非内因性ｐｏｌＩプロモーターを使用した逆遺伝学
宿主細胞が由来するのと同じ分類学上の目の生物にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターを使用して、宿主細胞中で導入遺伝子の発現が促進される。一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の発現構築物を含む宿主細胞を提供し、その発現構築物からのＲＮＡ分子の発現は、宿主細胞の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって調節される。本発明は、（ｉ）目的の導入遺伝子の発現が第１の生物由来のｐｏｌＩプロモーターによって促進される発現構築物を調製するステップと、（ｉｉ）第１の生物と異なる分類学上の目由来である宿主細胞中にステップ（ｉ）の発現構築物を導入するステップとを含む、宿主細胞中でＲＮＡを発現させるプロセスをさらに提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００９年５月２１日に出願された米国仮特許出願６１／２１６，９１９からの優先権を主張し、上記米国仮特許出願の全容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は逆遺伝学の分野にある。さらに、それは、様々なウイルスから保護するためのワクチンを製造することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
逆遺伝学は、細胞培養中でのＲＮＡウイルスの組換え発現および操作を可能にする。それは、（リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）を含む）組換えウイルスの迅速な産生および／またはその変異を可能とするため、ウイルス学およびワクチン製造における強力なツールである。その方法では、宿主細胞にウイルスゲノムをコードする１つまたは複数の発現構築物をトランスフェクトし、その細胞からウイルスを単離することを伴なう。例えば、特許文献１および２は、イヌｐｏｌＩプロモーターを使用してイヌ細胞中でインフルエンザゲノムＲＮＡを発現させる方法を記載している。他の出典は、ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用した、ヒト細胞中でのインフルエンザゲノムＲＮＡの発現を報告している。
【０００４】
従来技術の方法の１つの重大な欠点は、ｐｏｌＩプロモーターが高度に種特異的であることである。例えば、ヒトｐｏｌＩプロモーターは霊長目細胞中でのみ活性であり［非特許文献１］、同様にイヌ細胞中での発現ではイヌｐｏｌＩプロモーターが必要となることが報告されている。したがって、内因性ｐｏｌＩプロモーターが特徴付けられていない細胞系統中でウイルスを増殖させることが必要である場合、ウイルスをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）し増殖させる２つの異なる細胞型を使用することが必要であった。しかし、例えば競合培養選択圧を回避できる利点を有するので、複数の細胞系統の使用を回避することが望ましい。ワクチン産生のすべてのステップで単一の細胞系統を使用すると、規制認可も容易となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／００２００８号
【特許文献２】国際公開第２００７／１２４３２７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｏｕｄｓｔａａｌ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ（２００９）２７２５８８−２５９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、逆遺伝学を実施する代替の方法を提供することが当技術分野において必要であり続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（好ましい実施形態の概要）
本発明者らは、現時点で驚くべきことに、宿主細胞が由来するのと同じ分類学上の目の生物にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターを使用して、宿主細胞中での導入遺伝子の発現を促進（ｄｒｉｖｅ）することが可能であることを発見した。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の発現構築物を含む宿主細胞を提供し、その発現構築物（複数可）からのＲＮＡ分子の発現は、宿主細胞の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって調節される。これらの宿主細胞は、本発明の発現系で使用することができる。
【００１０】
本発明は、（ｉ）目的の導入遺伝子の発現が第１の生物由来のｐｏｌＩプロモーターによって促進される発現構築物を調製するステップと、（ｉｉ）第１の生物と異なる分類学上の目由来である宿主細胞中にステップ（ｉ）の発現構築物を導入するステップとを含む、宿主細胞中でＲＮＡを発現させるプロセスをさらに提供する。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、組換えウイルスを産生する方法を提供し、そのウイルスは、本発明の宿主細胞を使用して産生される。
【００１２】
本発明は、（ｉ）本発明の宿主細胞を使用して組換えウイルスを産生するステップと、（ｉｉ）培養宿主にステップ（ｉ）で得られたウイルスを感染させるステップと、（ｉｉｉ）ウイルスを産生させるためにステップ（ｉｉ）の培養宿主を培養するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたウイルスを精製するステップとを含む、（例えばワクチンへと処方するための）ウイルスを調製する方法も提供する。ワクチンを調製する方法を提供するために、その方法は次いで（ｖ）ウイルスをワクチンへと処方するさらなるステップを含むことができる。
【００１３】
上記で論じたように導入される非内因性ｐｏｌＩプロモーター（複数可）に加えて、宿主細胞は内因性ｐｏｌＩプロモーターを含む。非内因性ｐｏｌＩプロモーター（複数可）は、細胞中での非内因性ＲＮＡ、詳細にはウイルスＲＮＡの発現を促進する。したがって、本発明は、内因性ｒＲＮＡの発現を調節する少なくとも１つの内因性ｐｏｌＩプロモーター、およびウイルスＲＮＡまたはその相補体の発現を調節する少なくとも１つの非内因性ｐｏｌＩプロモーターを有する細胞を提供する。
【００１４】
本発明は、タンパク質コードｍＲＮＡもウイルスＲＮＡもコードするＤＮＡ発現構築物も提供し、（ｉ）タンパク質コードｍＲＮＡについてのＤＮＡ中のコドン使用頻度はイヌ細胞について最適化され、（ｉｉ）ウイルスＲＮＡは霊長目ｐｏｌＩプロモーターの調節下にある。イヌ細胞は、理想的にはＭＤＣＫ細胞であり、霊長目プロモーターは、理想的にはヒトｐｏｌＩプロモーターである。タンパク質コードｍＲＮＡの発現は、イヌ細胞について最適化されたｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にあってもよい。
【００１５】
（発現構築物）
本発明者らは、驚くべきことに、細胞中で、その細胞と異なる分類学上の目に入る生物由来のｐｏｌＩプロモーターを使用してＲＮＡ発現を促進することが可能であることを発見した。したがって、ｐｏｌＩプロモーターは、その細胞が由来するのと同じ分類学上の目の生物にとって内因性ではない。「目」という用語は慣用的な分類学上の順位付けを指し、目の例は、霊長目、齧歯目、食肉目、有袋目、クジラ目などである。ヒトおよびチンパンジーは同じ分類学上の目に入る（霊長目）が、ヒトとイヌは異なる目に入る（霊長目に対して食肉目）。
【００１６】
したがって、第１の態様では、本発明は、１つまたは複数の発現構築物を含む宿主細胞を提供し、その発現構築物（複数可）からのＲＮＡ分子の発現は、宿主細胞の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって促進される。
【００１７】
一実施形態では、宿主細胞は非霊長目細胞であり、ｐｏｌＩプロモーターは霊長目ｐｏｌＩプロモーターである。特定の実施形態では、宿主細胞は非霊長目細胞であり、プロモーターはヒトプロモーターである。さらなる実施形態では、宿主細胞は非ヒト細胞であり、ｐｏｌＩプロモーターはヒトｐｏｌＩプロモーターである。代替の実施形態では、ｐｏｌＩプロモーターは非イヌｐｏｌＩプロモーターであり、宿主細胞はイヌ細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞はイヌ細胞であり、プロモーターは霊長目ｐｏｌＩプロモーターである。さらなる好ましい実施形態では、ｐｏｌＩプロモーターはヒトプロモーターであり、宿主細胞は（ＭＤＣＫ細胞などの）イヌ細胞である。この実施形態は、ヒトｐｏｌＩプロモーターが十分に特徴付けられており、イヌ細胞がワクチンの産生にしばしば使用されるため、好ましい。
【００１８】
宿主細胞中で使用される発現構築物は、一方向性発現構築物でもよく、または両方向性発現構築物でもよい。宿主細胞が、（同じ発現構築物にあろうと異なる発現構築物にあろうと）１を超える導入遺伝子を発現する場合、一方向性および／または両方向性発現を使用することが可能である。
【００１９】
両方向性発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（すなわち、５’から３’と３’から５’の両方）で発現を促進する少なくとも２つのプロモーターを含有する。プロモーターの少なくとも１つは、本明細書で論じられている非内因性ｐｏｌＩプロモーターである。２つのプロモーターは、同じ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖と作動可能に連結することができる。好ましくは、プロモーターの１つは非内因性ｐｏｌＩプロモーターであり、その他のプロモーターの少なくとも１つはｐｏｌＩＩプロモーターである。ｐｏｌＩプロモーターを使用してキャップのないｃＲＮＡを発現させることができ、一方でｐｏｌＩＩプロモーターを使用して、その後タンパク質に翻訳することができるｍＲＮＡを転写することができ、それによって同じ構築物からＲＮＡおよびタンパク質の同時発現が可能となるため、これは有用である。ｐｏｌＩＩプロモーターは内因性でもよく、または非内因性でもよい。１を超える発現構築物が発現系内で使用される場合、プロモーターは、プロモーターの少なくとも１つが宿主細胞中で発現を促進できる非内因性ｐｏｌＩプロモーターであるという条件で、内因性および非内因性プロモーターの混合物でもよい。
【００２０】
発現構築物は、典型的にはＲＮＡ転写終結配列を含む。終結配列は内因性の終結配列でもよく、または宿主細胞にとって内因性ではない終結配列でもよい。適切な終結配列は当業者には明らかであり、その配列には、それだけに限らないが、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、およびリボザイムが含まれる。さらに、発現構築物は、特にその発現がｐｏｌＩＩプロモーターによって調節される遺伝子の末端に、ｍＲＮＡの１つまたは複数のポリアデニル化シグナルを含有してもよい。
【００２１】
発現系は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個または少なくとも１２個の発現構築物を含有してもよい。
【００２２】
発現構築物は、プラスミドまたは他のエピソーム性構築物などのベクターでよい。そのようなベクターは、典型的には少なくとも１つの細菌および／または真核生物の複製起点を含む。さらに、ベクターは、原核および／または真核細胞中での選択を可能とする選択可能マーカーを含んでもよい。そのような選択可能マーカーの例は、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子である。ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを容易にする１つまたは複数のマルチクローニング部位をさらに含んでもよい。
【００２３】
代替として、発現構築物は、直鎖発現構築物でもよい。そのような直鎖発現構築物は、典型的には増幅および／または選択配列を含有しない。しかし、そのような増幅および／または選択配列を含む直鎖構築物も本発明の範囲内にある。インフルエンザウイルスの発現にそのような直鎖発現構築物を使用する方法の例が参考文献４に記載されている。
【００２４】
本発明の発現構築物は、当技術分野で公知である方法を使用して得ることができる。そのような方法は、例えば、参考文献５に記載されたものである。発現構築物が直鎖発現構築物である場合、単一の制限酵素部位を利用して、宿主細胞への導入前にそれを直鎖化することが可能である。あるいは、少なくとも２つの制限酵素部位を使用して、ベクターから発現構築物を切り出すことが可能である。さらに、核酸増幅技術を使用して（例えば、ＰＣＲによって）それを増幅することによって、直鎖発現構築物を得ることも可能である。
【００２５】
当業者に公知である任意の技術を使用して、宿主細胞中に本発明の発現構築物を導入することができる。例えば、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクション、または微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を使用することによって、宿主細胞中に本発明の発現構築物を導入することができる。
【００２６】
発現宿主がＭＤＣＫ細胞系統などのイヌ細胞である場合、例えば、野生型イヌ遺伝子もしくはイヌウイルス由来のプロモーターを使用し、および／またはヒト細胞よりイヌ細胞に適したコドン使用頻度を有するようにすることで、イヌ発現についてタンパク質コード領域を最適化することができる。例えば、ヒト遺伝子はＰｈｅのコドンとしてＵＵＣを少し好むが（５４％）、イヌ細胞ではその優先性がより高い（５９％）。同様に、ヒト細胞ではＩｌｅコドンについて多数派となる優先性は認められないが、イヌコドンの５３％がＩｌｅにＡＵＣを使用する。イヌパルボウイルス（ｓｓＤＮＡウイルス）などのイヌウイルスがコドンを最適化するための指針をもたらすこともでき、例えば、イヌパルボウイルス配列においてＰｈｅコドンの９５％がＵＵＵであり（対してイヌゲノムでは４１％）、Ｉｌｅコドンの６８％がＡＵＵであり（対して３２％）、Ｖａｌコドンの４６％がＧＵＵであり（対して１４％）、Ｐｒｏコドンの７２％がＣＣＡであり（対して２５％）、Ｔｙｒコドンの８７％がＵＡＵであり（対して４０％）、Ｈｉｓコドンの８７％がＣＡＵであり（対して３９％）、Ｇｌｎコドンの９２％がＣＡＡであり（対して２５％）、Ｇｌｕコドンの８１％がＧＡＡであり（対して４０％）、Ｃｙｓコドンの９４％がＵＧＵであり（対して４２％）、Ｓｅｒコドンのわずか１％がＵＣＵであり（対して２４％）、ＣＣＣはＰｈｅに使用されず、ＵＡＧは終止コドンとして使用されない。したがって、タンパク質コード遺伝子を、イヌ細胞中での発現について自然にすでに最適化されている遺伝子のようにすることができ、それによって発現が容易となる。
【００２７】
（逆遺伝学）
上記に記載の発現構築物および宿主細胞は、逆遺伝学技術により組換えウイルス株を産生するのに特に適している。その技術を、プラス鎖ＲＮＡウイルス［６、７］、マイナス鎖ＲＮＡウイルス［８，９］および二本鎖ＲＮＡウイルス［１０］を含めた幅広いＲＮＡウイルスの産生に使用することができる。したがって、さらなる態様では、本発明は、組換えウイルスを産生する方法を提供し、そのウイルスは、上記に記載の発現系を使用して産生される。
【００２８】
公知の逆遺伝学系では、ｐｏｌＩプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどから所望のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子をコードするＤＮＡ分子を発現させることを伴なう。さらに、ウイルスが感染性ウイルスを形成するのに特定のタンパク質を必要とする場合、系はこれらのタンパク質をも提供し、例えば、その系は、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含み、その結果、両方の型のＤＮＡを発現させると完全な感染性ウイルスが構築される。
【００２９】
逆遺伝学がｖＲＮＡの発現に使用される場合、配列エレメントの互いに対する正確な間隔が、ポリメラーゼが複製を開始するのに極めて重要であることが当業者には明らかであろう。したがって、ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子をｐｏｌＩプロモーターと終結配列との間に正しく位置付けることが重要であるが、この位置付けは、逆遺伝学系を用いて作業する者の能力の十分に範囲内にある。
【００３０】
一般に、逆遺伝学は、その生活環の間にゲノムＲＮＡの産生を必要とすることが知られている任意のウイルスの発現に適している。そのようなウイルスには、それだけに限らないが、下記に記載するものなどのプラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、ウイルスはオルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルスである。本発明の方法は、分節型（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）ウイルスに加えて、非分節型ウイルスにさらに適している。
【００３１】
ウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスゲノムを含む発現構築物を細胞にトランスフェクトすると十分であることが多い。例えば、ポリオウイルスゲノムを含有するプラスミドのトランスフェクションの結果、感染性ポリオウイルスが収集される［６、７］。アンチセンスウイルスＲＮＡは通常非感染性であり、生活環を完了するのにＲＮＡポリメラーゼを必要とするため、マイナス鎖ＲＮＡウイルスでの逆遺伝学はより難題を提示している。したがって、インサイチュータンパク質発現ではタンパク質または遺伝子としてのいずれかで、ウイルスポリメラーゼが供給されなければならない。
【００３２】
ウイルスが感染性のためにタンパク質を必要とする場合、宿主細胞によって必要とされる発現構築物の総数を減らすので、両方向性発現構築物を使用することが一般に好ましい。したがって、本発明の方法は、遺伝子またはｃＤＮＡが上流のｐｏｌＩＩプロモーターと下流の非内因性ｐｏｌＩプロモーターとの間に位置する少なくとも１つの両方向性発現構築物を利用することができる。ｐｏｌＩＩプロモーターから遺伝子またはｃＤＮＡが転写されると、タンパク質に翻訳することができる、キャップの付いたプラスセンスウイルスｍＲＮＡが産生されるが、非内因性ｐｏｌＩプロモーターから転写されると、マイナスセンスｖＲＮＡが産生される。両方向性発現構築物は両方向性発現ベクターでよい。
【００３３】
組換えウイルスを産生するために、細胞は、ビリオンを構築するのに必要なウイルスゲノムのすべての分節を発現しなければならない。本発明の発現構築物中にクローニングされたＤＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全部を提供し、ヘルパーウイルスを使用しない系が好ましいがヘルパーウイルスを使用してＲＮＡおよびタンパク質の一部を提供することも可能である。ウイルスが非分節型ウイルスである場合、１を超える発現構築物を使用して非分節型ウイルスのウイルスゲノムを発現させることも本発明の範囲内にあるが、通常は本発明の方法で単一の発現構築物を利用することによってこれを実現することができる。ウイルスが分節型ウイルスである場合、通常は本発明の方法で１を超える発現構築物を使用してウイルスゲノムを発現させる。しかし、単一の発現構築物上でウイルスゲノムの１つまたは複数の分節を、またはすべての分節をも組み合わせることも想像される。
【００３４】
本発明の方法は、リアソータントウイルス株の産生に特に適している。その技術は、プラスミドのインビトロ操作を使用して、ウイルス分節の組合せを得、ウイルス分節中のコードまたは非コード配列の操作を容易にし、変異を導入することなどができる。リアソータントウイルス株の産生での発現系の使用は、流行に対抗するのにワクチンの迅速な産生が必要である状況で特に有益なリアソータント種ウイルスを得るのに必要な時間を著しく低下させることができるので好ましい。したがって、本発明のこの態様の方法は、少なくとも２つの異なる野生型株からのまたはそれに由来するウイルス遺伝子を発現する１つまたは複数の発現構築物を使用することが好ましい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞中でアクセサリータンパク質の発現を導く発現構築物も含まれる。例えば、逆遺伝学系の一部として非ウイルス性セリンプロテアーゼ（例えばトリプシン）を発現させると有利となり得る。
【００３６】
本発明の発現構築物をインフルエンザＡ型ウイルス分節の発現に使用するとき、ネガティブ選択マーカー（例えばｃｃｄＢ）および高度に保存されているインフルエンザＡ型ウイルス遺伝子末端［１１］を含む発現構築物中にインフルエンザＡ型ウイルス分節を導入することによって、発現構築物を得ることが可能である。この利点は、制限部位が必要でなく、発現構築物上の遺伝子末端と相補的である末端を有するという条件で任意のインフルエンザＡ型ウイルス分節をクローニングできることである。
【００３７】
（細胞）
目的のウイルスを産生することができる任意の真核または原核細胞を用いて、本発明を実施することができる。本発明は典型的には細胞系統を使用するが、例えば、代替として初代細胞を使用することができる。細胞は典型的には哺乳動物のものである。適切な哺乳動物細胞には、それだけに限らないが、ハムスター、ウシ、（ヒトおよびサルを含む）霊長目およびイヌ細胞が含まれる。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など様々な細胞型を使用することができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称を有する細胞系統である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系統のような腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である［１２〜１４］。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系統のような腎臓細胞である。
【００３８】
さらなる適切な細胞には、それだけに限らないが、ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ ５；ＰＥＲ．Ｃ６［１５］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８などが含まれる。適切な細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［１６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［１７］またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ ８１、ＣＣＬ ８１．２、ＣＲＬ １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ ３４の下でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００３９】
本発明での使用に（特にインフルエンザウイルスの増殖に）好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞である［１８〜２０］。元々のＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ ３４としてＡＴＣＣから入手可能である。これらの細胞または他のＭＤＣＫ細胞の誘導体を使用することが好ましい。そのような誘導体は、例えば、懸濁培養中での増殖に適合させたＭＤＣＫ細胞を開示する参考文献１８に記載されたものである（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ３３０１６」または「３３０１６−ＰＦ」；参考文献１８も参照）。さらに、参考文献２１は、無血清培地中で懸濁状態で増殖するＭＤＣＫ由来細胞を開示する（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。いくつかの実施形態では、使用するＭＤＣＫ細胞系統は腫瘍形成性でもよい。非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することも想像される。例えば、参考文献２２は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０３）を含めた非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献２３は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０４２）を含めた、感染に高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞を開示する。
【００４０】
１を超える細胞型の混合物を使用して、本発明の方法を実施することが可能である。しかし、単一の細胞型、例えばモノクローナル細胞を用いて本発明の方法を実施することが好ましい。好ましくは、本発明の方法で使用する細胞は、単一の細胞系統由来である。さらに、ウイルスのレスキューおよびウイルスの任意のその後の増殖に同じ細胞系統を使用することができる。
【００４１】
好ましくは、血清の不在下で細胞を培養して、汚染物の共通供給源を回避する。真核細胞培養用の様々な無血清培地が当業者に公知である（例えば、イスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地を使用することができる（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。そうでなければ、複製用の細胞を通例の血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％の胎仔ウシ血清を有するＭＥＭまたはＤＭＥＭ培地）で培養することもできる。
【００４２】
細胞は付着培養でもよく、または懸濁状態でもよい。
【００４３】
（適切な細胞系統のスクリーニング）
本発明に従って使用するのに適した細胞は広く入手可能である。さらに、当技術分野で一般に公知である技術を使用して、さらなる細胞をスクリーニングすることが可能である。適切な細胞のスクリーニングは、例えば、新たなｐｏｌＩプロモーターが同定され、その新たなプロモーターによる発現を支援する細胞系統を見つけることが望ましい場合に必要となる可能性がある。同様に、新たな細胞が単離された場合、どのｐｏｌＩプロモーターがその中で発現を促進できるかを確認することが必要となる可能性がある。
【００４４】
細胞のスクリーニングに適した技術は当業者には明らかである。例えば、目的のｐｏｌＩプロモーターの調節下でレポーター遺伝子をクローニングすることができ、スクリーニングする細胞系統に構築物をトランスフェクトすることができる。そのような実験では、レポーター遺伝子を含有するがプロモーター配列を欠く構築物をトランスフェクトした細胞を対照として使用することができる。したがって、試験試料（例えば、目的のｐｏｌＩプロモーターの調節下で導入遺伝子を含有する細胞）中での遺伝子の発現が対照（例えば、試験試料と同じ導入遺伝子を含有するが、その導入遺伝子が導入遺伝子の発現を促進するプロモーターを含有しない細胞）中での発現より著しく高い場合、その細胞系統は、本発明によるそのプロモーターと共に使用するのに適している。導入遺伝子の発現は、例えば、導入遺伝子ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに供することによって測定することができる。あるいは、ｐｏｌＩプロモーターの調節下でアンチセンスの方向でレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｌｕｃなど）をクローニングすることも可能である。次いでウイルスポリメラーゼによってそのような構築物からの転写物をｍＲＮＡに転写し、その後タンパク質に翻訳することができる。したがって、レポーター遺伝子産物の存在によって、レポーター遺伝子を発現する任意の細胞を容易に同定することができる。
