関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置
【課題】関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性を、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができる関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置の提供。
【解決手段】本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程と、
を含むことを特徴とする。
【解決手段】本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程と、
を含むことを特徴とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標とした、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、関節リウマチ寛解目的にＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α）を標的にした生物学的製剤が使用されるようになり、その有効性が認められるようになってきた。エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分とＩＩ型ＴＮＦ受容体との融合タンパク質から成る生物学的製剤である。前記ＴＮＦは、α型、及びβ型の２つの型が存在し、エタネルセプトは、前記ＴＮＦα、及びＴＮＦβ（ＬＴα）の両方を標的とする。エタネルセプトは、関節リウマチの活動性を抑えることがＤＡＳ（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）２８と呼ばれる臨床的指標を用いて既に知られており、更に、関節リウマチに伴う骨破壊も抑制することが報告されている。
【０００３】
しかし、このように顕著な有効性を持ち合わせているにもかかわらず、エタネルセプト無効の関節リウマチ症例も存在する。更に、エタネルセプトにはニューモシスティス肺炎や、肺結核などの感染症を惹起しやすい副作用もあるため、投与前にエタネルセプトの有効性を予測することで、より確実に効く症例にエタネルセプトを投与することができ、無駄な副作用を回避することもできうる。
【０００４】
エタネルセプトのような生物学的製剤の有効性予測因子を同定する試みはこれまでにも報告が認められる（非特許文献１参照）。それらは、エタネルセプト有効例と無効例との間で比較した後ろ向き試験により、有効例と関連する遺伝子発現をアルゴリズムで解析したものが多く、前向き試験などで確認し得た確実なエタネルセプト有効性予測因子は、まだ同定されていない。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）４は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関与するアグリカナーゼであることが知られている。
しかしながら、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量と、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性との相関については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｏｃｚａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２００８； １０（３）： Ｒ５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性を、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができる関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、エタネルセプト投与前の関節リウマチ患者の末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が少ないほど、エタネルセプトが有効であるという知見である。エタネルセプト投与前の血中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、エタネルセプトの有効性を予測できないかを前向き試験により行った報告は従来には無く、前記知見は、本発明者らによる新たな知見である。
なお、後ろ向き試験とは、過去と現在のデータを扱う試験であり、前向き試験とは、これから生じる現象を観察する試験である。後ろ向き試験では既に判明している事項を扱うので研究者によるバイアスが入りやすいのに対して、前向き試験では結果がわかっていないために、バイアスがかかりにくく、より信頼のおける結果が得られる点で優れている。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜２＞ 可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である前記＜１＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜３＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜４＞ ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する前記＜３＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜５＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
＜６＞ 可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である前記＜５＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
＜７＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
＜８＞ ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する前記＜７＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性を、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができる関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が、０．４×１／２５より小さい低値群、及び０．４×１／２５以上である高値群における、エタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の値を示すグラフである。
【図２】図２は、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）と、エタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８の変化率（ΔＤＡＳ２８（２０ｗ））との相関を示すグラフである。
【図３】図３は、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が、０．６×１／２５より小さい低値群、及び０．６×１／２５以上である高値群における、エタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置）
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程（測定工程）と、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程（評価工程）とを少なくとも含み、更に必要に応じて、その他の工程を含んでいる。
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段（測定手段）と、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段（評価手段）とを少なくとも含み、更に必要に応じて、その他の手段を含んでいる。
【００１３】
＜測定工程、及び測定手段＞
前記測定工程は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程である。
前記測定手段は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段である。
【００１４】
−被検体由来の試料−
前記被検体由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢血、関節滑膜、関節液などが挙げられる。中でも、末梢血が、採取が簡便である点で、好ましい。
前記被検体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒトなどが挙げられる。
【００１５】
−ＡＤＡＭＴＳ４−
前記ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）４は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関与するアグリカナーゼであることが知られている。
前記ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の塩基配列は、例えば、ヒトにおいて公知であり、その塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００５０９９で入手可能である。
【００１６】
−含有量の測定−
前記被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡの発現量を測定する方法、タンパク質の発現量を測定する方法などが挙げられる。
【００１７】
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法などが挙げられる。
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ装置、リアルタイムＰＣＲ装置、ＤＮＡアレイ装置、ノーザンブロット装置などが挙げられる。前記装置は、前記測定手段として好適に使用することができる。
【００１８】
前記リアルタイムＰＣＲ法の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検量線を作成し、その検量線からサンプルの定量を行う方法（検量線法）が挙げられる。
前記検量線法に用いる鋳型ＤＮＡコントロールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、健常人から採取・精製した全ｃＤＮＡや、ＡＤＡＭＴＳ４ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドなどが挙げられる。
