酵素標識抗体を用いた酵素免疫測定方法
【課題】防腐剤による阻害を受けにくく、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いて標識した抗体を用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る反応性・感度で酵素免疫測定を行う方法を提供する。
【解決手段】担子菌由来のＰＯＤを用いて抗体を標識し、この標識抗体を固定化された状態で用いて酵素免疫測定を行う。
【効果】西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いて標識した抗体を用いた場合に劣らないか、それに勝る反応性・感度でＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うことができる。さらに、アジ化ナトリウムをはじめとする防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、酵素免疫測定を行うことができる。
【解決手段】担子菌由来のＰＯＤを用いて抗体を標識し、この標識抗体を固定化された状態で用いて酵素免疫測定を行う。
【効果】西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いて標識した抗体を用いた場合に劣らないか、それに勝る反応性・感度でＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うことができる。さらに、アジ化ナトリウムをはじめとする防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、酵素免疫測定を行うことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素標識抗体を用いた酵素免疫測定方法に関し、具体的には、担子菌由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）をＩｇＧおよび／またはＦａｂ’等の抗体または断片化抗体に標識して得られるＰＯＤ標識抗体を使用した酵素免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微量の抗原あるいは抗体等を測定するための技術として、酵素免疫測定方法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が知られている。酵素免疫測定方法の技術としては、例えば、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング法等が広く用いられている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
西洋ワサビ由来のＰＯＤは、上記の各種の酵素免疫測定方法に利用される酵素のひとつとして、広く使用されている。しかし、西洋ワサビ由来のＰＯＤは、植物由来であるために、微生物における遺伝子組換え技術を用いた大量生産が困難である。そのため、西洋ワサビ中に含まれるＰＯＤの量が十分とはいえない状態で、その植物体を破壊し、多種多様な夾雑成分の中からＰＯＤを精製するという方法で製造され、その製造効率は高いとは言いがたい。原料としての西洋ワサビの栽培に長時間を要するという問題もある。その上、近年では、栽培効率の悪さや、需要の大きいバイオエタノール用穀物への転作などから、ＰＯＤの原料としての西洋ワサビの供給不安が生じつつある状況が懸念されており、これに代わり得る酵素に対する潜在的なニーズは大きい。
【０００４】
また、西洋ワサビ由来のＰＯＤには、多くのアイソザイムが存在するという問題も存在する。現在市場に出回っている多くの西洋ワサビ由来のＰＯＤは、上述の通り低い生産効率の中で一定の価格で流通させるという制約上、多くのアイソザイムの混合物である場合がほとんどである。しかし、このようなＰＯＤを用いて各種の測定、例えば、酵素免疫測定を行った場合、異なる反応特性を有する各種アイソザイムの含有量が、ＰＯＤの製造ロットごとにばらつき、このことに起因して、安定した測定結果を得ることが困難になるという重大な問題を生じる。
【０００５】
上記のような西洋ワサビ由来のＰＯＤが有する問題を克服し得ることが期待されるＰＯＤとして、微生物由来のＰＯＤがある。微生物は短時間で大量に培養可能であり、微生物由来のＰＯＤは、植物体から精製を行う場合よりも格段に少ない手間で精製を行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いることにより、微生物宿主内での発現量を人為的に高めることも容易である。遺伝子組換え技術を利用すれば、目的とするＰＯＤのみを多量に発現させることができるため、アイソザイムの夾雑という問題も回避が容易であると同時に、そのＰＯＤを改変し、改良することも比較的容易である。このようなことから、微生物由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る有望な酵素である。
【０００６】
しかし、微生物由来のＰＯＤを用いて、酵素免疫測定における性能を検討した知見は乏しい。公知の微生物由来ＰＯＤとしては、Arthromyces属由来のＰＯＤが知られ、遊離状態で、あるいは、抗体と結合させて標識抗体を調製し、その標識抗体を測定物を介して固層に固定した状態で用いる測定系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも反応性が優れていることが報告されている（例えば、特許文献２、非特許文献１参照）。また、過ヨウ素酸法を用いてArthromyces ramosus由来のＰＯＤで標識した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法の系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤ標識抗体を用いた場合よりも反応性が高いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、このＰＯＤの反応性の高さは、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の４倍程度にとどまり、また、このＰＯＤの耐熱性にも問題があることが報告されている。
【０００７】
また、発明者は、Coprinus属由来のＰＯＤ（例えば、特許文献３、非特許文献２参照）を調製し、これを遊離状態で用いて、発色反応系または発光反応系における性能を西洋ワサビ由来のＰＯＤの反応性との比較を試みた。その結果、この酵素は、遊離状態で用いた場合には、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において西洋ワサビＰＯＤよりも９〜１０倍程度高活性であった。また、ルミノールを基質とした発光系においては、活性化剤であるｐ−ヨードフェノールを添加した西洋ワサビＰＯＤと同等の発光が見られた。しかしながら、Coprinus属由来のＰＯＤで抗体を標識し、このＰＯＤ標識抗体を、遊離状態で、ルミノールを基質とした発光反応に用いた場合には、上記の傾向とは逆に、西洋ワサビ由来のＰＯＤに対して、反応性が劣ることが確認された。
【０００８】
すなわち、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法等のように、標識抗体を固定化された状態で用いる各種酵素免疫測定方法において、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いることなく、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る反応性・感度を有する酵素免疫測定方法の提供が望まれている。
【０００９】
また、上述のような酵素免疫測定方法で用いられる酵素標識抗体溶液は一般に腐敗しやすいため、保存のために防腐剤を添加しておく必要がある。このような防腐剤は各種知られており、特に、アジ化ナトリウム等は、中性ｐＨ域での防腐効果に優れることから広く用いられている。しかしながら、アジ化ナトリウムは、微量の添加でも、西洋ワサビＰＯＤの活性を強く阻害することが知られている（例えば、非特許文献３参照）。そして、これを解決するために、例えば、ペルオキシダーゼ標識物質とアジ化ナトリウムの共存下にポリアルキレングリコール（例えば、特許文献４参照）やフェノール系化合物（例えば、特許文献５参照）を添加してアジ化ナトリウムによるペルオキシダーゼ活性阻害を低減する試みが行われている。また、ＰＯＤ標識物質含有溶液に西洋ワサビＰＯＤを添加することによってＰＯＤ活性を安定化する方法も報告されている（例えば、特許文献６参照）。しかしながら、酵素免疫測定の測定系中に、本来の測定反応にな無関係な添加物を意図的に加えることは、抗原抗体反応や各種測定対象物質へ余計な影響を及ぼすおそれを有する。また、西洋ワサビＰＯＤを添加する方法は、Ｂ／Ｆ分離（抗体と結合している抗原と抗体と結合していない抗原を分ける操作）を行う方法に限定的であり、使用範囲が制限されるという問題を有する。
上記のような事情から、本来の測定反応に無関係な添加物を加えることなく、アジ化ナトリウム等の防腐剤を用いた場合でもＰＯＤ活性が阻害されにくい、すなわち、防腐剤耐性に優れた酵素免疫測定方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平２０００−８８８５０号公報
【特許文献２】特許第２５２８４５７号明細書
【特許文献３】特開平３−１９４９号公報
【特許文献４】特開平２−１３８９９９号公報
【特許文献５】特開平７−１３５９７５号公報
【特許文献６】特開平７−２２２６００号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９， １−６（１９９１）
【非特許文献２】Ｋｊａｌｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９２ Ａｐｒ １７；１１２０（３）：２４８−５６
【非特許文献３】Ｍａｅｈｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．ＩＩ，ｐｐ．８０１−８１３（１９６９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行い得る方法を提供することにある。さらには、アジ化ナトリウム等の防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行い得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、担子菌由来のＰＯＤで抗体を標識し、この標識抗体を用いてＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うときには、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の反応性・感度を上回る反応性・感度が得られることを知った。さらに、この標識抗体を用いてＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うときには、アジ化ナトリウムをはじめとする各種防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行い得ることを知り、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
（１）担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を使用し、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を用いた場合と比較して、ペルオキシダーゼ反応に由来する発色量または発光量が増大していることを特徴とする酵素免疫測定方法。
（２）担子菌がCoprinus属に属する微生物である、上記（１）記載の酵素免疫測定方法。
（３）担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、上記（１）または（２）記載の酵素免疫測定方法。
（４）防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、上記（３）記載の酵素免疫測定方法。
（５）Coprinus属由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を含有し、前記標識した抗体が固定化された状態において発色反応又は発光反応を行うことを特徴とする、酵素免疫測定用組成物。
（６）担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、上記（５）記載の酵素免疫測定用組成物。
（７）防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、上記（６）記載の酵素免疫測定用組成物。
（８）上記（５）〜（７）記載の酵素免疫測定用組成物を含む、酵素免疫測定用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いない場合でも、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いた場合に劣らないか、それに勝る反応性・感度で酵素免疫測定を行う方法を提供することができる。さらに、アジ化ナトリウムをはじめとする防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性（２次抗体濃度−発色量）を示す図である。
【図２】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるヒトトランスフェリンの測定における反応性（ヒトトランスフェリン濃度−発色量）を示す図である。
【図３】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるヒトトランスフェリン（１ｎｇ／ｍｌ）の測定における反応時間と発光量を示す図である。
【図４】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるヒトトランスフェリン（１００ｎｇ／ｍｌ）の測定における反応時間と発光量を示す図である。
【図５】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるヒトトランスフェリンの測定における反応性（ヒトトランスフェリン濃度−発色量）を示す図である。
【図６】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるα２−マクログロブリンの測定における反応性（α２−マクログロブリン濃度―発光量）を示す図である。
【図７】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるα２−マクログロブリンの測定における反応性（ＰＯＤ標識抗体濃度―発光量）を示す図である。
