエンハンサー要素(element)またはプローモーターの偶然な挿入に起因して所望しない遺伝子などの活性化または内因性(endogenous)遺伝子の破壊の可能性がある。相同組換え(Homologous recombination、ＨＲ)を介する遺伝子標的化は、ゲノムスクリプトの精巧な操作が許容されるが、これの効率が低いため大部分の高等真核細胞及び生物に制限的に使用されている。Ｃｒｅのような組換え酵素(recombinase)は、ゲノムエンジニアリングのツールとして使用され得るが、この酵素は酵素処理以後にもゲノムの中に残されるそれら自体の認識要素のゲノム内事前挿入が要求される。転移酵素(transposase)もゲノム内足跡(footprint)を残し、ゲノムスクリプトの標的された操作が許容されない。
【０００４】
長さ１０ｋｂｐ超過のゲノムＤＮＡの標的された欠失を発生させる能力は、遺伝子群、遺伝子間の領域、エクソン及びイントロンの選択的除去を許容するから新しい次元の遺伝学及びゲノム研究を確張するのみならず、研究、生命工学及び遺伝子治療に広範囲な適用を有するが、不可能でないとしても、高等真核細胞と生物でこの目的を達成することは難しい。マウス胚芽幹細胞でＣｒｅ／ｌｏｘＰ方法(Ramirez-Solis et al.，1995)またはＢＡＣ−ベース遺伝子標的化(Valenzuela et al.，2003)は、大きいゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失に使用される。しかし、このようなアプローチは他の細胞に比べて相同組換えを介する遺伝子操作がより容易なマウス胚芽幹細胞に事実上制限されている。さらに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ方法は相同組換え(ＨＲ)を介したゲノムへの２回ｌｏｘＰ挿入、他の相同染色体ではない同一染色体上に２つの標的部位が挿入された細胞の分離、及び標的された欠失の後、ゲノムで単一ｌｏｘＰ部位はずっと残され得る過程であるＣｒｅ組換え酵素での後続的処理で介在ＤＮＡ断片の除去を要求する。ＢＡＣ−ベース遺伝子標的化もこのベクターの巨大なサイズによってＢＡＣベクターの準備と組換えクローンのスクリーニングに関連された限界を有する。さらに、ＢＡＣベクターの破損と部分挿入によって偽陽性 (false positive)クローンがたびたび分離する (Gomez-Rodriguez et al.，2008)。したがって、これらのアプローチは、マウス胚芽幹細胞でも非常に時間と努力がかかり、現在まで他の高等哺乳類または植物細胞で予定されたゲノムＤＮＡ断片欠失に使用された事例がなかった。
【０００５】
部位−特異的ヌクレアーゼ(site-specific nuclease)とは、ＤＮＡ配列を特異的に認識及び切断できるすべての酵素を示し、部位−特異的ヌクレアーゼ中の一つであるジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease、以下、“ＺＦＮ”で示す)は、ゲノムエンジニアリングのために有望な新しいツールである。ＺＦＮは、人工酵素であって、ＤＮＡ−結合ジンクフィンガードメイン及びＦｏｋＩヌクレアーゼから由来したＤＮＡ切断ドメインから構成される。従来の組換え酵素とは異なり、ＺＦＮは再プログラミングが可能であり、また、オーダーメード型ヌクレアーゼはゲノム内の任意の予定された内因性部位を標的化して容易に生産することができる。ＺＦＮは細胞内で部位−特異的ＤＮＡ二重鎖破損(Double strand break、 以下、“ＤＳＢ”で示す)を誘導するための標的配列を認識し、この細胞は相同組換え(ＨＲ)及び非相同末端結合(non-homologous end joining、ＮＨＥＪ)として知られている２つの内因性機作によって修繕され、標的された突然変異(targeted mutagenesis)を誘発する。
【０００６】
ＺＦＮは哺乳動物細胞、植物、ゼブラフィッシュ、及びショウジョウバエで関心のある内因性遺伝子の不活性化または特定の突然変異導入を示す。しかし、既存の努力などはゲノムの予定された部位で地域突然変異である部位−特異的誘導のためのＺＦＮの有用性を立証し、細胞でのゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失、ゲノムへの合成オリゴヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)カセットの部位−特異的挿入、または細胞への合成ＤＮＡ要素及び内因性ＤＮＡ断片の標的置換を伴わなかった。したがって、ＺＦＮは、ゲノムエンジニアリングで有望のようであるが、今までは、細胞内組換えＤＮＡ技術に多目的ツールとして相変らず期待に達することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明者らはゲノムの欠失、挿入及び置換を誘導することができるＺＦＮを捜し出すために多くの努力をして来た。彼らは人間染色体で互いに異なる２つの部位を標的するようにデザインされたＺＦＮが染色体で２つのＤＳＢを導入することができ、数百の塩基対で１５Ｍｂｐ範囲のゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失が発生することを明らかにし、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つまたはそれ以上を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡの欠失、重複、逆位、置換または再配列させる方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記方法でゲノムＤＮＡ断片を欠失、重複、逆位、置換または再配列させた細胞を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムに予定された部位を切断する段階を含む、合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、前記方法で予定されたゲノム部位に合成ＤＮＡ分子を挿入させた細胞を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、（ａ）切断しようとする特異的塩基配列を決定する段階；（ｂ）塩基配列を認識するジンクフィンガーモジュールを選択する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階のジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを製造する段階；及び（ｄ）前記製造されたジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内に導入させる段階を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の大きいゲノムＤＮＡ断片を欠失、重複、逆位、置換、挿入、または再配列させ得る部位−特異的ヌクレアーゼ、具体的にジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、標的されたゲノムの欠失を介して関心のあるゲノムから遺伝子群を除去するのに使用されることができ、または幹細胞研究と遺伝子治療に適用することができる。また、重複を介して植物または動物の遺伝子量(gene dosage)の増加によって有用な生物を生産するのに使用するとか、または逆位を介して遺伝病患者の細胞及び癌細胞の治療ツールとして使用するとか、または置換及び挿入を介する作物、魚類、及び家畜を品種改良するのに使用するとか、または窮極的には、部位−特異的ヌクレアーゼを介して所望の遺伝子の標的化された突然変異を誘導するために使用して特異的にジンクフィンガーヌクレアーゼ誘導されたゲノム手術に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位にＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失を示す概略的な模式図であり、ジグザグ線はＺＦＮ標的部位を示し、Ｆ２とＲ５（矢印）はゲノム欠失現象(event)を検出するために使用されたＰＣＲプライマーである（ＤＳＢ、二重鎖破損）。
【図２】ＺＦＮで処理した細胞中のゲノムＤＮＡ欠失に該当するＰＣＲ産物を示し、ｐ３は陰性対照群として使用された空(empty)のプラスミドである。
【図３】ＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列を示し、ＰＣＲ産物をクローニング及び配列分析し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の非保存塩基は小文字で示し、発生回数(number of occurrences)は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図４】ＣＣＲ５座位内のＺＦＮによる２つの異なる欠失現象を模式図で示し、Ｆ５とＲ５（矢印）はＣＣＲ５コード塩基配列の増幅に使用されたプライマーである
【図５】ＣＣＲ５座位内に２つの異なる欠失現象を示すＰＣＲ分析結果であり、ここでは、図４で予想された通りであり、1328708113203_0の野生型配列(1,060bp)と欠失現象(（１）199bpと（２）331bp)に該当するＰＣＲ産物の近似値サイズが示され、ｐ３は陰性対照群として使用された空のプラスミドである。
【図６】ＣＣＲ５座位内の２つのＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失の切断接合部分(breakpoint junction)のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の非保存塩基は小文字で示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図７】染色体の記号上の標的部位の大きいネスト(large nested)されたゲノム欠失を示し、矢印は関連する染色体３領域の拡大された視野上のＺＦＮ標的部位の位置を示す。
【図８】大きいネストされた欠失を示すＰＣＲ分析結果であり、７つの新しいＺＦＮの各々とＳ１６２をＨＥＫ２９３細胞で同時発現し、ＰＣＲ分析に使用されたプライマーの配列は表２に整理されている。
【図９】大きい欠失の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図１０】大きい欠失の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図１１】ＺＦＮ−誘導された重複を模式図で示し、Ｆ５とＲ２（矢印）はゲノム重複現状の検出のために使用されたＰＣＲプライマーである。
【図１２】ＺＦＮ−誘導された重複を示すＰＣＲ分析結果であり、ｐ３は陰性対照群として使用された空のプラスミドである。
【図１３】ＺＦＮ−誘導された重複の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＣＣＲ５及びＣＣＲ２の各塩基配列は黒色及び灰色で示し、重複された塩基配列はＣＣＲ５コード領域の５’部分とＣＣＲ２コード領域の３’部分が直接連結されており、ＺＦＮ標的部位は太字で示され、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の非保存塩基は小文字で示し、発生回数は括弧内に示す。
【図１４】新しいＺＦＮの組み合わせで誘導された重複の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示す。
【図１５】ＺＦＮ−誘導された逆位を模式図で示し、ＰＣＲプライマーＦＡとＦＢは切断接合部分１の検出のために使用され、ＰＣＲプライマーＲＡとＲＢは切断接合部分２の検出のために使用された。“切断”はＺＦＮ−誘導されたゲノム切断を示し、“回転”は切断したＤＮＡが１８０゜回転したことを示し、“逆位”は非相同末端結合(ＮＨＥＪ)による切断部位の連結を示す。
【図１６】ＺＦＮ−誘導された逆位を示すＰＣＲ分析結果であり、６対の新しいＺＦＮの各々とＳ１６２をＨＥＫ２９３細胞で同時発現させ、ＰＣＲ分析に使用されたプライマー配列は表２に整理されている。
【図１７】逆位の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図１８】逆位の切断接合部分１のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示す。
【図１９】逆位の切断接合部分２のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示す。
【図２０】細胞のクローン集団の分析結果であり、ゲノム断片が欠失されたクローン細胞のＣＣＲ２とＣＣＲ５座位のＺＦＮ標的部位のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図２１】クローン細胞のサザンブロット分析結果であり、ゲノム欠失に該当する９．７ｋｂバンドはＣＣＲ２座位周辺ＤＮＡをプローブとして使用して検出し、ＸはＸｂａＩ制限部位を示し、Ｓ１６２はＺＦＮ標的部位を示し、白の矢印はＣＣＲ２コード領域を示し、灰色の矢印はＣＣＲ５コード領域を示し、ＷＴは野生型ＨＥＫ２９３細胞を示す。
【図２２】ＺＦＮ−誘導された挿入と置換を示す概略的な模式図である。ジグザグ線はＺＦＮ標的部位を示し、ＦとＲ（矢印）はゲノム挿入と欠失現象を検出するために使用されたＰＣＲプライマーであり、ＯＦとＯＲはオリゴヌクレオチドを示し、ｄｓＯＤＮカセットはＯＦとＯＲのアニーリングによって製造した。
【図２３】ＺＦＮと合成ＤＮＡ−処理された細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析結果であり、ｐ３は陰性対照群として使用された空のプラスミドであり、ＯＲ−３０とＯＲ−８９１はｄｓＯＤＮカセットを構成する一つの鎖のＯＤＮを示し、Ｆ−３０とＦ−８９１は合成ＤＮＡ挿入を検出するために使用されたプライマーである。
【図２４】Ｚ３０とｄｓＯＤＮカセットで処理した細胞から得たＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示し、ＰＣＲ産物をクローニングして配列分析したし、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図２５】Ｚ８９１とｄｓＯＤＮカセット−処理した細胞から得たＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示し、ＰＣＲ産物をクローニングして配列分析したし、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図２６】ＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮ(二重鎖オリゴヌクレオチド)でＣＣＲ５座位での挿入を示す。対照細胞から分離したゲノムＤＮＡの蛍光ＰＣＲ分析を示す。挿入ピークは対照群で示されなかったことが分かる。表示されたピーク面積の数はＤＮＡの量に比例する。
【図２７】ＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮ(二重鎖オリゴヌクレオチド)でＣＣＲ５座位での挿入を示す。ＺＦＮとともに処理された細胞から分離したゲノムＤＮＡの蛍光ＰＣＲ分析を示す。一つの星印(*)はＺＦＮ−誘導された欠失に該当するＤＮＡピークを示し、２つの星印(**)はＺＦＮ−誘導された特異的な５−ｂｐ挿入を示す。挿入ピークは対照君で示されなかったことが分かる。表示されたピーク面積の数はＤＮＡの量に比例する
【図２８】ＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮ(二重鎖オリゴヌクレオチド)でＣＣＲ５座位での挿入を示す。ＺＦＮ及びｄｓＯＤＮに処理された細胞から分離したゲノムＤＮＡの蛍光ＰＣＲ分析を示す。一つの星印(*)はＺＦＮ−誘導された欠失に該当するＤＮＡピーク(peak)を示す。２つの星印(**)はＺＦＮ−誘導された特異的な５−ｂｐ挿入を示し、三つの星印(***)はＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮのゲノム挿入を示した。表示されたピーク面積の数はＤＮＡの量に比例する
【図２９】ゲノムＤＮＡ断片の標的された置換を示す。ＺＦＮとともに処理した細胞からＣＣＲ２とＣＣＲ５との間の１５−ｋｂｐＤＮＡ欠失を確認できるＰＣＲを行った後、ＤＮＡはＥｃｏＲＩによって切断した。それぞれのレーン(lane)は陰性対照群として使用したｐ３を処理した細胞ゲノム、ＺＦＮ−処理した細胞、そして、ＺＦＮとｄｓＯＤＮカセットとをともに処理した細胞をＥｃｏＲＩで切断した結果を示す。矢印はｄｓＯＤＮカセット−由来したＥｃｏＲＩによって切断されたＤＮＡ断片を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
前記目的を達成するための一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位またはそれ以上を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換または再配列させる方法に関する。
【００１６】
本発明で使用される用語“部位−特異的ヌクレアーゼ”とは、ゲノム内ＤＮＡの標的部位を認識及び切断できるヌクレアーゼを意味し、本発明の目的のゲノム内標的部位を認識するドメインと切断するドメインとが融合されたヌクレアーゼが含めることができる。その例として、変形されたメガヌクレアーゼ(meganuclease)、植物病原性遺伝子(ゲノムの標的部位を認識するドメイン)から由来したＴＡＬ 作動体(transcription activator-like effector)ドメインと切断ドメインとが融合された融合タンパク質、及びジンクフィンガーヌクレアーゼが制限なく含めることができるが、より好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼである。
【００１７】
本発明で使用される用語“変形されたメガヌクレアーゼ”とは、ゲノム内ＤＮＡの１０ｂｐ以上を認識できる制限酵素の“メガヌクレアーゼ”を既存の分子生物学的方法を使用して新しいＤＮＡ切断特異性を有するように変形された酵素を意味する。
【００１８】
本発明で使用される用語“ジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease)”とは、ジンクフィンガードメイン及びヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を意味し、公知のまたは商業用ジンクフィンガーヌクレアーゼのすべてを含むことができる。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼに制限されるのではないが、表３に記載され、または好ましい一つの実施例で使用される任意の一つのジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。本発明で使用される用語“ジンクフィンガーヌクレアーゼ”と“ＺＦＮ”とは互換され得る。
【００１９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖破損に導入するために、例えば、ホモダイマー(homodimer)またはヘテロダイマー(heterodimer)のような二量体(dimers)として作用し、本発明の所望の目的を達成することができる。
【００２０】
一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)は二量体として作用するため、単一ＤＮＡ部位を標的するために２つのＺＦＮ単量体が必要である。２つのＺＦＮ単量体は各々、異なるＤＮＡ鎖中の２つのうち、一つのハーフサイト(half-site)を認識し、これらは５または６ｂｐスペーサーほど互いに離れている。また、単一ジンクフィンガーモジュールは、サブサイトの３ｂｐを認識し、これに結合するので、２つ〜４つのジンクフィンガーモジュールから構成されたジンクフィンガードメインは６〜１２ｂｐのＤＮＡ結合部位を認識する。
【００２１】
本発明で使用される用語“ジンクフィンガードメイン”とは、一つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを介して配列−特異的方式でヌクレオチドと結合するタンパク質をいう。ジンクフィンガードメインは、少なくとも２つのジンクフィンガーモジュールを含む。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰとしてしばしば省略されたりする。
【００２２】
本発明で使用される用語“ジンクフィンガーモジュール”とは、亜鉛イオンの配位を通じて構造が安定的で結合ドメインの内部にあるアミノ酸配列をいう。本発明のジンクフィンガーモジュールは、自然発生的、野生型ジンクフィンガーモジュールのものと同一の配列であるか、または、野生型配列の任意のアミノ酸を他のアミノ酸の置換によって変形された配列を有する。野生型ジンクフィンガーモジュールは、真核細胞、例えば、真菌(例えば、酵母)、植物または動物細胞(例えば、人間やマウスのような哺乳動物)から由来することができる。本発明で使用されたジンクフィンガーモジュールは、公知のモジュールと商業用のモジュールとを含むことができるが、これに制限されない。好ましく本発明のジンクフィンガーモジュールは、２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールであることができ、より好ましくは２つ〜４つのジンクフィンガーモジュール、さらに好ましくは３つジンクフィンガーモジュール、最も好ましくは下記表１に記載されたモジュールから選択することができる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
1ZF No.はAddgeneで使用するジンクフィンガーコンソーシアムモジュールアセンブリキット(Zinc Finger Consortium Modular Assembly Kit)１.０のナンバリングスキームに基づいた。
【００２５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガードメインは、３ｂｐのサブサイトを各々認識し、２つまたはそれ以上タンデム(tandem)配列されたジンクフィンガーモジュールから構成されている。各々のモジュールは独立的にＤＮＡ配列を認識するから、２つ〜４つのモジュールから構成されたジンクフィンガードメインは６または１２ｂｐ配列に結合することができる。したがって、二量体機能をするジンクフィンガーヌクレアーゼの場合、２つ〜４つのジンクフィンガーモジュールから構成されたジンクフィンガーヌクレアーゼ１対は、１２〜２４ｂｐ配列を特異的に認識する。具体例として、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガードメインが２つまたはそれ以上、好ましくは２つ〜４つ、及びより好ましくは３つのジンクフィンガーモジュールから構成されている。
【００２６】
本発明で使用される用語“切断”は、ヌクレオチド分子の共有結合されたバックボーンの連結を解除することを意味し、“切断ドメイン”とは、このようなヌクレオチド切断のための触媒の活性を有するポリペプチド配列を意味する。
【００２７】
前記切断ドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る模範的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼを含むことができるが、これに制限されない。このような酵素は切断ドメインのソースとして使用することができる。また、前記切断ドメインは単一鎖ヌクレオチド配列を切断することができ、その切断ドメインのソースに応じて二重鎖切断が発生することができる。この点で、二重鎖切断活性を持つ切断ドメインを切断ハーフ−ドメインとして使用することができる。
