関節疾患及び関節損傷を治療する関節内補充法
関節内補充薬用のヒドロゲルを作製する方法であって、アルギネートの溶液を準備する工程と、６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンを含む溶液を準備する工程と、前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％（ｗ／ｖ）〜１．４％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含み、前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、前記カチオンを含む溶液から重合したビーズを単離する工程とを含む、関節内補充薬用のヒドロゲルを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンとアルギネートとの混合物を含む球状ヒドロゲルビーズを作製する方法に関する。
【０００２】
本発明は、関節障害、特に変形性関節症を治療するための新規の補充法及び組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）は痛みを伴う進行性変性障害であり、関節内の軟骨の破壊、関節中に存在する滑液の劣化、及び結果として生じる骨硬化を特徴とする。
【０００４】
変形性関節症は年齢とともに増加し、６０歳以上での確率は６０％を超える。
【０００５】
現在、ＯＡに伴う機械的な痛みを緩和する（remediate）ための現行療法は一般に、鎮痛薬若しくは抗炎症剤の投与による治療的療法、又は部分的若しくは完全な関節の置換による外科的療法のいずれかである。代替的なアプローチは、摩擦及び痛みを軽減する生体適合性の粘性（例えばヒアルロン酸）潤滑剤を関節内に注射する関節内補充療法である。
【０００６】
関節内補充療法は、関節を潤滑化し保護する滑液を補充するために用いられる。実際には、ＯＡ患者では、滑液はヒアルロナン（又はヒアルロン酸ＨＡの塩）の濃度及び分子量（Ｍｗ）の低下によって修正されている。
【０００７】
高分子量のＨＡ製剤を含む関節内注射液が現在利用可能であり、膝、股関節（hip）、母指手根中手関節又は足首を治療するために使用されている。これらの製剤は、１回（Ｄｕｒｏｌａｎｅ（商標）、Q-Med AB、ウプサラ、スウェーデン）、３回（Ｓｙｎｖｉｓｃ（商標）、高分子量架橋ＨＡ、Ｏｒｔｈｏｖｉｓｃ（商標））〜５回（Ｈｙａｌｇａｎ（商標）、Ｓｕｐａｒｔｚ（商標））の関節内（ＩＡ）注射（その関節に応じて、１回の注射につき５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのＨＡを含有する注射液１ｍｌ〜３ｍｌ）を必要とする。
【０００８】
【表１】
【０００９】
ＨＡ製剤は、例えばＨＡ源（動物由来又は細菌性）、ＨＡの濃度及びＭｗ、並びにもしあれば用いられる化学的架橋の種類及び程度を含む多数の特徴に違いがある。通常、大半の注射用ＨＡ製剤は、一度注射すると、数時間〜数日の滞留半減期を有する。
【００１０】
幾つかの研究によって上述の製品の有効性が比較され、痛みの顕著な減少及び膝ＯＡ患者の機能改善について異なった結論が出されている。一方では、プラセボ注射と比較して良くても僅かな効果しかないと結論付けられている。他方では、上記の製品のうち１つを毎週３回〜５回注射することによってＯＡ患者の痛み及び機能状態が大幅に改善されること、並びに改善の始まりが３週間〜４週間遅れたが、効果が少なくとも６ヶ月間、治療中止後まで持続し得ることが観察されている。他方では、ＯＡ症状に対する有益な効果が膝ＯＡだけでなく足首ＯＡ又は母指手根中手関節ＯＡについても観察され、同時に副作用も観察されている。
【００１１】
さらに、臨床効果は１週目と迅速な場合があり、６ヶ月以上持続し得るが、いずれの場合も、主に大半のＨＡ製剤の短い滞留半減期のために、変形性関節症の痛みに対する長期にわたる（６ヶ月〜１年の）効果には複数回の注射が不可欠である。
【００１２】
最後に、特許文献１は、不溶性のコアセルベートを生じない、アルギネートとキトサンとの混合物の多糖類組成物による関節内補充療法を記載している。コアセルベートは、ヒアルロン酸（ポリアニオン）又はアルギネート等の他の多糖類との相溶性を困難にする、キトサンのポリカチオン性に起因する。特許文献１によると、キトサン及びアルギネート等の多糖類の沈殿／コアセルベーションは、注射用組成物としてのその調合を妨げる。
【００１３】
特許文献１では、少なくとも４０％という高い誘導体化度を有するキトサンとアルギネートとの水性混合物を含む組成物が、したがって不溶性のコアセルベートを生じることなく高度に粘性であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３５１１４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
力学的歪みに対して軟骨を保護し、複数回の注射を必要とすることなくＯＡ患者に効果的な症状緩和をもたらす新規の関節内補充薬製品を開発すること、及び副作用を回避することが引き続き必要とされている。
【００１６】
本発明者らは今回、アルギネートと、低分子量であり、コアセルベートであるキトサンとを含む均質なヒドロゲルマトリックスを作製する新規の方法を見出した。この新規の方法によって得ることのできる生じたアルギネート／キトサンビーズは、関節内補充に使用しても依然として驚くべきことに均質かつ安定なままである。
【００１７】
本発明者らは今回、滑液の粘性を増大させることなく関節内で長期の滞留時間（少なくとも２週間）を有するキトサン／アルギネートビーズの単回関節内補充のための新規の方法及び組成物を見出した。
【００１８】
上述の概要及び以下の説明は特許請求される発明を限定するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一態様は、ヒドロゲルマトリックスを作製する方法であって、
アルギネートの溶液を準備する工程と、
６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンを含む溶液を準備する工程と、
前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％（ｗ／ｖ）〜１．４％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含み、
前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、
前記カチオンを含む溶液からゲル化ビーズを単離する工程と
を含む、ヒドロゲルマトリックスを作製する方法に関する。
【００２０】
本発明の方法の或る特定の実施の形態では、混合溶液の液滴をＳｒ2+イオンの溶液に導入する。
【００２１】
本方法の特定の実施の形態では、混合溶液は０．６％のキトサンを含み、かつ／又は１．２％のアルギネートを含む。
【００２２】
本発明の方法の特定の実施の形態では、混合溶液中のアルギネートとキトサンとの比率が１．４〜２．８、又は１．７５〜２．２５、又は約２である。
【００２３】
本発明の方法の特定の実施の形態では、キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有し、かつ／又は動物起源若しくは好ましくは植物起源である。
【００２４】
本発明の方法の他の特定の実施の形態では、方法はビーズを感熱性ヒドロゲル中に混合する工程を更に含む。ここで、ビーズとヒドロゲルとの比率は例えば５／１〜１／１、又は４／１〜２／１である。
【００２５】
本発明の方法の他の特定の実施の形態では、ビーズの形成を、液滴を針に通して直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍのビーズを得ることによって行う。