【図８】ウエスタンブロッティング法を用いたヒト由来プラズマおよびヒトトランスフェリンの検出を示す図である（Ｐ：ヒト由来プラズマ Ｔ：ヒトトランスフェリン Ｍ：分子量マーカー）。
【図９】ＨｅＬａ細胞の抗アクチン抗体による免疫染色を示す図である。
【図１０】ラットすい臓の抗インスリン抗体による免疫染色を示す図である。
【図１１】アジ化ナトリウムと一定時間共存させたＰＯＤ標識抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性（アジ化ナトリウム濃度−残存活性）を示す図である。
【図１２】各種防腐剤と一定時間共存させたＰＯＤ標識抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性（各種防腐剤濃度−残存活性）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（本発明で用いる微生物由来のＰＯＤ）
本発明の酵素免疫測定に使用するＰＯＤとしては、担子菌由来のＰＯＤが挙げられる。担子菌に属する微生物としては、例えば、Coprinus属、Uredinales属、Auriculariales属、Agaricales属等が挙げられる。その中で、例えば、Coprinus属に属する微生物の例としては、Coprinus cinereus(NBRC30114)、Coprinus macrorhizus(ATCC20120)、Coprinellus disseminatus、Coprinus comatus(ATCC12640)、Coprinus clastophyllus、Coprinus alkalinus、Coprinus amphibius、Coprinus micaceus、Coprinus atramentarius、Coprinus luteocephalus、Coprinus trisporus、Coprinus sclerotiger、Coprinus domesticus、Coprinus stercorarius、Coprinus radiatus等が挙げられるがそれらに限定されない。なお、NBRCは、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、ATCCは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを示す。
【００１７】
また、分類学上Coprinus属に属さない微生物であっても、例えば、Coprinus属に近縁の微生物由来のＰＯＤや、Coprinus属由来のＰＯＤとアミノ酸配列が近似するもので、本発明の酵素免疫測定において同様の反応性を示すＰＯＤ等も、本発明の酵素免疫測定に使用可能なＰＯＤに含まれ得る。Coprinus属（Coprinus cinereus）由来ＰＯＤの、遺伝子配列の一例を配列番号１に、アミノ酸配列の一例を配列番号２に示す。
ＰＯＤは、天然のものであってもよく、耐熱性向上や基質特異性向上その他の、何らかの１以上の変異を人為的に導入したものであってもよく、キメラタンパク質等であってもよい。市販のＰＯＤを購入して用いてもよい。酵素は単一精製したものを用いることもできるし、また、測定上支障がない範囲において、由来や構造、作用の異なるＰＯＤや、アイソザイムを含む複数のＰＯＤを共に使用してもよい。
【００１８】
（抗体）
本発明の酵素免疫測定に使用する抗体は、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスでもよく、さらには抗体断片でもよい。抗体断片とは、前述の抗体の一部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびその重合体等がこれにあたる。また、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。
【００１９】
（酵素免疫測定）
本発明の酵素免疫測定は、抗体を用いた競合的な測定でも、非競合的な測定でも良い。また、ホモジニアスアッセイ法（均一系による測定）でも、ヘテロジニアスアッセイ法（不均一系による測定）でもよい。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法、免疫染色法等の常法に従って、本発明の酵素免疫測定を行うことができる。
本発明の抗体を用いるアッセイの好ましい具体的方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。これらの方法は、酵素で標識された抗体または抗原を用い、抗体または抗原の量を標識酵素の活性（通常は、発色量や発光量等に変換される場合が多い）により定量する方法である。それぞれの方法の具体的な手順については、当業者に公知であり、例えば、本明細書中に後述する実施例に記載の方法を用いてもよい。
【００２０】
（標識抗体の固定化）
本発明の酵素免疫測定においては、標識された抗原抗体結合物と、遊離型の標識抗原または抗体を分離するために、固相化された抗体や抗原が用いられる。固相としては、アガロース、マイクロタイタープレートの内面、ラテックス粒子、各種素材によるビーズ等が利用できる。それぞれの方法の具体的な手順については、当業者に公知であり、例えば、本明細書中に後述する実施例に記載の方法を用いてもよい。
本発明の酵素免疫測定において、「固定化された状態」とは、ＰＯＤで標識した抗体自体が、マイクロタイタープレートやビーズ上に必ずしも直接固定化されていることのみを指すものではない。例えば、ＥＬＩＳＡのように抗原が固定化されたところに抗体を介して結合させてもよいし、サンドイッチＥＬＩＳＡ法のように、抗体が固定化されたところに抗原を結合させ、さらにその抗体を認識した状態で固定化しても良い。また、ＰＯＤをアビジン、またはストレプトアビジン化し、ビオチンを介して固定化しても良い。すなわち、ＰＯＤで標識した抗体が、何らかの介在分子を介して、間接的に固相上に固定されたような状態に関しても、本発明の酵素免疫測定における「固定化された状態」に含まれる。
【００２１】
（ＰＯＤを用いた抗体の標識）
本発明で用いるＰＯＤを用いた抗体の標識（架橋）方法としては、公知の各種の標識方法を用いることができる。例えば、一般的に知られている方法として、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、イソシアネート架橋法、ベンゾキノン架橋法等がある。特に、マレイミド法は、重合体形成の有無、抗原、抗体、酵素の活性維持、さらには標識効率の点で好適である。
【００２２】
マレイミド法においては、１分子中にマレイミド基とスクシンイミドエステル基を有する化合物を使用して、ＰＯＤ中にマレイミド基を導入する。そのための試薬としては、例えば、一端にマレイミド基を、他端にＮ−ハイドロキシスクシンイミド基を有する二価の架橋剤が挙げられる。具体的には、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロシル）スクシニアミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スクシニアミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（Ｎ−スクシニミジル−Ｎ−マレイミドアセテート）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチラート）、Ｎ−スクシミジル−６−（マレイミド）ヘキサノエート（Ｎ−スクシミジル−６−（Ｎ−マレイミド）ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート等が挙げられるが、それらに限定されない。これらの物質が酵素のアミノ基と結合して酸アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）を形成し、同時にマレイミド基を導入する。導入されたマレイミド基は、後述するように、抗体中のチオール基と反応してチオエーテル結合（−Ｓ−）を形成することにより、担体へと結合する。
【００２３】
（発光反応および発色反応）
本発明の酵素免疫測定法においては、抗体を標識したＰＯＤの反応基質となる物質とともに、発光系および／または発色系を構築することができる。発光系試薬の例としては、ルミノール、ＮｏｖａＬｕｍｅ、Ｌ−０１２（和光純薬社製）等が挙げられる。発色系用試薬の例としては、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ、ロシュ社製）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ ＢＬＡＣＫ（フナコシ社製）、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ ＯＲＡＮＧＥ（フナコシ社製）、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ ＴｒｕｅＢｌｕｅ（フナコシ社製）等が挙げられるが、それらに限定されない。
発光系および／または発色系は、いずれを用いても良好な測定結果が得られるが、より高い感度が求められる近年では、発光系の原理を利用した測定形が、より好ましく用いられる傾向にある。
【００２４】
なお、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いる酵素免疫測定法においては、測定感度を向上させる技術として、ＰＯＤの反応性を大きく向上させるアクチベーター（例えば、ｐ−ヨードフェノール：Ｃｏｙｌｅら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８６ Ｊａｎ；２３（Ｐｔ １）：４２−６．参照）を反応系に添加することが通常的に行われている。このアクチベーターの反応性増強作用は、西洋ワサビ由来のＰＯＤに特異的であって、微生物由来のＰＯＤには増強効果をもたらさない。従って、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る微生物由来のＰＯＤを探索するにあたっては、アクチベーターを添加された状態の西洋ワサビ由来のＰＯＤを基準として、それと同等以上の酵素を探索することがより望ましい。あるいは、微生物由来のＰＯＤの反応性を向上させ得る新たなアクチベーターを探索し、それを組み合わせてもよい。
【００２５】
発光量および／または発色量の評価は、反応開始直後の発光量、および／または測定時間の間の発光量または発色量の積算値等により行うことができる。本発明の酵素免疫測定方法においては、Coprinus属由来のＰＯＤで標識した抗体を用いて、標識抗体を固定化された状態で酵素免疫測定に用いる場合に、アクチベーターを添加された状態の西洋ワサビ由来のＰＯＤを顕著に上回る発光量（反応性）が得られる。この傾向は、発色法を用いた場合でも同様であるが、特に発光系において、その優位性が顕著である。
【００２６】
（酵素免疫測定用組成物）
本発明の酵素免疫測定方法に用いるＰＯＤ、および／または前記ＰＯＤで標識した抗体は、研究用の汎用試薬として提供することもできるが、発色系または発光系の試薬、所望により、発色／発光強度を増強して、測定系の感度を向上させるよう最適化された組成とするためのその他の成分、例えば、緩衝剤、金属、および／または、防腐剤をはじめとした、酵素の保存安定性に寄与する成分等を含んだ、酵素免疫測定用組成物として提供することもできる。
【００２７】
（防腐剤耐性）
本発明の酵素免疫測定用組成物中に含まれ、本発明の酵素免疫測定方法に用いるＰＯＤ、および／または前記ＰＯＤで標識した抗体は、酵素免疫測定用組成物中に防腐剤が共存した際に、一定以上の防腐剤耐性を示すことを特徴とする。防腐剤の種類は特に限定されないが、例えば、プロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体が挙げられる。防腐剤耐性を示すとは、酵素免疫測定に１種以上の好適な濃度の防腐剤が共存するときでも、前記防腐剤が共存しない場合と遜色ない程度のＰＯＤ酵素活性を示すことをいう。あるいは、前記防腐剤が共存しない場合よりはＰＯＤ活性が低下するものの、従来公知の各種ＰＯＤおよび／または従来公知の各種ＰＯＤで標識した抗体と比較した場合には、そのＰＯＤ活性の低下度合が顕著に少ないことをいう。
本発明の酵素免疫測定用組成物の好ましい一例として、１％のアジ化ナトリウムと共存させた場合でも、前記防腐剤が共存しない場合と比較してＰＯＤ活性が全く低下せず、優れた防腐剤耐性を有している。また、本発明の酵素免疫測定用組成物の好ましい一例においては、防腐剤が共存した場合でも、防腐剤が共存しない場合のＰＯＤ活性の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上のＰＯＤ活性を示す。
【００２８】
（酵素免疫測定用キット）
本発明の酵素免疫測定方法に用いるＰＯＤ、および／または前記ＰＯＤで標識した抗体は、研究用の汎用試薬として提供することもできるが、発色系または発光系の試薬、所望により、発色／発光強度を増強して、測定系の感度を向上させるよう最適化された組成とするためのその他の成分、例えば、緩衝剤、金属、および／または、ＰＯＤの保存安定性に寄与する成分等を含んだ複数種の酵素免疫測定用組成物および／または、サンプル希釈用の溶液、および／または測定用マイクロウェルプレート、操作用器具、説明書等を一式として組み合わせた酵素免疫測定用キットとして提供することもできる。
【００２９】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（抗マウスＩｇＧ抗体のＰＯＤ標識）
１）Ｆ（ａｂ’）２の調製
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製、Ａ９０−１１６Ａ）（３−５ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶液置換した。ブタ胃由来ペプシン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｐ７０１２）を前記抗体の１／５０量（ｗ／ｗ）添加し、３７℃にて２０時間インキュベーションした。その後１／１０（ｖ／ｖ）量の３．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を加えて反応を停止した。これを５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）により平衡化したセルロース樹脂ＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ社製 ４０５７−２００、平衡化：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、溶出液：５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）に供し、素通り画分を回収した。素通り画分中に回収されたＦ（ａｂ’）２抗体の濃度は２８０ｎｍにおける吸光度測定値から、ε２８０ｎｍ＝１．４８ｌ／（ｇ・ｃｍ）を用いて求めた。
【００３１】
２）Ｆａｂ’２（ＩｇＧ）−ＳＨ、ＩｇＧ−ＳＨの調製
