鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法
【課題】鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる方法を提供する。
【解決手段】穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を培地に添加することにより、鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる。代表的には、清酒粕を用いる。また、代表的には、麹菌を用いてデフェリフェリクリシンやレクチンを生産させる場合に有効である。
【解決手段】穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を培地に添加することにより、鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる。代表的には、清酒粕を用いる。また、代表的には、麹菌を用いてデフェリフェリクリシンやレクチンを生産させる場合に有効である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法、この方法に特に適した培地、及びこの培地の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物に代表される生物は、種々の有用な物質を生産する。これらの中には、鉄濃度が低くなると生産が亢進し、鉄濃度が高くなると生産が抑制される物質がある。例えば、麹菌は、シデオロフォアの１種であるフェリクロームやレクチンを生産するが、これらは鉄により生産が抑制される。フェリクロームは鉄をキレートすることから医薬品などとして有用であり、レクチンは糖検出試薬として有用である。
【０００３】
微生物に有用物質を生産させるにあたっては、培地中のアミノ酸などの窒素源量を多くすれば、微生物の増殖速度が向上するとともに、種々の物質生産量が増大することが知られている。
【０００４】
培地に添加される窒素源としては、ポリペプトンや酵母エキスなどが汎用されている。しかし、このような汎用の窒素源は鉄が含まれているものが多いため、鉄により生産が抑制される物質の製造のための窒素源としては適さない。一方、合成培地では、窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩、アミノ酸などが用いられるため、鉄含量を低くすることができる。しかし、合成培地は貧栄養培地であり、微生物の生育が悪いため、効率よく有用物質を生産させることができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる方法、並びに鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる培地、及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、穀類の醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を培地に添加することにより、意外にも、鉄により生産が抑制される物質の培地当たりの生産量が極めて高くなることを見出した。
【０００７】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記の培地、及び物質製造方法を提供する。
【０００８】
項１． 醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法。
【０００９】
項２． 生物が微生物である項１に記載の方法。
【００１０】
項３． 微生物が糸状菌である項２に記載の方法。
【００１１】
項４． 微生物がアスペルギルス属微生物である項３に記載の方法。
【００１２】
項５． 培養に使用する培地が、鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１３】
項６． 培養に使用する培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１４】
項７． もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００１５】
項８． 培地が液体培地である項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００１６】
項９． もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項８に記載の方法。
【００１７】
項１０． もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項８に記載の方法。
【００１８】
項１１． 培地が固体培地である項１〜７のいずれかに記載の培地。
【００１９】
項１２． もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項１１に記載の方法。
【００２０】
項１３． もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項１１に記載の方法。
【００２１】
項１４． 鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００２２】
項１５． 醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地。
【００２３】
項１６． 鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである項１５に記載の培地。
【００２４】
項１７． 鉄濃度が２ｐｐｍ以下である項１５又は１６に記載の培地。
【００２５】
項１８． もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【００２６】
項１９． 培地が液体培地である項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【００２７】
項２０． もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項１９に記載の培地。
【００２８】
項２１． もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項１９に記載の培地。
【００２９】
項２２． 培地が固体培地である項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【００３０】
項２３． もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項２２に記載の培地。
【００３１】
項２４． もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項２２に記載の培地。
【００３２】
項２５． 鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである項１５〜２４のいずれかに記載の培地。
【００３３】
項２６． 基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地の製造方法。
【００３４】
項２７． 基礎となる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である項２６に記載の方法。
【００３５】
項２８． 得られる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下となるように、基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、項２６又は２７に記載の方法。
【００３６】
項２９． もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【００３７】
項３０． 培地が液体培地である項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【００３８】
項３１． もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する項３０に記載の方法。
【００３９】
項３２． もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する項３０に記載の方法。
【００４０】
項３３． 培地が固体培地である項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【００４１】