前記リアルタイムＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、ＡＤＡＭＴＳ４を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リアルタイムＰＣＲ法における内在性コントロールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）などが挙げられる。
【００１９】
＜評価工程、及び評価手段＞
前記評価工程は、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程である。
前記評価手段は、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段である。
【００２０】
−可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬−
前記可溶性ＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α）／ＬＴα（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ α）レセプター薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、完全ヒト型可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬であるエタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））が好適に挙げられる。
【００２１】
−指標−
前記指標としては、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を使用する。
【００２２】
−評価−
前記関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、関節リウマチ患者の中で低い場合には、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効であると評価することができる。
具体例としては、前記指標として、ＡＤＡＭＴＳ４を用いた場合（詳細は、後述する実施例１参照）、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が、０．４×１／２５より小さい場合に、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効であると評価することができる。
前記評価を行う装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電子計算機（コンピュータ）などが挙げられる。前記装置は、前記評価手段として好適に使用することができる。
【００２３】
また、前記評価においては、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後のＤＡＳ２８を予測することも可能である。
前記ＤＡＳ２８とは、Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅの略で、関節リウマチの疾患活動性をスコア化しようということでヨーロッパリウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）が定めたものであり、Ｆｒａｎｓｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００５； ２３（Ｓｕｐｐｌ．３９）： Ｓ９３−Ｓ９９に記載されている。
前記可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後のＤＡＳ２８を予測する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、関節リウマチ患者の末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４ ｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）を、後述する実施例１で示すグラフ（図２参照）に当てはめ、ＤＡＳ２８が、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与前から低下する割合を算出し、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後のＤＡＳ２８を予測することができる。
【００２４】
＜その他の工程、及びその他の手段＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＡＤＡＭＴＳ４と、他の遺伝子とを組み合わせて評価する工程などが挙げられる。
前記その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＡＤＡＭＴＳ４と、他の遺伝子と組み合わせて評価する手段などが挙げられる。
【００２５】
−他の遺伝子−
前記他の遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４以外のアグリカナーゼをコードする遺伝子、関節リウマチに特異的に発現する遺伝子などが挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１：ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標とした、関節リウマチに対するエタネルセプトの有効性予測）
平成１９年１０月から平成２０年４月までに埼玉医科大学総合医療センター・リウマチ膠原病内科外来を受診した関節リウマチ患者のうち、エタネルセプトを投与された患者１５例を対象とした。
【００２８】
＜測定工程＞
末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量の測定
エタネルセプト投与前の関節リウマチ患者の末梢血２．５ｍＬを採取し、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡ採血管（登録商標、日本ベクトン・ディッキンソン社製）に刺入後、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（登録商標、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。前記全ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて全ｃＤＮＡに変換した。前記全ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、Ｔａｑｍａｎ （登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定した。なお、プライマー、及びプローブは、プライマー・プローブセット（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ （登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ｈｓ００１９２７０８＿ｍ１， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
上記により得られたＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの含有量は、β−ａｃｔｉｎ（内在性コントロール）のｍＲＮＡとの相対量で定量化を行った。
なお、β−ａｃｔｉｎのプライマー、及びプローブは、プライマー・プローブセット（Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ （登録商標） Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｈｕｍａｎ ＡＣＴＢ， ＮＭ＿００１１０１， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【００２９】
＜評価工程＞
関節リウマチ患者の関節リウマチ活動性は、エタネルセプト投与前、及び投与２０週後のＤＡＳ２８［ＤＡＳ２８（０ｗ）、ＤＡＳ２８（２０ｗ）］で評価した。
エタネルセプトが有効か否かは、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を用いたＥＵＬＡＲ改善基準によって、反応性良好（ｇｏｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、中等度反応（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、反応なし（ｎｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）とした。
なお、ＥＵＬＡＲ改善基準とは、ヨーロッパリウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）が定めたものであり、Ｆｒａｎｓｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００５； ２３（Ｓｕｐｐｌ．３９）： Ｓ９３−Ｓ９９に記載されている。
【００３０】
投与２０週後におけるＥＵＬＡＲ改善基準に基づくエタネルセプトの有効性は、反応性良好が６例、中等度反応が６例、反応なしが３例であった。また、寛解例（ＤＡＳ２８（２０ｗ）＜２．６）は、５例であった。
【００３１】
−低値群と高値群との比較−
上記エタネルセプト投与関節リウマチ患者１５例につき、健常人より抽出の全ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡコントロールとして用いた検量線法によるリアルタイムＰＣＲ法で、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）を定量した。前記ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が０．４×１／２５より小さい場合を低値群(Ｌｏｗ)、０．４×１／２５以上の場合を高値群(Ｈｉｇｈ) として群分けし、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を比較した結果、低値群では、ＤＡＳ２８（２０ｗ）が有意に低かった（図１参照）。
【００３２】
−−Ｒ群とＮＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲ群（中等度反応＋反応性良好）と、ＮＲ群（反応なし）とした場合の分類を表１に示す。
【表１】
【００３３】
表１の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表２に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｃ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｄ／（Ｄ＋Ｂ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ａ／（Ｂ＋Ａ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｄ／（Ｄ＋Ｃ）×１００
なお、上記式中Ａ〜Ｄは、以下のとおりである。
