電気検出に基づいた幹細胞分化測定用センサー
【課題】幹細胞分化測定用センサーを提供すること。
【解決手段】本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーに関する。本発明のセンサーは、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化及び非脱リン酸化を電気的信号で測定して、幹細胞の状態を電気的な方法により迅速に検出することができ、幹細胞の分化有無を判断することができる。
【解決手段】本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーに関する。本発明のセンサーは、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化及び非脱リン酸化を電気的信号で測定して、幹細胞の状態を電気的な方法により迅速に検出することができ、幹細胞の分化有無を判断することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞チップ技術は、細胞基盤技法の中、最も有望な道具である。細胞チップは、二種類の細胞検出システムを有する。その一つは、光学システムであり、他の一つは、電気的(電気化学的)検出システムである。光学システムは、細胞の視覚的な変化を感知して、高い敏感度と選別度を有する反面、小型化の限界と、光学信号を電気的な信号に変換する過程に限界を有している(１−２)。
【０００３】
その反面、電気的な細胞検出システムは、光学的な検出システムに比べ、相対的に開発が劣っているが、小型化が容易で、電気信号分析が容易であるという強点を有している。したがって、細胞界面における電子発生と電子伝達などを電気化学的に検出して、生きている細胞を分析しようとする試みが持続されている(３)。
【０００４】
生きている細胞は、細胞の電子活性中心部における電子伝達、細胞/センサー界面における開放回路電位差(open circuit potential)、ＥＣＩＳ(electric cell-substrate impedance sensing)またはＳＥＣＭ(scanning electrochemical microscopy)などのような数多い電気化学的な状況により研究されてきた(４−１１)。
【０００５】
しかしながら、電気的あるいは電気化学的な方法を利用して幹細胞の分化度を測定しようとする試みは未だになされていない。
【０００６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、幹細胞の分化度を電気化学的方法により測定するセンサー及び方法を開発するために鋭意研究した。その結果、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定して、幹細胞の分化有無を電気化学的に確認することにより、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、幹細胞分化測定用センサーを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、幹細胞の分化有無を確認する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一様態によると、本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーを提供する。
【００１２】
本発明者らは、幹細胞の分化度を電気化学的方法により測定するセンサー及び方法を開発するために鋭意研究した。その結果、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定して、幹細胞の分化有無を電気化学的に確認した。
【００１３】
本発明の幹細胞分化測定用センサーは、当業界に公知の通常の三−電極システムから構成されて、前記三−電極システムは、作業電極(working electrode)、相対電極(counter electrode)及び基準電極(reference electrode)から構成されてデザインされる。
【００１４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のセンサーに含まれる電極は、金、銅、ガラス炭素、白金及びＡｇ/ＡｇＣｌ電極からなる群から選択されて、より好ましくは、作業電極は、金、銅またはガラス炭素、相対電極は、白金、基準電極は、Ａｇ/ＡｇＣｌであり、最も好ましくは、作業電極は金、相対電極は白金、基準電極はＡｇ/ＡｇＣｌである。
【００１５】
本発明に利用されるアルカリホスファターゼは、脱リン酸化酵素であって、幹細胞の未分化状態を示すマーカーを意味する。
【００１６】
本発明のセンサーに含まれるアルカリホスファターゼの基質は、ホスフェート基を含む当業界に公知の多様な化合物を含み、好ましくは、１−ナフチルホスフェート、カルシウムホスフェート、フェニルホスフェート、２−アミノフェニルホスフェート、４−アミノフェニルホスフェート、ｐ−アミノフェニルホスフェート、３−インドキシルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート、４−メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)ホスフェート、６−クロロ−３−インドキシルホスフェートまたはヒドロキノンジホスフェートであり、より好ましくは、１−ナフチルホスフェート、フェニルホスフェート、２−アミノフェニルホスフェート、４−アミノフェニルホスフェートまたは３−インドキシルホスフェートであって、最も好ましくは、１−ナフチルホスフェートである。
【００１７】
アルカリホスファターゼの基質として、特に１−ナフチルホスフェートは、二つのベンゼン環にホスフェート基が結合されている化合物であって(図１)、未分化幹細胞に存在するアルカリホスファターゼにより脱リン酸化されて１−ナフトールに変換されて、変換された物質は、変換前と全く異なる電気化学的特性を示す(図２)。
【００１８】
本発明のまた他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーが利用される幹細胞は、胚芽幹細胞または生殖幹細胞であり、より好ましくは、胚芽幹細胞である。