ヤギ抗マウス抗体（Ｆ（ａｂ’）２、あるいはＩｇＧ）を０．１Ｍ リン酸ナトリウム （ｐＨ６．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶液置換し、１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。５００ｍＭ システアミン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｍ９７６８−２５Ｇ）（６ｍｇ／０．１ｍｌの０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を調製し、前記の抗体溶液に１／１０（ｖ／ｖ）量加え、３７℃にて１．５時間インキュベーションした。過剰なシステアミンを透析あるいはゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥ社製、１７−００３３−０１、平衡化液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、溶出液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）により除去した。
【００３２】
３）マレイミド化ＰＯＤの調製
市販のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０〜３０ｍｇ／ｍｌとなるよう０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁した。１００ｍＭ ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製、２２３６０）（３．３４ｍｇ／０．１ｍｌ ＤＭＳＯに溶解）を調製し、直ちにＰＯＤのモル濃度の５倍量を加えた。室温で３０分間インキュベーションし、前記の条件に従って、ゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５に供し、過剰なＳＭＣＣを除去した。酵素濃度を、４０３ｎｍにおける吸光度測定値から、ε４０３ｎｍ＝８．３３×１０４ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）を用いて求めた。
なお、上記の市販ＰＯＤの、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））を基質とした場合の酵素学的性質は表１に示す通りであった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
４）マレイミド化ＰＯＤによる抗体の標識（架橋）および標識抗体の精製
前記のマレイミド化ＰＯＤおよびＳＨ基還元抗体（溶媒は０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を、酵素：抗体のモル比が１０：１となるように混合した。４℃で６時間以上（一晩）インキュベーションした後、標識（架橋）後の反応溶液を、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（ＧＥ社製、１７−１０７１−０１、溶出溶液：ＰＢＳ含有０．５Ｍ ＮａＣｌ、カラムサイズ：約２４ｍｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）に供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体、ＰＯＤ−ＩｇＧ）を得た。Ｆａｂ’に関しても、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬに供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、ＰＯＤ標識抗マウスＦａｂ’（Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体、ＰＯＤ−Ｆａｂ’）を得た。
【実施例２】
【００３５】
（ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性比較試験）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体、または市販の西洋ワサビ（ＨＲＰ）標識抗体を用いて、マウスＩｇＧ（１次抗体、ヒトトランスフェリンに対し定法により作製）の検出における反応性比較を行った。
１．使用した抗体
１） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体１（比較例１の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
２） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体２（比較例２の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−ＩｇＧ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
３） 実施例１で得られた、Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体（本発明１の測定系で使用）
４） 実施例１で得られた、ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体（本発明２の測定系で使用）
【００３６】
２．ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧの検出
１、１０、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製したマウスＩｇＧ溶液を用い、定法により、９６ウェルマイクロタイタープレート中にマウスＩｇＧ（１次抗体：抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（バイオマトリックス研究所社製））を固相化した。ここに、上記の各種ＰＯＤ標識抗体（２次抗体）をそれぞれ添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュ社製）に、ＡＢＴＳ−Ｔａｂｌｅｔｓ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロシュ社製）を溶かした基質溶液を添加し、一定時間反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
測定値の一例として、Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体に関する、使用した２次抗体の濃度と発色量の関係を、図１に示す。
【００３７】
図１に示すように、固相化したマウスＩｇＧの濃度によらず、ＰＯＤ標識抗体の使用量の増加に応じて、発色量の増大が観察された。また、特に、測定対照（１次抗体）の量が比較的多い場合においては、２次抗体の使用量を一定以上に増やしても、発色度向上効果には限界があることも示唆される（この要因のひとつは、発色度測定上の制約によるものと思われる）。
【００３８】
本試験において、発色測定上好ましい数値範囲内で、同程度の量のマウスＩｇＧを、同程度の量のＰＯＤ標識抗体を用いて測定した時に、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合の方が、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合よりも高感度であることが示された。例えば、約０．８μｇ／ｍｌの２次抗体を使用し、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した溶液を用いて固相化したマウスＩｇＧを測定した場合の吸光度で比較すると、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合（比較例１、比較例２）では、それぞれ約０．３および約１．４であるのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明１）は約０．４および１．９であり、約１．３〜１．４倍高い値が得られた。
同様に、ＩｇＧを用いて作製したＰＯＤ標識抗体を用いた場合でも、良好な測定値が得られることがわかった（本発明２）。
【実施例３】
【００３９】
（ヒトトランスフェリンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧの検出における反応性比較）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体、または市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用い、発色系によりマウスＩｇＧを検出することによりヒトトランスフェリンを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の系を構築し、その発色量を比較した。
１．使用した抗体
１） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体１（比較例３の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
２） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体２（比較例４の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−ＩｇＧ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
３） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体３（比較例５の測定系で使用）：Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｍｏｕｓｅ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ（ＨＲＰ−ＩｇＧ）（Ｂｅｔｈｙｌ社製）４） 実施例１で得られた、Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体（本発明３の定系で使用）
５） 実施例１で得られた、ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体（本発明４の測定系で使用）
【００４０】
２．ヒトトランスフェリンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧの検出
抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（バイオマトリックス研究所社製）を定法により固相化した９６ウェルマイクロタイタープレートに、ＰＢＳを用いて調製した１、１０、および１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液５０μｌを添加し、室温で１時間反応させた。反応後、３５０μｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを用いて３回洗浄した。洗浄後、各ウェルに、適宜希釈した検出用抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、各種のＰＯＤ標識抗体をそれぞれ添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュ社製）に、ＡＢＴＳ−Ｔａｂｌｅｔｓ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロシュ社製）を溶かした基質溶液を添加し、一定時間反応させた後、４０５ｎｍの吸光度（発色量）を測定した。測定値の一例として、発色系における、ＨＲＰ標識抗体と実施例１で得られたＰＯＤ標識抗体を用いた、トランスフェリンの濃度と発色量の関係を図２に示す。
【００４１】
図２に示すように、添加したヒトトランスフェリンのいずれの濃度においても、各ＰＯＤ標識抗体の使用量の増加に応じて、発色量の増大が観察された。また、同量のＰＯＤ標識抗体を用いた場合には、ヒトトランスフェリン濃度の増加に応じて、発色量が増加する傾向が確認された。
【００４２】
本試験において、発色測定上好ましい数値範囲内で、同程度の量の検出用抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を用い、同程度の量のＰＯＤ標識抗体を用いて、ヒトトランスフェリン（抗原）を測定した時に、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合の方が、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合より高感度であることが示された。例えば、１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いたときの、固相化したマウスＩｇＧを測定した場合の吸光度で比較すると、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体（４００ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合（比較例３）では約０．４５であるのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体（３７５ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合（本発明３）では約１．０であり、２．２倍高い値が得られた。すなわち、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体と同程度か、むしろそれより少量の標識抗体を使用した場合に、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合の方が、高い発色量が得られることがわかった。
【００４３】
上記の傾向は、特にＦａｂ’のＰＯＤ標識抗体に関し顕著であったが、ＩｇＧを用いて作製したＰＯＤ標識抗体を用いた場合でも、本測定により良好な測定値が得られることがわかった（本発明４）。
【実施例４】
【００４４】
