錫ナノ粒子の製造方法
【課題】粒度分布が狭く、平均粒子径が小さい錫ナノ粒子を製造することができる製造方法を提供すること。
【解決手段】アポフェリチンと、錫イオンと、を含み、ｐＨが４以下の原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤（例えばＮａＢＨ4）を添加することで、前記アポフェリチンの内腔部で錫ナノ粒子を形成することを特徴とする錫ナノ粒子の製造方法。
【解決手段】アポフェリチンと、錫イオンと、を含み、ｐＨが４以下の原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤（例えばＮａＢＨ4）を添加することで、前記アポフェリチンの内腔部で錫ナノ粒子を形成することを特徴とする錫ナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、非鉛はんだ等の低温接合材に応用可能な錫ナノ粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属はナノ粒子化することで、その融点が大きく低下することが知られており、この性質を利用して、金属ナノ粒子を応用する技術が開発されている。
例えば、２００〜３００℃で揮発する分散剤とよばれる有機分子で分散させた、金や銀のナノ粒子が開発されている。これらのナノ粒子は、３００℃前後の低温でバルク化する性質を有しており、この性質を利用して、はんだ代替の接合材や、ナノ配線への実用化技術に応用されている。
また最近では、非鉛系はんだの開発が進んでおり、ＳｎやＺｎのナノ粒子からなるナノコンポジット構造の低温溶融はんだ合金なども開発されている（特許文献１参照）。
金属ナノ粒子を製造する方法としては、
(i)ＦｅやＮｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｓｎなどの卑金属ナノ粒子を、水素化硼素ナトリウム等の還元溶液で析出して合成する化学的還元法（非特許文献１参照）
(ii)溶融金属を蒸発させて気相の金属とした後に、冷却凝集により金属ナノ粒子を得るガス蒸発法
(iii) 卑金属酸化物前駆体と、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を含むハロゲン化物とを混合し、還元性雰囲気中で熱処理することで、卑金属ナノ粒子を得る方法（特許文献２参照）
(iv) バルク金属を超音波や機械的な処理で破砕して、ナノ粒子を得る手法（非特許文献２参照）
などが知られている。
【特許文献１】特開２００４−２６８０６５号公報
【特許文献２】特開２００６−１６６５３号公報
【非特許文献１】Chemical Physics Letters 429 (2006) 492-496
【非特許文献２】Materials Science and Engineering A359 (2003) 405-407
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら上記(i)の化学的還元法では、金や銀、白金、パナジウムなどの貴金属類のナノ粒子は合成することができるものの、錫等の卑金属類については、結晶性や粒径の揃いが悪くなり、均一な粒径、形状のナノ粒子を得ることが難しい。錫のナノ粒子については、酢酸スズを原料として水素化硼素ナトリウムで還元する手法が報告されているが、平均粒径は２６ｎｍと大きく、また、標準誤差も１０ｎｍと大きく、粒径の均一性は得られていない。
【０００４】
また、上記(ii)のガス蒸発法では、金属ナノ粒子の凝集による粗大な粒子の生成が起こり、粒度分布の広い金属ナノ粒子しか得られないという問題点がある。そこで、金属ナノ粒子の凝集を防ぐ目的で、原料のガス濃度を極めて希薄にする試みが行われているが、生産性が極めて低く、実用的でない方法となってしまう。
【０００５】
また、上記(iii)の方法では、得られる粒子の粒径が１００ｎｍ前後であり、粒径が数ｎｍの小さなナノ粒子を得ることは難しい。
また、上記(iv)の方法では、得られる錫ナノ粒子の粒径は、３０〜４０ｎｍ前後であり、また、粒径分布も広がる傾向がある。
【０００６】
以上のように、各種手法にて、錫等の卑金属ナノ粒子を合成する手段が検討されているが、粒径が小さく（例えば１０ｎｍ以下）、かつ、その粒径分布の狭い金属ナノ粒子が得られる方法は未だ知られていない。
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、粒度分布が狭く、平均粒子径が小さい錫ナノ粒子を製造することができる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）請求項１の発明は、
アポフェリチンと、錫イオンと、を含み、ｐＨが４以下の原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤を添加し、ｐＨ７以上の条件下、前記アポフェリチンの内腔部で、錫ナノ粒子を形成することを特徴とする錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【０００９】
本発明で用いる原料溶液では、ｐＨ４以下の酸性条件下で、アポフェリチンの内腔部に錫イオンが拡散している。この原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤を添加すると、錫イオンが還元され、アポフェリチンの内腔部で錫ナノ粒子が形成される。アポフェリチンの内腔部の大きさは約７ｎｍで均一であるから、粒径が小さく、しかも粒度分布が狭い錫ナノ粒子を製造することができる。
【００１０】
本発明で製造した錫ナノ粒子のように、その粒径が小さいと、例えば、錫ナノ粒子を非鉛はんだ等の低温接合材に用いた場合に、低温接合材の融点を低下させることができる。また、本発明で製造した錫ナノ粒子のように、その粒度分布が狭いと、例えば、錫ナノ粒子を上記低温接合材に用いた場合に、低温接合材において状態変化（固体から液体への変化、あるいはその逆の変化）が生じる温度範囲を狭くすることができる。すなわち、本発明で製造した錫ナノ粒子を用いれば、融点が低く、しかも、状態変化が生じる温度範囲が狭いため、非常に使いやすい低温接合剤を製造することができる。
【００１１】
錫イオンは、その溶解しているｐＨ環境や塩化物イオンの存在により、その存在形態を大きく変える性質がある。すなわち、アルカリ側（ｐＨ７以上）では、Ｓｎ（ＯＨ）2となり、その安定構造のために白沈してしまう。一方、ｐＨ４以下の酸性条件下では、Ｓｎ2+、Ｓｎ（ＯＨ）+などが主流となり、イオン状態で存在できるため、沈殿し難くなる。本発明では、還元剤を添加する前における原料溶液のｐＨを４以下とすることにより、錫イオンが白沈しにくい。
【００１２】
アポフェリチンの内腔部に取り込まれた錫イオンを還元剤で還元する場合、添加する還元剤がプロトンからの水素生産に消費されるのを防ぐ目的で、原料溶液のｐＨを、速やかにｐＨ７以上のアルカリ側にもっていくことが好ましい。その手段としては、緩衝能力のない原料溶液を用いることが好ましい。例えば、大腸菌等に合成させたアポフェリチンをカラムで精製する場合に、通常トリス（トリスヒドロキシメチルアンモニウム）緩衝液での溶出が試みられる。トリスは、ｐＨ８前後のアルカリ側での緩衝能が強い緩衝液であり、そのままのアポフェリチン溶液に錫イオンを添加して原料溶液とすると、錫の水酸化物が沈殿し易くなる。そこで、アポフェリチン分子の通らない透析膜等を利用して、アポフェリチン溶液中のトリスを、０．２ｍＭ以下に抑えることが好ましい。このことにより、錫の塩化物または硫酸化物等の添加により、容易に、ｐＨが４以下の原料溶液を得ることができ、また、還元剤の添加により、容易に原料溶液のｐＨを７以上のアルカリ条件に移行させることができる。また、原料溶液に、酢酸緩衝液などの、酸性側に緩衝能力のある溶液を用いて、アポフェリチンに錫イオンを吸着させた場合は、還元剤の添加前に、水酸化ナトリウムなどの適当なアルカリで、原料溶液のｐＨを７以上に設定するとよい。このことにより、効率的にＳｎイオンの還元が行われ、アポフェリチンの内腔部に吸着した、実質的に全ての錫イオンから錫ナノ粒子を合成することが可能となる。
【００１３】
本発明における原料溶液には、塩化物イオンが実質的に存在しないことが好ましい。塩化物イオンが存在すると、酸性条件下でも、Ｓｎ（ＯＨ）Ｃｌの形で白沈が生じることがあるからである。
【００１４】
前記アポフェリチンとは、生物界に広く分布する蛋白質であり、分子量１８,５００ＫＤａからなるモノマーサブユニットが２４個集まってできている。アポフェリチンは、内部に空間（内腔部）を有する特徴がある。その働きは、生体内の鉄の量を調整することである。アポフェリチンと鉄、または鉄化合物との複合体はフェリチンと呼ばれる。
【００１５】
前記還元剤としては、錫の酸化還元電位より負側の電位を有するものを広く用いることができるが、例えば、ＮａＢＨ4、次亜リン酸ナトリウム等が挙げられる。
（２）請求項２の発明は、
前記錫イオンの価数が２価であることを特徴とする請求項１記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００１６】