【００２８】
制限エンドヌクレアーゼは多くの種に存在し、ＤＮＡ(認識部位で)で配列特異的結合が可能であり、結合部位でまたはその辺りでＤＮＡを切断することができる。特定制限酵素(例えば、タイプＩＩｓ)は、認識部位から除去された部位でもＤＮＡを切断し、分離することができる結合ドメインと切断ドメインとを有する。例えば、タイプＩＩｓ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖でその認識部位から９ヌクレオチドで、及び他方の鎖でその意認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二重鎖切断を触媒する。
【００２９】
タイプＩＩｓ制限酵素の例はＦｏｋＩ、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＣｄｉＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦｉｎＩ、ＭｂｏＩ、ｓａｐＩ、及びＳｓｐＤ５１があるが、これに制限されるのではなく、より具体的な例はＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照する。
【００３０】
本発明で使用される用語“融合タンパク質”とは、ペプチド結合を介して２つ以上の異なるポリペプチドの連結によって形成されたポリペプチドを示す。ポリペプチドはジンクフィンガードメイン及びヌクレオチド切断ドメインとを含み、これはヌクレオチド配列中の任意の標的部位を切断することができる。融合タンパク質(または融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド)をデザインして構成する方法は、当該分野に広く知られている如何なる方法であってもよく、ポリヌクレオチドはベクターに挿入されることができ、ベクターは細胞内に導入することができる。一般的に融合タンパク質(例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合)の構成要素は、ジンクフィンガードメインは融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ末端)の最も近くに及び、切断ハーフドメインはカルボキシ末端(Ｃ末端)の最も近くに配列される。これはＦｏｋＩ酵素に由来した自然−発生切断二量体化ドメイン中の切断ドメインの相対的配向(orientation)を反映するが、ここでもＤＮＡ−結合ドメインはアミノ末端の最も近くに及び、切断−ハーフドメインはカルボキシ末端の最も近くにある。
【００３１】
本発明で使用される用語“ゲノムの予定された２つの部位”とは、ゲノム内切断するための標的部位を意味し、ゲノムとは、遺伝子群を有した染色体のセットを意味する。本発明でゲノム内標的部位は互いに異なり、したがって、各異なる部位の切断は本発明で意図する欠失、重複、逆位、置換または再配列を誘導することができる。
【００３２】
前記“ゲノムでの予定された２つの部位”とは、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって切断した部位であって、各々の部位は少なくとも６つの塩基対ほど離れている。
【００３３】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含み、ゲノムＤＮＡを欠失させる方法に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり、より好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼは１対または２対のＺＦＮであり、１対のＺＦＮはゲノム内の２つの部位を認識することができ、または、２つのＺＦＮ対の各々はゲノムの２つの異なる部位のうち一つを認識することができる。さらに好ましくは、２対のＺＦＮを使用することができ、２対のジンクフィンガーヌクレアーゼは同一であるか異なるジンクフィンガードメインを含むことができる。最も好ましくは、異なるジンクフィンガードメインを持つ２つのＺＦＮ対は、２つまたはそれ以上の異なる部位の標的された欠失を誘導するために機能する。
【００３４】
ＺＦＮによって欠失されたゲノムＤＮＡ断片は、宿主ゲノム内に挿入された内因性染色体断片または遺伝子導入カセットであり得る。
【００３５】
一般的に、単一ジンクフィンガーモジュールは３つの塩基対を認識することができる。本発明で使用した結合したＺＦＮ対は２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールからなっている。したがって、ゲノム内の２つの標的部位はジンクフィンガーモジュール２つを使用して認識することができる長さで少なくても６つの塩基対ほど離れていなければならない。もし２つのＺＦＮ標的部位の間の切断されたＤＮＡ断片の長さが５つの塩基対より小さいと、一方の対のジンクフィンガーヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡに、他方の対のジンクフィンガーヌクレアーゼが機能できなくなる。この場合、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼを構成するそれぞれの単量体は少なくとも２つのジンクフィンガーモジュールから構成されているので、少なくとも６つの塩基対を認識することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施例１で使用される人間ケモカイン(C-C motif)受容体コード化ＣＣＲ５とＣＣＲ２遺伝子は、３番染色体上に互いに隣接して位置しており、相同性が高い。このように、２つのＣＣＲ５とＣＣＲ２部位を標的するＺＦＮは１５ｋｂｐＤＮＡ断片の欠失を誘導することを確認し、ＺＦＮはゲノム内標的された２つの異なる部位に特異的なゲノム欠失が生ずることを示す(図２)。図３に示されたように、切断接合部分での小さな挿入／欠失の頻繁な観察は２つのＺＦＮ標的部位のスペーサー配列が一致する必要はないということを提案する。これはゲノム内の２対の特異的部位を認識できるジンクフィンガードメインが、標的された方法でゲノム欠失を誘導するために選択されることを示す。実施例２において、２つの異なるジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノム欠失を誘導することができるかどうかを確認するために、同じ染色体中の２つの非相同部位のうち１つを各々標的する２つのＺＦＮ対で実験を行った。その結果、２つの部位の間のゲノム欠失が発生したことを確認した(図４〜図６)。実施例３において、４つのジンクフィンガーモジュールから構成されたいくつかのＺＦＮが数十ｋｂｐ〜数十ｍｂｐ範囲のサイズのゲノム断片の大きい欠失を誘導するために使用されたことを確認した(図７〜図１０)。
【００３７】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含み、ゲノムＤＮＡを重複させる方法に関する。好ましくは前記部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。ジンクフィンガーヌクレアーゼの特徴は前述したゲノムＤＮＡを欠失させる方法と同様である。
【００３８】
２つの二重鎖破損が同一染色体で発生した場合、ゲノム欠失は分子内接合(intra-molecular joining)で発生する。一方、２つの二重鎖破損が２つの姉妹染色分体または２つの相同染色体中で別々に発生した場合、分子内接合によって一つの染色分体では欠失が、他の染色分体では重複が発生する。本発明のゲノムの予定された部位のゲノム重複は、遺伝子量(gene dosage)の増加を発生させ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる重複は常に欠失を伴うようになるから、一つの細胞内で重複された遺伝子の数は変化がないが、減数分裂の後、受精の間に３または４に遺伝子の数が増加することができる。したがって、本発明の重複方法は、植物または動物の遺伝子量を増加させて有用な個体を作るために使用することができる。
【００３９】
実施例４において、このようなゲノム重複は異なる部位を標的したジンクフィンガーヌクレアーゼ２対を発現させて確認した(図１２〜図１４)。
【００４０】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡを逆位させる方法に関する。好ましく部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼの特徴は前述したゲノムＤＮＡを欠失させる方法と同様である。
【００４１】
ゲノム逆位はゲノムの一部が元々のゲノムと反対であることを意味する。ゲノム逆位は頻繁に癌細胞と遺伝病患者の細胞で観察される。例えば、１０番染色体上の５００ｋｂｐ部分の逆位は、チェルノブイリ原子力発電事故のために電離放射線に被曝した甲状腺癌患者で発見され(Nikiforov et al.，1999; Nikiforova et al.，2000)、Ｘ染色体での因子ＶＩＩＩの逆位は、すべての深刻な血友病患者のうち、約半分で確認された(Lakich et al.，1993)。本発明のゲノム逆位方法は前記疾病の予防と治療に効果的に使用することができる。
【００４２】
実施例５において、ゲノム逆位はＰＣＲを使用してゲノムの２つの異なる部位を標的するジンクフィンガーヌクレアーゼを発現させて確認した(図１５及び図１６)。Ｉ−ＳｃｅＩと異なり、本発明のオーダーメード型ＺＦＮはゲノム内標的部位の事前導入をせずゲノム逆位を誘導することができる。
【００４３】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノム内の予定された２つの部位を切断する段階を含む、二重鎖オリゴヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)のような合成ＤＮＡ分子とゲノムＤＮＡとを置換させる方法に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼの特徴は前述したゲノムＤＮＡを欠失させる方法と同様である。
【００４４】
挿入及び置換に使用され得るＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドカセットだけでなくクローニングされた長いプローモーター、エンハンサー、遺伝子であり得る。この時、挿入させるＤＮＡの５’オーバーハング(overhang)はＺＦＮ作動によって発生された二重鎖破損の５’オーバーハング配列と相補的に作って、予定された方向での外来ＤＮＡ挿入を許容する。本発明のゲノム置換の方法は、遺伝子発現の活性のために低く発現される遺伝子の上流に強力なプローモーター及びエンハンサーを挿入するとか遺伝子発現の活性化のために強いプローモーターの下流に関心のある遺伝子を挿入するために使用することができる。
【００４５】
挿入及び置換に使用されたＤＮＡ分子は化学的に変形され得る。ｄｓＯＤＮの５’オーバーハングは内因性エキソヌクレアーゼによる消化を防止するために化学的に変形され得る。例えば、ヌクレオシド間の連結(inter-nucleoside linkage)のホスホロチオエート変形はオーバーハングを保護するのに使用され得る。
【００４６】
挿入及び置換方法は、一部ゲノムＤＮＡの転座(translocation)に使用することができる。すなわち、１番染色体に位置した遺伝子Ａと２番染色体に位置した遺伝子Ｂとを置換するのが可能である。その達成のために、遺伝子Ａの両末端にそれぞれ標的されたＺＦＮ２つと遺伝子Ｂの両末端にそれぞれ標的されたＺＦＮ２つとを、細胞内で発現させるために準備しなければならない。このようなゲノムシャフリングは、遺伝子と染色体との間の相互作用を研究するのに寄与することができ、作物、魚類、及び家畜の品種改良に使用され得る。
【００４７】
実施例９において、ゲノム置換は、ゲノムで欠失と挿入とが同時に発生されて置換がなり得るかどうかを調査して確認した(図２９)。
【００４８】
また一つの態様として、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換または再配列させた細胞に関する。好ましくは前記部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００４９】
細胞は、Ｅ.ｃｏｌｉのような原核細胞、または酵母、真菌、原生動物、高等植物、及び昆虫のような真核細胞、または両生類細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、及びＣＯＳ−１のような哺乳類細胞など、例えば、培養された細胞(in vitro)、移植細胞と初代細胞培養(in vitro及びex vivo)、及び生体内細胞、並びにまた人間を含んだ哺乳類の細胞が当業界で通常的に使用され、制限されない。
【００５０】
また一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された部位を切断する段階を含み、合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法に関する。好ましくは部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００５１】
本発明者らは、ジンクフィンガーヌクレアーゼによる人間培養細胞におけるゲノムＤＮＡ欠失でゲノムの挿入が可能であることを推論した。実施例７において、標的方法での合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド挿入を確認した(図２３〜図２５)。また、実施例８において、所望の部位に合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドが挿入されるのか確認した(図２６〜図２８)。事前に２つの二重鎖破損が要求される欠失とは異なり、挿入は事前に１つの二重鎖破損で十分である。
【００５２】
好ましい一実施態様において、合成ＤＮＡ分子はＤＮＡ合成機を使用して２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして準備することができる。この時、合成オリゴヌクレオチド自体を使用することもでき、合成オリゴヌクレオチド上に５’−リン酸基(phosphate group)を配置させて使用することもできる。好ましくはアニーリングして準備した合成ＤＮＡ分子が５’４ｂｐまたは５ｂｐのオーバーハングを有しており、オーバーハング配列はＺＦＮ作用によって発生されたオーバーハング配列と相補的に作る。
【００５３】
好ましい一実施態様において、合成ＤＮＡ分子はＰＣＲによって準備され得る。これとは異なり、合成ＤＮＡ分子はプラスミドのようなベクターにクローニングされたＤＮＡを制限酵素処理で得たＤＮＡ断片であり得る。
【００５４】
前記合成ＤＮＡ分子の長さと塩基配列とは、所望の突然変異によって任意的な方法で研究者らによってデザインされ得る。例えば、停止コドン(stop codon)をコードした合成ＤＮＡ分子をゲノムの遺伝子に挿入してその遺伝子発現を中断させることもでき、ＧＦＰとＦＬＡＧタグのようなアミノ酸配列がフレームに挿入され得る。合成ＤＮＡ分子はｃＤＮＡ配列全体または一部であってもよく、エンハンサー、プローモーター、エクソン、イントロンなどであってもよい。
【００５５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼは１対のジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。好ましい一実施態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを含むことができる。好ましくはジンクフィンガーモジュールは表１に記載されたモジュールのうちから選択され得る。ヌクレオチド配列の切断で、ジンクフィンガーヌクレアーゼは二量体として機能することができる。好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼは表３に記載されたもののうちの一つであり得る。
【００５６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用してゲノム中で合成ＤＮＡを挿入するとか置換する方法は、相同組換えを介した遺伝子標的化方法によるゲノムエンジニアリングに比べて大きい長所がある。第一に、遺伝子標的化方法は非常に低い効率を持つ。第二に、遺伝子標的化方法は挿入しようとする塩基配列両端に相同アーム(homology arm)の少なくとも１ｋｂｐを含む遺伝子標的化ベクターが要求される。有利に本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した挿入または置換方法は、遺伝子標的ベクターが要求されず、また、高い効率で突然変異が誘導される。
【００５７】
また一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用したゲノムの予定された部位を切断する段階を含み、合成ＤＮＡの挿入が発生した細胞に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００５８】
合成ＤＮＡ挿入は欠失、重複、逆位、置換と異なり、ゲノム内の予定された一つの部位の切断によって発生することができる。挿入のためには一対のＺＦＮの使用でも十分である。本発明の挿入方法によって高等真核細胞で高い再現性のあるゲノムの予定された部位への合成ＤＮＡ挿入ができる。
【００５９】
好ましい実施態様において、合成ＤＮＡの挿入はＰＣＲ結果で調査した(図２３〜図２５)。大部分のクローンは、いかなる小さな欠失や挿入もなく合成ＤＮＡカセットが完璧にジンクフィンガーヌクレアーゼによって標的された部位に挿入されたことを確認し、合成ＤＮＡカセットのオーバーハング配列は二重鎖破損のオーバーハング配列と相補的に作って部位−特異的突然変異を誘導することができることを示す。
【００６０】
また一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼに誘導されたゲノム手術(以下、“ＺｉＧＳ”という)に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００６１】
本発明の方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して高等真核細胞及び個体のゲノム内で標的された欠失と逆位とを誘導することができ、関心のあるゲノムから遺伝子群を除去することができる。動物研究やインビトロ(in vitro)実験で単一遺伝子をノックアウト(knock-out)させた時、ある識別可能な表現型の変化結果を示さない場合がしばしばある。大概、表現型マスキングは頻繁に相同遺伝子の存在に起因する。興味深いことに、相同遺伝子はゲノムでクラスター(cluster)化する傾向がある。例えば、本発明の好ましい実施例で使用したＣＣＲ２とＣＣＲ５とは染色体３ｐ２１に真横に互いに隣接している。本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、同一細胞でユニットとして相同遺伝子のクラスターを除去するのに使用することができる。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼ−誘導された欠失は、遺伝子間領域(intergenic region)とイントロンとを選択的に欠失させるのに使用することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは幹細胞または体細胞から疾病関連遺伝子を選択的に除去するのに使用することができる。遺伝子間領域またはイントロン中の２つの部位を標的することによってプローモーターやエクソンが欠失され得る。しかも、プローモーター領域を含むＤＮＡ断片の標的された欠失は関心のある遺伝子を完璧にノックアウトさせて表現型を１００％ヌル(null)にすることができる。このようにＺｉＧＳは高等真核細胞と個体でゲノム欠失及び逆位を誘導するのに使用され得る。
【００６２】
また一つの態様において、本発明は（ａ）切断しようとする特定塩基配列を決定する段階と、（ｂ）前記塩基配列を認識するジンクフィンガーモジュールを選択する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階のジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを製造する段階と、（ｄ）製造されたジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内に導入させる段階と、を含むジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。
【００６３】
前記（ａ）段階のヌクレオチド配列は、細胞内または外に存在することができ、その長さの制限はない。ヌクレオチド配列は円型、単一または二重鎖の形態で存在することができる。
【００６４】
前記（ｂ）段階は、前記塩基配列を認識するジンクフィンガーモジュールを選択する段階であって、ジンクフィンガーモジュールはどんな公知のモジュール及び商業用モジュールであってもよく、また、新しく合成されることもできる。
【００６５】
前記（ｃ）段階のジンクフィンガーモジュールは、２つまたはそれ以上のモジュールを含むことができ、好ましくは２つ〜４つのモジュールを含むことができ、より好ましくは３つのモジュールを含むことができる。好ましくは前記で製造されたジンクフィンガーヌクレアーゼは異なる部位を認識することができる１対のジンクフィンガーヌクレアーゼであることができ、または異なる部位を認識することができる２対のジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。さらに好ましくは２対のジンクフィンガーヌクレアーゼを製造することができる。
【００６６】
前記（ｄ）段階の細胞内にジンクフィンガーヌクレアーゼを導入させる方法は、当業界に知られた公知のどんな方法でも行うことができ、形質感染(transfection) または形質導入(transduction)によって外来ＤＮＡを細胞に導入させることもできる。形質感染は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿(co-precipitation)、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質感染、ポリブレン−媒介形質感染、電気穿孔、マイクロインジェクション法、リボソーム融合、リポフェクション及び原形質体融合を含む当業界に公知された多くの方法によって行われることができる。前記（ｄ）段階のジンクフィンガーヌクレアーゼの細胞内での発現は、当業界に知られたどんな方法によっても行うことができ、例えば、ベクターを使用することができる。ベクターの例として、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ及びウイルスベクターを含むが、これに制限されない。適合した発現ベクターはその目的に応じてプローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン(termination codon)、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節要素だけでなく分泌シグナル配列を含んで製造することができる。
【００６７】
参考文献
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Nikiforova, M.N., Stringer, J.R., Blough, R., Medvedovic, M., Fagin, J.A., and Nikiforov, Y.E. (2000). Science 290, 138-141.