【００１９】
本発明の他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーが利用される幹細胞は、ヒトまたはマウス由来の幹細胞であり、より好ましくはマウス由来の幹細胞である。
【００２０】
本発明のまた他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーが利用される幹細胞が未分化幹細胞である場合、アルカリホスファターゼを含み、分化幹細胞である場合は、アルカリホスファターゼを含まない。
【００２１】
本発明の他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーは、細胞によるアルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定し、幹細胞の分化有無を確認する。
【００２２】
本発明のまた他の好ましい具現例によると、本発明においてアルカリホスファターゼにより脱リン酸化される基質は、１−ナフトール、カルシウムイオン、フェノール、２−アミノフェノール、４−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、３−インドキソール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキソール、４−メチルウンベリフェロール、６−クロロ−３−インドキソールまたはヒドロキノンであり、より好ましくは、１−ナフトール、フェノール、２−アミノフェノール、４−アミノフェノールまたは３−インドキソールであって、最も好ましくは、１−ナフトールである。
【００２３】
本発明の他の様態によると、本発明は、(ａ)上述の本発明の幹細胞分化測定用センサーを準備する段階と、(ｂ)前記センサーに分析対象の細胞を接触させる段階と、(ｃ)前記細胞による前記アルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定する段階とを含む、幹細胞の分化有無を確認する方法を提供する。
【００２４】
以下、幹細胞の分化有無を確認する本発明の方法を段階別に詳細に説明する。
【００２５】
(ａ)幹細胞分化測定用センサーの準備
まず、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーを準備する。
【００２６】
センサーの電極及びアルカリホスファターゼの基質は上述したため、その共通する内容は、反復記載による明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００２７】
(ｂ)前記センサーに分析対象細胞の接触
その後、分化有無を確認したい分析対象幹細胞を前記センサーに接触する。
【００２８】
(ｃ)基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定
未分化幹細胞に存在するアルカリホスファターゼによりその基質は、脱リン酸化されて変換されて、変換された物質は、変換前と全く異なる電気化学的特性を示し、これをサイクリックボルタンメトリーを利用して測定する。
【００２９】
アルカリホスファターゼの基質の電気化学的な特性を利用することにより、アルカリホスファターゼの基質の電気化学的な信号を追跡し、未分化された幹細胞に対するデータを定量化して、分化により変化するアルカリホスファターゼの基質の信号を追跡することにより、幹細胞の分化有無を電気化学的な方法を利用して判断する。
【００３０】
そして、未分化された幹細胞におけるアルカリホスファターゼの基質の信号を幹細胞の細胞量によって定量化して、分化された幹細胞におけるアルカリホスファターゼの基質の信号を幹細胞の細胞量によって定量化した後、その結果を比較し、幹細胞の分化有無を測定する。
【００３１】
好ましい具現例として、マウス胚芽幹細胞(MES)の分化有無を確認するにおいて、分化ＭＥＳ細胞は、電気的信号及び増加する細胞数間に独立的な関係を示す反面、未分化ＭＥＳ細胞は、信号及び細胞数間に線形関係を示す。未分化ＭＥＳ細胞の線形性を示す決定係数(Ｒ2)値が０．９４３２を示し、有意な結果を示すと、これを通じて電気化学的方法を利用して細胞状態(cell status)を確認することができて、検出限界が５０，０００個の未分化ＭＥＳ細胞であることを示す(図４)。
【発明の効果】
【００３２】
以上詳細に説明したように、本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーを提供する。本発明のセンサーは、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化及び非脱リン酸化を電気的信号で測定して、幹細胞の状態を電気的な方法により迅速に検出することができ、幹細胞の分化有無を判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のセンサーに含まれるアルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase, AP)の基質である１−ナフチルホスフェート(naphthyl phosphate, NP)が未分化マウス胚芽幹細胞のアルカリホスファターゼにより１−ナフトールに変換されることを示す。
【図２】（ａ）は、本発明のセンサーに基質として利用される１−ＮＰの循環性ボルタモグラムであり、（ｂ）は、１−ＮＰのピーク電流及び濃度間の直接線形関係を示す。
【図３】（ａ）は、１−ＮＰ添加後のマウス胚芽幹細胞(mouse embryonic stem, MES)の循環性ボルタモグラムであり、（ｂ）は、還元ピーク電流とＭＥＳ細胞の数間の線形プロットを示す。
【図４】未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞間の関係を示すグラフである。分化ＭＥＳ細胞は、電気的信号及び増加する細胞数間に独立的な関係を示す反面、未分化ＭＥＳ細胞は、信号及び細胞数間に線形関係を示した。
【図５ａ】１ｍＭの１−ＮＰで細胞を処理した後、生存率試験を行った結果を示す。
【図５ｂ】幹細胞に１−ＮＰを処理する前のＡＰ染色結果を示す。
【図５ｃ】幹細胞に１−ＮＰを処理する後のＡＰ染色結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００３５】
