酵素基質、これを含む培養基、及び、アミノペプチダーゼ活性を検出するための、及び／又は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するためのその使用
本発明は、微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するために使用される、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するために使用される、新規の発色性酵素基質に関する。また、本発明は、この基質を含む培養基、アミノペプチダーゼ活性を検出するための、及び／又は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するための上記基質又は上記培養基の使用、及び、その使用方法にも関する。
上記新規基質は、下記式：
【化１】
式中、
・Ｒ１は、存在しない、又は、アルキル基、アリル基若しくはアリール基であり、
・Ｒ２は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはアラニンからなり、
・Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ−、又は、−Ｏ−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ３からなり、
・Ｒ７は、Ｈ、Ｏ−ＣＨ３、アルキル基又はハロゲンからなり、
・Ｒ８は、Ｈ又はＣｌからなり、かつ、
・ｎは、０又は１の整数である：を有する。
本発明は、診断分野における使用に特に適している。
上記新規基質は、下記式：
【化１】
式中、
・Ｒ１は、存在しない、又は、アルキル基、アリル基若しくはアリール基であり、
・Ｒ２は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはアラニンからなり、
・Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ−、又は、−Ｏ−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ３からなり、
・Ｒ７は、Ｈ、Ｏ−ＣＨ３、アルキル基又はハロゲンからなり、
・Ｒ８は、Ｈ又はＣｌからなり、かつ、
・ｎは、０又は１の整数である：を有する。
本発明は、診断分野における使用に特に適している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノペプチダーゼ活性を検出するための新規の発色性酵素基質に関する。上記基質は、物理化学的なシグナルを発する酵素加水分解段階を含む用途、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において使用できる。また、本発明は、この基質を含む培養基、アミノペプチダーゼ活性を検出するための、又は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するための上記基質又は上記培養基の使用、及び、その使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の基質の大部分は蛍光性であるのに対し、この新規の基質は着色を生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるので、微生物を検出するためのゲル化媒体においてこの新規の基質を特に使用できる。
【０００３】
アミノペプチダーゼ活性を検出するための拡散しない発色性酵素基質が文献に記載されていて、従来技術から既に公知である。また、この基質は、本出願人による特許文献１及び２に含まれる。しかし、この基質には様々な欠点がある、すなわち、合成が困難であり、純度が低く、かつ、収率が低い。また、培養基中で使用する際には、培養基の組成を非常に正確に定義しなければ着色を観察できない。これ以外では、現在のところ文献に記載されている基質のうち、混合培養において固形媒体中で使用して微生物を検出できるものはない。
【０００４】
また、アクリジンに基づく物質が知られている。この物質は、以下の特性を有しているために使用される：
・着色特性、例えば非特許文献１若しくは２を参照、
・化学療法的特性、例えば非特許文献３、又は、
・ＤＮＡ中への挿入能、例えば非特許文献４若しくは５。
【０００５】
特許文献３は、アクリジンの誘導体であるアクリジノン（ａｃｒｉｄｉｎｏｎｅ）に基づく発色性酵素基質について提案している。酵素は、アクリジン基の７の位置にある基を切断できる。この構造では、エステラーゼ及びグリコシダーゼの酵素活性しか視覚化できない。
【特許文献１】ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９８／０４７３５
【特許文献２】ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９９／３８９９５
【特許文献３】ヨーロッパ特許Ｎｏ．ＥＰ−Ｂ−０２７０９４６
【非特許文献１】Ｓ．Ｒａｐｐｏｓｃｈら，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．２０００ Ｄｅｃ；８３（１２）：２７５３−２７５８
【非特許文献２】Ａ．Ｇｉｏｒｇｉｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ １９８９ Ｊａｎ；１２（１）：９７−１００
【非特許文献３】Ｎ．Ｃｏｓｔｅｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ｊｕｎ １５；４３（１２）：２３９５−２４０２
【非特許文献４】Ｏ．Ｏｋｗｕｍａｂｕａら，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２ Ｆｅｂ；１４３（２）：１８３−１８９
【非特許文献５】Ｔ．Ｓｃｈｅｌｈｏｒｎら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｊｕｌ；３８（４）：３４５−３６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明によれば、微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するための、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するための、新規の発色性酵素基質が提案される。また、本発明は、上記基質を含む培養基、並びに、アミノペプチダーゼ活性を検出するための、及び／又は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するための上記基質又は上記培養基の使用、並びに、その使用方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この趣旨において、本発明は、微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するための、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するための、発色性酵素基質に関する。上記基質は、下記式（Ｉ）を有する：
【０００８】
【化１】
【０００９】
式中、
・Ｒ１は、存在しない、又は、アルキル基、アリル基若しくはアリール基であり、
・Ｒ２は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはアラニンからなり、
・Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ−、又は、−Ｏ−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ３からなり、
・Ｒ７は、Ｈ、Ｏ−ＣＨ３、アルキル基又はハロゲンからなり、
・Ｒ８は、Ｈ又はＣｌからなり、かつ、
・ｎは、０又は１の整数である。
【００１０】
本発明によれば、「アリール基」という用語は特に、Ｃ６〜Ｃ１０芳香環、特にフェニル基、ベンジル基、１−ナフチル基又は２−ナフチル基を意味するものとする。
【００１１】
「アルキル基」という用語は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、すなわち炭素原子を１〜６個有する直鎖又は分岐のアルキル基を意味するものとする。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基及びヘキシル基が挙げられる。
【００１２】
「ハロゲン原子」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素及びフッ素を意味するものとする。
【００１３】
本発明において使用するアミノ酸は、当業者に公知の任意のアミノ酸である。
【００１４】
「少なくとも１個のアミノ酸」という表現は、１個以上のアミノ酸を意味するものとする。
【００１５】
本発明のある実施形態によれば、Ｒ２は、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０個のアミノ酸を有するペプチドを表わす。好ましくは、基質にかかるコストの理由のために、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる（好ましくは同一の）最大４個のアミノ酸を有するペプチドを表わす。
【００１６】
アミノ酸Ｒ２は遮断剤に結合でき、このことは本発明の別の実施形態である。
【００１７】
上記遮断剤は、アミンを保護できる当業者に公知の任意の遮断剤を含む。例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔＢＯＣ）、９−フルオレニルオキシカルボニル基、スクシニル基等の可溶性化剤、又は、ピペコリン酸等の代謝不可能なアミノ酸、すなわち非天然アミノ酸が挙げられる。
【００１８】
ある実施形態によれば、上記基質は下記式（Ｉａ）：
【００１９】
【化２】
【００２０】
又は、下記式（Ｉｂ）を有する。：
【００２１】
【化３】
【００２２】
別の実施形態によれば、上記基質は、Ｒ１がメチル基又はアリル基である上記式（Ｉ）である。
【００２３】
また別の実施形態によれば、上記基質は、Ｒ１がアルキル基、好ましくはメチル基又はアリル基であり、Ｒ２が、遮断剤によって任意に遮断された少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１個のアラニンであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８がＨであり、かつ、ｎが０又は１であるような上記式（Ｉ）である。
【００２４】
更に別の実施形態によれば、上記基質は下記式（Ｉｃ）：
【００２５】
【化４】
【００２６】
又は、下記式（Ｉｄ）を有する。：
【００２７】
【化５】
【００２８】
本発明の化合物は、ｎの値に応じて以下のように調製することができる。：
【００２９】
（１）ｎ＝０である場合、適切な塩酸アクリジン（Ｒ８がＨ又はＣｌである）を適切なアニリン（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が上記に定義するものである）及び硫黄と反応させて、適切な９−（４−アミノフェニル）アクリジンを得る。その後、遮断剤と結合している少なくとも１個のアミノ酸とこれを反応させ、得られた化合物を任意に脱保護して本発明の化合物から遮断剤を分離する。化合物の１０の位置にある窒素が四級であることが望ましい場合、得られた化合物を、ＸがハロゲンでＲ１が上記に定義するものであるようなＸＲ１と反応させる。
【００３０】
（２）ｎ＝１である場合、Ｃａｍｐｂｅｌｌらの方法（１９５８年、上記）に従って調製した９−メチルアクリジン又はＬｅｈｍｓｔｅｄｔ及びＳｃｈｒａｄｅｒの方法（Ａｌｂｅｒｔ，１９６６，上記）によって調製した９−クロロアクリジンを、適切なニトロベンズアルデヒド（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は上記に定義するものである）及び塩化亜鉛と反応させて、適切な９−（４−ニトロスチリル）アクリジンを調製する。その後、酢酸エチルとエタノールとの混合物中の塩化スズ（ＩＩ）、又は、ホウ化水素ナトリウム及び銅アセチルアセトネートのいずれかを使用してニトロ基を還元し、９−（４−アミノスチリル）アクリジンを得る。その後、遮断剤と結合している少なくとも１個のアミノ酸とこれを反応させ、得られた化合物を任意に脱保護して本発明の化合物から遮断剤を分離する。化合物の１０の位置にある窒素が四級であることが望ましい場合、得られた化合物を、ＸがハロゲンでＲ１が上記に定義するものであるようなＸＲ１と反応させる。
【００３１】
また、本発明は、少なくとも一種の上記発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した培養基に関する。
【００３２】
その結果、本発明の化合物を含む反応媒体中にペプチダーゼ活性を示す微生物を播種すると、着色が生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まる。
【００３３】
「本発明の反応媒体」という表現は、少なくとも一種の微生物の少なくとも一種の酵素活性を現わすことができる媒体を意味するものとする。
【００３４】
この反応媒体は、視覚化用の媒体としてのみ使用してもよいし、培養基及び視覚化用の媒体の両方として使用してもよい。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応媒体が培養基でもある。
【００３５】
反応媒体は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形媒体」という用語は、例えばゲル化媒体を意味するものとする。
【００３６】
この媒体はゲル化媒体からなることが好ましい。
【００３７】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用されるゲル化剤は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースを使用することもできる。例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ、Ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ ａｇａｒ、マッコンキー寒天（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用することができる。
【００３８】
反応媒体中における寒天の量は、２〜４０ｇ／ｌ、好ましくは９〜２５ｇ／ｌである。
【００３９】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用できる。
【００４０】
反応媒体中における本発明の酵素基質の濃度は０．０２５〜１．０ｇ／ｌ、有利には０．３ｇ／ｌである。この基質濃度である場合には、着色のコントラストがとりわけ良好である。
【００４１】
反応媒体は、本発明の基質によって検出される以外の酵素活性に特異的な少なくとも一種の他の基質を含んでいてもよい。この他の基質の酵素加水分解により、本発明の基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、一種以上の微生物について検出、識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【００４２】
他の特異的な基質としては、微生物の検出において従来から使用されている他の任意の基質を使用してもよい。
【００４３】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【００４４】
また、反応媒体は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、鉱物、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてもよい。媒体の例が、本出願人によるヨーロッパ特許ＥＰ６５６４２１及びＰＣＴ出願ＷＯ９９／０９２０７中に記載されている。
【００４５】
従って、本発明の酵素基質及び反応媒体は、ペプチダーゼ活性を有する微生物の分析において有用である。
【００４６】
上記より、本発明は、微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出するための、上記発色性酵素基質の使用、又は、上記培養基の使用にも関する。