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【００６８】
本明細書で言及される特許及び特許出願及び他のすべてのものを含むすべての参考文献はその全体が本明細書で参考として含まれる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明することにする。しかし、これらの実施例はただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されることに解釈されない。
【００７０】
実施例１：ＣＣＲ５−ＣＣＲ２欠失
＜１−１＞ＣＣＲ５−ＣＣＲ２欠失
ＣＣＲ５遺伝子を標的とするＺＦＮを製造した(Kim et al.，2009)。このＣＣＲ５−標的ＺＦＮの大部分は、ＣＣＲ２座位で該当する相同部位で部位−特異的ゲノムエディティング(editing)活性を示すことができるので、研究されたＺＦＮは各座位に部位−特異的点突然変異だけでなく大きいゲノム欠失を誘導することができた。
【００７１】
ＺＦＮ発現プラスミドをＨＥＫ２９３(Human embryonic kidney 293)細胞に形質感染(transfection)し、３日後に、それからゲノムＤＮＡを分離してゲノム欠失検出のためにＤＮＡ増幅のための鋳型として使用した。配列がＣＣＲ２領域またはＣＣＲ５領域に該当し、１６ｋｂｐ離れている２つのプライマーを使用した(図１)。実験に使用したプライマー配列は表２に整理した。
【００７２】
【表２】
【００７３】
その結果、ＰＣＲ産物は対照群の空のプラスミドで形質感染された細胞から観察されなかった。その標的部位がＣＣＲ５座位ＣＣＲ２座位との間に保存されている７つの異なるＺＦＮをそれぞれ発現させた細胞から増幅されたＤＮＡ断片が観察されたし(図２)、そのＰＣＲ産物のサイズは約１ｋｂｐであったし、これは２つのＺＦＮ標的部位の間のＤＮＡ断片が染色体から欠失された時に予想されるサイズであった。一方、Ｚ３０とＺ２６６とを発現させた細胞からは増幅されたＤＮＡ断片が観察されなかったし(ここで、数字はＣＣＲ５遺伝子の開始コドンに対するＺＦＮ切断部位の位置を示す)、その認識部位はＣＣＲ２座位で保存されず、その細胞でゲノム欠失が発生されなかったことを示唆する。
【００７４】
このような結果は、人間細胞内で大きいゲノム欠失を起こすためには、ＺＦＮが染色体でただ一つの二重鎖破損(ＤＳＢ)のみを発生させるのではなく、２つの二重鎖破損(ＤＳＢ)を発生させなければならないことを示す。
【００７５】
＜１−２＞ＣＣＲ２−ＣＣＲ５欠失の塩基配列分析
ＰＣＲ産物はそれらのＤＮＡ配列を決定するためにクローニングし、実際に ＣＣＲ２部位とＣＣＲ５部位とは結合されており、間には１５−ｋｂｐＤＮＡ断片が欠失されていることを示した(図３)。切断接合部分の塩基配列はＺＦＮのＤＮＡ切断パターンと一致した。ＺＦＮは二量体として機能し、各単量体は５または６ｂｐのスペーサーで離れている２つの９−ｂｐまたは１２−ｂｐのハーフ−サイト(half-site)のうち、一つを認識した。ＺＦＮはスペーサーでＤＮＡを切断し、５’に４または５−ｂｐのオーバーハングを発生させる(Smith et al.，2000)。ＰＣＲに使用したプライマー配列は表２に整理した。ＰＣＲ産物の配列分析は、ＣＣＲ２座位のハーフ−サイト（Ａ）がＣＣＲ５座位のハーフ−サイト（Ｂ）と直接連結され、ＣＣＲ２座位に他のハーフ−サイト（Ａ）からＣＣＲ５座位に他のハーフ−サイト（Ｂ）まで１５−ｋｂｐＤＮＡ幅が欠失されたことを示した。切断接合部分配列では１５−ｋｂｐ欠失だけでなく小さな(１−１４ｂｐ)挿入／欠失を示した(図３)。このような小さな挿入／欠失の突然変異パターンは非相同末端結合(以下、“ＮＨＥＪ”という)の特徴的な結果である。さらに、１−５塩基のマイクロホモロジー(microhomologies)が接合部分で観察された(図３)。
【００７６】
切断接合部分で小さな挿入／欠失が頻繁に観察されることは、ゲノム欠失を促進させるために２つのＺＦＮ標的部位のスペーサー配列が一致する必要はないということを示唆する。この点で本発明で使用したサンガモ(Sangamo Biosciences，Inc.)のＣＣＲ５−標的ＺＦＮに注目する価値がある(このＺＦＮはPerez et al． 2008でＺＦＮ−２１５としてデザインされたが、混乱を避けるために本発明ではＳ１６２と示す)。それぞれの異なる６つのＺＦＮはＣＣＲ５座位とＣＣＲ２座位とに保存されたスペーサー配列を有するが、Ｓ１６２はその座位で他のオーバーハング配列を発生した。すなわち、Ｓ１６２はＣＣＲ５座位で５’ＣＴＧＡＴ及びＣＣＲ２座位で５’ＡＴＴＡＡを(図３にその相補的配列を記述した)発生した。このようなオーバーハング配列はＤＮＡ修復の間に埋めたり除去される。Ｓ１６２を発現させた時に特異的な１５−ｋｂｐのゲノム欠失を観察した(図２及び図３)。
【００７７】
実施例２：２対のＺＦＮによる欠失
＜２−１＞２対のＺＦＮによる欠失
次に、異なる２つの部位を標的する２対のＺＦＮがＤＮＡ断片の間の欠失を誘導できることを確認した。この分析のために、ＣＣＲ５を標的するＺＦＮの２つのセットを選択し、Ｚ３０＋Ｚ８９１とＳ１６２＋Ｚ８９１との組み合わせを分析に使用した。２対のＺＦＮを発現させた細胞からゲノムＤＮＡを分離し、ＣＣＲ５コード配列を増幅した。ＰＣＲに使用したプライマー配列を表２に整理した。
【００７８】
その結果、全体ＣＣＲ５コード領域に該当する１，０６０ｂｐの増幅は野生型ゲノムＤＮＡ(ＤＮＡ欠失無し)で観察され、１９９ｂｐＤＮＡバンドと３３１ｂｐバンドとの増幅はＺ３０＋Ｚ８９１セットとＳ１６２＋Ｚ８９１セットとがそれぞれ発現する細胞で観察された(図４及び図５)。しかし、ＰＣＲ産物はＺＦＮを発現させないとかまたは２対のＺＦＮのうち、一対のＺＦＮのみを発現させた細胞では観察されなかった。
【００７９】
＜２−２＞２対のＺＦＮによる欠失の塩基配列分析
ＰＣＲ産物はクローニングして配列分析し、Ｚ３０＋Ｚ８９１を発現した細胞では約８６１ｂｐＤＮＡ断片とＳ１６２＋Ｚ８９１を発現した細胞では約７２９−ｂｐＤＮＡ断片の特異的な欠失を確認した(図６)。実施例１−２に記述したように、特異的な欠失だけでなくマイクロホモロジー及び小さな挿入／欠失はジョイント(joint)で観察した。このような結果は、ＤＮＡ欠失が非相同末端結合を介して媒介されたことを強く支持する。たとえＣＣＲ５座位で異なる２つの部位のうち、一つを標的とするそれぞれ２対のＺＦＮを使用した時でも、標的欠失は相変らず観察された。相同組換えが欠失現象の原因という可能性を排除した。
【００８０】
実施例１に記述したように、２つのＺＦＮ標的部位の異なるスペーサー配列はゲノム欠失が不可能ではない。例えば、Ｚ３０とＺ８９１とは、それぞれ５’ＡＴＧＴ(相補的な配列は図６に記述した)と５’ＣＣＴＴオーバーハングを発生するが、ＣＣＲ５座位に約８６１ｂｐＤＮＡ断片の欠失を起こすことができた。このような結果は、標的ゲノム欠失のためのＺＦＮデザインはＺＦＮ認識部位またはスペーサーの配列に制限されないということを示す。
【００８１】
実施例３：大きいネストされた欠失
２つのＺＦＮ対を使用して人間ゲノムからＤＮＡの非常に長い伸長(stretches)の欠失が可能かどうかを調査した。このために、ＣＣＲ５座位のはるか上流(upstream)の異なる標的部位であるＺＦＮ対のシリーズを合成した。人間またはショウジョウバエゲノムにコードされた１７の自然的−発生ジンクフィンガーを４−フィンガーＺＦＮを集合させるためのモジュールとして使用した(すなわち、ＺＦＮは４つのジンクフィンガーモジュールがタンデム配列されて構成)(表１)。
【００８２】
それぞれのジンクフィンガーモジュールは３ｂｐを認識し、１７個のジンクフィンガーのそれぞれは異なる３ｂｐのサブサイトを認識し、総括的に、６４個のトリプレットサブサイト(triplet sub-site)のうち、２１個をカバーする。ＺＦＮは二量体(dimer)として機能するから、一つの部位を標的するＺＦＮを準備するためには、部位当り２つの４−フィンガーＺＦＮ単量体を準備しなければならない。４−フィンガーＺＦＮは１２−ｂｐハーフ−サイトまたは２４−ｂｐフルサイトを認識する。全体３０対のＺＦＮを合成し、新しく準備したＺＦＮはＣＣＲ５座位の３０ｋｂｐ〜４６Ｍｂｐ上流の部位を認識する。
【００８３】
それぞれのＺＦＮ対を、ＣＣＲ５座位を標的するＳ１６２対とともに形質感染によってＨＥＫ２９３細胞で同時発現させた。スワップ(Swapped)された二量体の形成を防止するために、義務的ヘテロ二量体(obligatory heterodimer)のＳ１６２を使用した。二量体界面のアミノ酸残基の変化のため義務的ヘテロ二量体はホモ二量体(ＡＡまたはＢＢのような)またはスワップされた二量体(ＡＢのような)を形成しない(Miller et al.，2007)。したがって、Ｓ１６２を構成する各々の単量体は任意の新しいＺＦＮ単量体と二量体とを形成することができない(他の言及がない限り、本発明に使用した他のすべてのＺＦＮは野生型である)。
【００８４】
その結果、Ｓ１６２とともに同時発現された３０対のＺＦＮのうち、７対で全体欠失に該当するＰＣＲ産物を得た(これらＺＦＮに対する情報は下記表３に記載する)。ＰＣＲに使用されたプライマー配列は表２に整理した。
【００８５】
下記表３に示したＺＦＮは２つの単量体から構成された二量体として機能した。例えば、Ｋ３３をＫ３３ＲとＫ３３Ｆとの対で構成した。下記に記述したジンクフィンガーモジュールの名前は、塩基と相互作用すると期待される主要部位のアミノ酸残基４つから由来した。Ｆ１とＦ４とはそれぞれＮ末端のジンクフィンガーモジュールとＣ末端のジンクフィンガーモジュールとを示した。Ｆ２とＦ３とはＦ１とＦ４との間に位置するジンクフィンガーモジュールを示した。Ｆ１はＤＮＡの３’末端の３−ｂｐと結合し、Ｆ４はＤＮＡの５’末端３−ｂｐと結合した。ジンクフィンガーモジュールは“ＴＧＥＫＰ”アミノ酸によって互いに連結し、Ｆ４と“ＦｏｋＩ”制限酵素ドメインが（Ｆ４Ｈ）−ＴＧＥＫ−（ＦｏｋＩＱＬＶ）で連結した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
ＰＣＲ産物の配列分析はそれぞれゲノムＤＮＡ断片３３ｋｂｐ、２３０ｋｂｐ、２７６ｋｂｐ、７８１ｋｂｐ、８３５ｋｂｐと１５．１Ｍｂｐの大きい欠失をはっきりと確認し、小さな挿入／欠失とマイクロホモロジーも観察した(図７〜図１０)。新しく作ったＺＦＮまたはただＳ１６２のみ発現させた細胞ではＰＣＲ産物が観察されなかった。
【００８８】
また、Ｓ１６２不在での新しいＺＦＮの使用が、該当するゲノム欠失を生じさせることができるかどうかを調査した。７対の活性ＺＦＮの様々な組み合わせでそれぞれの場合に欠失を確認することができる。Ｋ２３０とＭ１５とが１４．９Ｍｂｐ(＝１５．１−０．２３)の欠失をもたらす。前記実施例１−２及び２−２のように、ＰＣＲ産物の配列分析でまた、ＺＦＮ−誘導された欠失がマイクロホモロジーと小さな挿入／欠失を伴うことを明らかにした(図９及び図１０)。
【００８９】
要約すると、ＺＦＮのさまざまな組み合わせを用いて、ＣＣＲ５座位内で２つの欠失(７３０ｂｐと８６１ｂｐ)、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の間の７つの異なる１５ｋｂｐ欠失、ＣＣＲ５座位とＣＣＲ５上流座位の間の７つの欠失(３３ｋｂｐ、２３０ｋｂｐ、２４３ｋｂｐ、２７６ｋｂｐ、７８１ｋｂｐ、８３５ｋｂｐ、１５．１Ｍｂｐ)、及びＣＣＲ５の２つの上流座位の間の３つの欠失(５３８ｋｂｐ、５５１ｋｂｐ、１４．９Ｍｂｐ)が、人間細胞内で観察された。この結果は、任意の２つの活性ＺＦＮを使用して人間細胞で特異的なゲノム欠失を生じさせることができることを示唆した。
【００９０】
実施例４：重複
ＺＦＮが人間細胞内で欠失だけでなく重複または逆位のようなゲノム再配列を誘導するかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【００９１】
図１１で例示したように、２つの姉妹染色分体(sister chromatid)の異なる部位で二重鎖破損が発生した後、互いの間に結合が発生すると、一つの染色分体でゲノム欠失が発生し、他の染色分体ではゲノム重複が発生するようになる。我々は重複の発生を確認するためにＰＣＲを使用した。
【００９２】
ＣＣＲ５とＣＣＲ２座位を標的するすべてのＺＦＮは、図１２に示すように、重複に該当するＰＣＲ産物を生成した。しかし、ＺＦＮを発現させない細胞(陰性対照細胞：図１２にｐ３で示す)と、認識部位がＣＣＲ５座位でだけ存在し、ＣＣＲ２にはないＺ３０とＺ２６６とを発現させる細胞では、増幅されたＤＮＡ断片を得ることができなかった(図２で示したように、Ｚ３０とＺ２６６とは１５−ｋｂｐＤＮＡ欠失を誘導しなかった)。ＰＣＲに使用されたプライマー配列は前記表２に整理した。
【００９３】
ＰＣＲ産物をクローニングし、配列分析してＣＣＲ５コード領域の５’部分とＣＣＲ２コード領域の３’部分が直接連結されていることを確認した(図１３)。
【００９４】
３０ｋｂｐまたはそれ以上のゲノム欠失を誘導するさまざまな組み合わせのＺＦＮで実験を行った。その結果、２つのＺＦＮ認識部位でＤＮＡの重複に該当するＰＣＲ産物はそれぞれのＺＦＮの組み合わせで処理されたすべての細胞から得ることができた(データは提示せず)。一方、ただ一つの部位のみを標的する1対のＺＦＮで処理した細胞からはＰＣＲ産物を得ることができなかった。欠失から分かるように、小さな挿入／欠失とマイクロホモロジーを重複の切断接合部分で観察した(図１４)。この結果は、非相同末端結合がＺＦＮ−誘導された重複に関与することを示唆した。
【００９５】
実施例５：逆位
逆位の機作を調査し、人間細胞内ＤＮＡ断片逆位復帰の可能性を調査するために、本発明者らはＨＥＫ２９３細胞での一時的ＺＦＮ発現後に示される現象を調査した。
【００９６】
図１５に示したように、ＺＦＮ−誘導された標的された逆位は同じ方向を指示するプライマーを使用し、ＰＣＲによって確認した。ＰＣＲに使用したプライマー配列は表２に整理した。逆位が発生しないならば、ＰＣＲ産物を得ることがなく、逆位が発生したら、予定されたサイズのＰＣＲ産物を得ることができる。
【００９７】
その結果、ＺＦＮ標的された２つの部位のさまざまな組み合わせとともに染色体３ｑ２１で２３０ｋｂｐ、２４３ｋｂｐ、２７６ｋｂｐ、７８１ｋｂｐ、８３５ｋｂｐ、１５．１Ｍｂｐのゲノム逆位に該当するＰＣＲ産物を観察した。しかし、ＺＦＮを発現させない細胞ではＰＣＲ産物を得ることができなかった(図１６)。
【００９８】
ＰＣＲ産物をクローニングし、配列分析して、これに該当する部位で実際に逆位が発生することを確認した(図１７〜図１９)。ゲノム逆位は２つの切断接合部分を発生させる。これらのそれぞれを配列分析し、このジャンクションで小さな欠失／挿入とマイクロホモロジーとを観察した。この結果は、非相同末端結合がＺＦＮ−誘導された逆位にも関与することを示唆した。
【００９９】
要約すると、この結果は、染色体上の二重鎖破損が、該当する領域のゲノム逆位を発生させ、逆位されたゲノム断片がＺＦＮによって復帰することができることを示唆した。
【０１００】
実施例６：細胞のクローン集団(clonal population)の分析
＜６−１＞ＰＣＲを使用した細胞のクローン集団分析
ＺＦＮに誘導されたゲノム欠失の頻度及び特性を調査し、標的されたゲノム欠失が発生したクローンをスクリーニングした。
【０１０１】
Ｓ１６２−処理された細胞をプレートで限界希釈して(９６ウェルプレート中０．７細胞／ウェル)１５日〜２１日培養した。細胞の分離されたクローン集団からゲノムＤＮＡを分離し、その後、ゲノム欠失を検出するためにＰＣＲによって分析した。ＰＣＲに使用されたプライマー配列は表２に整理した。
【０１０２】
その結果、２つのクローンで予想されたサイズの増幅されたＰＣＲ断片を得た。前記ＰＣＲ産物の配列分析は、２つの標的部位(ＣＣＲ２の一部位とＣＣＲ５座位の他の一部位)の間の１５ｋｂｐＤＮＡ断片の特異的欠失及び２つの終点の結合を確認した(図２０)。ＨＥＫ２９３は、多倍体細胞株で、３番染色体の少なくとも３つのコピーを含むようにした。クローン２では２つの異なる１５ｋｂｐ欠失に相応する塩基配列が示され、２つの相同染色体で欠失が発生したことを示した。クローン２は、他の３番染色体では１５ｋｂｐ欠失を示さなかったが、ＣＣＲ５座位でＳ１６２−誘導された局所的な突然変異(local mutation)が示された。クローン１は、ただ一つの相同染色体に１５−ｋｂｐ欠失を示し、他の相同染色体では１つの野生型塩基配列と３つの異なる突然変異を示した。クローン１は単一クローンではなく、２つのクローンの混合物として推定した。クローン１、２の両方で１５−ｋｂｐＤＮＡ重複が示さなかった。この結果は、欠失及び重複がいつも同時に発生しないとの予測と一致する。
【０１０３】
＜６−２＞サザンブロット分析
この細胞のクローン集団は、ゲノム欠失の存在を確認するためにさらにサザンブロッティングで分析した。クローン１と２及び野生型ＨＥＫ２９３からゲノムＤＮＡを分離し、ＸｂａＩを処理し、及び電気泳動した。ＣＣＲ２座位周辺のＤＮＡをプローブとして使用してゲノム突然変異(genome mutation)を確認した。
【０１０４】
図２１に示したように、クローン１と２から１５ｋｂｐ欠失に該当するＤＮＡバンドを観察した。本発明者らが分析した数十クローンのうち、２つのクローンでＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失を示し、ＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失の効率は２％またはそれ以上と推定した。この結果は、効率がＺＦＮによって標的された欠失を有する細胞を得るのに充分に高いことを意味する。