【００２６】
本発明の別の態様は、球状ヒドロゲルビーズであって、キトサンとアルギネートとの均質混合物を含み、上記に記載のような方法によって得ることができる、球状ヒドロゲルビーズに言及する。
【００２７】
本発明の別の態様は、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズであって、キトサンとアルギネートとの均質混合物を含み、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含む、例えば該ビーズが１．２％のアルギネートを含む、又は例えば該ビーズが０．６％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズに言及する。
【００２８】
本発明のビーズの特定の実施の形態では、アルギネート／キトサンの比率は１．４〜２．８、好ましくは１．７５〜２．２５、最も好ましくは１．８〜２．２である。
【００２９】
本発明のビーズの他の特定の実施の形態では、キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有し、かつ／又は動物起源若しくは植物起源である。
【００３０】
本発明は、アルギネートと６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンとの均質混合物を含む、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬であって、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬にも関する。
【００３１】
関節内補充薬は、例えば多糖類ヒドロゲル、特にキトサンヒドロゲルのような粘性熱ゲル化ゲルを更に含み得る。
【００３２】
多糖類とは、グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンから構成される繰り返し二糖単位を有するとして知られるヒアルロン酸、アルギネート並びにキトサン等の生体高分子を意味する。
【００３３】
キトサンは、キチン及び甲殻類の外骨格の主要構成成分の化学的脱アセチル化によってだけでなく、キノコの細胞壁（mushrooms wall）からも得られる、天然に広く入手可能な多糖類である。キトサンは、Ｄ−グルコサミン単位及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位から構成される。
【００３４】
関節内補充薬は、非ステロイド性抗炎症薬、麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、コルチコステロイド、抗悪性腫瘍薬、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ビタミン、ミネラル、栄養補助成分からなる群から選択される成分も含み得る。
【００３５】
関節内補充薬は、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、例えばジクロフェナク（商標）、イブプロフェン（商標）、ピロキシカム（商標）；麻酔薬、例えばリドカイン（商標）及びブピバカイン（商標）；オピオイド鎮痛薬、例えばコデイン及びモルヒネ；コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン及びプレドニゾン；抗悪性腫瘍剤、例えばメトトレキサート（商標）；抗ウイルス剤、例えばアシクロビル（商標）及びビダラビン（商標）；モノクローナル抗体、例えばＨｕｍｉｒａ（商標）及びキメラモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ（商標）を含む更なる活性成分又は不活性成分を含有していてもよい。関節内注射用補充薬は、細胞、タンパク質、ＤＮＡ、ミネラル、例えばセレン、ストロンチウム、ビタミン、例えばトコフェロール、栄養補助成分、例えばクルクミン、又は他の望ましい生物活性物質等の成分を含有していてもよい。
【００３６】
本発明は、被験体の関節障害を治療し、関節損傷又は関節疾患（変形性関節症及び外傷性軟骨病変を含む）に伴う痛み及び不快感を軽減する補充法にも関する。
【００３７】
かかる関節疾患の例としては、変形性関節症（一次性（特発性）又は二次性）、関節リウマチ、関節損傷（例えば外傷性の又は反復運動による損傷）、軟骨病理（例えば軟骨石灰化症、軟骨軟化症）、敗血症性関節炎が挙げられる。本発明は、かかる疾患に伴う痛みを軽減して、骨及び軟骨の病変部を修復し、疾患の進行を遅らせる方法を更に提供する。
【００３８】
関節障害を治療する補充法は、本発明に従って調製される関節内補充薬を投与することを含む。
【００３９】
補充法は、治療効果をもたらすのに十分な量の補充薬の単回又は複数回の関節内注射又は埋め込みを含み得る。
【００４０】
関節内注射又は埋め込みは、例えば関節鏡検査によって又は注射器等の注射器具を用いて、ヒト又は非ヒト哺乳動物の骨及び／又は軟骨の欠損部において直接行われる。
【００４１】
投与部位の例としては、膝、肩、足首、顎関節（temporomandibular）及び手根中手関節、肘、股関節、手首、椎間板が挙げられる。
【００４２】
本発明は、１回量の補充薬を有する予充填された単回使用注射器を含む補充デバイスを更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の方法に従って得られたビーズを示す図である。
【図２】アルギネートビーズの断面を示す図である（Ａ）。キトサン／アルギネートビーズ（キトサン：濃灰色の柱状構造；アルギネート：薄灰色の背景）の断面を示す図である（Ｂ）。
【図３】キトサンヒドロゲル中に組み込まれたキトサン／アルギネートビーズを低倍率で示す図である。
【図４】０．６％キトサン／１．２％アルギネートビーズ（マッシュルーム（A. bisporus）キトサン（４０ｋＤ））を含む感熱性キトサンヒドロゲルの埋め込みを示す図である。
【図５】埋め込みの１５日後の埋め込み物の組織学的評価を示す図である。Ａ：軟骨下骨；Ｂ：細胞が定着したヒドロゲル；Ｃ：細胞が定着したキトサン／アルギネートビーズ；Ｄ：キトサンの小腔（lacunae）中に組み込まれた細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明の一態様は、ヒドロゲルマトリックスを作製する方法に関する。この方法は、
アルギネートの溶液を準備する工程と、
６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンの溶液を準備する工程と、
前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％〜１．４％のアルギネートを含み、
前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、
前記カチオンを含む溶液からゲル化ビーズを単離する工程と
を含む。
【００４５】
本方法によって得られるヒドロゲルは、アルギン酸カルシウム及びキトサンの均質なマトリックスをもたらす。
【００４６】
本発明において得られるマトリックスは、或る成分のコアを有し、それが別の成分の層で被覆されている従来技術のマトリックスとは異なる。
【００４７】
本発明において得られるマトリックスは、マトリックスの空隙率を、或る特定の程度の空隙率を得るために初めに凍結乾燥されるマトリックスと比較して、より正確に規定することができるという利点を有する。
【００４８】
本発明において得られるマトリックスは、アルギネートマトリックス中に均質な網状構造を自発的に形成する低分子量のキトサン（特に１５ｋＤＡ〜５０ｋＤＡ）によって構成されるという利点を有する。
【００４９】