錫イオンは、２価と４価のものが存在するが、４価の錫イオンが原料溶液中に存在すると、錫イオンの大きな陽電荷により、アポフェリチンが凝集し易くなる。その結果、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散が起こり難くなり、アポフェリチンの内腔部を鋳型とした錫ナノ粒子の合成も難しくなる。そこで、本発明では、２価の錫イオンを用いることで、アポフェリチンの凝集を起こさせずに、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を一層促進することができる。
（３）請求項３の発明は、
前記原料溶液には、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、及びＳｎＦ2から成る群から選ばれる一種以上の塩が溶解しており、前記錫イオンは、前記塩が解離して得られるものであることを特徴とする請求項１または２記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００１７】
ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、及びＳｎＦ2は、解離しやすいため、これらの化合物を用いることにより、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を促進することができる。またこれらの化合物は、強酸と錫からなるものであるから、これらの化合物を用いることにより、原料溶液のｐＨを、酸の添加をせずとも（あるいは酸の添加量が少なくとも）、４以下に設定することができる。
（４）請求項４の発明は、
前記原料溶液は、前記アポフェリチンを含む溶液と、前記錫イオンを含む溶液とを混合して得られるものであり、
前記錫イオンを含む溶液における錫イオン濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００１８】
錫イオンを含む溶液のうち、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、ＳｎＦ2などの強酸と錫からなる化合物を含む溶液は、それらが水に溶解することで酸性となり、Ｓｎ（ＯＨ）2の白沈が生じ易くなる。そして、錫イオンの濃度が高い場合は、Ｓｎ2+が水の加水分解を促進する結果、Ｓｎ（ＯＨ）2の白沈が時間の経過とともに増加してしまう。
【００１９】
そこで、本発明は、錫イオン濃度を１０ｍＭ以下とすることにより、そのような沈殿を抑制して、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を促し、結果として、効率的にアポフェリチンの内腔部にて錫ナノ粒子を合成することができる。
【００２０】
前記錫イオンを含む溶液における錫イオンの濃度は、５ｍＭ以上であることが好ましい。
（５）請求項５の発明は、
前記原料溶液において、前記錫イオンの個数は、前記アポフェリチンの個数の５００倍以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００２１】
アポフェリチンの内腔部で錫イオンの吸着するサイトは３００前後であり、それを大きく超える量の錫イオンを原料溶液中に含んでしまうと、余剰錫イオン由来の錫ナノ粒子がアポフェリチンの外部で形成されてしまい、結果として、アポフェリチンの凝集を発生させる結果、濁りが生じる。また、アポフェリチンの外部で形成される錫ナノ粒子は、その粒径が揃わないため、錫ナノ粒子の粒径における均一性も失われてしまう。そこで、本発明では、アポフェリチンの個数に対して、添加する錫イオンの個数を５００倍以下、好ましくは、３００倍以下とすることで、アポフェリチン同士の凝集、アポフェリチンの外での錫ナノ粒子の形成を抑制することができる。なお、錫イオンの配合量をアポフェリチンに対して３００〜５００倍の間にする場合、透析膜等により、余分な錫イオンをフェイリン溶液外に排除することが好ましい。
【００２２】
前記原料溶液において、前記錫イオンの個数は、前記アポフェリチンの個数の２００倍以上（より好ましくは３００倍以上）であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
【００２４】
（１）錫ナノ粒子の製造
（ａ）５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液を含む、アポフェリチン溶液の作成
ウマ由来の市販フェリチン（９３ｍｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍＬに対し、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５．５ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた。それを、１６０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に入れ、窒素パージしながら透析処理を１５ｍｉｎ行った。そして、０．４ｍＬのチオグルコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下、２ｈ透析処理を実施した。更に、０．２ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に加え、窒素パージ下１ｈ透析処理を実施した。
【００２５】
引き続き、予め窒素パージしておいた、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１６０ｍＬ中に、フェリチンを収容した透析膜チューブを移し、０．４ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下で１ｈ、透析処理を実施した。透析チューブ内のフェリチンの色が消えたことを確認した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む、４００ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液中に透析チューブを移し、１ｈ透析処理を実施した。
【００２６】
引き続き、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む、５００ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液中に透析チューブを移し、４℃下で一晩、透析処理を実施した。透析チューブ内の溶液を回収し、１０,０００Ｇで８ｍｉｎ、遠心処理を実施し、変性したフェリチンを沈殿として取り除いた。なお、この時点で、フェリチンの総量は２０ｍｇとなっており、フェリチン内部に存在していたフェロハイドライドが完全に取り除かれた、アポフェリチンを調製できた。
（ｂ）アポフェリチン溶液からのＮａＣｌの除去、及び緩衝能の除去
引き続き、上記（ａ）により得られた、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液を含む、３．６ｍｇ／ｍＬのアポフェリチン溶液３８０μＬに滅菌水２．６２ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた。それを、１００ｍＬの蒸留水中に入れ、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。引き続き、１００ｍＬの新しい蒸留水に透析チューブを移し、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。
なお、アポフェリチンの溶解した水溶液中に塩化物イオンが存在する場合、Ｓｎ（ＯＨ）Ｃｌの沈殿が生じやすくなるが、上記のようにしてＮａＣｌを除去することで、Ｓｎ（ＯＨ）Ｃｌの沈殿発生を防止できる。
また、水溶液中で錫イオンを吸着させるには、ｐＨ４以下にする必要があるが、ＮａＢＨ4による還元の最適なｐＨは７以上であり、錫イオンの吸着とＮａＢＨ4還元の最適なｐＨ環境は異なる。これらの工程の最適なｐＨ環境を両立させるためには、上記のようにして、アポフェリチン溶液の緩衝能を下げることが有効である。
（ｃ）アポフェリチン溶液へのＳｎＣｌ2の添加（原料溶液の調製）
次に、透析チューブ内のアポフェリチン溶液を別の容器に移し、４ｍＭのＳｎＣｌ2を３７５μＬ添加し、３０ｍｉｎ攪拌した。この時点で、アポフェリチン溶液が白濁する現象は見られなかった。
（ｄ）還元剤（ＮａＢＨ4）による錫イオンの還元
その後、７．５μｍｏｌのＮａＢＨ4を溶解した２０μＬの水溶液を、ゆっくり滴下した。ＮａＢＨ4を添加してから３０ｍｉｎ攪拌し、アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１４,０００）中に入れた後、１００ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中でアポフェリチン溶液の透析を３０ｍｉｎ実施した。
（２）ｐＨ変化のモニタリング
ＮａＢＨ4による錫イオンの還元工程（前記（１）（ｄ））におけるアポフェリチン溶液のｐＨ変化をモニタリングした。アポフェリチン溶液のｐＨ変化を図１に示す。Ｓｎ2+吸着時（還元剤の添加前）のｐＨは３．３であったが、ＮａＢＨ4添加によりｐＨは上昇し、９近くまで上がることを確認できた。
（３）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