【０１０５】
実施例７：ゲノムへの合成ＤＮＡ分子の挿入
ＺＦＮ−誘導されたゲノム挿入の可能性を確認するために、小さなオリゴヌクレオチドの２つの鎖を合成し、二重鎖ＯＤＮ(oligodeoxynucleotide)カセットを準備するためにアニーリングし、ＺＦＮとともにＨＥＫ２９３細胞に形質感染させた。この実験のために、Ｚ３０とＺ８９１のそれぞれを使用した。Ｚ３０はＣＣＲ５座位を標的するために作り、５’−ＡＣＡＴ及び５’−ＡＴＧＴのオーバーハングを発生し、ｄｓＯＤＮカセットはこれと相補的な５’オーバーハングを有するようにデザインされた２つの相補的な２７−ｍｅｒＯＤＮ(図２２にＯＦ及びＯＲで示す)から構成した。Ｚ３０−発現させた細胞内でｄｓＯＤＮカセットの挿入を確認するために、カセットを構成するｄｓＯＤＮのうち、一つをプライマーとして使用してＰＣＲを行った。
【０１０６】
その結果、予想されたサイズのＤＮＡバンドを得た(図２３)。ＤＮＡバンドをクローニングし、配列分析して実際にゲノムにｄｓＯＤＮカセットが挿入されたことを確認した(図２４)。Ｚ８９１で類似した結果を示した(図２５)。
【０１０７】
実施例８：ＺＦＮによるゲノムの予定された部位への合成ＤＮＡ分子の標的された挿入
本発明者らはＺＦＮを使用して任意の他の高等真核細胞及び生物と人間の予定されたゲノムの座位内の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)カセット導入が可能であるかどうかを調査した。ＺＦＮ(Ｓ１６２)標的部位を含む、ＣＣＲ５座位に２８０ｂｐＤＮＡ断片を検出するためにＰＣＲプライマーをデザインした。プライマーのうち、一つは６−ＦＡＭ蛍光物質染色で末端標識した。蛍光ＰＣＲ分析は、ＺＦＮ対(Ｓ１６２)がコードされたプラスミドと適切な二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)とを同時形質感染させた細胞から分離されたゲノムＤＮＡを使用して行った。増幅されたＰＣＲ産物をＡＢＩ３７３０ｘｌＤＮＡ分析器を使用して分析した。その結果データはＡＢＩピークスキャナソフトウェアを使用して転換した。
【０１０８】
ＰＣＲ産物は下記プライマー対を使用して得た。
Ｚ３０Ｆ：５’−ＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’(配列番号３７)
Ｓ１６２Ｒ：５’−ＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧ−３’(配列番号３８)
【０１０９】
ＺＦＮを発現させない対照群細胞から分離したゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物は２８０−ｂｐＤＮＡ断片に該当する単一最大ピークを示した(図２６)。ＺＦＮの発現は、誘導されたインデル(indel、挿入と欠失)及びそれぞれ５ｂｐ挿入ピーク(**)及び欠失ピーク(*)にそれぞれ該当する長いＰＣＲ産物及び短いＰＣＲ産物を生成する(図２７)。ＺＦＮ及びｄｓＯＤＮで処理した細胞で増幅したＰＣＲ産物は注目するに値する(図２８)。５ｂｐ挿入ピークだけでなく、蛍光ＰＣＲは２８−ｂｐｄｓＯＤＮの挿入に該当する新しいピーク(***)を示した。この結果は、ＺＦＮを高い効率で人間細胞の予定されたゲノム座位への合成ｄｓＯＤＮカセット挿入に使用できることを示す。
【０１１０】
ｄｓＯＤＮカセットは下記の２つのＯＤＮをアニーリングして準備し、それぞれの５’末端に５ｂｐオーバーハングを有し、その配列はゲノムＺＦＮ標的部位で発生したオーバーハングと相補的である。
Ｓ１６２ ５Ｆ：５’−ＣＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧ−３’(配列番号３９)
Ｓ１６２ ５Ｒ：５’−ＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’(配列番号４０)
【０１１１】
実施例９：置換
本発明者らは、人間細胞でＺＦＮがゲノムＤＮＡ断片を合成ｄｓＯＤＮカセットで置換するために使用できるかどうかを調査した。すなわち、本発明者らはそれぞれＳ１６２及びＺ８９１である２つのＺＦＮを使用してＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の間の１５−ｋｂｐＤＮＡの欠失の結果生じる染色体ＤＮＡ断片を検出するためにＰＣＲを行った。ＥｃｏＲＩ部位を含むｄｓＯＤＮカセットはＨＥＫ２９３細胞内にそのＺＦＮをコードするプラスミドとともに同時形質挿入した。この実験で使用したプライマーは、図１で染色体欠失に使用したものと同様である(配列番号１８及び２１)。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩで消化してアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１１２】
ＺＦＮとｄｓＯＤＮカセットをともに処理した時、増幅されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとともに処理して電気泳動で分析した。その結果、カセットが挿入された時に期待できるＤＮＡバンドを観察し(図２９に矢印で表示)、一方、同じ試料にＥｃｏＲＩを処理しない場合には切断したＤＮＡバンドを観察できなかった。ｄｓＯＤＮカセットを追加せず、ＺＦＮのみ発現させた細胞から分離したゲノムＤＮＡでは、ＥｃｏＲＩによって切断したＤＮＡバンドを観察できなかった。ＺＦＮを発現させずｄｓＯＤＮカセットのみ追加した細胞においても、欠失に該当するＰＣＲ産物を観察できなかったが、増幅されたＰＣＲ産物は欠失を示すサイズのバンドだけ得た。ＺＦＮとｄｓＯＤＮカセットをともに処理した細胞から分離したゲノムＤＮＡを使用して増幅したＰＣＲ産物のみがＥｃｏＲＩ−依存ＤＮＡ切断を生じた。この結果はＺＦＮを使用してゲノムＤＮＡ断片を合成ｄｓＯＤＮカセットで置換できることを示した。
【０１１３】
本研究で使用したｄｓＯＤＮカセットは、下記２つのｄｓＯＤＮをアニーリングして準備し、５’末端に４ｂｐまたは５ｂｐオーバーハングを有し、その配列はゲノムＺＦＮ標的部位で発生したオーバーハングと相補的である。
Ｆ８９１ ＺＦＮ：Ｆ−８９１、５’−ＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧ−３’(配列番号４１)
ＯＲ−８９１、５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’(配列番号４２)
Ｓ１６２ ＺＦＮ：２−Ｆ−１６２、５’−ＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧ−３’(配列番号４３)
５−ＯＲ−１６２、５’−ＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’(配列番号４４)
【技術分野】
【０００１】
本発明はゲノムＤＮＡを再配列させる方法に関し、より詳細にはゲノムの２つまたはそれ以上の部位を標的する部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換、または再配列させる方法、前記方法によってゲノムＤＮＡが欠失、重複、逆位、置換、または再配列された細胞、前記部位−特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。また、本発明はゲノム内の特定の部位を標的する部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムに合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法、前記方法によってＤＮＡ挿入が発生した細胞、及び前記部位−特異的ヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の遺伝子工学で広く使用されているＤＮＡ組換え技術は、生命科学(life science)発展に中枢的な役割を果たしたし、生命工学(biotechnology)産業の誕生に直接的な動機として作用した。制限エンドヌクレアーゼ(restriction endonuclease)は、ＤＮＡ組換え技術の主要成分であり、試験管内でＤＮＡ断片を切って貼り付けるのに使用される。しかし、この制限酵素はＤＮＡをあまりにも頻繁に切断するから細胞内でゲノムスクリプト(script)の操作に使用できない。したがって、ＤＮＡ組換え技術は、生体内ではなく、試験管内での制限酵素(restriction enzyme)の使用に制限される。次世代ＤＮＡ配列分析技術によって多くの生物のゲノムは、加速相で配列分析され、急速な進歩がポストゲノム(post-genomic)時代でゲノムエンジニアリングのために要求される。新規なゲノムエンジニアリングアプローチとして本願で定義された、細胞内ＤＮＡ組換え技術は、ｉ）高等真核細胞及び生物のゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失、ｉｉ）ゲノムの予定された部位内への合成オリゴデオキシヌクレオチド(ＯＤＮ)カセットの標的された挿入、及びｉｉｉ）合成されたＤＮＡ分子などによるゲノムＤＮＡ断片の置換を許容し、新しい次元の生物学、医学、及び生命工学に追加され得る。
【０００３】
現在のゲノムエンジニアリング方法は、細胞内ＤＮＡ組換え技術として多目的ツールになるのに不足である。例えば、ゲノムエンジニアリングのために最も普遍的に使用されるゲノム内への外来ＤＮＡ断片のランダム組込みの方法は、外因性(exogenous) 断片と係わるエンハンサー要素(element)またはプローモーターの偶然な挿入に起因して所望しない遺伝子などの活性化または内因性(endogenous)遺伝子の破壊の可能性がある。相同組換え(Homologous recombination、ＨＲ)を介する遺伝子標的化は、ゲノムスクリプトの精巧な操作が許容されるが、これの効率が低いため大部分の高等真核細胞及び生物に制限的に使用されている。Ｃｒｅのような組換え酵素(recombinase)は、ゲノムエンジニアリングのツールとして使用され得るが、この酵素は酵素処理以後にもゲノムの中に残されるそれら自体の認識要素のゲノム内事前挿入が要求される。転移酵素(transposase)もゲノム内足跡(footprint)を残し、ゲノムスクリプトの標的された操作が許容されない。
【０００４】
長さ１０ｋｂｐ超過のゲノムＤＮＡの標的された欠失を発生させる能力は、遺伝子群、遺伝子間の領域、エクソン及びイントロンの選択的除去を許容するから新しい次元の遺伝学及びゲノム研究を確張するのみならず、研究、生命工学及び遺伝子治療に広範囲な適用を有するが、不可能でないとしても、高等真核細胞と生物でこの目的を達成することは難しい。マウス胚芽幹細胞でＣｒｅ／ｌｏｘＰ方法(Ramirez-Solis et al.，1995)またはＢＡＣ−ベース遺伝子標的化(Valenzuela et al.，2003)は、大きいゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失に使用される。しかし、このようなアプローチは他の細胞に比べて相同組換えを介する遺伝子操作がより容易なマウス胚芽幹細胞に事実上制限されている。さらに、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ方法は相同組換え(ＨＲ)を介したゲノムへの２回ｌｏｘＰ挿入、他の相同染色体ではない同一染色体上に２つの標的部位が挿入された細胞の分離、及び標的された欠失の後、ゲノムで単一ｌｏｘＰ部位はずっと残され得る過程であるＣｒｅ組換え酵素での後続的処理で介在ＤＮＡ断片の除去を要求する。ＢＡＣ−ベース遺伝子標的化もこのベクターの巨大なサイズによってＢＡＣベクターの準備と組換えクローンのスクリーニングに関連された限界を有する。さらに、ＢＡＣベクターの破損と部分挿入によって偽陽性 (false positive)クローンがたびたび分離する (Gomez-Rodriguez et al.，2008)。したがって、これらのアプローチは、マウス胚芽幹細胞でも非常に時間と努力がかかり、現在まで他の高等哺乳類または植物細胞で予定されたゲノムＤＮＡ断片欠失に使用された事例がなかった。
【０００５】
部位−特異的ヌクレアーゼ(site-specific nuclease)とは、ＤＮＡ配列を特異的に認識及び切断できるすべての酵素を示し、部位−特異的ヌクレアーゼ中の一つであるジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease、以下、“ＺＦＮ”で示す)は、ゲノムエンジニアリングのために有望な新しいツールである。ＺＦＮは、人工酵素であって、ＤＮＡ−結合ジンクフィンガードメイン及びＦｏｋＩヌクレアーゼから由来したＤＮＡ切断ドメインから構成される。従来の組換え酵素とは異なり、ＺＦＮは再プログラミングが可能であり、また、オーダーメード型ヌクレアーゼはゲノム内の任意の予定された内因性部位を標的化して容易に生産することができる。ＺＦＮは細胞内で部位−特異的ＤＮＡ二重鎖破損(Double strand break、 以下、“ＤＳＢ”で示す)を誘導するための標的配列を認識し、この細胞は相同組換え(ＨＲ)及び非相同末端結合(non-homologous end joining、ＮＨＥＪ)として知られている２つの内因性機作によって修繕され、標的された突然変異(targeted mutagenesis)を誘発する。
【０００６】
ＺＦＮは哺乳動物細胞、植物、ゼブラフィッシュ、及びショウジョウバエで関心のある内因性遺伝子の不活性化または特定の突然変異導入を示す。しかし、既存の努力などはゲノムの予定された部位で地域突然変異である部位−特異的誘導のためのＺＦＮの有用性を立証し、細胞でのゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失、ゲノムへの合成オリゴヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)カセットの部位−特異的挿入、または細胞への合成ＤＮＡ要素及び内因性ＤＮＡ断片の標的置換を伴わなかった。したがって、ＺＦＮは、ゲノムエンジニアリングで有望のようであるが、今までは、細胞内組換えＤＮＡ技術に多目的ツールとして相変らず期待に達することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明者らはゲノムの欠失、挿入及び置換を誘導することができるＺＦＮを捜し出すために多くの努力をして来た。彼らは人間染色体で互いに異なる２つの部位を標的するようにデザインされたＺＦＮが染色体で２つのＤＳＢを導入することができ、数百の塩基対で１５Ｍｂｐ範囲のゲノムＤＮＡ断片の標的された欠失が発生することを明らかにし、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つまたはそれ以上を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡの欠失、重複、逆位、置換または再配列させる方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記方法でゲノムＤＮＡ断片を欠失、重複、逆位、置換または再配列させた細胞を提供することである。
【００１０】
本発明のまた他の目的は、部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムに予定された部位を切断する段階を含む、合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、前記方法で予定されたゲノム部位に合成ＤＮＡ分子を挿入させた細胞を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、（ａ）切断しようとする特異的塩基配列を決定する段階；（ｂ）塩基配列を認識するジンクフィンガーモジュールを選択する段階；（ｃ）前記（ｂ）段階のジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを製造する段階；及び（ｄ）前記製造されたジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内に導入させる段階を含む、ジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の大きいゲノムＤＮＡ断片を欠失、重複、逆位、置換、挿入、または再配列させ得る部位−特異的ヌクレアーゼ、具体的にジンクフィンガーヌクレアーゼ対は、標的されたゲノムの欠失を介して関心のあるゲノムから遺伝子群を除去するのに使用されることができ、または幹細胞研究と遺伝子治療に適用することができる。また、重複を介して植物または動物の遺伝子量(gene dosage)の増加によって有用な生物を生産するのに使用するとか、または逆位を介して遺伝病患者の細胞及び癌細胞の治療ツールとして使用するとか、または置換及び挿入を介する作物、魚類、及び家畜を品種改良するのに使用するとか、または窮極的には、部位−特異的ヌクレアーゼを介して所望の遺伝子の標的化された突然変異を誘導するために使用して特異的にジンクフィンガーヌクレアーゼ誘導されたゲノム手術に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位にＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失を示す概略的な模式図であり、ジグザグ線はＺＦＮ標的部位を示し、Ｆ２とＲ５（矢印）はゲノム欠失現象(event)を検出するために使用されたＰＣＲプライマーである（ＤＳＢ、二重鎖破損）。