【００４７】
また、本発明の主題は、グラム陽性着色された細菌とグラム陰性着色された細菌とを分けるための、上記発色性酵素基質の使用、又は、上記培養基の使用に関する。
【００４８】
最後に、本発明は、微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出する方法に関し、この方法は以下：
・上記培養基を準備すること、
・試験する生物試料を上記培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、これ以外の少なくとも一種の酵素活性と共に視覚化すること：
である。
【００４９】
また、本発明は、グラム陽性菌若しくはグラム陰性菌のいずれに属するかという点において細菌を識別する別の方法に関し、この方法は以下：
・上記培養基を準備すること、
・試験する生物試料を上記培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性の微生物が存在することを示す少なくとも一種の色の存在を視覚化すること：
である。
【００５０】
いずれの方法を使用する際にも、アクリジン基の１０の位置にある窒素が四級でない場合、酸、好ましくは塩酸、酢酸又はクエン酸を培養基中に添加することにより、少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を視覚化する。「四級」という用語は、アクリジン基の１０の位置にある窒素が４価であるために、すなわち、３個の一般的な結合でフェニル環と結合していて、かつ、別の結合で１個の基と結合しているために、上記窒素原子が正電荷を有していて陽イオン性であることを意味するものとして理解するべきである。この場合、上記物質は、塩、例えば塩化物、臭化物、トリフルオロ酢酸塩の形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下の実施例中に記載する全ての反応は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって測定し、また、生成物の構造は質量分析（ＭＳ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって確認した。
【実施例１】
【００５２】
＜非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
１．１：使用した物質
アクリジンに基づく二種の基質について比較検討した。この基質は、それぞれ下記式の、Ｌ−アラニル−９−（４−アミノスチリル）アクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡと呼ぶ）、及び、Ｌ−アラニル−アミノフェニルアクリジン（非四級基質）（以下、Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡと呼ぶ）である。：
【００５３】
【化６】
【００５４】
１．２：基質の合成
１．２．１：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡの合成
この合成は数段階に分けて実施する。
【００５５】
（９−クロロアクリジンの調製）
Ａｌｂｅｒｔ著の本（「Ｔｈｅ Ａｃｒｉｄｉｎｅｓ」、Ａｒｎｏｌｄ、第二版、３３頁（１９６６年））を参照して、Ｌｅｈｍｓｔｅｄｔ法及びＳｃｈｒａｄｅｒ法によって調製する。
【００５６】
（９−メチルアクリジンの調製）
Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｍｏｒｇａｎ及びＴｉｖｅｙ（参照：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５８，１１４５）の方法を使用した。収率は９０％に達した。
【００５７】
（融解による９−（４−ニトロスチリル）アクリジンの調製）
９−メチルアクリジン（４．８３ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）、４−ニトロベンズアルデヒド（４．２３ｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）及び塩化亜鉛（５．０６ｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）の混合物を、油浴を使用して１３０℃において３時間加熱する。回収した固形物をメタ重亜硫酸ナトリウム溶液中で加熱して過剰なアルデヒドを除去し、高温になった混合物をろ過する。得られた沈殿を最少量のテトラヒドロフラン中に溶解し、この溶液に水を添加して、生成物を沈殿として得る。この沈殿をろ過することによって回収し、乾燥させる。この生成物をエタノールから再結晶させてもよい。収率は３５％である。
【００５８】
（９−（４−アミノスチリル）アクリジンの調製）
生成物９−（４−ニトロスチリル）アクリジン（２．８６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２５０ｍｌ）中に溶解した後、還流する。塩化スズ（ＩＩ）（無水）（９．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）を高温のエタノール（１５０ｍｌ）中に溶解した溶液を冷却して、上記９−（４−ニトロスチリル）アクリジン溶液に添加する。この混合物を撹拌しながら還流下で５時間反応させる。冷却すると９−（４−アミノスチリル）アクリジンが沈殿し、この沈殿を真空下でろ過することによって分離する。ろ過したものを蒸発により乾燥させ、撹拌しながら水（５００ｍｌ）に溶解する。この溶液を水酸化ナトリウム溶液で塩基性にする（ｐＨ１３〜１４）。上記で分離した、高濃度のスズ塩を含む９−（４−アミノスチリル）アクリジン部分についても、同様に塩基性にする。９−（４−アミノスチリル）アクリジンをろ過することによって分離し、水洗して乾燥させる。以上によって十分に純粋となり、以下の段階で使用できる。
【００５９】
（ｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノスチリル）アクリジンの調製）
ｔ−Ｂｏｃアラニン（３．７９ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、この溶液を、エチレングリコ−ル／ドライアイスの混合物を使用して浴中で−１５℃に冷却する。この混合物にＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（２．０２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。その後、この反応混合物にクロロ蟻酸イソブチル（ＩＢＣＦ）（２．５３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。温度は−１０℃より低くなければならない。約３分後に、最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して−１５℃に冷却した９−（４−アミノスチリル）アクリジン（５．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を撹拌して、室温に戻す。フィルタープレートを含む漏斗を使用してろ過することによってＮ−メチルモルホリン塩を除去する。ロータリーエバポレーターを使用して、この混合物を最初の体積の４分の１まで蒸発させる。ろ過したものを、大量の水／氷の混合物中に撹拌しながら滴下により添加する。できた黄色の沈殿をろ過することによって回収し、水洗して乾燥させる。この生成物をメタノールから再結晶させてもよい。収率は実質７５％である。
【００６０】
また、他のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸類似体を使用して新規の物質を形成した。アミノ酸は以下のとおりである：プロリン、グリシン、セリン及びβ−アラニン。これらの物質について、収率は６０〜８０％の範囲であり、一般的にβ−アラニン類似体の収率が最も高く、一般的にセリン類似体の収率が最も低い。
【００６１】
１．２．２：Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡの合成
溶融硫黄の反応による９−（４−アミノフェニル）アクリジンの調製は、二つの異なる方法によって実施できる。
【００６２】
（方法Ａ）
塩酸アクリジン（９．７ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）、アニリン（８．３７ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）及び硫黄１０．０ｇを十分に混合し、効率的なフードの下で１３０℃において４時間加熱する。丸底フラスコ中の反応媒体を室温に冷却して高温のメタノール中に溶解し、濃い赤色の溶液を得る。この溶液を冷却して、ろ過することによって硫黄を除去する。ろ液を濃アンモニア水溶液を使用して塩基性にする。できた淡黄色の沈殿をろ過した後、冷メタノールで洗浄する。収率は６５％である。
【００６３】
（方法Ｂ）
アクリジン（８．０６ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）、塩酸アニリン（１１．６１ｇ、９０ｍｍｏｌ）及び硫黄１０．０ｇを十分に混合し、１３０℃において４時間加熱する。その後、上記の方法Ａと同様に、反応媒体を処理する。この後、上記二つの方法のうち一方及び／又はもう一方の方法に基づいて調製を実施する。
【００６４】
（ｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジンの調製）
ｔ−Ｂｏｃアラニン（３．７９ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、この溶液を、エチレングリコ−ル／ドライアイス混合物を使用して浴中で−１５℃に冷却する。この混合物にＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（２．０２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。その後、この反応混合物にクロロ蟻酸イソブチル（ＩＢＣＦ）（２．５３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。温度は−１０℃より低くなければならない。約３分後に、最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して−１５℃に冷却した９−（４−アミノフェニル）アクリジン（５．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を撹拌して、室温に戻す。フィルタープレートを含む漏斗を使用してろ過することによってＮ−メチルモルホリン塩を除去する。ロータリーエバポレーターを使用して、この混合物を最初の体積の４分の１まで蒸発させる。ろ過したものを、大量の水／氷の混合物中に撹拌しながら滴下により添加する。できた黄色の沈殿をろ過することによって回収し、水洗して乾燥させる。この生成物をメタノールから再結晶させてもよい。収率は７５％である。
【００６５】
また、他のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸類似体を使用して新規の物質を形成した。アミノ酸は以下のとおりである：プロリン、グリシン、セリン及びβ−アラニン。これらの物質について、収率は６０〜８０％の範囲であり、一般的にβ−アラニン類似体の収率が最も高く、一般的にセリン類似体の収率が最も低い。
【００６６】
１．３：媒体の調製
Ｌ−アラニル−９−（４−アミノスチリル）アクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡと呼ぶ）又はＬ−アラニル−アミノフェニルアクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡと呼ぶ）を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を等体積で二つに分ける。この二つの媒体はそれぞれ、以下を含む：ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−４−ＡＳＡを０．３ｇ／ｌ、及び、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−ＡＰＡを０．３ｇ／ｌ。
【００６７】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて各媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色を、塩酸を少量添加する前後について記録した。
【００６８】
１．４：結果
結果を下記表１中に示す。ＨＣｌが存在しない場合、二種の基質は自発的には着色しない。少量のＨＣｌが存在する場合、Ｌ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を有するコロニーの色は、灰色がかった薄紫色から薄紫色である。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の混合培養において、この二種類の微生物を分離できる。
【００６９】
【表１】
【００７０】
表１：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡ又はＬ−Ａｌａ−ＡＰＡを使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【実施例２】
【００７１】
＜四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
２．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−アリルアクリジニウム塩化物（Ｌ−ａｌａｎｙｌ−９−（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１０−ａｌｌｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（四級基質）（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡと表す）を使用して決定する。
【００７２】
【化７】
【００７３】
２．２：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡの合成
出発化合物はｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジンであり、これの合成については段落１．２．２（Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡの合成）中に既に開示している。閉鎖可能な１０ｍｌのフラスコ中の無水テトラヒドロフラン（４．０ｍｌ）にｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（０．８８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加して、沸騰するまで加熱して、この混合物の一部を溶液とする。この溶液／懸濁液を冷却し、臭化アリル（２．０ｍｌ）を添加する。その後、フラスコを８時間還流して、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって反応を定期的に測定する。冷却して溶媒を除去した後、四級塩をジエチルエーテルで洗浄して乾燥させる。
【００７４】
生成物を最少量のエタノール中に溶解し、ＨＣｌで飽和した酢酸エチル（１０ｍｌ）と共に撹拌する。数時間後に生じた沈殿を、減圧下でろ過することによって回収する。ろ過したものにエチルエーテルを添加することによって、生成物を更に回収することができる。生成物を合わせてエチルエーテルで洗浄し、水分を吸収しないように急速に乾燥させる。
【００７５】
２．３：媒体の調製
Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡを基質として含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を等体積で三つに分ける。この三つの媒体はそれぞれ、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡを０．１ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌ、０．４ｇ／ｌ含む。