還元後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した。なお、２．０％の金チオグルコース液による負染色も実施し、アポフェリチンを見えるように工夫した。ＮａＢＨ4還元後のアポフェリチンのＴＥＭ観察結果を図２に示す。８割以上のアポフェリチン内部において、Ｓｎ2+還元により生じた錫ナノ粒子を観察することができた。錫ナノ粒子の粒径は３〜４ｎｍであり、粒径分布は非常に狭かった。
（比較例１）
基本的には前記実施例１の「（１）錫ナノ粒子の製造」と同様であるが、ＳｎＣｌ2を添加するときにおけるアポフェリチン溶液を、５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）として実験を行った。
【００２７】
その際の、ＮａＢＨ4滴下によるアポフェリチン溶液のｐＨ変化を図３に示す。ＮａＢＨ4を滴下しても、アポフェリチン溶液のｐＨはアルカリ側にならないことを確認した。
また、還元後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した結果を図４に示す。この場合、アポフェリチンの内腔部に錫ナノ粒子は形成されなかった。これは、滴下したＮａＢＨ4の殆どが、プロトンの還元に消費された結果、Ｓｎ2+の還元が殆ど起こらなかったことによると考えられる。
【００２８】
以上より、アポフェリチン溶液の緩衝能およびＮａＣｌを除くことが、Ｓｎ2+のアポフェリチンの内腔部への吸着と還元を促進させるために好ましいことが分かった。
【実施例２】
【００２９】
（１）錫ナノ粒子の製造
（ａ）アポフェリチン溶液の作成
ウマ由来の市販フェリチン（９３ｍｇ／ｍＬ，ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍＬに対し、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５．５ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた。それを、１６０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に入れ、窒素パージしながら透析処理を１５ｍｉｎ行った。そして、０．４ｍＬのチオグルコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下、２ｈ透析処理を実施した。更に、０．２ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に加え、窒素パージ下、１ｈ透析処理を実施した。
引き続き、予め窒素パージしておいた、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１６０ｍＬ中に、フェリチンを収容した透析膜チューブを移し、０．４ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下で１ｈ、透析処理を実施した。透析チューブ内のフェリチンの色が消えたことを確認した後、４００ｍＬの０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液中に、透析チューブを移し、１ｈ透析処理を実施した。
引き続き、５００ｍＬの０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液中に透析チューブを移し、４℃下で一晩、透析処理を実施した。透析チューブ内の溶液を回収し、１０,０００Ｇで８ｍｉｎ、遠心処理を実施し、変性したフェリチンを沈殿として取り除いた。なお、この時点で、フェリチンの総量は２０ｍｇとなっており、フェリチン内部に存在していたフェロハイドライドが完全に取り除かれた、アポフェリチンを調製できた。
（ｂ）アポフェリチン溶液へのＳｎＣｌ2の添加（原料溶液の調製）
以下の工程は、Ｓｎナノ粒子の酸化を抑える目的で、全て窒素パージ下で実施した。アポフェリチン濃度を０．５μＭに調整した０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液（アポフェリチンと塩化ナトリウムとを含む水溶液）３ｍＬを作り、２０ｍＭのＳｎＣｌ2水溶液を３０μＬ加えて３０ｍｉｎ攪拌した。この時点におけるアポフェリチン溶液のｐＨは３．８であったが、ＳｎＣｌ2添加により、アポフェリチン溶液が少し白濁した。
（ｃ）還元剤（ＮａＢＨ4）による錫イオンの還元
その後、４．５μｍｏｌのＮａＢＨ4を溶解した２０μＬの水溶液をゆっくり滴下した。その過程で、アポフェリチン溶液の白濁は消失した。ＮａＢＨ4を添加してから３０ｍｉｎ攪拌し、アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１４,０００）中に入れた後、１００ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中でアポフェリチン溶液の透析を３０ｍｉｎ実施した。
以上の、ＳｎＣｌ2添加からＮａＢＨ4還元、透析までの工程を３回繰り返した。
（２）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
前記（１）の工程を行った後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した。なお、２．０％の金チオグルコース液による負染色も実施し、アポフェリチンを見えるように工夫した。その結果について図５に示す。図５の（ａ）は、負染色をしていないサンプル、図５の（ｂ）は、負染色を実施したサンプルである。（ｂ）において、着色していない部分がアポフェリチンであり、その内部に錫ナノ粒子が存在していることを確認できた。なお、本法によると、アポフェリチン内部で錫ナノ粒子を合成できたが、錫ナノ粒子の入ってないアポフェリチンも一部存在していた。
【実施例３】
【００３０】
（１）予備実験
アポフェリチン溶液に加える錫イオンの量について検討した。
ｐＨ４以下の酸性条件のアポフェリチン溶液に所定量の錫イオンを添加した後、アポフェリチン溶液のｐＨをアルカリ側としたとき、錫イオン量が少なく、その大部分がアポフェリチンの内腔部に取り込まれている場合は、ｐＨがアルカリ側となることでＳｎ（ＯＨ）2の沈澱が生じても、アポフェリチン溶液は、外見上白濁することはない。一方、錫イオン量が多く、アポフェリチンの外側にも錫イオンが存在する場合は、ｐＨがアルカリ側となることでＳｎ（ＯＨ）2の沈澱が生じると、アポフェリチン溶液が白濁する。よって、ｐＨがアルカリ側となったときの白濁の有無により、アポフェリチンの内腔部に取り込まれる錫イオンの大まかな量を予測することができる。
【００３１】
アポフェリチンの個数に対し、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍の個数のＳｎＣｌ2をそれぞれ添加し、３０ｍｉｎ攪拌した後に、各アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れ、それを１００ｍＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に入れて攪拌することで、透析膜チューブ内で白濁が発生するかを確認した。その結果、アポフェリチンの個数に対して、３００倍の個数の錫イオンを添加した場合までは白濁が発生しなかったが、４００倍以上の個数の錫イオンを添加した場合に白濁が発生した。よって、アポフェリチンの内腔部に入る錫イオンの量（個数）は、アポフェリチンの３００倍程度と考えられる。
（２）錫ナノ粒子の製造
基本的には前記実施例２と同様の方法であるが、添加するＳｎＣｌ2の量を変化させて、錫ナノ粒子を製造した。具体的には、添加するＳｎＣｌ2の個数が、アポフェリチンの個数の、それぞれ、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍となるようにした。なお、ＳｎＣｌ2添加から還元に至る工程は、窒素パージ下で３回繰り返し実施し、粒径３〜４ｎｍの錫ナノ粒子をアポフェリチンの内腔部にて合成した。
（３）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
前記実施例１の（３）と同様に、前記（２）で製造した錫ナノ粒子をＴＥＭ観察したところ、錫ナノ粒子の添加量（個数）がいずれの場合であっても、粒径が３〜４ｎｍである錫ナノ粒子が合成された。
【００３２】
ＳｎＣｌ2添加量がアポフェリチン個数の６００倍、７００倍である場合は、還元後の溶液に、目視にて白濁が観察された。この白濁は、アポフェリチン外で合成された錫ナノ粒子がアポフェリチンを凝集させる結果、発生するものであり、錫ナノ粒子の回収率を低下させる原因となる。実際に、ＳｎＣｌ2添加量をアポフェリチンの５００倍にした場合は、アポフェリチンの凝集により回収できなかった錫ナノ粒子が、全体の７％程度であったが、ＳｎＣｌ2添加量をアポフェリチンの６００倍にした場合は、アポフェリチンの凝集により回収できなかった錫ナノ粒子が、全体の３０％程度になった。そこで、錫ナノ粒子の回収率を低下させないために、添加する錫イオンの量を、アポフェリチンの個数に対して、５００倍以下、より好ましくは３００倍以下にすることが好ましい。
【実施例４】
【００３３】
（１）錫ナノ粒子の製造
（ａ）ｐＨ３のアポフェリチン溶液の作成（その１）