（ヒトトランスフェリン、またはα２−マクログロブリンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（発光系）によるマウスＩｇＧの検出における反応性比較）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体、または市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用い、発光系によりマウスＩｇＧを検出することによりヒトトランスフェリン、またはα２−マクログロブリンを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の系を構築し、その発光量を比較した。具体的には、ＰＯＤ標識抗体を添加し、洗浄した後、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）に代えてルミノール（シグマ社製）と過酸化水素をトリス（西洋ワサビＰＯＤ標識抗体使用時）、またはトリシン（本発明ＰＯＤ標識抗体使用時）に溶解した基質溶液を添加し、一定時間反応させた後、発光量を測定する以外は、実施例３の方法に準じて、ヒトトランスフェリン、またはα２−マクログロブリンをサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定し、その発光量を比較した。なお、使用したＰＯＤ標識抗体の使用量は同一ではないが、本測定系において好適な反応が行えるよう、予め各々について予備試験を行い、最適化された濃度で使用した。
測定値の一例として、各種ＰＯＤ標識抗体を用いた場合の、１ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いた場合の発光強度の時間経過を図３に、１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いた場合の発光強度の時間経過を図４に、各種ＰＯＤ標識抗体濃度を一定にし、α２−マクログロブリン濃度を変化させた場合の試薬添加時における発光強度の変化を図６に、α２−マクログロブリン濃度を一定にし、各種ＰＯＤ標識抗体濃度を変化させた場合の試薬添加時における発酵強度変化を図７に、それぞれ示す。
【００４５】
発色反応進行に伴い、一定時間の間、経時的に吸光度が増加していく発色系とは異なり、発光系では、初発時（発光反応直後）の光が最も強く、その後経時的に減少する。実際の発光量の測定では、一定時間内の発光量の積算値を用いる場合が多いが、その積算値は、初発の発光量と、その減衰の程度に依存し、特に初発の発光量に依存する。
いずれの濃度のヒトトランスフェリン（抗原）を測定した場合においても、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いたもの（比較例６〜８）より、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いたもの（本発明５〜６）の方が、初発の発光量、および測定後３０分間までの発光積算値についても、顕著に高いことが示された。
【００４６】
例えば、図３に示す、１ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いたときの初発発光量では、３種の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合（比較例６〜８）は、初発発光量が非常に低く、最も高いものでも１００，０００ＲＬＵであった（比較例７）のに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明５）には約８００，０００ＲＬＵとなり、８倍以上高い値を示した。ＰＯＤをＩｇＧに標識した本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明６）は、本発明の２種のＰＯＤ標識抗体の中では相対的に発光量が低かったが、それでも初発発光量が約３００，０００ＲＬＵであり、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合より３倍以上高い値が得られた。
【００４７】
この傾向は、図４に示す、１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いた場合でも同様であった。西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合（比較例６〜８）では、初発発光量が約２５０，０００ＲＬＵおよび１，０００，０００ＲＬＵであったのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明５）では約４，２００，０００ＲＬＵで４．５倍および１８倍以上高い値を示した。ＩｇＧに標識した本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明６）でも、約３，５００，０００ＲＬＵとなり、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合より３．５倍および１４倍以上高い値が得られた。
【００４８】
上記の通り、発光系における本発明のＰＯＤ標識抗体の高い感度は、特にＦａｂ’のＰＯＤ標識抗体に関し顕著であったが、ＩｇＧを用いて作製したＰＯＤ標識抗体を用いた場合でも同様に優れており、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合と比較して顕著に優れていることがわかった。
【００４９】
本測定のデータから算出した、トランスフェリンの濃度と初発発光量の関係を図５に示す。この図の各グラフにおける直線部分は、本測定の試験系を用いてトランスフェリンの濃度を算出することを想定した場合の、精度よく測定可能なトランスフェリンの濃度範囲を示す。各データのプロットから、Ｒ２＝０．９９以上となる直線性が得られるトランスフェリンの濃度範囲（測定可能濃度範囲）を求めた結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１に示す通り、比較例（西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を使用）の測定方法では、０．５ｎｇ／ｍｌ、最も良い場合でも、０．１ｎｇ／ｍｌを下回るトランスフェリンは正確に測定することができないことが示された。これに対し、本発明（Coprinus属由来のＰＯＤを使用）の方法を用いれば、０．０１ｎｇ／ｍｌ、最も悪い場合でも、０．０５ｎｇ／ｍｌという低濃度のトランスフェリンまで良好に測定できることが示された。
【００５２】
また、図６に示すとおり、各種ＰＯＤ標識抗体の濃度を一定の適切な濃度に固定し、α２−マクログロブリン（抗原）濃度を変化させた場合、いずれの濃度のα２−マクログロブリンを測定した場合においても、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いたもの（比較例６）よりも、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いたもの（本発明５）の方で、顕著に高い測定値が得られた。本測定値（試薬添加直後１秒間の積算値で示す）より、本発明のＰＯＤ標識抗体が高感度であることが確認された。本発明と比較例との差をよりわかりやすく表すため、α２−マクログロブリン濃度を０〜１００ｎｇ／ｍｌと低濃度域の０〜１０ｎｇ／ｍｌの２つの図にて表した。抗原濃度によっては、本発明のＰＯＤ標識抗体の方が３０倍以上高感度であった。同様の検討をヒトトランスフェリンの系においても行い、同様に高感度であることを確認した。
【００５３】
図７に示すとおり、α２−マクログロブリン（抗原）の濃度を一定の適切な濃度に固定し、各種ＰＯＤ標識抗体濃度を変化させた場合、いずれの濃度のＰＯＤ標識抗体においても、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いたもの（比較例６）より、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いたもの（本発明５）の方で、顕著に高い測定値が得られた。なお、この際のその他の測定条件は、ＰＯＤ標識抗体濃度を一定とし、抗原濃度を変化させた場合と同様である。本発明と比較例との差をよりわかりやすく表すため、α２−マクログロブリン濃度を０〜１００ｎｇ／ｍｌと低濃度域の０〜０．５ｎｇ／ｍｌの２つの図にて表した。標識抗体濃度によっては、本発明のＰＯＤ標識抗体の方が２００倍以上高感度であった。同様の検討をヒトトランスフェリンの系においても行い、同様に高感度であることを確認した。
【００５４】
以上より、本発明の方法を用いることにより、より少ない標識抗体を使用して、しかも、より少ない量の目的物質を測定できるようになることがわかった。そして、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法等の酵素免疫測定を発光系を用いて行う場合における、担子菌由来ＰＯＤを用いた場合のこのような顕著な反応性・感度の向上傾向は、担子菌由来ＰＯＤ標識抗体を固定化しない系で試験した場合のさほど高いとはいえない反応性からは予測しがたいものであった。
【実施例５】
【００５５】
（酵素免疫測定用組成物の調製）
表３に示すＰＯＤ標識試薬、マウスＩｇＧ、希釈用緩衝液、洗浄用緩衝液、標準用抗原および発光用試薬溶液を調製して、酵素免疫測定用組成物を得た。
【００５６】
【表２】
【実施例６】
【００５７】
（酵素免疫測定用キットの調製）
実施例５に従って調製した６種類の試薬をそれぞれ小分け容器に分注し、各試薬と９６穴マイクロタイタープレートを一式として取り揃えて、酵素免疫測定用キットとした。
上記のように作製したキットを用いて、ヒトトランスフェリンを測定したところ、良好かつ効率よく測定操作を行うことができ、実施例４の本発明８に示すものと同様の結果が得られた。
【実施例７】
【００５８】
（ウエスタンブロッティング法を用いたヒトトランスフェリンの検出）
ヒト由来プラズマ１００ｎｇ、およびヒトトランスフェリン１０ｎｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。終了後、ゲルをウエスタンブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜を定法により洗浄、ブロッキングし、ここに抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳにて３回洗浄し、実施例１の方法にのっとって作製した２種の標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ、ＰＯＤ−Ｆａｂ’）を適宜希釈して添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。次いで、ルミノールを含む発光試薬（ＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ社製））を添加し、発光を検出した。
結果を図８に示す。図中、「１」（○印の囲い文字）と表記されたものがプラズマ１００ｎｇ、「２」（○印の囲い文字）と表記されたものがヒトトランスフェリン１０ｎｇの結果である。Ｍは分子量マーカーである。いずれの標識抗体を使用した場合でも、双方とも問題なく良好にバンドとして検出でき、本発明の標識抗体をウエスタンブロッティングに良好に使用可能であることが示された。
【実施例８】
【００５９】
（ＨｅＬａ細胞の抗アクチン抗体による免疫染色）
本発明で使用する上述の３種のＰＯＤ標識抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ’）を用いて、ＨｅＬａ細胞の抗アクチン抗体による免疫染色を行った。免疫染色は、例えば、羊土社より発行されている抗体実験マニュアル等に記載されている常法に準じて行った。１次抗体として、抗アクチンモノクローナル抗体を用いた。２次抗体は実施例１の方法により作製したＰＯＤ標識抗体をそれぞれ適当な濃度で添加した。
結果の一例を図９に示す。いずれの系に関しても、細胞中のアクチンの存在部位に相当する部位が染色され、本発明で使用するＰＯＤ標識抗体を良好に使用できることが示された。
【実施例９】
【００６０】
（ラットすい臓の抗インスリン抗体による免疫染色）
上述の２種のＰＯＤ標識抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ’）を用いて、ラットすい臓の抗インスリン抗体による免疫染色を行った。免疫染色は、例えば、羊土社より発行されている抗体実験マニュアル等に記載されている常法に準じて行った。１次抗体として、抗インスリンモノクローナル抗体を用いた。２次抗体は実施例１の方法により作製した標識抗体を１／１０００倍に希釈した後添加した。
結果の一例を図１０に示す。いずれの系に関しても、細胞中のインスリンの存在部位に相当する部位が染色され、本発明で使用するＰＯＤ標識抗体を良好に使用できることが示された。
【実施例１０】
【００６１】
（アジ化ナトリウムの共存がＰＯＤ活性値に及ぼす影響の確認）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体または市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を０〜１％のアジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）と一定時間（３時間）共存させた後、マウスＩｇＧ（１次抗体、ヒトトランスフェリンに対し定法により作製）の検出における反応性比較を行った。測定方法は実施例２のとおりである。
結果の一例を図１１に示す。西洋ワサビＰＯＤ標識抗体（比較例６）を用いた場合には、共存するアジ化ナトリウムの濃度に依存してＰＯＤ活性が大幅に阻害されるのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体（本発明５）を用いた場合には、アジ化ナトリウム共存下でもＰＯＤ活性の阻害は全くみられず、優れた防腐剤耐性が確認された。このことから、本発明の免疫測定用組成物が、アジ化ナトリウム共存下でも、特別に添加物を必要とせず、ＰＯＤ標識抗体を良好に保存・使用できることが示された。
【実施例１１】
【００６２】
（各種防腐剤の共存がＰＯＤ活性値に及ぼす影響の確認）
実施例１０以外のさらなる防腐剤として、汎用的に使われているプロクリンの一種であるＰｒｏｃｌｉｎ３００（シグマ社製）、チメロサール（シグマ社製）、ゲンタマイシン（和光純薬工業社製）を用い、実施例１の方法に準じて作製した標識抗体を用いて、実施例１０と同様の操作を行い、防腐剤耐性を試験した。
結果の一例を図１２に示す。いずれの防腐剤においても、本発明の免疫測定用組成物における測定で、ＰＯＤ活性の阻害はみられなかった。すなわち、各種の防腐剤を用いても、測定の際のＰＯＤ活性を損なうことなく、本発明の免疫測定用組成物を良好に保存・使用できることが示された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素標識抗体を用いた酵素免疫測定方法に関し、具体的には、担子菌由来のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）をＩｇＧおよび／またはＦａｂ’等の抗体または断片化抗体に標識して得られるＰＯＤ標識抗体を使用した酵素免疫測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、微量の抗原あるいは抗体等を測定するための技術として、酵素免疫測定方法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）が知られている。酵素免疫測定方法の技術としては、例えば、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロッティング法等が広く用いられている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