【００７６】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて各媒体上に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【００７７】
２．４：結果
結果は色の濃さで、０〜４の範囲の任意の段階に基づいて表す。この結果を下記表２中に示す。
【００７８】
この基質を使用すると、（酸を添加せずに）コロニー中に集まった状態で自発的に着色が生じることによって、グラム陰性菌におけるＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化することができる。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の混合培養において、この二種類の微生物を分離できる。アクリジン基の１０の位置にある窒素を「四級化」することによって、実施例１中に記載する四級でない同種の物質とは異なり、酸を添加せずに自発的に反応させることができる。
【００７９】
【表２】
【００８０】
表２：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡと呼ばれる基質を使用した微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化における、基質の濃度の影響
【実施例３】
【００８１】
＜他の四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
３．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物（四級基質）（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
【００８２】
【化８】
【００８３】
３．２：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡの合成
この合成は上記段落２．２中で既に実施しているが、上記合成における臭化アリルをヨウ化メチルに置き換えた。Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを合成する際にはこれを参照するのがよい。
【００８４】
３．３：媒体の調製
Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを３００ｍｇ／ｌ含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後でオートクレーブし、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して基質を添加する。本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて媒体上に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【００８５】
３．４：結果
結果を下記表３中に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】
表３：濃度を最適化した基質Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡを使用した、微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【００８８】
この基質を使用すると、（酸を添加せずに）コロニー中に集まった状態で自発的にピンク−オレンジ色の着色が生じることによって、グラム陰性菌におけるＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化することができる。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の混合培養において、この二種類の微生物を分離できる。実施例２中に記載する基質とは異なり、この基質を使用することによって陽性株の色をより濃くすることができるようである。この二種類の基質は、アクリジン環の１０の位置にある窒素の基の種類が異なる。
【実施例４】
【００８９】
＜他の非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
４．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、それぞれ下記式のＬ−アラニル−２−メトキシアミノフェニルアクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡと呼ぶ）及びＬ−アラニル−２，５−ジメトキシアミノフェニルアクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡと呼ぶ）と呼ばれる二種類の基質を使用して視覚化する。
【００９０】
【化９】
【００９１】
４．２：基質の合成
４．２．１：Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡの合成
上記１．２．２の部に記載する方法に基づいて、他のアニリン類似体を使用して、新規の物質を形成する：例えばアニシジン（３−メトキシアニリン）を使用して９−（４−アミノ−２−メトキシフェニル）アクリジンを得る。
【００９２】
４．２．２：Ｌ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡの合成
上記１．２．２の部に記載する方法に基づいて、他のアニリン類似体を使用して、新規の物質を形成する：例えば２，５−ジメトキシアニリンを使用して９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシフェニル）アクリジンを得る。
【００９３】
４．３：媒体の調製
Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡ又はＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を等体積で二つに分ける。この二つの媒体はそれぞれ、以下を含む：ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡを０．３ｇ／ｌ、及び、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを０．３ｇ／ｌ。本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて各媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。ＨＣｌを添加した後で、このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【００９４】
４．４：結果
結果を下記表４中に示す。
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４：Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡ及びＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを使用した、微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
表中、＊ほとんど増殖していない
【００９７】
この二種類の基質を使用することによって、ＨＣｌを少量添加した後、グラム陽性菌におけるＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化できる。更に、フェニル基に（メトキシ）置換基を付加することによって、（特にグラム陽性菌に対する）基質の毒性を低減できる。しかし、このように増殖力が増大すると特異性が損なわれる；具体的には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓはＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを使用して４８時間インキュベートした後に活性を示す。
【実施例５】
【００９８】
＜ゲル化媒体における微生物のβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化：β−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物（四級基質）の使用＞
５．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のβ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物（四級基質）（以下、β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
【００９９】
【化１０】
【０１００】
５．２：β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡの合成
出発化合物はｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジンであり、これの合成については段落１．２．２（Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡの合成）中に既に開示している。ｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（０．６７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（最小体積）中に溶解し、ヨウ化メチル（４．０ｍｌ）を使用して還流する。その後フラスコを閉鎖し、４０℃において１００時間より長くインキュベートする。固体の反応物が反応が進行するにつれて溶解し、オレンジ色の溶液になる。この溶液中に、オレンジ色がかった黒色の結晶が生じる。
【０１０１】
１００時間後、この反応混合物を撹拌しながら酢酸エチル（１００ｍｌ）中に移す。所定時間後、四級塩をろ過してジエチルエーテルで洗浄する。
【０１０２】
生成物を最少量のエタノール中に溶解し、ＨＣｌで飽和した酢酸エチル（１０ｍｌ）と共に撹拌する。数時間後に生じた沈殿を、減圧下でろ過することによって回収する。ろ過したものにジエチルエーテルを添加することによって、生成物を更に回収することができる。生成物を合わせてジエチルエーテルで洗浄し、水分を吸収しないように急速に乾燥させる。
【０１０３】
脱保護は上記の方法と同様である。
【０１０４】
５．３：媒体の調製
β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを３００ｍｇ／ｌ含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後でオートクレーブし、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して基質を添加する。本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて媒体上に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【０１０５】
５．４：結果
結果を下記表５中に示す。
【０１０６】
この基質を使用すると、（酸を添加せずに）コロニー中に集まった状態で自発的にオレンジ色の着色が生じることによって、グラム陰性菌におけるβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化することができる。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株を確認でき、特にこの株と他の細菌とを識別できる。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５：β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを使用した、微生物のβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【実施例６】
【０１０９】
＜プロリンに基づく非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
６．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−プロリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（非四級基質）（以下、Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
実施される：
【０１１０】
【化１１】
【０１１１】
６．２：Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡの合成
この合成は上記段落１．２中で二つの方法Ａ及びＢに従って既に実施しているが、この方法におけるアミノ酸アラニンをアミノ酸プロリンに置き換えた。Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡを合成する際にはこれを参照するのがよい。
【０１１２】
６．３：媒体の調製
Ｌ−プロリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（以下、Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡと呼ぶ）を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：サブロー寒天４５ｇを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体は、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ｐｒｏ−ＡＰＡを０．３ｇ／ｌを含む。
【０１１３】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けてこの媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色を、酢酸（以下、ＧＡＡ（氷酢酸）と呼ぶ）を少量添加する前後について記録した。
【０１１４】
６．４：結果
結果を下記表６中に示す。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
表６：濃度を最適化した基質Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡを使用した、微生物のＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【０１１７】
特定のＣａｎｄｉｄａ酵母株について、この基質の阻害特性が実証される。しかし、酸を添加しなくても黄色に着色する酵母がある。この着色は特定の株について、特にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓについてより濃く、また、培養基が存在しない場合にもより濃い。このことから、アミノ酸としてプロリンを含む本出願人の基質を使用することよって、酵母におけるＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化できることが明らかである。
【実施例７】
【０１１８】
＜セリンに基づく非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−セリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
７．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−セリン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−セリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（非四級基質）（以下、Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