実験材料及び方法
実験材料
１−ナフチルホスフェート及びＰＢＳ(phosphate buffered saline)(PH 7.4, 10mM)溶液をSigma Aldrichから購入した。本発明の実施例に利用される他のあらゆる化学物質は、試薬級(Reagent grade)を購入して利用した。
【００３６】
未分化MES細胞培養及び胚芽体(Embryyonic body)の形成
Ｊ１細胞及びマウス胚芽幹(MES)細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、１５％ＦＢＳ、１ｍＭのナトリウムピルベート、１０-4Ｍの２−メルカプトエタノール、１ｘ非必須アミノ酸及び１，０００Ｕ/ｍｌのＬＩＦ(leukemia inhibitory factor)で補充されたＤＭＥＭ(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)で培養した。ＥＢ形成は、知られた方法により、Ｊ１ ＥＳ細胞をもって行った(１３)。ＥＳ細胞(２×１０6個)をＬＩＦ無しに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭのbacterial-gradeペトリディッシュにシーディングした。懸濁培養２日後、ＥＢを収集して、トリプシンを処理した。同一培地を含む０．２％ゼラチンコーティング６ウェルプレートに総１．３７×１０6個の細胞をreplateした。細胞の数は、三日後に測定した。
【００３７】
電気化学セルの製造
培養チャンバとして、一辺の長さが２ｍｍである正方形チャンバを利用した。金を作業電極(CHI101)、Ａｇ/ＡｇＣｌを基準電極(CHI111)、そして白金を相対電極(CHI115)として利用した。新鮮な培養培地と共に注入して、知られた細胞密度でＪ１細胞をチャンバに移した。細胞数は、トリパンブルー溶液で染色した後、ヘマサイトメーターを利用して測定した。
【００３８】
ＭＥＳ細胞の電気化学センシング
サイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry, CV)実験は、一般の電気化学システムソフトウェアにより制御されるＣＨＩ６６０Ａマシーンを利用して行った。三−電極システムは、作業電極として金、相対電極として白金線、及び基準電極としてＡｇ/ＡｇＣｌセルから構成されてデザインされた。１−ＮＰ及び分化マーカーのアルカリホスファターゼ間の相互作用によるマウス胚芽幹細胞の分化を検出するだけではなく、ＭＥＳ細胞の電気的特性を研究するために測定を行った。ＰＢＳ(10mM、pH7.4)を０．１Ｖ/ｓのスキャン速度で電解質として利用した。実験前に、培養培地を除去し、ＰＢＳを含む１−ＮＰをチャンバに注入した。緩衝液を変えた１５分後に実験を始めて、３７℃及び５％ＣＯ2で測定条件を維持した。
【００３９】
アルカリホスファターゼ染色免疫分析
アルカリホスファターゼ(AP)染色免疫分析キットをSigma-Aldrichから購入した。まず、固定溶液(シトレート−アセトン−ホルムアルデヒド)を利用して細胞を固定した。細胞固定後、暗室でナトリウムニトレート、ＦＲＶ−アルカリ溶液及びナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液を含むアルカリ−染色薬混合物を前記細胞に添加して１５分間染色した。最終的に、ヘマトキシリン(hematoxylin)溶液を利用して、前記細胞を対照染色(counterstaining)した。
【００４０】
実験結果
１−ナフチルホスフェートの電気的信号検出
以下のような方法により１−ＮＰ信号を定量化した。
１０ｍＭ ＰＢＳの電解質溶液において１−ＮＰ濃度は、１μＭから５ｍＭまでの範囲にした(図２（ａ）及び（ｂ）)。図２（ａ）は、１−ＮＰの電気化学的特性を示す。ピークは、０．１Ｖ周囲で観察されて、１−ＮＰの濃度が減少するにつれて、電位は陰の電圧値に徐々に変化した。図２（ｂ）は、１−ＮＰピーク電流及び１−ＮＰ濃度間の直接線形関係を示す。線形回帰分析は、サイクリックボルタンメトリーを利用して、電気化学的定量方法の信頼度を立証するために行った(Ｒ2＝０．９５４３)。このような結果は、１−ＮＰがサイクリックボルタンメトリー分析により定量化され得ることを示す。
【００４１】
未分化ＭＥＳ細胞の電気化学応答
１−ＮＰをＭＥＳ細胞の基質に含ませることにより、１−ＮＰに対する脱リン酸化作用によりアルカリホスファターゼ(胚芽幹細胞マーカー)を追跡することができる。解離された１−ＮＰが１−ナフトールに変化される場合、１−ＮＰを検出するために設定された境界条件(Boundary conditions)により１−ナフトールが見えられない時、電気的信号において相応する変化が発生する。前記１−ＮＰが注入された１５分後に検出を行った。図３（ａ）は、１−ＮＰ添加後、ＭＥＳ細胞の電気化学的特性を示す。全体電位は、陽の方向に僅かに変化したが、還元ピーク電流は、ＭＥＳ細胞の濃度が増加する方向に減少した。このような電位の変化は、多様な物質を有する培地を含むことができるからであると判断される。線形プロットは図３（ｂ）に示して、線形回帰分析(linear regression analysis)は、Ｒ2値、０．９４１９で示した。このような結果は、細胞数及び１−ＮＰにおいて推定されるＣＶ還元電流ピーク間によい相関関係を示す。
【００４２】
ＭＥＳ細胞の分化検出
ＭＥＳ細胞の分化を検出するために、未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞の電気化学的信号を比較した。細胞の各群は、特定細胞数で培養チャンバに接種した。未分化されたＭＥＳ細胞は、分化されたＭＥＳ細胞よりよく接着して成長するため、未分化されたＭＥＳ細胞に対し、分化された細胞を二倍として接種した。
【００４３】