【図２】ＺＦＮで処理した細胞中のゲノムＤＮＡ欠失に該当するＰＣＲ産物を示し、ｐ３は陰性対照群として使用された空(empty)のプラスミドである。
【図３】ＰＣＲ産物のＤＮＡ塩基配列を示し、ＰＣＲ産物をクローニング及び配列分析し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の非保存塩基は小文字で示し、発生回数(number of occurrences)は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図４】ＣＣＲ５座位内のＺＦＮによる２つの異なる欠失現象を模式図で示し、Ｆ５とＲ５（矢印）はＣＣＲ５コード塩基配列の増幅に使用されたプライマーである
【図５】ＣＣＲ５座位内に２つの異なる欠失現象を示すＰＣＲ分析結果であり、ここでは、図４で予想された通りであり、1328708113203_0の野生型配列(1,060bp)と欠失現象(（１）199bpと（２）331bp)に該当するＰＣＲ産物の近似値サイズが示され、ｐ３は陰性対照群として使用された空のプラスミドである。
【図６】ＣＣＲ５座位内の２つのＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失の切断接合部分(breakpoint junction)のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の非保存塩基は小文字で示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図７】染色体の記号上の標的部位の大きいネスト(large nested)されたゲノム欠失を示し、矢印は関連する染色体３領域の拡大された視野上のＺＦＮ標的部位の位置を示す。
【図８】大きいネストされた欠失を示すＰＣＲ分析結果であり、７つの新しいＺＦＮの各々とＳ１６２をＨＥＫ２９３細胞で同時発現し、ＰＣＲ分析に使用されたプライマーの配列は表２に整理されている。
【図９】大きい欠失の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図１０】大きい欠失の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図１１】ＺＦＮ−誘導された重複を模式図で示し、Ｆ５とＲ２（矢印）はゲノム重複現状の検出のために使用されたＰＣＲプライマーである。
【図１２】ＺＦＮ−誘導された重複を示すＰＣＲ分析結果であり、ｐ３は陰性対照群として使用された空のプラスミドである。
【図１３】ＺＦＮ−誘導された重複の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＣＣＲ５及びＣＣＲ２の各塩基配列は黒色及び灰色で示し、重複された塩基配列はＣＣＲ５コード領域の５’部分とＣＣＲ２コード領域の３’部分が直接連結されており、ＺＦＮ標的部位は太字で示され、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の非保存塩基は小文字で示し、発生回数は括弧内に示す。
【図１４】新しいＺＦＮの組み合わせで誘導された重複の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示す。
【図１５】ＺＦＮ−誘導された逆位を模式図で示し、ＰＣＲプライマーＦＡとＦＢは切断接合部分１の検出のために使用され、ＰＣＲプライマーＲＡとＲＢは切断接合部分２の検出のために使用された。“切断”はＺＦＮ−誘導されたゲノム切断を示し、“回転”は切断したＤＮＡが１８０゜回転したことを示し、“逆位”は非相同末端結合(ＮＨＥＪ)による切断部位の連結を示す。
【図１６】ＺＦＮ−誘導された逆位を示すＰＣＲ分析結果であり、６対の新しいＺＦＮの各々とＳ１６２をＨＥＫ２９３細胞で同時発現させ、ＰＣＲ分析に使用されたプライマー配列は表２に整理されている。
【図１７】逆位の切断接合部分のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図１８】逆位の切断接合部分１のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示す。
【図１９】逆位の切断接合部分２のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示す。
【図２０】細胞のクローン集団の分析結果であり、ゲノム断片が欠失されたクローン細胞のＣＣＲ２とＣＣＲ５座位のＺＦＮ標的部位のＤＮＡ配列を示し、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、マイクロホモロジーは下線で示し、挿入塩基はイタリック体で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図２１】クローン細胞のサザンブロット分析結果であり、ゲノム欠失に該当する９．７ｋｂバンドはＣＣＲ２座位周辺ＤＮＡをプローブとして使用して検出し、ＸはＸｂａＩ制限部位を示し、Ｓ１６２はＺＦＮ標的部位を示し、白の矢印はＣＣＲ２コード領域を示し、灰色の矢印はＣＣＲ５コード領域を示し、ＷＴは野生型ＨＥＫ２９３細胞を示す。
【図２２】ＺＦＮ−誘導された挿入と置換を示す概略的な模式図である。ジグザグ線はＺＦＮ標的部位を示し、ＦとＲ（矢印）はゲノム挿入と欠失現象を検出するために使用されたＰＣＲプライマーであり、ＯＦとＯＲはオリゴヌクレオチドを示し、ｄｓＯＤＮカセットはＯＦとＯＲのアニーリングによって製造した。
【図２３】ＺＦＮと合成ＤＮＡ−処理された細胞のゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析結果であり、ｐ３は陰性対照群として使用された空のプラスミドであり、ＯＲ−３０とＯＲ−８９１はｄｓＯＤＮカセットを構成する一つの鎖のＯＤＮを示し、Ｆ−３０とＦ−８９１は合成ＤＮＡ挿入を検出するために使用されたプライマーである。
【図２４】Ｚ３０とｄｓＯＤＮカセットで処理した細胞から得たＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示し、ＰＣＲ産物をクローニングして配列分析したし、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図２５】Ｚ８９１とｄｓＯＤＮカセット−処理した細胞から得たＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示し、ＰＣＲ産物をクローニングして配列分析したし、ＺＦＮ標的部位は太字で示し、ダッシュ(−)は欠失された塩基を示し、発生回数は括弧内に示し、ＷＴは野生型ＤＮＡ配列を示す。
【図２６】ＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮ(二重鎖オリゴヌクレオチド)でＣＣＲ５座位での挿入を示す。対照細胞から分離したゲノムＤＮＡの蛍光ＰＣＲ分析を示す。挿入ピークは対照群で示されなかったことが分かる。表示されたピーク面積の数はＤＮＡの量に比例する。
【図２７】ＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮ(二重鎖オリゴヌクレオチド)でＣＣＲ５座位での挿入を示す。ＺＦＮとともに処理された細胞から分離したゲノムＤＮＡの蛍光ＰＣＲ分析を示す。一つの星印(*)はＺＦＮ−誘導された欠失に該当するＤＮＡピークを示し、２つの星印(**)はＺＦＮ−誘導された特異的な５−ｂｐ挿入を示す。挿入ピークは対照君で示されなかったことが分かる。表示されたピーク面積の数はＤＮＡの量に比例する
【図２８】ＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮ(二重鎖オリゴヌクレオチド)でＣＣＲ５座位での挿入を示す。ＺＦＮ及びｄｓＯＤＮに処理された細胞から分離したゲノムＤＮＡの蛍光ＰＣＲ分析を示す。一つの星印(*)はＺＦＮ−誘導された欠失に該当するＤＮＡピーク(peak)を示す。２つの星印(**)はＺＦＮ−誘導された特異的な５−ｂｐ挿入を示し、三つの星印(***)はＺＦＮ−誘導されたｄｓＯＤＮのゲノム挿入を示した。表示されたピーク面積の数はＤＮＡの量に比例する
【図２９】ゲノムＤＮＡ断片の標的された置換を示す。ＺＦＮとともに処理した細胞からＣＣＲ２とＣＣＲ５との間の１５−ｋｂｐＤＮＡ欠失を確認できるＰＣＲを行った後、ＤＮＡはＥｃｏＲＩによって切断した。それぞれのレーン(lane)は陰性対照群として使用したｐ３を処理した細胞ゲノム、ＺＦＮ−処理した細胞、そして、ＺＦＮとｄｓＯＤＮカセットとをともに処理した細胞をＥｃｏＲＩで切断した結果を示す。矢印はｄｓＯＤＮカセット−由来したＥｃｏＲＩによって切断されたＤＮＡ断片を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
前記目的を達成するための一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位またはそれ以上を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換または再配列させる方法に関する。
【００１６】
本発明で使用される用語“部位−特異的ヌクレアーゼ”とは、ゲノム内ＤＮＡの標的部位を認識及び切断できるヌクレアーゼを意味し、本発明の目的のゲノム内標的部位を認識するドメインと切断するドメインとが融合されたヌクレアーゼが含めることができる。その例として、変形されたメガヌクレアーゼ(meganuclease)、植物病原性遺伝子(ゲノムの標的部位を認識するドメイン)から由来したＴＡＬ 作動体(transcription activator-like effector)ドメインと切断ドメインとが融合された融合タンパク質、及びジンクフィンガーヌクレアーゼが制限なく含めることができるが、より好ましくはジンクフィンガーヌクレアーゼである。
【００１７】
本発明で使用される用語“変形されたメガヌクレアーゼ”とは、ゲノム内ＤＮＡの１０ｂｐ以上を認識できる制限酵素の“メガヌクレアーゼ”を既存の分子生物学的方法を使用して新しいＤＮＡ切断特異性を有するように変形された酵素を意味する。
【００１８】
本発明で使用される用語“ジンクフィンガーヌクレアーゼ(zinc finger nuclease)”とは、ジンクフィンガードメイン及びヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質を意味し、公知のまたは商業用ジンクフィンガーヌクレアーゼのすべてを含むことができる。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼに制限されるのではないが、表３に記載され、または好ましい一つの実施例で使用される任意の一つのジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。本発明で使用される用語“ジンクフィンガーヌクレアーゼ”と“ＺＦＮ”とは互換され得る。
【００１９】
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖破損に導入するために、例えば、ホモダイマー(homodimer)またはヘテロダイマー(heterodimer)のような二量体(dimers)として作用し、本発明の所望の目的を達成することができる。
【００２０】
一般的に、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ＺＦＮ)は二量体として作用するため、単一ＤＮＡ部位を標的するために２つのＺＦＮ単量体が必要である。２つのＺＦＮ単量体は各々、異なるＤＮＡ鎖中の２つのうち、一つのハーフサイト(half-site)を認識し、これらは５または６ｂｐスペーサーほど互いに離れている。また、単一ジンクフィンガーモジュールは、サブサイトの３ｂｐを認識し、これに結合するので、２つ〜４つのジンクフィンガーモジュールから構成されたジンクフィンガードメインは６〜１２ｂｐのＤＮＡ結合部位を認識する。
【００２１】
本発明で使用される用語“ジンクフィンガードメイン”とは、一つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを介して配列−特異的方式でヌクレオチドと結合するタンパク質をいう。ジンクフィンガードメインは、少なくとも２つのジンクフィンガーモジュールを含む。ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰとしてしばしば省略されたりする。
【００２２】
本発明で使用される用語“ジンクフィンガーモジュール”とは、亜鉛イオンの配位を通じて構造が安定的で結合ドメインの内部にあるアミノ酸配列をいう。本発明のジンクフィンガーモジュールは、自然発生的、野生型ジンクフィンガーモジュールのものと同一の配列であるか、または、野生型配列の任意のアミノ酸を他のアミノ酸の置換によって変形された配列を有する。野生型ジンクフィンガーモジュールは、真核細胞、例えば、真菌(例えば、酵母)、植物または動物細胞(例えば、人間やマウスのような哺乳動物)から由来することができる。本発明で使用されたジンクフィンガーモジュールは、公知のモジュールと商業用のモジュールとを含むことができるが、これに制限されない。好ましく本発明のジンクフィンガーモジュールは、２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールであることができ、より好ましくは２つ〜４つのジンクフィンガーモジュール、さらに好ましくは３つジンクフィンガーモジュール、最も好ましくは下記表１に記載されたモジュールから選択することができる。
【００２３】
【表１】
【００２４】
1ZF No.はAddgeneで使用するジンクフィンガーコンソーシアムモジュールアセンブリキット(Zinc Finger Consortium Modular Assembly Kit)１.０のナンバリングスキームに基づいた。
【００２５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼのジンクフィンガードメインは、３ｂｐのサブサイトを各々認識し、２つまたはそれ以上タンデム(tandem)配列されたジンクフィンガーモジュールから構成されている。各々のモジュールは独立的にＤＮＡ配列を認識するから、２つ〜４つのモジュールから構成されたジンクフィンガードメインは６または１２ｂｐ配列に結合することができる。したがって、二量体機能をするジンクフィンガーヌクレアーゼの場合、２つ〜４つのジンクフィンガーモジュールから構成されたジンクフィンガーヌクレアーゼ１対は、１２〜２４ｂｐ配列を特異的に認識する。具体例として、本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガードメインが２つまたはそれ以上、好ましくは２つ〜４つ、及びより好ましくは３つのジンクフィンガーモジュールから構成されている。
【００２６】
本発明で使用される用語“切断”は、ヌクレオチド分子の共有結合されたバックボーンの連結を解除することを意味し、“切断ドメイン”とは、このようなヌクレオチド切断のための触媒の活性を有するポリペプチド配列を意味する。
【００２７】
前記切断ドメインは、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る模範的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼを含むことができるが、これに制限されない。このような酵素は切断ドメインのソースとして使用することができる。また、前記切断ドメインは単一鎖ヌクレオチド配列を切断することができ、その切断ドメインのソースに応じて二重鎖切断が発生することができる。この点で、二重鎖切断活性を持つ切断ドメインを切断ハーフ−ドメインとして使用することができる。
【００２８】
制限エンドヌクレアーゼは多くの種に存在し、ＤＮＡ(認識部位で)で配列特異的結合が可能であり、結合部位でまたはその辺りでＤＮＡを切断することができる。特定制限酵素(例えば、タイプＩＩｓ)は、認識部位から除去された部位でもＤＮＡを切断し、分離することができる結合ドメインと切断ドメインとを有する。例えば、タイプＩＩｓ酵素であるＦｏｋＩは、一方の鎖でその認識部位から９ヌクレオチドで、及び他方の鎖でその意認識部位から１３ヌクレオチドでＤＮＡの二重鎖切断を触媒する。
【００２９】
タイプＩＩｓ制限酵素の例はＦｏｋＩ、ＡａｒＩ、ＡｃｅＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｅＩ、Ｂｂｒ７Ｉ、ＣｄｉＩ、ＣｊｅＰＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦｉｎＩ、ＭｂｏＩ、ｓａｐＩ、及びＳｓｐＤ５１があるが、これに制限されるのではなく、より具体的な例はＲｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１：４１８−４２０を参照する。
【００３０】