【０１１９】
【化１２】
【０１２０】
７．２：Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡの合成
Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡについて開示したように（上記段落６．２）、この合成は上記段落１．２中で二つの方法Ａ及びＢに従って既に実施しているが、この方法におけるアミノ酸アラニンをアミノ酸セリンに置き換えた。Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡを合成する際にはこれを参照するのがよい。
【０１２１】
７．３：媒体の調製
Ｌ−セリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（以下、Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡと呼ぶ）を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡ３０ｍｇを４ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加し、これを更に蒸留水０．１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を１１６℃において２０分間オートクレーブする。この基質の大部分は溶液状であり、着色は残っていない。
【０１２２】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用してこの媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。各懸濁液を１０μｌずつ採取した試料を培養して、コロニーを形成させた。１８〜２４時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
【０１２３】
このコロニーの色を、酢酸（以下、ＧＡＡ（氷酢酸）と呼ぶ）を少量添加する前後について記録した。
【０１２４】
７．４：結果
結果を下記表７中に示す。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
表７：濃度を最適化した基質Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡを使用した、微生物のＬ−セリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【０１２７】
ここでも、アクリジンに基づく基質によって、特定の株が部分的に阻害される。試験した三種のグラム陰性菌株においては、酢酸を添加した後に、反応による特定の着色が生じる。
【実施例８】
【０１２８】
＜１個、２個又は３個のＬ−アラニンに基づく四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
８．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、三種の基質、すなわち実施例３中に記載するＬ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡ、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡにＬ−アラニンが１個付加したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡ、更にＬ−アラニンが１個付加したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを使用して視覚化する。
【０１２９】
８．２：上記基質の合成
上記３．２の部に記載した方法と同様に、Ｌ−アラニンを１個、２個又は３個有する適切な出発化合物を使用して、上記基質を調製した。
【０１３０】
８．３：媒体の調製
上記三種の基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：各基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１３１】
こうして得られた媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を複数点接種法（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）によって播種した：各株について、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液１０μｌを各培養基上に載せた。
【０１３２】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１３３】
８．４：結果
結果を下記表８中に示す。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１３６】
この三種の媒体において、グラム陰性菌株はオレンジ色のコロニーを形成し、一方、グラム陽性菌株は無色のコロニーを形成した、又は、増殖しなかった。従って、この三種の媒体を使用することによって、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを識別することができ、この媒体によれば、試験した全ての又はいくつかの株の増殖を識別することができる。
【実施例９】
【０１３７】
＜ピログルタミル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン塩酸塩（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌ−９−（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１０−ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓａｌｔ）を使用する四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のピログルタミン−アミノペプチダーゼ（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）活性の視覚化＞
９．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のピログルタミン−アミノペプチダーゼ活性を、ピログルタミル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン（以下、ＰＧ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）を使用して視覚化する。
【０１３８】
９．２：この基質の合成
Ｌ−アラニンをピログルタミンに置き換える以外は上記３．２の部に記載した方法と同様に、この基質を調製した。
【０１３９】
９．３：媒体の調製
この基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：各基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１４０】
上記で得た媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を、上記実施例８中に記載した複数点接種法によって播種した。
【０１４１】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１４２】
９．４：結果
結果を下記表９中に示す。
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１４５】
この実施例の媒体を使用することによって、ピログルタミル−アミノペプチダーゼ活性を示す菌とこの活性を示さない菌とを識別することができる。
【実施例１０】
【０１４６】
＜グリシル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン塩酸塩に基づく四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のグリシン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
１０．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のグリシン−アミノペプチダーゼ活性を、グリシル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン（以下、Ｇ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）を使用して視覚化する。
【０１４７】
１０．２：この基質の合成
Ｌ−アラニンをグリシンに置き換える以外は上記３．２の部に記載した方法と同様に、この基質を調製した。
【０１４８】
１０．３：媒体の調製
この基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：この基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１４９】
上記で得た媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を、上記実施例８中に記載した複数点接種法によって播種した。
【０１５０】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１５１】
１０．４：結果
結果を下記表１０中に示す。
【０１５２】
【表１０】
【０１５３】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１５４】
この実施例の媒体を使用することによって、グリシルアミル−アミノペプチダーゼ（ｇｌｙｃｙｌａｍｙｌ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）活性を示す菌とこの活性を示さない菌とを識別することができる。
【実施例１１】
【０１５５】
＜ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン塩酸塩に基づく四級基質（アミノ酸が遮断剤に結合している）を使用した、ゲル化媒体における微生物のｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−ペプチダーゼ活性の視覚化＞
１１．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン（以下、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）を使用して視覚化する。
【０１５６】
１１．２：この基質の合成
アミノ化合物を脱保護しないこと以外は上記３．２の部に記載した方法と同様に、この基質を調製した。
【０１５７】
１１．３：媒体の調製
この基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：この基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１５８】
上記で得た媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を、上記実施例８中に記載した複数点接種法によって播種した。
【０１５９】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１６０】
１１．４：結果
結果を下記表１１中に示す。
【０１６１】
【表１１】
【０１６２】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１６３】
この実施例の媒体を使用することによって、４つの群の微生物を得ることができる：
・本来のオレンジ色のコロニーを形成する微生物、
・淡いオレンジ色のコロニーを形成する微生物、
・無色のコロニーを形成する微生物、及び、
・コロニーを形成しない微生物。
【０１６４】
試験した株のうち、グラム陰性菌は上記の最初の２つの群に属し、一方、グラム陽性菌は後の２つの群に属する。
【０１６５】
脱保護した基質について得られた結果（上記実施例８を参照）に対し、遮断剤（ｔ−Ｂｏｃ）の存在によって活性を調節することができる。
【０１６６】
（実施した他の実験）
本明細書中において示した結果が確認できる他の基質について試験した；例えば以下のものを挙げることができる。
・Ｌ−アラニル−９−（４−アミノ−３−メトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物
・Ｌ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・Ｌ−アラニル−９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・β−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・β−アラニル−９−（４−アミノ−２−メトキシアミノフェニル）アクリジン
・β−アラニル−９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシアミノフェニル）アクリジン
・β−アラニル−９−（４−アミノ−３−メトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・β−アラニル−９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
【０１６７】
同様に、以下のもの等の上記以外の種の微生物、一般的に細菌についても試験した。
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
・Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アミノペプチダーゼ活性を検出するための新規の発色性酵素基質に関する。上記基質は、物理化学的なシグナルを発する酵素加水分解段階を含む用途、特に微生物学、生化学、免疫学、分子生物学、組織学等において使用できる。また、本発明は、この基質を含む培養基、アミノペプチダーゼ活性を検出するための、又は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するための上記基質又は上記培養基の使用、及び、その使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
既存の基質の大部分は蛍光性であるのに対し、この新規の基質は着色を生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まるので、微生物を検出するためのゲル化媒体においてこの新規の基質を特に使用できる。
【０００３】
アミノペプチダーゼ活性を検出するための拡散しない発色性酵素基質が文献に記載されていて、従来技術から既に公知である。また、この基質は、本出願人による特許文献１及び２に含まれる。しかし、この基質には様々な欠点がある、すなわち、合成が困難であり、純度が低く、かつ、収率が低い。また、培養基中で使用する際には、培養基の組成を非常に正確に定義しなければ着色を観察できない。これ以外では、現在のところ文献に記載されている基質のうち、混合培養において固形媒体中で使用して微生物を検出できるものはない。
【０００４】
また、アクリジンに基づく物質が知られている。この物質は、以下の特性を有しているために使用される：
・着色特性、例えば非特許文献１若しくは２を参照、
・化学療法的特性、例えば非特許文献３、又は、
・ＤＮＡ中への挿入能、例えば非特許文献４若しくは５。
【０００５】
特許文献３は、アクリジンの誘導体であるアクリジノン（ａｃｒｉｄｉｎｏｎｅ）に基づく発色性酵素基質について提案している。酵素は、アクリジン基の７の位置にある基を切断できる。この構造では、エステラーゼ及びグリコシダーゼの酵素活性しか視覚化できない。
【特許文献１】ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９８／０４７３５
【特許文献２】ＰＣＴ出願ＷＯ−Ａ−９９／３８９９５
【特許文献３】ヨーロッパ特許Ｎｏ．ＥＰ−Ｂ−０２７０９４６