【００４５】
ｐｏｌＩプロモーターが発現を促進できる細胞が得られるように、正常なら外来ｐｏｌＩが発現を促進しない細胞を適合させることがさらに可能である。これは、例えば、細胞を正常ならそれに適さない増殖条件に供することによって実現することができる。例えば、正常なら付着してしか増殖しない細胞系統を懸濁状態で人工的に保持することができ、これらの条件下で増殖し続ける細胞をさらに増殖させることができる。あるいは、通常なら懸濁状態で増殖する細胞を、例えば、高結合性プラスチック培養ベッセルを使用して、または培養物に血清を添加することによって付着培養することが可能である。同様に、正常ならその増殖に血清を必要とする細胞を無血清条件下で増殖させること、または逆に、無血清増殖に適合させた細胞を血清に曝露することが可能である。次いで、先に記載したように、選択された細胞をｐｏｌＩプロモーターの活性についてアッセイすることができる。このようにして変化させることができるさらなる適切な増殖パラメーターは当業者には明白であり、そのパラメーターには、それだけに限らないが、温度、ｐＨ、ｐＯ２、血清濃度などが含まれる。さらに、細胞をＵＶ放射などの物理的もしくは化学的処理に、または化学的変異原に供することができる。同様に、正常な培養条件下で単に継代された細胞の新たな特性についてスクリーニングすることが可能である。
【００４６】
例えば、参考文献１８は、ＭＤＣＫ細胞（通常は付着性）を無血清条件下における懸濁状態での増殖に適合させた方法を記載している。懸濁状態で増殖する細胞を培養するのに通常使用される条件下で、ローラーボトルに入れた無血清培地中で開始細胞を培養した。これらの選択的条件下で数回継代した後、無血清培地中で懸濁状態で増殖できるいくつかの細胞系統が得られた。１つの例は、３３０１６細胞系統（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託）である。本発明者らは、ヒトｐｏｌＩプロモーターがこれらのＭＤＣＫ細胞中でレポーター遺伝子の発現を促進できることを実証している。
【００４７】
（ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター）
ほとんどの逆遺伝学の方法は、ウイルスゲノムＲＮＡの転写を促進するＲＮＡポリメラーゼＩ（ＲＮＡｐｏｌＩ）プロモーターを含む発現ベクターを使用する。ｐｏｌＩプロモーターは、多くのウイルス、例えばインフルエンザの完全な感染性に必要である、修飾されていない５’および３’末端を有する転写物をもたらす。
【００４８】
天然のｐｏｌＩプロモーターは２つの部分からなり、２つの別々の領域：コアプロモーターおよび上流プロモーターエレメント（ＵＰＥ）を有する。この一般的な構成はほとんどの種由来のｐｏｌＩプロモーターに共通するが、プロモーターの実際の配列は広く様々である。コアプロモーターは転写開始点を取り囲み、約−４５から＋２０にわたり、転写を開始するのに十分である。コアプロモーターは一般にＧＣリッチである。コアプロモーターは単独で転写を開始するのに十分であるが、プロモーターの効率は、ＵＰＥによって非常に増大する。ＵＰＥは、典型的には約−１８０から−１０７にわたり、やはりＧＣリッチである。開始前複合体を安定化することによって機能することができる遠位のエンハンサー様配列の存在によって、プロモーターの活性をさらに増強することができる。
【００４９】
ｐｏｌＩプロモーターの配列は、ヒト、イヌおよびニワトリを含めた様々な種で同定されている。本発明は、宿主細胞と同じ分類学上の目にある生物にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターを使用する。したがって、「内因性」および「非内因性」という用語は、宿主細胞および発現構築物中に存在するｐｏｌＩプロモーターに関連して使用される。ｐｏｌＩプロモーターにおける種間の配列の変動は、細胞中の任意の特定のｐｏｌＩプロモーターが内因性であるかまたは非内因性であるかを判定することが簡単であることを意味する。したがって、本発明は、ｐｏｌＩプロモーターと同じ分類学上の目に由来しない宿主細胞中でのＲＮＡ発現にヒト、イヌまたはニワトリｐｏｌＩプロモーターを利用することができる（例えば、イヌ宿主細胞中での霊長目ｐｏｌＩプロモーター）。インシリコのまたは実験的な配列比較を使用して、任意の特定のｐｏｌＩプロモーターが由来する生物を確認することができ、例えば、図１０は、＜６０％の配列同一性を有する、転写開始部位までのイヌｐｏｌプロモーターおよびヒトｐｏｌプロモーターのアラインメントを示す。
【００５０】
本発明の発現構築物は、少なくとも１つのコアプロモーターを含み、好ましくは少なくとも１つのＵＰＥも含み、１つまたは複数のエンハンサーエレメントも含んでもよい。転写を開始できるという条件で、天然のプロモーターの断片を使用することも可能である。例えば、図３は、完全長イヌｐｏｌＩプロモーター（配列番号３）および導入遺伝子の発現を促進するのに十分である様々な断片の配列を示す（図４ならびに配列番号４および５も参照）。さらに、図２は、ヒトｐｏｌＩプロモーター（配列番号１）および単独で宿主細胞中での導入遺伝子の発現に十分であるその断片の配列を示す（図５および配列番号２も参照）。
【００５１】
本発明に従って使用することができるヒトｐｏｌＩプロモーターは、配列番号１もしくは配列番号２の配列、またはその改変体を含んでよい。本発明に従ってイヌプロモーターが使用される場合、それは、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の配列、またはその改変体を含んでよい。
【００５２】
ｐｏｌＩプロモーターは、プロモーターが目的の宿主細胞中で作動可能に連結したＲＮＡのコードする配列の転写を開始および促進する能力を有するという条件で、（ｉ）配列番号１〜５のいずれかと少なくともｐ％の配列同一性を有する配列、および／または（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの断片を含んでよい。ｐの値は、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上でよい。断片はそれ自体で発現を促進するのに十分な長さのものでもよく（例えば配列番号４は配列番号３の断片である）、または断片は他の配列と結合していてもよく、この組合せが発現を促進する。そのようなｐｏｌＩプロモーターが目的の宿主細胞中で発現を促進する能力は、例えば、プロモーターの調節下でアンチセンスレポーター遺伝子を用いる上記に記載のアッセイを使用して容易に評価することができる。
【００５３】
（ウイルス調製）
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の組換えウイルスを産生するステップと、（ｉｉ）培養宿主にステップ（ｉ）で得られたウイルスを感染させるステップと、（ｉｉｉ）ウイルスを産生させるためにステップ（ｉｉｉ）の宿主を培養するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたウイルスを精製するステップと、（任意選択で）（ｖ）ウイルスをワクチンへと処方するステップとを含む、ワクチン製造用のウイルスを調製する方法を提供する。
【００５４】
本発明のこの態様において細胞を培養宿主として使用する場合、使用する細胞系統およびウイルスに対し、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が広い範囲の対象にわたって変化し、適用の必要条件にそれを適合させることができることが知られている。したがって、以下の情報は単にガイドラインを表すに過ぎない。
【００５５】
上記で述べたように、好ましくは無血清または無タンパク質培地中で細胞を培養する。
【００５６】
当業者に公知の方法に従って細胞を増加（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）させることができる。例えば、遠心分離または濾過のような通常の支援方法を使用して、灌流系で細胞を培養することができる。さらに、感染前に流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）系で本発明に従って細胞を増加させることができる。本発明の場面において、培養系は流加系と称され、その系では最初に細胞をバッチ系で培養し、培地中の栄養素（または栄養素の一部）の減少は濃縮栄養素の管理補給によって補償される。感染前の細胞の増加の間に培地のｐＨ値をｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の値、特にｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の値に調整すると有利となり得る。好ましくは、３０〜４０℃の温度で細胞の培養を行う。ステップ（ｉｉｉ）において、好ましくは３０℃〜３６℃、または３２℃〜３４℃、または３３℃の温度で細胞を培養する。この温度範囲での感染細胞のインキュベーションの結果、ワクチンへと処方したときに効力が向上したウイルスが産生されることが示されているので［２４］、これは、本発明の方法を使用してインフルエンザウイルスを産生する場合に特に好ましい。
【００５７】
感染前の培養の間に酸素分圧を好ましくは２５％〜９５％の値に、特に３５％〜６０％の値に調整することができる。本発明の場面において述べる酸素分圧の値は、空気の飽和に基づいている。細胞の感染は、好ましくはバッチ系で細胞約８〜２５×１０５個／ｍＬ、または好ましくは灌流系で細胞約５〜２０×１０６個／ｍＬの細胞密度で行う。１０−８〜１０、好ましくは０．０００１〜０．５のウイルス用量（ＭＯＩ値、「感染多重度」；感染時における細胞１個当たりのウイルス単位の数に対応する）で細胞に感染させることができる。
【００５８】
付着培養中または懸濁状態の細胞でウイルスを増殖させることができる。マイクロキャリア培養を使用することができる。いくつかの実施形態では、こうして細胞を懸濁状態での増殖に適合させることができる。
【００５９】
本発明による方法は、ウイルスまたはそれによって生じるタンパク質の収集および単離も含む。ウイルスまたはタンパク質の単離の間に、分離、濾過または限外濾過のような標準的な方法によって培地から細胞を分離する。次いで、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどのような、当業者に十分に公知である方法に従って、ウイルスまたはタンパク質を濃縮し、その後精製する。本発明によれば、精製の間またはその後にウイルスを不活性化することも好ましい。ウイルス不活性化は、例えば、精製プロセス内の任意の時点でβ−プロピオラクトンまたはホルムアルデヒドによって行うことができる。
【００６０】
ステップ（ｉ）において単離されたウイルスを、ステップ（ｉｉ）において卵で増殖させることもできる。ワクチン用にインフルエンザウイルスを増殖させる現在の標準的な方法は孵化ＳＰＦ鶏卵を使用し、ウイルスは卵内容物（尿膜腔液）から精製される。卵を介してウイルスを継代し、その後細胞培養でそれを増殖させることも可能である。
【００６１】
（ウイルス）
細胞中で逆遺伝学によって発現させることができる任意のウイルスを用いて、本発明の方法を実施することができる。そのようなウイルスは、分節型ウイルスでもよく、または非分節型ウイルスでもよい。さらに、ウイルスはプラス鎖ＲＮＡウイルスでもよく、またはマイナス鎖ウイルスでもよい。さらなる実施形態では、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスでもあり得る。
【００６２】
ウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、またはアレナウイルス科からなる群より選択される科のものでよい。さらに、ウイルスは、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レスピロウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ヘニパウイルス（Ｈｅｎｉｐａｖｉｒａｓ）、アブラウイルス、ニューモウイルス、メタニューモウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス、ヌクレオラブドウイルス、ノビラブドウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、ボルナウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型、トゴトウイルス、イサウイルス、オルトブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、アレナウイルス、オフィオウイルス、テヌイウイルス、またはデルタウイルスからなる群より選択される属のウイルスでよい。特定の実施形態では、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、センダイウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヘンドラウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトＲＳウイルス、トリニューモウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ一日熱ウイルス、レタス壊死性黄変病ウイルス、ポテト黄萎病ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ザイールエボラウイルス、ボルナ病ウイルス、インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、ブンヤムウェラウイルス、ハンターンウイルス、ジュグベウイルス、リフトバレー熱ウイルス、トマト黄化壊疽ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、カンキツソローシスウイルス、イネ縞葉枯ウイルス、およびデルタ型肝炎ウイルスからなる群より選択される。好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである（下記を参照）。
【００６３】
ウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科およびロニウイルス科からなる群より選択される科のものでよい。さらに、ウイルスは、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｕｓ）、コロナウイルス、エンテロウイルス、トロウイルス、オカウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、パレコウイルス、エルボウイルス、コブウイルスおよびテシオウイルスからなる群より選択される属のウイルスでよい。特定の実施形態では、ウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ポリオウイルス、ヒトエンテロウイルスＡ型（ＨＥＶ−Ａ）、ヒトエンテロウイルスＢ型（ＨＥＶ−Ｂ）、ヒトエンテロウイルスＣ型、ヒトエンテロウイルスＤ型、肝炎Ａ型ならびにヒトライノウイルスＡおよびＢ型からなる群より選択される。
【００６４】
ウイルスが二本鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、ビルナウイルス科、シストウイルス科、ハイポウイルス科、パーティティウイルス科、レオウイルス科およびトティウイルス科からなる群より選択される科のものでよい。さらに、ウイルスは、アクアビルナウイルス、アビビルナウイルス、エントモビルナウイルス、シストウイルス、パーティティウイルス、アルファクリプトウイルス、ベータクリプトウイルス、アクアレオウイルス、コルチウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、イドノレオウイルス、マイコレオウイルス、オルビウイルス、オルトレオウイルス、オリザウイルス、フィトレオウイルス、ロタウイルスおよびシードルナウイルスからなる群より選択される属のウイルスでよい。
【００６５】
本発明は、迅速な変異を起こすウイルス、および組換えの手法がウイルスのより迅速な単離を可能にし、次いでそれをさらに増殖させて適切なワクチンを得ることができる場合に特に適している。したがって、好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザである。
【００６６】
（インフルエンザウイルス）
インフルエンザウイルス、特にインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスは、このウイルスの逆遺伝学が十分に特徴付けられているため、本発明の方法での使用に特に適している。インフルエンザウイルスは、分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡおよびＢ型ウイルスは分節を８個有するが、インフルエンザＣ型ウイルスは７個有する。上記ウイルスは、複製および転写を開始するのに少なくとも４個のウイルスタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよび核タンパク質）を必要とする。
【００６７】
インフルエンザＡおよびＢ型ウイルスの逆遺伝学は、４個の必要なタンパク質および８個すべてのゲノム分節を発現する１２個のプラスミドを用いて実施することができる。しかし、構築物の数を減らすために、単一のプラスミドに（ウイルスＲＮＡ合成用の）複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個すべてのインフルエンザｖＲＮＡ分節をコードする配列）を、別のプラスミドにＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個のインフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を含めることができる［２５］。同じプラスミドに、ｐｏｌＩプロモーターの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザｖＲＮＡ分節および別のプロモーター、詳細にはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザタンパク質コード領域を含めることも可能である。上記に記載のように、これは、好ましくは、両方向性プラスミドを使用することによってなされる。参考文献２５の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミドにあるＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡをコードする領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミドにある８個すべてのｖＲＮＡをコードする分節を伴う。１つのプラスミドにノイラミニダーゼ（ＮＡ）および赤血球凝集素（ＨＡ）分節を、別のプラスミドに６個の他の分節を含めると、新たに現れるインフルエンザウイルス株は通常ＮＡおよび／またはＨＡ分節中に変異を有するため、特に好ましい。したがって、この実施形態では、ＨＡおよびＮＡ配列を含むベクターだけを置換することが必要である。
【００６８】
インフルエンザＡ型ウイルスの好ましい発現系は、複数の異なる野生型株に由来するゲノム分節をコードする。その系は、ＰＲ／８／３４株（Ａ／プエルトリコ／８／３４）由来の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のゲノム分節をコードしてもよいが、通常これ／これらはＰＲ／８／３４ＨＡ分節を含まず、通常ＰＲ／８／３４ＮＡ分節を含まない。したがって、その系は、ＰＲ／８／３４由来の分節ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２の少なくとも１つ（場合により６個すべて）をコードしてもよい。
【００６９】
インフルエンザＡ型ウイルスの他の有用な発現系は、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／アナーバー／６／６０）由来の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のゲノム分節をコードしてもよいが、通常これ／これらはＡＡ／６／６０ＨＡ分節を含まず、通常ＡＡ／６／６０ＮＡ分節を含まない。したがって、その系は、ＡＡ／６／６０由来の分節ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２の少なくとも１つ（場合により６個すべて）をコードしてもよい。
【００７０】
その系は、Ａ／カリフォルニア／４／０９株由来の１個または複数のゲノム分節、例えばＨＡ分節および／またはＮＡ分節をコードしてもよい。したがって、例えば、ＨＡ遺伝子分節は、配列番号７より配列番号６に密接に関連する（すなわち、同じアルゴリズムおよびパラメーターを使用して配列番号７より配列番号６と比較したときに高度の配列同一性を有する）Ｈ１赤血球凝集素をコードしてもよい。配列番号６および７は８０％同一である。同様に、ＮＡ遺伝子は、配列番号９より配列番号８に密接に関連するＮ１ノイラミニダーゼをコードしてもよい。配列番号８および９は８２％同一である。
【００７１】
インフルエンザＢ型ウイルスの発現系は、複数の異なる野生型株に由来するゲノム分節をコードしてもよい。その系は、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／アナーバー／１／６６）由来の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のゲノム分節をコードしてもよいが、通常これ／これらはＡＡ／１／６６ＨＡ分節を含まず、通常ＡＡ／１／６６ＮＡ分節を含まない。したがって、その系は、ＡＡ／１／６６由来の分節ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２の少なくとも１つをコードしてもよい。
【００７２】
Ａ／ＰＲ／８／３４、ＡＡ／６／６０、ＡＡ／１／６６、Ａ／チリ／１／８３およびＡ／カリフォルニア／０４／０９株由来のウイルス分節および配列は広く入手可能である。それらの配列、例えばＧＩ：８９７７９３３７、ＧＩ：８９７７９３３４、ＧＩ：８９７７９３３２、ＧＩ：８９７７９３２０、ＧＩ：８９７７９３２７、ＧＩ：８９７７９３２５、ＧＩ：８９７７９３２２、ＧＩ：８９７７９３２９は、公的データベースで入手可能である。
【００７３】
インフルエンザウイルスの逆遺伝学系は、宿主細胞中でアクセサリータンパク質の発現を導く発現構築物を含んでよい。例えば、非ウイルス性セリンプロテアーゼ（例えばトリプシン）を発現させると有利となり得る。
【００７４】
（ワクチン）
本発明の第３の態様の方法は、ワクチンを産生する方法に従って産生されたウイルスを利用する。
【００７５】
（特にインフルエンザウイルスの）ワクチンは一般に生ウイルスまたは不活性化ウイルスに基づいている。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、または精製表面抗原に基づき得る。抗原は、ビロソームの形態で提示することもできる。これらの型のワクチンのいずれかを製造するのに本発明を使用することができる。
【００７６】
不活性化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、（インフルエンザでは赤血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む）全ビリオン、スプリットビリオン、または精製表面抗原を含んでよい。ウイルスを不活性化する化学的手段には、有効量の１つまたは複数の以下の作用物質：洗浄剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはその組合せでの処理が含まれる。例えばＵＶ光またはガンマ線照射など、ウイルス不活性化の非化学的方法が当技術分野で公知である。
【００７７】
ウイルス含有流体、例えば尿膜腔液または細胞培養上清から、様々な方法によってビリオンを収集することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する洗浄剤を含む直線的スクロース勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を伴うことがある。次いで、任意選択の希釈後に、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。
【００７８】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリット化プロセスを含めて、精製ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を作製することによって得られる。例えば、インフルエンザウイルスをスプリット化する方法は当技術分野で周知であり、例えば参考文献２６〜３１等を参照されたい。典型的には、ウイルスのスプリット化は、感染性であれまたは非感染性であれ全ウイルスを破壊濃度のスプリット化剤で破壊または断片化することによって実施される。破壊の結果、ウイルスタンパク質が完全にまたは部分的に可溶化され、ウイルスの完全性が変化する。好ましいスプリット化剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎＮ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用なスプリット化手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な効果を使用し、最初のビリオン精製の間に（例えばスクロース密度勾配溶液中で）スプリット化を行うことができる。したがって、スプリット化プロセスは、（非ビリオン物質を除去する）ビリオン含有物質の清澄化、（例えばＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を使用する）収集されたビリオンの濃縮、非ビリオン物質からの全ビリオンの分離、（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリット化剤を含有するスクロース勾配を使用した）密度勾配遠心分離ステップにおけるスプリット化剤を使用したビリオンのスプリット化、次いで所望されない物質を除去する濾過（例えば限外濾過）を伴い得る。有用なことに、リン酸ナトリウム緩衝等張性塩化ナトリウム溶液中でスプリットビリオンを再懸濁することができる。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品である。
【００７９】
本発明の方法を使用して、生ワクチンを産生することもできる。そのようなワクチンは通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、その流体を遠心分離によって清澄化し、（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸ナトリウムを含有する）緩衝液を用いて安定化することができる。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在入手可能である（例えば、参考文献３２の第１７および１８章を参照）。生ウイルスワクチンには、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品（三価の生ウイルスワクチン）が含まれる。
【００８０】
精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは表面抗原の赤血球凝集素を、また典型的にはノイラミニダーゼも含む。精製形態でこれらのタンパク質を調製するプロセスは当技術分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品はインフルエンザサブユニットワクチンである。
【００８１】
別の形態の不活性化抗原はビロソーム［３３］（核酸を含まないウイルス様のリポソーム粒子）である。ビロソームは、洗浄剤でウイルスを可溶化し、その後ヌクレオキャプシドを除去し、ウイルス糖タンパク質を含有する膜を再構成することによって調製することができる。ビロソームを調製する代替の方法では、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、その膜中にウイルスタンパク質を有するリポソームを得ることを含む。