Ａ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｂ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、ＮＲ群に分類された症例
Ｃ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｄ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、ＮＲ群に分類された症例
【００３４】
【表２】
表２の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群の場合に、Ｒ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、１００％と高く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することができることが示された。
【００３５】
−−ＧＲ群とＮＧＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＧＲ群（反応性良好）と、ＮＧＲ群（反応なし＋中等度反応）とした場合の分類を表３に示す。
【表３】
【００３６】
表３の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表４に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｅ／（Ｅ＋Ｇ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｈ／（Ｈ＋Ｆ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｅ／（Ｆ＋Ｅ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｈ／（Ｈ＋Ｇ）×１００
なお、上記式中Ｅ〜Ｈは、以下のとおりである。
Ｅ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｆ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
Ｇ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｈ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
【００３７】
【表４】
表４の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群の場合に、ＧＲ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、１００％と高く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することができることが示された。
【００３８】
−−Ｒｅ群とＮｒｅ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲｅ（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：寛解）群と、Ｎｒｅ（ｎｏｎ−ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：非寛解）群とした場合の分類を表５に示す。
【表５】
【００３９】
表５の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表６に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｉ／（Ｉ＋Ｋ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｌ／（Ｌ＋Ｊ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｉ／（Ｊ＋Ｉ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｌ／（Ｌ＋Ｋ）×１００
なお、上記式中Ｉ〜Ｌは、以下のとおりである。
Ｉ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｊ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
Ｋ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｌ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
【００４０】
【表６】
【００４１】
表６の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群の場合に、寛解（Ｒｅ群となる）を予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、１００％と高かった。また、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群の場合に、寛解を否定する陰性予測率（ＮＰＶ）も８３．３％と高かった。そのため、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、寛解をも予測することができることが示された。
【００４２】
−エタネルセプト投与後のＤＡＳ２８の予測−
エタネルセプト投与前の末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）と、エタネルセプト投与前のＤＡＳ２８（０ｗ）と比較したエタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の変化率（ΔＤＡＳ２８（２０ｗ））との相関を検討した結果を図２に示す。
図２に示されるように、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）と、エタネルセプト投与前のＤＡＳ２８（０ｗ）と比較したエタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の変化率（ΔＤＡＳ２８（２０ｗ））との間に負の相関（ｒ＝−０．４８６）が認められた。
このことは即ち、被検体由来の試料中のエタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が少ないほど、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効であること、及び被検体由来の試料中のエタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後におけるＤＡＳ２８を予測できることを示している。
【００４３】
（参考実験１：ＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標とした、関節リウマチに対するエタネルセプトの有効性予測）
ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）５は、前記実施例１に記載のＡＤＡＭＴＳ４と同様に、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関与するアグリカナーゼであることが知られている。
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の塩基配列は、ヒトにおいて公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００７０３８で入手可能ある。
参考実験１の対象としては、前記実施例１と同様の患者１５例を対象とした。
【００４４】
＜測定工程＞
末梢血中のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量の測定
ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの調製方法、測定方法、及び定量方法は、リアルタイムＰＣＲ法に用いたプライマー・プローブセットを、ＡＤＡＭＴＳ５のプライマー・プローブセット（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ （登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））に変えた以外は、前記実施例１と同様である。
【００４５】
＜評価工程＞
関節リウマチ患者の関節リウマチ活動性は、エタネルセプト投与前、及び投与２０週後のＤＡＳ２８［ＤＡＳ２８（０ｗ）、ＤＡＳ２８（２０ｗ）］で評価した。
エタネルセプトが有効か否かは、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を用いたＥＵＬＡＲ改善基準によって、反応性良好（ｇｏｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、中等度反応（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、反応なし（ｎｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）とした。
【００４６】
投与２０週後におけるＥＵＬＡＲ改善基準に基づくエタネルセプトの有効性は、反応性良好が６例、中等度反応が６例、反応なしが３例であった。また、寛解例（ＤＡＳ２８（２０ｗ）＜２．６）は、５例であった。
【００４７】
−低値群と高値群との比較−
上記エタネルセプト投与関節リウマチ患者１５例につき、健常人より抽出の全ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡコントロールとして用いた検量線法によるリアルタイムＰＣＲ法で、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）を定量した。前記ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が０．６×１／２５より小さい場合を低値群(Ｌｏｗ)、０．６×１／２５以上の場合を高値群(Ｈｉｇｈ) として群分けし、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を比較した結果、低値群と高値群とでは、ＤＡＳ２８（２０ｗ）に差は認められなかった（図３参照）。
【００４８】
−−Ｒ群とＮＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲ群（中等度反応＋反応性良好）と、ＮＲ群（反応なし）とした場合の分類を表７に示す。
【表７】
【００４９】
表７の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表８に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｍ／（Ｍ＋Ｏ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｐ／（Ｐ＋Ｎ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｍ／（Ｎ＋Ｍ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｐ／（Ｐ＋Ｏ）×１００