【非特許文献１】Ｓ．Ｒａｐｐｏｓｃｈら，Ｊ．Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ．２０００ Ｄｅｃ；８３（１２）：２７５３−２７５８
【非特許文献２】Ａ．Ｇｉｏｒｇｉｏら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａ １９８９ Ｊａｎ；１２（１）：９７−１００
【非特許文献３】Ｎ．Ｃｏｓｔｅｓら，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０００ Ｊｕｎ １５；４３（１２）：２３９５−２４０２
【非特許文献４】Ｏ．Ｏｋｗｕｍａｂｕａら，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２ Ｆｅｂ；１４３（２）：１８３−１８９
【非特許文献５】Ｔ．Ｓｃｈｅｌｈｏｒｎら，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９２ Ｊｕｌ；３８（４）：３４５−３６５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明によれば、微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するための、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するための、新規の発色性酵素基質が提案される。また、本発明は、上記基質を含む培養基、並びに、アミノペプチダーゼ活性を検出するための、及び／又は、グラム陽性菌とグラム陰性菌とを識別するための上記基質又は上記培養基の使用、並びに、その使用方法にも関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
この趣旨において、本発明は、微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するための、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するための、発色性酵素基質に関する。上記基質は、下記式（Ｉ）を有する：
【０００８】
【化１】
【０００９】
式中、
・Ｒ１は、存在しない、又は、アルキル基、アリル基若しくはアリール基であり、
・Ｒ２は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはアラニンからなり、
・Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ−、又は、−Ｏ−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ３からなり、
・Ｒ７は、Ｈ、Ｏ−ＣＨ３、アルキル基又はハロゲンからなり、
・Ｒ８は、Ｈ又はＣｌからなり、かつ、
・ｎは、０又は１の整数である。
【００１０】
本発明によれば、「アリール基」という用語は特に、Ｃ６〜Ｃ１０芳香環、特にフェニル基、ベンジル基、１−ナフチル基又は２−ナフチル基を意味するものとする。
【００１１】
「アルキル基」という用語は、Ｃ１〜Ｃ６のアルキル基、すなわち炭素原子を１〜６個有する直鎖又は分岐のアルキル基を意味するものとする。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基及びヘキシル基が挙げられる。
【００１２】
「ハロゲン原子」という用語は、塩素、臭素、ヨウ素及びフッ素を意味するものとする。
【００１３】
本発明において使用するアミノ酸は、当業者に公知の任意のアミノ酸である。
【００１４】
「少なくとも１個のアミノ酸」という表現は、１個以上のアミノ酸を意味するものとする。
【００１５】
本発明のある実施形態によれば、Ｒ２は、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる最大１０個のアミノ酸を有するペプチドを表わす。好ましくは、基質にかかるコストの理由のために、Ａは、アミノ酸、又は、同一の若しくは異なる（好ましくは同一の）最大４個のアミノ酸を有するペプチドを表わす。
【００１６】
アミノ酸Ｒ２は遮断剤に結合でき、このことは本発明の別の実施形態である。
【００１７】
上記遮断剤は、アミンを保護できる当業者に公知の任意の遮断剤を含む。例えば、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｎ−ｔＢＯＣ）、９−フルオレニルオキシカルボニル基、スクシニル基等の可溶性化剤、又は、ピペコリン酸等の代謝不可能なアミノ酸、すなわち非天然アミノ酸が挙げられる。
【００１８】
ある実施形態によれば、上記基質は下記式（Ｉａ）：
【００１９】
【化２】
【００２０】
又は、下記式（Ｉｂ）を有する。：
【００２１】
【化３】
【００２２】
別の実施形態によれば、上記基質は、Ｒ１がメチル基又はアリル基である上記式（Ｉ）である。
【００２３】
また別の実施形態によれば、上記基質は、Ｒ１がアルキル基、好ましくはメチル基又はアリル基であり、Ｒ２が、遮断剤によって任意に遮断された少なくとも１個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１個のアラニンであり、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７及びＲ８がＨであり、かつ、ｎが０又は１であるような上記式（Ｉ）である。
【００２４】
更に別の実施形態によれば、上記基質は下記式（Ｉｃ）：
【００２５】
【化４】
【００２６】
又は、下記式（Ｉｄ）を有する。：
【００２７】
【化５】
【００２８】
本発明の化合物は、ｎの値に応じて以下のように調製することができる。：
【００２９】
（１）ｎ＝０である場合、適切な塩酸アクリジン（Ｒ８がＨ又はＣｌである）を適切なアニリン（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６が上記に定義するものである）及び硫黄と反応させて、適切な９−（４−アミノフェニル）アクリジンを得る。その後、遮断剤と結合している少なくとも１個のアミノ酸とこれを反応させ、得られた化合物を任意に脱保護して本発明の化合物から遮断剤を分離する。化合物の１０の位置にある窒素が四級であることが望ましい場合、得られた化合物を、ＸがハロゲンでＲ１が上記に定義するものであるようなＸＲ１と反応させる。
【００３０】
（２）ｎ＝１である場合、Ｃａｍｐｂｅｌｌらの方法（１９５８年、上記）に従って調製した９−メチルアクリジン又はＬｅｈｍｓｔｅｄｔ及びＳｃｈｒａｄｅｒの方法（Ａｌｂｅｒｔ，１９６６，上記）によって調製した９−クロロアクリジンを、適切なニトロベンズアルデヒド（Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は上記に定義するものである）及び塩化亜鉛と反応させて、適切な９−（４−ニトロスチリル）アクリジンを調製する。その後、酢酸エチルとエタノールとの混合物中の塩化スズ（ＩＩ）、又は、ホウ化水素ナトリウム及び銅アセチルアセトネートのいずれかを使用してニトロ基を還元し、９−（４−アミノスチリル）アクリジンを得る。その後、遮断剤と結合している少なくとも１個のアミノ酸とこれを反応させ、得られた化合物を任意に脱保護して本発明の化合物から遮断剤を分離する。化合物の１０の位置にある窒素が四級であることが望ましい場合、得られた化合物を、ＸがハロゲンでＲ１が上記に定義するものであるようなＸＲ１と反応させる。
【００３１】
また、本発明は、少なくとも一種の上記発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した培養基に関する。
【００３２】
その結果、本発明の化合物を含む反応媒体中にペプチダーゼ活性を示す微生物を播種すると、着色が生じ、この着色は反応媒体中に拡散せずにコロニーの中に集まる。
【００３３】
「本発明の反応媒体」という表現は、少なくとも一種の微生物の少なくとも一種の酵素活性を現わすことができる媒体を意味するものとする。
【００３４】
この反応媒体は、視覚化用の媒体としてのみ使用してもよいし、培養基及び視覚化用の媒体の両方として使用してもよい。前者の場合においては播種前に微生物を培養し、後者の場合においては反応媒体が培養基でもある。
【００３５】
反応媒体は、固形、半固形又は液体であってよい。「固形媒体」という用語は、例えばゲル化媒体を意味するものとする。
【００３６】
この媒体はゲル化媒体からなることが好ましい。
【００３７】
微生物を培養するために微生物学において従来から使用されるゲル化剤は寒天であるが、ゼラチン又はアガロースを使用することもできる。例えば、Ｃｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒ、Ｔｒｙｐｃａｓｅ−ｓｏｙ ａｇａｒ、マッコンキー寒天（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ ａｇａｒ）、サブロー寒天（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ）、又は、より一般的には、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）中に記載されているもの等、いくつかの市販の調製品を使用することができる。
【００３８】
反応媒体中における寒天の量は、２〜４０ｇ／ｌ、好ましくは９〜２５ｇ／ｌである。
【００３９】
本発明の酵素基質は、広い範囲のｐＨにおいて、特にｐＨ５．５〜１０において使用できる。
【００４０】
反応媒体中における本発明の酵素基質の濃度は０．０２５〜１．０ｇ／ｌ、有利には０．３ｇ／ｌである。この基質濃度である場合には、着色のコントラストがとりわけ良好である。
【００４１】
反応媒体は、本発明の基質によって検出される以外の酵素活性に特異的な少なくとも一種の他の基質を含んでいてもよい。この他の基質の酵素加水分解により、本発明の基質によって検出されるシグナルとは異なる（例えば、色の異なる又は蛍光の異なる）検出可能なシグナルが生じるため、一種以上の微生物について検出、識別及び／又は定量等の実証が可能である。
【００４２】
他の特異的な基質としては、微生物の検出において従来から使用されている他の任意の基質を使用してもよい。
【００４３】
他の特異的な酵素基質の濃度は、一般的に０．０１〜２ｇ／ｌである。当業者であれば、使用する基質に応じて上記濃度を容易に決定できるであろう。
【００４４】
また、反応媒体は、アミノ酸、ペプトン、炭水化物、ヌクレオチド、鉱物、ビタミン、抗生物質、界面活性剤、バッファー、リン酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩又は金属塩等の一種以上の成分を組み合わせて含んでいてもよい。媒体の例が、本出願人によるヨーロッパ特許ＥＰ６５６４２１及びＰＣＴ出願ＷＯ９９／０９２０７中に記載されている。
【００４５】
従って、本発明の酵素基質及び反応媒体は、ペプチダーゼ活性を有する微生物の分析において有用である。
【００４６】
上記より、本発明は、微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出するための、上記発色性酵素基質の使用、又は、上記培養基の使用にも関する。
【００４７】
また、本発明の主題は、グラム陽性着色された細菌とグラム陰性着色された細菌とを分けるための、上記発色性酵素基質の使用、又は、上記培養基の使用に関する。
【００４８】
最後に、本発明は、微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出する方法に関し、この方法は以下：
・上記培養基を準備すること、
・試験する生物試料を上記培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、これ以外の少なくとも一種の酵素活性と共に視覚化すること：
である。
【００４９】
また、本発明は、グラム陽性菌若しくはグラム陰性菌のいずれに属するかという点において細菌を識別する別の方法に関し、この方法は以下：
・上記培養基を準備すること、
・試験する生物試料を上記培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性の微生物が存在することを示す少なくとも一種の色の存在を視覚化すること：
である。
【００５０】
いずれの方法を使用する際にも、アクリジン基の１０の位置にある窒素が四級でない場合、酸、好ましくは塩酸、酢酸又はクエン酸を培養基中に添加することにより、少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を視覚化する。「四級」という用語は、アクリジン基の１０の位置にある窒素が４価であるために、すなわち、３個の一般的な結合でフェニル環と結合していて、かつ、別の結合で１個の基と結合しているために、上記窒素原子が正電荷を有していて陽イオン性であることを意味するものとして理解するべきである。この場合、上記物質は、塩、例えば塩化物、臭化物、トリフルオロ酢酸塩の形態である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下の実施例中に記載する全ての反応は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって測定し、また、生成物の構造は質量分析（ＭＳ）及び核磁気共鳴（ＮＭＲ）によって確認した。
【実施例１】
【００５２】
＜非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
１．１：使用した物質
アクリジンに基づく二種の基質について比較検討した。この基質は、それぞれ下記式の、Ｌ−アラニル−９−（４−アミノスチリル）アクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡと呼ぶ）、及び、Ｌ−アラニル−アミノフェニルアクリジン（非四級基質）（以下、Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡと呼ぶ）である。：
【００５３】
【化６】
【００５４】
１．２：基質の合成
１．２．１：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡの合成
この合成は数段階に分けて実施する。
【００５５】
（９−クロロアクリジンの調製）
Ａｌｂｅｒｔ著の本（「Ｔｈｅ Ａｃｒｉｄｉｎｅｓ」、Ａｒｎｏｌｄ、第二版、３３頁（１９６６年））を参照して、Ｌｅｈｍｓｔｅｄｔ法及びＳｃｈｒａｄｅｒ法によって調製する。
【００５６】
（９−メチルアクリジンの調製）
Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ、Ｍｏｒｇａｎ及びＴｉｖｅｙ（参照：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９５８，１１４５）の方法を使用した。収率は９０％に達した。
【００５７】
（融解による９−（４−ニトロスチリル）アクリジンの調製）
９−メチルアクリジン（４．８３ｇ、２５．０ｍｍｏｌ）、４−ニトロベンズアルデヒド（４．２３ｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）及び塩化亜鉛（５．０６ｇ、３１．２５ｍｍｏｌ）の混合物を、油浴を使用して１３０℃において３時間加熱する。回収した固形物をメタ重亜硫酸ナトリウム溶液中で加熱して過剰なアルデヒドを除去し、高温になった混合物をろ過する。得られた沈殿を最少量のテトラヒドロフラン中に溶解し、この溶液に水を添加して、生成物を沈殿として得る。この沈殿をろ過することによって回収し、乾燥させる。この生成物をエタノールから再結晶させてもよい。収率は３５％である。
【００５８】
（９−（４−アミノスチリル）アクリジンの調製）
生成物９−（４−ニトロスチリル）アクリジン（２．８６ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（２５０ｍｌ）中に溶解した後、還流する。塩化スズ（ＩＩ）（無水）（９．０ｇ、４０ｍｍｏｌ）を高温のエタノール（１５０ｍｌ）中に溶解した溶液を冷却して、上記９−（４−ニトロスチリル）アクリジン溶液に添加する。この混合物を撹拌しながら還流下で５時間反応させる。冷却すると９−（４−アミノスチリル）アクリジンが沈殿し、この沈殿を真空下でろ過することによって分離する。ろ過したものを蒸発により乾燥させ、撹拌しながら水（５００ｍｌ）に溶解する。この溶液を水酸化ナトリウム溶液で塩基性にする（ｐＨ１３〜１４）。上記で分離した、高濃度のスズ塩を含む９−（４−アミノスチリル）アクリジン部分についても、同様に塩基性にする。９−（４−アミノスチリル）アクリジンをろ過することによって分離し、水洗して乾燥させる。以上によって十分に純粋となり、以下の段階で使用できる。