【００８２】
ウイルスは弱毒化されていてもよい。ウイルスは温度感受性でもよい。ウイルスは寒冷に適合していてもよい。これら３つの特徴は、抗原として生ウイルスを使用するときに特に有用である。
【００８３】
ＨＡは現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定されるＨＡレベルを参照することによって標準化される。既存のワクチンは、典型的には１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば、小児に、または世界的流行の状況で、またはアジュバントを使用するときには低い用量を使用することができる。高用量（例えば３×または９×の用量［３４、３５］）と同様に、２分の１（すなわち、１株当たりＨＡ７．５μｇ）、４分の１や８分の１などの分数用量が使用されている。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株当たり０．１〜１５０μｇ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどのＨＡを含んでよい。特定の用量は、例えば、１株当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などを含む。
【００８４】
生ワクチンでは、ＨＡ含量ではなく中央組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって投与量を測定し、１株当たり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【００８５】
本発明と共に使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスで認められる天然のＨＡを有してもよく、または改変されたＨＡを有してもよい。例えば、ＨＡを改変して、トリの種においてウイルスを高度に病原性にする決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りにある超塩基性領域）を除去することが知られている。逆遺伝学の使用は、そのような改変を容易にする。
【００８６】
ワクチンで使用するインフルエンザウイルス株は季節によって変化する。世界的流行間期では、ワクチンは、典型的には２つのインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ型株を含み、三価のワクチンが典型的である。本発明は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株など、世界的流行ウイルス株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般のヒト集団が免疫学的にナイーブである、詳細にはインフルエンザＡ型ウイルスの株）を使用することもでき、世界的流行株のインフルエンザワクチンは一価でもよく、または世界的流行株によって補充される通常の三価のワクチンに基づいていてもよい。しかし、季節およびワクチンに含まれる抗原の性質に応じて、本発明はＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１つまたは複数に対して保護することができる。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１つまたは複数に対して保護することができる。
【００８７】
世界的流行間期株に対する免疫化に適しているのと同様に、本発明の組成物は、世界的流行株または潜在的に世界的流行性のある株に対する免疫化に特に有用である。世界的流行の発生を引き起こす潜在性をもたらすインフルエンザ株の特徴は：（ａ）現在循環しているヒト株中の赤血球凝集素と比較して新たな赤血球凝集素、すなわち１０年にわたってヒト集団において明らかとなっていないもの（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団において以前に全く見られていないもの（例えば、トリ集団においてのみ一般に見つかっているＨ５、Ｈ６またはＨ９）を含有し、その結果、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）ヒト集団において水平に伝染する能力があること；（ｃ）ヒトに対して病原性があることである。Ｈ５赤血球凝集素型のウイルスは、Ｈ５Ｎ１株など、世界的流行性インフルエンザに対する免疫化に好ましい。他の考えられる株には、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の潜在的に世界的流行性のある新興の株が含まれる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと広がることができるか、または広がっている潜在的な世界的流行ウイルス株、例えばブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対して保護するのに特に適している。次いで本発明はヒトならびに非ヒト動物へのワクチン接種に適している。
【００８８】
有用なことにその抗原を組成物中に含めることができる他の株は、耐性の世界的流行株を含めて［３７］、抗ウイルス療法に耐性である（例えば、オセルタミビル［３６］および／またはザナミビルに耐性である）株である。
【００８９】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含めた１つまたは複数の（例えば１、２、３、４つまたはそれ以上の）インフルエンザウイルス株由来の抗原（複数可）を含んでよい。ワクチンがインフルエンザの１を超える株を含む場合、典型的には異なる株を別々に増殖させ、ウイルスを収集し抗原を調製した後に混合する。したがって、本発明のプロセスは、１を超えるインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含んでよい。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む三価のワクチンが典型的である。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む四価のワクチンも有用である［３８］。
【００９０】
（医薬組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は薬学的に許容される。それは通常、抗原に加えて構成成分を含み、例えば典型的には１つまたは複数の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。下記に記載するように、アジュバントを含めることもできる。そのような構成成分の完全な論述は、参考文献３９において入手可能である。
【００９１】
ワクチン組成物は一般に水性の形態となる。しかし、一部のワクチンは、乾燥形態、例えば注射可能な固体またはパッチ上の乾燥もしくは重合調製物の形態であり得る。
【００９２】
ワクチン組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでよい。しかし、好ましくは、ワクチンは水銀物質を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないべきである［３０、４０］。水銀を全く含有しないワクチンがより好ましい。水銀化合物の代替物として、コハク酸α−トコフェロールを含めることができる［３０］。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【００９３】
張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【００９４】
ワクチン組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入る。重量オスモル濃度はワクチン接種によって引き起こされる痛みに影響を有さないことが以前に報告されているが［４１］、それにも関わらずこの範囲で重量オスモル濃度を維持することが好ましい。
【００９５】
ワクチン組成物は１つまたは複数の緩衝剤を含んでよい。典型的な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、（特に水酸化アルミニウムアジュバントを有する）ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤は、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含める。
【００９６】
ワクチン組成物のｐＨは一般に５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５、または７．０〜７．８である。したがって、本発明のプロセスは、パッケージング前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含んでよい。
【００９７】
ワクチン組成物は好ましくは無菌である。ワクチン組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。ワクチン組成物は好ましくはグルテンを含まない。
【００９８】
本発明のワクチン組成物は、特にスプリットまたは表面抗原ワクチン用に、洗浄剤、例えば（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、オクトキシノール（オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含んでよい。洗浄剤は微量でのみ存在できる。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。微量の他の残りの構成成分は抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００９９】
ワクチン組成物は、単回免疫化用の物質を含んでもよく、または複数回免疫化用の物質を含んでもよい（すなわち「複数用量」キット）。複数用量で準備する際には保存剤を含めることが好ましい。複数用量組成物で保存剤を含めることの代替法として（またはそれに加えて）、物質を取り出すための無菌的アダプターを有する容器に組成物を入れることができる。
【０１００】
インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投与容積で投与するが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を小児に投与してもよい。
【０１０１】
組成物およびキットは好ましくは２℃〜８℃で貯蔵する。それらは凍結すべきでない。それらは理想的には直接光を避けるべきである。
【０１０２】
（宿主細胞ＤＮＡ）
細胞系統でウイルスを単離および／または増殖させている場合、ＤＮＡのあらゆる腫瘍形成活性を最小限にするために、最終的なワクチン中に残存する細胞系統ＤＮＡの量を最小限にすることが標準的には実施される。
【０１０３】
したがって、本発明に従って調製されたワクチン組成物は、好ましくは、用量当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残存する宿主細胞ＤＮＡを含有するが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。
【０１０４】
任意の残存する宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【０１０５】
ワクチン調製の間に、標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィーなどを使用して、汚染ＤＮＡを除去することができる。残存する宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えばＤＮアーゼを使用することによって増強することができる。宿主細胞ＤＮＡの汚染を低減する便利な方法は、参考文献４２および４３で開示され、２ステップの処理を伴い、最初にウイルス増殖の間に使用できるＤＮアーゼ（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）を、次いでビリオン破壊の間に使用できる陽イオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用することを伴なう。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理は、宿主細胞ＤＮＡの除去に使用することもでき、有利にはビリオンの不活性化に使用することもできる［４４］。
【０１０６】
（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、組成物を受容した被験体中で惹起される（体液性および／または細胞性）免疫応答を増強するように機能することができるアジュバントを含んでよい。好ましいアジュバントは水中油型エマルジョンを含む。種々のそのようなアジュバントが公知であり、それらは典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は生分解性（代謝可能）であり生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般に直径５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、この小さいサイズは、安定なエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーを用いて実現される。フィルター滅菌に供することができるため、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【０１０７】
エマルジョンは、動物（魚など）または植物供給源由来のものなどの油を含み得る。植物油の供給源には、堅果、種子および穀物が含まれる。最も一般的に入手可能であるラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油が堅果油を例示する。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油には、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが含まれる。穀物の群では、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなど他の穀物類の油を使用することもできる。種子油では天然に存在しないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルを、堅果および種子油から開始する適当な物質の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって本発明の実施に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、鹸化および他の手段の手順は当技術分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などのクジラ油が、本明細書で使用することができるいくつかの魚油を例示する。５炭素イソプレン単位でいくつかの分岐鎖油が生化学的に合成され、それは一般にテルペノイドと称される。サメ肝油は、スクアレンとして公知である分岐不飽和テルペノイド２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有し、それが本明細書で特に好ましい。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知である方法によって得ることができる。別の好ましい油はα−トコフェロールである（下記を参照）。
【０１０８】
油の混合物を使用することができる。
【０１０９】
界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。それだけに限らないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと称される）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々となり得、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深いオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）など、ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ならびにトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）やモノラウリン酸ソルビタンなどのソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）を含めた界面活性剤と共に本発明を使用することができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に含めるのに好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【０１１０】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用することができる。モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などのオクトキシノールの組合せも適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９、プラス、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１１１】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０など）では０．０１〜１％、詳細には約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中の他の洗浄剤など）では０．００１〜０．１％、詳細には０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）では０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、詳細には０．１〜１％または約０．５％である。
【０１１２】
ワクチンがスプリットウイルスを含有する場合、水相中に遊離界面活性剤を含有することが好ましい。遊離界面活性剤が抗原に対して「スプリット化効果」を発揮することができ、それによって非スプリットビリオンおよび／またはその他の形で存在し得るビリオン凝集物が破壊されるので、これは有利である。これはスプリットウイルスワクチンの安全性を向上させることができる［４５］。
【０１１３】
好ましいエマルジョンは、＜ｌμｍ、例えば≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍの、またはそれより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、好都合なことに、マイクロフルイダイゼーションなどの技術によって実現することができる。
【０１１４】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントには、それだけに限らないが、以下のものが含まれる。
【０１１５】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。そのエマルジョンの組成は容積で約５％がスクアレン、約０．５％がポリソルベート８０、約０．５％がＳｐａｎ８５であり得る。重量でいうと、これらの比は４．３％がスクアレン、０．５％がポリソルベート８０、０．４８％がＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知であり［４６〜４８］、参考文献４９の第１０章および参考文献５０の第１２章でより詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を含む。
【０１１６】
・スクアレン、ＤＬ−α−トコフェロール、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のエマルジョン。そのエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を含んでよい。それは、Ｓｐａｎ８５（例えば１％）および／またはレシチンも含んでもよい。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有してもよく、より安定なエマルジョンを提供するのでスクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容積比、または約１１：５の重量比で存在してもよい。１つのそのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ８０を溶解して２％溶液を得、次いでこの溶液９０ｍｌを（ＤＬ−α−トコフェロール５ｇおよびスクアレン５ｍｌ）の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られたエマルジョンは、例えば、平均直径が１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍであるサブミクロンの油滴を有してもよい。そのエマルジョンは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ−ＭＰＬ）も含んでもよい。この型の別の有用なエマルジョンは、ヒト用量当たり０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含み得る［５１］。
【０１１７】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。そのエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでもよい（下記を参照）。そのエマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してもよい。
【０１１８】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、約７５：１１：１０の質量比でこれら３つの構成成分を含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）、これらの濃度は抗原からのこれらの構成成分の任意の寄与を含むべきである。そのエマルジョンは、スクアレンも含んでもよい。そのエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでもよい（下記を参照）。その水相は、リン酸緩衝液を含有してもよい。
【０１１９】
・スクアレン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルジョン。そのエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中で処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でスレオニル−ＭＤＰと共に使用されている［５２］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアレン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。それは、「ＡＦ」アジュバントに見られるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用することもできる［５３］（５％のスクアレン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１２０】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、モノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは好ましくは熱可逆性であり、かつ／またはサイズが２００ｎｍ未満の油滴を（容積で）少なくとも９０％有する［５４］。そのエマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドのうち１つまたは複数も含んでもよい。そのエマルジョンはＴＬＲ４アゴニストを含んでよい［５５］。そのようなエマルジョンを凍結乾燥することができる。
【０１２１】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ［５６］のエマルジョン。アジュバント添加ワクチン中のこれらの構成成分の終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【０１２２】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献５７に記載されているように、好ましいリン脂質構成成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１２３】
・代謝不可能な油（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０など）のサブミクロン水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（グルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに脂肪族アミンを付加することによって作製される、参考文献５８に記載のＧＰＩ−０１００など）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加物を含めることができる。
【０１２４】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）がらせん状ミセルとして会合しているエマルジョン［５９］。
【０１２５】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６０］。
【０１２６】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６０］。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは送達時にその場で抗原と混合することができ、したがってアジュバントおよび抗原はパッケージングまたは分配されたワクチンにおいて別々に維持され、使用時に最終的な処方物にする準備ができていてもよい。他の実施形態では、製造の間にエマルジョンを抗原と混合し、したがって液体アジュバント添加形態で組成物をパッケージングする。抗原は一般に水性の形態にあり、その結果ワクチンは２つの液体を混合することによって最終的に調製される。混合する２つの液体の容積比は（例えば５：１と１：５との間で）様々となり得るが、一般に約１：１である。特定のエマルジョンの上記の記載において構成成分の濃度が示されている場合、これらの濃度は典型的には無希釈の組成物についてのものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。
【０１２８】
（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（またはキット構成成分）に適した容器には、バイアル、シリンジ、（例えば、ディスポーザブルシリンジ）、鼻スプレーなどが含まれる。これらの容器は無菌であるべきである。
【０１２９】
組成物／構成成分がバイアルの中にある場合、バイアルは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック物質でできている。バイアルは、好ましくは、それに組成物を添加する前に滅菌する。ラテックス感受性の患者に伴う問題を回避するために、好ましくはラテックスを含まないストッパーでバイアルを密封し、すべてのパッケージング物質においてラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは単回用量のワクチンを含んでもよく、または１を超える用量（「複数用量」バイアル）、例えば１０用量を含んでもよい。好ましいバイアルは、無色のガラスでできている。