なお、上記式中Ｍ〜Ｐは、以下のとおりである。
Ｍ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｎ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、ＮＲ群に分類された症例
Ｏ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｐ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、ＮＲ群に分類された症例
【００５０】
【表８】
表８の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群の場合に、Ｒ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、７７．８％と低く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することは適切ではないことが示された。
【００５１】
−−ＧＲ群とＮＧＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＧＲ群（反応性良好）と、ＮＧＲ群（反応なし＋中等度反応）とした場合の分類を表９に示す。
【表９】
【００５２】
表９の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表１０に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｑ／（Ｑ＋Ｓ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｔ／（Ｔ＋Ｒ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｑ／（Ｒ＋Ｑ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｔ／（Ｔ＋Ｓ）×１００
なお、上記式中Ｑ〜Ｔは、以下のとおりである。
Ｑ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｒ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
Ｓ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｔ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
【００５３】
【表１０】
【００５４】
表１０の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群の場合に、ＧＲ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、３３．３％と低く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することは適切ではないことが示された。
【００５５】
−−Ｒｅ群とＮｒｅ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲｅ（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：寛解）群と、Ｎｒｅ（ｎｏｎ−ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：非寛解）群とした場合の分類を表１１に示す。
【表１１】
【００５６】
表１１の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表１２に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｕ／（Ｕ＋Ｗ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｖ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｕ／（Ｖ＋Ｕ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｗ）×１００
なお、上記式中Ｕ〜Ｘは、以下のとおりである。
Ｕ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｖ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
Ｗ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｘ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
【００５７】
【表１２】
表１２の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群の場合に、寛解（Ｒｅ群となる）を予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、２２．２％と低かった。また、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群の場合に、寛解を否定する陰性予測率（ＮＰＶ）も５０．０％と低かった。そのため、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標として、寛解を予測することは適切ではないことが示された。
【００５８】
（比較例１：既報告との比較）
エタネルセプトの有効性について、マイクロアレイ法とクラスター分析とを用いて予測したＫｏｃｚａｎらの報告（Ｋｏｃｚａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２００８； １０（３）： Ｒ５０）と、本発明とを比較した（表１３参照）。
前記報告は、エタネルセプト投与前と、エタネルセプト投与３ヶ月後との２ポイントにおけるＤＡＳ２８を、マイクロアレイとアルゴリズムとを用いて解析する後ろ向き試験であり、その減少量（ΔＤＡＳ）が１．２未満を有効と定義した場合の陽性予測率（ＰＰＶ）は、８９％（７転写物）、９５％（１０転写物）であった。
一方、上述した実施例１は、エタネルセプト投与前のワンポイントにおけるＤＡＳ２８を解析する前向き試験であり、前記Ｋｏｃｚａｎらの報告と同じ定義で陽性予測率を算出すると、１００％と高かった。更に、ＤＡＳ２８が２．６未満を寛解と定義した場合の陽性予測率（ＰＰＶ）は１００％、陰性予測率（ＮＰＶ）は８３．３％と高かった。
上述した実施例１は、エタネルセプト投与前の血中ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）によって、エタネルセプト投与２０週後におけるエタネルセプトの有効性、及び寛解を定量化して推測できる点で優れている。
【表１３】
【００５９】
前記実施例１の結果から、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することができるだけでなく、エタネルセプト投与による寛解をも予測可能であることが示された。
また、前記参考実験１の結果から、同じＡＤＡＭＴＳファミリーに属する遺伝子であるＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標としては、エタネルセプトの薬効、及び寛解を予測することができないことが示された。
前記実施例１、前記参考実験１、及び前記比較例１の結果から、本発明の薬効予測方法は、エタネルセプト投与前のワンポイントにおけるＡＤＡＭＴＳ４という単一遺伝子のみであってもエタネルセプト投与による寛解を含めた有効性を予測できる点で他の方法よりも優れている。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法は、前記薬投与前のワンポイントにおけるＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができるので、医学的診断、及び治療の分野において、好適に利用できる。
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置は、前記薬投与前のワンポイントにおけるＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができるので、医学的診断、及び治療の分野において、好適に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標とした、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、関節リウマチ寛解目的にＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α）を標的にした生物学的製剤が使用されるようになり、その有効性が認められるようになってきた。エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））は、ヒトＩｇＧのＦｃ部分とＩＩ型ＴＮＦ受容体との融合タンパク質から成る生物学的製剤である。前記ＴＮＦは、α型、及びβ型の２つの型が存在し、エタネルセプトは、前記ＴＮＦα、及びＴＮＦβ（ＬＴα）の両方を標的とする。エタネルセプトは、関節リウマチの活動性を抑えることがＤＡＳ（Ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）２８と呼ばれる臨床的指標を用いて既に知られており、更に、関節リウマチに伴う骨破壊も抑制することが報告されている。
【０００３】
しかし、このように顕著な有効性を持ち合わせているにもかかわらず、エタネルセプト無効の関節リウマチ症例も存在する。更に、エタネルセプトにはニューモシスティス肺炎や、肺結核などの感染症を惹起しやすい副作用もあるため、投与前にエタネルセプトの有効性を予測することで、より確実に効く症例にエタネルセプトを投与することができ、無駄な副作用を回避することもできうる。
【０００４】
エタネルセプトのような生物学的製剤の有効性予測因子を同定する試みはこれまでにも報告が認められる（非特許文献１参照）。それらは、エタネルセプト有効例と無効例との間で比較した後ろ向き試験により、有効例と関連する遺伝子発現をアルゴリズムで解析したものが多く、前向き試験などで確認し得た確実なエタネルセプト有効性予測因子は、まだ同定されていない。
【０００５】
ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）４は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関与するアグリカナーゼであることが知られている。