【００５９】
（ｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノスチリル）アクリジンの調製）
ｔ−Ｂｏｃアラニン（３．７９ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、この溶液を、エチレングリコ−ル／ドライアイスの混合物を使用して浴中で−１５℃に冷却する。この混合物にＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（２．０２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。その後、この反応混合物にクロロ蟻酸イソブチル（ＩＢＣＦ）（２．５３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。温度は−１０℃より低くなければならない。約３分後に、最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して−１５℃に冷却した９−（４−アミノスチリル）アクリジン（５．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を撹拌して、室温に戻す。フィルタープレートを含む漏斗を使用してろ過することによってＮ−メチルモルホリン塩を除去する。ロータリーエバポレーターを使用して、この混合物を最初の体積の４分の１まで蒸発させる。ろ過したものを、大量の水／氷の混合物中に撹拌しながら滴下により添加する。できた黄色の沈殿をろ過することによって回収し、水洗して乾燥させる。この生成物をメタノールから再結晶させてもよい。収率は実質７５％である。
【００６０】
また、他のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸類似体を使用して新規の物質を形成した。アミノ酸は以下のとおりである：プロリン、グリシン、セリン及びβ−アラニン。これらの物質について、収率は６０〜８０％の範囲であり、一般的にβ−アラニン類似体の収率が最も高く、一般的にセリン類似体の収率が最も低い。
【００６１】
１．２．２：Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡの合成
溶融硫黄の反応による９−（４−アミノフェニル）アクリジンの調製は、二つの異なる方法によって実施できる。
【００６２】
（方法Ａ）
塩酸アクリジン（９．７ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）、アニリン（８．３７ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）及び硫黄１０．０ｇを十分に混合し、効率的なフードの下で１３０℃において４時間加熱する。丸底フラスコ中の反応媒体を室温に冷却して高温のメタノール中に溶解し、濃い赤色の溶液を得る。この溶液を冷却して、ろ過することによって硫黄を除去する。ろ液を濃アンモニア水溶液を使用して塩基性にする。できた淡黄色の沈殿をろ過した後、冷メタノールで洗浄する。収率は６５％である。
【００６３】
（方法Ｂ）
アクリジン（８．０６ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）、塩酸アニリン（１１．６１ｇ、９０ｍｍｏｌ）及び硫黄１０．０ｇを十分に混合し、１３０℃において４時間加熱する。その後、上記の方法Ａと同様に、反応媒体を処理する。この後、上記二つの方法のうち一方及び／又はもう一方の方法に基づいて調製を実施する。
【００６４】
（ｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジンの調製）
ｔ−Ｂｏｃアラニン（３．７９ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解し、この溶液を、エチレングリコ−ル／ドライアイス混合物を使用して浴中で−１５℃に冷却する。この混合物にＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）（２．０２ｇ、２０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。その後、この反応混合物にクロロ蟻酸イソブチル（ＩＢＣＦ）（２．５３ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を滴下により添加する。温度は−１０℃より低くなければならない。約３分後に、最少量の無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解して−１５℃に冷却した９−（４−アミノフェニル）アクリジン（５．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加する。この反応混合物を撹拌して、室温に戻す。フィルタープレートを含む漏斗を使用してろ過することによってＮ−メチルモルホリン塩を除去する。ロータリーエバポレーターを使用して、この混合物を最初の体積の４分の１まで蒸発させる。ろ過したものを、大量の水／氷の混合物中に撹拌しながら滴下により添加する。できた黄色の沈殿をろ過することによって回収し、水洗して乾燥させる。この生成物をメタノールから再結晶させてもよい。収率は７５％である。
【００６５】
また、他のｔ−Ｂｏｃ保護アミノ酸類似体を使用して新規の物質を形成した。アミノ酸は以下のとおりである：プロリン、グリシン、セリン及びβ−アラニン。これらの物質について、収率は６０〜８０％の範囲であり、一般的にβ−アラニン類似体の収率が最も高く、一般的にセリン類似体の収率が最も低い。
【００６６】
１．３：媒体の調製
Ｌ−アラニル−９−（４−アミノスチリル）アクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡと呼ぶ）又はＬ−アラニル−アミノフェニルアクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡと呼ぶ）を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を等体積で二つに分ける。この二つの媒体はそれぞれ、以下を含む：ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−４−ＡＳＡを０．３ｇ／ｌ、及び、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−ＡＰＡを０．３ｇ／ｌ。
【００６７】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて各媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色を、塩酸を少量添加する前後について記録した。
【００６８】
１．４：結果
結果を下記表１中に示す。ＨＣｌが存在しない場合、二種の基質は自発的には着色しない。少量のＨＣｌが存在する場合、Ｌ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を有するコロニーの色は、灰色がかった薄紫色から薄紫色である。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の混合培養において、この二種類の微生物を分離できる。
【００６９】
【表１】
【００７０】
表１：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＳＡ又はＬ−Ａｌａ−ＡＰＡを使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【実施例２】
【００７１】
＜四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
２．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−アリルアクリジニウム塩化物（Ｌ−ａｌａｎｙｌ−９−（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１０−ａｌｌｙｌａｃｒｉｄｉｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（四級基質）（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡと表す）を使用して決定する。
【００７２】
【化７】
【００７３】
２．２：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡの合成
出発化合物はｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジンであり、これの合成については段落１．２．２（Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡの合成）中に既に開示している。閉鎖可能な１０ｍｌのフラスコ中の無水テトラヒドロフラン（４．０ｍｌ）にｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（０．８８ｇ、２．０ｍｍｏｌ）を添加して、沸騰するまで加熱して、この混合物の一部を溶液とする。この溶液／懸濁液を冷却し、臭化アリル（２．０ｍｌ）を添加する。その後、フラスコを８時間還流して、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって反応を定期的に測定する。冷却して溶媒を除去した後、四級塩をジエチルエーテルで洗浄して乾燥させる。
【００７４】
生成物を最少量のエタノール中に溶解し、ＨＣｌで飽和した酢酸エチル（１０ｍｌ）と共に撹拌する。数時間後に生じた沈殿を、減圧下でろ過することによって回収する。ろ過したものにエチルエーテルを添加することによって、生成物を更に回収することができる。生成物を合わせてエチルエーテルで洗浄し、水分を吸収しないように急速に乾燥させる。
【００７５】
２．３：媒体の調製
Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡを基質として含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を等体積で三つに分ける。この三つの媒体はそれぞれ、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡを０．１ｇ／ｌ、０．２ｇ／ｌ、０．４ｇ／ｌ含む。
【００７６】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて各媒体上に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【００７７】
２．４：結果
結果は色の濃さで、０〜４の範囲の任意の段階に基づいて表す。この結果を下記表２中に示す。
【００７８】
この基質を使用すると、（酸を添加せずに）コロニー中に集まった状態で自発的に着色が生じることによって、グラム陰性菌におけるＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化することができる。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の混合培養において、この二種類の微生物を分離できる。アクリジン基の１０の位置にある窒素を「四級化」することによって、実施例１中に記載する四級でない同種の物質とは異なり、酸を添加せずに自発的に反応させることができる。
【００７９】
【表２】
【００８０】
表２：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡと呼ばれる基質を使用した微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化における、基質の濃度の影響
【実施例３】
【００８１】
＜他の四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
３．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物（四級基質）（以下、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
【００８２】
【化８】
【００８３】
３．２：Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡの合成
この合成は上記段落２．２中で既に実施しているが、上記合成における臭化アリルをヨウ化メチルに置き換えた。Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを合成する際にはこれを参照するのがよい。
【００８４】
３．３：媒体の調製
Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを３００ｍｇ／ｌ含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後でオートクレーブし、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して基質を添加する。本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて媒体上に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【００８５】
３．４：結果
結果を下記表３中に示す。
【００８６】
【表３】
【００８７】
表３：濃度を最適化した基質Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＡＡを使用した、微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【００８８】
この基質を使用すると、（酸を添加せずに）コロニー中に集まった状態で自発的にピンク−オレンジ色の着色が生じることによって、グラム陰性菌におけるＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化することができる。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、グラム陽性菌とグラム陰性菌の混合培養において、この二種類の微生物を分離できる。実施例２中に記載する基質とは異なり、この基質を使用することによって陽性株の色をより濃くすることができるようである。この二種類の基質は、アクリジン環の１０の位置にある窒素の基の種類が異なる。
【実施例４】
【００８９】
＜他の非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
４．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、それぞれ下記式のＬ−アラニル−２−メトキシアミノフェニルアクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡと呼ぶ）及びＬ−アラニル−２，５−ジメトキシアミノフェニルアクリジン（以下、Ｌ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡと呼ぶ）と呼ばれる二種類の基質を使用して視覚化する。
【００９０】
【化９】
【００９１】
４．２：基質の合成
４．２．１：Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡの合成
上記１．２．２の部に記載する方法に基づいて、他のアニリン類似体を使用して、新規の物質を形成する：例えばアニシジン（３−メトキシアニリン）を使用して９−（４−アミノ−２−メトキシフェニル）アクリジンを得る。
【００９２】
４．２．２：Ｌ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡの合成
上記１．２．２の部に記載する方法に基づいて、他のアニリン類似体を使用して、新規の物質を形成する：例えば２，５−ジメトキシアニリンを使用して９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシフェニル）アクリジンを得る。