【０１３０】
バイアルは、キャップ中に充填済（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジを挿入することができるように適合させたキャップ（例えば、ルアーロック）を有することができ、（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）シリンジの内容物をバイアルに放出することができ、そして、バイアルの内容物をシリンジに戻すことができる。バイアルからシリンジを取り出した後、次いで針を取り付けることができ、組成物を患者に投与することができる。キャップは好ましくはシールまたはカバーの内部にあり、その結果、キャップに到達できる前には、シールまたはカバーを取り外さなければならない。バイアルは、特に複数用量バイアル用に、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有してもよい。
【０１３１】
構成成分がシリンジにパッケージングされている場合、シリンジは、それに取り付けられた針を有してもよい。針が取り付けられていない場合、組み立てて使用するための別々の針をシリンジと共に供給することができる。そのような針は、鞘に入っていてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。記録の維持が容易となるように、ロット番号、インフルエンザの流行期および内容物の使用期限が印刷され得る剥離式のラベルを付けてシリンジを提供することができる。シリンジ中のプランジャーは、好ましくは、吸引の間にプランジャーが誤って取り出されることを防止するストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有してもよい。ディスポーザブルシリンジは、単回用量のワクチンを含有する。シリンジは一般に、針を取り付ける前に先端を密封する先端キャップを有し、その先端キャップは好ましくはブチルゴムでできている。シリンジおよび針が別々にパッケージングされている場合、針は、好ましくはブチルゴム遮蔽を装着している。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで販売されているものである。
【０１３２】
例えば小児への送達を容易にするために、容器に半分の用量の容積を示す印をつけてもよい。例えば、０．５ｍｌ用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌの容積を示す印を有してもよい。
【０１３３】
ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスでできている容器を使用することが好ましい。
【０１３４】
キットまたは組成物は、ワクチンの詳細、例えば投与の指示、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットと共に（例えば、同じ箱の中に）パッケージングすることができる。その指示は、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に備えて、アドレナリンの溶液を容易に入手できるようにしておくなどの警告も含有してもよい。
【０１３５】
（処置の方法、およびワクチンの投与）
本発明は、本発明に従って製造されたワクチンを提供する。これらのワクチン組成物は、ヒトまたはブタなどの非ヒト動物被験体への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体中で免疫応答を起こす方法を提供する。本発明は、医薬として使用するための本発明の組成物も提供し、被験体中で免疫応答を起こす医薬を製造するための、本発明の組成物の使用も提供する。
【０１３６】
これらの方法および使用により起こった免疫応答は一般に抗体応答、好ましくは保護的抗体応答を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および保護を評価する方法は当技術分野で周知である。ヒトでの研究では、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体価が保護と相関する（血清試料の赤血球凝集阻止反応力価が約３０〜４０であると、同種のウイルスによる感染からおよそ５０％保護される）ことが示されている［６１］。抗体応答は、典型的には、赤血球凝集阻止反応法、マイクロ中和法、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血反応法（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は当技術分野で周知である。
【０１３７】
本発明の組成物は様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は、（例えば腕または脚への）筋肉内注射によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻内［６２〜６４］、経口［６５］、皮内［６６、６７］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［６８］などが含まれる。
【０１３８】
本発明に従って調製されるワクチンを使用して、小児も成人も処置することができる。インフルエンザワクチンは、６カ月齢から、小児および成人の免疫化での使用について現在推奨されている。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でよい。ワクチンを受けることが好ましい被験体は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、幼年者（例えば≦５歳）、入院している被験体、医療従事者、軍人および軍関係者、妊娠している女性、慢性疾患の免疫不全被験体、ワクチンを受ける前７日以内に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を参照）を服用した被験体、卵アレルギーの人々および外国旅行をしている人々である。しかし、ワクチンはこれらの群にだけ適しているわけではなく、より一般に集団で使用することができる。世界的流行株では、すべての年齢群への投与が好ましい。
【０１３９】
本発明の好ましい組成物は、効力についてのＣＰＭＰ基準の１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は、（１）≧７０％のセロプロテクション、（２）≧４０％のセロコンバージョン、および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増大である。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は、（１）≧６０％のセロプロテクション、（２）≧３０％のセロコンバージョン、および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増大である。これらの基準は、少なくとも５０人の患者での非盲検試験に基づいている。
【０１４０】
処置は、単回投与スケジュールによるものでもよく、または複数回投与スケジュールによるものでもよい。初回免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールで複数回投与を使用することができる。複数回投与スケジュールでは、例えば非経口での初回および粘膜での追加、粘膜での初回および非経口での追加など、同じかまたは異なる経路によって様々な投与を行うことができる。１を超える投与（典型的には２回の投与）を施すことは、免疫学的にナイーブな患者で、例えばこれまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人々に、または（世界的流行の発生でのように）新たなＨＡサブタイプに対するワクチン接種に特に有用である。典型的には、少なくとも１週間間隔で（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）複数回投与を行う。
【０１４１】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ医療相談または訪問の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（４価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなどと実質的に同時に患者に投与することができる。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、高齢患者で特に有用である。
【０１４２】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、詳細にはインフルエンザウイルスに対して活性のある抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、同じ医療相談または医療専門家への訪問の間に）患者に投与することができる。これらの抗ウイルス薬には、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩）を含めた、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼインヒビターが含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，リン酸塩（１：１）である。
【０１４３】
（全般）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、もっぱらＸのみからなるものでもよく、または追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０１４４】
「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないこともある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略することができる。
【０１４５】
数値ｘに関連して「約」という用語は任意選択のものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４６】
別段に述べられない限り、２つ以上の構成成分を混合するステップを含むプロセスは、混合する任意の特定の順序を必要としない。したがって、任意の順序で構成成分を混合することができる。３つの構成成分が存在する場合、２つの構成成分を互いに組み合わせ、次いでその組合せを第３の構成成分と組み合わせることなどができる。
【０１４７】
細胞の培養で動物（特にウシ）物質を使用する場合、それは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、詳細にはウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体的に、動物由来物質が総じて存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１４８】
組成物の一部として化合物を身体に投与する場合、その化合物は、代わりに適切なプロドラッグに置換することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、ルシフェラーゼレポーターを用いたｐｏｌＩプロモーター活性のアッセイに使用した発現構築物を図示する。
【図２】図２は、完全長（ＦＬ）ヒトｐｏｌＩプロモーター配列（配列番号１）を示す。完全長配列内のｐＨＷ２０００ヒトｐｏｌＩプロモーター配列（配列番号２；「ショート」ヒトｐｏｌＩプロモーター）が下線を引いたフォントで示されている。矢印は転写開始部位を指し示す。
【図３】図３は、完全長（ＦＬ）イヌｐｏｌＩプロモーター配列（ＮＷ＿８７８９４５；配列番号３）を示す。完全長プロモーター配列内のＳＨＯＲＴプロモーター配列が下線を引いた大文字フォント（配列番号５）で示され、完全長プロモーター配列内のＭＩＤプロモーター配列が下線を引いた大文字フォントおよび太い小文字フォント（配列番号４）で示されている。
【図４】図４は、ＭＤＣＫ細胞中でのイヌｐｏｌＩプロモーター活性を示す。無地の灰色のカラムはＦＬイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、斜線付きのカラムはＭＩＤイヌプロモーターを用いた結果を示し、斑点付きのカラムはＳＨＯＲＴイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示す。「Ａ」はＬＵＣおよびウイルスポリメラーゼを指し示し、「Ｂ」はＬＵＣおよび感染（ＭＯＩ＝０．０５）を指し示し、「Ｃ」はＬＵＣを指し示し、「Ｄ」はＤＮＡ無しである。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図５】図５は、ＭＤＣＫ３３０１６細胞中でのヒトｐｏｌＩプロモーター活性を示す。無地の灰色のカラムはヒトｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、斜線付きのカラムはＦＬイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、斑点付きのカラムはＭＩＤイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、垂直線付き（ｖｅｒｔｉｃａｌｌｙ ｈａｔｃｈｅｄ）のカラムはＳＨＯＲＴイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示す。「Ａ」はＬＵＣおよびウイルスポリメラーゼを指し示し、「Ｂ」はＬＵＣおよび感染（ＭＯＩ＝０．０５）を指し示し、「Ｃ」はＬＵＣを指し示す。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図６】図６は、ＭＤＣＫ細胞の３３０１６細胞中でのＦＬおよびＳＨＯＲＴヒトｐｏｌＩプロモーターならびに完全長イヌｐｏｌＩプロモーターの活性の比較を示す。無地の灰色のカラムは完全長ヒトプロモーターを用いた結果を示し、斜線カラムは完全長イヌプロモーターを用いた結果を示し、斑点付きのカラムはショートヒトｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示す。ＡはＬＵＣ＋ポリメラーゼを指し示し、ＢはＬＵＣ＋感染を指し示し、ＣはＬＵＣのみを指し示す。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図７】図７は、ＭＤＣＫ３３０１６細胞（図７Ａ）およびＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞（図７Ｂ）中でのヒトｐｏｌＩプロモーター（斑点付きのカラム）およびイヌｐｏｌＩプロモーター（斜線付きのカラム）の活性を示す。ＡはＬＵＣ＋ポリメラーゼを指し示し、ＢはＬＵＣ＋感染を指し示し、ＣはＬＵＣのみを指し示す。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図８】図８は、ウイルスレスキュー後の細胞溶解物中のＭおよびＮＰタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。
【図９】図９は、逆遺伝学構築物を感染させた細胞の上清を使用したフォーカス形成アッセイの結果を示す。
【図１０】図１０は、ヒトおよびイヌｐｏｌＩプロモーターのＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１および３）のアラインメントを示す。
【図１１】図１１Ａは、ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦおよび２９３Ｔ細胞中でのヒトｐｏｌＩ（ｈＰｏｌＩ）プロモーターまたはイヌｐｏｌＩプロモーター（ｃＰｏｌＩ）の調節下のレポーター導入遺伝子の発現レベルを示す。黒色カラムは２９３Ｔ細胞を用いた結果を表し、白色カラムはＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦを用いた結果を示し、斜線付きのカラムはＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞を用いた結果を表す；図１１Ｂは、ヒトおよびイヌ細胞中でのトランスフェクション効率を比較している。どちらのグラフでもｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図１２】図１２は、ＴＭＰＲＳＳ２ヘルパープラスミドの存在下（白色カラム）および不在下（黒色カラム）、ならびにフィーダー細胞を添加した状態（黒色カラム）および添加していない状態（白色カラム）（１２Ｂ）における、ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦおよび２９３Ｔ細胞中でのヒトｐｏｌＩプロモーターに基づく逆遺伝学によるＡ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザ株のレスキューを示す。ｙ軸はウイルス力価（ｆｆｕ／ｍＬ）を表す。
【図１３】図１３は、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦ細胞中での、ヒトまたはイヌｐｏｌＩで促進される逆遺伝学によるＡ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザ株のレスキューを比較している。黒色カラムはＴＭＰＲＳＳ２ヘルパープラスミドの不在下での結果を示し、白色バーはＴＭＰＲＳＳ２ヘルパープラスミドの存在下での結果を示す。ｙ軸はウイルス力価（ｆｆｕ／ｍＬ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１５０】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１は、完全長（ＦＬ）ヒトｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号２は、ｐＨＷ２０００ヒトＰｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号３は、完全長（ＦＬ）イヌｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号４は、ＭＩＤイヌｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号５は、ＳＨＯＲＴイヌｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号６は、Ａ／カリフォルニア／０４／０９由来のＨＡ配列である。
配列番号７は、Ａ／チリ／１／１９８３由来のＨＡ配列である。
配列番号８は、Ａ／カリフォルニア／０４／０９由来のＮＡ配列である。
配列番号９は、Ａ／チリ／１／１９８３由来のＮＡ配列である。
【０１５１】
（発明を実施するための様式）
（ヒトｐｏｌＩプロモーターはヒトならびにイヌ細胞中で活性である）
非内因性宿主細胞中でのｐｏｌＩプロモーターの活性を評価するために、ヒトｐｏｌＩプロモーターの４８７ｂｐ断片またはイヌｐｏｌＩプロモーターの様々な断片の調節下で（図３に示されている）、アンチセンスの方向でルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ＲＮＡの発現を可能とする発現構築物をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。発現したＲＮＡをウイルスポリメラーゼによりｍＲＮＡに転写し、その後ｌｕｃタンパク質に翻訳することができる。したがって、ルシフェラーゼ活性についてアッセイを行うことにより、導入遺伝子を発現している細胞を容易に同定することができる。このアッセイが働くには、ウイルスポリメラーゼを提供することが必要である。これは、細胞にウイルスポリメラーゼをコードする発現構築物を共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）するか、あるいはトランスフェクトした細胞にヘルパーウイルスを感染させることによって実現することができる。このアッセイは図１に図示されている。
【０１５２】
図１１Ａは、ヒトｐｏｌＩプロモーターが、ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞中で、またＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦ細胞中でもイヌｐｏｌＩプロモーターと同じ効率で導入遺伝子の発現を促進できることを示す。ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞中でヒトｐｏｌＩプロモーターを用いた導入遺伝子の発現レベルは、ヒト２９３Ｔ細胞中で観察されるものよりさらに高い。試験した細胞型のトランスフェクション効率が同等であることを確認するために、ＣＭＶプロモーターの調節下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有する構築物をそれらにトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性のレベルを測定した。その結果は図１１Ｂに示され、それから、試験した細胞のトランスフェクション効率が同等であることが確認される。
【０１５３】
図４は、イヌｐｏｌＩプロモーターの試験した断片がすべて、ＭＤＣＫ細胞中でｌｕｃ導入遺伝子の発現を促進できることを示す。さらに、図５は、完全長ヒトｐｏｌＩプロモーターがＭＤＣＫ細胞中で導入遺伝子の発現を促進でき、イヌｐｏｌＩプロモーターよりさらに効率がよいことを実証している。
【０１５４】
導入遺伝子の発現の促進に必要なヒトｐｏｌＩプロモーターの領域をさらに規定するために、図２に示されているヒトｐｏｌＩプロモーターの断片（「ショート」ｐｏｌＩ）を用いて実験を反復した。完全長ｐｏｌＩプロモーターがより活性であるが、完全長ならびにショートヒトｐｏｌＩプロモーターがＭＤＣＫ細胞中で活性であることが分かった（図６）。
【０１５５】
ヒトｐｏｌＩプロモーターの活性が特定の細胞系統に制限されるかどうかを判定するために、ヒトおよびイヌｐｏｌＩプロモーター配列を含有する構築物をＡＴＣＣのＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ３３０１６細胞［１８］にさらにトランスフェクトした。図７に示されているように、ヒトｐｏｌＩプロモーターは、どちらの細胞型でも導入遺伝子の発現を促進することができたが、その発現は、ＭＤＣＫ３３０１６細胞でより効率がよかった。ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用した、ＭＤＣＫ細胞からのインフルエンザウイルスのレスキュー。
【０１５６】
ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用したインフルエンザウイルスレスキューの効率をＭＤＣＫおよび２９３Ｔ細胞で比較した。インフルエンザウイルスゲノムをｐＨＷ２０００発現ベクター中にクローニングした［６９］。このベクターは、ＭＤＣＫ細胞中で活性であることが示されたヒトｐｏｌＩプロモーターの断片を含有する（図５を参照）。詳細には、以下のベクターを使用した：ｐＨＷ−ＷＳＮ ＰＡ（０．５３４μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＰＢ１（０．４３２μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＰＢ２（０．３５７μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＮＰ（０．２８４μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＮＳ（０．２１７μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ Ｍ（０．２３２μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＨＡ（０．１６９μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＮＡ（０．２８０μｇ／μｌ）およびｐｃＤＮＡ−ＴＭＰＲＳＳ（０．７７５μｇ／μｌ；セリンプロテアーゼをコードする）。タンパク質コード遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって調節されていた。
【０１５７】
ウイルスレスキューでは、１０％ＦＣＳを入れたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）２ｍｌを入れた６ウェルディッシュ中の１ウェル当たり細胞５×１０６個の密度に２９３Ｔ細胞を播いた。培地２ｍｌを入れた６ウェルディッシュ中の１ウェル当たり細胞０．３×１０６個にＭＤＣＫ細胞を入れた（ｐｌａｔｅ）。細胞を３７℃で１晩インキュベートし、５０〜８０％のコンフルエンシーに達したときにトランスフェクトした。
【０１５８】
２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞は、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１９８８３８７００１）およびリポフェクタミンＬＴＸプラス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５３３８−１００）をそれぞれ使用してトランスフェクトした。以下のプロトコールに従って細胞に各ベクター１μｇをトランスフェクトした。ＦｕＧＥＮＥ６では、試薬（ＤＮＡ１μｇ当たりＦｕＧＥＮＥ３μｌ）を無血清培地７３μｌ（抗生物質を含まない）で希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、希釈したＦｕＧＥＮＥにそれぞれＤＮＡを添加し、穏やかに混合し、室温で少なくとも１５分間インキュベートした。増殖培地を除去せずにＤＮＡ／ＦｕＧＥＮＥ複合体を２９３Ｔ細胞に滴下して加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１５９】
リポフェクタミンを用いたトランスフェクションでは、試薬（２５μｌ）を無血清培地５００μｌで希釈し、室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡを添加し、その混合物を室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞から増殖培地を除去した後に無血清培地５００μｌをトランスフェクション試薬に滴下して加えた。その後細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションから２４時間後に培地を交換した。
【０１６０】
感染から２日後、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞から上清を収集した。上清中に収集されたウイルスをフォーカス形成アッセイに使用した。さらに、感染した細胞を溶解させ、それをウェスタンブロット分析に使用した。
【０１６１】
（ウェスタンブロット分析）
標準的なプロトコールに従って、２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞を溶解しそれをウェスタンブロット分析に供した。ＭおよびＮＰタンパク質に対する抗体を使用して、膜上のこれらのタンパク質を検出した。Ｓ６に対する抗体をローディング対照として使用した。「ＷＳＮ」とラベルを付けたレーンに、レスキューされたウイルス由来のタンパク質をロードした。「Ｍ」および「ＮＰ」のラベルを付けたレーンは、対照として組換えＭおよびＮＰタンパク質を含有する。これらの組換えタンパク質は異なる遺伝子から発現したので、ゲル中でわずかにゆっくりと移動する。
【０１６２】
分析の結果は図８に示され、ヒトｐｏｌＩプロモーターの調節下にある発現構築物が２９３ＴならびにＭＤＣＫ細胞中でのウイルスレスキューを可能とすることが明らかである。
【０１６３】
（フォーカス形成アッセイ）