図４は、未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞間の関係を示す。分化ＭＥＳ細胞は、電気的信号及び増加する細胞数間に独立的な関係を示す反面、未分化ＭＥＳ細胞は、信号及び細胞数間に線形関係を示した。未分化ＭＥＳ細胞の線形性は、０．９４３２の高いＲ2値で示した。未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞間の信頼度に対するＰ−値は、細胞数の二番目データポイントから、各ポイントに対してそれぞれ０．０９５、０．００１、０．００６及び０．００２である。細胞の数が最も低い二つを除いては、他の全てのポイントは、５％信頼度水準で非常に差があった。これは、ＭＥＳ細胞の分化を確認するにおいて、細胞数の三番目ポイントが検出限界であることを意味する。このような結果は、前記電気化学的方法を利用して細胞状態(Cell status)を確認することができて、検出限界が５０，０００個の未分化ＭＥＳ細胞であることを示す。
【００４４】
マウスＭＥＳ細胞に対する１−ナフチルホスフェートの効果
ＭＥＳ細胞生存率または分化を変化させることにより、１−ＮＰの存在が本発明の実施例に影響を及ぼさないことを確認するために、アルカリホスファターゼ(AP)染色分析法を行った。図５ａは、１ｍＭの１−ＮＰで細胞を処理した後、生存率試験を行った結果を示す。細胞生存率は、対照群と比較し、９９．６５％を示した。図５ｂ及び５ｃは、幹細胞にＮＰを処理する前及び後のＡＰ染色結果を示す。各図面は、よく染色された幹細胞を示して、これは、１−ＮＰが幹細胞の分化に影響を及ぼさないことを意味する。
【００４５】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【００４６】
［参照文献］
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2. Zhu L, Wu W, Zhu MQ et al. Reversibly photoswitchable dual-color fluorescent nanoparticles as new tools for live-cell imaging. J Am Chem Soc;129:3524-3526(2007).
3. Matsunaga T, Namba Y. Detection of microbilal cells by cyclic voltammetry. Anal Chem;56:798-801(1984).
4. Bard AJ, Li X, Zhan W. Chemically imaging living cells by scanning electrochemical microscopy. Biosens Bioelectron;22:461472(2006).
5. Lu H, Gratzl M. Monitoring drug efflux from sensitivity and multidrugresistant single cancer cells with microvoltammetry. Anal Chem;71:2821-2830(1999).
6. Cui HF, Ye JS, Chen Y et al. Microelectrode array biochip: Tool for in vitro drug screening based on the detection of a drug effect on dopamine release from PC12 cells. Anal Chem;78:6347-6355(2006).
7. Fasching RJ, Bai SJ, Fabian T, Prinz FB. Nanoscale electrochemical probes for single cell analysis. Microelectron Eng;83:1638-1641(2006).
8. Kaya T, Torisawa Y, Oyamatsu D et al. Monitoring the cellular activity of a cultured single cell by scanning electrochemical microscopy (SECM).Acomparisonwithfluorescenceviabilitymonitoring. Biosens Bioelectron;18:1379-1383(2003).
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10. Zhang X, Peng X, Jin W. Scanning electrochemical microscopy with enzyme immunoassay of the cancer-related antigen CA15-3. Anal Chim Acta;558:110- 114(2006).
11. Bard AJ, Fan FRF, Kwak J. Scanning electrochemical microscopy. Introduction and principles. Anal Chem;61:132-138(1989).
12. El-Said WA, Yea CH, Kim H et al. Cell-based chip for the Detection of Anticancer effect on HeLa Cells Using Cyclic Voltammetry. Biosens Bioelectron 2008 in press
13. Abe K, Niwa H, Iwase K et al. Endoderm-specific gene expression in embryonic stem cells differentiated to embryoid bodies. Exp Cell Res ;229:27-34(1996).
14. Wolf P, Rothermel A, Beck-Sickinger AG et al. Microelectrode chip based real time monitoring of vital MCF-7 mamma carcinoma cells by impedance spectroscopy. Biosens Bioelectron;24:253-259(2008).
15. Kim BS, Choi JW. Polyelectrolyte multilayer microcapsules : Self assembly and toward biomedical applications. Biotechnol Bioprocess Eng;12:323- 332(2007).