【００９３】
４．３：媒体の調製
Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡ又はＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を等体積で二つに分ける。この二つの媒体はそれぞれ、以下を含む：ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡを０．３ｇ／ｌ、及び、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを０．３ｇ／ｌ。本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて各媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。ＨＣｌを添加した後で、このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【００９４】
４．４：結果
結果を下記表４中に示す。
【００９５】
【表４】
【００９６】
表４：Ｌ−Ａｌａ−２−ＭｅＯＡＰＡ及びＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを使用した、微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
表中、＊ほとんど増殖していない
【００９７】
この二種類の基質を使用することによって、ＨＣｌを少量添加した後、グラム陽性菌におけるＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化できる。更に、フェニル基に（メトキシ）置換基を付加することによって、（特にグラム陽性菌に対する）基質の毒性を低減できる。しかし、このように増殖力が増大すると特異性が損なわれる；具体的には、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓはＬ−Ａｌａ−２，５−ジＭｅＯＡＰＡを使用して４８時間インキュベートした後に活性を示す。
【実施例５】
【００９８】
＜ゲル化媒体における微生物のβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化：β−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物（四級基質）の使用＞
５．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のβ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物（四級基質）（以下、β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
【００９９】
【化１０】
【０１００】
５．２：β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡの合成
出発化合物はｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジンであり、これの合成については段落１．２．２（Ｌ−Ａｌａ−ＡＰＡの合成）中に既に開示している。ｔ−Ｂｏｃ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（０．６７ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（最小体積）中に溶解し、ヨウ化メチル（４．０ｍｌ）を使用して還流する。その後フラスコを閉鎖し、４０℃において１００時間より長くインキュベートする。固体の反応物が反応が進行するにつれて溶解し、オレンジ色の溶液になる。この溶液中に、オレンジ色がかった黒色の結晶が生じる。
【０１０１】
１００時間後、この反応混合物を撹拌しながら酢酸エチル（１００ｍｌ）中に移す。所定時間後、四級塩をろ過してジエチルエーテルで洗浄する。
【０１０２】
生成物を最少量のエタノール中に溶解し、ＨＣｌで飽和した酢酸エチル（１０ｍｌ）と共に撹拌する。数時間後に生じた沈殿を、減圧下でろ過することによって回収する。ろ過したものにジエチルエーテルを添加することによって、生成物を更に回収することができる。生成物を合わせてジエチルエーテルで洗浄し、水分を吸収しないように急速に乾燥させる。
【０１０３】
脱保護は上記の方法と同様である。
【０１０４】
５．３：媒体の調製
β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを３００ｍｇ／ｌ含むゲル化媒体を、以下のように調製する：４６．３７ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒを蒸留水１リットル中に添加した後でオートクレーブし、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して基質を添加する。本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けて媒体上に播種した。培養皿を３７℃において４８時間インキュベートした。２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及びこの色の濃さについて記録した。
【０１０５】
５．４：結果
結果を下記表５中に示す。
【０１０６】
この基質を使用すると、（酸を添加せずに）コロニー中に集まった状態で自発的にオレンジ色の着色が生じることによって、グラム陰性菌におけるβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化することができる。この活性を有しないコロニーは無色のままである。従って、この基質は感受性がありかつ特異的である。この基質を使用することによって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株を確認でき、特にこの株と他の細菌とを識別できる。
【０１０７】
【表５】
【０１０８】
表５：β−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを使用した、微生物のβ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【実施例６】
【０１０９】
＜プロリンに基づく非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
６．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−プロリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（非四級基質）（以下、Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
実施される：
【０１１０】
【化１１】
【０１１１】
６．２：Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡの合成
この合成は上記段落１．２中で二つの方法Ａ及びＢに従って既に実施しているが、この方法におけるアミノ酸アラニンをアミノ酸プロリンに置き換えた。Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡを合成する際にはこれを参照するのがよい。
【０１１２】
６．３：媒体の調製
Ｌ−プロリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（以下、Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡと呼ぶ）を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：サブロー寒天４５ｇを蒸留水１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体は、ＤＭＳＯ中に溶解した原液を使用して得られるＬ−Ｐｒｏ−ＡＰＡを０．３ｇ／ｌを含む。
【０１１３】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用して、三か所に分けてこの媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。２４時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色を、酢酸（以下、ＧＡＡ（氷酢酸）と呼ぶ）を少量添加する前後について記録した。
【０１１４】
６．４：結果
結果を下記表６中に示す。
【０１１５】
【表６】
【０１１６】
表６：濃度を最適化した基質Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡを使用した、微生物のＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【０１１７】
特定のＣａｎｄｉｄａ酵母株について、この基質の阻害特性が実証される。しかし、酸を添加しなくても黄色に着色する酵母がある。この着色は特定の株について、特にＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓについてより濃く、また、培養基が存在しない場合にもより濃い。このことから、アミノ酸としてプロリンを含む本出願人の基質を使用することよって、酵母におけるＬ−プロリン−アミノペプチダーゼ活性を視覚化できることが明らかである。
【実施例７】
【０１１８】
＜セリンに基づく非四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−セリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
７．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−セリン−アミノペプチダーゼ活性を、下記式のＬ−セリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（非四級基質）（以下、Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡと呼ぶ）と呼ばれる基質を使用して視覚化する。
【０１１９】
【化１２】
【０１２０】
７．２：Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡの合成
Ｌ−Ｐｒｏ−４−ＡＰＡについて開示したように（上記段落６．２）、この合成は上記段落１．２中で二つの方法Ａ及びＢに従って既に実施しているが、この方法におけるアミノ酸アラニンをアミノ酸セリンに置き換えた。Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡを合成する際にはこれを参照するのがよい。
【０１２１】
７．３：媒体の調製
Ｌ−セリル−９−（４−アミノフェニル）アクリジン（以下、Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡと呼ぶ）を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡ３０ｍｇを４ｇのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加し、これを更に蒸留水０．１リットル中に添加した後、オートクレーブする。この反応媒体を１１６℃において２０分間オートクレーブする。この基質の大部分は溶液状であり、着色は残っていない。
【０１２２】
本出願人が保存している株に由来する微生物を、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液を使用してこの媒体上に播種した。培養皿を３７℃において２４時間インキュベートした。各懸濁液を１０μｌずつ採取した試料を培養して、コロニーを形成させた。１８〜２４時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。
【０１２３】
このコロニーの色を、酢酸（以下、ＧＡＡ（氷酢酸）と呼ぶ）を少量添加する前後について記録した。
【０１２４】
７．４：結果
結果を下記表７中に示す。
【０１２５】
【表７】
【０１２６】
表７：濃度を最適化した基質Ｌ−Ｓｅｒ−４−ＡＰＡを使用した、微生物のＬ−セリン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化
【０１２７】
ここでも、アクリジンに基づく基質によって、特定の株が部分的に阻害される。試験した三種のグラム陰性菌株においては、酢酸を添加した後に、反応による特定の着色が生じる。
【実施例８】
【０１２８】
＜１個、２個又は３個のＬ−アラニンに基づく四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
８．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、三種の基質、すなわち実施例３中に記載するＬ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡ、Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡにＬ−アラニンが１個付加したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡ、更にＬ−アラニンが１個付加したＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡを使用して視覚化する。
【０１２９】
８．２：上記基質の合成
上記３．２の部に記載した方法と同様に、Ｌ−アラニンを１個、２個又は３個有する適切な出発化合物を使用して、上記基質を調製した。
【０１３０】
８．３：媒体の調製
上記三種の基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：各基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１３１】
こうして得られた媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を複数点接種法（ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）によって播種した：各株について、０．５ＭｃＦａｒｌａｎｄの懸濁液１０μｌを各培養基上に載せた。
【０１３２】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１３３】
８．４：結果
結果を下記表８中に示す。
【０１３４】
【表８】
【０１３５】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１３６】
この三種の媒体において、グラム陰性菌株はオレンジ色のコロニーを形成し、一方、グラム陽性菌株は無色のコロニーを形成した、又は、増殖しなかった。従って、この三種の媒体を使用することによって、グラム陰性菌とグラム陽性菌とを識別することができ、この媒体によれば、試験した全ての又はいくつかの株の増殖を識別することができる。
【実施例９】
【０１３７】
＜ピログルタミル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン塩酸塩（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｙｌ−９−（４−ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）−１０−ｍｅｔｈｙｌａｃｒｉｄｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ ｓａｌｔ）を使用する四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のピログルタミン−アミノペプチダーゼ（ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）活性の視覚化＞