本発明で使用される用語“融合タンパク質”とは、ペプチド結合を介して２つ以上の異なるポリペプチドの連結によって形成されたポリペプチドを示す。ポリペプチドはジンクフィンガードメイン及びヌクレオチド切断ドメインとを含み、これはヌクレオチド配列中の任意の標的部位を切断することができる。融合タンパク質(または融合タンパク質をエンコードするポリヌクレオチド)をデザインして構成する方法は、当該分野に広く知られている如何なる方法であってもよく、ポリヌクレオチドはベクターに挿入されることができ、ベクターは細胞内に導入することができる。一般的に融合タンパク質(例えば、ＺＦＰ−ＦｏｋＩ融合)の構成要素は、ジンクフィンガードメインは融合タンパク質のアミノ末端(Ｎ末端)の最も近くに及び、切断ハーフドメインはカルボキシ末端(Ｃ末端)の最も近くに配列される。これはＦｏｋＩ酵素に由来した自然−発生切断二量体化ドメイン中の切断ドメインの相対的配向(orientation)を反映するが、ここでもＤＮＡ−結合ドメインはアミノ末端の最も近くに及び、切断−ハーフドメインはカルボキシ末端の最も近くにある。
【００３１】
本発明で使用される用語“ゲノムの予定された２つの部位”とは、ゲノム内切断するための標的部位を意味し、ゲノムとは、遺伝子群を有した染色体のセットを意味する。本発明でゲノム内標的部位は互いに異なり、したがって、各異なる部位の切断は本発明で意図する欠失、重複、逆位、置換または再配列を誘導することができる。
【００３２】
前記“ゲノムでの予定された２つの部位”とは、ジンクフィンガーヌクレアーゼによって切断した部位であって、各々の部位は少なくとも６つの塩基対ほど離れている。
【００３３】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含み、ゲノムＤＮＡを欠失させる方法に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり、より好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼは１対または２対のＺＦＮであり、１対のＺＦＮはゲノム内の２つの部位を認識することができ、または、２つのＺＦＮ対の各々はゲノムの２つの異なる部位のうち一つを認識することができる。さらに好ましくは、２対のＺＦＮを使用することができ、２対のジンクフィンガーヌクレアーゼは同一であるか異なるジンクフィンガードメインを含むことができる。最も好ましくは、異なるジンクフィンガードメインを持つ２つのＺＦＮ対は、２つまたはそれ以上の異なる部位の標的された欠失を誘導するために機能する。
【００３４】
ＺＦＮによって欠失されたゲノムＤＮＡ断片は、宿主ゲノム内に挿入された内因性染色体断片または遺伝子導入カセットであり得る。
【００３５】
一般的に、単一ジンクフィンガーモジュールは３つの塩基対を認識することができる。本発明で使用した結合したＺＦＮ対は２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールからなっている。したがって、ゲノム内の２つの標的部位はジンクフィンガーモジュール２つを使用して認識することができる長さで少なくても６つの塩基対ほど離れていなければならない。もし２つのＺＦＮ標的部位の間の切断されたＤＮＡ断片の長さが５つの塩基対より小さいと、一方の対のジンクフィンガーヌクレアーゼによって切断されたＤＮＡに、他方の対のジンクフィンガーヌクレアーゼが機能できなくなる。この場合、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼを構成するそれぞれの単量体は少なくとも２つのジンクフィンガーモジュールから構成されているので、少なくとも６つの塩基対を認識することができる。
【００３６】
本発明の好ましい実施例１で使用される人間ケモカイン(C-C motif)受容体コード化ＣＣＲ５とＣＣＲ２遺伝子は、３番染色体上に互いに隣接して位置しており、相同性が高い。このように、２つのＣＣＲ５とＣＣＲ２部位を標的するＺＦＮは１５ｋｂｐＤＮＡ断片の欠失を誘導することを確認し、ＺＦＮはゲノム内標的された２つの異なる部位に特異的なゲノム欠失が生ずることを示す(図２)。図３に示されたように、切断接合部分での小さな挿入／欠失の頻繁な観察は２つのＺＦＮ標的部位のスペーサー配列が一致する必要はないということを提案する。これはゲノム内の２対の特異的部位を認識できるジンクフィンガードメインが、標的された方法でゲノム欠失を誘導するために選択されることを示す。実施例２において、２つの異なるジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノム欠失を誘導することができるかどうかを確認するために、同じ染色体中の２つの非相同部位のうち１つを各々標的する２つのＺＦＮ対で実験を行った。その結果、２つの部位の間のゲノム欠失が発生したことを確認した(図４〜図６)。実施例３において、４つのジンクフィンガーモジュールから構成されたいくつかのＺＦＮが数十ｋｂｐ〜数十ｍｂｐ範囲のサイズのゲノム断片の大きい欠失を誘導するために使用されたことを確認した(図７〜図１０)。
【００３７】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含み、ゲノムＤＮＡを重複させる方法に関する。好ましくは前記部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼである。ジンクフィンガーヌクレアーゼの特徴は前述したゲノムＤＮＡを欠失させる方法と同様である。
【００３８】
２つの二重鎖破損が同一染色体で発生した場合、ゲノム欠失は分子内接合(intra-molecular joining)で発生する。一方、２つの二重鎖破損が２つの姉妹染色分体または２つの相同染色体中で別々に発生した場合、分子内接合によって一つの染色分体では欠失が、他の染色分体では重複が発生する。本発明のゲノムの予定された部位のゲノム重複は、遺伝子量(gene dosage)の増加を発生させ得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼによる重複は常に欠失を伴うようになるから、一つの細胞内で重複された遺伝子の数は変化がないが、減数分裂の後、受精の間に３または４に遺伝子の数が増加することができる。したがって、本発明の重複方法は、植物または動物の遺伝子量を増加させて有用な個体を作るために使用することができる。
【００３９】
実施例４において、このようなゲノム重複は異なる部位を標的したジンクフィンガーヌクレアーゼ２対を発現させて確認した(図１２〜図１４)。
【００４０】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡを逆位させる方法に関する。好ましく部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼの特徴は前述したゲノムＤＮＡを欠失させる方法と同様である。
【００４１】
ゲノム逆位はゲノムの一部が元々のゲノムと反対であることを意味する。ゲノム逆位は頻繁に癌細胞と遺伝病患者の細胞で観察される。例えば、１０番染色体上の５００ｋｂｐ部分の逆位は、チェルノブイリ原子力発電事故のために電離放射線に被曝した甲状腺癌患者で発見され(Nikiforov et al.，1999; Nikiforova et al.，2000)、Ｘ染色体での因子ＶＩＩＩの逆位は、すべての深刻な血友病患者のうち、約半分で確認された(Lakich et al.，1993)。本発明のゲノム逆位方法は前記疾病の予防と治療に効果的に使用することができる。
【００４２】
実施例５において、ゲノム逆位はＰＣＲを使用してゲノムの２つの異なる部位を標的するジンクフィンガーヌクレアーゼを発現させて確認した(図１５及び図１６)。Ｉ−ＳｃｅＩと異なり、本発明のオーダーメード型ＺＦＮはゲノム内標的部位の事前導入をせずゲノム逆位を誘導することができる。
【００４３】
好ましい一実施態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノム内の予定された２つの部位を切断する段階を含む、二重鎖オリゴヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)のような合成ＤＮＡ分子とゲノムＤＮＡとを置換させる方法に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。ジンクフィンガーヌクレアーゼの特徴は前述したゲノムＤＮＡを欠失させる方法と同様である。
【００４４】
挿入及び置換に使用され得るＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドカセットだけでなくクローニングされた長いプローモーター、エンハンサー、遺伝子であり得る。この時、挿入させるＤＮＡの５’オーバーハング(overhang)はＺＦＮ作動によって発生された二重鎖破損の５’オーバーハング配列と相補的に作って、予定された方向での外来ＤＮＡ挿入を許容する。本発明のゲノム置換の方法は、遺伝子発現の活性のために低く発現される遺伝子の上流に強力なプローモーター及びエンハンサーを挿入するとか遺伝子発現の活性化のために強いプローモーターの下流に関心のある遺伝子を挿入するために使用することができる。
【００４５】
挿入及び置換に使用されたＤＮＡ分子は化学的に変形され得る。ｄｓＯＤＮの５’オーバーハングは内因性エキソヌクレアーゼによる消化を防止するために化学的に変形され得る。例えば、ヌクレオシド間の連結(inter-nucleoside linkage)のホスホロチオエート変形はオーバーハングを保護するのに使用され得る。
【００４６】
挿入及び置換方法は、一部ゲノムＤＮＡの転座(translocation)に使用することができる。すなわち、１番染色体に位置した遺伝子Ａと２番染色体に位置した遺伝子Ｂとを置換するのが可能である。その達成のために、遺伝子Ａの両末端にそれぞれ標的されたＺＦＮ２つと遺伝子Ｂの両末端にそれぞれ標的されたＺＦＮ２つとを、細胞内で発現させるために準備しなければならない。このようなゲノムシャフリングは、遺伝子と染色体との間の相互作用を研究するのに寄与することができ、作物、魚類、及び家畜の品種改良に使用され得る。
【００４７】
実施例９において、ゲノム置換は、ゲノムで欠失と挿入とが同時に発生されて置換がなり得るかどうかを調査して確認した(図２９)。
【００４８】
また一つの態様として、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された２つの部位を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡを欠失、重複、逆位、置換または再配列させた細胞に関する。好ましくは前記部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００４９】
細胞は、Ｅ.ｃｏｌｉのような原核細胞、または酵母、真菌、原生動物、高等植物、及び昆虫のような真核細胞、または両生類細胞、またはＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、及びＣＯＳ−１のような哺乳類細胞など、例えば、培養された細胞(in vitro)、移植細胞と初代細胞培養(in vitro及びex vivo)、及び生体内細胞、並びにまた人間を含んだ哺乳類の細胞が当業界で通常的に使用され、制限されない。
【００５０】
また一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された部位を切断する段階を含み、合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法に関する。好ましくは部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００５１】
本発明者らは、ジンクフィンガーヌクレアーゼによる人間培養細胞におけるゲノムＤＮＡ欠失でゲノムの挿入が可能であることを推論した。実施例７において、標的方法での合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド挿入を確認した(図２３〜図２５)。また、実施例８において、所望の部位に合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドが挿入されるのか確認した(図２６〜図２８)。事前に２つの二重鎖破損が要求される欠失とは異なり、挿入は事前に１つの二重鎖破損で十分である。
【００５２】
好ましい一実施態様において、合成ＤＮＡ分子はＤＮＡ合成機を使用して２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングして準備することができる。この時、合成オリゴヌクレオチド自体を使用することもでき、合成オリゴヌクレオチド上に５’−リン酸基(phosphate group)を配置させて使用することもできる。好ましくはアニーリングして準備した合成ＤＮＡ分子が５’４ｂｐまたは５ｂｐのオーバーハングを有しており、オーバーハング配列はＺＦＮ作用によって発生されたオーバーハング配列と相補的に作る。
【００５３】
好ましい一実施態様において、合成ＤＮＡ分子はＰＣＲによって準備され得る。これとは異なり、合成ＤＮＡ分子はプラスミドのようなベクターにクローニングされたＤＮＡを制限酵素処理で得たＤＮＡ断片であり得る。
【００５４】
前記合成ＤＮＡ分子の長さと塩基配列とは、所望の突然変異によって任意的な方法で研究者らによってデザインされ得る。例えば、停止コドン(stop codon)をコードした合成ＤＮＡ分子をゲノムの遺伝子に挿入してその遺伝子発現を中断させることもでき、ＧＦＰとＦＬＡＧタグのようなアミノ酸配列がフレームに挿入され得る。合成ＤＮＡ分子はｃＤＮＡ配列全体または一部であってもよく、エンハンサー、プローモーター、エクソン、イントロンなどであってもよい。
【００５５】
ジンクフィンガーヌクレアーゼは１対のジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。好ましい一実施態様において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを含むことができる。好ましくはジンクフィンガーモジュールは表１に記載されたモジュールのうちから選択され得る。ヌクレオチド配列の切断で、ジンクフィンガーヌクレアーゼは二量体として機能することができる。好ましくは、ジンクフィンガーヌクレアーゼは表３に記載されたもののうちの一つであり得る。
【００５６】
ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用してゲノム中で合成ＤＮＡを挿入するとか置換する方法は、相同組換えを介した遺伝子標的化方法によるゲノムエンジニアリングに比べて大きい長所がある。第一に、遺伝子標的化方法は非常に低い効率を持つ。第二に、遺伝子標的化方法は挿入しようとする塩基配列両端に相同アーム(homology arm)の少なくとも１ｋｂｐを含む遺伝子標的化ベクターが要求される。有利に本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した挿入または置換方法は、遺伝子標的ベクターが要求されず、また、高い効率で突然変異が誘導される。
【００５７】
また一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼを使用したゲノムの予定された部位を切断する段階を含み、合成ＤＮＡの挿入が発生した細胞に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００５８】
合成ＤＮＡ挿入は欠失、重複、逆位、置換と異なり、ゲノム内の予定された一つの部位の切断によって発生することができる。挿入のためには一対のＺＦＮの使用でも十分である。本発明の挿入方法によって高等真核細胞で高い再現性のあるゲノムの予定された部位への合成ＤＮＡ挿入ができる。
【００５９】
好ましい実施態様において、合成ＤＮＡの挿入はＰＣＲ結果で調査した(図２３〜図２５)。大部分のクローンは、いかなる小さな欠失や挿入もなく合成ＤＮＡカセットが完璧にジンクフィンガーヌクレアーゼによって標的された部位に挿入されたことを確認し、合成ＤＮＡカセットのオーバーハング配列は二重鎖破損のオーバーハング配列と相補的に作って部位−特異的突然変異を誘導することができることを示す。
【００６０】
また一つの態様において、本発明は部位−特異的ヌクレアーゼに誘導されたゲノム手術(以下、“ＺｉＧＳ”という)に関する。好ましくは、部位−特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。
【００６１】
本発明の方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用して高等真核細胞及び個体のゲノム内で標的された欠失と逆位とを誘導することができ、関心のあるゲノムから遺伝子群を除去することができる。動物研究やインビトロ(in vitro)実験で単一遺伝子をノックアウト(knock-out)させた時、ある識別可能な表現型の変化結果を示さない場合がしばしばある。大概、表現型マスキングは頻繁に相同遺伝子の存在に起因する。興味深いことに、相同遺伝子はゲノムでクラスター(cluster)化する傾向がある。例えば、本発明の好ましい実施例で使用したＣＣＲ２とＣＣＲ５とは染色体３ｐ２１に真横に互いに隣接している。本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼは、同一細胞でユニットとして相同遺伝子のクラスターを除去するのに使用することができる。また、ジンクフィンガーヌクレアーゼ−誘導された欠失は、遺伝子間領域(intergenic region)とイントロンとを選択的に欠失させるのに使用することができる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは幹細胞または体細胞から疾病関連遺伝子を選択的に除去するのに使用することができる。遺伝子間領域またはイントロン中の２つの部位を標的することによってプローモーターやエクソンが欠失され得る。しかも、プローモーター領域を含むＤＮＡ断片の標的された欠失は関心のある遺伝子を完璧にノックアウトさせて表現型を１００％ヌル(null)にすることができる。このようにＺｉＧＳは高等真核細胞と個体でゲノム欠失及び逆位を誘導するのに使用され得る。