実施例の項で示されるように、ヒドロゲルを調製するために使用されるアルギネート及びキトサンを、殺菌効果を有する強アルカリ性又は強酸性の緩衝液に溶解させる。これは本発明の更なる利点である。
【００５０】
本発明に従う方法では、アルギネート溶液とキトサン溶液とを混合して、種々の濃度を有するビーズを得ることができる。本発明の特定の実施形態は、カルシウムイオン又はストロンチウムイオンによるゲル化の前の組成が、０．４％（ｗ／ｖ）、０．４５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．５５％（ｗ／ｖ）、０．６０％（ｗ／ｖ）、０．６５％（ｗ／ｖ）、０．７０％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）又は０．８０％（ｗ／ｖ）のキトサンと、それとは独立して０．９％（ｗ／ｖ）、０．９５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．１０５％（ｗ／ｖ）、０．１１％（ｗ／ｖ）、０．１１５％（ｗ／ｖ）、０．１２％（ｗ／ｖ）、０．１２５％（ｗ／ｖ）、０．１３％（ｗ／ｖ）、０．１３５％（ｗ／ｖ）、０．１４％（ｗ／ｖ）、０．１４５％（ｗ／ｖ）又は１．５％（ｗ／ｖ）のアルギネートとを含むビーズに関する。特定の実施形態では、キトサンの濃度は０．５％〜０．７％又は０．５５％〜０．６５％の範囲である。他の特定の実施形態では、アルギネートの濃度は１．％〜１．４％又は１．２５％〜１．３５％の範囲である。ヒドロゲルの特定の実施形態は、約０．６％のキトサンと約１．２％のアルギネートとを含む。
【００５１】
本発明の方法及び組成物の更なる実施形態は、混合溶液中のアルギネートとキトサンとの比率が１．４〜２．８、より具体的には１．５〜２．７、より具体的には１．６〜２．６、又は１．７５〜２．２５であるヒドロゲル組成物及びそれから得られるビーズに関する。この比率の具体的な値は約１．９、１．９５、２．０、２．０５及び１である。
【００５２】
本発明の方法では、ビーズの平均サイズを、カルシウム溶液又はストロンチウム溶液に導入する液滴を形成するために使用される針の直径を調節することによって適合させ、経験的に決定することができる。ここでは直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍのビーズが想定される。これらの寸法は、取り扱いの容易さと、ビーズ中への栄養素（nutrients）の拡散との折り合いをつける。
【００５３】
本発明によるキトサンは、甲殻類（エビの殻）又はイカ等の種々の動物源から単離することができる。代替的には、キトサンは植物起源、より具体的には、ケカビ（Mucoralean）株、ムコール・ラセモサス（Mucor racemosus）及びクニンガメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、ゴングロネラ・ブトレリ（Gongronella butleri）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、リゾプス・オリーゼ（Rhizopus oryzae）、シイタケ（Lentinus edodes）、ヒマラヤヒラタケ（Pleurotus sajor-caju）、チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）又はマッシュルーム（Agaricus bisporus）等の真菌起源であってもよい。
【００５４】
キトサンは更に、様々な分子量で存在する。ここで、キトサンの鎖長はヒドロゲルの三次元構造に関与し得る。本発明において使用される典型的なキトサンは、１５ｋＤ〜５０ｋＤ、より具体的には３５ｋＤ〜４５ｋＤの平均分子量を有し得る。
【００５５】
上記に記載のようなビーズを製造する方法は、キトサンとアルギネートとの均質混合物を含む球状ヒドロゲルビーズの形成をもたらす。
【００５６】
特定の実施形態では、補充薬はビーズと粘性ゲルとによって形成される二相性補充薬材料として調合される。この補充薬はポリマーマトリックス（「ゲル」）と、キトサン及びアルギネートを含む球状三次元ビーズとを含む。
【００５７】
これにより、埋め込みの際に宿主の組織又は器官における最適な空間分布を確実にする、埋め込み型又は注射用のゲルを調合することが可能となる。本明細書において、本発明の方法によって調製されるビーズとともに補充薬に通常使用されるゲルは、感熱性ゲルである。これらのゲルは常温で（患者への導入に使用される器具内で）液体のままであるが、約３７℃の体内に導入されると固体となる。このｉｎ ｓｉｔｕゲル化によってビーズがその空間分布に維持される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、３７℃に加熱した際にビーズがかかるヒドロゲル中に均質に分布することが実証された。感熱性ヒドロゲルの例としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）が挙げられる。その具体的な種類はキトサンである。
【００５８】
理論に束縛されるものではないが、マイクロビーズ内のキトサンの網状構造によって、アルギネートのみから作られたビーズよりも圧縮されにくく、圧力に対する抵抗性が高いというような特定の機械的特性がビーズに与えられると考えられる。本発明のマトリックスは、アルギネートゲル内に相互接続したキトサン柱状構造をもたらし、ｐＨが中性の水性媒体をもたらすことによって細胞培養に適した環境を生じる。
【００５９】
かかる柱状構造は、アルギネートと混合すると、かご状構造、網状構造又は柱状構造を構築するコアセルベートを形成する不溶性キトサンによって得られる。柱状構造の厚さ及び長さは多様であり、ビーズに表現型安定化、変形能、弾性及び圧縮率等の特定の生物学的特性及び機械的特性を与える。
【実施例】
【００６０】
実施例１．アルギネート／キトサンビーズの調製
キトサン（最終０．６％）とアルギネート（最終１．２％）との均質混合物からビーズを調製する。この２つの溶液は混合前に別個に調製する。アルギネート及びキトサンの溶液は以下のように調製する：０．１６Ｍ ＮａＯＨ中の２．４％（Ｗ／ｖ）アルギネート溶液及び１．６６６Ｍ ＨＡｃ中の１．３３３％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を調製する。１０容量のアルギネート溶液に、１容量の１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）溶液を添加する。均質化の後、９容量のキトサン溶液を規則的に激しく混合しながら徐々に添加する。このキトサン／アルギネート溶液をゆっくりと２５ゲージ針に通して１０２ｍＭ ＣａＣｌ2溶液（Sigma-Aldrich、ボルネム、ベルギー）中に滴加する。即座のゲル化の後、ビーズを更に１０分間このＣａＣｌ2溶液中でゲル化させる。顕微鏡スケールでは、キトサン（エオシンによって赤色に染色される）は、様々な厚さ及び長さの柱状構造又は繊維構造から構成されるかご状構造を形成する（図２及び図３を参照されたい）。ここで、その隙間はアルギネート（紫色にヘマトキシリン染色される）によって満たされる。
【００６１】
実施例２．感熱性ヒドロゲル中でのビーズの調合
ビーズを植物性（マッシュルーム）キトサンヒドロゲル（Kitozyme、アルール、ベルギー）と混合する。この工程はヒドロゲルのゲル化を回避するために２７℃未満で行う。３／１（ｖ／ｖ）というビーズ／ヒドロゲルの比率を用いた。
【００６２】
実施例３．動物モデルにおける埋め込み
実施例２に記載のゲルを、関節の軟骨下骨及び軟骨が欠損したウサギに埋め込んだ（図４）。
【００６３】
１５日間の埋め込みの後に、埋め込み物を評価した（図５）。病変部は埋め込み物で満たされたままである。ビーズ及び粘性ヒドロゲルは、損傷関節への注射の少なくとも２週間後、一定に保たれたままであり、安全性プロファイルを維持している。