項３４． もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する項３３に記載の方法。
【００４２】
項３５． もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する項３３に記載の方法。
【００４３】
項３６． 鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００４４】
清酒や焼酎などの醸造に代表される、穀類を用いた醸造により得られるもろみ、又はその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養することにより、その生物による、鉄により生産が抑制される物質の生産の効率が著しく向上する。
【００４５】
特に、醸造粕は、産業廃棄物であるため、これを培地成分として有効利用すれば、鉄により生産が抑制される物質を、低コストで製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（Ｉ）鉄により生産が抑制される生物生産物の製造のための培地
本発明の培地は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造のための培地であって、穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地である。
【００４７】
鉄により生産が抑制される生物生産物としては、代表的には、フェリクロームなどのシデロフォアが挙げられる。例えば、麹菌の生産するデフェリフェリクリシンがこれに該当する。また、麹菌が生産するレクチン（フコース特異的レクチン）も、鉄により生産が抑制される物質である。
【００４８】
穀類の種類は、特に限定されず、米、麦、そば、あわなど、醸造に用いられる穀類を制限なく使用することができる。例えば、米を用いた醸造により得られるもろみ・粕としては、清酒もろみ・粕（普通もろみ・粕、液化もろみ・粕）、焼酎もろみ・粕、味醂もろみ・粕などが挙げられるが、一般に精白度が高い清酒、味醂のもろみ・粕が好ましい。この他、麦を用いた焼酎やビールの醸造のもろみ・粕を用いることもできる。
【００４９】
本発明において、もろみは、穀類、水に麹若しくは酵母、又はその両方を混合して発酵させたもの、発酵中のもの、及び仕込んだ直後のものをいう。また、粕は、もろみから液体部（例えば酒類）を搾ったあとに残る固形物をいう。
【００５０】
もろみまたは粕のプロテアーゼ分解物は、例えば、以下のようにして得ることができる。粕は、固体であるため、水やバッファーを添加して流動状にしたものにプロテアーゼを作用させればよい。また、もろみは液状または流動状であるため、そのままプロテアーゼを作用させればよい。プロテアーゼの作用温度、時間は、特に限定されず、そのプロテアーゼが活性を示す条件とすればよい。
【００５１】
プロテアーゼの種類は特に限定されず、公知のプロテアーゼを制限なく使用できる。また、プロテイナーゼ（エンドペプチダーゼ）を用いてタンパク質をペプチドにまで分解してもよく、ペプチダーゼ（エキソペプチダーゼ）を用いてタンパク質をアミノ酸にまで分解してもよい。培養する微生物が利用できる程度にタンパク質が分解されていればよい。
【００５２】
粕含有液、またはもろみにプロテアーゼを作用させて得られる産物をそのまま培地に添加しても良い。このプロテアーゼ分解物の中には、タンパク質がプロテアーゼにより分解されて生じたアミノ酸やペプチド、水溶性タンパク質の未分解物、少量のアルコールのような水溶性成分と、水不溶性タンパク質、穀類残渣、麹菌や酵母のような水不溶性成分とが含まれる。アルコールは少量しか含まれないため、生物の生育を実質的に阻害しない。
【００５３】
また、粕含有液、またはもろみにプロテアーゼを作用させて得られる産物を濾過または遠心分離して水不溶性成分を除去し、残った水溶性成分を添加しても良い。液体培地にプロテアーゼ分解物を添加する場合は、目的生産物を単離し易くするため、水不溶性成分を除去しておくことが好ましい。
【００５４】
粕、又はもろみのプロテアーゼ分解物をそのまま培地に添加する場合も、水不溶性成分を除去したものを培地に添加する場合も、さらに乾燥してから添加することができる。これにより、添加量を正確に制御することができる。
【００５５】
培地中のもろみまたは粕のプロテアーゼ分解物の含有量は、プロテアーゼ分解物の乾燥重量に換算して、液体培地の場合は、０．０５〜５ｗ／ｖ％程度であることが好ましく、０．２〜１．５ｗ／ｖ％程度であることがより好ましく、０．３〜０．７ｗ／ｖ％程度であることがさらにより好ましい。また、固体培地の場合は、０．０５〜５重量％程度であることが好ましく、０．２〜１．５重量％程度であることがより好ましく、０．３〜０．７重量％程度であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、生物の増殖を十分に促進するとともに、得られる培地中の上記プロテアーゼ分解物に由来する鉄含有量が多くなりすぎることがなく、その結果、目的生産物を効率よく得ることができる。
【００５６】
本発明の培地は、基礎となる培地に上記プロテアーゼ分解物を添加することにより得られる。基礎となる培地は、鉄含有量が２ｐｐｍ以下のものを用いることが好ましく、１ｐｐｍ以下のものを用いることがより好ましく、鉄を実質的に含まないことがさらにより好ましい。その他の成分は特に限定されない。合成培地を用いれば、鉄含有量を制御し易い。もろみまたは粕のプロテアーゼ分解物を添加することにより、生物の生育に必要な窒素量を十分に確保できるため、合成培地のような貧栄養培地を用いても十分な生物生育速度が得られる。
【００５７】
基礎となる培地としては、液体培地では、代表的には、真菌類の培養に汎用される培地であるツァペックドックス培地であって鉄を含まないものが挙げられる。また、固体培地としては、蒸米等が挙げられる。
（ＩＩ）鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法
本発明の方法は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法であって、穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む方法である。
【００５８】
生物は、培地で培養されるものであればよく、微生物、植物の細胞や組織、動物の細胞や組織などが挙げられる。代表的には微生物であり、中でも真菌が好ましく、糸状菌がより好ましく、アスペルギルス属糸状菌がさらにより好ましい。
【００５９】
培地は上記説明したものを用いる。培養方法は、回分、流加、連続などのいずれの方法であってもよい。培養温度は、使用する生物の生育、及び目的物質の生産に適した温度とすればよい。培養時間は、生物及び目的物質の種類に応じて適宜決める事ができる。
【００６０】
例えば、全体重量に対して清酒粕のプロテアーゼ分解物を乾燥重量に換算して０．５ｗ／ｖ％程度含むツァペックドックス培地を用いて、アスペルギルス・オリゼの培養によりデフェリフェリクリシンを生産する場合は、２５〜３５℃程度で３〜７日間程度培養すればよい。また、同様の培地を用いて、アスペルギルス・オリゼの培養によりフコース特異的レクチンを生産する場合は、２５〜３５℃程度で３日間〜７日間程度培養すればよい。
【００６１】
目的生産物は、培地ごと回収することもできるが、さらに公知の手段により精製してもよい。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（窒素源の種類の検討）
（１―１）供試菌株
麹菌アスペルギルス・オリゼＯ−１０１３株（平成９年１１月２０日にＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第６）に寄託済み）、及びアスペルギルス・オリゼＯ−１０１８株（平成８年９月４日にＦＥＲＭ Ｐ−１５８３４として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託済み）を用いた。
（１―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
液化粕の凍結乾燥品１０ gに蒸留水５０ｍｌを加え均一にし、市販プロテアーゼであるサモアーゼ（アマノエンザイム社製）を０．２ｇ加え６０℃で３時間攪拌しながら反応させた。１００℃で１０分加熱し酵素を失活させた後、遠心分離により不溶性の残渣を除去し、上清液を凍結乾燥し、液化粕サモアーゼ分解物の乾燥粉末を得た。
(１―３)培地の調製
培地１：基本培地としては、鉄制限ツァペックドックス培地 (０．２ｗ/ｖ％ ＮａＮＯ３, ０．１ｗ/ｖ％Ｋ２ＨＰＯ４, ０．０５ｗ/ｖ％ＫＣｌ, ０．０５ｗ/ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ, ２ｗ/ｖ％ ｇｌｕｃｏｓｅ, ｐＨ ６．０)を用いた。