西洋ワサビ由来のＰＯＤは、上記の各種の酵素免疫測定方法に利用される酵素のひとつとして、広く使用されている。しかし、西洋ワサビ由来のＰＯＤは、植物由来であるために、微生物における遺伝子組換え技術を用いた大量生産が困難である。そのため、西洋ワサビ中に含まれるＰＯＤの量が十分とはいえない状態で、その植物体を破壊し、多種多様な夾雑成分の中からＰＯＤを精製するという方法で製造され、その製造効率は高いとは言いがたい。原料としての西洋ワサビの栽培に長時間を要するという問題もある。その上、近年では、栽培効率の悪さや、需要の大きいバイオエタノール用穀物への転作などから、ＰＯＤの原料としての西洋ワサビの供給不安が生じつつある状況が懸念されており、これに代わり得る酵素に対する潜在的なニーズは大きい。
【０００４】
また、西洋ワサビ由来のＰＯＤには、多くのアイソザイムが存在するという問題も存在する。現在市場に出回っている多くの西洋ワサビ由来のＰＯＤは、上述の通り低い生産効率の中で一定の価格で流通させるという制約上、多くのアイソザイムの混合物である場合がほとんどである。しかし、このようなＰＯＤを用いて各種の測定、例えば、酵素免疫測定を行った場合、異なる反応特性を有する各種アイソザイムの含有量が、ＰＯＤの製造ロットごとにばらつき、このことに起因して、安定した測定結果を得ることが困難になるという重大な問題を生じる。
【０００５】
上記のような西洋ワサビ由来のＰＯＤが有する問題を克服し得ることが期待されるＰＯＤとして、微生物由来のＰＯＤがある。微生物は短時間で大量に培養可能であり、微生物由来のＰＯＤは、植物体から精製を行う場合よりも格段に少ない手間で精製を行うことができる。また、遺伝子組換え技術を用いることにより、微生物宿主内での発現量を人為的に高めることも容易である。遺伝子組換え技術を利用すれば、目的とするＰＯＤのみを多量に発現させることができるため、アイソザイムの夾雑という問題も回避が容易であると同時に、そのＰＯＤを改変し、改良することも比較的容易である。このようなことから、微生物由来のＰＯＤは、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る有望な酵素である。
【０００６】
しかし、微生物由来のＰＯＤを用いて、酵素免疫測定における性能を検討した知見は乏しい。公知の微生物由来ＰＯＤとしては、Arthromyces属由来のＰＯＤが知られ、遊離状態で、あるいは、抗体と結合させて標識抗体を調製し、その標識抗体を測定物を介して固層に固定した状態で用いる測定系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤよりも反応性が優れていることが報告されている（例えば、特許文献２、非特許文献１参照）。また、過ヨウ素酸法を用いてArthromyces ramosus由来のＰＯＤで標識した抗体を用いたＥＬＩＳＡ法の系において、西洋ワサビ由来のＰＯＤ標識抗体を用いた場合よりも反応性が高いことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。しかし、このＰＯＤの反応性の高さは、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の４倍程度にとどまり、また、このＰＯＤの耐熱性にも問題があることが報告されている。
【０００７】
また、発明者は、Coprinus属由来のＰＯＤ（例えば、特許文献３、非特許文献２参照）を調製し、これを遊離状態で用いて、発色反応系または発光反応系における性能を西洋ワサビ由来のＰＯＤの反応性との比較を試みた。その結果、この酵素は、遊離状態で用いた場合には、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）を基質とした発色反応において西洋ワサビＰＯＤよりも９〜１０倍程度高活性であった。また、ルミノールを基質とした発光系においては、活性化剤であるｐ−ヨードフェノールを添加した西洋ワサビＰＯＤと同等の発光が見られた。しかしながら、Coprinus属由来のＰＯＤで抗体を標識し、このＰＯＤ標識抗体を、遊離状態で、ルミノールを基質とした発光反応に用いた場合には、上記の傾向とは逆に、西洋ワサビ由来のＰＯＤに対して、反応性が劣ることが確認された。
【０００８】
すなわち、ＥＬＩＳＡ法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法等のように、標識抗体を固定化された状態で用いる各種酵素免疫測定方法において、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いることなく、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る反応性・感度を有する酵素免疫測定方法の提供が望まれている。
【０００９】
また、上述のような酵素免疫測定方法で用いられる酵素標識抗体溶液は一般に腐敗しやすいため、保存のために防腐剤を添加しておく必要がある。このような防腐剤は各種知られており、特に、アジ化ナトリウム等は、中性ｐＨ域での防腐効果に優れることから広く用いられている。しかしながら、アジ化ナトリウムは、微量の添加でも、西洋ワサビＰＯＤの活性を強く阻害することが知られている（例えば、非特許文献３参照）。そして、これを解決するために、例えば、ペルオキシダーゼ標識物質とアジ化ナトリウムの共存下にポリアルキレングリコール（例えば、特許文献４参照）やフェノール系化合物（例えば、特許文献５参照）を添加してアジ化ナトリウムによるペルオキシダーゼ活性阻害を低減する試みが行われている。また、ＰＯＤ標識物質含有溶液に西洋ワサビＰＯＤを添加することによってＰＯＤ活性を安定化する方法も報告されている（例えば、特許文献６参照）。しかしながら、酵素免疫測定の測定系中に、本来の測定反応にな無関係な添加物を意図的に加えることは、抗原抗体反応や各種測定対象物質へ余計な影響を及ぼすおそれを有する。また、西洋ワサビＰＯＤを添加する方法は、Ｂ／Ｆ分離（抗体と結合している抗原と抗体と結合していない抗原を分ける操作）を行う方法に限定的であり、使用範囲が制限されるという問題を有する。
上記のような事情から、本来の測定反応に無関係な添加物を加えることなく、アジ化ナトリウム等の防腐剤を用いた場合でもＰＯＤ活性が阻害されにくい、すなわち、防腐剤耐性に優れた酵素免疫測定方法が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開平２０００−８８８５０号公報
【特許文献２】特許第２５２８４５７号明細書
【特許文献３】特開平３−１９４９号公報
【特許文献４】特開平２−１３８９９９号公報
【特許文献５】特開平７−１３５９７５号公報
【特許文献６】特開平７−２２２６００号公報
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９， １−６（１９９１）
【非特許文献２】Ｋｊａｌｋｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ． １９９２ Ａｐｒ １７；１１２０（３）：２４８−５６
【非特許文献３】Ｍａｅｈｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．ＩＩ，ｐｐ．８０１−８１３（１９６９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の性能に劣らないか、それに勝る反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行い得る方法を提供することにある。さらには、アジ化ナトリウム等の防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行い得る方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、担子菌由来のＰＯＤで抗体を標識し、この標識抗体を用いてＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うときには、西洋ワサビ由来のＰＯＤを標識した抗体を用いた場合の反応性・感度を上回る反応性・感度が得られることを知った。さらに、この標識抗体を用いてＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うときには、アジ化ナトリウムをはじめとする各種防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行い得ることを知り、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に関する。
（１）担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を使用し、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を用いた場合と比較して、ペルオキシダーゼ反応に由来する発色量または発光量が増大していることを特徴とする酵素免疫測定方法。
（２）担子菌がCoprinus属に属する微生物である、上記（１）記載の酵素免疫測定方法。
（３）担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、上記（１）または（２）記載の酵素免疫測定方法。
（４）防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、上記（３）記載の酵素免疫測定方法。
（５）Coprinus属由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を含有し、前記標識した抗体が固定化された状態において発色反応又は発光反応を行うことを特徴とする、酵素免疫測定用組成物。
（６）担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、上記（５）記載の酵素免疫測定用組成物。
（７）防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、上記（６）記載の酵素免疫測定用組成物。
（８）上記（５）〜（７）記載の酵素免疫測定用組成物を含む、酵素免疫測定用キット。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いない場合でも、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いた場合に劣らないか、それに勝る反応性・感度で酵素免疫測定を行う方法を提供することができる。さらに、アジ化ナトリウムをはじめとする防腐剤を添加した場合でも、ＰＯＤ活性が阻害されにくく、良好な反応性・感度で、ＥＬＩＳＡ法等の酵素免疫測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性（２次抗体濃度−発色量）を示す図である。
【図２】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるヒトトランスフェリンの測定における反応性（ヒトトランスフェリン濃度−発色量）を示す図である。
【図３】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるヒトトランスフェリン（１ｎｇ／ｍｌ）の測定における反応時間と発光量を示す図である。
【図４】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるヒトトランスフェリン（１００ｎｇ／ｍｌ）の測定における反応時間と発光量を示す図である。
【図５】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるヒトトランスフェリンの測定における反応性（ヒトトランスフェリン濃度−発色量）を示す図である。
【図６】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるα２−マクログロブリンの測定における反応性（α２−マクログロブリン濃度―発光量）を示す図である。
【図７】サンドイッチ ＥＬＩＳＡ法（発光系）によるα２−マクログロブリンの測定における反応性（ＰＯＤ標識抗体濃度―発光量）を示す図である。
【図８】ウエスタンブロッティング法を用いたヒト由来プラズマおよびヒトトランスフェリンの検出を示す図である（Ｐ：ヒト由来プラズマ Ｔ：ヒトトランスフェリン Ｍ：分子量マーカー）。
【図９】ＨｅＬａ細胞の抗アクチン抗体による免疫染色を示す図である。
【図１０】ラットすい臓の抗インスリン抗体による免疫染色を示す図である。
【図１１】アジ化ナトリウムと一定時間共存させたＰＯＤ標識抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性（アジ化ナトリウム濃度−残存活性）を示す図である。
【図１２】各種防腐剤と一定時間共存させたＰＯＤ標識抗体を用いた、ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性（各種防腐剤濃度−残存活性）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（本発明で用いる微生物由来のＰＯＤ）
本発明の酵素免疫測定に使用するＰＯＤとしては、担子菌由来のＰＯＤが挙げられる。担子菌に属する微生物としては、例えば、Coprinus属、Uredinales属、Auriculariales属、Agaricales属等が挙げられる。その中で、例えば、Coprinus属に属する微生物の例としては、Coprinus cinereus(NBRC30114)、Coprinus macrorhizus(ATCC20120)、Coprinellus disseminatus、Coprinus comatus(ATCC12640)、Coprinus clastophyllus、Coprinus alkalinus、Coprinus amphibius、Coprinus micaceus、Coprinus atramentarius、Coprinus luteocephalus、Coprinus trisporus、Coprinus sclerotiger、Coprinus domesticus、Coprinus stercorarius、Coprinus radiatus等が挙げられるがそれらに限定されない。なお、NBRCは、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門、ATCCは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを示す。
【００１７】