【００６４】
さらに、埋め込み物に下層の骨髄に由来する細胞が定着していることが観察される。細胞は固定された感熱性キトサンヒドロゲル（Ｂ）及びキトサン／アルギネートビーズ（Ｃ）（キトサン柱状構造はＤで示される）内に見られた。この試験により、この二相性埋め込み物を容易に処理及び移植することができることが確認される。埋め込み物の生分解性によって埋め込み後の漸進的な（progressive）吸収が確実となる。
【００６５】
実施例４．ビーズ形成におけるキトサン分子量の影響
種々の分子量の天然キトサンを本発明に従うプロセスに使用した。混合溶液（軟骨細胞を含む）のｐＨ及び粘性等の種々の物理的パラメーターを測定した。得られるヒドロゲルのオスモル濃度は当該技術分野で既知の技法に従って測定する。
【００６６】
【表２】
【００６７】
混合ビーズは５５ｋＤａ未満の天然キトサンを用いて作製することができると結論付けた。例えば、９１ｋＤＡでは、ビーズを本発明に記載のプロセスを用いて作製することができず、アルギネート１．２％及びキトサン０．６％の比率ではキトサン溶液は粘性が高すぎる。したがって、キトサンの分子量の選択は本発明において不可欠な要素である。
【００６８】
実施例５：針を用いてヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法
針を使用して、関節内補充薬を送達した。関節内投与のために、１ｍｌ当たり１０００個〜２００００個のビーズ（０．１μｍ〜０．５μｍ）という密度で、１回の注射につきおよそ１ｍｌ〜２ｍｌの容量で補充薬を滑液腔内に送達する。例えば、１００００個のビーズ（０．２μｍ）を含有する１ｍｌの生理的液体（physiological liquid）を、微細（例えば１４ゲージ〜２２ゲージ、好ましくは１８ゲージ〜２２ゲージ）針を用いて膝関節に注射する。
【００６９】
実施例６：トロカールを用いてヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法
トロカールを使用して、補充薬を小〜中程度の軟骨欠損部（１ｃｍ2未満）に送達した。埋め込みのために、補充薬を５個〜５０個のビーズ（直径１ｍｍ〜５ｍｍ）という密度でトロカールを通して軟骨内に送達する。例えば、４個のビーズ（直径１ｍｍ）を直径０．５ｃｍ、深さ１ｍｍの外傷性軟骨病変部に埋め込む。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キトサンとアルギネートとの混合物を含む球状ヒドロゲルビーズを作製する方法に関する。
【０００２】
本発明は、関節障害、特に変形性関節症を治療するための新規の補充法及び組成物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）は痛みを伴う進行性変性障害であり、関節内の軟骨の破壊、関節中に存在する滑液の劣化、及び結果として生じる骨硬化を特徴とする。
【０００４】
変形性関節症は年齢とともに増加し、６０歳以上での確率は６０％を超える。
【０００５】
現在、ＯＡに伴う機械的な痛みを緩和する（remediate）ための現行療法は一般に、鎮痛薬若しくは抗炎症剤の投与による治療的療法、又は部分的若しくは完全な関節の置換による外科的療法のいずれかである。代替的なアプローチは、摩擦及び痛みを軽減する生体適合性の粘性（例えばヒアルロン酸）潤滑剤を関節内に注射する関節内補充療法である。
【０００６】
関節内補充療法は、関節を潤滑化し保護する滑液を補充するために用いられる。実際には、ＯＡ患者では、滑液はヒアルロナン（又はヒアルロン酸ＨＡの塩）の濃度及び分子量（Ｍｗ）の低下によって修正されている。
【０００７】
高分子量のＨＡ製剤を含む関節内注射液が現在利用可能であり、膝、股関節（hip）、母指手根中手関節又は足首を治療するために使用されている。これらの製剤は、１回（Ｄｕｒｏｌａｎｅ（商標）、Q-Med AB、ウプサラ、スウェーデン）、３回（Ｓｙｎｖｉｓｃ（商標）、高分子量架橋ＨＡ、Ｏｒｔｈｏｖｉｓｃ（商標））〜５回（Ｈｙａｌｇａｎ（商標）、Ｓｕｐａｒｔｚ（商標））の関節内（ＩＡ）注射（その関節に応じて、１回の注射につき５ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのＨＡを含有する注射液１ｍｌ〜３ｍｌ）を必要とする。
【０００８】
【表１】
【０００９】
ＨＡ製剤は、例えばＨＡ源（動物由来又は細菌性）、ＨＡの濃度及びＭｗ、並びにもしあれば用いられる化学的架橋の種類及び程度を含む多数の特徴に違いがある。通常、大半の注射用ＨＡ製剤は、一度注射すると、数時間〜数日の滞留半減期を有する。
【００１０】
幾つかの研究によって上述の製品の有効性が比較され、痛みの顕著な減少及び膝ＯＡ患者の機能改善について異なった結論が出されている。一方では、プラセボ注射と比較して良くても僅かな効果しかないと結論付けられている。他方では、上記の製品のうち１つを毎週３回〜５回注射することによってＯＡ患者の痛み及び機能状態が大幅に改善されること、並びに改善の始まりが３週間〜４週間遅れたが、効果が少なくとも６ヶ月間、治療中止後まで持続し得ることが観察されている。他方では、ＯＡ症状に対する有益な効果が膝ＯＡだけでなく足首ＯＡ又は母指手根中手関節ＯＡについても観察され、同時に副作用も観察されている。
【００１１】
さらに、臨床効果は１週目と迅速な場合があり、６ヶ月以上持続し得るが、いずれの場合も、主に大半のＨＡ製剤の短い滞留半減期のために、変形性関節症の痛みに対する長期にわたる（６ヶ月〜１年の）効果には複数回の注射が不可欠である。
【００１２】
最後に、特許文献１は、不溶性のコアセルベートを生じない、アルギネートとキトサンとの混合物の多糖類組成物による関節内補充療法を記載している。コアセルベートは、ヒアルロン酸（ポリアニオン）又はアルギネート等の他の多糖類との相溶性を困難にする、キトサンのポリカチオン性に起因する。特許文献１によると、キトサン及びアルギネート等の多糖類の沈殿／コアセルベーションは、注射用組成物としてのその調合を妨げる。
【００１３】
特許文献１では、少なくとも４０％という高い誘導体化度を有するキトサンとアルギネートとの水性混合物を含む組成物が、したがって不溶性のコアセルベートを生じることなく高度に粘性であると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００７／１３５１１４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
力学的歪みに対して軟骨を保護し、複数回の注射を必要とすることなくＯＡ患者に効果的な症状緩和をもたらす新規の関節内補充薬製品を開発すること、及び副作用を回避することが引き続き必要とされている。
【００１６】
本発明者らは今回、アルギネートと、低分子量であり、コアセルベートであるキトサンとを含む均質なヒドロゲルマトリックスを作製する新規の方法を見出した。この新規の方法によって得ることのできる生じたアルギネート／キトサンビーズは、関節内補充に使用しても依然として驚くべきことに均質かつ安定なままである。
【００１７】
本発明者らは今回、滑液の粘性を増大させることなく関節内で長期の滞留時間（少なくとも２週間）を有するキトサン／アルギネートビーズの単回関節内補充のための新規の方法及び組成物を見出した。
【００１８】
上述の概要及び以下の説明は特許請求される発明を限定するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明の一態様は、ヒドロゲルマトリックスを作製する方法であって、
アルギネートの溶液を準備する工程と、
６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンを含む溶液を準備する工程と、