16. Yea CH. Min J, Choi JW. The fabrication of cell chips for use as bio-sensors. Biochip J;1:219-227(2007).
【技術分野】
【０００１】
本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞チップ技術は、細胞基盤技法の中、最も有望な道具である。細胞チップは、二種類の細胞検出システムを有する。その一つは、光学システムであり、他の一つは、電気的(電気化学的)検出システムである。光学システムは、細胞の視覚的な変化を感知して、高い敏感度と選別度を有する反面、小型化の限界と、光学信号を電気的な信号に変換する過程に限界を有している(１−２)。
【０００３】
その反面、電気的な細胞検出システムは、光学的な検出システムに比べ、相対的に開発が劣っているが、小型化が容易で、電気信号分析が容易であるという強点を有している。したがって、細胞界面における電子発生と電子伝達などを電気化学的に検出して、生きている細胞を分析しようとする試みが持続されている(３)。
【０００４】
生きている細胞は、細胞の電子活性中心部における電子伝達、細胞/センサー界面における開放回路電位差(open circuit potential)、ＥＣＩＳ(electric cell-substrate impedance sensing)またはＳＥＣＭ(scanning electrochemical microscopy)などのような数多い電気化学的な状況により研究されてきた(４−１１)。
【０００５】
しかしながら、電気的あるいは電気化学的な方法を利用して幹細胞の分化度を測定しようとする試みは未だになされていない。
【０００６】
本明細書全体にかけて多数の特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、幹細胞の分化度を電気化学的方法により測定するセンサー及び方法を開発するために鋭意研究した。その結果、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定して、幹細胞の分化有無を電気化学的に確認することにより、本発明を完成した。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、幹細胞分化測定用センサーを提供することにある。
【０００９】
本発明の他の目的は、幹細胞の分化有無を確認する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一様態によると、本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーを提供する。
【００１２】
本発明者らは、幹細胞の分化度を電気化学的方法により測定するセンサー及び方法を開発するために鋭意研究した。その結果、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定して、幹細胞の分化有無を電気化学的に確認した。
【００１３】
本発明の幹細胞分化測定用センサーは、当業界に公知の通常の三−電極システムから構成されて、前記三−電極システムは、作業電極(working electrode)、相対電極(counter electrode)及び基準電極(reference electrode)から構成されてデザインされる。
【００１４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明のセンサーに含まれる電極は、金、銅、ガラス炭素、白金及びＡｇ/ＡｇＣｌ電極からなる群から選択されて、より好ましくは、作業電極は、金、銅またはガラス炭素、相対電極は、白金、基準電極は、Ａｇ/ＡｇＣｌであり、最も好ましくは、作業電極は金、相対電極は白金、基準電極はＡｇ/ＡｇＣｌである。
【００１５】
本発明に利用されるアルカリホスファターゼは、脱リン酸化酵素であって、幹細胞の未分化状態を示すマーカーを意味する。
【００１６】
本発明のセンサーに含まれるアルカリホスファターゼの基質は、ホスフェート基を含む当業界に公知の多様な化合物を含み、好ましくは、１−ナフチルホスフェート、カルシウムホスフェート、フェニルホスフェート、２−アミノフェニルホスフェート、４−アミノフェニルホスフェート、ｐ−アミノフェニルホスフェート、３−インドキシルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート、４−メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)ホスフェート、６−クロロ−３−インドキシルホスフェートまたはヒドロキノンジホスフェートであり、より好ましくは、１−ナフチルホスフェート、フェニルホスフェート、２−アミノフェニルホスフェート、４−アミノフェニルホスフェートまたは３−インドキシルホスフェートであって、最も好ましくは、１−ナフチルホスフェートである。
【００１７】
アルカリホスファターゼの基質として、特に１−ナフチルホスフェートは、二つのベンゼン環にホスフェート基が結合されている化合物であって(図１)、未分化幹細胞に存在するアルカリホスファターゼにより脱リン酸化されて１−ナフトールに変換されて、変換された物質は、変換前と全く異なる電気化学的特性を示す(図２)。
【００１８】
本発明のまた他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーが利用される幹細胞は、胚芽幹細胞または生殖幹細胞であり、より好ましくは、胚芽幹細胞である。
【００１９】
本発明の他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーが利用される幹細胞は、ヒトまたはマウス由来の幹細胞であり、より好ましくはマウス由来の幹細胞である。
【００２０】
本発明のまた他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーが利用される幹細胞が未分化幹細胞である場合、アルカリホスファターゼを含み、分化幹細胞である場合は、アルカリホスファターゼを含まない。
【００２１】
本発明の他の好ましい具現例によると、本発明のセンサーは、細胞によるアルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定し、幹細胞の分化有無を確認する。
【００２２】