しかしながら、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量と、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性との相関については知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｏｃｚａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２００８； １０（３）： Ｒ５０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、前記従来における諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性を、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができる関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため、本発明者らは鋭意検討した結果、以下のような知見を得た。即ち、エタネルセプト投与前の関節リウマチ患者の末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が少ないほど、エタネルセプトが有効であるという知見である。エタネルセプト投与前の血中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、エタネルセプトの有効性を予測できないかを前向き試験により行った報告は従来には無く、前記知見は、本発明者らによる新たな知見である。
なお、後ろ向き試験とは、過去と現在のデータを扱う試験であり、前向き試験とは、これから生じる現象を観察する試験である。後ろ向き試験では既に判明している事項を扱うので研究者によるバイアスが入りやすいのに対して、前向き試験では結果がわかっていないために、バイアスがかかりにくく、より信頼のおける結果が得られる点で優れている。
【０００９】
本発明は、本発明者らの前記知見に基づくものであり、前記課題を解決するための手段としては、以下の通りである。即ち、
＜１＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜２＞ 可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である前記＜１＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜３＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜４＞ ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する前記＜３＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法である。
＜５＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
＜６＞ 可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である前記＜５＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
＜７＞ 被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である前記＜５＞から＜６＞のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
＜８＞ ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する前記＜７＞に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置である。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前記従来における諸問題を解決し、前記目的を達成することができ、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の有効性を、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができる関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が、０．４×１／２５より小さい低値群、及び０．４×１／２５以上である高値群における、エタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の値を示すグラフである。
【図２】図２は、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）と、エタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８の変化率（ΔＤＡＳ２８（２０ｗ））との相関を示すグラフである。
【図３】図３は、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が、０．６×１／２５より小さい低値群、及び０．６×１／２５以上である高値群における、エタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法、及び薬効予測装置）
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程（測定工程）と、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程（評価工程）とを少なくとも含み、更に必要に応じて、その他の工程を含んでいる。
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段（測定手段）と、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段（評価手段）とを少なくとも含み、更に必要に応じて、その他の手段を含んでいる。
【００１３】
＜測定工程、及び測定手段＞
前記測定工程は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程である。
前記測定手段は、被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段である。
【００１４】
−被検体由来の試料−
前記被検体由来の試料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、末梢血、関節滑膜、関節液などが挙げられる。中でも、末梢血が、採取が簡便である点で、好ましい。
前記被検体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、ヒトなどが挙げられる。
【００１５】
−ＡＤＡＭＴＳ４−
前記ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）４は、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関与するアグリカナーゼであることが知られている。
前記ＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の塩基配列は、例えば、ヒトにおいて公知であり、その塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ（ＮＣＢＩ）などの公共データベースを通じて容易に入手することができる。例えば、ヒトＡＤＡＭＴＳ４遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００５０９９で入手可能である。
【００１６】
−含有量の測定−
前記被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量の測定方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ｍＲＮＡの発現量を測定する方法、タンパク質の発現量を測定する方法などが挙げられる。
【００１７】
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡアレイ法、ノーザンブロット法などが挙げられる。
前記ｍＲＮＡの発現量を測定する装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＰＣＲ装置、リアルタイムＰＣＲ装置、ＤＮＡアレイ装置、ノーザンブロット装置などが挙げられる。前記装置は、前記測定手段として好適に使用することができる。
【００１８】
前記リアルタイムＰＣＲ法の方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、検量線を作成し、その検量線からサンプルの定量を行う方法（検量線法）が挙げられる。
前記検量線法に用いる鋳型ＤＮＡコントロールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、健常人から採取・精製した全ｃＤＮＡや、ＡＤＡＭＴＳ４ ｃＤＮＡを組み込んだプラスミドなどが挙げられる。
前記リアルタイムＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、ＡＤＡＭＴＳ４を増幅することができるものであれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記リアルタイムＰＣＲ法における内在性コントロールとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）などが挙げられる。
【００１９】
＜評価工程、及び評価手段＞
前記評価工程は、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程である。
前記評価手段は、前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段である。
【００２０】
−可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬−
前記可溶性ＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ α）／ＬＴα（Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ α）レセプター薬としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、完全ヒト型可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬であるエタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））が好適に挙げられる。
【００２１】
−指標−
前記指標としては、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を使用する。
【００２２】
−評価−
前記関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、関節リウマチ患者の中で低い場合には、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効であると評価することができる。
具体例としては、前記指標として、ＡＤＡＭＴＳ４を用いた場合（詳細は、後述する実施例１参照）、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が、０．４×１／２５より小さい場合に、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効であると評価することができる。