また、分類学上Coprinus属に属さない微生物であっても、例えば、Coprinus属に近縁の微生物由来のＰＯＤや、Coprinus属由来のＰＯＤとアミノ酸配列が近似するもので、本発明の酵素免疫測定において同様の反応性を示すＰＯＤ等も、本発明の酵素免疫測定に使用可能なＰＯＤに含まれ得る。Coprinus属（Coprinus cinereus）由来ＰＯＤの、遺伝子配列の一例を配列番号１に、アミノ酸配列の一例を配列番号２に示す。
ＰＯＤは、天然のものであってもよく、耐熱性向上や基質特異性向上その他の、何らかの１以上の変異を人為的に導入したものであってもよく、キメラタンパク質等であってもよい。市販のＰＯＤを購入して用いてもよい。酵素は単一精製したものを用いることもできるし、また、測定上支障がない範囲において、由来や構造、作用の異なるＰＯＤや、アイソザイムを含む複数のＰＯＤを共に使用してもよい。
【００１８】
（抗体）
本発明の酵素免疫測定に使用する抗体は、いずれのイムノグロブリンクラスおよびサブクラスでもよく、さらには抗体断片でもよい。抗体断片とは、前述の抗体の一部分を意味し、具体的にはＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ−ｌｉｎｋｅｄ Ｆｖ、ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびその重合体等がこれにあたる。また、ポリクローナル抗体でもよく、モノクローナル抗体でもよい。
【００１９】
（酵素免疫測定）
本発明の酵素免疫測定は、抗体を用いた競合的な測定でも、非競合的な測定でも良い。また、ホモジニアスアッセイ法（均一系による測定）でも、ヘテロジニアスアッセイ法（不均一系による測定）でもよい。例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴ法、イムノブロット法、ウェスタンブロット法、免疫染色法等の常法に従って、本発明の酵素免疫測定を行うことができる。
本発明の抗体を用いるアッセイの好ましい具体的方法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ法が挙げられる。これらの方法は、酵素で標識された抗体または抗原を用い、抗体または抗原の量を標識酵素の活性（通常は、発色量や発光量等に変換される場合が多い）により定量する方法である。それぞれの方法の具体的な手順については、当業者に公知であり、例えば、本明細書中に後述する実施例に記載の方法を用いてもよい。
【００２０】
（標識抗体の固定化）
本発明の酵素免疫測定においては、標識された抗原抗体結合物と、遊離型の標識抗原または抗体を分離するために、固相化された抗体や抗原が用いられる。固相としては、アガロース、マイクロタイタープレートの内面、ラテックス粒子、各種素材によるビーズ等が利用できる。それぞれの方法の具体的な手順については、当業者に公知であり、例えば、本明細書中に後述する実施例に記載の方法を用いてもよい。
本発明の酵素免疫測定において、「固定化された状態」とは、ＰＯＤで標識した抗体自体が、マイクロタイタープレートやビーズ上に必ずしも直接固定化されていることのみを指すものではない。例えば、ＥＬＩＳＡのように抗原が固定化されたところに抗体を介して結合させてもよいし、サンドイッチＥＬＩＳＡ法のように、抗体が固定化されたところに抗原を結合させ、さらにその抗体を認識した状態で固定化しても良い。また、ＰＯＤをアビジン、またはストレプトアビジン化し、ビオチンを介して固定化しても良い。すなわち、ＰＯＤで標識した抗体が、何らかの介在分子を介して、間接的に固相上に固定されたような状態に関しても、本発明の酵素免疫測定における「固定化された状態」に含まれる。
【００２１】
（ＰＯＤを用いた抗体の標識）
本発明で用いるＰＯＤを用いた抗体の標識（架橋）方法としては、公知の各種の標識方法を用いることができる。例えば、一般的に知られている方法として、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、マレイミド法、ピリジルジスルフィド法、イソシアネート架橋法、ベンゾキノン架橋法等がある。特に、マレイミド法は、重合体形成の有無、抗原、抗体、酵素の活性維持、さらには標識効率の点で好適である。
【００２２】
マレイミド法においては、１分子中にマレイミド基とスクシンイミドエステル基を有する化合物を使用して、ＰＯＤ中にマレイミド基を導入する。そのための試薬としては、例えば、一端にマレイミド基を、他端にＮ−ハイドロキシスクシンイミド基を有する二価の架橋剤が挙げられる。具体的には、Ｎ−（６−マレイミドカプロイロシル）スクシニアミド（ＥＭＣＳ）、Ｎ−（４−マレイミドブチリロキシ）スクシニアミド（ＧＭＢＳ）、Ｎ−スクシンイミジル−Ｎ−マレイミドアセテート（Ｎ−スクシニミジル−Ｎ−マレイミドアセテート）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチレート（Ｎ−スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミド）ブチラート）、Ｎ−スクシミジル−６−（マレイミド）ヘキサノエート（Ｎ−スクシミジル−６−（Ｎ−マレイミド）ヘキサノエート、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｎ−スルホスクシンイミジル−ｐ−（Ｎ−マレイミドフェニル）−４−ブチレート等が挙げられるが、それらに限定されない。これらの物質が酵素のアミノ基と結合して酸アミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）を形成し、同時にマレイミド基を導入する。導入されたマレイミド基は、後述するように、抗体中のチオール基と反応してチオエーテル結合（−Ｓ−）を形成することにより、担体へと結合する。
【００２３】
（発光反応および発色反応）
本発明の酵素免疫測定法においては、抗体を標識したＰＯＤの反応基質となる物質とともに、発光系および／または発色系を構築することができる。発光系試薬の例としては、ルミノール、ＮｏｖａＬｕｍｅ、Ｌ−０１２（和光純薬社製）等が挙げられる。発色系用試薬の例としては、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ、ロシュ社製）、３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢＺ）、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ ＢＬＡＣＫ（フナコシ社製）、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ ＯＲＡＮＧＥ（フナコシ社製）、ＨｉｓｔｏＭａｒｋ ＴｒｕｅＢｌｕｅ（フナコシ社製）等が挙げられるが、それらに限定されない。
発光系および／または発色系は、いずれを用いても良好な測定結果が得られるが、より高い感度が求められる近年では、発光系の原理を利用した測定形が、より好ましく用いられる傾向にある。
【００２４】
なお、西洋ワサビ由来のＰＯＤを用いる酵素免疫測定法においては、測定感度を向上させる技術として、ＰＯＤの反応性を大きく向上させるアクチベーター（例えば、ｐ−ヨードフェノール：Ｃｏｙｌｅら、Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８６ Ｊａｎ；２３（Ｐｔ １）：４２−６．参照）を反応系に添加することが通常的に行われている。このアクチベーターの反応性増強作用は、西洋ワサビ由来のＰＯＤに特異的であって、微生物由来のＰＯＤには増強効果をもたらさない。従って、西洋ワサビ由来のＰＯＤに代わり得る微生物由来のＰＯＤを探索するにあたっては、アクチベーターを添加された状態の西洋ワサビ由来のＰＯＤを基準として、それと同等以上の酵素を探索することがより望ましい。あるいは、微生物由来のＰＯＤの反応性を向上させ得る新たなアクチベーターを探索し、それを組み合わせてもよい。
【００２５】
発光量および／または発色量の評価は、反応開始直後の発光量、および／または測定時間の間の発光量または発色量の積算値等により行うことができる。本発明の酵素免疫測定方法においては、Coprinus属由来のＰＯＤで標識した抗体を用いて、標識抗体を固定化された状態で酵素免疫測定に用いる場合に、アクチベーターを添加された状態の西洋ワサビ由来のＰＯＤを顕著に上回る発光量（反応性）が得られる。この傾向は、発色法を用いた場合でも同様であるが、特に発光系において、その優位性が顕著である。
【００２６】
（酵素免疫測定用組成物）
本発明の酵素免疫測定方法に用いるＰＯＤ、および／または前記ＰＯＤで標識した抗体は、研究用の汎用試薬として提供することもできるが、発色系または発光系の試薬、所望により、発色／発光強度を増強して、測定系の感度を向上させるよう最適化された組成とするためのその他の成分、例えば、緩衝剤、金属、および／または、防腐剤をはじめとした、酵素の保存安定性に寄与する成分等を含んだ、酵素免疫測定用組成物として提供することもできる。
【００２７】
（防腐剤耐性）
本発明の酵素免疫測定用組成物中に含まれ、本発明の酵素免疫測定方法に用いるＰＯＤ、および／または前記ＰＯＤで標識した抗体は、酵素免疫測定用組成物中に防腐剤が共存した際に、一定以上の防腐剤耐性を示すことを特徴とする。防腐剤の種類は特に限定されないが、例えば、プロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体が挙げられる。防腐剤耐性を示すとは、酵素免疫測定に１種以上の好適な濃度の防腐剤が共存するときでも、前記防腐剤が共存しない場合と遜色ない程度のＰＯＤ酵素活性を示すことをいう。あるいは、前記防腐剤が共存しない場合よりはＰＯＤ活性が低下するものの、従来公知の各種ＰＯＤおよび／または従来公知の各種ＰＯＤで標識した抗体と比較した場合には、そのＰＯＤ活性の低下度合が顕著に少ないことをいう。
本発明の酵素免疫測定用組成物の好ましい一例として、１％のアジ化ナトリウムと共存させた場合でも、前記防腐剤が共存しない場合と比較してＰＯＤ活性が全く低下せず、優れた防腐剤耐性を有している。また、本発明の酵素免疫測定用組成物の好ましい一例においては、防腐剤が共存した場合でも、防腐剤が共存しない場合のＰＯＤ活性の５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上のＰＯＤ活性を示す。
【００２８】
（酵素免疫測定用キット）
本発明の酵素免疫測定方法に用いるＰＯＤ、および／または前記ＰＯＤで標識した抗体は、研究用の汎用試薬として提供することもできるが、発色系または発光系の試薬、所望により、発色／発光強度を増強して、測定系の感度を向上させるよう最適化された組成とするためのその他の成分、例えば、緩衝剤、金属、および／または、ＰＯＤの保存安定性に寄与する成分等を含んだ複数種の酵素免疫測定用組成物および／または、サンプル希釈用の溶液、および／または測定用マイクロウェルプレート、操作用器具、説明書等を一式として組み合わせた酵素免疫測定用キットとして提供することもできる。
【００２９】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
（抗マウスＩｇＧ抗体のＰＯＤ標識）
１）Ｆ（ａｂ’）２の調製
ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製、Ａ９０−１１６Ａ）（３−５ｍｇ／ｍｌ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）に溶液置換した。ブタ胃由来ペプシン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｐ７０１２）を前記抗体の１／５０量（ｗ／ｗ）添加し、３７℃にて２０時間インキュベーションした。その後１／１０（ｖ／ｖ）量の３．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）を加えて反応を停止した。これを５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）により平衡化したセルロース樹脂ＤＥ５２（Ｗｈａｔｍａｎ社製 ４０５７−２００、平衡化：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、溶出液：５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）に供し、素通り画分を回収した。素通り画分中に回収されたＦ（ａｂ’）２抗体の濃度は２８０ｎｍにおける吸光度測定値から、ε２８０ｎｍ＝１．４８ｌ／（ｇ・ｃｍ）を用いて求めた。
【００３１】
２）Ｆａｂ’２（ＩｇＧ）−ＳＨ、ＩｇＧ−ＳＨの調製
ヤギ抗マウス抗体（Ｆ（ａｂ’）２、あるいはＩｇＧ）を０．１Ｍ リン酸ナトリウム （ｐＨ６．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに溶液置換し、１〜１０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した。５００ｍＭ システアミン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｍ９７６８−２５Ｇ）（６ｍｇ／０．１ｍｌの０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を調製し、前記の抗体溶液に１／１０（ｖ／ｖ）量加え、３７℃にて１．５時間インキュベーションした。過剰なシステアミンを透析あるいはゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（ＧＥ社製、１７−００３３−０１、平衡化液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、溶出液：０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、カラムサイズ：１０ｍｌ、重力による溶出）により除去した。
【００３２】
３）マレイミド化ＰＯＤの調製
市販のＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ社製）を１０〜３０ｍｇ／ｍｌとなるよう０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡに懸濁した。１００ｍＭ ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製、２２３６０）（３．３４ｍｇ／０．１ｍｌ ＤＭＳＯに溶解）を調製し、直ちにＰＯＤのモル濃度の５倍量を加えた。室温で３０分間インキュベーションし、前記の条件に従って、ゲルろ過カラムＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５に供し、過剰なＳＭＣＣを除去した。酵素濃度を、４０３ｎｍにおける吸光度測定値から、ε４０３ｎｍ＝８．３３×１０４ｌ／（ｍｏｌ・ｃｍ）を用いて求めた。
なお、上記の市販ＰＯＤの、ＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸））を基質とした場合の酵素学的性質は表１に示す通りであった。