前記実施例２の（１）（ａ）で得られたアポフェリチン溶液を、アポフェリチン濃度が０．４７ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水で希釈した。その希釈溶液を、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた後、１００ｍＬのｐＨ３の１０ｍＭクエン酸緩衝液中に入れ、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。引き続き、１００ｍＬの新しい緩衝液（同じもの）中に透析チューブを移し、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。
（ｂ）ｐＨ４のアポフェリチン溶液の作成（その２）
前記実施例２の（１）（ａ）で得られたアポフェリチン溶液を、アポフェリチン濃度が０．４７ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水で希釈した。その希釈溶液を、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた後、１００ｍＬのｐＨ４の１０ｍＭクエン酸緩衝液中に入れ、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。引き続き、１００ｍＬの新しい緩衝液（同じもの）中に透析チューブを移し、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。
（ｃ）アポフェリチン溶液へのＳｎＣｌ２の添加
前記（ａ）、（ｂ）で調製したアポフェリチン溶液のぞれぞれについて、透析チューブ内のアポフェリチン溶液を別の容器に移し、それぞれのサンプルに対して、４ｍＭのＳｎＣｌ2を３７５μＬ添加し、３０ｍｉｎ攪拌した。攪拌後、それぞれの溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブに入れ、１００ｍＬの蒸留水中で３０ｍｉｎ攪拌しながら透析をおこなった。
（ｄ）還元剤（ＮａＢＨ4）による錫イオンの還元
その後、透析チューブ内の溶液を別の容器に移し、７．５μｍｏｌのＮａＢＨ4を溶解した２０μＬの水溶液をゆっくり滴下した。ＮａＢＨ4を添加してから３０ｍｉｎ攪拌し、アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１４,０００）中に入れた後、１００ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中でアポフェリチン溶液の透析を３０ｍｉｎ実施した。なお、ＮａＢＨ4の添加により、アポフェリチン溶液のｐＨがアルカリ側（ｐＨ７以上）に移行することを確認した。
（２）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
還元後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した。なお、２．０％の金チオグルコース液による負染色も実施し、アポフェリチンが見えるように工夫した。その結果、前記（ａ）で調製した、ｐＨ３のアポフェリチン溶液を用いた場合および前記（ｂ）で調製した、ｐＨ４のアポフェリチン溶液を用いた場合のいずれにおいても、アポフェリチンの内腔部での錫ナノ粒子の合成を確認することが出来た。錫ナノ粒子の粒径は３〜４ｎｍであり、その粒径分布は非常に狭かった。
（比較例２）
基本的には前記実施例４の「（１）錫ナノ粒子の製造」と同様であるが、アポフェリチン溶液の作成において用いる１０ｍＭクエン酸緩衝液のｐＨを５として、錫ナノ粒子を製造しようとした（すなわち、ＮａＢＨ4を添加する前におけるアポフェリチン溶液のｐＨを５として、錫ナノ粒子を製造しようとした）。
【００３４】
この場合、ＴＥＭ観察の結果、錫ナノ粒子の合成を確認することができなかった。なお、ｐＨ５のアポフェリチン溶液にＳｎＣｌ2を加えた際に、アポフェリチン溶液の白濁が少し観察された。これは、ｐＨ５においては、錫の水酸化物の生成が激しくなったことを示している。錫の水酸化物の生成が激しくなったことにより、アポフェリチンの内腔部に拡散する錫イオンの量が極端に少なくなり、結果として、錫ナノ粒子が形成されなかったと考えられる。
（実験例１）
基本的には前記実施例１の「（１）錫ナノ粒子の製造」と同様であるが、塩化錫（II）の代わりに、塩化錫（IV）、酢酸錫（II）、酢酸錫（IV）を用いて、錫ナノ粒子を製造した。
【００３５】
それぞれの場合について、還元剤を添加したときにおける溶液の白濁、及びＴＥＭ観察で錫ナノ粒子が観察できたか否かを判定した。その結果を表１に示す。また、表１には、実施例１の場合（塩化錫(II)を用いた場合）も併せて示す。
【００３６】
【表１】
表１に示すように、塩化錫（IV）を用いた場合は、還元剤の添加時に溶液の白濁が生じ、錫ナノ粒子の形成が認められなかった。これは、解離度が大きい塩化錫（IV）を用いたため、アポフェリチンの凝集による白濁、沈澱が生じてしまい、アポフェリチンの内腔部での錫ナノ粒子の形成が起こらなかったためであると考えられる。
【００３７】
また、酢酸錫（II）、酢酸錫（IV）を用いた場合は、いずれも、溶液の白濁は生じなかったが、錫ナノ粒子の形成が認められなかった。これは、解離し難い塩を用いたため、錫イオンがアポフェリチンの内腔部に拡散できなかったことが原因と考えられる。
【００３８】
以上の結果より、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの取り込みを実現するためには、錫イオンの価数が２価で、解離度の高い化合物（例えば、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、ＳｎＦ2等）を用いることが好ましいことが分かった。
（実験例２）アポフェリチン溶液に添加する錫イオン溶液における錫イオン濃度について
アポフェリチン溶液に添加する錫イオン溶液における錫イオン濃度が高くなり過ぎると、水酸化錫などの白沈が生じてしまい、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を促し難くなる。そこで、白沈の生じない錫イオン濃度について調査した。
ＳｎＣｌ2を５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭになるように、蒸留水で溶解させた。そのまま、１０ｍｉｎ放置した後、ＳｎＣｌ2の終濃度が５ｍＭになるように、それぞれのサンプルを蒸留水で希釈して、Ｏ.Ｄ.６００ｎｍを測定した。
その結果を図６に示す。ＳｎＣｌ2濃度が１０ｍＭ以下であれば、沈澱は殆ど生じなかったが、１０ｍＭを超えると白沈が多くなり、２０ｍＭ以上では激しく白沈した。なお、ＳｎＣｌ2が１０ｍＭ以下の溶液については、数日間放置しても白沈は生じなかった。白濁した溶液の主成分は水酸化錫であり、アポフェリチン溶液に添加しても溶解するものではないため、錫イオン溶液における錫イオン濃度は１０ｍＭ以下であることが好ましいことが分かった。
【００３９】
尚、本発明は前記実施例になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
例えば、還元剤は、ＮａＢＨ4の代わりに、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する他の還元剤を用いることができる。
【００４０】
また、ＳｎＣｌ2の代わりに、あるいはＳｎＣｌ2とともに、ＳｎＳＯ4、及び／又はＳｎＦ2を用いても略同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】還元剤を添加する工程における溶液のｐＨ変化を表すグラフである。
【図２】アポフェリチンをＴＥＭ観察した結果を表す写真である。
【図３】還元剤を添加する工程における溶液のｐＨ変化を表すグラフである。
【図４】アポフェリチンをＴＥＭ観察した結果を表す写真である。
【図５】アポフェリチンをＴＥＭ観察した結果を表す写真であって、（ａ）は負染色をしていないサンプルの写真であり、 (b)は、負染色を実施したサンプルの写真である。
【図６】錫イオン溶液における錫イオン濃度と、白沈の程度との関係を表すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば、非鉛はんだ等の低温接合材に応用可能な錫ナノ粒子の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
金属はナノ粒子化することで、その融点が大きく低下することが知られており、この性質を利用して、金属ナノ粒子を応用する技術が開発されている。
例えば、２００〜３００℃で揮発する分散剤とよばれる有機分子で分散させた、金や銀のナノ粒子が開発されている。これらのナノ粒子は、３００℃前後の低温でバルク化する性質を有しており、この性質を利用して、はんだ代替の接合材や、ナノ配線への実用化技術に応用されている。
また最近では、非鉛系はんだの開発が進んでおり、ＳｎやＺｎのナノ粒子からなるナノコンポジット構造の低温溶融はんだ合金なども開発されている（特許文献１参照）。
金属ナノ粒子を製造する方法としては、
(i)ＦｅやＮｉ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｚｎ、Ｓｎなどの卑金属ナノ粒子を、水素化硼素ナトリウム等の還元溶液で析出して合成する化学的還元法（非特許文献１参照）
(ii)溶融金属を蒸発させて気相の金属とした後に、冷却凝集により金属ナノ粒子を得るガス蒸発法