前記評価を行う装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、電子計算機（コンピュータ）などが挙げられる。前記装置は、前記評価手段として好適に使用することができる。
【００２３】
また、前記評価においては、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後のＤＡＳ２８を予測することも可能である。
前記ＤＡＳ２８とは、Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｓｃｏｒｅの略で、関節リウマチの疾患活動性をスコア化しようということでヨーロッパリウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）が定めたものであり、Ｆｒａｎｓｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００５； ２３（Ｓｕｐｐｌ．３９）： Ｓ９３−Ｓ９９に記載されている。
前記可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後のＤＡＳ２８を予測する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、関節リウマチ患者の末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４ ｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）を、後述する実施例１で示すグラフ（図２参照）に当てはめ、ＤＡＳ２８が、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与前から低下する割合を算出し、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後のＤＡＳ２８を予測することができる。
【００２４】
＜その他の工程、及びその他の手段＞
前記その他の工程としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＡＤＡＭＴＳ４と、他の遺伝子とを組み合わせて評価する工程などが挙げられる。
前記その他の手段としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前記ＡＤＡＭＴＳ４と、他の遺伝子と組み合わせて評価する手段などが挙げられる。
【００２５】
−他の遺伝子−
前記他の遺伝子としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＡＤＡＭＴＳ４以外のアグリカナーゼをコードする遺伝子、関節リウマチに特異的に発現する遺伝子などが挙げられる。
【実施例】
【００２６】
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
【００２７】
（実施例１：ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標とした、関節リウマチに対するエタネルセプトの有効性予測）
平成１９年１０月から平成２０年４月までに埼玉医科大学総合医療センター・リウマチ膠原病内科外来を受診した関節リウマチ患者のうち、エタネルセプトを投与された患者１５例を対象とした。
【００２８】
＜測定工程＞
末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量の測定
エタネルセプト投与前の関節リウマチ患者の末梢血２．５ｍＬを採取し、ＰＡＸｇｅｎｅ ＲＮＡ採血管（登録商標、日本ベクトン・ディッキンソン社製）に刺入後、ＰＡＸｇｅｎｅ Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ Ｋｉｔ（登録商標、ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ社製）を用いて全ＲＮＡを抽出した。前記全ＲＮＡを、逆転写酵素を用いて全ｃＤＮＡに変換した。前記全ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして、Ｔａｑｍａｎ （登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定した。なお、プライマー、及びプローブは、プライマー・プローブセット（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ （登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ｈｓ００１９２７０８＿ｍ１， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
上記により得られたＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの含有量は、β−ａｃｔｉｎ（内在性コントロール）のｍＲＮＡとの相対量で定量化を行った。
なお、β−ａｃｔｉｎのプライマー、及びプローブは、プライマー・プローブセット（Ｐｒｅ−Ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ＴａｑＭａｎ （登録商標） Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｈｕｍａｎ ＡＣＴＢ， ＮＭ＿００１１０１， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使用した。
【００２９】
＜評価工程＞
関節リウマチ患者の関節リウマチ活動性は、エタネルセプト投与前、及び投与２０週後のＤＡＳ２８［ＤＡＳ２８（０ｗ）、ＤＡＳ２８（２０ｗ）］で評価した。
エタネルセプトが有効か否かは、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を用いたＥＵＬＡＲ改善基準によって、反応性良好（ｇｏｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、中等度反応（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、反応なし（ｎｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）とした。
なお、ＥＵＬＡＲ改善基準とは、ヨーロッパリウマチ学会（ＥＵＬＡＲ）が定めたものであり、Ｆｒａｎｓｅｎ Ｊ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２００５； ２３（Ｓｕｐｐｌ．３９）： Ｓ９３−Ｓ９９に記載されている。
【００３０】
投与２０週後におけるＥＵＬＡＲ改善基準に基づくエタネルセプトの有効性は、反応性良好が６例、中等度反応が６例、反応なしが３例であった。また、寛解例（ＤＡＳ２８（２０ｗ）＜２．６）は、５例であった。
【００３１】
−低値群と高値群との比較−
上記エタネルセプト投与関節リウマチ患者１５例につき、健常人より抽出の全ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡコントロールとして用いた検量線法によるリアルタイムＰＣＲ法で、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）を定量した。前記ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が０．４×１／２５より小さい場合を低値群(Ｌｏｗ)、０．４×１／２５以上の場合を高値群(Ｈｉｇｈ) として群分けし、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を比較した結果、低値群では、ＤＡＳ２８（２０ｗ）が有意に低かった（図１参照）。
【００３２】
−−Ｒ群とＮＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲ群（中等度反応＋反応性良好）と、ＮＲ群（反応なし）とした場合の分類を表１に示す。
【表１】
【００３３】
表１の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表２に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ａ／（Ａ＋Ｃ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｄ／（Ｄ＋Ｂ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ａ／（Ｂ＋Ａ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｄ／（Ｄ＋Ｃ）×１００
なお、上記式中Ａ〜Ｄは、以下のとおりである。
Ａ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｂ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、ＮＲ群に分類された症例
Ｃ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｄ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、ＮＲ群に分類された症例
【００３４】
【表２】
表２の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群の場合に、Ｒ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、１００％と高く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することができることが示された。
【００３５】
−−ＧＲ群とＮＧＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＧＲ群（反応性良好）と、ＮＧＲ群（反応なし＋中等度反応）とした場合の分類を表３に示す。
【表３】
【００３６】
表３の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表４に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｅ／（Ｅ＋Ｇ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｈ／（Ｈ＋Ｆ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｅ／（Ｆ＋Ｅ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｈ／（Ｈ＋Ｇ）×１００
なお、上記式中Ｅ〜Ｈは、以下のとおりである。
Ｅ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｆ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
Ｇ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｈ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
【００３７】
【表４】