培地２：鉄含有の対照培地として、上記鉄制限ツァペックドックス培地に最終濃度０．００１ｗ/ｖ％となるようにＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを添加した培地を調製した。
培地３：上記鉄制限ツァペックドックス培地にカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地４：上記鉄制限ツァペックドックス培地にイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地５：上記鉄制限ツァペックドックス培地にダイゴポリペプトン（日本製薬社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地６：上記鉄制限ツァペックドックス培地に液化粕サモアーゼ分解物を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地７：上記鉄制限ツァペックドックス培地にスピルリナ（大日本インキ社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
（１―４）培養
上記２麹菌株を保存スラントからポテトデキストロースアガープレート（ニッスイ社製）に塗布し、胞子を形成させた。各株の胞子を回収し、上記の各培地４０ｍｌに１０６個／ｍｌ胞子を植菌し、３０℃で７日間、振盪培養した。
（１―５）菌体湿重量の測定
培養終了後の菌糸を回収し、乾いた布を用いて水分を搾り取った後の菌体湿重量を測定した。これを培養液の液量で除し、培地あたりの菌体湿重量（ｍｇ／ｍｌ―ｂｒｏｔｈ）を算出した。
（１―６）デフェリフェリクリシン生産量の測定
培養上清１００μｌに１０μｌの０．２Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０μｌの３０００ｐｐｍ ＦｅＣｌ３溶液を添加し、デフェリフェリクリシン（Ｄｆｃｙ）に鉄をキレートさせフェリクリシン（Ｆｃｙ）とした。
【００６２】
これをＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製；Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）を用い逆相クロマト分析に供し、Ｆｃｙに特異的な吸収波長である波長４３０ｎｍを指標にＦｃｙピークを同定した。そのピーク面積からＦｃｙの定量を行った。定量したＦｃｙ量に、分子量比より０．９３（７４４／８００）を乗じてＤｆｃｙ量を算出した。
（１―７）フコース特異的レクチンの調製および活性測定
アスペルギルス・オリゼのフコース特異的レクチンを、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，１００２−１００８（２００２）に記載の方法に準拠して調製した。即ち、培養物から菌糸を回収し、１．０ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー （ｐＨ７．０）中で海砂を用いて磨り潰し、細胞抽出液を得た。このホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を分離した。こうして得た細胞抽出液上清を用いフコース特異的レクチンの赤血球凝集活性を測定した。即ち、Ｕ型96穴マイクロプレートのウェル中で、５０μｌの５００―７．８μｇ／ｍｌの２倍希釈系列の細胞抽出液上清に５０μｌのウサギ赤血球２％（ｖ／ｖ）を加え、室温で1時間放置後、赤血球凝集を目視で判定し、最小凝集濃度を算出した。レクチン活性を１Ｕ（１％ウサギ赤血球に対して１ｍｇ/ｍｌが最小凝集濃度である凝集素１μｇの凝集活性）と定義し、各々の最小凝集濃度とたんぱく質量を乗じて得られた総活性を培地量で除することで培地あたり活性（Ｕ／ｄｌ）を各培地でのレクチン生産量として比較した。なお、細胞抽出液、赤血球溶液の希釈には５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用い、たんぱく質濃度の測定はブラッドフォード法で行い、ＢＳＡ換算量として求めた。
（１―８）結果
培地容量当たりの菌体湿重量、培養上清中のＤｆｃｙ濃度、培養上清中のフコースレクチン活性を、図１に示す。図１横軸の数値１〜７は培地１〜７を示す。アスペルギルス・オリゼＯ―１０１３株、及びＯ―１０１８株の双方において、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地では、その他の窒素源を添加した培地に比べて、Ｄｆｃｙ濃度、及びフコースレクチン濃度のいずれも格段に高かった。特にレクチンは、実質的には、窒素源として液化粕サモアーゼ分解物を使用した場合のみ生産された。特に、鉄含有量が少ないと考えられるカザミノ酸を添加した培地より、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地を使用する方が、Ｄｆｃｙ、及びレクチンの生産量が格段に高くなることは注目すべきことである。
【００６３】
また、スピルリナやイーストエキスを添加した培地では、菌体湿重量が多くても、Ｄｆｃｙ、及びレクチンの生産量は低いが、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地を使用した場合は、菌体質重量が高く、かつＤｆｃｙ生産量、及びレクチン生産量も高かった。
【００６４】
実施例２（分解酵素の種類の検討）
（２―１）供試菌株
実施例１と同様である。
（２―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
プロテアーゼ１：実施例１と同様にして、液化粕サモアーゼ（アマノエンザイム社製）分解物を調製した。
プロテアーゼ２：サモアーゼに代えてプロチンＦＡ（アマノエンザイム社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ３：サモアーゼに代えてＹＰ―ＳＳ（ヤクルト社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ４：サモアーゼに代えてスミチームＬＰ（新日本化学工業社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ５：サモアーゼに代えてプロテアーゼＳアマノ（アマノエンザイム社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ６：サモアーゼに代えてトリプシン（和光純薬社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
（２―３)培地組成
実施例１と同様の、鉄制限ツァペックドックス培地 （０．２ｗ/ｖ％ＮａＮＯ３, ０．１ｗ/ｖ％Ｋ２ＨＰＯ４, ０．０５ｗ/ｖ％ＫＣｌ, ０．０５ｗ/ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ, ２ｗ/ｖ％ｇｌｕｃｏｓｅ, ｐＨ６．０)を用いた。これに、液化粕の各種プロテアーゼ分解物を全体に対して０．５ｗ/ｖ％添加した。
（２―４）培養
実施例1と同様にした。
（２―５）菌体湿重量測定・Ｄｆｃｙ濃度測定・フコース特異的レクチンの調製および活性測定
実施例1と同様にした。
（２―６）フコース特異的レクチンの生産量の確認
実施例１と同様にして、培養物から菌糸を回収し、１．０ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で海砂を用いて磨り潰し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液上清を各レーン５μｇとなるようにＳＤＳ―ＰＡＧＥに供しフコース特異的レクチンの生産量を確認した。精製フコース特異的レクチンはＳＤＳ―ＰＡＧＥにおいて単一バンドを与えることが上記文献によって示されておりその分子量は３５，０００である。分子量３５，０００の位置に出現するバンドから、各種培養におけるフコース特異的レクチンの生産性を比較した。
（２―７）結果
菌体湿重量、Ｄｆｃｙ濃度、及びレクチン活性の結果を図２に示す。図２横軸の数値１〜６は、プロテアーゼ１〜６を示す。また、細胞抽出液のＳＤＳ―ＰＡＧＥの結果を図３に示す。いずれのプロテアーゼを用いた場合も、高い菌体湿重量、及びＤｆｃｙ濃度が得られた。また、レクチン活性は、プロテアーゼ３（ＹＰ―ＳＳ）及びプロテアーゼ４（スミチームＬＰ）を用いた場合に、他のプロテアーゼを用いる場合より低かったが、ＳＤＳ―ＰＡＧＥにより、プロテアーゼ３、４を用いる場合にもレクチンが十分に生産されていることが分かる。細胞抽出液中に活性測定を阻害する因子が含まれているために測定できなかったと考えられる。