【００３３】
【表１】
【００３４】
４）マレイミド化ＰＯＤによる抗体の標識（架橋）および標識抗体の精製
前記のマレイミド化ＰＯＤおよびＳＨ基還元抗体（溶媒は０．１Ｍ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を、酵素：抗体のモル比が１０：１となるように混合した。４℃で６時間以上（一晩）インキュベーションした後、標識（架橋）後の反応溶液を、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有ＰＢＳで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（ＧＥ社製、１７−１０７１−０１、溶出溶液：ＰＢＳ含有０．５Ｍ ＮａＣｌ、カラムサイズ：約２４ｍｌ、流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ）に供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧ（ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体、ＰＯＤ−ＩｇＧ）を得た。Ｆａｂ’に関しても、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ＧＬに供することにより、抗体と結合されなかった酵素を除去して、ＰＯＤ標識抗マウスＦａｂ’（Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体、ＰＯＤ−Ｆａｂ’）を得た。
【実施例２】
【００３５】
（ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧ（１次抗体）の検出における反応性比較試験）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体、または市販の西洋ワサビ（ＨＲＰ）標識抗体を用いて、マウスＩｇＧ（１次抗体、ヒトトランスフェリンに対し定法により作製）の検出における反応性比較を行った。
１．使用した抗体
１） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体１（比較例１の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
２） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体２（比較例２の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−ＩｇＧ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
３） 実施例１で得られた、Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体（本発明１の測定系で使用）
４） 実施例１で得られた、ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体（本発明２の測定系で使用）
【００３６】
２．ＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧの検出
１、１０、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製したマウスＩｇＧ溶液を用い、定法により、９６ウェルマイクロタイタープレート中にマウスＩｇＧ（１次抗体：抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（バイオマトリックス研究所社製））を固相化した。ここに、上記の各種ＰＯＤ標識抗体（２次抗体）をそれぞれ添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュ社製）に、ＡＢＴＳ−Ｔａｂｌｅｔｓ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロシュ社製）を溶かした基質溶液を添加し、一定時間反応させた後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
測定値の一例として、Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体に関する、使用した２次抗体の濃度と発色量の関係を、図１に示す。
【００３７】
図１に示すように、固相化したマウスＩｇＧの濃度によらず、ＰＯＤ標識抗体の使用量の増加に応じて、発色量の増大が観察された。また、特に、測定対照（１次抗体）の量が比較的多い場合においては、２次抗体の使用量を一定以上に増やしても、発色度向上効果には限界があることも示唆される（この要因のひとつは、発色度測定上の制約によるものと思われる）。
【００３８】
本試験において、発色測定上好ましい数値範囲内で、同程度の量のマウスＩｇＧを、同程度の量のＰＯＤ標識抗体を用いて測定した時に、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合の方が、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合よりも高感度であることが示された。例えば、約０．８μｇ／ｍｌの２次抗体を使用し、１０ｎｇ／ｍｌ、および１００ｎｇ／ｍｌの濃度に調製した溶液を用いて固相化したマウスＩｇＧを測定した場合の吸光度で比較すると、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合（比較例１、比較例２）では、それぞれ約０．３および約１．４であるのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明１）は約０．４および１．９であり、約１．３〜１．４倍高い値が得られた。
同様に、ＩｇＧを用いて作製したＰＯＤ標識抗体を用いた場合でも、良好な測定値が得られることがわかった（本発明２）。
【実施例３】
【００３９】
（ヒトトランスフェリンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧの検出における反応性比較）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体、または市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用い、発色系によりマウスＩｇＧを検出することによりヒトトランスフェリンを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の系を構築し、その発色量を比較した。
１．使用した抗体
１） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体１（比較例３の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−Ｆ（ａｂ’）２）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
２） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体２（比較例４の測定系で使用）：Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（ＨＲＰ−ＩｇＧ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ．社製）
３） 市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体３（比較例５の測定系で使用）：Ａｎｔｉ−ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｍｏｕｓｅ，Ｇｏａｔ−Ｐｏｌｙ（ＨＲＰ−ＩｇＧ）（Ｂｅｔｈｙｌ社製）４） 実施例１で得られた、Ｆａｂ’のＰＯＤ標識抗体（本発明３の定系で使用）
５） 実施例１で得られた、ＩｇＧのＰＯＤ標識抗体（本発明４の測定系で使用）
【００４０】
２．ヒトトランスフェリンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（発色系）によるマウスＩｇＧの検出
抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体（バイオマトリックス研究所社製）を定法により固相化した９６ウェルマイクロタイタープレートに、ＰＢＳを用いて調製した１、１０、および１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液５０μｌを添加し、室温で１時間反応させた。反応後、３５０μｌの０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳを用いて３回洗浄した。洗浄後、各ウェルに、適宜希釈した検出用抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、各種のＰＯＤ標識抗体をそれぞれ添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ Ｂｕｆｆｅｒ（ロシュ社製）に、ＡＢＴＳ−Ｔａｂｌｅｔｓ（２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロシュ社製）を溶かした基質溶液を添加し、一定時間反応させた後、４０５ｎｍの吸光度（発色量）を測定した。測定値の一例として、発色系における、ＨＲＰ標識抗体と実施例１で得られたＰＯＤ標識抗体を用いた、トランスフェリンの濃度と発色量の関係を図２に示す。
【００４１】
図２に示すように、添加したヒトトランスフェリンのいずれの濃度においても、各ＰＯＤ標識抗体の使用量の増加に応じて、発色量の増大が観察された。また、同量のＰＯＤ標識抗体を用いた場合には、ヒトトランスフェリン濃度の増加に応じて、発色量が増加する傾向が確認された。
【００４２】
本試験において、発色測定上好ましい数値範囲内で、同程度の量の検出用抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を用い、同程度の量のＰＯＤ標識抗体を用いて、ヒトトランスフェリン（抗原）を測定した時に、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合の方が、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合より高感度であることが示された。例えば、１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いたときの、固相化したマウスＩｇＧを測定した場合の吸光度で比較すると、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体（４００ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合（比較例３）では約０．４５であるのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体（３７５ｎｇ／ｍｌ）を用いた場合（本発明３）では約１．０であり、２．２倍高い値が得られた。すなわち、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体と同程度か、むしろそれより少量の標識抗体を使用した場合に、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合の方が、高い発色量が得られることがわかった。
【００４３】
上記の傾向は、特にＦａｂ’のＰＯＤ標識抗体に関し顕著であったが、ＩｇＧを用いて作製したＰＯＤ標識抗体を用いた場合でも、本測定により良好な測定値が得られることがわかった（本発明４）。
【実施例４】
【００４４】
（ヒトトランスフェリン、またはα２−マクログロブリンサンドイッチＥＬＩＳＡ法（発光系）によるマウスＩｇＧの検出における反応性比較）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体、または市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用い、発光系によりマウスＩｇＧを検出することによりヒトトランスフェリン、またはα２−マクログロブリンを測定するサンドイッチＥＬＩＳＡ法の系を構築し、その発光量を比較した。具体的には、ＰＯＤ標識抗体を添加し、洗浄した後、２，２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）に代えてルミノール（シグマ社製）と過酸化水素をトリス（西洋ワサビＰＯＤ標識抗体使用時）、またはトリシン（本発明ＰＯＤ標識抗体使用時）に溶解した基質溶液を添加し、一定時間反応させた後、発光量を測定する以外は、実施例３の方法に準じて、ヒトトランスフェリン、またはα２−マクログロブリンをサンドイッチＥＬＩＳＡ法にて測定し、その発光量を比較した。なお、使用したＰＯＤ標識抗体の使用量は同一ではないが、本測定系において好適な反応が行えるよう、予め各々について予備試験を行い、最適化された濃度で使用した。
測定値の一例として、各種ＰＯＤ標識抗体を用いた場合の、１ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いた場合の発光強度の時間経過を図３に、１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いた場合の発光強度の時間経過を図４に、各種ＰＯＤ標識抗体濃度を一定にし、α２−マクログロブリン濃度を変化させた場合の試薬添加時における発光強度の変化を図６に、α２−マクログロブリン濃度を一定にし、各種ＰＯＤ標識抗体濃度を変化させた場合の試薬添加時における発酵強度変化を図７に、それぞれ示す。
【００４５】
発色反応進行に伴い、一定時間の間、経時的に吸光度が増加していく発色系とは異なり、発光系では、初発時（発光反応直後）の光が最も強く、その後経時的に減少する。実際の発光量の測定では、一定時間内の発光量の積算値を用いる場合が多いが、その積算値は、初発の発光量と、その減衰の程度に依存し、特に初発の発光量に依存する。
いずれの濃度のヒトトランスフェリン（抗原）を測定した場合においても、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いたもの（比較例６〜８）より、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いたもの（本発明５〜６）の方が、初発の発光量、および測定後３０分間までの発光積算値についても、顕著に高いことが示された。
【００４６】