本発明のまた他の好ましい具現例によると、本発明においてアルカリホスファターゼにより脱リン酸化される基質は、１−ナフトール、カルシウムイオン、フェノール、２−アミノフェノール、４−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、３−インドキソール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキソール、４−メチルウンベリフェロール、６−クロロ−３−インドキソールまたはヒドロキノンであり、より好ましくは、１−ナフトール、フェノール、２−アミノフェノール、４−アミノフェノールまたは３−インドキソールであって、最も好ましくは、１−ナフトールである。
【００２３】
本発明の他の様態によると、本発明は、(ａ)上述の本発明の幹細胞分化測定用センサーを準備する段階と、(ｂ)前記センサーに分析対象の細胞を接触させる段階と、(ｃ)前記細胞による前記アルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定する段階とを含む、幹細胞の分化有無を確認する方法を提供する。
【００２４】
以下、幹細胞の分化有無を確認する本発明の方法を段階別に詳細に説明する。
【００２５】
(ａ)幹細胞分化測定用センサーの準備
まず、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーを準備する。
【００２６】
センサーの電極及びアルカリホスファターゼの基質は上述したため、その共通する内容は、反復記載による明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。
【００２７】
(ｂ)前記センサーに分析対象細胞の接触
その後、分化有無を確認したい分析対象幹細胞を前記センサーに接触する。
【００２８】
(ｃ)基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定
未分化幹細胞に存在するアルカリホスファターゼによりその基質は、脱リン酸化されて変換されて、変換された物質は、変換前と全く異なる電気化学的特性を示し、これをサイクリックボルタンメトリーを利用して測定する。
【００２９】
アルカリホスファターゼの基質の電気化学的な特性を利用することにより、アルカリホスファターゼの基質の電気化学的な信号を追跡し、未分化された幹細胞に対するデータを定量化して、分化により変化するアルカリホスファターゼの基質の信号を追跡することにより、幹細胞の分化有無を電気化学的な方法を利用して判断する。
【００３０】
そして、未分化された幹細胞におけるアルカリホスファターゼの基質の信号を幹細胞の細胞量によって定量化して、分化された幹細胞におけるアルカリホスファターゼの基質の信号を幹細胞の細胞量によって定量化した後、その結果を比較し、幹細胞の分化有無を測定する。
【００３１】
好ましい具現例として、マウス胚芽幹細胞(MES)の分化有無を確認するにおいて、分化ＭＥＳ細胞は、電気的信号及び増加する細胞数間に独立的な関係を示す反面、未分化ＭＥＳ細胞は、信号及び細胞数間に線形関係を示す。未分化ＭＥＳ細胞の線形性を示す決定係数(Ｒ2)値が０．９４３２を示し、有意な結果を示すと、これを通じて電気化学的方法を利用して細胞状態(cell status)を確認することができて、検出限界が５０，０００個の未分化ＭＥＳ細胞であることを示す(図４)。
【発明の効果】
【００３２】
以上詳細に説明したように、本発明は、(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサーを提供する。本発明のセンサーは、幹細胞の未分化状態のマーカーとしてのアルカリホスファターゼがその基質を脱リン酸化することを利用し、基質の脱リン酸化及び非脱リン酸化を電気的信号で測定して、幹細胞の状態を電気的な方法により迅速に検出することができ、幹細胞の分化有無を判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】本発明のセンサーに含まれるアルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase, AP)の基質である１−ナフチルホスフェート(naphthyl phosphate, NP)が未分化マウス胚芽幹細胞のアルカリホスファターゼにより１−ナフトールに変換されることを示す。
【図２】（ａ）は、本発明のセンサーに基質として利用される１−ＮＰの循環性ボルタモグラムであり、（ｂ）は、１−ＮＰのピーク電流及び濃度間の直接線形関係を示す。
【図３】（ａ）は、１−ＮＰ添加後のマウス胚芽幹細胞(mouse embryonic stem, MES)の循環性ボルタモグラムであり、（ｂ）は、還元ピーク電流とＭＥＳ細胞の数間の線形プロットを示す。
【図４】未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞間の関係を示すグラフである。分化ＭＥＳ細胞は、電気的信号及び増加する細胞数間に独立的な関係を示す反面、未分化ＭＥＳ細胞は、信号及び細胞数間に線形関係を示した。
【図５ａ】１ｍＭの１−ＮＰで細胞を処理した後、生存率試験を行った結果を示す。
【図５ｂ】幹細胞に１−ＮＰを処理する前のＡＰ染色結果を示す。
【図５ｃ】幹細胞に１−ＮＰを処理する後のＡＰ染色結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【実施例】
【００３５】
実験材料及び方法
実験材料
１−ナフチルホスフェート及びＰＢＳ(phosphate buffered saline)(PH 7.4, 10mM)溶液をSigma Aldrichから購入した。本発明の実施例に利用される他のあらゆる化学物質は、試薬級(Reagent grade)を購入して利用した。
【００３６】
未分化MES細胞培養及び胚芽体(Embryyonic body)の形成
Ｊ１細胞及びマウス胚芽幹(MES)細胞を、３７℃、５％ＣＯ2で、１５％ＦＢＳ、１ｍＭのナトリウムピルベート、１０-4Ｍの２−メルカプトエタノール、１ｘ非必須アミノ酸及び１，０００Ｕ/ｍｌのＬＩＦ(leukemia inhibitory factor)で補充されたＤＭＥＭ(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)で培養した。ＥＢ形成は、知られた方法により、Ｊ１ ＥＳ細胞をもって行った(１３)。ＥＳ細胞(２×１０6個)をＬＩＦ無しに１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭのbacterial-gradeペトリディッシュにシーディングした。懸濁培養２日後、ＥＢを収集して、トリプシンを処理した。同一培地を含む０．２％ゼラチンコーティング６ウェルプレートに総１．３７×１０6個の細胞をreplateした。細胞の数は、三日後に測定した。