実施例３（粕の種類の検討）
（３―１）供試菌株
アスペルギルス・オリゼＯ−１０１８株を用いた。
（３―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
粕として、清酒粕（普通粕および液化粕）、米焼酎粕、及び味醂粕をそれぞれ用いた。プロテアーゼＳアマノ（アマノエンザイム社製）を用いて、実施例１と同様にして各種粕のプロテアーゼ分解物を得た。
（３―３）培地組成
基本培地としては、実施例1と同様の上記鉄制限ツァペックドックス培地を用いた。これに、各種粕のプロテアーゼ分解物を全体に対して０．５ｗ/ｖ％添加した。また、粕分解物を添加しない培地も対照として用いた。
（３―４）培養
実施例１と同様とした。
（３―５） 菌体湿重量測定・Ｄｆｃｙ濃度測定・フコース特異的レクチンの調製および活性測定
実施例１と同様とした。
（３―６）鉄濃度測定
各種粕プロテアーゼ分解物の０．１ｗ/ｖ％溶液を調製し、原子吸光（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ＡＡｎａｌｙｓｔ８００）にてＦｅ含量を測定した。この結果から、各種粕プロテアーゼ分解物の粉末あたり、又は粕プロテアーゼ分解物を０．５ｗ/ｖ％添加した培地あたりの鉄含量を算出した。
（３―７）結果
菌体湿重量、Ｄｆｃｙ濃度、及びレクチン活性の結果を図４に示す。図４横軸の１は液化粕、２は普通粕、３は焼酎粕、４は味醂粕のプロテアーゼ分解物を全体に対して０．５ｗ/ｖ％添加した培地での各値、５は粕分解物を添加しない培地での各値を示す。また、各種粕のプロテアーゼ分解物の鉄濃度を以下の表１に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
いずれの粕を用いた場合も、菌体湿重量、Ｄｆｃｙ濃度、及びレクチン活性が高かった。表１によれば、焼酎粕には比較的高濃度の鉄が含まれるが、Ｄｆｃｙ及びレクチンの生産量は、その他の粕を用いた場合と余り変わらなかった。このことから、添加するプロテアーゼ分解物由来の鉄量が培地あたりの鉄濃度に換算して１ｐｐｍ程度では、鉄制限がかからず、Ｄｆｃｙ及びレクチンの生産量に影響しないことが分かる。粕やもろみの鉄含量が低いことだけが、これらの物質生産に寄与しているのではなく、粕分解物を添加することにより、ペプチドやアミノ酸を鉄含量が低い状態で添加することができたため、鉄により生産が抑制されたと考えられる。
実施例４（清酒粕のプロテアーゼ分解物添加量の検討）
（４―１）供試菌株
アスペルギルス・オリゼＯ−１０１３株を用いた。
（４―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
実施例１と同様にして、液化粕サモアーゼ（アマノエンザイム社製）分解物の乾燥粉末を調製した。
（４―３)培地組成
実施例１と同様の、鉄制限ツァペックドックス培地 （０．２ｗ/ｖ％ＮａＮＯ３, ０．１ｗ/ｖ％Ｋ２ＨＰＯ４, ０．０５ｗ/ｖ％ＫＣｌ, ０．０５ｗ/ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ, ２ｗ/ｖ％ｇｌｕｃｏｓｅ, ｐＨ６．０)を用いた。これに、液化粕のサモアーゼ分解物の乾燥粉末を全体に対して０．５〜１．５ｗ/ｖ％添加した。
（４―４）培養
実施例1と同様にした。
（４―５）Ｄｆｃｙ濃度測定
実施例1と同様にした。
（４―６）結果
Ｄｆｃｙ濃度の結果を図５に示す。図５横軸の数値は、清酒粕のプロテアーゼ分解物の添加濃度ｗ/ｖ％を示す。いずれの濃度で清酒粕のプロテアーゼ分解物を添加した場合も、高いＤｆｃｙ濃度が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】菌体湿重量、デフェリフェリクリシン濃度、及びレクチン活性に対して、培地に添加する窒素源の種類が与える影響を示す図である。
【図２】菌体湿重量、デフェリフェリクリシン濃度、及びレクチン活性に対して、培地に添加する清酒粕分解物を生産する際のプロテアーゼの種類が与える影響を示す図である。
【図３】培地に添加する清酒粕分解物を生産する際のプロテアーゼの種類がレクチンたんぱく質の生産状況に与える影響をＳＤＳ―ＰＡＧＥで示す図である。
【図４】菌体湿重量、デフェリフェリクリシン濃度、及びレクチン活性に与える粕の種類の影響を示す図である。
【図５】デフェリフェリクリシン濃度に与える清酒粕のプロテアーゼ分解物添加量の影響を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法、この方法に特に適した培地、及びこの培地の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物に代表される生物は、種々の有用な物質を生産する。これらの中には、鉄濃度が低くなると生産が亢進し、鉄濃度が高くなると生産が抑制される物質がある。例えば、麹菌は、シデオロフォアの１種であるフェリクロームやレクチンを生産するが、これらは鉄により生産が抑制される。フェリクロームは鉄をキレートすることから医薬品などとして有用であり、レクチンは糖検出試薬として有用である。
【０００３】
微生物に有用物質を生産させるにあたっては、培地中のアミノ酸などの窒素源量を多くすれば、微生物の増殖速度が向上するとともに、種々の物質生産量が増大することが知られている。
【０００４】
培地に添加される窒素源としては、ポリペプトンや酵母エキスなどが汎用されている。しかし、このような汎用の窒素源は鉄が含まれているものが多いため、鉄により生産が抑制される物質の製造のための窒素源としては適さない。一方、合成培地では、窒素源として、硝酸塩、アンモニウム塩、アミノ酸などが用いられるため、鉄含量を低くすることができる。しかし、合成培地は貧栄養培地であり、微生物の生育が悪いため、効率よく有用物質を生産させることができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる方法、並びに鉄により生産が抑制される生物生産物を効率よく製造することができる培地、及びその製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、穀類の醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を培地に添加することにより、意外にも、鉄により生産が抑制される物質の培地当たりの生産量が極めて高くなることを見出した。
【０００７】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記の培地、及び物質製造方法を提供する。
【０００８】
項１． 醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法。
【０００９】
項２． 生物が微生物である項１に記載の方法。
【００１０】
項３． 微生物が糸状菌である項２に記載の方法。
【００１１】
項４． 微生物がアスペルギルス属微生物である項３に記載の方法。
【００１２】
項５． 培養に使用する培地が、鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである項１〜４のいずれかに記載の方法。
【００１３】
項６． 培養に使用する培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である項１〜５のいずれかに記載の方法。
【００１４】
項７． もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である項１〜６のいずれかに記載の方法。
【００１５】
項８． 培地が液体培地である項１〜７のいずれかに記載の方法。
【００１６】
項９． もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項８に記載の方法。
【００１７】
項１０． もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項８に記載の方法。
【００１８】
項１１． 培地が固体培地である項１〜７のいずれかに記載の培地。
【００１９】
項１２． もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項１１に記載の方法。
【００２０】
項１３． もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項１１に記載の方法。
【００２１】
項１４． 鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【００２２】