１０％ＦＣＳを入れたＤＭＥＭ５００μｌの入った４８ウェルプレート中の１ウェル当たり細胞６．２５×１０４個の密度に、感染していないＭＤＣＫ細胞を入れた。次の日に、細胞に１００〜１５０μｌの容積のウイルスを３７℃で２時間感染させた。それによって細胞は様々な希釈のウイルスに感染した。感染から２時間後、培地を吸引し１０％ＦＣＳを入れたＤＭＥＭ５００μｌを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で次の日までインキュベートした。
【０１６４】
感染から２４時間後、培地を吸引し細胞をＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ中８０％の氷冷アセトン５００μｌを各ウェルに添加し、その後４℃で３０分間インキュベーションを行った。アセトン混合物を吸引し、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ）で１回洗浄した。ＰＢＳ中２％のＢＳＡ５００μｌを各ウェルに添加し、その後室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションを行った。ブロッキング緩衝液中１：６０００希釈の抗ＮＰを５００μｌ添加し、その後ＲＴで２時間インキュベーションを行った。抗体溶液を吸引し、細胞をＰＢＳＴで２回洗浄した。５００μｌのブロッキング緩衝液中１：２０００の希釈で二次抗体（ヤギ抗マウス）を添加し、プレートをＲＴで２時間インキュベートした。抗体溶液を吸引し、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄した。ＫＰＬ Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ ５００μｌを各ウェルに添加し１０分間インキュベートした。Ｔｒｕｅ−Ｂｌｕｅを吸引し、ｄＨ２Ｏで１回洗浄することによって反応を停止した。水を吸引し、細胞を乾燥させた。
【０１６５】
アッセイの結果は図９に示され、それから、２９３ＴならびにＭＤＣＫ細胞から感染性ウイルスが得られたことがはっきりと実証される。
【０１６６】
参考文献７０に記載されているように、ヒトｐｏｌＩ逆遺伝学系を使用したＡ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザ株のウイルスレスキューもＭＤＣＫ ＡＴＣＣ、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦおよび２９３Ｔ細胞で試験した。セリンプロテアーゼをコードするヘルパープラスミドＴＭＰＲＳＳ２の存在下および不在下でウイルスがレスキューされる実験を行った。さらに、ウイルスレスキューから２４時間後にフィーダー細胞を添加して、および添加せずにウイルスレスキューを行った。その結果は図１２に示され、それから、ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用して様々な条件下で効率的なウイルスレスキューをＭＤＣＫ細胞で実現できることが実証される。
【０１６７】
ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用したＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦでのウイルスレスキューの効率がイヌｐｏｌＩプロモーターを使用したレスキューと同等であるかどうかを比較するため、参考文献７０に記載されているように、細胞にヒトｐｏｌＩ ＲＧ系またはイヌｐｏｌＩ ＲＧ系をトランスフェクトした。ＴＭＰＲＳＳヘルパープラスミドの存在下および不在下で実験を行った。その結果（図１３）は、ヒトｐｏｌＩ系を使用したときイヌｐｏｌＩ系と同等の効率でＡ／プエルトリコ／８／３４株がレスキューされたことを実証している。
【０１６８】
本発明がほんの一例として記載されており、本発明の範囲および精神の中にとどまりつつ改変をなすことができることが理解される。
【０１６９】
（参考文献）
【０１７０】
【数１】
【０１７１】
【数２】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００９年５月２１日に出願された米国仮特許出願６１／２１６，９１９からの優先権を主張し、上記米国仮特許出願の全容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は逆遺伝学の分野にある。さらに、それは、様々なウイルスから保護するためのワクチンを製造することに関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
逆遺伝学は、細胞培養中でのＲＮＡウイルスの組換え発現および操作を可能にする。それは、（リアソータント（ｒｅａｓｓｏｒｔａｎｔ）を含む）組換えウイルスの迅速な産生および／またはその変異を可能とするため、ウイルス学およびワクチン製造における強力なツールである。その方法では、宿主細胞にウイルスゲノムをコードする１つまたは複数の発現構築物をトランスフェクトし、その細胞からウイルスを単離することを伴なう。例えば、特許文献１および２は、イヌｐｏｌＩプロモーターを使用してイヌ細胞中でインフルエンザゲノムＲＮＡを発現させる方法を記載している。他の出典は、ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用した、ヒト細胞中でのインフルエンザゲノムＲＮＡの発現を報告している。
【０００４】
従来技術の方法の１つの重大な欠点は、ｐｏｌＩプロモーターが高度に種特異的であることである。例えば、ヒトｐｏｌＩプロモーターは霊長目細胞中でのみ活性であり［非特許文献１］、同様にイヌ細胞中での発現ではイヌｐｏｌＩプロモーターが必要となることが報告されている。したがって、内因性ｐｏｌＩプロモーターが特徴付けられていない細胞系統中でウイルスを増殖させることが必要である場合、ウイルスをレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）し増殖させる２つの異なる細胞型を使用することが必要であった。しかし、例えば競合培養選択圧を回避できる利点を有するので、複数の細胞系統の使用を回避することが望ましい。ワクチン産生のすべてのステップで単一の細胞系統を使用すると、規制認可も容易となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／００２００８号
【特許文献２】国際公開第２００７／１２４３２７号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｏｕｄｓｔａａｌ ｅｔ ａｌ．Ｖａｃｃｉｎｅ（２００９）２７２５８８−２５９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、逆遺伝学を実施する代替の方法を提供することが当技術分野において必要であり続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（好ましい実施形態の概要）
本発明者らは、現時点で驚くべきことに、宿主細胞が由来するのと同じ分類学上の目の生物にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターを使用して、宿主細胞中での導入遺伝子の発現を促進（ｄｒｉｖｅ）することが可能であることを発見した。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、１つまたは複数の発現構築物を含む宿主細胞を提供し、その発現構築物（複数可）からのＲＮＡ分子の発現は、宿主細胞の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって調節される。これらの宿主細胞は、本発明の発現系で使用することができる。
【００１０】
本発明は、（ｉ）目的の導入遺伝子の発現が第１の生物由来のｐｏｌＩプロモーターによって促進される発現構築物を調製するステップと、（ｉｉ）第１の生物と異なる分類学上の目由来である宿主細胞中にステップ（ｉ）の発現構築物を導入するステップとを含む、宿主細胞中でＲＮＡを発現させるプロセスをさらに提供する。
【００１１】
さらなる実施形態では、本発明は、組換えウイルスを産生する方法を提供し、そのウイルスは、本発明の宿主細胞を使用して産生される。
【００１２】
本発明は、（ｉ）本発明の宿主細胞を使用して組換えウイルスを産生するステップと、（ｉｉ）培養宿主にステップ（ｉ）で得られたウイルスを感染させるステップと、（ｉｉｉ）ウイルスを産生させるためにステップ（ｉｉ）の培養宿主を培養するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたウイルスを精製するステップとを含む、（例えばワクチンへと処方するための）ウイルスを調製する方法も提供する。ワクチンを調製する方法を提供するために、その方法は次いで（ｖ）ウイルスをワクチンへと処方するさらなるステップを含むことができる。
【００１３】
上記で論じたように導入される非内因性ｐｏｌＩプロモーター（複数可）に加えて、宿主細胞は内因性ｐｏｌＩプロモーターを含む。非内因性ｐｏｌＩプロモーター（複数可）は、細胞中での非内因性ＲＮＡ、詳細にはウイルスＲＮＡの発現を促進する。したがって、本発明は、内因性ｒＲＮＡの発現を調節する少なくとも１つの内因性ｐｏｌＩプロモーター、およびウイルスＲＮＡまたはその相補体の発現を調節する少なくとも１つの非内因性ｐｏｌＩプロモーターを有する細胞を提供する。
【００１４】
本発明は、タンパク質コードｍＲＮＡもウイルスＲＮＡもコードするＤＮＡ発現構築物も提供し、（ｉ）タンパク質コードｍＲＮＡについてのＤＮＡ中のコドン使用頻度はイヌ細胞について最適化され、（ｉｉ）ウイルスＲＮＡは霊長目ｐｏｌＩプロモーターの調節下にある。イヌ細胞は、理想的にはＭＤＣＫ細胞であり、霊長目プロモーターは、理想的にはヒトｐｏｌＩプロモーターである。タンパク質コードｍＲＮＡの発現は、イヌ細胞について最適化されたｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にあってもよい。
【００１５】
（発現構築物）
本発明者らは、驚くべきことに、細胞中で、その細胞と異なる分類学上の目に入る生物由来のｐｏｌＩプロモーターを使用してＲＮＡ発現を促進することが可能であることを発見した。したがって、ｐｏｌＩプロモーターは、その細胞が由来するのと同じ分類学上の目の生物にとって内因性ではない。「目」という用語は慣用的な分類学上の順位付けを指し、目の例は、霊長目、齧歯目、食肉目、有袋目、クジラ目などである。ヒトおよびチンパンジーは同じ分類学上の目に入る（霊長目）が、ヒトとイヌは異なる目に入る（霊長目に対して食肉目）。
【００１６】
したがって、第１の態様では、本発明は、１つまたは複数の発現構築物を含む宿主細胞を提供し、その発現構築物（複数可）からのＲＮＡ分子の発現は、宿主細胞の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって促進される。
【００１７】
一実施形態では、宿主細胞は非霊長目細胞であり、ｐｏｌＩプロモーターは霊長目ｐｏｌＩプロモーターである。特定の実施形態では、宿主細胞は非霊長目細胞であり、プロモーターはヒトプロモーターである。さらなる実施形態では、宿主細胞は非ヒト細胞であり、ｐｏｌＩプロモーターはヒトｐｏｌＩプロモーターである。代替の実施形態では、ｐｏｌＩプロモーターは非イヌｐｏｌＩプロモーターであり、宿主細胞はイヌ細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞はイヌ細胞であり、プロモーターは霊長目ｐｏｌＩプロモーターである。さらなる好ましい実施形態では、ｐｏｌＩプロモーターはヒトプロモーターであり、宿主細胞は（ＭＤＣＫ細胞などの）イヌ細胞である。この実施形態は、ヒトｐｏｌＩプロモーターが十分に特徴付けられており、イヌ細胞がワクチンの産生にしばしば使用されるため、好ましい。
【００１８】
宿主細胞中で使用される発現構築物は、一方向性発現構築物でもよく、または両方向性発現構築物でもよい。宿主細胞が、（同じ発現構築物にあろうと異なる発現構築物にあろうと）１を超える導入遺伝子を発現する場合、一方向性および／または両方向性発現を使用することが可能である。
【００１９】
両方向性発現構築物は、同じ構築物から異なる方向（すなわち、５’から３’と３’から５’の両方）で発現を促進する少なくとも２つのプロモーターを含有する。プロモーターの少なくとも１つは、本明細書で論じられている非内因性ｐｏｌＩプロモーターである。２つのプロモーターは、同じ二本鎖ＤＮＡの異なる鎖と作動可能に連結することができる。好ましくは、プロモーターの１つは非内因性ｐｏｌＩプロモーターであり、その他のプロモーターの少なくとも１つはｐｏｌＩＩプロモーターである。ｐｏｌＩプロモーターを使用してキャップのないｃＲＮＡを発現させることができ、一方でｐｏｌＩＩプロモーターを使用して、その後タンパク質に翻訳することができるｍＲＮＡを転写することができ、それによって同じ構築物からＲＮＡおよびタンパク質の同時発現が可能となるため、これは有用である。ｐｏｌＩＩプロモーターは内因性でもよく、または非内因性でもよい。１を超える発現構築物が発現系内で使用される場合、プロモーターは、プロモーターの少なくとも１つが宿主細胞中で発現を促進できる非内因性ｐｏｌＩプロモーターであるという条件で、内因性および非内因性プロモーターの混合物でもよい。
【００２０】
発現構築物は、典型的にはＲＮＡ転写終結配列を含む。終結配列は内因性の終結配列でもよく、または宿主細胞にとって内因性ではない終結配列でもよい。適切な終結配列は当業者には明らかであり、その配列には、それだけに限らないが、ＲＮＡポリメラーゼＩ転写終結配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写終結配列、およびリボザイムが含まれる。さらに、発現構築物は、特にその発現がｐｏｌＩＩプロモーターによって調節される遺伝子の末端に、ｍＲＮＡの１つまたは複数のポリアデニル化シグナルを含有してもよい。
【００２１】
発現系は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個または少なくとも１２個の発現構築物を含有してもよい。
【００２２】
発現構築物は、プラスミドまたは他のエピソーム性構築物などのベクターでよい。そのようなベクターは、典型的には少なくとも１つの細菌および／または真核生物の複製起点を含む。さらに、ベクターは、原核および／または真核細胞中での選択を可能とする選択可能マーカーを含んでもよい。そのような選択可能マーカーの例は、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子である。ベクターは、ＤＮＡ配列のクローニングを容易にする１つまたは複数のマルチクローニング部位をさらに含んでもよい。
【００２３】
代替として、発現構築物は、直鎖発現構築物でもよい。そのような直鎖発現構築物は、典型的には増幅および／または選択配列を含有しない。しかし、そのような増幅および／または選択配列を含む直鎖構築物も本発明の範囲内にある。インフルエンザウイルスの発現にそのような直鎖発現構築物を使用する方法の例が参考文献４に記載されている。
【００２４】
本発明の発現構築物は、当技術分野で公知である方法を使用して得ることができる。そのような方法は、例えば、参考文献５に記載されたものである。発現構築物が直鎖発現構築物である場合、単一の制限酵素部位を利用して、宿主細胞への導入前にそれを直鎖化することが可能である。あるいは、少なくとも２つの制限酵素部位を使用して、ベクターから発現構築物を切り出すことが可能である。さらに、核酸増幅技術を使用して（例えば、ＰＣＲによって）それを増幅することによって、直鎖発現構築物を得ることも可能である。
【００２５】
当業者に公知である任意の技術を使用して、宿主細胞中に本発明の発現構築物を導入することができる。例えば、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム、マイクロインジェクション、または微粒子銃（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ−ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を使用することによって、宿主細胞中に本発明の発現構築物を導入することができる。
【００２６】
発現宿主がＭＤＣＫ細胞系統などのイヌ細胞である場合、例えば、野生型イヌ遺伝子もしくはイヌウイルス由来のプロモーターを使用し、および／またはヒト細胞よりイヌ細胞に適したコドン使用頻度を有するようにすることで、イヌ発現についてタンパク質コード領域を最適化することができる。例えば、ヒト遺伝子はＰｈｅのコドンとしてＵＵＣを少し好むが（５４％）、イヌ細胞ではその優先性がより高い（５９％）。同様に、ヒト細胞ではＩｌｅコドンについて多数派となる優先性は認められないが、イヌコドンの５３％がＩｌｅにＡＵＣを使用する。イヌパルボウイルス（ｓｓＤＮＡウイルス）などのイヌウイルスがコドンを最適化するための指針をもたらすこともでき、例えば、イヌパルボウイルス配列においてＰｈｅコドンの９５％がＵＵＵであり（対してイヌゲノムでは４１％）、Ｉｌｅコドンの６８％がＡＵＵであり（対して３２％）、Ｖａｌコドンの４６％がＧＵＵであり（対して１４％）、Ｐｒｏコドンの７２％がＣＣＡであり（対して２５％）、Ｔｙｒコドンの８７％がＵＡＵであり（対して４０％）、Ｈｉｓコドンの８７％がＣＡＵであり（対して３９％）、Ｇｌｎコドンの９２％がＣＡＡであり（対して２５％）、Ｇｌｕコドンの８１％がＧＡＡであり（対して４０％）、Ｃｙｓコドンの９４％がＵＧＵであり（対して４２％）、Ｓｅｒコドンのわずか１％がＵＣＵであり（対して２４％）、ＣＣＣはＰｈｅに使用されず、ＵＡＧは終止コドンとして使用されない。したがって、タンパク質コード遺伝子を、イヌ細胞中での発現について自然にすでに最適化されている遺伝子のようにすることができ、それによって発現が容易となる。
【００２７】
（逆遺伝学）
上記に記載の発現構築物および宿主細胞は、逆遺伝学技術により組換えウイルス株を産生するのに特に適している。その技術を、プラス鎖ＲＮＡウイルス［６、７］、マイナス鎖ＲＮＡウイルス［８，９］および二本鎖ＲＮＡウイルス［１０］を含めた幅広いＲＮＡウイルスの産生に使用することができる。したがって、さらなる態様では、本発明は、組換えウイルスを産生する方法を提供し、そのウイルスは、上記に記載の発現系を使用して産生される。
【００２８】
公知の逆遺伝学系では、ｐｏｌＩプロモーター、細菌ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、バクテリオファージポリメラーゼプロモーターなどから所望のウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）分子をコードするＤＮＡ分子を発現させることを伴なう。さらに、ウイルスが感染性ウイルスを形成するのに特定のタンパク質を必要とする場合、系はこれらのタンパク質をも提供し、例えば、その系は、ウイルスタンパク質をコードするＤＮＡ分子をさらに含み、その結果、両方の型のＤＮＡを発現させると完全な感染性ウイルスが構築される。
【００２９】
逆遺伝学がｖＲＮＡの発現に使用される場合、配列エレメントの互いに対する正確な間隔が、ポリメラーゼが複製を開始するのに極めて重要であることが当業者には明らかであろう。したがって、ウイルスＲＮＡをコードするＤＮＡ分子をｐｏｌＩプロモーターと終結配列との間に正しく位置付けることが重要であるが、この位置付けは、逆遺伝学系を用いて作業する者の能力の十分に範囲内にある。
【００３０】
一般に、逆遺伝学は、その生活環の間にゲノムＲＮＡの産生を必要とすることが知られている任意のウイルスの発現に適している。そのようなウイルスには、それだけに限らないが、下記に記載するものなどのプラス鎖およびマイナス鎖ＲＮＡウイルスが含まれる。好ましくは、ウイルスはオルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルスである。本発明の方法は、分節型（ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）ウイルスに加えて、非分節型ウイルスにさらに適している。
【００３１】
ウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスゲノムを含む発現構築物を細胞にトランスフェクトすると十分であることが多い。例えば、ポリオウイルスゲノムを含有するプラスミドのトランスフェクションの結果、感染性ポリオウイルスが収集される［６、７］。アンチセンスウイルスＲＮＡは通常非感染性であり、生活環を完了するのにＲＮＡポリメラーゼを必要とするため、マイナス鎖ＲＮＡウイルスでの逆遺伝学はより難題を提示している。したがって、インサイチュータンパク質発現ではタンパク質または遺伝子としてのいずれかで、ウイルスポリメラーゼが供給されなければならない。
【００３２】
ウイルスが感染性のためにタンパク質を必要とする場合、宿主細胞によって必要とされる発現構築物の総数を減らすので、両方向性発現構築物を使用することが一般に好ましい。したがって、本発明の方法は、遺伝子またはｃＤＮＡが上流のｐｏｌＩＩプロモーターと下流の非内因性ｐｏｌＩプロモーターとの間に位置する少なくとも１つの両方向性発現構築物を利用することができる。ｐｏｌＩＩプロモーターから遺伝子またはｃＤＮＡが転写されると、タンパク質に翻訳することができる、キャップの付いたプラスセンスウイルスｍＲＮＡが産生されるが、非内因性ｐｏｌＩプロモーターから転写されると、マイナスセンスｖＲＮＡが産生される。両方向性発現構築物は両方向性発現ベクターでよい。
【００３３】
組換えウイルスを産生するために、細胞は、ビリオンを構築するのに必要なウイルスゲノムのすべての分節を発現しなければならない。本発明の発現構築物中にクローニングされたＤＮＡは、好ましくは、ウイルスＲＮＡおよびタンパク質の全部を提供し、ヘルパーウイルスを使用しない系が好ましいがヘルパーウイルスを使用してＲＮＡおよびタンパク質の一部を提供することも可能である。ウイルスが非分節型ウイルスである場合、１を超える発現構築物を使用して非分節型ウイルスのウイルスゲノムを発現させることも本発明の範囲内にあるが、通常は本発明の方法で単一の発現構築物を利用することによってこれを実現することができる。ウイルスが分節型ウイルスである場合、通常は本発明の方法で１を超える発現構築物を使用してウイルスゲノムを発現させる。しかし、単一の発現構築物上でウイルスゲノムの１つまたは複数の分節を、またはすべての分節をも組み合わせることも想像される。
【００３４】
本発明の方法は、リアソータントウイルス株の産生に特に適している。その技術は、プラスミドのインビトロ操作を使用して、ウイルス分節の組合せを得、ウイルス分節中のコードまたは非コード配列の操作を容易にし、変異を導入することなどができる。リアソータントウイルス株の産生での発現系の使用は、流行に対抗するのにワクチンの迅速な産生が必要である状況で特に有益なリアソータント種ウイルスを得るのに必要な時間を著しく低下させることができるので好ましい。したがって、本発明のこの態様の方法は、少なくとも２つの異なる野生型株からのまたはそれに由来するウイルス遺伝子を発現する１つまたは複数の発現構築物を使用することが好ましい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、宿主細胞中でアクセサリータンパク質の発現を導く発現構築物も含まれる。例えば、逆遺伝学系の一部として非ウイルス性セリンプロテアーゼ（例えばトリプシン）を発現させると有利となり得る。
【００３６】
本発明の発現構築物をインフルエンザＡ型ウイルス分節の発現に使用するとき、ネガティブ選択マーカー（例えばｃｃｄＢ）および高度に保存されているインフルエンザＡ型ウイルス遺伝子末端［１１］を含む発現構築物中にインフルエンザＡ型ウイルス分節を導入することによって、発現構築物を得ることが可能である。この利点は、制限部位が必要でなく、発現構築物上の遺伝子末端と相補的である末端を有するという条件で任意のインフルエンザＡ型ウイルス分節をクローニングできることである。
【００３７】
（細胞）
目的のウイルスを産生することができる任意の真核または原核細胞を用いて、本発明を実施することができる。本発明は典型的には細胞系統を使用するが、例えば、代替として初代細胞を使用することができる。細胞は典型的には哺乳動物のものである。適切な哺乳動物細胞には、それだけに限らないが、ハムスター、ウシ、（ヒトおよびサルを含む）霊長目およびイヌ細胞が含まれる。腎臓細胞、線維芽細胞、網膜細胞、肺細胞など様々な細胞型を使用することができる。適切なハムスター細胞の例は、ＢＨＫ２１またはＨＫＣＣという名称を有する細胞系統である。適切なサル細胞は、例えば、Ｖｅｒｏ細胞系統のような腎臓細胞などのアフリカミドリザル細胞である［１２〜１４］。適切なイヌ細胞は、例えば、ＣＬＤＫおよびＭＤＣＫ細胞系統のような腎臓細胞である。
【００３８】
さらなる適切な細胞には、それだけに限らないが、ＣＨＯ；２９３Ｔ；ＢＨＫ；ＭＲＣ ５；ＰＥＲ．Ｃ６［１５］；ＦＲｈＬ２；ＷＩ−３８などが含まれる。適切な細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＡＴＣＣ）コレクション［１６］、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ［１７］またはＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）から広く入手可能である。例えば、ＡＴＣＣは、カタログ番号ＣＣＬ ８１、ＣＣＬ ８１．２、ＣＲＬ １５８６およびＣＲＬ−１５８７の下で様々な異なるＶｅｒｏ細胞を供給し、カタログ番号ＣＣＬ ３４の下でＭＤＣＫ細胞を供給する。ＰＥＲ．Ｃ６は、寄託番号９６０２２９４０の下でＥＣＡＣＣから入手可能である。
【００３９】
本発明での使用に（特にインフルエンザウイルスの増殖に）好ましい細胞は、Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙイヌ腎臓に由来するＭＤＣＫ細胞である［１８〜２０］。元々のＭＤＣＫ細胞は、ＣＣＬ ３４としてＡＴＣＣから入手可能である。これらの細胞または他のＭＤＣＫ細胞の誘導体を使用することが好ましい。そのような誘導体は、例えば、懸濁培養中での増殖に適合させたＭＤＣＫ細胞を開示する参考文献１８に記載されたものである（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託された「ＭＤＣＫ３３０１６」または「３３０１６−ＰＦ」；参考文献１８も参照）。さらに、参考文献２１は、無血清培地中で懸濁状態で増殖するＭＤＣＫ由来細胞を開示する（ＦＥＲＭ ＢＰ−７４４９として寄託された「Ｂ−７０２」）。いくつかの実施形態では、使用するＭＤＣＫ細胞系統は腫瘍形成性でもよい。非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を使用することも想像される。例えば、参考文献２２は、「ＭＤＣＫ−Ｓ」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５００）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０１」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０１）、「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０２」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０２）および「ＭＤＣＫ−ＳＦ１０３」（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６５０３）を含めた非腫瘍形成性ＭＤＣＫ細胞を開示する。参考文献２３は、「ＭＤＣＫ．５Ｆ１」細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １２０４２）を含めた、感染に高い感受性を有するＭＤＣＫ細胞を開示する。
【００４０】
１を超える細胞型の混合物を使用して、本発明の方法を実施することが可能である。しかし、単一の細胞型、例えばモノクローナル細胞を用いて本発明の方法を実施することが好ましい。好ましくは、本発明の方法で使用する細胞は、単一の細胞系統由来である。さらに、ウイルスのレスキューおよびウイルスの任意のその後の増殖に同じ細胞系統を使用することができる。
【００４１】