９．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のピログルタミン−アミノペプチダーゼ活性を、ピログルタミル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン（以下、ＰＧ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）を使用して視覚化する。
【０１３８】
９．２：この基質の合成
Ｌ−アラニンをピログルタミンに置き換える以外は上記３．２の部に記載した方法と同様に、この基質を調製した。
【０１３９】
９．３：媒体の調製
この基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：各基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１４０】
上記で得た媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を、上記実施例８中に記載した複数点接種法によって播種した。
【０１４１】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１４２】
９．４：結果
結果を下記表９中に示す。
【０１４３】
【表９】
【０１４４】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１４５】
この実施例の媒体を使用することによって、ピログルタミル−アミノペプチダーゼ活性を示す菌とこの活性を示さない菌とを識別することができる。
【実施例１０】
【０１４６】
＜グリシル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン塩酸塩に基づく四級基質を使用した、ゲル化媒体における微生物のグリシン−アミノペプチダーゼ活性の視覚化＞
１０．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のグリシン−アミノペプチダーゼ活性を、グリシル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン（以下、Ｇ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）を使用して視覚化する。
【０１４７】
１０．２：この基質の合成
Ｌ−アラニンをグリシンに置き換える以外は上記３．２の部に記載した方法と同様に、この基質を調製した。
【０１４８】
１０．３：媒体の調製
この基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：この基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１４９】
上記で得た媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を、上記実施例８中に記載した複数点接種法によって播種した。
【０１５０】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１５１】
１０．４：結果
結果を下記表１０中に示す。
【０１５２】
【表１０】
【０１５３】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１５４】
この実施例の媒体を使用することによって、グリシルアミル−アミノペプチダーゼ（ｇｌｙｃｙｌａｍｙｌ−ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）活性を示す菌とこの活性を示さない菌とを識別することができる。
【実施例１１】
【０１５５】
＜ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン塩酸塩に基づく四級基質（アミノ酸が遮断剤に結合している）を使用した、ゲル化媒体における微生物のｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−ペプチダーゼ活性の視覚化＞
１１．１：使用した物質
ゲル化媒体における微生物のＬ−アラニン−アミノペプチダーゼ活性を、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジン（以下、ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−Ａｌａ−４−ＡＰ−１０−ＭＡと呼ぶ）を使用して視覚化する。
【０１５６】
１１．２：この基質の合成
アミノ化合物を脱保護しないこと以外は上記３．２の部に記載した方法と同様に、この基質を調製した。
【０１５７】
１１．３：媒体の調製
この基質を含むゲル化媒体を、以下のように調製する：この基質３０ｍｇを、滅菌蒸留水１０ｍｌ中に（加熱）溶解する。この溶液１０ｍｌを、５０℃において溶融状に維持した９０ｍｌのＣｏｌｕｍｂｉａ ａｇａｒに添加する。
【０１５８】
上記で得た媒体上に、ＮＣＴＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、英国コリンデール）が保存している株に由来する様々な微生物株を、上記実施例８中に記載した複数点接種法によって播種した。
【０１５９】
２４時間及び４８時間インキュベートした後に、形成されたコロニーの外観を調べた。このコロニーの色及び増殖を記録した。
【０１６０】
１１．４：結果
結果を下記表１１中に示す。
【０１６１】
【表１１】
【０１６２】
＋＋は良好な増殖、＋は適度な増殖、＋／−は不十分な増殖、ＮＧは増殖していないことを意味する。
【０１６３】
この実施例の媒体を使用することによって、４つの群の微生物を得ることができる：
・本来のオレンジ色のコロニーを形成する微生物、
・淡いオレンジ色のコロニーを形成する微生物、
・無色のコロニーを形成する微生物、及び、
・コロニーを形成しない微生物。
【０１６４】
試験した株のうち、グラム陰性菌は上記の最初の２つの群に属し、一方、グラム陽性菌は後の２つの群に属する。
【０１６５】
脱保護した基質について得られた結果（上記実施例８を参照）に対し、遮断剤（ｔ−Ｂｏｃ）の存在によって活性を調節することができる。
【０１６６】
（実施した他の実験）
本明細書中において示した結果が確認できる他の基質について試験した；例えば以下のものを挙げることができる。
・Ｌ−アラニル−９−（４−アミノ−３−メトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物
・Ｌ−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・Ｌ−アラニル−９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・β−アラニル−９−（４−アミノフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・β−アラニル−９−（４−アミノ−２−メトキシアミノフェニル）アクリジン
・β−アラニル−９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシアミノフェニル）アクリジン
・β−アラニル−９−（４−アミノ−３−メトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
・β−アラニル−９−（４−アミノ−２，５−ジメトキシフェニル）−１０−メチルアクリジニウム塩化物の塩酸塩
【０１６７】
同様に、以下のもの等の上記以外の種の微生物、一般的に細菌についても試験した。
・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ
・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
・Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するための、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するための、発色性酵素基質であって、
下記式（Ｉ）を有する：
【化１】
式中、
・Ｒ１は、存在しない、又は、アルキル基、アリル基若しくはアリール基であり、
・Ｒ２は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはアラニンからなり、
・Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ−、又は、−Ｏ−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ３からなり、
・Ｒ７は、Ｈ、Ｏ−ＣＨ３、アルキル基又はハロゲンからなり、
・Ｒ８は、Ｈ又はＣｌからなり、かつ、
・ｎは、０又は１の整数である：
ことを特徴とする基質。
【請求項２】
下記式（Ｉａ）を有する：
【化２】
又は、下記式（Ｉｂ）を有する：
【化３】
ことを特徴とする請求項１に記載の基質。
【請求項３】
Ｒ１がメチル基又はアリル基である
ことを特徴とする請求項１に記載の基質。
【請求項４】
下記式（Ｉｃ）を有する：
【化４】
又は、下記式（Ｉｄ）を有する：
【化５】
ことを特徴とする請求項１に記載の基質。
【請求項５】
Ｒ２又はＬ−アラニンが遮断剤と結合している
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の基質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも一種の発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した培養基。
【請求項７】
ゲル化媒体からなる
ことを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項８】
微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の使用、又は、請求項６又は７に記載の培養基の使用。
【請求項９】
グラム陽性着色された細菌とグラム陰性着色された細菌とを分けるための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の使用、又は、請求項６又は７に記載の培養基の使用。
【請求項１０】
微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
以下：
・請求項６又は７に記載の培養基を準備すること、
・試験する生物試料を前期培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、アミノペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の酵素活性と共に視覚化すること：
である
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
グラム陽性菌若しくはグラム陰性菌のいずれに属するかという点において細菌を識別する方法であって、
以下：
・請求項６又は７に記載の培養基を準備すること、
・試験する生物試料を前期培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性の微生物が存在することを示す少なくとも一種の色の存在を視覚化すること：
である
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
アクリジン基の１０の位置にある窒素が四級でない場合、酸、好ましくは塩酸、酢酸又はクエン酸を培養基中に添加することにより、少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を視覚化する
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１】
微生物におけるアミノペプチダーゼ活性を着色によって検出するための、又は、少なくとも一種の細菌がグラム陽性群若しくはグラム陰性群のいずれに属するかを着色によって決定するための、発色性酵素基質であって、
下記式（Ｉ）を有する：
【化１】
式中、
・Ｒ１は、存在しない、又は、アルキル基、アリル基若しくはアリール基であり、
・Ｒ２は、少なくとも１個のアミノ酸、好ましくはアラニンからなり、
・Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は、互いに独立して、Ｈ−、又は、−Ｏ−アルキル基、好ましくは−Ｏ−ＣＨ３からなり、
・Ｒ７は、Ｈ、Ｏ−ＣＨ３、アルキル基又はハロゲンからなり、
・Ｒ８は、Ｈ又はＣｌからなり、かつ、
・ｎは、０又は１の整数である：
ことを特徴とする基質。
【請求項２】
下記式（Ｉａ）を有する：
【化２】
又は、下記式（Ｉｂ）を有する：
【化３】
ことを特徴とする請求項１に記載の基質。
【請求項３】
Ｒ１がメチル基又はアリル基である
ことを特徴とする請求項１に記載の基質。
【請求項４】
下記式（Ｉｃ）を有する：
【化４】
又は、下記式（Ｉｄ）を有する：
【化５】
ことを特徴とする請求項１に記載の基質。
【請求項５】
Ｒ２又はＬ−アラニンが遮断剤と結合している
ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の基質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の少なくとも一種の発色性酵素基質を、単独で使用した、又は、本発明の基質によって検出される酵素活性以外の酵素活性に特異的な少なくとも一種の他の酵素基質と併用して使用した培養基。
【請求項７】
ゲル化媒体からなる
ことを特徴とする請求項６に記載の媒体。
【請求項８】
微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の使用、又は、請求項６又は７に記載の培養基の使用。
【請求項９】
グラム陽性着色された細菌とグラム陰性着色された細菌とを分けるための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発色性酵素基質の使用、又は、請求項６又は７に記載の培養基の使用。
【請求項１０】
微生物における少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性を検出する方法であって、
以下：
・請求項６又は７に記載の培養基を準備すること、
・試験する生物試料を前期培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を、単独で、又は、アミノペプチダーゼ活性以外の少なくとも一種の酵素活性と共に視覚化すること：
である
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
グラム陽性菌若しくはグラム陰性菌のいずれに属するかという点において細菌を識別する方法であって、
以下：
・請求項６又は７に記載の培養基を準備すること、
・試験する生物試料を前期培養基に播種すること、
・これをインキュベートしておくこと、及び、
・グラム陰性の微生物が存在することを示す少なくとも一種の色の存在を視覚化すること：
である
ことを特徴とする方法。
【請求項１２】
アクリジン基の１０の位置にある窒素が四級でない場合、酸、好ましくは塩酸、酢酸又はクエン酸を培養基中に添加することにより、少なくとも一種のアミノペプチダーゼ活性の存在を視覚化する
ことを特徴とする請求項１０又は１１に記載の方法。
【公表番号】特表２００６−５１６４０１（Ｐ２００６−５１６４０１Ａ）
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０２１７０（Ｐ２００６−５０２１７０）
【出願日】平成１６年１月２６日（２００４．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５００３１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６９８０４
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月２６日（２００４．１．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００４／０５００３１
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６９８０４
【国際公開日】平成１６年８月１９日（２００４．８．１９）
【出願人】（５０４２３８３０１）ビオメリュー (74)
【Ｆターム（参考）】
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