項１５． 醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地。
【００２３】
項１６． 鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである項１５に記載の培地。
【００２４】
項１７． 鉄濃度が２ｐｐｍ以下である項１５又は１６に記載の培地。
【００２５】
項１８． もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【００２６】
項１９． 培地が液体培地である項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【００２７】
項２０． もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項１９に記載の培地。
【００２８】
項２１． もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である項１９に記載の培地。
【００２９】
項２２． 培地が固体培地である項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【００３０】
項２３． もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項２２に記載の培地。
【００３１】
項２４． もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である項２２に記載の培地。
【００３２】
項２５． 鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである項１５〜２４のいずれかに記載の培地。
【００３３】
項２６． 基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地の製造方法。
【００３４】
項２７． 基礎となる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である項２６に記載の方法。
【００３５】
項２８． 得られる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下となるように、基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、項２６又は２７に記載の方法。
【００３６】
項２９． もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【００３７】
項３０． 培地が液体培地である項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【００３８】
項３１． もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する項３０に記載の方法。
【００３９】
項３２． もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する項３０に記載の方法。
【００４０】
項３３． 培地が固体培地である項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【００４１】
項３４． もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する項３３に記載の方法。
【００４２】
項３５． もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する項３３に記載の方法。
【００４３】
項３６． 鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【００４４】
清酒や焼酎などの醸造に代表される、穀類を用いた醸造により得られるもろみ、又はその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養することにより、その生物による、鉄により生産が抑制される物質の生産の効率が著しく向上する。
【００４５】
特に、醸造粕は、産業廃棄物であるため、これを培地成分として有効利用すれば、鉄により生産が抑制される物質を、低コストで製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
（Ｉ）鉄により生産が抑制される生物生産物の製造のための培地
本発明の培地は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造のための培地であって、穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地である。
【００４７】
鉄により生産が抑制される生物生産物としては、代表的には、フェリクロームなどのシデロフォアが挙げられる。例えば、麹菌の生産するデフェリフェリクリシンがこれに該当する。また、麹菌が生産するレクチン（フコース特異的レクチン）も、鉄により生産が抑制される物質である。
【００４８】
穀類の種類は、特に限定されず、米、麦、そば、あわなど、醸造に用いられる穀類を制限なく使用することができる。例えば、米を用いた醸造により得られるもろみ・粕としては、清酒もろみ・粕（普通もろみ・粕、液化もろみ・粕）、焼酎もろみ・粕、味醂もろみ・粕などが挙げられるが、一般に精白度が高い清酒、味醂のもろみ・粕が好ましい。この他、麦を用いた焼酎やビールの醸造のもろみ・粕を用いることもできる。
【００４９】
本発明において、もろみは、穀類、水に麹若しくは酵母、又はその両方を混合して発酵させたもの、発酵中のもの、及び仕込んだ直後のものをいう。また、粕は、もろみから液体部（例えば酒類）を搾ったあとに残る固形物をいう。
【００５０】
もろみまたは粕のプロテアーゼ分解物は、例えば、以下のようにして得ることができる。粕は、固体であるため、水やバッファーを添加して流動状にしたものにプロテアーゼを作用させればよい。また、もろみは液状または流動状であるため、そのままプロテアーゼを作用させればよい。プロテアーゼの作用温度、時間は、特に限定されず、そのプロテアーゼが活性を示す条件とすればよい。
【００５１】
プロテアーゼの種類は特に限定されず、公知のプロテアーゼを制限なく使用できる。また、プロテイナーゼ（エンドペプチダーゼ）を用いてタンパク質をペプチドにまで分解してもよく、ペプチダーゼ（エキソペプチダーゼ）を用いてタンパク質をアミノ酸にまで分解してもよい。培養する微生物が利用できる程度にタンパク質が分解されていればよい。
【００５２】
粕含有液、またはもろみにプロテアーゼを作用させて得られる産物をそのまま培地に添加しても良い。このプロテアーゼ分解物の中には、タンパク質がプロテアーゼにより分解されて生じたアミノ酸やペプチド、水溶性タンパク質の未分解物、少量のアルコールのような水溶性成分と、水不溶性タンパク質、穀類残渣、麹菌や酵母のような水不溶性成分とが含まれる。アルコールは少量しか含まれないため、生物の生育を実質的に阻害しない。
【００５３】
また、粕含有液、またはもろみにプロテアーゼを作用させて得られる産物を濾過または遠心分離して水不溶性成分を除去し、残った水溶性成分を添加しても良い。液体培地にプロテアーゼ分解物を添加する場合は、目的生産物を単離し易くするため、水不溶性成分を除去しておくことが好ましい。
【００５４】
粕、又はもろみのプロテアーゼ分解物をそのまま培地に添加する場合も、水不溶性成分を除去したものを培地に添加する場合も、さらに乾燥してから添加することができる。これにより、添加量を正確に制御することができる。
【００５５】
培地中のもろみまたは粕のプロテアーゼ分解物の含有量は、プロテアーゼ分解物の乾燥重量に換算して、液体培地の場合は、０．０５〜５ｗ／ｖ％程度であることが好ましく、０．２〜１．５ｗ／ｖ％程度であることがより好ましく、０．３〜０．７ｗ／ｖ％程度であることがさらにより好ましい。また、固体培地の場合は、０．０５〜５重量％程度であることが好ましく、０．２〜１．５重量％程度であることがより好ましく、０．３〜０．７重量％程度であることがさらにより好ましい。上記範囲であれば、生物の増殖を十分に促進するとともに、得られる培地中の上記プロテアーゼ分解物に由来する鉄含有量が多くなりすぎることがなく、その結果、目的生産物を効率よく得ることができる。
【００５６】
本発明の培地は、基礎となる培地に上記プロテアーゼ分解物を添加することにより得られる。基礎となる培地は、鉄含有量が２ｐｐｍ以下のものを用いることが好ましく、１ｐｐｍ以下のものを用いることがより好ましく、鉄を実質的に含まないことがさらにより好ましい。その他の成分は特に限定されない。合成培地を用いれば、鉄含有量を制御し易い。もろみまたは粕のプロテアーゼ分解物を添加することにより、生物の生育に必要な窒素量を十分に確保できるため、合成培地のような貧栄養培地を用いても十分な生物生育速度が得られる。