好ましくは、血清の不在下で細胞を培養して、汚染物の共通供給源を回避する。真核細胞培養用の様々な無血清培地が当業者に公知である（例えば、イスコフ培地、ウルトラＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、ＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。さらに、無タンパク質培地を使用することができる（例えば、ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））。そうでなければ、複製用の細胞を通例の血清含有培地（例えば、０．５％〜１０％の胎仔ウシ血清を有するＭＥＭまたはＤＭＥＭ培地）で培養することもできる。
【００４２】
細胞は付着培養でもよく、または懸濁状態でもよい。
【００４３】
（適切な細胞系統のスクリーニング）
本発明に従って使用するのに適した細胞は広く入手可能である。さらに、当技術分野で一般に公知である技術を使用して、さらなる細胞をスクリーニングすることが可能である。適切な細胞のスクリーニングは、例えば、新たなｐｏｌＩプロモーターが同定され、その新たなプロモーターによる発現を支援する細胞系統を見つけることが望ましい場合に必要となる可能性がある。同様に、新たな細胞が単離された場合、どのｐｏｌＩプロモーターがその中で発現を促進できるかを確認することが必要となる可能性がある。
【００４４】
細胞のスクリーニングに適した技術は当業者には明らかである。例えば、目的のｐｏｌＩプロモーターの調節下でレポーター遺伝子をクローニングすることができ、スクリーニングする細胞系統に構築物をトランスフェクトすることができる。そのような実験では、レポーター遺伝子を含有するがプロモーター配列を欠く構築物をトランスフェクトした細胞を対照として使用することができる。したがって、試験試料（例えば、目的のｐｏｌＩプロモーターの調節下で導入遺伝子を含有する細胞）中での遺伝子の発現が対照（例えば、試験試料と同じ導入遺伝子を含有するが、その導入遺伝子が導入遺伝子の発現を促進するプロモーターを含有しない細胞）中での発現より著しく高い場合、その細胞系統は、本発明によるそのプロモーターと共に使用するのに適している。導入遺伝子の発現は、例えば、導入遺伝子ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡをリアルタイムＰＣＲに供することによって測定することができる。あるいは、ｐｏｌＩプロモーターの調節下でアンチセンスの方向でレポーター遺伝子（例えば、ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｌｕｃなど）をクローニングすることも可能である。次いでウイルスポリメラーゼによってそのような構築物からの転写物をｍＲＮＡに転写し、その後タンパク質に翻訳することができる。したがって、レポーター遺伝子産物の存在によって、レポーター遺伝子を発現する任意の細胞を容易に同定することができる。
【００４５】
ｐｏｌＩプロモーターが発現を促進できる細胞が得られるように、正常なら外来ｐｏｌＩが発現を促進しない細胞を適合させることがさらに可能である。これは、例えば、細胞を正常ならそれに適さない増殖条件に供することによって実現することができる。例えば、正常なら付着してしか増殖しない細胞系統を懸濁状態で人工的に保持することができ、これらの条件下で増殖し続ける細胞をさらに増殖させることができる。あるいは、通常なら懸濁状態で増殖する細胞を、例えば、高結合性プラスチック培養ベッセルを使用して、または培養物に血清を添加することによって付着培養することが可能である。同様に、正常ならその増殖に血清を必要とする細胞を無血清条件下で増殖させること、または逆に、無血清増殖に適合させた細胞を血清に曝露することが可能である。次いで、先に記載したように、選択された細胞をｐｏｌＩプロモーターの活性についてアッセイすることができる。このようにして変化させることができるさらなる適切な増殖パラメーターは当業者には明白であり、そのパラメーターには、それだけに限らないが、温度、ｐＨ、ｐＯ２、血清濃度などが含まれる。さらに、細胞をＵＶ放射などの物理的もしくは化学的処理に、または化学的変異原に供することができる。同様に、正常な培養条件下で単に継代された細胞の新たな特性についてスクリーニングすることが可能である。
【００４６】
例えば、参考文献１８は、ＭＤＣＫ細胞（通常は付着性）を無血清条件下における懸濁状態での増殖に適合させた方法を記載している。懸濁状態で増殖する細胞を培養するのに通常使用される条件下で、ローラーボトルに入れた無血清培地中で開始細胞を培養した。これらの選択的条件下で数回継代した後、無血清培地中で懸濁状態で増殖できるいくつかの細胞系統が得られた。１つの例は、３３０１６細胞系統（ＤＳＭ ＡＣＣ ２２１９として寄託）である。本発明者らは、ヒトｐｏｌＩプロモーターがこれらのＭＤＣＫ細胞中でレポーター遺伝子の発現を促進できることを実証している。
【００４７】
（ＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター）
ほとんどの逆遺伝学の方法は、ウイルスゲノムＲＮＡの転写を促進するＲＮＡポリメラーゼＩ（ＲＮＡｐｏｌＩ）プロモーターを含む発現ベクターを使用する。ｐｏｌＩプロモーターは、多くのウイルス、例えばインフルエンザの完全な感染性に必要である、修飾されていない５’および３’末端を有する転写物をもたらす。
【００４８】
天然のｐｏｌＩプロモーターは２つの部分からなり、２つの別々の領域：コアプロモーターおよび上流プロモーターエレメント（ＵＰＥ）を有する。この一般的な構成はほとんどの種由来のｐｏｌＩプロモーターに共通するが、プロモーターの実際の配列は広く様々である。コアプロモーターは転写開始点を取り囲み、約−４５から＋２０にわたり、転写を開始するのに十分である。コアプロモーターは一般にＧＣリッチである。コアプロモーターは単独で転写を開始するのに十分であるが、プロモーターの効率は、ＵＰＥによって非常に増大する。ＵＰＥは、典型的には約−１８０から−１０７にわたり、やはりＧＣリッチである。開始前複合体を安定化することによって機能することができる遠位のエンハンサー様配列の存在によって、プロモーターの活性をさらに増強することができる。
【００４９】
ｐｏｌＩプロモーターの配列は、ヒト、イヌおよびニワトリを含めた様々な種で同定されている。本発明は、宿主細胞と同じ分類学上の目にある生物にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターを使用する。したがって、「内因性」および「非内因性」という用語は、宿主細胞および発現構築物中に存在するｐｏｌＩプロモーターに関連して使用される。ｐｏｌＩプロモーターにおける種間の配列の変動は、細胞中の任意の特定のｐｏｌＩプロモーターが内因性であるかまたは非内因性であるかを判定することが簡単であることを意味する。したがって、本発明は、ｐｏｌＩプロモーターと同じ分類学上の目に由来しない宿主細胞中でのＲＮＡ発現にヒト、イヌまたはニワトリｐｏｌＩプロモーターを利用することができる（例えば、イヌ宿主細胞中での霊長目ｐｏｌＩプロモーター）。インシリコのまたは実験的な配列比較を使用して、任意の特定のｐｏｌＩプロモーターが由来する生物を確認することができ、例えば、図１０は、＜６０％の配列同一性を有する、転写開始部位までのイヌｐｏｌプロモーターおよびヒトｐｏｌプロモーターのアラインメントを示す。
【００５０】
本発明の発現構築物は、少なくとも１つのコアプロモーターを含み、好ましくは少なくとも１つのＵＰＥも含み、１つまたは複数のエンハンサーエレメントも含んでもよい。転写を開始できるという条件で、天然のプロモーターの断片を使用することも可能である。例えば、図３は、完全長イヌｐｏｌＩプロモーター（配列番号３）および導入遺伝子の発現を促進するのに十分である様々な断片の配列を示す（図４ならびに配列番号４および５も参照）。さらに、図２は、ヒトｐｏｌＩプロモーター（配列番号１）および単独で宿主細胞中での導入遺伝子の発現に十分であるその断片の配列を示す（図５および配列番号２も参照）。
【００５１】
本発明に従って使用することができるヒトｐｏｌＩプロモーターは、配列番号１もしくは配列番号２の配列、またはその改変体を含んでよい。本発明に従ってイヌプロモーターが使用される場合、それは、配列番号３、配列番号４もしくは配列番号５の配列、またはその改変体を含んでよい。
【００５２】
ｐｏｌＩプロモーターは、プロモーターが目的の宿主細胞中で作動可能に連結したＲＮＡのコードする配列の転写を開始および促進する能力を有するという条件で、（ｉ）配列番号１〜５のいずれかと少なくともｐ％の配列同一性を有する配列、および／または（ｉｉ）配列番号１〜５のいずれかの断片を含んでよい。ｐの値は、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９またはそれ以上でよい。断片はそれ自体で発現を促進するのに十分な長さのものでもよく（例えば配列番号４は配列番号３の断片である）、または断片は他の配列と結合していてもよく、この組合せが発現を促進する。そのようなｐｏｌＩプロモーターが目的の宿主細胞中で発現を促進する能力は、例えば、プロモーターの調節下でアンチセンスレポーター遺伝子を用いる上記に記載のアッセイを使用して容易に評価することができる。
【００５３】
（ウイルス調製）
さらなる態様では、本発明は、（ｉ）本明細書に記載の組換えウイルスを産生するステップと、（ｉｉ）培養宿主にステップ（ｉ）で得られたウイルスを感染させるステップと、（ｉｉｉ）ウイルスを産生させるためにステップ（ｉｉｉ）の宿主を培養するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたウイルスを精製するステップと、（任意選択で）（ｖ）ウイルスをワクチンへと処方するステップとを含む、ワクチン製造用のウイルスを調製する方法を提供する。
【００５４】
本発明のこの態様において細胞を培養宿主として使用する場合、使用する細胞系統およびウイルスに対し、細胞培養条件（例えば、温度、細胞密度、ｐＨ値など）が広い範囲の対象にわたって変化し、適用の必要条件にそれを適合させることができることが知られている。したがって、以下の情報は単にガイドラインを表すに過ぎない。
【００５５】
上記で述べたように、好ましくは無血清または無タンパク質培地中で細胞を培養する。
【００５６】
当業者に公知の方法に従って細胞を増加（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）させることができる。例えば、遠心分離または濾過のような通常の支援方法を使用して、灌流系で細胞を培養することができる。さらに、感染前に流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）系で本発明に従って細胞を増加させることができる。本発明の場面において、培養系は流加系と称され、その系では最初に細胞をバッチ系で培養し、培地中の栄養素（または栄養素の一部）の減少は濃縮栄養素の管理補給によって補償される。感染前の細胞の増加の間に培地のｐＨ値をｐＨ６．６〜ｐＨ７．８の値、特にｐＨ７．２〜ｐＨ７．３の値に調整すると有利となり得る。好ましくは、３０〜４０℃の温度で細胞の培養を行う。ステップ（ｉｉｉ）において、好ましくは３０℃〜３６℃、または３２℃〜３４℃、または３３℃の温度で細胞を培養する。この温度範囲での感染細胞のインキュベーションの結果、ワクチンへと処方したときに効力が向上したウイルスが産生されることが示されているので［２４］、これは、本発明の方法を使用してインフルエンザウイルスを産生する場合に特に好ましい。
【００５７】
感染前の培養の間に酸素分圧を好ましくは２５％〜９５％の値に、特に３５％〜６０％の値に調整することができる。本発明の場面において述べる酸素分圧の値は、空気の飽和に基づいている。細胞の感染は、好ましくはバッチ系で細胞約８〜２５×１０５個／ｍＬ、または好ましくは灌流系で細胞約５〜２０×１０６個／ｍＬの細胞密度で行う。１０−８〜１０、好ましくは０．０００１〜０．５のウイルス用量（ＭＯＩ値、「感染多重度」；感染時における細胞１個当たりのウイルス単位の数に対応する）で細胞に感染させることができる。
【００５８】
付着培養中または懸濁状態の細胞でウイルスを増殖させることができる。マイクロキャリア培養を使用することができる。いくつかの実施形態では、こうして細胞を懸濁状態での増殖に適合させることができる。
【００５９】
本発明による方法は、ウイルスまたはそれによって生じるタンパク質の収集および単離も含む。ウイルスまたはタンパク質の単離の間に、分離、濾過または限外濾過のような標準的な方法によって培地から細胞を分離する。次いで、勾配遠心分離、濾過、沈殿、クロマトグラフィーなどのような、当業者に十分に公知である方法に従って、ウイルスまたはタンパク質を濃縮し、その後精製する。本発明によれば、精製の間またはその後にウイルスを不活性化することも好ましい。ウイルス不活性化は、例えば、精製プロセス内の任意の時点でβ−プロピオラクトンまたはホルムアルデヒドによって行うことができる。
【００６０】
ステップ（ｉ）において単離されたウイルスを、ステップ（ｉｉ）において卵で増殖させることもできる。ワクチン用にインフルエンザウイルスを増殖させる現在の標準的な方法は孵化ＳＰＦ鶏卵を使用し、ウイルスは卵内容物（尿膜腔液）から精製される。卵を介してウイルスを継代し、その後細胞培養でそれを増殖させることも可能である。
【００６１】
（ウイルス）
細胞中で逆遺伝学によって発現させることができる任意のウイルスを用いて、本発明の方法を実施することができる。そのようなウイルスは、分節型ウイルスでもよく、または非分節型ウイルスでもよい。さらに、ウイルスはプラス鎖ＲＮＡウイルスでもよく、またはマイナス鎖ウイルスでもよい。さらなる実施形態では、ウイルスは二本鎖ＲＮＡウイルスでもあり得る。
【００６２】
ウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、パラミクソウイルス科、ニューモウイルス科、ラブドウイルス科、フィロウイルス科、ボルナウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブンヤウイルス科、またはアレナウイルス科からなる群より選択される科のものでよい。さらに、ウイルスは、パラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、レスピロウイルス、モルビリウイルス、ルブラウイルス、ヘニパウイルス（Ｈｅｎｉｐａｖｉｒａｓ）、アブラウイルス、ニューモウイルス、メタニューモウイルス、ベシクロウイルス、リッサウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス、ヌクレオラブドウイルス、ノビラブドウイルス、マールブルグウイルス、エボラウイルス、ボルナウイルス、インフルエンザウイルスＡ型、インフルエンザウイルスＢ型、インフルエンザウイルスＣ型、トゴトウイルス、イサウイルス、オルトブンヤウイルス、ハンタウイルス、ナイロウイルス、フレボウイルス、トスポウイルス、アレナウイルス、オフィオウイルス、テヌイウイルス、またはデルタウイルスからなる群より選択される属のウイルスでよい。特定の実施形態では、マイナス鎖ＲＮＡウイルスは、センダイウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヘンドラウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、ヒトＲＳウイルス、トリニューモウイルス、水疱性口内炎インディアナウイルス、狂犬病ウイルス、ウシ一日熱ウイルス、レタス壊死性黄変病ウイルス、ポテト黄萎病ウイルス、伝染性造血器壊死症ウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ザイールエボラウイルス、ボルナ病ウイルス、インフルエンザウイルス、トゴトウイルス、伝染性サケ貧血ウイルス、ブンヤムウェラウイルス、ハンターンウイルス、ジュグベウイルス、リフトバレー熱ウイルス、トマト黄化壊疽ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、カンキツソローシスウイルス、イネ縞葉枯ウイルス、およびデルタ型肝炎ウイルスからなる群より選択される。好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザウイルスである（下記を参照）。
【００６３】
ウイルスがプラス鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科およびロニウイルス科からなる群より選択される科のものでよい。さらに、ウイルスは、アルテリウイルス（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｕｓ）、コロナウイルス、エンテロウイルス、トロウイルス、オカウイルス、ライノウイルス、ヘパトウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、パレコウイルス、エルボウイルス、コブウイルスおよびテシオウイルスからなる群より選択される属のウイルスでよい。特定の実施形態では、ウイルスは、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルス、ポリオウイルス、ヒトエンテロウイルスＡ型（ＨＥＶ−Ａ）、ヒトエンテロウイルスＢ型（ＨＥＶ−Ｂ）、ヒトエンテロウイルスＣ型、ヒトエンテロウイルスＤ型、肝炎Ａ型ならびにヒトライノウイルスＡおよびＢ型からなる群より選択される。
【００６４】
ウイルスが二本鎖ＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは、ビルナウイルス科、シストウイルス科、ハイポウイルス科、パーティティウイルス科、レオウイルス科およびトティウイルス科からなる群より選択される科のものでよい。さらに、ウイルスは、アクアビルナウイルス、アビビルナウイルス、エントモビルナウイルス、シストウイルス、パーティティウイルス、アルファクリプトウイルス、ベータクリプトウイルス、アクアレオウイルス、コルチウイルス、サイポウイルス、フィジウイルス、イドノレオウイルス、マイコレオウイルス、オルビウイルス、オルトレオウイルス、オリザウイルス、フィトレオウイルス、ロタウイルスおよびシードルナウイルスからなる群より選択される属のウイルスでよい。
【００６５】
本発明は、迅速な変異を起こすウイルス、および組換えの手法がウイルスのより迅速な単離を可能にし、次いでそれをさらに増殖させて適切なワクチンを得ることができる場合に特に適している。したがって、好ましい実施形態では、ウイルスはインフルエンザである。
【００６６】
（インフルエンザウイルス）
インフルエンザウイルス、特にインフルエンザＡ型ウイルスおよびインフルエンザＢ型ウイルスは、このウイルスの逆遺伝学が十分に特徴付けられているため、本発明の方法での使用に特に適している。インフルエンザウイルスは、分節型マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。インフルエンザＡおよびＢ型ウイルスは分節を８個有するが、インフルエンザＣ型ウイルスは７個有する。上記ウイルスは、複製および転写を開始するのに少なくとも４個のウイルスタンパク質（ＰＢ１、ＰＢ２、ＰＡおよび核タンパク質）を必要とする。
【００６７】
インフルエンザＡおよびＢ型ウイルスの逆遺伝学は、４個の必要なタンパク質および８個すべてのゲノム分節を発現する１２個のプラスミドを用いて実施することができる。しかし、構築物の数を減らすために、単一のプラスミドに（ウイルスＲＮＡ合成用の）複数のＲＮＡポリメラーゼＩ転写カセット（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個すべてのインフルエンザｖＲＮＡ分節をコードする配列）を、別のプラスミドにＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを有する複数のタンパク質コード領域（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８個のインフルエンザｍＲＮＡ転写物をコードする配列）を含めることができる［２５］。同じプラスミドに、ｐｏｌＩプロモーターの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザｖＲＮＡ分節および別のプロモーター、詳細にはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下にある１つまたは複数のインフルエンザタンパク質コード領域を含めることも可能である。上記に記載のように、これは、好ましくは、両方向性プラスミドを使用することによってなされる。参考文献２５の方法の好ましい態様は、（ａ）単一のプラスミドにあるＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡのｍＲＮＡをコードする領域、ならびに（ｂ）単一のプラスミドにある８個すべてのｖＲＮＡをコードする分節を伴う。１つのプラスミドにノイラミニダーゼ（ＮＡ）および赤血球凝集素（ＨＡ）分節を、別のプラスミドに６個の他の分節を含めると、新たに現れるインフルエンザウイルス株は通常ＮＡおよび／またはＨＡ分節中に変異を有するため、特に好ましい。したがって、この実施形態では、ＨＡおよびＮＡ配列を含むベクターだけを置換することが必要である。
【００６８】
インフルエンザＡ型ウイルスの好ましい発現系は、複数の異なる野生型株に由来するゲノム分節をコードする。その系は、ＰＲ／８／３４株（Ａ／プエルトリコ／８／３４）由来の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のゲノム分節をコードしてもよいが、通常これ／これらはＰＲ／８／３４ＨＡ分節を含まず、通常ＰＲ／８／３４ＮＡ分節を含まない。したがって、その系は、ＰＲ／８／３４由来の分節ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２の少なくとも１つ（場合により６個すべて）をコードしてもよい。
【００６９】
インフルエンザＡ型ウイルスの他の有用な発現系は、ＡＡ／６／６０インフルエンザウイルス（Ａ／アナーバー／６／６０）由来の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のゲノム分節をコードしてもよいが、通常これ／これらはＡＡ／６／６０ＨＡ分節を含まず、通常ＡＡ／６／６０ＮＡ分節を含まない。したがって、その系は、ＡＡ／６／６０由来の分節ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２の少なくとも１つ（場合により６個すべて）をコードしてもよい。
【００７０】
その系は、Ａ／カリフォルニア／４／０９株由来の１個または複数のゲノム分節、例えばＨＡ分節および／またはＮＡ分節をコードしてもよい。したがって、例えば、ＨＡ遺伝子分節は、配列番号７より配列番号６に密接に関連する（すなわち、同じアルゴリズムおよびパラメーターを使用して配列番号７より配列番号６と比較したときに高度の配列同一性を有する）Ｈ１赤血球凝集素をコードしてもよい。配列番号６および７は８０％同一である。同様に、ＮＡ遺伝子は、配列番号９より配列番号８に密接に関連するＮ１ノイラミニダーゼをコードしてもよい。配列番号８および９は８２％同一である。
【００７１】
インフルエンザＢ型ウイルスの発現系は、複数の異なる野生型株に由来するゲノム分節をコードしてもよい。その系は、ＡＡ／１／６６インフルエンザウイルス（Ｂ／アナーバー／１／６６）由来の１個または複数（例えば、１、２、３、４、５または６個）のゲノム分節をコードしてもよいが、通常これ／これらはＡＡ／１／６６ＨＡ分節を含まず、通常ＡＡ／１／６６ＮＡ分節を含まない。したがって、その系は、ＡＡ／１／６６由来の分節ＮＰ、Ｍ、ＮＳ、ＰＡ、ＰＢ１および／またはＰＢ２の少なくとも１つをコードしてもよい。
【００７２】
Ａ／ＰＲ／８／３４、ＡＡ／６／６０、ＡＡ／１／６６、Ａ／チリ／１／８３およびＡ／カリフォルニア／０４／０９株由来のウイルス分節および配列は広く入手可能である。それらの配列、例えばＧＩ：８９７７９３３７、ＧＩ：８９７７９３３４、ＧＩ：８９７７９３３２、ＧＩ：８９７７９３２０、ＧＩ：８９７７９３２７、ＧＩ：８９７７９３２５、ＧＩ：８９７７９３２２、ＧＩ：８９７７９３２９は、公的データベースで入手可能である。
【００７３】
インフルエンザウイルスの逆遺伝学系は、宿主細胞中でアクセサリータンパク質の発現を導く発現構築物を含んでよい。例えば、非ウイルス性セリンプロテアーゼ（例えばトリプシン）を発現させると有利となり得る。
【００７４】
（ワクチン）
本発明の第３の態様の方法は、ワクチンを産生する方法に従って産生されたウイルスを利用する。
【００７５】
（特にインフルエンザウイルスの）ワクチンは一般に生ウイルスまたは不活性化ウイルスに基づいている。不活性化ワクチンは、全ビリオン、「スプリット」ビリオン、または精製表面抗原に基づき得る。抗原は、ビロソームの形態で提示することもできる。これらの型のワクチンのいずれかを製造するのに本発明を使用することができる。
【００７６】
不活性化ウイルスを使用する場合、ワクチンは、（インフルエンザでは赤血球凝集素を含み、通常はノイラミニダーゼも含む）全ビリオン、スプリットビリオン、または精製表面抗原を含んでよい。ウイルスを不活性化する化学的手段には、有効量の１つまたは複数の以下の作用物質：洗浄剤、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、バイナリーエチルアミン、アセチルエチレンイミン、またはその組合せでの処理が含まれる。例えばＵＶ光またはガンマ線照射など、ウイルス不活性化の非化学的方法が当技術分野で公知である。
【００７７】
ウイルス含有流体、例えば尿膜腔液または細胞培養上清から、様々な方法によってビリオンを収集することができる。例えば、精製プロセスは、ビリオンを破壊する洗浄剤を含む直線的スクロース勾配溶液を使用したゾーン遠心分離を伴うことがある。次いで、任意選択の希釈後に、ダイアフィルトレーションによって抗原を精製することができる。
【００７８】
スプリットビリオンは、「Ｔｗｅｅｎ−エーテル」スプリット化プロセスを含めて、精製ビリオンを洗浄剤（例えば、エチルエーテル、ポリソルベート８０、デオキシコレート、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＮ１０１、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ＴｅｒｇｉｔｏｌＮＰ９など）で処理してサブビリオン調製物を作製することによって得られる。例えば、インフルエンザウイルスをスプリット化する方法は当技術分野で周知であり、例えば参考文献２６〜３１等を参照されたい。典型的には、ウイルスのスプリット化は、感染性であれまたは非感染性であれ全ウイルスを破壊濃度のスプリット化剤で破壊または断片化することによって実施される。破壊の結果、ウイルスタンパク質が完全にまたは部分的に可溶化され、ウイルスの完全性が変化する。好ましいスプリット化剤は、非イオン性およびイオン性（例えば陽イオン性）界面活性剤、例えばアルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル糖、スルホベタイン、ベタイン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、Ｎ，Ｎ−ジアルキル−グルカミド、Ｈｅｃａｍｅｇ、アルキルフェノキシ−ポリエトキシエタノール、ＮＰ９、第四級アンモニウム化合物、サルコシル、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、トリ−Ｎ−ブチルホスフェート、Ｃｅｔａｖｌｏｎ、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびＤＯＴ−ＭＡ、オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎＮ１０１などのＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ界面活性剤）、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンエステルなどである。１つの有用なスプリット化手順は、デオキシコール酸ナトリウムおよびホルムアルデヒドの連続的な効果を使用し、最初のビリオン精製の間に（例えばスクロース密度勾配溶液中で）スプリット化を行うことができる。したがって、スプリット化プロセスは、（非ビリオン物質を除去する）ビリオン含有物質の清澄化、（例えばＣａＨＰＯ４吸着などの吸着法を使用する）収集されたビリオンの濃縮、非ビリオン物質からの全ビリオンの分離、（例えば、デオキシコール酸ナトリウムなどのスプリット化剤を含有するスクロース勾配を使用した）密度勾配遠心分離ステップにおけるスプリット化剤を使用したビリオンのスプリット化、次いで所望されない物質を除去する濾過（例えば限外濾過）を伴い得る。有用なことに、リン酸ナトリウム緩衝等張性塩化ナトリウム溶液中でスプリットビリオンを再懸濁することができる。スプリットインフルエンザワクチンの例は、ＢＥＧＲＩＶＡＣＴＭ、ＦＬＵＡＲＩＸＴＭ、ＦＬＵＺＯＮＥＴＭおよびＦＬＵＳＨＩＥＬＤＴＭ製品である。