前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％（ｗ／ｖ）〜１．４％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含み、
前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、
前記カチオンを含む溶液からゲル化ビーズを単離する工程と
を含む、ヒドロゲルマトリックスを作製する方法に関する。
【００２０】
本発明の方法の或る特定の実施の形態では、混合溶液の液滴をＳｒ2+イオンの溶液に導入する。
【００２１】
本方法の特定の実施の形態では、混合溶液は０．６％のキトサンを含み、かつ／又は１．２％のアルギネートを含む。
【００２２】
本発明の方法の特定の実施の形態では、混合溶液中のアルギネートとキトサンとの比率が１．４〜２．８、又は１．７５〜２．２５、又は約２である。
【００２３】
本発明の方法の特定の実施の形態では、キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有し、かつ／又は動物起源若しくは好ましくは植物起源である。
【００２４】
本発明の方法の他の特定の実施の形態では、方法はビーズを感熱性ヒドロゲル中に混合する工程を更に含む。ここで、ビーズとヒドロゲルとの比率は例えば５／１〜１／１、又は４／１〜２／１である。
【００２５】
本発明の方法の他の特定の実施の形態では、ビーズの形成を、液滴を針に通して直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍのビーズを得ることによって行う。
【００２６】
本発明の別の態様は、球状ヒドロゲルビーズであって、キトサンとアルギネートとの均質混合物を含み、上記に記載のような方法によって得ることができる、球状ヒドロゲルビーズに言及する。
【００２７】
本発明の別の態様は、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズであって、キトサンとアルギネートとの均質混合物を含み、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含む、例えば該ビーズが１．２％のアルギネートを含む、又は例えば該ビーズが０．６％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズに言及する。
【００２８】
本発明のビーズの特定の実施の形態では、アルギネート／キトサンの比率は１．４〜２．８、好ましくは１．７５〜２．２５、最も好ましくは１．８〜２．２である。
【００２９】
本発明のビーズの他の特定の実施の形態では、キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有し、かつ／又は動物起源若しくは植物起源である。
【００３０】
本発明は、アルギネートと６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンとの均質混合物を含む、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬であって、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬にも関する。
【００３１】
関節内補充薬は、例えば多糖類ヒドロゲル、特にキトサンヒドロゲルのような粘性熱ゲル化ゲルを更に含み得る。
【００３２】
多糖類とは、グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンから構成される繰り返し二糖単位を有するとして知られるヒアルロン酸、アルギネート並びにキトサン等の生体高分子を意味する。
【００３３】
キトサンは、キチン及び甲殻類の外骨格の主要構成成分の化学的脱アセチル化によってだけでなく、キノコの細胞壁（mushrooms wall）からも得られる、天然に広く入手可能な多糖類である。キトサンは、Ｄ−グルコサミン単位及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン単位から構成される。
【００３４】
関節内補充薬は、非ステロイド性抗炎症薬、麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、コルチコステロイド、抗悪性腫瘍薬、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ビタミン、ミネラル、栄養補助成分からなる群から選択される成分も含み得る。
【００３５】
関節内補充薬は、例えば、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）、例えばジクロフェナク（商標）、イブプロフェン（商標）、ピロキシカム（商標）；麻酔薬、例えばリドカイン（商標）及びブピバカイン（商標）；オピオイド鎮痛薬、例えばコデイン及びモルヒネ；コルチコステロイド、例えばデキサメタゾン及びプレドニゾン；抗悪性腫瘍剤、例えばメトトレキサート（商標）；抗ウイルス剤、例えばアシクロビル（商標）及びビダラビン（商標）；モノクローナル抗体、例えばＨｕｍｉｒａ（商標）及びキメラモノクローナル抗体、例えばインフリキシマブ（商標）を含む更なる活性成分又は不活性成分を含有していてもよい。関節内注射用補充薬は、細胞、タンパク質、ＤＮＡ、ミネラル、例えばセレン、ストロンチウム、ビタミン、例えばトコフェロール、栄養補助成分、例えばクルクミン、又は他の望ましい生物活性物質等の成分を含有していてもよい。
【００３６】
本発明は、被験体の関節障害を治療し、関節損傷又は関節疾患（変形性関節症及び外傷性軟骨病変を含む）に伴う痛み及び不快感を軽減する補充法にも関する。
【００３７】
かかる関節疾患の例としては、変形性関節症（一次性（特発性）又は二次性）、関節リウマチ、関節損傷（例えば外傷性の又は反復運動による損傷）、軟骨病理（例えば軟骨石灰化症、軟骨軟化症）、敗血症性関節炎が挙げられる。本発明は、かかる疾患に伴う痛みを軽減して、骨及び軟骨の病変部を修復し、疾患の進行を遅らせる方法を更に提供する。
【００３８】
関節障害を治療する補充法は、本発明に従って調製される関節内補充薬を投与することを含む。
【００３９】
補充法は、治療効果をもたらすのに十分な量の補充薬の単回又は複数回の関節内注射又は埋め込みを含み得る。
【００４０】
関節内注射又は埋め込みは、例えば関節鏡検査によって又は注射器等の注射器具を用いて、ヒト又は非ヒト哺乳動物の骨及び／又は軟骨の欠損部において直接行われる。
【００４１】
投与部位の例としては、膝、肩、足首、顎関節（temporomandibular）及び手根中手関節、肘、股関節、手首、椎間板が挙げられる。
【００４２】
本発明は、１回量の補充薬を有する予充填された単回使用注射器を含む補充デバイスを更に提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】本発明の方法に従って得られたビーズを示す図である。
【図２】アルギネートビーズの断面を示す図である（Ａ）。キトサン／アルギネートビーズ（キトサン：濃灰色の柱状構造；アルギネート：薄灰色の背景）の断面を示す図である（Ｂ）。
【図３】キトサンヒドロゲル中に組み込まれたキトサン／アルギネートビーズを低倍率で示す図である。
【図４】０．６％キトサン／１．２％アルギネートビーズ（マッシュルーム（A. bisporus）キトサン（４０ｋＤ））を含む感熱性キトサンヒドロゲルの埋め込みを示す図である。
【図５】埋め込みの１５日後の埋め込み物の組織学的評価を示す図である。Ａ：軟骨下骨；Ｂ：細胞が定着したヒドロゲル；Ｃ：細胞が定着したキトサン／アルギネートビーズ；Ｄ：キトサンの小腔（lacunae）中に組み込まれた細胞。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明の一態様は、ヒドロゲルマトリックスを作製する方法に関する。この方法は、