【００３７】
電気化学セルの製造
培養チャンバとして、一辺の長さが２ｍｍである正方形チャンバを利用した。金を作業電極(CHI101)、Ａｇ/ＡｇＣｌを基準電極(CHI111)、そして白金を相対電極(CHI115)として利用した。新鮮な培養培地と共に注入して、知られた細胞密度でＪ１細胞をチャンバに移した。細胞数は、トリパンブルー溶液で染色した後、ヘマサイトメーターを利用して測定した。
【００３８】
ＭＥＳ細胞の電気化学センシング
サイクリックボルタンメトリー(cyclic voltammetry, CV)実験は、一般の電気化学システムソフトウェアにより制御されるＣＨＩ６６０Ａマシーンを利用して行った。三−電極システムは、作業電極として金、相対電極として白金線、及び基準電極としてＡｇ/ＡｇＣｌセルから構成されてデザインされた。１−ＮＰ及び分化マーカーのアルカリホスファターゼ間の相互作用によるマウス胚芽幹細胞の分化を検出するだけではなく、ＭＥＳ細胞の電気的特性を研究するために測定を行った。ＰＢＳ(10mM、pH7.4)を０．１Ｖ/ｓのスキャン速度で電解質として利用した。実験前に、培養培地を除去し、ＰＢＳを含む１−ＮＰをチャンバに注入した。緩衝液を変えた１５分後に実験を始めて、３７℃及び５％ＣＯ2で測定条件を維持した。
【００３９】
アルカリホスファターゼ染色免疫分析
アルカリホスファターゼ(AP)染色免疫分析キットをSigma-Aldrichから購入した。まず、固定溶液(シトレート−アセトン−ホルムアルデヒド)を利用して細胞を固定した。細胞固定後、暗室でナトリウムニトレート、ＦＲＶ−アルカリ溶液及びナフトールＡＳ−ＢＩアルカリ溶液を含むアルカリ−染色薬混合物を前記細胞に添加して１５分間染色した。最終的に、ヘマトキシリン(hematoxylin)溶液を利用して、前記細胞を対照染色(counterstaining)した。
【００４０】
実験結果
１−ナフチルホスフェートの電気的信号検出
以下のような方法により１−ＮＰ信号を定量化した。
１０ｍＭ ＰＢＳの電解質溶液において１−ＮＰ濃度は、１μＭから５ｍＭまでの範囲にした(図２（ａ）及び（ｂ）)。図２（ａ）は、１−ＮＰの電気化学的特性を示す。ピークは、０．１Ｖ周囲で観察されて、１−ＮＰの濃度が減少するにつれて、電位は陰の電圧値に徐々に変化した。図２（ｂ）は、１−ＮＰピーク電流及び１−ＮＰ濃度間の直接線形関係を示す。線形回帰分析は、サイクリックボルタンメトリーを利用して、電気化学的定量方法の信頼度を立証するために行った(Ｒ2＝０．９５４３)。このような結果は、１−ＮＰがサイクリックボルタンメトリー分析により定量化され得ることを示す。
【００４１】
未分化ＭＥＳ細胞の電気化学応答
１−ＮＰをＭＥＳ細胞の基質に含ませることにより、１−ＮＰに対する脱リン酸化作用によりアルカリホスファターゼ(胚芽幹細胞マーカー)を追跡することができる。解離された１−ＮＰが１−ナフトールに変化される場合、１−ＮＰを検出するために設定された境界条件(Boundary conditions)により１−ナフトールが見えられない時、電気的信号において相応する変化が発生する。前記１−ＮＰが注入された１５分後に検出を行った。図３（ａ）は、１−ＮＰ添加後、ＭＥＳ細胞の電気化学的特性を示す。全体電位は、陽の方向に僅かに変化したが、還元ピーク電流は、ＭＥＳ細胞の濃度が増加する方向に減少した。このような電位の変化は、多様な物質を有する培地を含むことができるからであると判断される。線形プロットは図３（ｂ）に示して、線形回帰分析(linear regression analysis)は、Ｒ2値、０．９４１９で示した。このような結果は、細胞数及び１−ＮＰにおいて推定されるＣＶ還元電流ピーク間によい相関関係を示す。
【００４２】
ＭＥＳ細胞の分化検出
ＭＥＳ細胞の分化を検出するために、未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞の電気化学的信号を比較した。細胞の各群は、特定細胞数で培養チャンバに接種した。未分化されたＭＥＳ細胞は、分化されたＭＥＳ細胞よりよく接着して成長するため、未分化されたＭＥＳ細胞に対し、分化された細胞を二倍として接種した。
【００４３】
図４は、未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞間の関係を示す。分化ＭＥＳ細胞は、電気的信号及び増加する細胞数間に独立的な関係を示す反面、未分化ＭＥＳ細胞は、信号及び細胞数間に線形関係を示した。未分化ＭＥＳ細胞の線形性は、０．９４３２の高いＲ2値で示した。未分化ＭＥＳ細胞及び分化ＭＥＳ細胞間の信頼度に対するＰ−値は、細胞数の二番目データポイントから、各ポイントに対してそれぞれ０．０９５、０．００１、０．００６及び０．００２である。細胞の数が最も低い二つを除いては、他の全てのポイントは、５％信頼度水準で非常に差があった。これは、ＭＥＳ細胞の分化を確認するにおいて、細胞数の三番目ポイントが検出限界であることを意味する。このような結果は、前記電気化学的方法を利用して細胞状態(Cell status)を確認することができて、検出限界が５０，０００個の未分化ＭＥＳ細胞であることを示す。
【００４４】
マウスＭＥＳ細胞に対する１−ナフチルホスフェートの効果
ＭＥＳ細胞生存率または分化を変化させることにより、１−ＮＰの存在が本発明の実施例に影響を及ぼさないことを確認するために、アルカリホスファターゼ(AP)染色分析法を行った。図５ａは、１ｍＭの１−ＮＰで細胞を処理した後、生存率試験を行った結果を示す。細胞生存率は、対照群と比較し、９９．６５％を示した。図５ｂ及び５ｃは、幹細胞にＮＰを処理する前及び後のＡＰ染色結果を示す。各図面は、よく染色された幹細胞を示して、これは、１−ＮＰが幹細胞の分化に影響を及ぼさないことを意味する。
【００４５】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【００４６】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサー。
【請求項２】
前記電極は、金、銅、ガラス炭素、白金及びＡｇ/ＡｇＣｌ電極からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項３】
前記基質は、１−ナフチルホスフェート、カルシウムホスフェート、フェニルホスフェート、２−アミノフェニルホスフェート、４−アミノフェニルホスフェート、ｐ−アミノフェニルホスフェート、３−インドキシルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート、４−メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)ホスフェート、６−クロロ−３−インドキシルホスフェート及びヒドロキノンジホスフェートから構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項４】