【００５７】
基礎となる培地としては、液体培地では、代表的には、真菌類の培養に汎用される培地であるツァペックドックス培地であって鉄を含まないものが挙げられる。また、固体培地としては、蒸米等が挙げられる。
（ＩＩ）鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法
本発明の方法は、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法であって、穀類を用いた醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む方法である。
【００５８】
生物は、培地で培養されるものであればよく、微生物、植物の細胞や組織、動物の細胞や組織などが挙げられる。代表的には微生物であり、中でも真菌が好ましく、糸状菌がより好ましく、アスペルギルス属糸状菌がさらにより好ましい。
【００５９】
培地は上記説明したものを用いる。培養方法は、回分、流加、連続などのいずれの方法であってもよい。培養温度は、使用する生物の生育、及び目的物質の生産に適した温度とすればよい。培養時間は、生物及び目的物質の種類に応じて適宜決める事ができる。
【００６０】
例えば、全体重量に対して清酒粕のプロテアーゼ分解物を乾燥重量に換算して０．５ｗ／ｖ％程度含むツァペックドックス培地を用いて、アスペルギルス・オリゼの培養によりデフェリフェリクリシンを生産する場合は、２５〜３５℃程度で３〜７日間程度培養すればよい。また、同様の培地を用いて、アスペルギルス・オリゼの培養によりフコース特異的レクチンを生産する場合は、２５〜３５℃程度で３日間〜７日間程度培養すればよい。
【００６１】
目的生産物は、培地ごと回収することもできるが、さらに公知の手段により精製してもよい。
実施例
以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１（窒素源の種類の検討）
（１―１）供試菌株
麹菌アスペルギルス・オリゼＯ−１０１３株（平成９年１１月２０日にＦＥＲＭ Ｐ−１６５２８として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1-1-1 つくばセンター中央第６）に寄託済み）、及びアスペルギルス・オリゼＯ−１０１８株（平成８年９月４日にＦＥＲＭ Ｐ−１５８３４として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託済み）を用いた。
（１―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
液化粕の凍結乾燥品１０ gに蒸留水５０ｍｌを加え均一にし、市販プロテアーゼであるサモアーゼ（アマノエンザイム社製）を０．２ｇ加え６０℃で３時間攪拌しながら反応させた。１００℃で１０分加熱し酵素を失活させた後、遠心分離により不溶性の残渣を除去し、上清液を凍結乾燥し、液化粕サモアーゼ分解物の乾燥粉末を得た。
(１―３)培地の調製
培地１：基本培地としては、鉄制限ツァペックドックス培地 (０．２ｗ/ｖ％ ＮａＮＯ３, ０．１ｗ/ｖ％Ｋ２ＨＰＯ４, ０．０５ｗ/ｖ％ＫＣｌ, ０．０５ｗ/ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ, ２ｗ/ｖ％ ｇｌｕｃｏｓｅ, ｐＨ ６．０)を用いた。
培地２：鉄含有の対照培地として、上記鉄制限ツァペックドックス培地に最終濃度０．００１ｗ/ｖ％となるようにＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏを添加した培地を調製した。
培地３：上記鉄制限ツァペックドックス培地にカザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地４：上記鉄制限ツァペックドックス培地にイーストエキス（Ｄｉｆｃｏ社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地５：上記鉄制限ツァペックドックス培地にダイゴポリペプトン（日本製薬社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地６：上記鉄制限ツァペックドックス培地に液化粕サモアーゼ分解物を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
培地７：上記鉄制限ツァペックドックス培地にスピルリナ（大日本インキ社製）を最終濃度０．５ｗ/ｖ％となるように添加した。
（１―４）培養
上記２麹菌株を保存スラントからポテトデキストロースアガープレート（ニッスイ社製）に塗布し、胞子を形成させた。各株の胞子を回収し、上記の各培地４０ｍｌに１０６個／ｍｌ胞子を植菌し、３０℃で７日間、振盪培養した。
（１―５）菌体湿重量の測定
培養終了後の菌糸を回収し、乾いた布を用いて水分を搾り取った後の菌体湿重量を測定した。これを培養液の液量で除し、培地あたりの菌体湿重量（ｍｇ／ｍｌ―ｂｒｏｔｈ）を算出した。
（１―６）デフェリフェリクリシン生産量の測定
培養上清１００μｌに１０μｌの０．２Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０μｌの３０００ｐｐｍ ＦｅＣｌ３溶液を添加し、デフェリフェリクリシン（Ｄｆｃｙ）に鉄をキレートさせフェリクリシン（Ｆｃｙ）とした。
【００６２】
これをＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製；Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ）を用い逆相クロマト分析に供し、Ｆｃｙに特異的な吸収波長である波長４３０ｎｍを指標にＦｃｙピークを同定した。そのピーク面積からＦｃｙの定量を行った。定量したＦｃｙ量に、分子量比より０．９３（７４４／８００）を乗じてＤｆｃｙ量を算出した。
（１―７）フコース特異的レクチンの調製および活性測定
アスペルギルス・オリゼのフコース特異的レクチンを、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，１００２−１００８（２００２）に記載の方法に準拠して調製した。即ち、培養物から菌糸を回収し、１．０ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー （ｐＨ７．０）中で海砂を用いて磨り潰し、細胞抽出液を得た。このホモジネートを１０，０００×ｇで１０分間遠心し、上清を分離した。こうして得た細胞抽出液上清を用いフコース特異的レクチンの赤血球凝集活性を測定した。即ち、Ｕ型96穴マイクロプレートのウェル中で、５０μｌの５００―７．８μｇ／ｍｌの２倍希釈系列の細胞抽出液上清に５０μｌのウサギ赤血球２％（ｖ／ｖ）を加え、室温で1時間放置後、赤血球凝集を目視で判定し、最小凝集濃度を算出した。レクチン活性を１Ｕ（１％ウサギ赤血球に対して１ｍｇ/ｍｌが最小凝集濃度である凝集素１μｇの凝集活性）と定義し、各々の最小凝集濃度とたんぱく質量を乗じて得られた総活性を培地量で除することで培地あたり活性（Ｕ／ｄｌ）を各培地でのレクチン生産量として比較した。なお、細胞抽出液、赤血球溶液の希釈には５０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用い、たんぱく質濃度の測定はブラッドフォード法で行い、ＢＳＡ換算量として求めた。
（１―８）結果
培地容量当たりの菌体湿重量、培養上清中のＤｆｃｙ濃度、培養上清中のフコースレクチン活性を、図１に示す。図１横軸の数値１〜７は培地１〜７を示す。アスペルギルス・オリゼＯ―１０１３株、及びＯ―１０１８株の双方において、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地では、その他の窒素源を添加した培地に比べて、Ｄｆｃｙ濃度、及びフコースレクチン濃度のいずれも格段に高かった。特にレクチンは、実質的には、窒素源として液化粕サモアーゼ分解物を使用した場合のみ生産された。特に、鉄含有量が少ないと考えられるカザミノ酸を添加した培地より、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地を使用する方が、Ｄｆｃｙ、及びレクチンの生産量が格段に高くなることは注目すべきことである。
【００６３】
また、スピルリナやイーストエキスを添加した培地では、菌体湿重量が多くても、Ｄｆｃｙ、及びレクチンの生産量は低いが、液化粕サモアーゼ分解物を添加した培地を使用した場合は、菌体質重量が高く、かつＤｆｃｙ生産量、及びレクチン生産量も高かった。
【００６４】