例えば、図３に示す、１ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いたときの初発発光量では、３種の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合（比較例６〜８）は、初発発光量が非常に低く、最も高いものでも１００，０００ＲＬＵであった（比較例７）のに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明５）には約８００，０００ＲＬＵとなり、８倍以上高い値を示した。ＰＯＤをＩｇＧに標識した本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明６）は、本発明の２種のＰＯＤ標識抗体の中では相対的に発光量が低かったが、それでも初発発光量が約３００，０００ＲＬＵであり、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合より３倍以上高い値が得られた。
【００４７】
この傾向は、図４に示す、１００ｎｇ／ｍｌのトランスフェリン溶液を用いた場合でも同様であった。西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合（比較例６〜８）では、初発発光量が約２５０，０００ＲＬＵおよび１，０００，０００ＲＬＵであったのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明５）では約４，２００，０００ＲＬＵで４．５倍および１８倍以上高い値を示した。ＩｇＧに標識した本発明のＰＯＤ標識抗体を用いた場合（本発明６）でも、約３，５００，０００ＲＬＵとなり、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合より３．５倍および１４倍以上高い値が得られた。
【００４８】
上記の通り、発光系における本発明のＰＯＤ標識抗体の高い感度は、特にＦａｂ’のＰＯＤ標識抗体に関し顕著であったが、ＩｇＧを用いて作製したＰＯＤ標識抗体を用いた場合でも同様に優れており、西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いた場合と比較して顕著に優れていることがわかった。
【００４９】
本測定のデータから算出した、トランスフェリンの濃度と初発発光量の関係を図５に示す。この図の各グラフにおける直線部分は、本測定の試験系を用いてトランスフェリンの濃度を算出することを想定した場合の、精度よく測定可能なトランスフェリンの濃度範囲を示す。各データのプロットから、Ｒ２＝０．９９以上となる直線性が得られるトランスフェリンの濃度範囲（測定可能濃度範囲）を求めた結果を表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
表１に示す通り、比較例（西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を使用）の測定方法では、０．５ｎｇ／ｍｌ、最も良い場合でも、０．１ｎｇ／ｍｌを下回るトランスフェリンは正確に測定することができないことが示された。これに対し、本発明（Coprinus属由来のＰＯＤを使用）の方法を用いれば、０．０１ｎｇ／ｍｌ、最も悪い場合でも、０．０５ｎｇ／ｍｌという低濃度のトランスフェリンまで良好に測定できることが示された。
【００５２】
また、図６に示すとおり、各種ＰＯＤ標識抗体の濃度を一定の適切な濃度に固定し、α２−マクログロブリン（抗原）濃度を変化させた場合、いずれの濃度のα２−マクログロブリンを測定した場合においても、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いたもの（比較例６）よりも、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いたもの（本発明５）の方で、顕著に高い測定値が得られた。本測定値（試薬添加直後１秒間の積算値で示す）より、本発明のＰＯＤ標識抗体が高感度であることが確認された。本発明と比較例との差をよりわかりやすく表すため、α２−マクログロブリン濃度を０〜１００ｎｇ／ｍｌと低濃度域の０〜１０ｎｇ／ｍｌの２つの図にて表した。抗原濃度によっては、本発明のＰＯＤ標識抗体の方が３０倍以上高感度であった。同様の検討をヒトトランスフェリンの系においても行い、同様に高感度であることを確認した。
【００５３】
図７に示すとおり、α２−マクログロブリン（抗原）の濃度を一定の適切な濃度に固定し、各種ＰＯＤ標識抗体濃度を変化させた場合、いずれの濃度のＰＯＤ標識抗体においても、市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を用いたもの（比較例６）より、本発明のＰＯＤ標識抗体を用いたもの（本発明５）の方で、顕著に高い測定値が得られた。なお、この際のその他の測定条件は、ＰＯＤ標識抗体濃度を一定とし、抗原濃度を変化させた場合と同様である。本発明と比較例との差をよりわかりやすく表すため、α２−マクログロブリン濃度を０〜１００ｎｇ／ｍｌと低濃度域の０〜０．５ｎｇ／ｍｌの２つの図にて表した。標識抗体濃度によっては、本発明のＰＯＤ標識抗体の方が２００倍以上高感度であった。同様の検討をヒトトランスフェリンの系においても行い、同様に高感度であることを確認した。
【００５４】
以上より、本発明の方法を用いることにより、より少ない標識抗体を使用して、しかも、より少ない量の目的物質を測定できるようになることがわかった。そして、ＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロッティング法等の酵素免疫測定を発光系を用いて行う場合における、担子菌由来ＰＯＤを用いた場合のこのような顕著な反応性・感度の向上傾向は、担子菌由来ＰＯＤ標識抗体を固定化しない系で試験した場合のさほど高いとはいえない反応性からは予測しがたいものであった。
【実施例５】
【００５５】
（酵素免疫測定用組成物の調製）
表３に示すＰＯＤ標識試薬、マウスＩｇＧ、希釈用緩衝液、洗浄用緩衝液、標準用抗原および発光用試薬溶液を調製して、酵素免疫測定用組成物を得た。
【００５６】
【表２】
【実施例６】
【００５７】
（酵素免疫測定用キットの調製）
実施例５に従って調製した６種類の試薬をそれぞれ小分け容器に分注し、各試薬と９６穴マイクロタイタープレートを一式として取り揃えて、酵素免疫測定用キットとした。
上記のように作製したキットを用いて、ヒトトランスフェリンを測定したところ、良好かつ効率よく測定操作を行うことができ、実施例４の本発明８に示すものと同様の結果が得られた。
【実施例７】
【００５８】
（ウエスタンブロッティング法を用いたヒトトランスフェリンの検出）
ヒト由来プラズマ１００ｎｇ、およびヒトトランスフェリン１０ｎｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。終了後、ゲルをウエスタンブロッティングによってＰＶＤＦ膜に転写した。転写した膜を定法により洗浄、ブロッキングし、ここに抗ヒトトランスフェリンモノクローナル抗体を添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳにて３回洗浄し、実施例１の方法にのっとって作製した２種の標識抗体（ＰＯＤ−ＩｇＧ、ＰＯＤ−Ｆａｂ’）を適宜希釈して添加し、室温で１時間反応させた。反応後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで３回洗浄した。次いで、ルミノールを含む発光試薬（ＥＣＬ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ社製））を添加し、発光を検出した。
結果を図８に示す。図中、「１」（○印の囲い文字）と表記されたものがプラズマ１００ｎｇ、「２」（○印の囲い文字）と表記されたものがヒトトランスフェリン１０ｎｇの結果である。Ｍは分子量マーカーである。いずれの標識抗体を使用した場合でも、双方とも問題なく良好にバンドとして検出でき、本発明の標識抗体をウエスタンブロッティングに良好に使用可能であることが示された。
【実施例８】
【００５９】
（ＨｅＬａ細胞の抗アクチン抗体による免疫染色）
本発明で使用する上述の３種のＰＯＤ標識抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ’）を用いて、ＨｅＬａ細胞の抗アクチン抗体による免疫染色を行った。免疫染色は、例えば、羊土社より発行されている抗体実験マニュアル等に記載されている常法に準じて行った。１次抗体として、抗アクチンモノクローナル抗体を用いた。２次抗体は実施例１の方法により作製したＰＯＤ標識抗体をそれぞれ適当な濃度で添加した。
結果の一例を図９に示す。いずれの系に関しても、細胞中のアクチンの存在部位に相当する部位が染色され、本発明で使用するＰＯＤ標識抗体を良好に使用できることが示された。
【実施例９】
【００６０】
（ラットすい臓の抗インスリン抗体による免疫染色）
上述の２種のＰＯＤ標識抗体（ＩｇＧ、Ｆａｂ’）を用いて、ラットすい臓の抗インスリン抗体による免疫染色を行った。免疫染色は、例えば、羊土社より発行されている抗体実験マニュアル等に記載されている常法に準じて行った。１次抗体として、抗インスリンモノクローナル抗体を用いた。２次抗体は実施例１の方法により作製した標識抗体を１／１０００倍に希釈した後添加した。
結果の一例を図１０に示す。いずれの系に関しても、細胞中のインスリンの存在部位に相当する部位が染色され、本発明で使用するＰＯＤ標識抗体を良好に使用できることが示された。
【実施例１０】
【００６１】
（アジ化ナトリウムの共存がＰＯＤ活性値に及ぼす影響の確認）
実施例１の方法に準じて作製した標識抗体または市販の西洋ワサビＰＯＤ標識抗体を０〜１％のアジ化ナトリウム（和光純薬工業社製）と一定時間（３時間）共存させた後、マウスＩｇＧ（１次抗体、ヒトトランスフェリンに対し定法により作製）の検出における反応性比較を行った。測定方法は実施例２のとおりである。
結果の一例を図１１に示す。西洋ワサビＰＯＤ標識抗体（比較例６）を用いた場合には、共存するアジ化ナトリウムの濃度に依存してＰＯＤ活性が大幅に阻害されるのに対し、本発明のＰＯＤ標識抗体（本発明５）を用いた場合には、アジ化ナトリウム共存下でもＰＯＤ活性の阻害は全くみられず、優れた防腐剤耐性が確認された。このことから、本発明の免疫測定用組成物が、アジ化ナトリウム共存下でも、特別に添加物を必要とせず、ＰＯＤ標識抗体を良好に保存・使用できることが示された。
【実施例１１】
【００６２】
（各種防腐剤の共存がＰＯＤ活性値に及ぼす影響の確認）
実施例１０以外のさらなる防腐剤として、汎用的に使われているプロクリンの一種であるＰｒｏｃｌｉｎ３００（シグマ社製）、チメロサール（シグマ社製）、ゲンタマイシン（和光純薬工業社製）を用い、実施例１の方法に準じて作製した標識抗体を用いて、実施例１０と同様の操作を行い、防腐剤耐性を試験した。
結果の一例を図１２に示す。いずれの防腐剤においても、本発明の免疫測定用組成物における測定で、ＰＯＤ活性の阻害はみられなかった。すなわち、各種の防腐剤を用いても、測定の際のＰＯＤ活性を損なうことなく、本発明の免疫測定用組成物を良好に保存・使用できることが示された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を使用し、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を用いた場合と比較して、ペルオキシダーゼ反応に由来する発色量または発光量が増大していることを特徴とする酵素免疫測定方法。
【請求項２】
担子菌がCoprinus属に属する微生物である、請求項１記載の酵素免疫測定方法。
【請求項３】
担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、請求項１または２記載の酵素免疫測定方法。
【請求項４】
防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、請求項３記載の酵素免疫測定方法。
【請求項５】
Coprinus属由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を含有し、前記標識した抗体が固定化された状態において発色反応又は発光反応を行うことを特徴とする、酵素免疫測定用組成物。
【請求項６】
担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、請求項５記載の酵素免疫測定用組成物。
【請求項７】
防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、請求項６記載の酵素免疫測定用組成物。
【請求項８】
請求項５〜７記載の酵素免疫測定用組成物を含む、酵素免疫測定用キット。
【請求項１】
担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を使用し、西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を用いた場合と比較して、ペルオキシダーゼ反応に由来する発色量または発光量が増大していることを特徴とする酵素免疫測定方法。
【請求項２】
担子菌がCoprinus属に属する微生物である、請求項１記載の酵素免疫測定方法。
【請求項３】
担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、請求項１または２記載の酵素免疫測定方法。
【請求項４】
防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、請求項３記載の酵素免疫測定方法。
【請求項５】
Coprinus属由来のペルオキシダーゼを標識した抗体を含有し、前記標識した抗体が固定化された状態において発色反応又は発光反応を行うことを特徴とする、酵素免疫測定用組成物。
【請求項６】
担子菌由来のペルオキシダーゼおよび／または担子菌由来のペルオキシダーゼを標識した抗体が防腐剤耐性を有することを特徴とする、請求項５記載の酵素免疫測定用組成物。
【請求項７】
防腐剤がプロクリン、チメロサール、アジ化ナトリウム、ゲンタマイシン、またはそれらの誘導体である、請求項６記載の酵素免疫測定用組成物。
【請求項８】
請求項５〜７記載の酵素免疫測定用組成物を含む、酵素免疫測定用キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−４４０５８（Ｐ２０１０−４４０５８Ａ）
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６４３４３（Ｐ２００９−１６４３４３）
【出願日】平成２１年７月１３日（２００９．７．１３）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月２５日（２０１０．２．２５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１３日（２００９．７．１３）
【出願人】（０００００４４７７）キッコーマン株式会社 (212)
【Ｆターム（参考）】
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