前記幹細胞は、胚芽幹細胞または生殖幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項５】
前記幹細胞は、未分化幹細胞の場合はアルカリホスファターゼを含み、分化幹細胞の場合はアルカリホスファターゼを含まないことを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項６】
前記センサーは、細胞によるアルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定し、幹細胞の分化有無を確認することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項７】
前記脱リン酸化された基質は、１−ナフトール、カルシウムイオン、フェノール、２−アミノフェノール、４−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、３−インドキソール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキソール、４−メチルウンベリフェロール、６−クロロ−３−インドキソール及びヒドロキノンから構成された群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項８】
(ａ)請求項１乃至７のいずれかに記載の幹細胞分化測定用センサーを準備する段階と、
(ｂ)前記センサーに分析対象の細胞を接触させる段階と、
(ｃ)前記細胞による前記アルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定する段階と、
を含むことを特徴とする、幹細胞の分化有無を確認する方法。
【請求項１】
(ａ)電極及び(ｂ)アルカリホスファターゼの基質を含む幹細胞分化測定用センサー。
【請求項２】
前記電極は、金、銅、ガラス炭素、白金及びＡｇ/ＡｇＣｌ電極からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項３】
前記基質は、１−ナフチルホスフェート、カルシウムホスフェート、フェニルホスフェート、２−アミノフェニルホスフェート、４−アミノフェニルホスフェート、ｐ−アミノフェニルホスフェート、３−インドキシルホスフェート、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルホスフェート、４−メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)ホスフェート、６−クロロ−３−インドキシルホスフェート及びヒドロキノンジホスフェートから構成された群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項４】
前記幹細胞は、胚芽幹細胞または生殖幹細胞であることを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項５】
前記幹細胞は、未分化幹細胞の場合はアルカリホスファターゼを含み、分化幹細胞の場合はアルカリホスファターゼを含まないことを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項６】
前記センサーは、細胞によるアルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定し、幹細胞の分化有無を確認することを特徴とする、請求項１に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項７】
前記脱リン酸化された基質は、１−ナフトール、カルシウムイオン、フェノール、２−アミノフェノール、４−アミノフェノール、ｐ−アミノフェノール、３−インドキソール、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキソール、４−メチルウンベリフェロール、６−クロロ−３−インドキソール及びヒドロキノンから構成された群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の幹細胞分化測定用センサー。
【請求項８】
(ａ)請求項１乃至７のいずれかに記載の幹細胞分化測定用センサーを準備する段階と、
(ｂ)前記センサーに分析対象の細胞を接触させる段階と、
(ｃ)前記細胞による前記アルカリホスファターゼの基質の脱リン酸化または非脱リン酸化を電気的信号により測定する段階と、
を含むことを特徴とする、幹細胞の分化有無を確認する方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｃ】
【図１】
【図５ｂ】
【図３】
【図４】
【図５ａ】
【図５ｃ】
【図１】
【図５ｂ】
【公開番号】特開２０１０−２２７０８９（Ｐ２０１０−２２７０８９Ａ）
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２３９４０５（Ｐ２００９−２３９４０５）
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【出願人】（５０５４６３４５６）インダストリー−ユニバーシティ コオペレーション ファウンデーション ソギャン ユニバーシティ (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｏｇａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１０月１４日（２０１０．１０．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１０月１６日（２００９．１０．１６）
【出願人】（５０５４６３４５６）インダストリー−ユニバーシティ コオペレーション ファウンデーション ソギャン ユニバーシティ (9)
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｏｇａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
【Ｆターム（参考）】
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