実施例２（分解酵素の種類の検討）
（２―１）供試菌株
実施例１と同様である。
（２―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
プロテアーゼ１：実施例１と同様にして、液化粕サモアーゼ（アマノエンザイム社製）分解物を調製した。
プロテアーゼ２：サモアーゼに代えてプロチンＦＡ（アマノエンザイム社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ３：サモアーゼに代えてＹＰ―ＳＳ（ヤクルト社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ４：サモアーゼに代えてスミチームＬＰ（新日本化学工業社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ５：サモアーゼに代えてプロテアーゼＳアマノ（アマノエンザイム社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
プロテアーゼ６：サモアーゼに代えてトリプシン（和光純薬社製）を用いた他は、実施例１と同様にした。
（２―３)培地組成
実施例１と同様の、鉄制限ツァペックドックス培地 （０．２ｗ/ｖ％ＮａＮＯ３, ０．１ｗ/ｖ％Ｋ２ＨＰＯ４, ０．０５ｗ/ｖ％ＫＣｌ, ０．０５ｗ/ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ, ２ｗ/ｖ％ｇｌｕｃｏｓｅ, ｐＨ６．０)を用いた。これに、液化粕の各種プロテアーゼ分解物を全体に対して０．５ｗ/ｖ％添加した。
（２―４）培養
実施例1と同様にした。
（２―５）菌体湿重量測定・Ｄｆｃｙ濃度測定・フコース特異的レクチンの調製および活性測定
実施例1と同様にした。
（２―６）フコース特異的レクチンの生産量の確認
実施例１と同様にして、培養物から菌糸を回収し、１．０ｍＭ ＰＭＳＦを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）中で海砂を用いて磨り潰し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液上清を各レーン５μｇとなるようにＳＤＳ―ＰＡＧＥに供しフコース特異的レクチンの生産量を確認した。精製フコース特異的レクチンはＳＤＳ―ＰＡＧＥにおいて単一バンドを与えることが上記文献によって示されておりその分子量は３５，０００である。分子量３５，０００の位置に出現するバンドから、各種培養におけるフコース特異的レクチンの生産性を比較した。
（２―７）結果
菌体湿重量、Ｄｆｃｙ濃度、及びレクチン活性の結果を図２に示す。図２横軸の数値１〜６は、プロテアーゼ１〜６を示す。また、細胞抽出液のＳＤＳ―ＰＡＧＥの結果を図３に示す。いずれのプロテアーゼを用いた場合も、高い菌体湿重量、及びＤｆｃｙ濃度が得られた。また、レクチン活性は、プロテアーゼ３（ＹＰ―ＳＳ）及びプロテアーゼ４（スミチームＬＰ）を用いた場合に、他のプロテアーゼを用いる場合より低かったが、ＳＤＳ―ＰＡＧＥにより、プロテアーゼ３、４を用いる場合にもレクチンが十分に生産されていることが分かる。細胞抽出液中に活性測定を阻害する因子が含まれているために測定できなかったと考えられる。
実施例３（粕の種類の検討）
（３―１）供試菌株
アスペルギルス・オリゼＯ−１０１８株を用いた。
（３―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
粕として、清酒粕（普通粕および液化粕）、米焼酎粕、及び味醂粕をそれぞれ用いた。プロテアーゼＳアマノ（アマノエンザイム社製）を用いて、実施例１と同様にして各種粕のプロテアーゼ分解物を得た。
（３―３）培地組成
基本培地としては、実施例1と同様の上記鉄制限ツァペックドックス培地を用いた。これに、各種粕のプロテアーゼ分解物を全体に対して０．５ｗ/ｖ％添加した。また、粕分解物を添加しない培地も対照として用いた。
（３―４）培養
実施例１と同様とした。
（３―５） 菌体湿重量測定・Ｄｆｃｙ濃度測定・フコース特異的レクチンの調製および活性測定
実施例１と同様とした。
（３―６）鉄濃度測定
各種粕プロテアーゼ分解物の０．１ｗ/ｖ％溶液を調製し、原子吸光（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社製、ＡＡｎａｌｙｓｔ８００）にてＦｅ含量を測定した。この結果から、各種粕プロテアーゼ分解物の粉末あたり、又は粕プロテアーゼ分解物を０．５ｗ/ｖ％添加した培地あたりの鉄含量を算出した。
（３―７）結果
菌体湿重量、Ｄｆｃｙ濃度、及びレクチン活性の結果を図４に示す。図４横軸の１は液化粕、２は普通粕、３は焼酎粕、４は味醂粕のプロテアーゼ分解物を全体に対して０．５ｗ/ｖ％添加した培地での各値、５は粕分解物を添加しない培地での各値を示す。また、各種粕のプロテアーゼ分解物の鉄濃度を以下の表１に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
いずれの粕を用いた場合も、菌体湿重量、Ｄｆｃｙ濃度、及びレクチン活性が高かった。表１によれば、焼酎粕には比較的高濃度の鉄が含まれるが、Ｄｆｃｙ及びレクチンの生産量は、その他の粕を用いた場合と余り変わらなかった。このことから、添加するプロテアーゼ分解物由来の鉄量が培地あたりの鉄濃度に換算して１ｐｐｍ程度では、鉄制限がかからず、Ｄｆｃｙ及びレクチンの生産量に影響しないことが分かる。粕やもろみの鉄含量が低いことだけが、これらの物質生産に寄与しているのではなく、粕分解物を添加することにより、ペプチドやアミノ酸を鉄含量が低い状態で添加することができたため、鉄により生産が抑制されたと考えられる。
実施例４（清酒粕のプロテアーゼ分解物添加量の検討）
（４―１）供試菌株
アスペルギルス・オリゼＯ−１０１３株を用いた。
（４―２）清酒粕のプロテアーゼ分解物の調製
実施例１と同様にして、液化粕サモアーゼ（アマノエンザイム社製）分解物の乾燥粉末を調製した。
（４―３)培地組成
実施例１と同様の、鉄制限ツァペックドックス培地 （０．２ｗ/ｖ％ＮａＮＯ３, ０．１ｗ/ｖ％Ｋ２ＨＰＯ４, ０．０５ｗ/ｖ％ＫＣｌ, ０．０５ｗ/ｖ％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ, ２ｗ/ｖ％ｇｌｕｃｏｓｅ, ｐＨ６．０)を用いた。これに、液化粕のサモアーゼ分解物の乾燥粉末を全体に対して０．５〜１．５ｗ/ｖ％添加した。
（４―４）培養
実施例1と同様にした。
（４―５）Ｄｆｃｙ濃度測定
実施例1と同様にした。
（４―６）結果
Ｄｆｃｙ濃度の結果を図５に示す。図５横軸の数値は、清酒粕のプロテアーゼ分解物の添加濃度ｗ/ｖ％を示す。いずれの濃度で清酒粕のプロテアーゼ分解物を添加した場合も、高いＤｆｃｙ濃度が得られた。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】菌体湿重量、デフェリフェリクリシン濃度、及びレクチン活性に対して、培地に添加する窒素源の種類が与える影響を示す図である。
【図２】菌体湿重量、デフェリフェリクリシン濃度、及びレクチン活性に対して、培地に添加する清酒粕分解物を生産する際のプロテアーゼの種類が与える影響を示す図である。
【図３】培地に添加する清酒粕分解物を生産する際のプロテアーゼの種類がレクチンたんぱく質の生産状況に与える影響をＳＤＳ―ＰＡＧＥで示す図である。
【図４】菌体湿重量、デフェリフェリクリシン濃度、及びレクチン活性に与える粕の種類の影響を示す図である。
【図５】デフェリフェリクリシン濃度に与える清酒粕のプロテアーゼ分解物添加量の影響を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法。
【請求項２】
生物が微生物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が糸状菌である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物がアスペルギルス属微生物である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養に使用する培地が、鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
培養に使用する培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
培地が液体培地である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
培地が固体培地である請求項１〜７のいずれかに記載の培地。
【請求項１２】
もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地。