(iii) 卑金属酸化物前駆体と、アルカリ金属またはアルカリ土類金属を含むハロゲン化物とを混合し、還元性雰囲気中で熱処理することで、卑金属ナノ粒子を得る方法（特許文献２参照）
(iv) バルク金属を超音波や機械的な処理で破砕して、ナノ粒子を得る手法（非特許文献２参照）
などが知られている。
【特許文献１】特開２００４−２６８０６５号公報
【特許文献２】特開２００６−１６６５３号公報
【非特許文献１】Chemical Physics Letters 429 (2006) 492-496
【非特許文献２】Materials Science and Engineering A359 (2003) 405-407
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら上記(i)の化学的還元法では、金や銀、白金、パナジウムなどの貴金属類のナノ粒子は合成することができるものの、錫等の卑金属類については、結晶性や粒径の揃いが悪くなり、均一な粒径、形状のナノ粒子を得ることが難しい。錫のナノ粒子については、酢酸スズを原料として水素化硼素ナトリウムで還元する手法が報告されているが、平均粒径は２６ｎｍと大きく、また、標準誤差も１０ｎｍと大きく、粒径の均一性は得られていない。
【０００４】
また、上記(ii)のガス蒸発法では、金属ナノ粒子の凝集による粗大な粒子の生成が起こり、粒度分布の広い金属ナノ粒子しか得られないという問題点がある。そこで、金属ナノ粒子の凝集を防ぐ目的で、原料のガス濃度を極めて希薄にする試みが行われているが、生産性が極めて低く、実用的でない方法となってしまう。
【０００５】
また、上記(iii)の方法では、得られる粒子の粒径が１００ｎｍ前後であり、粒径が数ｎｍの小さなナノ粒子を得ることは難しい。
また、上記(iv)の方法では、得られる錫ナノ粒子の粒径は、３０〜４０ｎｍ前後であり、また、粒径分布も広がる傾向がある。
【０００６】
以上のように、各種手法にて、錫等の卑金属ナノ粒子を合成する手段が検討されているが、粒径が小さく（例えば１０ｎｍ以下）、かつ、その粒径分布の狭い金属ナノ粒子が得られる方法は未だ知られていない。
【０００７】
本発明は、上記の課題を解決するためになされたものであって、粒度分布が狭く、平均粒子径が小さい錫ナノ粒子を製造することができる製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（１）請求項１の発明は、
アポフェリチンと、錫イオンと、を含み、ｐＨが４以下の原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤を添加し、ｐＨ７以上の条件下、前記アポフェリチンの内腔部で、錫ナノ粒子を形成することを特徴とする錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【０００９】
本発明で用いる原料溶液では、ｐＨ４以下の酸性条件下で、アポフェリチンの内腔部に錫イオンが拡散している。この原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤を添加すると、錫イオンが還元され、アポフェリチンの内腔部で錫ナノ粒子が形成される。アポフェリチンの内腔部の大きさは約７ｎｍで均一であるから、粒径が小さく、しかも粒度分布が狭い錫ナノ粒子を製造することができる。
【００１０】
本発明で製造した錫ナノ粒子のように、その粒径が小さいと、例えば、錫ナノ粒子を非鉛はんだ等の低温接合材に用いた場合に、低温接合材の融点を低下させることができる。また、本発明で製造した錫ナノ粒子のように、その粒度分布が狭いと、例えば、錫ナノ粒子を上記低温接合材に用いた場合に、低温接合材において状態変化（固体から液体への変化、あるいはその逆の変化）が生じる温度範囲を狭くすることができる。すなわち、本発明で製造した錫ナノ粒子を用いれば、融点が低く、しかも、状態変化が生じる温度範囲が狭いため、非常に使いやすい低温接合剤を製造することができる。
【００１１】
錫イオンは、その溶解しているｐＨ環境や塩化物イオンの存在により、その存在形態を大きく変える性質がある。すなわち、アルカリ側（ｐＨ７以上）では、Ｓｎ（ＯＨ）2となり、その安定構造のために白沈してしまう。一方、ｐＨ４以下の酸性条件下では、Ｓｎ2+、Ｓｎ（ＯＨ）+などが主流となり、イオン状態で存在できるため、沈殿し難くなる。本発明では、還元剤を添加する前における原料溶液のｐＨを４以下とすることにより、錫イオンが白沈しにくい。
【００１２】
アポフェリチンの内腔部に取り込まれた錫イオンを還元剤で還元する場合、添加する還元剤がプロトンからの水素生産に消費されるのを防ぐ目的で、原料溶液のｐＨを、速やかにｐＨ７以上のアルカリ側にもっていくことが好ましい。その手段としては、緩衝能力のない原料溶液を用いることが好ましい。例えば、大腸菌等に合成させたアポフェリチンをカラムで精製する場合に、通常トリス（トリスヒドロキシメチルアンモニウム）緩衝液での溶出が試みられる。トリスは、ｐＨ８前後のアルカリ側での緩衝能が強い緩衝液であり、そのままのアポフェリチン溶液に錫イオンを添加して原料溶液とすると、錫の水酸化物が沈殿し易くなる。そこで、アポフェリチン分子の通らない透析膜等を利用して、アポフェリチン溶液中のトリスを、０．２ｍＭ以下に抑えることが好ましい。このことにより、錫の塩化物または硫酸化物等の添加により、容易に、ｐＨが４以下の原料溶液を得ることができ、また、還元剤の添加により、容易に原料溶液のｐＨを７以上のアルカリ条件に移行させることができる。また、原料溶液に、酢酸緩衝液などの、酸性側に緩衝能力のある溶液を用いて、アポフェリチンに錫イオンを吸着させた場合は、還元剤の添加前に、水酸化ナトリウムなどの適当なアルカリで、原料溶液のｐＨを７以上に設定するとよい。このことにより、効率的にＳｎイオンの還元が行われ、アポフェリチンの内腔部に吸着した、実質的に全ての錫イオンから錫ナノ粒子を合成することが可能となる。
【００１３】
本発明における原料溶液には、塩化物イオンが実質的に存在しないことが好ましい。塩化物イオンが存在すると、酸性条件下でも、Ｓｎ（ＯＨ）Ｃｌの形で白沈が生じることがあるからである。
【００１４】
前記アポフェリチンとは、生物界に広く分布する蛋白質であり、分子量１８,５００ＫＤａからなるモノマーサブユニットが２４個集まってできている。アポフェリチンは、内部に空間（内腔部）を有する特徴がある。その働きは、生体内の鉄の量を調整することである。アポフェリチンと鉄、または鉄化合物との複合体はフェリチンと呼ばれる。
【００１５】
前記還元剤としては、錫の酸化還元電位より負側の電位を有するものを広く用いることができるが、例えば、ＮａＢＨ4、次亜リン酸ナトリウム等が挙げられる。
（２）請求項２の発明は、
前記錫イオンの価数が２価であることを特徴とする請求項１記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００１６】
錫イオンは、２価と４価のものが存在するが、４価の錫イオンが原料溶液中に存在すると、錫イオンの大きな陽電荷により、アポフェリチンが凝集し易くなる。その結果、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散が起こり難くなり、アポフェリチンの内腔部を鋳型とした錫ナノ粒子の合成も難しくなる。そこで、本発明では、２価の錫イオンを用いることで、アポフェリチンの凝集を起こさせずに、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を一層促進することができる。
（３）請求項３の発明は、
前記原料溶液には、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、及びＳｎＦ2から成る群から選ばれる一種以上の塩が溶解しており、前記錫イオンは、前記塩が解離して得られるものであることを特徴とする請求項１または２記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００１７】
ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、及びＳｎＦ2は、解離しやすいため、これらの化合物を用いることにより、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を促進することができる。またこれらの化合物は、強酸と錫からなるものであるから、これらの化合物を用いることにより、原料溶液のｐＨを、酸の添加をせずとも（あるいは酸の添加量が少なくとも）、４以下に設定することができる。
（４）請求項４の発明は、
前記原料溶液は、前記アポフェリチンを含む溶液と、前記錫イオンを含む溶液とを混合して得られるものであり、
前記錫イオンを含む溶液における錫イオン濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００１８】
錫イオンを含む溶液のうち、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、ＳｎＦ2などの強酸と錫からなる化合物を含む溶液は、それらが水に溶解することで酸性となり、Ｓｎ（ＯＨ）2の白沈が生じ易くなる。そして、錫イオンの濃度が高い場合は、Ｓｎ2+が水の加水分解を促進する結果、Ｓｎ（ＯＨ）2の白沈が時間の経過とともに増加してしまう。
【００１９】