【００７９】
本発明の方法を使用して、生ワクチンを産生することもできる。そのようなワクチンは通常、ビリオン含有流体からビリオンを精製することによって調製される。例えば、その流体を遠心分離によって清澄化し、（例えば、スクロース、リン酸カリウム、およびグルタミン酸ナトリウムを含有する）緩衝液を用いて安定化することができる。様々な形態のインフルエンザウイルスワクチンが現在入手可能である（例えば、参考文献３２の第１７および１８章を参照）。生ウイルスワクチンには、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＦＬＵＭＩＳＴＴＭ製品（三価の生ウイルスワクチン）が含まれる。
【００８０】
精製インフルエンザウイルス表面抗原ワクチンは表面抗原の赤血球凝集素を、また典型的にはノイラミニダーゼも含む。精製形態でこれらのタンパク質を調製するプロセスは当技術分野で周知である。ＦＬＵＶＩＲＩＮＴＭ、ＡＧＲＩＰＰＡＬＴＭおよびＩＮＦＬＵＶＡＣＴＭ製品はインフルエンザサブユニットワクチンである。
【００８１】
別の形態の不活性化抗原はビロソーム［３３］（核酸を含まないウイルス様のリポソーム粒子）である。ビロソームは、洗浄剤でウイルスを可溶化し、その後ヌクレオキャプシドを除去し、ウイルス糖タンパク質を含有する膜を再構成することによって調製することができる。ビロソームを調製する代替の方法では、ウイルス膜糖タンパク質を過剰量のリン脂質に添加して、その膜中にウイルスタンパク質を有するリポソームを得ることを含む。
【００８２】
ウイルスは弱毒化されていてもよい。ウイルスは温度感受性でもよい。ウイルスは寒冷に適合していてもよい。これら３つの特徴は、抗原として生ウイルスを使用するときに特に有用である。
【００８３】
ＨＡは現在の不活性化インフルエンザワクチンにおける主要な免疫原であり、ワクチン用量は、典型的にはＳＲＩＤによって測定されるＨＡレベルを参照することによって標準化される。既存のワクチンは、典型的には１株当たり約１５μｇのＨＡを含有するが、例えば、小児に、または世界的流行の状況で、またはアジュバントを使用するときには低い用量を使用することができる。高用量（例えば３×または９×の用量［３４、３５］）と同様に、２分の１（すなわち、１株当たりＨＡ７．５μｇ）、４分の１や８分の１などの分数用量が使用されている。したがって、ワクチンは、１つのインフルエンザ株当たり０．１〜１５０μｇ、好ましくは０．１〜５０μｇ、例えば０．１〜２０μｇ、０．１〜１５μｇ、０．１〜１０μｇ、０．１〜７．５μｇ、０．５〜５μｇなどのＨＡを含んでよい。特定の用量は、例えば、１株当たり約４５、約３０、約１５、約１０、約７．５、約５、約３．８、約３．７５、約１．９、約１．５などを含む。
【００８４】
生ワクチンでは、ＨＡ含量ではなく中央組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）によって投与量を測定し、１株当たり１０６〜１０８（好ましくは１０６．５〜１０７．５）のＴＣＩＤ５０が典型的である。
【００８５】
本発明と共に使用されるインフルエンザ株は、野生型ウイルスで認められる天然のＨＡを有してもよく、または改変されたＨＡを有してもよい。例えば、ＨＡを改変して、トリの種においてウイルスを高度に病原性にする決定基（例えば、ＨＡ１／ＨＡ２切断部位の周りにある超塩基性領域）を除去することが知られている。逆遺伝学の使用は、そのような改変を容易にする。
【００８６】
ワクチンで使用するインフルエンザウイルス株は季節によって変化する。世界的流行間期では、ワクチンは、典型的には２つのインフルエンザＡ型株（Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２）および１つのインフルエンザＢ型株を含み、三価のワクチンが典型的である。本発明は、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ７またはＨ９サブタイプ株など、世界的流行ウイルス株（すなわち、ワクチンレシピエントおよび一般のヒト集団が免疫学的にナイーブである、詳細にはインフルエンザＡ型ウイルスの株）を使用することもでき、世界的流行株のインフルエンザワクチンは一価でもよく、または世界的流行株によって補充される通常の三価のワクチンに基づいていてもよい。しかし、季節およびワクチンに含まれる抗原の性質に応じて、本発明はＨＡサブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６の１つまたは複数に対して保護することができる。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＮＡサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８またはＮ９の１つまたは複数に対して保護することができる。
【００８７】
世界的流行間期株に対する免疫化に適しているのと同様に、本発明の組成物は、世界的流行株または潜在的に世界的流行性のある株に対する免疫化に特に有用である。世界的流行の発生を引き起こす潜在性をもたらすインフルエンザ株の特徴は：（ａ）現在循環しているヒト株中の赤血球凝集素と比較して新たな赤血球凝集素、すなわち１０年にわたってヒト集団において明らかとなっていないもの（例えば、Ｈ２）、またはヒト集団において以前に全く見られていないもの（例えば、トリ集団においてのみ一般に見つかっているＨ５、Ｈ６またはＨ９）を含有し、その結果、ヒト集団がその株の赤血球凝集素に対して免疫学的にナイーブであること；（ｂ）ヒト集団において水平に伝染する能力があること；（ｃ）ヒトに対して病原性があることである。Ｈ５赤血球凝集素型のウイルスは、Ｈ５Ｎ１株など、世界的流行性インフルエンザに対する免疫化に好ましい。他の考えられる株には、Ｈ５Ｎ３、Ｈ９Ｎ２、Ｈ２Ｎ２、Ｈ７Ｎ１およびＨ７Ｎ７、ならびに任意の他の潜在的に世界的流行性のある新興の株が含まれる。本発明は、非ヒト動物集団からヒトへと広がることができるか、または広がっている潜在的な世界的流行ウイルス株、例えばブタ起源のＨ１Ｎ１インフルエンザ株に対して保護するのに特に適している。次いで本発明はヒトならびに非ヒト動物へのワクチン接種に適している。
【００８８】
有用なことにその抗原を組成物中に含めることができる他の株は、耐性の世界的流行株を含めて［３７］、抗ウイルス療法に耐性である（例えば、オセルタミビル［３６］および／またはザナミビルに耐性である）株である。
【００８９】
本発明の組成物は、インフルエンザＡ型ウイルスおよび／またはインフルエンザＢ型ウイルスを含めた１つまたは複数の（例えば１、２、３、４つまたはそれ以上の）インフルエンザウイルス株由来の抗原（複数可）を含んでよい。ワクチンがインフルエンザの１を超える株を含む場合、典型的には異なる株を別々に増殖させ、ウイルスを収集し抗原を調製した後に混合する。したがって、本発明のプロセスは、１を超えるインフルエンザ株由来の抗原を混合するステップを含んでよい。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む三価のワクチンが典型的である。２つのインフルエンザＡ型ウイルス株および２つのインフルエンザＢ型ウイルス株、または３つのインフルエンザＡ型ウイルス株および１つのインフルエンザＢ型ウイルス株由来の抗原を含む四価のワクチンも有用である［３８］。
【００９０】
（医薬組成物）
本発明に従って製造されるワクチン組成物は薬学的に許容される。それは通常、抗原に加えて構成成分を含み、例えば典型的には１つまたは複数の薬学的キャリアおよび／または賦形剤を含む。下記に記載するように、アジュバントを含めることもできる。そのような構成成分の完全な論述は、参考文献３９において入手可能である。
【００９１】
ワクチン組成物は一般に水性の形態となる。しかし、一部のワクチンは、乾燥形態、例えば注射可能な固体またはパッチ上の乾燥もしくは重合調製物の形態であり得る。
【００９２】
ワクチン組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでよい。しかし、好ましくは、ワクチンは水銀物質を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないべきである［３０、４０］。水銀を全く含有しないワクチンがより好ましい。水銀化合物の代替物として、コハク酸α−トコフェロールを含めることができる［３０］。保存剤を含まないワクチンが特に好ましい。
【００９３】
張性を調節するために、ナトリウム塩などの生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、それは１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在してもよい。存在してもよい他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが含まれる。
【００９４】
ワクチン組成物は一般に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、より好ましくは２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲に入る。重量オスモル濃度はワクチン接種によって引き起こされる痛みに影響を有さないことが以前に報告されているが［４１］、それにも関わらずこの範囲で重量オスモル濃度を維持することが好ましい。
【００９５】
ワクチン組成物は１つまたは複数の緩衝剤を含んでよい。典型的な緩衝剤には、リン酸緩衝剤、トリス緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、（特に水酸化アルミニウムアジュバントを有する）ヒスチジン緩衝剤、またはクエン酸緩衝剤が含まれる。緩衝剤は、典型的には５〜２０ｍＭの範囲で含める。
【００９６】
ワクチン組成物のｐＨは一般に５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５〜７．５、または７．０〜７．８である。したがって、本発明のプロセスは、パッケージング前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含んでよい。
【００９７】
ワクチン組成物は好ましくは無菌である。ワクチン組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば用量当たり＜１ＥＵ（エンドトキシン単位、標準的な尺度）、好ましくは用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。ワクチン組成物は好ましくはグルテンを含まない。
【００９８】
本発明のワクチン組成物は、特にスプリットまたは表面抗原ワクチン用に、洗浄剤、例えば（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤、オクトキシノール（オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）、またはデオキシコール酸ナトリウムを含んでよい。洗浄剤は微量でのみ存在できる。したがって、ワクチンは、オクトキシノール−１０およびポリソルベート８０をそれぞれ１ｍｇ／ｍｌ未満で含み得る。微量の他の残りの構成成分は抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。
【００９９】
ワクチン組成物は、単回免疫化用の物質を含んでもよく、または複数回免疫化用の物質を含んでもよい（すなわち「複数用量」キット）。複数用量で準備する際には保存剤を含めることが好ましい。複数用量組成物で保存剤を含めることの代替法として（またはそれに加えて）、物質を取り出すための無菌的アダプターを有する容器に組成物を入れることができる。
【０１００】
インフルエンザワクチンは、典型的には約０．５ｍｌの投与容積で投与するが、半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を小児に投与してもよい。
【０１０１】
組成物およびキットは好ましくは２℃〜８℃で貯蔵する。それらは凍結すべきでない。それらは理想的には直接光を避けるべきである。
【０１０２】
（宿主細胞ＤＮＡ）
細胞系統でウイルスを単離および／または増殖させている場合、ＤＮＡのあらゆる腫瘍形成活性を最小限にするために、最終的なワクチン中に残存する細胞系統ＤＮＡの量を最小限にすることが標準的には実施される。
【０１０３】
したがって、本発明に従って調製されたワクチン組成物は、好ましくは、用量当たり１０ｎｇ未満（好ましくは１ｎｇ未満、より好ましくは１００ｐｇ未満）の残存する宿主細胞ＤＮＡを含有するが、微量の宿主細胞ＤＮＡが存在してもよい。
【０１０４】
任意の残存する宿主細胞ＤＮＡの平均の長さは、５００ｂｐ未満、例えば４００ｂｐ未満、３００ｂｐ未満、２００ｂｐ未満、１００ｂｐ未満などであることが好ましい。
【０１０５】
ワクチン調製の間に、標準的な精製手順、例えばクロマトグラフィーなどを使用して、汚染ＤＮＡを除去することができる。残存する宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えばＤＮアーゼを使用することによって増強することができる。宿主細胞ＤＮＡの汚染を低減する便利な方法は、参考文献４２および４３で開示され、２ステップの処理を伴い、最初にウイルス増殖の間に使用できるＤＮアーゼ（例えばＢｅｎｚｏｎａｓｅ）を、次いでビリオン破壊の間に使用できる陽イオン性洗浄剤（例えばＣＴＡＢ）を使用することを伴なう。β−プロピオラクトンなどのアルキル化剤での処理は、宿主細胞ＤＮＡの除去に使用することもでき、有利にはビリオンの不活性化に使用することもできる［４４］。
【０１０６】
（アジュバント）
本発明の組成物は、有利には、組成物を受容した被験体中で惹起される（体液性および／または細胞性）免疫応答を増強するように機能することができるアジュバントを含んでよい。好ましいアジュバントは水中油型エマルジョンを含む。種々のそのようなアジュバントが公知であり、それらは典型的には少なくとも１つの油および少なくとも１つの界面活性剤を含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は生分解性（代謝可能）であり生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般に直径５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、この小さいサイズは、安定なエマルジョンを提供するマイクロフルイダイザーを用いて実現される。フィルター滅菌に供することができるため、２２０ｎｍ未満のサイズを有する液滴が好ましい。
【０１０７】
エマルジョンは、動物（魚など）または植物供給源由来のものなどの油を含み得る。植物油の供給源には、堅果、種子および穀物が含まれる。最も一般的に入手可能であるラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油、およびオリーブ油が堅果油を例示する。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油には、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油などが含まれる。穀物の群では、トウモロコシ油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オートムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなど他の穀物類の油を使用することもできる。種子油では天然に存在しないが、グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルを、堅果および種子油から開始する適当な物質の加水分解、分離およびエステル化によって調製することができる。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は代謝可能であり、したがって本発明の実施に使用することができる。動物供給源から純粋な油を得るのに必要な分離、精製、鹸化および他の手段の手順は当技術分野で周知である。ほとんどの魚は、容易に収集することができる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨蝋などのクジラ油が、本明細書で使用することができるいくつかの魚油を例示する。５炭素イソプレン単位でいくつかの分岐鎖油が生化学的に合成され、それは一般にテルペノイドと称される。サメ肝油は、スクアレンとして公知である分岐不飽和テルペノイド２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有し、それが本明細書で特に好ましい。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含めた魚油は、商業的供給源から容易に入手可能であり、または当技術分野で公知である方法によって得ることができる。別の好ましい油はα−トコフェロールである（下記を参照）。
【０１０８】
油の混合物を使用することができる。
【０１０９】
界面活性剤は、その「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。それだけに限らないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと称される）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなど、ＤＯＷＦＡＸＴＭの商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復するエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が様々となり得、オクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深いオクトキシノール；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭＮＰシリーズなどのノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）など、ラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ならびにトリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）やモノラウリン酸ソルビタンなどのソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知）を含めた界面活性剤と共に本発明を使用することができる。非イオン性界面活性剤が好ましい。エマルジョン中に含めるのに好ましい界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）、Ｓｐａｎ８５（トリオレイン酸ソルビタン）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。
【０１１０】
界面活性剤の混合物、例えば、Ｔｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ８５混合物を使用することができる。モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）などのオクトキシノールの組合せも適切である。別の有用な組合せは、ラウレス９、プラス、ポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。
【０１１１】
界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（Ｔｗｅｅｎ８０など）では０．０１〜１％、詳細には約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、またはＴｒｉｔｏｎシリーズ中の他の洗浄剤など）では０．００１〜０．１％、詳細には０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）では０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、詳細には０．１〜１％または約０．５％である。
【０１１２】
ワクチンがスプリットウイルスを含有する場合、水相中に遊離界面活性剤を含有することが好ましい。遊離界面活性剤が抗原に対して「スプリット化効果」を発揮することができ、それによって非スプリットビリオンおよび／またはその他の形で存在し得るビリオン凝集物が破壊されるので、これは有利である。これはスプリットウイルスワクチンの安全性を向上させることができる［４５］。
【０１１３】
好ましいエマルジョンは、＜ｌμｍ、例えば≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍの、またはそれより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、好都合なことに、マイクロフルイダイゼーションなどの技術によって実現することができる。
【０１１４】
本発明で有用な特定の水中油型エマルジョンアジュバントには、それだけに限らないが、以下のものが含まれる。
【０１１５】
・スクアレン、Ｔｗｅｅｎ８０、およびＳｐａｎ８５のサブミクロンエマルジョン。そのエマルジョンの組成は容積で約５％がスクアレン、約０．５％がポリソルベート８０、約０．５％がＳｐａｎ８５であり得る。重量でいうと、これらの比は４．３％がスクアレン、０．５％がポリソルベート８０、０．４８％がＳｐａｎ８５となる。このアジュバントは、「ＭＦ５９」として公知であり［４６〜４８］、参考文献４９の第１０章および参考文献５０の第１２章でより詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利には、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を含む。
【０１１６】
・スクアレン、ＤＬ−α−トコフェロール、およびポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）のエマルジョン。そのエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を含んでよい。それは、Ｓｐａｎ８５（例えば１％）および／またはレシチンも含んでもよい。これらのエマルジョンは、２〜１０％のスクアレン、２〜１０％のトコフェロールおよび０．３〜３％のＴｗｅｅｎ８０を有してもよく、より安定なエマルジョンを提供するのでスクアレン：トコフェロールの重量比は好ましくは≦１である。スクアレンおよびＴｗｅｅｎ８０は、約５：２の容積比、または約１１：５の重量比で存在してもよい。１つのそのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にＴｗｅｅｎ８０を溶解して２％溶液を得、次いでこの溶液９０ｍｌを（ＤＬ−α−トコフェロール５ｇおよびスクアレン５ｍｌ）の混合物と混合し、次いでその混合物をマイクロフルイダイズすることによって作製することができる。得られたエマルジョンは、例えば、平均直径が１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍであるサブミクロンの油滴を有してもよい。そのエマルジョンは、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３ｄ−ＭＰＬ）も含んでもよい。この型の別の有用なエマルジョンは、ヒト用量当たり０．５〜１０ｍｇのスクアレン、０．５〜１１ｍｇのトコフェロール、および０．１〜４ｍｇのポリソルベート８０を含み得る［５１］。
【０１１７】
・スクアレン、トコフェロール、およびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。そのエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでもよい（下記を参照）。そのエマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してもよい。
【０１１８】
・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびトコフェロール（例えばコハク酸α−トコフェロール）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは、約７５：１１：１０の質量比でこれら３つの構成成分を含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌのポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌのＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌのコハク酸α−トコフェロール）、これらの濃度は抗原からのこれらの構成成分の任意の寄与を含むべきである。そのエマルジョンは、スクアレンも含んでもよい。そのエマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでもよい（下記を参照）。その水相は、リン酸緩衝液を含有してもよい。
【０１１９】
・スクアレン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭＬ１２１」）のエマルジョン。そのエマルジョンは、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中で処方することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドの有用な送達ビヒクルであり、「ＳＡＦ−１」アジュバント中でスレオニル−ＭＤＰと共に使用されている［５２］（０．０５〜１％のＴｈｒ−ＭＤＰ、５％のスクアレン、２．５％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｌ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。それは、「ＡＦ」アジュバントに見られるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰを伴わずに使用することもできる［５３］（５％のスクアレン、１．２５％のＰｌｕｒｏｎｉｃＬ１２１および０．２％のポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。
【０１２０】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン性界面活性剤（例えば、モノオレイン酸ソルビタンまたは「Ｓｐａｎ８０」などのソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。そのエマルジョンは好ましくは熱可逆性であり、かつ／またはサイズが２００ｎｍ未満の油滴を（容積で）少なくとも９０％有する［５４］。そのエマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えば、ドデシルマルトシドおよび／またはスクロースなどの糖）、および／またはアルキルポリグリコシドのうち１つまたは複数も含んでもよい。そのエマルジョンはＴＬＲ４アゴニストを含んでよい［５５］。そのようなエマルジョンを凍結乾燥することができる。
【０１２１】
・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅ［５６］のエマルジョン。アジュバント添加ワクチン中のこれらの構成成分の終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。
【０１２２】