【００６２】
また一つの態様において、本発明は（ａ）切断しようとする特定塩基配列を決定する段階と、（ｂ）前記塩基配列を認識するジンクフィンガーモジュールを選択する段階と、（ｃ）前記（ｂ）段階のジンクフィンガーモジュールを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを製造する段階と、（ｄ）製造されたジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内に導入させる段階と、を含むジンクフィンガーヌクレアーゼを細胞内で発現させる方法に関する。
【００６３】
前記（ａ）段階のヌクレオチド配列は、細胞内または外に存在することができ、その長さの制限はない。ヌクレオチド配列は円型、単一または二重鎖の形態で存在することができる。
【００６４】
前記（ｂ）段階は、前記塩基配列を認識するジンクフィンガーモジュールを選択する段階であって、ジンクフィンガーモジュールはどんな公知のモジュール及び商業用モジュールであってもよく、また、新しく合成されることもできる。
【００６５】
前記（ｃ）段階のジンクフィンガーモジュールは、２つまたはそれ以上のモジュールを含むことができ、好ましくは２つ〜４つのモジュールを含むことができ、より好ましくは３つのモジュールを含むことができる。好ましくは前記で製造されたジンクフィンガーヌクレアーゼは異なる部位を認識することができる１対のジンクフィンガーヌクレアーゼであることができ、または異なる部位を認識することができる２対のジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。さらに好ましくは２対のジンクフィンガーヌクレアーゼを製造することができる。
【００６６】
前記（ｄ）段階の細胞内にジンクフィンガーヌクレアーゼを導入させる方法は、当業界に知られた公知のどんな方法でも行うことができ、形質感染(transfection) または形質導入(transduction)によって外来ＤＮＡを細胞に導入させることもできる。形質感染は、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿(co-precipitation)、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介形質感染、ポリブレン−媒介形質感染、電気穿孔、マイクロインジェクション法、リボソーム融合、リポフェクション及び原形質体融合を含む当業界に公知された多くの方法によって行われることができる。前記（ｄ）段階のジンクフィンガーヌクレアーゼの細胞内での発現は、当業界に知られたどんな方法によっても行うことができ、例えば、ベクターを使用することができる。ベクターの例として、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ及びウイルスベクターを含むが、これに制限されない。適合した発現ベクターはその目的に応じてプローモーター、オペレーター、開始コドン、終結コドン(termination codon)、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーのような発現調節要素だけでなく分泌シグナル配列を含んで製造することができる。
【００６７】
参考文献
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【００６８】
本明細書で言及される特許及び特許出願及び他のすべてのものを含むすべての参考文献はその全体が本明細書で参考として含まれる。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例を介して本発明をより詳細に説明することにする。しかし、これらの実施例はただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されることに解釈されない。
【００７０】
実施例１：ＣＣＲ５−ＣＣＲ２欠失
＜１−１＞ＣＣＲ５−ＣＣＲ２欠失
ＣＣＲ５遺伝子を標的とするＺＦＮを製造した(Kim et al.，2009)。このＣＣＲ５−標的ＺＦＮの大部分は、ＣＣＲ２座位で該当する相同部位で部位−特異的ゲノムエディティング(editing)活性を示すことができるので、研究されたＺＦＮは各座位に部位−特異的点突然変異だけでなく大きいゲノム欠失を誘導することができた。
【００７１】
ＺＦＮ発現プラスミドをＨＥＫ２９３(Human embryonic kidney 293)細胞に形質感染(transfection)し、３日後に、それからゲノムＤＮＡを分離してゲノム欠失検出のためにＤＮＡ増幅のための鋳型として使用した。配列がＣＣＲ２領域またはＣＣＲ５領域に該当し、１６ｋｂｐ離れている２つのプライマーを使用した(図１)。実験に使用したプライマー配列は表２に整理した。
【００７２】
【表２】
【００７３】
その結果、ＰＣＲ産物は対照群の空のプラスミドで形質感染された細胞から観察されなかった。その標的部位がＣＣＲ５座位ＣＣＲ２座位との間に保存されている７つの異なるＺＦＮをそれぞれ発現させた細胞から増幅されたＤＮＡ断片が観察されたし(図２)、そのＰＣＲ産物のサイズは約１ｋｂｐであったし、これは２つのＺＦＮ標的部位の間のＤＮＡ断片が染色体から欠失された時に予想されるサイズであった。一方、Ｚ３０とＺ２６６とを発現させた細胞からは増幅されたＤＮＡ断片が観察されなかったし(ここで、数字はＣＣＲ５遺伝子の開始コドンに対するＺＦＮ切断部位の位置を示す)、その認識部位はＣＣＲ２座位で保存されず、その細胞でゲノム欠失が発生されなかったことを示唆する。
【００７４】
このような結果は、人間細胞内で大きいゲノム欠失を起こすためには、ＺＦＮが染色体でただ一つの二重鎖破損(ＤＳＢ)のみを発生させるのではなく、２つの二重鎖破損(ＤＳＢ)を発生させなければならないことを示す。
【００７５】
＜１−２＞ＣＣＲ２−ＣＣＲ５欠失の塩基配列分析
ＰＣＲ産物はそれらのＤＮＡ配列を決定するためにクローニングし、実際に ＣＣＲ２部位とＣＣＲ５部位とは結合されており、間には１５−ｋｂｐＤＮＡ断片が欠失されていることを示した(図３)。切断接合部分の塩基配列はＺＦＮのＤＮＡ切断パターンと一致した。ＺＦＮは二量体として機能し、各単量体は５または６ｂｐのスペーサーで離れている２つの９−ｂｐまたは１２−ｂｐのハーフ−サイト(half-site)のうち、一つを認識した。ＺＦＮはスペーサーでＤＮＡを切断し、５’に４または５−ｂｐのオーバーハングを発生させる(Smith et al.，2000)。ＰＣＲに使用したプライマー配列は表２に整理した。ＰＣＲ産物の配列分析は、ＣＣＲ２座位のハーフ−サイト（Ａ）がＣＣＲ５座位のハーフ−サイト（Ｂ）と直接連結され、ＣＣＲ２座位に他のハーフ−サイト（Ａ）からＣＣＲ５座位に他のハーフ−サイト（Ｂ）まで１５−ｋｂｐＤＮＡ幅が欠失されたことを示した。切断接合部分配列では１５−ｋｂｐ欠失だけでなく小さな(１−１４ｂｐ)挿入／欠失を示した(図３)。このような小さな挿入／欠失の突然変異パターンは非相同末端結合(以下、“ＮＨＥＪ”という)の特徴的な結果である。さらに、１−５塩基のマイクロホモロジー(microhomologies)が接合部分で観察された(図３)。
【００７６】
切断接合部分で小さな挿入／欠失が頻繁に観察されることは、ゲノム欠失を促進させるために２つのＺＦＮ標的部位のスペーサー配列が一致する必要はないということを示唆する。この点で本発明で使用したサンガモ(Sangamo Biosciences，Inc.)のＣＣＲ５−標的ＺＦＮに注目する価値がある(このＺＦＮはPerez et al． 2008でＺＦＮ−２１５としてデザインされたが、混乱を避けるために本発明ではＳ１６２と示す)。それぞれの異なる６つのＺＦＮはＣＣＲ５座位とＣＣＲ２座位とに保存されたスペーサー配列を有するが、Ｓ１６２はその座位で他のオーバーハング配列を発生した。すなわち、Ｓ１６２はＣＣＲ５座位で５’ＣＴＧＡＴ及びＣＣＲ２座位で５’ＡＴＴＡＡを(図３にその相補的配列を記述した)発生した。このようなオーバーハング配列はＤＮＡ修復の間に埋めたり除去される。Ｓ１６２を発現させた時に特異的な１５−ｋｂｐのゲノム欠失を観察した(図２及び図３)。
【００７７】
実施例２：２対のＺＦＮによる欠失
＜２−１＞２対のＺＦＮによる欠失
次に、異なる２つの部位を標的する２対のＺＦＮがＤＮＡ断片の間の欠失を誘導できることを確認した。この分析のために、ＣＣＲ５を標的するＺＦＮの２つのセットを選択し、Ｚ３０＋Ｚ８９１とＳ１６２＋Ｚ８９１との組み合わせを分析に使用した。２対のＺＦＮを発現させた細胞からゲノムＤＮＡを分離し、ＣＣＲ５コード配列を増幅した。ＰＣＲに使用したプライマー配列を表２に整理した。
【００７８】
その結果、全体ＣＣＲ５コード領域に該当する１，０６０ｂｐの増幅は野生型ゲノムＤＮＡ(ＤＮＡ欠失無し)で観察され、１９９ｂｐＤＮＡバンドと３３１ｂｐバンドとの増幅はＺ３０＋Ｚ８９１セットとＳ１６２＋Ｚ８９１セットとがそれぞれ発現する細胞で観察された(図４及び図５)。しかし、ＰＣＲ産物はＺＦＮを発現させないとかまたは２対のＺＦＮのうち、一対のＺＦＮのみを発現させた細胞では観察されなかった。
【００７９】
＜２−２＞２対のＺＦＮによる欠失の塩基配列分析
ＰＣＲ産物はクローニングして配列分析し、Ｚ３０＋Ｚ８９１を発現した細胞では約８６１ｂｐＤＮＡ断片とＳ１６２＋Ｚ８９１を発現した細胞では約７２９−ｂｐＤＮＡ断片の特異的な欠失を確認した(図６)。実施例１−２に記述したように、特異的な欠失だけでなくマイクロホモロジー及び小さな挿入／欠失はジョイント(joint)で観察した。このような結果は、ＤＮＡ欠失が非相同末端結合を介して媒介されたことを強く支持する。たとえＣＣＲ５座位で異なる２つの部位のうち、一つを標的とするそれぞれ２対のＺＦＮを使用した時でも、標的欠失は相変らず観察された。相同組換えが欠失現象の原因という可能性を排除した。
【００８０】
実施例１に記述したように、２つのＺＦＮ標的部位の異なるスペーサー配列はゲノム欠失が不可能ではない。例えば、Ｚ３０とＺ８９１とは、それぞれ５’ＡＴＧＴ(相補的な配列は図６に記述した)と５’ＣＣＴＴオーバーハングを発生するが、ＣＣＲ５座位に約８６１ｂｐＤＮＡ断片の欠失を起こすことができた。このような結果は、標的ゲノム欠失のためのＺＦＮデザインはＺＦＮ認識部位またはスペーサーの配列に制限されないということを示す。
【００８１】
実施例３：大きいネストされた欠失
２つのＺＦＮ対を使用して人間ゲノムからＤＮＡの非常に長い伸長(stretches)の欠失が可能かどうかを調査した。このために、ＣＣＲ５座位のはるか上流(upstream)の異なる標的部位であるＺＦＮ対のシリーズを合成した。人間またはショウジョウバエゲノムにコードされた１７の自然的−発生ジンクフィンガーを４−フィンガーＺＦＮを集合させるためのモジュールとして使用した(すなわち、ＺＦＮは４つのジンクフィンガーモジュールがタンデム配列されて構成)(表１)。
【００８２】
それぞれのジンクフィンガーモジュールは３ｂｐを認識し、１７個のジンクフィンガーのそれぞれは異なる３ｂｐのサブサイトを認識し、総括的に、６４個のトリプレットサブサイト(triplet sub-site)のうち、２１個をカバーする。ＺＦＮは二量体(dimer)として機能するから、一つの部位を標的するＺＦＮを準備するためには、部位当り２つの４−フィンガーＺＦＮ単量体を準備しなければならない。４−フィンガーＺＦＮは１２−ｂｐハーフ−サイトまたは２４−ｂｐフルサイトを認識する。全体３０対のＺＦＮを合成し、新しく準備したＺＦＮはＣＣＲ５座位の３０ｋｂｐ〜４６Ｍｂｐ上流の部位を認識する。
【００８３】
それぞれのＺＦＮ対を、ＣＣＲ５座位を標的するＳ１６２対とともに形質感染によってＨＥＫ２９３細胞で同時発現させた。スワップ(Swapped)された二量体の形成を防止するために、義務的ヘテロ二量体(obligatory heterodimer)のＳ１６２を使用した。二量体界面のアミノ酸残基の変化のため義務的ヘテロ二量体はホモ二量体(ＡＡまたはＢＢのような)またはスワップされた二量体(ＡＢのような)を形成しない(Miller et al.，2007)。したがって、Ｓ１６２を構成する各々の単量体は任意の新しいＺＦＮ単量体と二量体とを形成することができない(他の言及がない限り、本発明に使用した他のすべてのＺＦＮは野生型である)。
【００８４】
その結果、Ｓ１６２とともに同時発現された３０対のＺＦＮのうち、７対で全体欠失に該当するＰＣＲ産物を得た(これらＺＦＮに対する情報は下記表３に記載する)。ＰＣＲに使用されたプライマー配列は表２に整理した。
【００８５】
下記表３に示したＺＦＮは２つの単量体から構成された二量体として機能した。例えば、Ｋ３３をＫ３３ＲとＫ３３Ｆとの対で構成した。下記に記述したジンクフィンガーモジュールの名前は、塩基と相互作用すると期待される主要部位のアミノ酸残基４つから由来した。Ｆ１とＦ４とはそれぞれＮ末端のジンクフィンガーモジュールとＣ末端のジンクフィンガーモジュールとを示した。Ｆ２とＦ３とはＦ１とＦ４との間に位置するジンクフィンガーモジュールを示した。Ｆ１はＤＮＡの３’末端の３−ｂｐと結合し、Ｆ４はＤＮＡの５’末端３−ｂｐと結合した。ジンクフィンガーモジュールは“ＴＧＥＫＰ”アミノ酸によって互いに連結し、Ｆ４と“ＦｏｋＩ”制限酵素ドメインが（Ｆ４Ｈ）−ＴＧＥＫ−（ＦｏｋＩＱＬＶ）で連結した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
ＰＣＲ産物の配列分析はそれぞれゲノムＤＮＡ断片３３ｋｂｐ、２３０ｋｂｐ、２７６ｋｂｐ、７８１ｋｂｐ、８３５ｋｂｐと１５．１Ｍｂｐの大きい欠失をはっきりと確認し、小さな挿入／欠失とマイクロホモロジーも観察した(図７〜図１０)。新しく作ったＺＦＮまたはただＳ１６２のみ発現させた細胞ではＰＣＲ産物が観察されなかった。
【００８８】
また、Ｓ１６２不在での新しいＺＦＮの使用が、該当するゲノム欠失を生じさせることができるかどうかを調査した。７対の活性ＺＦＮの様々な組み合わせでそれぞれの場合に欠失を確認することができる。Ｋ２３０とＭ１５とが１４．９Ｍｂｐ(＝１５．１−０．２３)の欠失をもたらす。前記実施例１−２及び２−２のように、ＰＣＲ産物の配列分析でまた、ＺＦＮ−誘導された欠失がマイクロホモロジーと小さな挿入／欠失を伴うことを明らかにした(図９及び図１０)。
【００８９】
要約すると、ＺＦＮのさまざまな組み合わせを用いて、ＣＣＲ５座位内で２つの欠失(７３０ｂｐと８６１ｂｐ)、ＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の間の７つの異なる１５ｋｂｐ欠失、ＣＣＲ５座位とＣＣＲ５上流座位の間の７つの欠失(３３ｋｂｐ、２３０ｋｂｐ、２４３ｋｂｐ、２７６ｋｂｐ、７８１ｋｂｐ、８３５ｋｂｐ、１５．１Ｍｂｐ)、及びＣＣＲ５の２つの上流座位の間の３つの欠失(５３８ｋｂｐ、５５１ｋｂｐ、１４．９Ｍｂｐ)が、人間細胞内で観察された。この結果は、任意の２つの活性ＺＦＮを使用して人間細胞で特異的なゲノム欠失を生じさせることができることを示唆した。
【００９０】
実施例４：重複
ＺＦＮが人間細胞内で欠失だけでなく重複または逆位のようなゲノム再配列を誘導するかどうかを確認するために、下記の実験を行った。
【００９１】
図１１で例示したように、２つの姉妹染色分体(sister chromatid)の異なる部位で二重鎖破損が発生した後、互いの間に結合が発生すると、一つの染色分体でゲノム欠失が発生し、他の染色分体ではゲノム重複が発生するようになる。我々は重複の発生を確認するためにＰＣＲを使用した。
【００９２】
ＣＣＲ５とＣＣＲ２座位を標的するすべてのＺＦＮは、図１２に示すように、重複に該当するＰＣＲ産物を生成した。しかし、ＺＦＮを発現させない細胞(陰性対照細胞：図１２にｐ３で示す)と、認識部位がＣＣＲ５座位でだけ存在し、ＣＣＲ２にはないＺ３０とＺ２６６とを発現させる細胞では、増幅されたＤＮＡ断片を得ることができなかった(図２で示したように、Ｚ３０とＺ２６６とは１５−ｋｂｐＤＮＡ欠失を誘導しなかった)。ＰＣＲに使用されたプライマー配列は前記表２に整理した。
【００９３】
ＰＣＲ産物をクローニングし、配列分析してＣＣＲ５コード領域の５’部分とＣＣＲ２コード領域の３’部分が直接連結されていることを確認した(図１３)。
【００９４】
３０ｋｂｐまたはそれ以上のゲノム欠失を誘導するさまざまな組み合わせのＺＦＮで実験を行った。その結果、２つのＺＦＮ認識部位でＤＮＡの重複に該当するＰＣＲ産物はそれぞれのＺＦＮの組み合わせで処理されたすべての細胞から得ることができた(データは提示せず)。一方、ただ一つの部位のみを標的する1対のＺＦＮで処理した細胞からはＰＣＲ産物を得ることができなかった。欠失から分かるように、小さな挿入／欠失とマイクロホモロジーを重複の切断接合部分で観察した(図１４)。この結果は、非相同末端結合がＺＦＮ−誘導された重複に関与することを示唆した。
【００９５】
実施例５：逆位
逆位の機作を調査し、人間細胞内ＤＮＡ断片逆位復帰の可能性を調査するために、本発明者らはＨＥＫ２９３細胞での一時的ＺＦＮ発現後に示される現象を調査した。
【００９６】