そこで、本発明は、錫イオン濃度を１０ｍＭ以下とすることにより、そのような沈殿を抑制して、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を促し、結果として、効率的にアポフェリチンの内腔部にて錫ナノ粒子を合成することができる。
【００２０】
前記錫イオンを含む溶液における錫イオンの濃度は、５ｍＭ以上であることが好ましい。
（５）請求項５の発明は、
前記原料溶液において、前記錫イオンの個数は、前記アポフェリチンの個数の５００倍以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法を要旨とする。
【００２１】
アポフェリチンの内腔部で錫イオンの吸着するサイトは３００前後であり、それを大きく超える量の錫イオンを原料溶液中に含んでしまうと、余剰錫イオン由来の錫ナノ粒子がアポフェリチンの外部で形成されてしまい、結果として、アポフェリチンの凝集を発生させる結果、濁りが生じる。また、アポフェリチンの外部で形成される錫ナノ粒子は、その粒径が揃わないため、錫ナノ粒子の粒径における均一性も失われてしまう。そこで、本発明では、アポフェリチンの個数に対して、添加する錫イオンの個数を５００倍以下、好ましくは、３００倍以下とすることで、アポフェリチン同士の凝集、アポフェリチンの外での錫ナノ粒子の形成を抑制することができる。なお、錫イオンの配合量をアポフェリチンに対して３００〜５００倍の間にする場合、透析膜等により、余分な錫イオンをフェイリン溶液外に排除することが好ましい。
【００２２】
前記原料溶液において、前記錫イオンの個数は、前記アポフェリチンの個数の２００倍以上（より好ましくは３００倍以上）であることが好ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明を実施例に基づいて説明する。
【実施例１】
【００２４】
（１）錫ナノ粒子の製造
（ａ）５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液を含む、アポフェリチン溶液の作成
ウマ由来の市販フェリチン（９３ｍｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍＬに対し、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５．５ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた。それを、１６０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に入れ、窒素パージしながら透析処理を１５ｍｉｎ行った。そして、０．４ｍＬのチオグルコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下、２ｈ透析処理を実施した。更に、０．２ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に加え、窒素パージ下１ｈ透析処理を実施した。
【００２５】
引き続き、予め窒素パージしておいた、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１６０ｍＬ中に、フェリチンを収容した透析膜チューブを移し、０．４ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下で１ｈ、透析処理を実施した。透析チューブ内のフェリチンの色が消えたことを確認した後、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む、４００ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液中に透析チューブを移し、１ｈ透析処理を実施した。
【００２６】
引き続き、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む、５００ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液中に透析チューブを移し、４℃下で一晩、透析処理を実施した。透析チューブ内の溶液を回収し、１０,０００Ｇで８ｍｉｎ、遠心処理を実施し、変性したフェリチンを沈殿として取り除いた。なお、この時点で、フェリチンの総量は２０ｍｇとなっており、フェリチン内部に存在していたフェロハイドライドが完全に取り除かれた、アポフェリチンを調製できた。
（ｂ）アポフェリチン溶液からのＮａＣｌの除去、及び緩衝能の除去
引き続き、上記（ａ）により得られた、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）緩衝液を含む、３．６ｍｇ／ｍＬのアポフェリチン溶液３８０μＬに滅菌水２．６２ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた。それを、１００ｍＬの蒸留水中に入れ、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。引き続き、１００ｍＬの新しい蒸留水に透析チューブを移し、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。
なお、アポフェリチンの溶解した水溶液中に塩化物イオンが存在する場合、Ｓｎ（ＯＨ）Ｃｌの沈殿が生じやすくなるが、上記のようにしてＮａＣｌを除去することで、Ｓｎ（ＯＨ）Ｃｌの沈殿発生を防止できる。
また、水溶液中で錫イオンを吸着させるには、ｐＨ４以下にする必要があるが、ＮａＢＨ4による還元の最適なｐＨは７以上であり、錫イオンの吸着とＮａＢＨ4還元の最適なｐＨ環境は異なる。これらの工程の最適なｐＨ環境を両立させるためには、上記のようにして、アポフェリチン溶液の緩衝能を下げることが有効である。
（ｃ）アポフェリチン溶液へのＳｎＣｌ2の添加（原料溶液の調製）
次に、透析チューブ内のアポフェリチン溶液を別の容器に移し、４ｍＭのＳｎＣｌ2を３７５μＬ添加し、３０ｍｉｎ攪拌した。この時点で、アポフェリチン溶液が白濁する現象は見られなかった。
（ｄ）還元剤（ＮａＢＨ4）による錫イオンの還元
その後、７．５μｍｏｌのＮａＢＨ4を溶解した２０μＬの水溶液を、ゆっくり滴下した。ＮａＢＨ4を添加してから３０ｍｉｎ攪拌し、アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１４,０００）中に入れた後、１００ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中でアポフェリチン溶液の透析を３０ｍｉｎ実施した。
（２）ｐＨ変化のモニタリング
ＮａＢＨ4による錫イオンの還元工程（前記（１）（ｄ））におけるアポフェリチン溶液のｐＨ変化をモニタリングした。アポフェリチン溶液のｐＨ変化を図１に示す。Ｓｎ2+吸着時（還元剤の添加前）のｐＨは３．３であったが、ＮａＢＨ4添加によりｐＨは上昇し、９近くまで上がることを確認できた。
（３）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
還元後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した。なお、２．０％の金チオグルコース液による負染色も実施し、アポフェリチンを見えるように工夫した。ＮａＢＨ4還元後のアポフェリチンのＴＥＭ観察結果を図２に示す。８割以上のアポフェリチン内部において、Ｓｎ2+還元により生じた錫ナノ粒子を観察することができた。錫ナノ粒子の粒径は３〜４ｎｍであり、粒径分布は非常に狭かった。
（比較例１）
基本的には前記実施例１の「（１）錫ナノ粒子の製造」と同様であるが、ＳｎＣｌ2を添加するときにおけるアポフェリチン溶液を、５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ３．６）として実験を行った。
【００２７】
その際の、ＮａＢＨ4滴下によるアポフェリチン溶液のｐＨ変化を図３に示す。ＮａＢＨ4を滴下しても、アポフェリチン溶液のｐＨはアルカリ側にならないことを確認した。
また、還元後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した結果を図４に示す。この場合、アポフェリチンの内腔部に錫ナノ粒子は形成されなかった。これは、滴下したＮａＢＨ4の殆どが、プロトンの還元に消費された結果、Ｓｎ2+の還元が殆ど起こらなかったことによると考えられる。
【００２８】
以上より、アポフェリチン溶液の緩衝能およびＮａＣｌを除くことが、Ｓｎ2+のアポフェリチンの内腔部への吸着と還元を促進させるために好ましいことが分かった。
【実施例２】
【００２９】
（１）錫ナノ粒子の製造
（ａ）アポフェリチン溶液の作成
ウマ由来の市販フェリチン（９３ｍｇ／ｍＬ，ＳＩＧＭＡ社製）０．５ｍＬに対し、０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）５．５ｍＬを加え、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた。それを、１６０ｍＬの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中に入れ、窒素パージしながら透析処理を１５ｍｉｎ行った。そして、０．４ｍＬのチオグルコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下、２ｈ透析処理を実施した。更に、０．２ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に加え、窒素パージ下、１ｈ透析処理を実施した。