アルギネートの溶液を準備する工程と、
６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンの溶液を準備する工程と、
前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％〜１．４％のアルギネートを含み、
前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、
前記カチオンを含む溶液からゲル化ビーズを単離する工程と
を含む。
【００４５】
本方法によって得られるヒドロゲルは、アルギン酸カルシウム及びキトサンの均質なマトリックスをもたらす。
【００４６】
本発明において得られるマトリックスは、或る成分のコアを有し、それが別の成分の層で被覆されている従来技術のマトリックスとは異なる。
【００４７】
本発明において得られるマトリックスは、マトリックスの空隙率を、或る特定の程度の空隙率を得るために初めに凍結乾燥されるマトリックスと比較して、より正確に規定することができるという利点を有する。
【００４８】
本発明において得られるマトリックスは、アルギネートマトリックス中に均質な網状構造を自発的に形成する低分子量のキトサン（特に１５ｋＤＡ〜５０ｋＤＡ）によって構成されるという利点を有する。
【００４９】
実施例の項で示されるように、ヒドロゲルを調製するために使用されるアルギネート及びキトサンを、殺菌効果を有する強アルカリ性又は強酸性の緩衝液に溶解させる。これは本発明の更なる利点である。
【００５０】
本発明に従う方法では、アルギネート溶液とキトサン溶液とを混合して、種々の濃度を有するビーズを得ることができる。本発明の特定の実施形態は、カルシウムイオン又はストロンチウムイオンによるゲル化の前の組成が、０．４％（ｗ／ｖ）、０．４５％（ｗ／ｖ）、０．５％（ｗ／ｖ）、０．５５％（ｗ／ｖ）、０．６０％（ｗ／ｖ）、０．６５％（ｗ／ｖ）、０．７０％（ｗ／ｖ）、０．７５％（ｗ／ｖ）又は０．８０％（ｗ／ｖ）のキトサンと、それとは独立して０．９％（ｗ／ｖ）、０．９５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）、０．１０５％（ｗ／ｖ）、０．１１％（ｗ／ｖ）、０．１１５％（ｗ／ｖ）、０．１２％（ｗ／ｖ）、０．１２５％（ｗ／ｖ）、０．１３％（ｗ／ｖ）、０．１３５％（ｗ／ｖ）、０．１４％（ｗ／ｖ）、０．１４５％（ｗ／ｖ）又は１．５％（ｗ／ｖ）のアルギネートとを含むビーズに関する。特定の実施形態では、キトサンの濃度は０．５％〜０．７％又は０．５５％〜０．６５％の範囲である。他の特定の実施形態では、アルギネートの濃度は１．％〜１．４％又は１．２５％〜１．３５％の範囲である。ヒドロゲルの特定の実施形態は、約０．６％のキトサンと約１．２％のアルギネートとを含む。
【００５１】
本発明の方法及び組成物の更なる実施形態は、混合溶液中のアルギネートとキトサンとの比率が１．４〜２．８、より具体的には１．５〜２．７、より具体的には１．６〜２．６、又は１．７５〜２．２５であるヒドロゲル組成物及びそれから得られるビーズに関する。この比率の具体的な値は約１．９、１．９５、２．０、２．０５及び１である。
【００５２】
本発明の方法では、ビーズの平均サイズを、カルシウム溶液又はストロンチウム溶液に導入する液滴を形成するために使用される針の直径を調節することによって適合させ、経験的に決定することができる。ここでは直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍのビーズが想定される。これらの寸法は、取り扱いの容易さと、ビーズ中への栄養素（nutrients）の拡散との折り合いをつける。
【００５３】
本発明によるキトサンは、甲殻類（エビの殻）又はイカ等の種々の動物源から単離することができる。代替的には、キトサンは植物起源、より具体的には、ケカビ（Mucoralean）株、ムコール・ラセモサス（Mucor racemosus）及びクニンガメラ・エレガンス（Cunninghamella elegans）、ゴングロネラ・ブトレリ（Gongronella butleri）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、リゾプス・オリーゼ（Rhizopus oryzae）、シイタケ（Lentinus edodes）、ヒマラヤヒラタケ（Pleurotus sajor-caju）、チゴサッカロミセス・ルーキシィ（Zygosaccharomyces rouxii）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）又はマッシュルーム（Agaricus bisporus）等の真菌起源であってもよい。
【００５４】
キトサンは更に、様々な分子量で存在する。ここで、キトサンの鎖長はヒドロゲルの三次元構造に関与し得る。本発明において使用される典型的なキトサンは、１５ｋＤ〜５０ｋＤ、より具体的には３５ｋＤ〜４５ｋＤの平均分子量を有し得る。
【００５５】
上記に記載のようなビーズを製造する方法は、キトサンとアルギネートとの均質混合物を含む球状ヒドロゲルビーズの形成をもたらす。
【００５６】
特定の実施形態では、補充薬はビーズと粘性ゲルとによって形成される二相性補充薬材料として調合される。この補充薬はポリマーマトリックス（「ゲル」）と、キトサン及びアルギネートを含む球状三次元ビーズとを含む。
【００５７】
これにより、埋め込みの際に宿主の組織又は器官における最適な空間分布を確実にする、埋め込み型又は注射用のゲルを調合することが可能となる。本明細書において、本発明の方法によって調製されるビーズとともに補充薬に通常使用されるゲルは、感熱性ゲルである。これらのゲルは常温で（患者への導入に使用される器具内で）液体のままであるが、約３７℃の体内に導入されると固体となる。このｉｎ ｓｉｔｕゲル化によってビーズがその空間分布に維持される。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験により、３７℃に加熱した際にビーズがかかるヒドロゲル中に均質に分布することが実証された。感熱性ヒドロゲルの例としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）が挙げられる。その具体的な種類はキトサンである。
【００５８】
理論に束縛されるものではないが、マイクロビーズ内のキトサンの網状構造によって、アルギネートのみから作られたビーズよりも圧縮されにくく、圧力に対する抵抗性が高いというような特定の機械的特性がビーズに与えられると考えられる。本発明のマトリックスは、アルギネートゲル内に相互接続したキトサン柱状構造をもたらし、ｐＨが中性の水性媒体をもたらすことによって細胞培養に適した環境を生じる。
【００５９】
かかる柱状構造は、アルギネートと混合すると、かご状構造、網状構造又は柱状構造を構築するコアセルベートを形成する不溶性キトサンによって得られる。柱状構造の厚さ及び長さは多様であり、ビーズに表現型安定化、変形能、弾性及び圧縮率等の特定の生物学的特性及び機械的特性を与える。
【実施例】
【００６０】
実施例１．アルギネート／キトサンビーズの調製