表４の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群の場合に、ＧＲ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、１００％と高く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することができることが示された。
【００３８】
−−Ｒｅ群とＮｒｅ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲｅ（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：寛解）群と、Ｎｒｅ（ｎｏｎ−ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：非寛解）群とした場合の分類を表５に示す。
【表５】
【００３９】
表５の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表６に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｉ／（Ｉ＋Ｋ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｌ／（Ｌ＋Ｊ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｉ／（Ｊ＋Ｉ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｌ／（Ｌ＋Ｋ）×１００
なお、上記式中Ｉ〜Ｌは、以下のとおりである。
Ｉ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｊ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
Ｋ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｌ：ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
【００４０】
【表６】
【００４１】
表６の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が低値群の場合に、寛解（Ｒｅ群となる）を予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、１００％と高かった。また、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）が高値群の場合に、寛解を否定する陰性予測率（ＮＰＶ）も８３．３％と高かった。そのため、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、寛解をも予測することができることが示された。
【００４２】
−エタネルセプト投与後のＤＡＳ２８の予測−
エタネルセプト投与前の末梢血中のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）と、エタネルセプト投与前のＤＡＳ２８（０ｗ）と比較したエタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の変化率（ΔＤＡＳ２８（２０ｗ））との相関を検討した結果を図２に示す。
図２に示されるように、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）と、エタネルセプト投与前のＤＡＳ２８（０ｗ）と比較したエタネルセプト投与２０週後のＤＡＳ２８（２０ｗ）の変化率（ΔＤＡＳ２８（２０ｗ））との間に負の相関（ｒ＝−０．４８６）が認められた。
このことは即ち、被検体由来の試料中のエタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が少ないほど、関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効であること、及び被検体由来の試料中のエタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬投与後におけるＤＡＳ２８を予測できることを示している。
【００４３】
（参考実験１：ＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標とした、関節リウマチに対するエタネルセプトの有効性予測）
ＡＤＡＭＴＳ（ａ ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ ａｎｄ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｗｉｔｈ ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ ｍｏｔｉｆｓ）５は、前記実施例１に記載のＡＤＡＭＴＳ４と同様に、ＡＤＡＭＴＳファミリーに属する軟骨破壊に関与するアグリカナーゼであることが知られている。
前記ＡＤＡＭＴＳ５遺伝子の塩基配列は、ヒトにおいて公知であり、その塩基配列は、ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ＮＭ＿００７０３８で入手可能ある。
参考実験１の対象としては、前記実施例１と同様の患者１５例を対象とした。
【００４４】
＜測定工程＞
末梢血中のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量の測定
ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの調製方法、測定方法、及び定量方法は、リアルタイムＰＣＲ法に用いたプライマー・プローブセットを、ＡＤＡＭＴＳ５のプライマー・プローブセット（ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ （登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙ （Ｈｓ００１９９８４１＿ｍ１， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製））に変えた以外は、前記実施例１と同様である。
【００４５】
＜評価工程＞
関節リウマチ患者の関節リウマチ活動性は、エタネルセプト投与前、及び投与２０週後のＤＡＳ２８［ＤＡＳ２８（０ｗ）、ＤＡＳ２８（２０ｗ）］で評価した。
エタネルセプトが有効か否かは、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を用いたＥＵＬＡＲ改善基準によって、反応性良好（ｇｏｏｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、中等度反応（ｍｏｄｅｒａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）、反応なし（ｎｏ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）とした。
【００４６】
投与２０週後におけるＥＵＬＡＲ改善基準に基づくエタネルセプトの有効性は、反応性良好が６例、中等度反応が６例、反応なしが３例であった。また、寛解例（ＤＡＳ２８（２０ｗ）＜２．６）は、５例であった。
【００４７】
−低値群と高値群との比較−
上記エタネルセプト投与関節リウマチ患者１５例につき、健常人より抽出の全ｃＤＮＡを鋳型ＤＮＡコントロールとして用いた検量線法によるリアルタイムＰＣＲ法で、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）を定量した。前記ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が０．６×１／２５より小さい場合を低値群(Ｌｏｗ)、０．６×１／２５以上の場合を高値群(Ｈｉｇｈ) として群分けし、ＤＡＳ２８（２０ｗ）を比較した結果、低値群と高値群とでは、ＤＡＳ２８（２０ｗ）に差は認められなかった（図３参照）。
【００４８】
−−Ｒ群とＮＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲ群（中等度反応＋反応性良好）と、ＮＲ群（反応なし）とした場合の分類を表７に示す。
【表７】
【００４９】
表７の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表８に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｍ／（Ｍ＋Ｏ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｐ／（Ｐ＋Ｎ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｍ／（Ｎ＋Ｍ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｐ／（Ｐ＋Ｏ）×１００
なお、上記式中Ｍ〜Ｐは、以下のとおりである。
Ｍ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｎ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、ＮＲ群に分類された症例
Ｏ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、Ｒ群に分類された症例
Ｐ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、ＮＲ群に分類された症例
【００５０】
【表８】
表８の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群の場合に、Ｒ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、７７．８％と低く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することは適切ではないことが示された。
【００５１】
−−ＧＲ群とＮＧＲ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＧＲ群（反応性良好）と、ＮＧＲ群（反応なし＋中等度反応）とした場合の分類を表９に示す。
【表９】
【００５２】
表９の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表１０に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｑ／（Ｑ＋Ｓ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｔ／（Ｔ＋Ｒ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｑ／（Ｒ＋Ｑ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｔ／（Ｔ＋Ｓ）×１００
なお、上記式中Ｑ〜Ｔは、以下のとおりである。
Ｑ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｒ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