引き続き、予め窒素パージしておいた、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）１６０ｍＬ中に、フェリチンを収容した透析膜チューブを移し、０．４ｍＬのチオグリコール酸を透析膜チューブ内に添加し、窒素パージ下で１ｈ、透析処理を実施した。透析チューブ内のフェリチンの色が消えたことを確認した後、４００ｍＬの０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液中に、透析チューブを移し、１ｈ透析処理を実施した。
引き続き、５００ｍＬの０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液中に透析チューブを移し、４℃下で一晩、透析処理を実施した。透析チューブ内の溶液を回収し、１０,０００Ｇで８ｍｉｎ、遠心処理を実施し、変性したフェリチンを沈殿として取り除いた。なお、この時点で、フェリチンの総量は２０ｍｇとなっており、フェリチン内部に存在していたフェロハイドライドが完全に取り除かれた、アポフェリチンを調製できた。
（ｂ）アポフェリチン溶液へのＳｎＣｌ2の添加（原料溶液の調製）
以下の工程は、Ｓｎナノ粒子の酸化を抑える目的で、全て窒素パージ下で実施した。アポフェリチン濃度を０．５μＭに調整した０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液（アポフェリチンと塩化ナトリウムとを含む水溶液）３ｍＬを作り、２０ｍＭのＳｎＣｌ2水溶液を３０μＬ加えて３０ｍｉｎ攪拌した。この時点におけるアポフェリチン溶液のｐＨは３．８であったが、ＳｎＣｌ2添加により、アポフェリチン溶液が少し白濁した。
（ｃ）還元剤（ＮａＢＨ4）による錫イオンの還元
その後、４．５μｍｏｌのＮａＢＨ4を溶解した２０μＬの水溶液をゆっくり滴下した。その過程で、アポフェリチン溶液の白濁は消失した。ＮａＢＨ4を添加してから３０ｍｉｎ攪拌し、アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１４,０００）中に入れた後、１００ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中でアポフェリチン溶液の透析を３０ｍｉｎ実施した。
以上の、ＳｎＣｌ2添加からＮａＢＨ4還元、透析までの工程を３回繰り返した。
（２）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
前記（１）の工程を行った後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した。なお、２．０％の金チオグルコース液による負染色も実施し、アポフェリチンを見えるように工夫した。その結果について図５に示す。図５の（ａ）は、負染色をしていないサンプル、図５の（ｂ）は、負染色を実施したサンプルである。（ｂ）において、着色していない部分がアポフェリチンであり、その内部に錫ナノ粒子が存在していることを確認できた。なお、本法によると、アポフェリチン内部で錫ナノ粒子を合成できたが、錫ナノ粒子の入ってないアポフェリチンも一部存在していた。
【実施例３】
【００３０】
（１）予備実験
アポフェリチン溶液に加える錫イオンの量について検討した。
ｐＨ４以下の酸性条件のアポフェリチン溶液に所定量の錫イオンを添加した後、アポフェリチン溶液のｐＨをアルカリ側としたとき、錫イオン量が少なく、その大部分がアポフェリチンの内腔部に取り込まれている場合は、ｐＨがアルカリ側となることでＳｎ（ＯＨ）2の沈澱が生じても、アポフェリチン溶液は、外見上白濁することはない。一方、錫イオン量が多く、アポフェリチンの外側にも錫イオンが存在する場合は、ｐＨがアルカリ側となることでＳｎ（ＯＨ）2の沈澱が生じると、アポフェリチン溶液が白濁する。よって、ｐＨがアルカリ側となったときの白濁の有無により、アポフェリチンの内腔部に取り込まれる錫イオンの大まかな量を予測することができる。
【００３１】
アポフェリチンの個数に対し、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍の個数のＳｎＣｌ2をそれぞれ添加し、３０ｍｉｎ攪拌した後に、各アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れ、それを１００ｍＬの５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に入れて攪拌することで、透析膜チューブ内で白濁が発生するかを確認した。その結果、アポフェリチンの個数に対して、３００倍の個数の錫イオンを添加した場合までは白濁が発生しなかったが、４００倍以上の個数の錫イオンを添加した場合に白濁が発生した。よって、アポフェリチンの内腔部に入る錫イオンの量（個数）は、アポフェリチンの３００倍程度と考えられる。
（２）錫ナノ粒子の製造
基本的には前記実施例２と同様の方法であるが、添加するＳｎＣｌ2の量を変化させて、錫ナノ粒子を製造した。具体的には、添加するＳｎＣｌ2の個数が、アポフェリチンの個数の、それぞれ、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍となるようにした。なお、ＳｎＣｌ2添加から還元に至る工程は、窒素パージ下で３回繰り返し実施し、粒径３〜４ｎｍの錫ナノ粒子をアポフェリチンの内腔部にて合成した。
（３）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
前記実施例１の（３）と同様に、前記（２）で製造した錫ナノ粒子をＴＥＭ観察したところ、錫ナノ粒子の添加量（個数）がいずれの場合であっても、粒径が３〜４ｎｍである錫ナノ粒子が合成された。
【００３２】
ＳｎＣｌ2添加量がアポフェリチン個数の６００倍、７００倍である場合は、還元後の溶液に、目視にて白濁が観察された。この白濁は、アポフェリチン外で合成された錫ナノ粒子がアポフェリチンを凝集させる結果、発生するものであり、錫ナノ粒子の回収率を低下させる原因となる。実際に、ＳｎＣｌ2添加量をアポフェリチンの５００倍にした場合は、アポフェリチンの凝集により回収できなかった錫ナノ粒子が、全体の７％程度であったが、ＳｎＣｌ2添加量をアポフェリチンの６００倍にした場合は、アポフェリチンの凝集により回収できなかった錫ナノ粒子が、全体の３０％程度になった。そこで、錫ナノ粒子の回収率を低下させないために、添加する錫イオンの量を、アポフェリチンの個数に対して、５００倍以下、より好ましくは３００倍以下にすることが好ましい。
【実施例４】
【００３３】
（１）錫ナノ粒子の製造
（ａ）ｐＨ３のアポフェリチン溶液の作成（その１）
前記実施例２の（１）（ａ）で得られたアポフェリチン溶液を、アポフェリチン濃度が０．４７ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水で希釈した。その希釈溶液を、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた後、１００ｍＬのｐＨ３の１０ｍＭクエン酸緩衝液中に入れ、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。引き続き、１００ｍＬの新しい緩衝液（同じもの）中に透析チューブを移し、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。
（ｂ）ｐＨ４のアポフェリチン溶液の作成（その２）
前記実施例２の（１）（ａ）で得られたアポフェリチン溶液を、アポフェリチン濃度が０．４７ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水で希釈した。その希釈溶液を、透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブ中に入れた後、１００ｍＬのｐＨ４の１０ｍＭクエン酸緩衝液中に入れ、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。引き続き、１００ｍＬの新しい緩衝液（同じもの）中に透析チューブを移し、３０ｍｉｎ攪拌しながら透析を実施した。
（ｃ）アポフェリチン溶液へのＳｎＣｌ２の添加
前記（ａ）、（ｂ）で調製したアポフェリチン溶液のぞれぞれについて、透析チューブ内のアポフェリチン溶液を別の容器に移し、それぞれのサンプルに対して、４ｍＭのＳｎＣｌ2を３７５μＬ添加し、３０ｍｉｎ攪拌した。攪拌後、それぞれの溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１５,０００）チューブに入れ、１００ｍＬの蒸留水中で３０ｍｉｎ攪拌しながら透析をおこなった。
（ｄ）還元剤（ＮａＢＨ4）による錫イオンの還元
その後、透析チューブ内の溶液を別の容器に移し、７．５μｍｏｌのＮａＢＨ4を溶解した２０μＬの水溶液をゆっくり滴下した。ＮａＢＨ4を添加してから３０ｍｉｎ攪拌し、アポフェリチン溶液を透析膜（ＭＷＣＯ：１４,０００）中に入れた後、１００ｍＬの０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液中でアポフェリチン溶液の透析を３０ｍｉｎ実施した。なお、ＮａＢＨ4の添加により、アポフェリチン溶液のｐＨがアルカリ側（ｐＨ７以上）に移行することを確認した。