キトサン（最終０．６％）とアルギネート（最終１．２％）との均質混合物からビーズを調製する。この２つの溶液は混合前に別個に調製する。アルギネート及びキトサンの溶液は以下のように調製する：０．１６Ｍ ＮａＯＨ中の２．４％（Ｗ／ｖ）アルギネート溶液及び１．６６６Ｍ ＨＡｃ中の１．３３３％（ｗ／ｖ）キトサン溶液を調製する。１０容量のアルギネート溶液に、１容量の１Ｍ Ｈｅｐｅｓ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）溶液を添加する。均質化の後、９容量のキトサン溶液を規則的に激しく混合しながら徐々に添加する。このキトサン／アルギネート溶液をゆっくりと２５ゲージ針に通して１０２ｍＭ ＣａＣｌ2溶液（Sigma-Aldrich、ボルネム、ベルギー）中に滴加する。即座のゲル化の後、ビーズを更に１０分間このＣａＣｌ2溶液中でゲル化させる。顕微鏡スケールでは、キトサン（エオシンによって赤色に染色される）は、様々な厚さ及び長さの柱状構造又は繊維構造から構成されるかご状構造を形成する（図２及び図３を参照されたい）。ここで、その隙間はアルギネート（紫色にヘマトキシリン染色される）によって満たされる。
【００６１】
実施例２．感熱性ヒドロゲル中でのビーズの調合
ビーズを植物性（マッシュルーム）キトサンヒドロゲル（Kitozyme、アルール、ベルギー）と混合する。この工程はヒドロゲルのゲル化を回避するために２７℃未満で行う。３／１（ｖ／ｖ）というビーズ／ヒドロゲルの比率を用いた。
【００６２】
実施例３．動物モデルにおける埋め込み
実施例２に記載のゲルを、関節の軟骨下骨及び軟骨が欠損したウサギに埋め込んだ（図４）。
【００６３】
１５日間の埋め込みの後に、埋め込み物を評価した（図５）。病変部は埋め込み物で満たされたままである。ビーズ及び粘性ヒドロゲルは、損傷関節への注射の少なくとも２週間後、一定に保たれたままであり、安全性プロファイルを維持している。
【００６４】
さらに、埋め込み物に下層の骨髄に由来する細胞が定着していることが観察される。細胞は固定された感熱性キトサンヒドロゲル（Ｂ）及びキトサン／アルギネートビーズ（Ｃ）（キトサン柱状構造はＤで示される）内に見られた。この試験により、この二相性埋め込み物を容易に処理及び移植することができることが確認される。埋め込み物の生分解性によって埋め込み後の漸進的な（progressive）吸収が確実となる。
【００６５】
実施例４．ビーズ形成におけるキトサン分子量の影響
種々の分子量の天然キトサンを本発明に従うプロセスに使用した。混合溶液（軟骨細胞を含む）のｐＨ及び粘性等の種々の物理的パラメーターを測定した。得られるヒドロゲルのオスモル濃度は当該技術分野で既知の技法に従って測定する。
【００６６】
【表２】
【００６７】
混合ビーズは５５ｋＤａ未満の天然キトサンを用いて作製することができると結論付けた。例えば、９１ｋＤＡでは、ビーズを本発明に記載のプロセスを用いて作製することができず、アルギネート１．２％及びキトサン０．６％の比率ではキトサン溶液は粘性が高すぎる。したがって、キトサンの分子量の選択は本発明において不可欠な要素である。
【００６８】
実施例５：針を用いてヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法
針を使用して、関節内補充薬を送達した。関節内投与のために、１ｍｌ当たり１０００個〜２００００個のビーズ（０．１μｍ〜０．５μｍ）という密度で、１回の注射につきおよそ１ｍｌ〜２ｍｌの容量で補充薬を滑液腔内に送達する。例えば、１００００個のビーズ（０．２μｍ）を含有する１ｍｌの生理的液体（physiological liquid）を、微細（例えば１４ゲージ〜２２ゲージ、好ましくは１８ゲージ〜２２ゲージ）針を用いて膝関節に注射する。
【００６９】
実施例６：トロカールを用いてヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法
トロカールを使用して、補充薬を小〜中程度の軟骨欠損部（１ｃｍ2未満）に送達した。埋め込みのために、補充薬を５個〜５０個のビーズ（直径１ｍｍ〜５ｍｍ）という密度でトロカールを通して軟骨内に送達する。例えば、４個のビーズ（直径１ｍｍ）を直径０．５ｃｍ、深さ１ｍｍの外傷性軟骨病変部に埋め込む。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節内補充薬用のヒドロゲルを作製する方法であって、
アルギネートの溶液を準備する工程と、
６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンを含む溶液を準備する工程と、
前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％（ｗ／ｖ）〜１．４％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含み、
前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、
前記カチオンを含む溶液からゲル化ビーズを単離する工程と
を含む、関節内補充薬用のヒドロゲルを作製する方法。
【請求項２】
前記混合溶液が０．６％のキトサンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合溶液が１．２％のアルギネートを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合溶液中のアルギネート及びキトサンが１．７５〜２．２５の比率で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記液滴を針に通して直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍのビーズを得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記キトサンが動物起源又は植物起源である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズであって、アルギネートと６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンとの均質混合物を含み、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズ。
【請求項９】
１．２％のアルギネートを含む、請求項８に記載のビーズ。
【請求項１０】
０．６％のキトサンを含む、請求項８又は９に記載のビーズ。
【請求項１１】
前記キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１２】
関節内補充のための請求項８〜１１のいずれか一項に記載のビーズの使用。
【請求項１３】
アルギネートと６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンとの均質混合物を含む、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬であって、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬。
【請求項１４】
粘性熱ゲル化ゲル、好ましくはキトサンヒドロゲルを更に含む、請求項１３に記載の関節内補充薬。
【請求項１５】
前記キトサンが動物起源又は好ましくは植物起源である、請求項１３又は１４に記載の関節内補充薬。
【請求項１６】
非ステロイド性抗炎症薬、麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、コルチコステロイド、抗悪性腫瘍薬、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ビタミン、ミネラル、栄養補助成分からなる群から選択される成分を更に含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の関節内補充薬。
【請求項１７】
ヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法であって、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルビーズの単回又は複数回の関節内投与を含む、ヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルビーズを含有する補充デバイス。
【請求項１】
関節内補充薬用のヒドロゲルを作製する方法であって、
アルギネートの溶液を準備する工程と、
６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンを含む溶液を準備する工程と、
前記アルギネートの溶液と前記キトサンの溶液とを混合する工程であって、混合溶液が０．５％（ｗ／ｖ）〜０．７％（ｗ／ｖ）のキトサン及び１％（ｗ／ｖ）〜１．４％（ｗ／ｖ）のアルギネートを含み、
前記混合溶液の液滴をＣａ2+カチオン又はＳｒ2+カチオンを含む溶液に導入する工程と、
前記カチオンを含む溶液からゲル化ビーズを単離する工程と
を含む、関節内補充薬用のヒドロゲルを作製する方法。
【請求項２】
前記混合溶液が０．６％のキトサンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記混合溶液が１．２％のアルギネートを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記混合溶液中のアルギネート及びキトサンが１．７５〜２．２５の比率で存在する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記液滴を針に通して直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍのビーズを得る、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記キトサンが動物起源又は植物起源である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズであって、アルギネートと６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンとの均質混合物を含み、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズ。
【請求項９】
１．２％のアルギネートを含む、請求項８に記載のビーズ。
【請求項１０】
０．６％のキトサンを含む、請求項８又は９に記載のビーズ。
【請求項１１】
前記キトサンが３５ｋＤ〜４５ｋＤのＭｗを有する、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のビーズ。
【請求項１２】
関節内補充のための請求項８〜１１のいずれか一項に記載のビーズの使用。
【請求項１３】
アルギネートと６０ｋＤ未満のＭｗを有するキトサンとの均質混合物を含む、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬であって、該ビーズが１％〜１．４％のアルギネート及び０．５％〜０．７％のキトサンを含むことを特徴とする、直径０．０１ｍｍ〜５ｍｍの球状ヒドロゲルビーズを含む関節内補充薬。
【請求項１４】
粘性熱ゲル化ゲル、好ましくはキトサンヒドロゲルを更に含む、請求項１３に記載の関節内補充薬。
【請求項１５】
前記キトサンが動物起源又は好ましくは植物起源である、請求項１３又は１４に記載の関節内補充薬。
【請求項１６】
非ステロイド性抗炎症薬、麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、コルチコステロイド、抗悪性腫瘍薬、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ビタミン、ミネラル、栄養補助成分からなる群から選択される成分を更に含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の関節内補充薬。
【請求項１７】
ヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法であって、請求項８〜１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルビーズの単回又は複数回の関節内投与を含む、ヒト被験体又は動物の関節を治療する補充法。
【請求項１８】
請求項８〜１１のいずれか一項に記載のヒドロゲルビーズを含有する補充デバイス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５２０２５８（Ｐ２０１３−５２０２５８Ａ）
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５５４２８３（Ｐ２０１２−５５４２８３）
【出願日】平成２３年２月１１日（２０１１．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５２０２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４１３３
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０００２９９２５）ユニベルシテ・ド・リエージュ (18)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＥＧＥ
【住所又は居所原語表記】Ａｖｅｎｕｅ Ｐｒｅ−Ａｉｌｙ，４，Ｂ−４０３１ Ａｎｇｌｅｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
【出願人】（５１２２２２２５３）キットザイム・ソシエテ・アノニム (1)
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＴＯＺＹＭＥ Ｓ．Ａ．
【住所又は居所原語表記】Ｐａｒｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌ ｄｅｓ Ｈａｕｔｓ−Ｓａｒｔｓ ｚｏｎｅ ２，Ｒｕｅ Ｈａｕｔｅ Ｃｌａｉｒｅ，４，Ｂ−４０４０ Ｈｅｒｓｔａｌ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年６月６日（２０１３．６．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年２月１１日（２０１１．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１１／０５２０２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／１０４１３３
【国際公開日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【出願人】（５０００２９９２５）ユニベルシテ・ド・リエージュ (18)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＤＥ ＬＩＥＧＥ
【住所又は居所原語表記】Ａｖｅｎｕｅ Ｐｒｅ−Ａｉｌｙ，４，Ｂ−４０３１ Ａｎｇｌｅｕｒ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
【出願人】（５１２２２２２５３）キットザイム・ソシエテ・アノニム (1)
【氏名又は名称原語表記】ＫＩＴＯＺＹＭＥ Ｓ．Ａ．
【住所又は居所原語表記】Ｐａｒｃ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌ ｄｅｓ Ｈａｕｔｓ−Ｓａｒｔｓ ｚｏｎｅ ２，Ｒｕｅ Ｈａｕｔｅ Ｃｌａｉｒｅ，４，Ｂ−４０４０ Ｈｅｒｓｔａｌ
【Ｆターム（参考）】
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