図１５に示したように、ＺＦＮ−誘導された標的された逆位は同じ方向を指示するプライマーを使用し、ＰＣＲによって確認した。ＰＣＲに使用したプライマー配列は表２に整理した。逆位が発生しないならば、ＰＣＲ産物を得ることがなく、逆位が発生したら、予定されたサイズのＰＣＲ産物を得ることができる。
【００９７】
その結果、ＺＦＮ標的された２つの部位のさまざまな組み合わせとともに染色体３ｑ２１で２３０ｋｂｐ、２４３ｋｂｐ、２７６ｋｂｐ、７８１ｋｂｐ、８３５ｋｂｐ、１５．１Ｍｂｐのゲノム逆位に該当するＰＣＲ産物を観察した。しかし、ＺＦＮを発現させない細胞ではＰＣＲ産物を得ることができなかった(図１６)。
【００９８】
ＰＣＲ産物をクローニングし、配列分析して、これに該当する部位で実際に逆位が発生することを確認した(図１７〜図１９)。ゲノム逆位は２つの切断接合部分を発生させる。これらのそれぞれを配列分析し、このジャンクションで小さな欠失／挿入とマイクロホモロジーとを観察した。この結果は、非相同末端結合がＺＦＮ−誘導された逆位にも関与することを示唆した。
【００９９】
要約すると、この結果は、染色体上の二重鎖破損が、該当する領域のゲノム逆位を発生させ、逆位されたゲノム断片がＺＦＮによって復帰することができることを示唆した。
【０１００】
実施例６：細胞のクローン集団(clonal population)の分析
＜６−１＞ＰＣＲを使用した細胞のクローン集団分析
ＺＦＮに誘導されたゲノム欠失の頻度及び特性を調査し、標的されたゲノム欠失が発生したクローンをスクリーニングした。
【０１０１】
Ｓ１６２−処理された細胞をプレートで限界希釈して(９６ウェルプレート中０．７細胞／ウェル)１５日〜２１日培養した。細胞の分離されたクローン集団からゲノムＤＮＡを分離し、その後、ゲノム欠失を検出するためにＰＣＲによって分析した。ＰＣＲに使用されたプライマー配列は表２に整理した。
【０１０２】
その結果、２つのクローンで予想されたサイズの増幅されたＰＣＲ断片を得た。前記ＰＣＲ産物の配列分析は、２つの標的部位(ＣＣＲ２の一部位とＣＣＲ５座位の他の一部位)の間の１５ｋｂｐＤＮＡ断片の特異的欠失及び２つの終点の結合を確認した(図２０)。ＨＥＫ２９３は、多倍体細胞株で、３番染色体の少なくとも３つのコピーを含むようにした。クローン２では２つの異なる１５ｋｂｐ欠失に相応する塩基配列が示され、２つの相同染色体で欠失が発生したことを示した。クローン２は、他の３番染色体では１５ｋｂｐ欠失を示さなかったが、ＣＣＲ５座位でＳ１６２−誘導された局所的な突然変異(local mutation)が示された。クローン１は、ただ一つの相同染色体に１５−ｋｂｐ欠失を示し、他の相同染色体では１つの野生型塩基配列と３つの異なる突然変異を示した。クローン１は単一クローンではなく、２つのクローンの混合物として推定した。クローン１、２の両方で１５−ｋｂｐＤＮＡ重複が示さなかった。この結果は、欠失及び重複がいつも同時に発生しないとの予測と一致する。
【０１０３】
＜６−２＞サザンブロット分析
この細胞のクローン集団は、ゲノム欠失の存在を確認するためにさらにサザンブロッティングで分析した。クローン１と２及び野生型ＨＥＫ２９３からゲノムＤＮＡを分離し、ＸｂａＩを処理し、及び電気泳動した。ＣＣＲ２座位周辺のＤＮＡをプローブとして使用してゲノム突然変異(genome mutation)を確認した。
【０１０４】
図２１に示したように、クローン１と２から１５ｋｂｐ欠失に該当するＤＮＡバンドを観察した。本発明者らが分析した数十クローンのうち、２つのクローンでＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失を示し、ＺＦＮ−誘導されたゲノム欠失の効率は２％またはそれ以上と推定した。この結果は、効率がＺＦＮによって標的された欠失を有する細胞を得るのに充分に高いことを意味する。
【０１０５】
実施例７：ゲノムへの合成ＤＮＡ分子の挿入
ＺＦＮ−誘導されたゲノム挿入の可能性を確認するために、小さなオリゴヌクレオチドの２つの鎖を合成し、二重鎖ＯＤＮ(oligodeoxynucleotide)カセットを準備するためにアニーリングし、ＺＦＮとともにＨＥＫ２９３細胞に形質感染させた。この実験のために、Ｚ３０とＺ８９１のそれぞれを使用した。Ｚ３０はＣＣＲ５座位を標的するために作り、５’−ＡＣＡＴ及び５’−ＡＴＧＴのオーバーハングを発生し、ｄｓＯＤＮカセットはこれと相補的な５’オーバーハングを有するようにデザインされた２つの相補的な２７−ｍｅｒＯＤＮ(図２２にＯＦ及びＯＲで示す)から構成した。Ｚ３０−発現させた細胞内でｄｓＯＤＮカセットの挿入を確認するために、カセットを構成するｄｓＯＤＮのうち、一つをプライマーとして使用してＰＣＲを行った。
【０１０６】
その結果、予想されたサイズのＤＮＡバンドを得た(図２３)。ＤＮＡバンドをクローニングし、配列分析して実際にゲノムにｄｓＯＤＮカセットが挿入されたことを確認した(図２４)。Ｚ８９１で類似した結果を示した(図２５)。
【０１０７】
実施例８：ＺＦＮによるゲノムの予定された部位への合成ＤＮＡ分子の標的された挿入
本発明者らはＺＦＮを使用して任意の他の高等真核細胞及び生物と人間の予定されたゲノムの座位内の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)カセット導入が可能であるかどうかを調査した。ＺＦＮ(Ｓ１６２)標的部位を含む、ＣＣＲ５座位に２８０ｂｐＤＮＡ断片を検出するためにＰＣＲプライマーをデザインした。プライマーのうち、一つは６−ＦＡＭ蛍光物質染色で末端標識した。蛍光ＰＣＲ分析は、ＺＦＮ対(Ｓ１６２)がコードされたプラスミドと適切な二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド(ｄｓＯＤＮ)とを同時形質感染させた細胞から分離されたゲノムＤＮＡを使用して行った。増幅されたＰＣＲ産物をＡＢＩ３７３０ｘｌＤＮＡ分析器を使用して分析した。その結果データはＡＢＩピークスキャナソフトウェアを使用して転換した。
【０１０８】
ＰＣＲ産物は下記プライマー対を使用して得た。
Ｚ３０Ｆ：５’−ＴＧＣＡＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧ−３’(配列番号３７)
Ｓ１６２Ｒ：５’−ＧＡＧＣＣＣＡＧＡＡＧＧＧＧＡＣＡＧＴＡＡＧＡＡＧＧ−３’(配列番号３８)
【０１０９】
ＺＦＮを発現させない対照群細胞から分離したゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲ産物は２８０−ｂｐＤＮＡ断片に該当する単一最大ピークを示した(図２６)。ＺＦＮの発現は、誘導されたインデル(indel、挿入と欠失)及びそれぞれ５ｂｐ挿入ピーク(**)及び欠失ピーク(*)にそれぞれ該当する長いＰＣＲ産物及び短いＰＣＲ産物を生成する(図２７)。ＺＦＮ及びｄｓＯＤＮで処理した細胞で増幅したＰＣＲ産物は注目するに値する(図２８)。５ｂｐ挿入ピークだけでなく、蛍光ＰＣＲは２８−ｂｐｄｓＯＤＮの挿入に該当する新しいピーク(***)を示した。この結果は、ＺＦＮを高い効率で人間細胞の予定されたゲノム座位への合成ｄｓＯＤＮカセット挿入に使用できることを示す。
【０１１０】
ｄｓＯＤＮカセットは下記の２つのＯＤＮをアニーリングして準備し、それぞれの５’末端に５ｂｐオーバーハングを有し、その配列はゲノムＺＦＮ標的部位で発生したオーバーハングと相補的である。
Ｓ１６２ ５Ｆ：５’−ＣＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧ−３’(配列番号３９)
Ｓ１６２ ５Ｒ：５’−ＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’(配列番号４０)
【０１１１】
実施例９：置換
本発明者らは、人間細胞でＺＦＮがゲノムＤＮＡ断片を合成ｄｓＯＤＮカセットで置換するために使用できるかどうかを調査した。すなわち、本発明者らはそれぞれＳ１６２及びＺ８９１である２つのＺＦＮを使用してＣＣＲ２とＣＣＲ５座位の間の１５−ｋｂｐＤＮＡの欠失の結果生じる染色体ＤＮＡ断片を検出するためにＰＣＲを行った。ＥｃｏＲＩ部位を含むｄｓＯＤＮカセットはＨＥＫ２９３細胞内にそのＺＦＮをコードするプラスミドとともに同時形質挿入した。この実験で使用したプライマーは、図１で染色体欠失に使用したものと同様である(配列番号１８及び２１)。ＰＣＲ産物はＥｃｏＲＩで消化してアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１１２】
ＺＦＮとｄｓＯＤＮカセットをともに処理した時、増幅されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとともに処理して電気泳動で分析した。その結果、カセットが挿入された時に期待できるＤＮＡバンドを観察し(図２９に矢印で表示)、一方、同じ試料にＥｃｏＲＩを処理しない場合には切断したＤＮＡバンドを観察できなかった。ｄｓＯＤＮカセットを追加せず、ＺＦＮのみ発現させた細胞から分離したゲノムＤＮＡでは、ＥｃｏＲＩによって切断したＤＮＡバンドを観察できなかった。ＺＦＮを発現させずｄｓＯＤＮカセットのみ追加した細胞においても、欠失に該当するＰＣＲ産物を観察できなかったが、増幅されたＰＣＲ産物は欠失を示すサイズのバンドだけ得た。ＺＦＮとｄｓＯＤＮカセットをともに処理した細胞から分離したゲノムＤＮＡを使用して増幅したＰＣＲ産物のみがＥｃｏＲＩ−依存ＤＮＡ切断を生じた。この結果はＺＦＮを使用してゲノムＤＮＡ断片を合成ｄｓＯＤＮカセットで置換できることを示した。
【０１１３】
本研究で使用したｄｓＯＤＮカセットは、下記２つのｄｓＯＤＮをアニーリングして準備し、５’末端に４ｂｐまたは５ｂｐオーバーハングを有し、その配列はゲノムＺＦＮ標的部位で発生したオーバーハングと相補的である。
Ｆ８９１ ＺＦＮ：Ｆ−８９１、５’−ＣＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧ−３’(配列番号４１)
ＯＲ−８９１、５’−ＡＡＧＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’(配列番号４２)
Ｓ１６２ ＺＦＮ：２−Ｆ−１６２、５’−ＴＴＡＡＴＴＴＧＡＧＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＧＴＧＡＣＡＧ−３’(配列番号４３)
５−ＯＲ−１６２、５’−ＡＴＣＡＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＡ−３’(配列番号４４)
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの２つまたはそれ以上の予定された部位を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡの欠失、重複、逆位、置換または再配列させる方法。
【請求項２】
前記部位−特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジンクフィンガーモジュールは、表１に記述されたモジュールのうちから選択されるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記２対のジンクフィンガーヌクレアーゼは、それぞれ異なるジンクフィンガーヌクレアーゼを含むものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ゲノムの２つの異なる部位を標的するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１対または２対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノムの予定された部位は、少なくとも６塩基対離れている、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のうち、いずれか一項に記載の方法でゲノムＤＮＡが欠失、重複、逆位、置換または再配列された細胞。
【請求項１１】
部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された部位を切断する段階を含む、ゲノムの予定された部位に合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法。
【請求項１２】
前記部位−特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを含むものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ジンクフィンガーモジュールは、表１に記述されたモジュールから選択されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のうち、いずれか一項の方法を使用して、ゲノム内に合成ＤＮＡが挿入された細胞。
【請求項１】
部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの２つまたはそれ以上の予定された部位を切断する段階を含む、ゲノムＤＮＡの欠失、重複、逆位、置換または再配列させる方法。
【請求項２】
前記部位−特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを含むものである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジンクフィンガーモジュールは、表１に記述されたモジュールのうちから選択されるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記２対のジンクフィンガーヌクレアーゼは、それぞれ異なるジンクフィンガーヌクレアーゼを含むものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ゲノムの２つの異なる部位を標的するものである、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１対または２対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ゲノムの予定された部位は、少なくとも６塩基対離れている、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のうち、いずれか一項に記載の方法でゲノムＤＮＡが欠失、重複、逆位、置換または再配列された細胞。
【請求項１１】
部位−特異的ヌクレアーゼを使用してゲノムの予定された部位を切断する段階を含む、ゲノムの予定された部位に合成ＤＮＡ分子を挿入させる方法。
【請求項１２】
前記部位−特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、２つまたはそれ以上のジンクフィンガーモジュールを含むものである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ジンクフィンガーモジュールは、表１に記述されたモジュールから選択されるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼは、１対のジンクフィンガーヌクレアーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のうち、いずれか一項の方法を使用して、ゲノム内に合成ＤＮＡが挿入された細胞。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図２２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図２２】
【公表番号】特表２０１２−５２９２８７（Ｐ２０１２−５２９２８７Ａ）
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１４８８９（Ｐ２０１２−５１４８８９）
【出願日】平成２２年６月１１日（２０１０．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３７８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４３９１７
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５１１３０１０７２）トゥールゲン インコーポレイション (1)
【出願人】（５０８３６９９０６）エスエヌユー アール アンド ディービー ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月２２日（２０１２．１１．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１１日（２０１０．６．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００３７８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４３９１７
【国際公開日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【出願人】（５１１３０１０７２）トゥールゲン インコーポレイション (1)
【出願人】（５０８３６９９０６）エスエヌユー アール アンド ディービー ファウンデーション (11)
【Ｆターム（参考）】
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