【請求項１６】
鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
鉄濃度が２ｐｐｍ以下である請求項１５又は１６に記載の培地。
【請求項１８】
もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項１９】
培地が液体培地である請求項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【請求項２０】
もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項１９に記載の培地。
【請求項２１】
もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項１９に記載の培地。
【請求項２２】
培地が固体培地である請求項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【請求項２３】
もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項２２に記載の培地。
【請求項２４】
もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項２２に記載の培地。
【請求項２５】
鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである請求項１５〜２４のいずれかに記載の培地。
【請求項２６】
基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地の製造方法。
【請求項２７】
基礎となる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
得られる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下となるように、基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
培地が液体培地である請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
培地が固体培地である請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである請求項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項１】
醸造により得られるもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を含む培地を用いて生物を培養する工程と、培養物から鉄により生産が抑制される生物生産物を回収する工程とを含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造方法。
【請求項２】
生物が微生物である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物が糸状菌である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
微生物がアスペルギルス属微生物である請求項３に記載の方法。
【請求項５】
培養に使用する培地が、鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
培養に使用する培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
培地が液体培地である請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
培地が固体培地である請求項１〜７のいずれかに記載の培地。
【請求項１２】
もろみまたは粕が粕であり、培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
もろみまたは粕がもろみであり、培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を含む、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地。
【請求項１６】
鉄濃度２ｐｐｍ以下の基礎となる培地にもろみまたはその粕のプロテアーゼ分解物を添加したものである請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
鉄濃度が２ｐｐｍ以下である請求項１５又は１６に記載の培地。
【請求項１８】
もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項１９】
培地が液体培地である請求項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【請求項２０】
もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項１９に記載の培地。
【請求項２１】
もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％である請求項１９に記載の培地。
【請求項２２】
培地が固体培地である請求項１５〜１８のいずれかに記載の培地。
【請求項２３】
もろみまたは粕が粕であり、粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項２２に記載の培地。
【請求項２４】
もろみまたは粕がもろみであり、もろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％である請求項２２に記載の培地。
【請求項２５】
鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである請求項１５〜２４のいずれかに記載の培地。
【請求項２６】
基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、鉄により生産が抑制される生物生産物の製造用の培地の製造方法。
【請求項２７】
基礎となる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下である請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
得られる培地の鉄濃度が２ｐｐｍ以下となるように、基礎となる培地に、醸造により得られるもろみ又はその粕のプロテアーゼ分解物を添加する、請求項２６又は２７に記載の方法。
【請求項２９】
もろみまたは粕が、清酒、焼酎、味醂、ビールからなる群より選ばれる少なくとも１種の酒類のもろみまたは粕である請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
培地が液体培地である請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５ｗ／ｖ％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
培地が固体培地である請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
もろみまたは粕が粕であり、得られる培地中の粕のプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地に粕のプロテアーゼ分解物を添加する請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
もろみまたは粕がもろみであり、得られる培地中のもろみのプロテアーゼ分解物の含有量が、乾燥重量に換算して、０．０５〜５重量％となるように基礎となる培地にもろみのプロテアーゼ分解物を添加する請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
鉄により生産が抑制される生物生産物が、シデロフォア、又はレクチンである請求項２６〜３５のいずれかに記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−５４５７９（Ｐ２００８−５４５７９Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３５３０３（Ｐ２００６−２３５３０３）
【出願日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（０００１６５２５１）月桂冠株式会社 (88)
【Ｆターム（参考）】
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