Ｓ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、ＧＲ群に分類された症例
Ｔ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、ＮＧＲ群に分類された症例
【００５３】
【表１０】
【００５４】
表１０の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群の場合に、ＧＲ群となることを予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、３３．３％と低く、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することは適切ではないことが示された。
【００５５】
−−Ｒｅ群とＮｒｅ群との比較−−
前記低値群(Ｌｏｗ)、及び前記高値群(Ｈｉｇｈ)について、更にＲｅ（ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：寛解）群と、Ｎｒｅ（ｎｏｎ−ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ：非寛解）群とした場合の分類を表１１に示す。
【表１１】
【００５６】
表１１の分類をもとに、感度、特異度、陽性予測率、及び陰性予測率を以下の式で算出した。結果を表１２に示す。
感度（Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）（％）＝Ｕ／（Ｕ＋Ｗ）×１００
特異度（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）（％）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｖ）×１００
陽性予測率（ＰＰＶ）（％）＝Ｕ／（Ｖ＋Ｕ）×１００
陰性予測率（ＮＰＶ）（％）＝Ｘ／（Ｘ＋Ｗ）×１００
なお、上記式中Ｕ〜Ｘは、以下のとおりである。
Ｕ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｖ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
Ｗ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、Ｒｅ群に分類された症例
Ｘ：ＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群であり、Ｎｒｅ群に分類された症例
【００５７】
【表１２】
表１２の結果から、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が低値群の場合に、寛解（Ｒｅ群となる）を予測する陽性予測率（ＰＰＶ）は、２２．２％と低かった。また、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ５／β−アクチン）が高値群の場合に、寛解を否定する陰性予測率（ＮＰＶ）も５０．０％と低かった。そのため、エタネルセプト投与前のＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標として、寛解を予測することは適切ではないことが示された。
【００５８】
（比較例１：既報告との比較）
エタネルセプトの有効性について、マイクロアレイ法とクラスター分析とを用いて予測したＫｏｃｚａｎらの報告（Ｋｏｃｚａｎ Ｄ， ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ Ｔｈｅｒ ２００８； １０（３）： Ｒ５０）と、本発明とを比較した（表１３参照）。
前記報告は、エタネルセプト投与前と、エタネルセプト投与３ヶ月後との２ポイントにおけるＤＡＳ２８を、マイクロアレイとアルゴリズムとを用いて解析する後ろ向き試験であり、その減少量（ΔＤＡＳ）が１．２未満を有効と定義した場合の陽性予測率（ＰＰＶ）は、８９％（７転写物）、９５％（１０転写物）であった。
一方、上述した実施例１は、エタネルセプト投与前のワンポイントにおけるＤＡＳ２８を解析する前向き試験であり、前記Ｋｏｃｚａｎらの報告と同じ定義で陽性予測率を算出すると、１００％と高かった。更に、ＤＡＳ２８が２．６未満を寛解と定義した場合の陽性予測率（ＰＰＶ）は１００％、陰性予測率（ＮＰＶ）は８３．３％と高かった。
上述した実施例１は、エタネルセプト投与前の血中ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量（ＡＤＡＭＴＳ４／β−アクチン）によって、エタネルセプト投与２０週後におけるエタネルセプトの有効性、及び寛解を定量化して推測できる点で優れている。
【表１３】
【００５９】
前記実施例１の結果から、ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対するエタネルセプトの薬効を予測することができるだけでなく、エタネルセプト投与による寛解をも予測可能であることが示された。
また、前記参考実験１の結果から、同じＡＤＡＭＴＳファミリーに属する遺伝子であるＡＤＡＭＴＳ５の含有量を指標としては、エタネルセプトの薬効、及び寛解を予測することができないことが示された。
前記実施例１、前記参考実験１、及び前記比較例１の結果から、本発明の薬効予測方法は、エタネルセプト投与前のワンポイントにおけるＡＤＡＭＴＳ４という単一遺伝子のみであってもエタネルセプト投与による寛解を含めた有効性を予測できる点で他の方法よりも優れている。
【産業上の利用可能性】
【００６０】
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法は、前記薬投与前のワンポイントにおけるＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができるので、医学的診断、及び治療の分野において、好適に利用できる。
本発明の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置は、前記薬投与前のワンポイントにおけるＡＤＡＭＴＳ４の含有量によって、確実性が高く、かつ、簡便に予測すること、及び前記薬を投与した後における関節リウマチの活動性を予測することができ、また、前記薬がより確実に効く症例に薬を投与することで無駄な副作用を回避することができるので、医学的診断、及び治療の分野において、好適に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項２】
可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である請求項１に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項３】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である請求項１から２のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項４】
ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する請求項３に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項５】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項６】
可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である請求項５に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項７】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である請求項５から６のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する請求項７に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項１】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する工程と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する工程と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項２】
可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である請求項１に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項３】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である請求項１から２のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項４】
ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する請求項３に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測方法。
【請求項５】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量を測定する手段と、
前記ＡＤＡＭＴＳ４の含有量を指標として、関節リウマチに対して可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が有効か否かを評価する手段と、
を含むことを特徴とする関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項６】
可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬が、エタネルセプト（Ｅｔｅｒｎｅｒｃｅｐｔ（ＥＴＮ））である請求項５に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項７】
被検体由来の試料中のＡＤＡＭＴＳ４の含有量が、ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量である請求項５から６のいずれかに記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ４のｍＲＮＡの発現量をリアルタイムＰＣＲ法で測定する請求項７に記載の関節リウマチに対する可溶性ＴＮＦα／ＬＴαレセプター薬の薬効予測装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１７２３０７（Ｐ２０１０−１７２３０７Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２０９１５（Ｐ２００９−２０９１５）
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月３０日（２００９．１．３０）
【出願人】（５０４０１３７７５）学校法人 埼玉医科大学 (39)
【Ｆターム（参考）】
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