（２）錫ナノ粒子のＴＥＭ観察
還元後のアポフェリチン溶液を、炭素蒸着したＣｕグリッド上に滴下して、ＴＥＭ観察を実施した。なお、２．０％の金チオグルコース液による負染色も実施し、アポフェリチンが見えるように工夫した。その結果、前記（ａ）で調製した、ｐＨ３のアポフェリチン溶液を用いた場合および前記（ｂ）で調製した、ｐＨ４のアポフェリチン溶液を用いた場合のいずれにおいても、アポフェリチンの内腔部での錫ナノ粒子の合成を確認することが出来た。錫ナノ粒子の粒径は３〜４ｎｍであり、その粒径分布は非常に狭かった。
（比較例２）
基本的には前記実施例４の「（１）錫ナノ粒子の製造」と同様であるが、アポフェリチン溶液の作成において用いる１０ｍＭクエン酸緩衝液のｐＨを５として、錫ナノ粒子を製造しようとした（すなわち、ＮａＢＨ4を添加する前におけるアポフェリチン溶液のｐＨを５として、錫ナノ粒子を製造しようとした）。
【００３４】
この場合、ＴＥＭ観察の結果、錫ナノ粒子の合成を確認することができなかった。なお、ｐＨ５のアポフェリチン溶液にＳｎＣｌ2を加えた際に、アポフェリチン溶液の白濁が少し観察された。これは、ｐＨ５においては、錫の水酸化物の生成が激しくなったことを示している。錫の水酸化物の生成が激しくなったことにより、アポフェリチンの内腔部に拡散する錫イオンの量が極端に少なくなり、結果として、錫ナノ粒子が形成されなかったと考えられる。
（実験例１）
基本的には前記実施例１の「（１）錫ナノ粒子の製造」と同様であるが、塩化錫（II）の代わりに、塩化錫（IV）、酢酸錫（II）、酢酸錫（IV）を用いて、錫ナノ粒子を製造した。
【００３５】
それぞれの場合について、還元剤を添加したときにおける溶液の白濁、及びＴＥＭ観察で錫ナノ粒子が観察できたか否かを判定した。その結果を表１に示す。また、表１には、実施例１の場合（塩化錫(II)を用いた場合）も併せて示す。
【００３６】
【表１】
表１に示すように、塩化錫（IV）を用いた場合は、還元剤の添加時に溶液の白濁が生じ、錫ナノ粒子の形成が認められなかった。これは、解離度が大きい塩化錫（IV）を用いたため、アポフェリチンの凝集による白濁、沈澱が生じてしまい、アポフェリチンの内腔部での錫ナノ粒子の形成が起こらなかったためであると考えられる。
【００３７】
また、酢酸錫（II）、酢酸錫（IV）を用いた場合は、いずれも、溶液の白濁は生じなかったが、錫ナノ粒子の形成が認められなかった。これは、解離し難い塩を用いたため、錫イオンがアポフェリチンの内腔部に拡散できなかったことが原因と考えられる。
【００３８】
以上の結果より、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの取り込みを実現するためには、錫イオンの価数が２価で、解離度の高い化合物（例えば、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、ＳｎＦ2等）を用いることが好ましいことが分かった。
（実験例２）アポフェリチン溶液に添加する錫イオン溶液における錫イオン濃度について
アポフェリチン溶液に添加する錫イオン溶液における錫イオン濃度が高くなり過ぎると、水酸化錫などの白沈が生じてしまい、アポフェリチンの内腔部への錫イオンの拡散を促し難くなる。そこで、白沈の生じない錫イオン濃度について調査した。
ＳｎＣｌ2を５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、４０ｍＭになるように、蒸留水で溶解させた。そのまま、１０ｍｉｎ放置した後、ＳｎＣｌ2の終濃度が５ｍＭになるように、それぞれのサンプルを蒸留水で希釈して、Ｏ.Ｄ.６００ｎｍを測定した。
その結果を図６に示す。ＳｎＣｌ2濃度が１０ｍＭ以下であれば、沈澱は殆ど生じなかったが、１０ｍＭを超えると白沈が多くなり、２０ｍＭ以上では激しく白沈した。なお、ＳｎＣｌ2が１０ｍＭ以下の溶液については、数日間放置しても白沈は生じなかった。白濁した溶液の主成分は水酸化錫であり、アポフェリチン溶液に添加しても溶解するものではないため、錫イオン溶液における錫イオン濃度は１０ｍＭ以下であることが好ましいことが分かった。
【００３９】
尚、本発明は前記実施例になんら限定されるものではなく、本発明を逸脱しない範囲において種々の態様で実施しうることはいうまでもない。
例えば、還元剤は、ＮａＢＨ4の代わりに、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する他の還元剤を用いることができる。
【００４０】
また、ＳｎＣｌ2の代わりに、あるいはＳｎＣｌ2とともに、ＳｎＳＯ4、及び／又はＳｎＦ2を用いても略同様の効果を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】還元剤を添加する工程における溶液のｐＨ変化を表すグラフである。
【図２】アポフェリチンをＴＥＭ観察した結果を表す写真である。
【図３】還元剤を添加する工程における溶液のｐＨ変化を表すグラフである。
【図４】アポフェリチンをＴＥＭ観察した結果を表す写真である。
【図５】アポフェリチンをＴＥＭ観察した結果を表す写真であって、（ａ）は負染色をしていないサンプルの写真であり、 (b)は、負染色を実施したサンプルの写真である。
【図６】錫イオン溶液における錫イオン濃度と、白沈の程度との関係を表すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アポフェリチンと、錫イオンと、を含み、ｐＨが４以下の原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤を添加し、ｐＨ７以上の条件下、前記アポフェリチンの内腔部で、錫ナノ粒子を形成することを特徴とする錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記錫イオンの価数が２価であることを特徴とする請求項１記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記原料溶液には、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、及びＳｎＦ2から成る群から選ばれる一種以上の塩が溶解しており、前記錫イオンは、前記塩が解離して得られるものであることを特徴とする請求項１または２記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記原料溶液は、前記アポフェリチンを含む溶液と、前記錫イオンを含む溶液とを混合して得られるものであり、
前記錫イオンを含む溶液における錫イオン濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記原料溶液において、前記錫イオンの個数は、前記アポフェリチンの個数の５００倍以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項１】
アポフェリチンと、錫イオンと、を含み、ｐＨが４以下の原料溶液に、錫の酸化還元電位より負側の電位を有する還元剤を添加し、ｐＨ７以上の条件下、前記アポフェリチンの内腔部で、錫ナノ粒子を形成することを特徴とする錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記錫イオンの価数が２価であることを特徴とする請求項１記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記原料溶液には、ＳｎＣｌ2、ＳｎＳＯ4、及びＳｎＦ2から成る群から選ばれる一種以上の塩が溶解しており、前記錫イオンは、前記塩が解離して得られるものであることを特徴とする請求項１または２記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記原料溶液は、前記アポフェリチンを含む溶液と、前記錫イオンを含む溶液とを混合して得られるものであり、
前記錫イオンを含む溶液における錫イオン濃度が１０ｍＭ以下であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記原料溶液において、前記錫イオンの個数は、前記アポフェリチンの個数の５００倍以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の錫ナノ粒子の製造方法。
【図１】
【図３】
【図６】
【図２】
【図４】
【図５】
【図３】
【図６】
【図２】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−３５７７３（Ｐ２００９−３５７７３Ａ）
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２０１０３１（Ｐ２００７−２０１０３１）
【出願日】平成１９年８月１日（２００７．８．１）
【出願人】（０００００４２６０）株式会社デンソー (27,639)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月１日（２００７．８．１）
【出願人】（０００００４２６０）株式会社デンソー (27,639)
【Ｆターム（参考）】
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