・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質、および０．０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。参考文献５７に記載されているように、好ましいリン脂質構成成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。
【０１２３】
・代謝不可能な油（軽油など）および少なくとも１つの界面活性剤（レシチン、Ｔｗｅｅｎ８０またはＳｐａｎ８０など）のサブミクロン水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（グルクロン酸のカルボキシル基を介してデスアシルサポニンに脂肪族アミンを付加することによって作製される、参考文献５８に記載のＧＰＩ−０１００など）、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）および／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンなどの添加物を含めることができる。
【０１２４】
・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）がらせん状ミセルとして会合しているエマルジョン［５９］。
【０１２５】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親水性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６０］。
【０１２６】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、および非イオン性親油性界面活性剤（例えば、エトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン［６０］。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは送達時にその場で抗原と混合することができ、したがってアジュバントおよび抗原はパッケージングまたは分配されたワクチンにおいて別々に維持され、使用時に最終的な処方物にする準備ができていてもよい。他の実施形態では、製造の間にエマルジョンを抗原と混合し、したがって液体アジュバント添加形態で組成物をパッケージングする。抗原は一般に水性の形態にあり、その結果ワクチンは２つの液体を混合することによって最終的に調製される。混合する２つの液体の容積比は（例えば５：１と１：５との間で）様々となり得るが、一般に約１：１である。特定のエマルジョンの上記の記載において構成成分の濃度が示されている場合、これらの濃度は典型的には無希釈の組成物についてのものであり、したがって抗原溶液と混合した後の濃度は低下する。
【０１２８】
（ワクチン組成物のパッケージング）
本発明の組成物（またはキット構成成分）に適した容器には、バイアル、シリンジ、（例えば、ディスポーザブルシリンジ）、鼻スプレーなどが含まれる。これらの容器は無菌であるべきである。
【０１２９】
組成物／構成成分がバイアルの中にある場合、バイアルは、好ましくは、ガラスまたはプラスチック物質でできている。バイアルは、好ましくは、それに組成物を添加する前に滅菌する。ラテックス感受性の患者に伴う問題を回避するために、好ましくはラテックスを含まないストッパーでバイアルを密封し、すべてのパッケージング物質においてラテックスが存在しないことが好ましい。バイアルは単回用量のワクチンを含んでもよく、または１を超える用量（「複数用量」バイアル）、例えば１０用量を含んでもよい。好ましいバイアルは、無色のガラスでできている。
【０１３０】
バイアルは、キャップ中に充填済（ｐｒｅ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジを挿入することができるように適合させたキャップ（例えば、ルアーロック）を有することができ、（例えば、その中の凍結乾燥物質を再構成するために）シリンジの内容物をバイアルに放出することができ、そして、バイアルの内容物をシリンジに戻すことができる。バイアルからシリンジを取り出した後、次いで針を取り付けることができ、組成物を患者に投与することができる。キャップは好ましくはシールまたはカバーの内部にあり、その結果、キャップに到達できる前には、シールまたはカバーを取り外さなければならない。バイアルは、特に複数用量バイアル用に、その内容物の無菌的取り出しを可能にするキャップを有してもよい。
【０１３１】
構成成分がシリンジにパッケージングされている場合、シリンジは、それに取り付けられた針を有してもよい。針が取り付けられていない場合、組み立てて使用するための別々の針をシリンジと共に供給することができる。そのような針は、鞘に入っていてもよい。安全針が好ましい。１インチ２３ゲージ、１インチ２５ゲージおよび５／８インチ２５ゲージの針が典型的である。記録の維持が容易となるように、ロット番号、インフルエンザの流行期および内容物の使用期限が印刷され得る剥離式のラベルを付けてシリンジを提供することができる。シリンジ中のプランジャーは、好ましくは、吸引の間にプランジャーが誤って取り出されることを防止するストッパーを有する。シリンジは、ラテックスゴムキャップおよび／またはプランジャーを有してもよい。ディスポーザブルシリンジは、単回用量のワクチンを含有する。シリンジは一般に、針を取り付ける前に先端を密封する先端キャップを有し、その先端キャップは好ましくはブチルゴムでできている。シリンジおよび針が別々にパッケージングされている場合、針は、好ましくはブチルゴム遮蔽を装着している。好ましいシリンジは、商品名「Ｔｉｐ−Ｌｏｋ」ＴＭで販売されているものである。
【０１３２】
例えば小児への送達を容易にするために、容器に半分の用量の容積を示す印をつけてもよい。例えば、０．５ｍｌ用量を含有するシリンジは、０．２５ｍｌの容積を示す印を有してもよい。
【０１３３】
ガラス容器（例えばシリンジまたはバイアル）が使用される場合、ソーダ石灰ガラスではなくホウケイ酸ガラスでできている容器を使用することが好ましい。
【０１３４】
キットまたは組成物は、ワクチンの詳細、例えば投与の指示、ワクチン内の抗原の詳細などを含むリーフレットと共に（例えば、同じ箱の中に）パッケージングすることができる。その指示は、例えばワクチン接種後のアナフィラキシー反応の場合に備えて、アドレナリンの溶液を容易に入手できるようにしておくなどの警告も含有してもよい。
【０１３５】
（処置の方法、およびワクチンの投与）
本発明は、本発明に従って製造されたワクチンを提供する。これらのワクチン組成物は、ヒトまたはブタなどの非ヒト動物被験体への投与に適しており、本発明は、本発明の組成物を被験体に投与するステップを含む、被験体中で免疫応答を起こす方法を提供する。本発明は、医薬として使用するための本発明の組成物も提供し、被験体中で免疫応答を起こす医薬を製造するための、本発明の組成物の使用も提供する。
【０１３６】
これらの方法および使用により起こった免疫応答は一般に抗体応答、好ましくは保護的抗体応答を含む。インフルエンザウイルスワクチン接種後の抗体応答、中和能力および保護を評価する方法は当技術分野で周知である。ヒトでの研究では、ヒトインフルエンザウイルスの赤血球凝集素に対する抗体価が保護と相関する（血清試料の赤血球凝集阻止反応力価が約３０〜４０であると、同種のウイルスによる感染からおよそ５０％保護される）ことが示されている［６１］。抗体応答は、典型的には、赤血球凝集阻止反応法、マイクロ中和法、一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）、および／または一元放射溶血反応法（ＳＲＨ）によって測定される。これらのアッセイ技術は当技術分野で周知である。
【０１３７】
本発明の組成物は様々な方法で投与することができる。最も好ましい免疫化経路は、（例えば腕または脚への）筋肉内注射によるものであるが、他の利用可能な経路には、皮下注射、鼻内［６２〜６４］、経口［６５］、皮内［６６、６７］、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）［６８］などが含まれる。
【０１３８】
本発明に従って調製されるワクチンを使用して、小児も成人も処置することができる。インフルエンザワクチンは、６カ月齢から、小児および成人の免疫化での使用について現在推奨されている。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でよい。ワクチンを受けることが好ましい被験体は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、幼年者（例えば≦５歳）、入院している被験体、医療従事者、軍人および軍関係者、妊娠している女性、慢性疾患の免疫不全被験体、ワクチンを受ける前７日以内に抗ウイルス化合物（例えば、オセルタミビルまたはザナミビル化合物；下記を参照）を服用した被験体、卵アレルギーの人々および外国旅行をしている人々である。しかし、ワクチンはこれらの群にだけ適しているわけではなく、より一般に集団で使用することができる。世界的流行株では、すべての年齢群への投与が好ましい。
【０１３９】
本発明の好ましい組成物は、効力についてのＣＰＭＰ基準の１つ、２つまたは３つを満たす。成人（１８〜６０歳）では、これらの基準は、（１）≧７０％のセロプロテクション、（２）≧４０％のセロコンバージョン、および／または（３）≧２．５倍のＧＭＴ増大である。高齢者（＞６０歳）では、これらの基準は、（１）≧６０％のセロプロテクション、（２）≧３０％のセロコンバージョン、および／または（３）≧２倍のＧＭＴ増大である。これらの基準は、少なくとも５０人の患者での非盲検試験に基づいている。
【０１４０】
処置は、単回投与スケジュールによるものでもよく、または複数回投与スケジュールによるものでもよい。初回免疫化スケジュールおよび／または追加免疫化スケジュールで複数回投与を使用することができる。複数回投与スケジュールでは、例えば非経口での初回および粘膜での追加、粘膜での初回および非経口での追加など、同じかまたは異なる経路によって様々な投与を行うことができる。１を超える投与（典型的には２回の投与）を施すことは、免疫学的にナイーブな患者で、例えばこれまでインフルエンザワクチンを受けたことのない人々に、または（世界的流行の発生でのように）新たなＨＡサブタイプに対するワクチン接種に特に有用である。典型的には、少なくとも１週間間隔で（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）複数回投与を行う。
【０１４１】
本発明によって産生されるワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に（例えば、医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ医療相談または訪問の間に）、例えば麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型ワクチン、不活性化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合型ワクチン（４価のＡ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチン、肺炎球菌結合型ワクチンなどと実質的に同時に患者に投与することができる。肺炎球菌ワクチンおよび／または髄膜炎菌ワクチンと実質的に同時の投与は、高齢患者で特に有用である。
【０１４２】
同様に、本発明のワクチンは、抗ウイルス化合物、詳細にはインフルエンザウイルスに対して活性のある抗ウイルス化合物（例えばオセルタミビルおよび／またはザナミビル）と実質的に同時に（例えば、同じ医療相談または医療専門家への訪問の間に）患者に投与することができる。これらの抗ウイルス薬には、そのエステル（例えばエチルエステル）およびその塩（例えばリン酸塩）を含めた、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸または５−（アセチルアミノ）−４−［（アミノイミノメチル）−アミノ］−２，６−アンヒドロ−３，４，５−トリデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノン−２−エノン酸などのノイラミニダーゼインヒビターが含まれる。好ましい抗ウイルス薬は、リン酸オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵＴＭ）としても公知である、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ）−４−アセチルアミノ−５−アミノ−３（１−エチルプロポキシ）−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸，エチルエステル，リン酸塩（１：１）である。
【０１４３】
（全般）
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、もっぱらＸのみからなるものでもよく、または追加の何か、例えばＸ＋Ｙを含んでもよい。
【０１４４】
「実質的に」という語は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないこともある。必要な場合、「実質的に」という語は、本発明の定義から省略することができる。
【０１４５】
数値ｘに関連して「約」という用語は任意選択のものであり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１４６】
別段に述べられない限り、２つ以上の構成成分を混合するステップを含むプロセスは、混合する任意の特定の順序を必要としない。したがって、任意の順序で構成成分を混合することができる。３つの構成成分が存在する場合、２つの構成成分を互いに組み合わせ、次いでその組合せを第３の構成成分と組み合わせることなどができる。
【０１４７】
細胞の培養で動物（特にウシ）物質を使用する場合、それは、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）を含まない、詳細にはウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）を含まない供給源から得るべきである。全体的に、動物由来物質が総じて存在しない状態で細胞を培養することが好ましい。
【０１４８】
組成物の一部として化合物を身体に投与する場合、その化合物は、代わりに適切なプロドラッグに置換することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】図１は、ルシフェラーゼレポーターを用いたｐｏｌＩプロモーター活性のアッセイに使用した発現構築物を図示する。
【図２】図２は、完全長（ＦＬ）ヒトｐｏｌＩプロモーター配列（配列番号１）を示す。完全長配列内のｐＨＷ２０００ヒトｐｏｌＩプロモーター配列（配列番号２；「ショート」ヒトｐｏｌＩプロモーター）が下線を引いたフォントで示されている。矢印は転写開始部位を指し示す。
【図３】図３は、完全長（ＦＬ）イヌｐｏｌＩプロモーター配列（ＮＷ＿８７８９４５；配列番号３）を示す。完全長プロモーター配列内のＳＨＯＲＴプロモーター配列が下線を引いた大文字フォント（配列番号５）で示され、完全長プロモーター配列内のＭＩＤプロモーター配列が下線を引いた大文字フォントおよび太い小文字フォント（配列番号４）で示されている。
【図４】図４は、ＭＤＣＫ細胞中でのイヌｐｏｌＩプロモーター活性を示す。無地の灰色のカラムはＦＬイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、斜線付きのカラムはＭＩＤイヌプロモーターを用いた結果を示し、斑点付きのカラムはＳＨＯＲＴイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示す。「Ａ」はＬＵＣおよびウイルスポリメラーゼを指し示し、「Ｂ」はＬＵＣおよび感染（ＭＯＩ＝０．０５）を指し示し、「Ｃ」はＬＵＣを指し示し、「Ｄ」はＤＮＡ無しである。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図５】図５は、ＭＤＣＫ３３０１６細胞中でのヒトｐｏｌＩプロモーター活性を示す。無地の灰色のカラムはヒトｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、斜線付きのカラムはＦＬイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、斑点付きのカラムはＭＩＤイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示し、垂直線付き（ｖｅｒｔｉｃａｌｌｙ ｈａｔｃｈｅｄ）のカラムはＳＨＯＲＴイヌｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示す。「Ａ」はＬＵＣおよびウイルスポリメラーゼを指し示し、「Ｂ」はＬＵＣおよび感染（ＭＯＩ＝０．０５）を指し示し、「Ｃ」はＬＵＣを指し示す。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図６】図６は、ＭＤＣＫ細胞の３３０１６細胞中でのＦＬおよびＳＨＯＲＴヒトｐｏｌＩプロモーターならびに完全長イヌｐｏｌＩプロモーターの活性の比較を示す。無地の灰色のカラムは完全長ヒトプロモーターを用いた結果を示し、斜線カラムは完全長イヌプロモーターを用いた結果を示し、斑点付きのカラムはショートヒトｐｏｌＩプロモーターを用いた結果を示す。ＡはＬＵＣ＋ポリメラーゼを指し示し、ＢはＬＵＣ＋感染を指し示し、ＣはＬＵＣのみを指し示す。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図７】図７は、ＭＤＣＫ３３０１６細胞（図７Ａ）およびＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞（図７Ｂ）中でのヒトｐｏｌＩプロモーター（斑点付きのカラム）およびイヌｐｏｌＩプロモーター（斜線付きのカラム）の活性を示す。ＡはＬＵＣ＋ポリメラーゼを指し示し、ＢはＬＵＣ＋感染を指し示し、ＣはＬＵＣのみを指し示す。ｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図８】図８は、ウイルスレスキュー後の細胞溶解物中のＭおよびＮＰタンパク質のウェスタンブロット分析を示す。
【図９】図９は、逆遺伝学構築物を感染させた細胞の上清を使用したフォーカス形成アッセイの結果を示す。
【図１０】図１０は、ヒトおよびイヌｐｏｌＩプロモーターのＤＮＡ配列（それぞれ配列番号１および３）のアラインメントを示す。
【図１１】図１１Ａは、ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦおよび２９３Ｔ細胞中でのヒトｐｏｌＩ（ｈＰｏｌＩ）プロモーターまたはイヌｐｏｌＩプロモーター（ｃＰｏｌＩ）の調節下のレポーター導入遺伝子の発現レベルを示す。黒色カラムは２９３Ｔ細胞を用いた結果を表し、白色カラムはＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦを用いた結果を示し、斜線付きのカラムはＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞を用いた結果を表す；図１１Ｂは、ヒトおよびイヌ細胞中でのトランスフェクション効率を比較している。どちらのグラフでもｙ軸は相対光単位（ＲＬＵ）を指し示す。
【図１２】図１２は、ＴＭＰＲＳＳ２ヘルパープラスミドの存在下（白色カラム）および不在下（黒色カラム）、ならびにフィーダー細胞を添加した状態（黒色カラム）および添加していない状態（白色カラム）（１２Ｂ）における、ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦおよび２９３Ｔ細胞中でのヒトｐｏｌＩプロモーターに基づく逆遺伝学によるＡ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザ株のレスキューを示す。ｙ軸はウイルス力価（ｆｆｕ／ｍＬ）を表す。
【図１３】図１３は、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦ細胞中での、ヒトまたはイヌｐｏｌＩで促進される逆遺伝学によるＡ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザ株のレスキューを比較している。黒色カラムはＴＭＰＲＳＳ２ヘルパープラスミドの不在下での結果を示し、白色バーはＴＭＰＲＳＳ２ヘルパープラスミドの存在下での結果を示す。ｙ軸はウイルス力価（ｆｆｕ／ｍＬ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【０１５０】
（配列表の簡単な説明）
配列番号１は、完全長（ＦＬ）ヒトｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号２は、ｐＨＷ２０００ヒトＰｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号３は、完全長（ＦＬ）イヌｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号４は、ＭＩＤイヌｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号５は、ＳＨＯＲＴイヌｐｏｌＩプロモーター配列である。
配列番号６は、Ａ／カリフォルニア／０４／０９由来のＨＡ配列である。
配列番号７は、Ａ／チリ／１／１９８３由来のＨＡ配列である。
配列番号８は、Ａ／カリフォルニア／０４／０９由来のＮＡ配列である。
配列番号９は、Ａ／チリ／１／１９８３由来のＮＡ配列である。
【０１５１】
（発明を実施するための様式）
（ヒトｐｏｌＩプロモーターはヒトならびにイヌ細胞中で活性である）
非内因性宿主細胞中でのｐｏｌＩプロモーターの活性を評価するために、ヒトｐｏｌＩプロモーターの４８７ｂｐ断片またはイヌｐｏｌＩプロモーターの様々な断片の調節下で（図３に示されている）、アンチセンスの方向でルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ＲＮＡの発現を可能とする発現構築物をＭＤＣＫ細胞にトランスフェクトした。発現したＲＮＡをウイルスポリメラーゼによりｍＲＮＡに転写し、その後ｌｕｃタンパク質に翻訳することができる。したがって、ルシフェラーゼ活性についてアッセイを行うことにより、導入遺伝子を発現している細胞を容易に同定することができる。このアッセイが働くには、ウイルスポリメラーゼを提供することが必要である。これは、細胞にウイルスポリメラーゼをコードする発現構築物を共トランスフェクト（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）するか、あるいはトランスフェクトした細胞にヘルパーウイルスを感染させることによって実現することができる。このアッセイは図１に図示されている。
【０１５２】
図１１Ａは、ヒトｐｏｌＩプロモーターが、ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞中で、またＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦ細胞中でもイヌｐｏｌＩプロモーターと同じ効率で導入遺伝子の発現を促進できることを示す。ＭＤＣＫ ＡＴＣＣ細胞中でヒトｐｏｌＩプロモーターを用いた導入遺伝子の発現レベルは、ヒト２９３Ｔ細胞中で観察されるものよりさらに高い。試験した細胞型のトランスフェクション効率が同等であることを確認するために、ＣＭＶプロモーターの調節下にあるルシフェラーゼ遺伝子を含有する構築物をそれらにトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性のレベルを測定した。その結果は図１１Ｂに示され、それから、試験した細胞のトランスフェクション効率が同等であることが確認される。
【０１５３】
図４は、イヌｐｏｌＩプロモーターの試験した断片がすべて、ＭＤＣＫ細胞中でｌｕｃ導入遺伝子の発現を促進できることを示す。さらに、図５は、完全長ヒトｐｏｌＩプロモーターがＭＤＣＫ細胞中で導入遺伝子の発現を促進でき、イヌｐｏｌＩプロモーターよりさらに効率がよいことを実証している。
【０１５４】
導入遺伝子の発現の促進に必要なヒトｐｏｌＩプロモーターの領域をさらに規定するために、図２に示されているヒトｐｏｌＩプロモーターの断片（「ショート」ｐｏｌＩ）を用いて実験を反復した。完全長ｐｏｌＩプロモーターがより活性であるが、完全長ならびにショートヒトｐｏｌＩプロモーターがＭＤＣＫ細胞中で活性であることが分かった（図６）。
【０１５５】
ヒトｐｏｌＩプロモーターの活性が特定の細胞系統に制限されるかどうかを判定するために、ヒトおよびイヌｐｏｌＩプロモーター配列を含有する構築物をＡＴＣＣのＭＤＣＫおよびＭＤＣＫ３３０１６細胞［１８］にさらにトランスフェクトした。図７に示されているように、ヒトｐｏｌＩプロモーターは、どちらの細胞型でも導入遺伝子の発現を促進することができたが、その発現は、ＭＤＣＫ３３０１６細胞でより効率がよかった。ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用した、ＭＤＣＫ細胞からのインフルエンザウイルスのレスキュー。
【０１５６】
ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用したインフルエンザウイルスレスキューの効率をＭＤＣＫおよび２９３Ｔ細胞で比較した。インフルエンザウイルスゲノムをｐＨＷ２０００発現ベクター中にクローニングした［６９］。このベクターは、ＭＤＣＫ細胞中で活性であることが示されたヒトｐｏｌＩプロモーターの断片を含有する（図５を参照）。詳細には、以下のベクターを使用した：ｐＨＷ−ＷＳＮ ＰＡ（０．５３４μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＰＢ１（０．４３２μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＰＢ２（０．３５７μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＮＰ（０．２８４μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＮＳ（０．２１７μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ Ｍ（０．２３２μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＨＡ（０．１６９μｇ／μｌ）；ｐＨＷ−ＷＳＮ ＮＡ（０．２８０μｇ／μｌ）およびｐｃＤＮＡ−ＴＭＰＲＳＳ（０．７７５μｇ／μｌ；セリンプロテアーゼをコードする）。タンパク質コード遺伝子は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって調節されていた。
【０１５７】
ウイルスレスキューでは、１０％ＦＣＳを入れたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）２ｍｌを入れた６ウェルディッシュ中の１ウェル当たり細胞５×１０６個の密度に２９３Ｔ細胞を播いた。培地２ｍｌを入れた６ウェルディッシュ中の１ウェル当たり細胞０．３×１０６個にＭＤＣＫ細胞を入れた（ｐｌａｔｅ）。細胞を３７℃で１晩インキュベートし、５０〜８０％のコンフルエンシーに達したときにトランスフェクトした。
【０１５８】
２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞は、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１９８８３８７００１）およびリポフェクタミンＬＴＸプラス試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１５３３８−１００）をそれぞれ使用してトランスフェクトした。以下のプロトコールに従って細胞に各ベクター１μｇをトランスフェクトした。ＦｕＧＥＮＥ６では、試薬（ＤＮＡ１μｇ当たりＦｕＧＥＮＥ３μｌ）を無血清培地７３μｌ（抗生物質を含まない）で希釈し、穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートした。その後、希釈したＦｕＧＥＮＥにそれぞれＤＮＡを添加し、穏やかに混合し、室温で少なくとも１５分間インキュベートした。増殖培地を除去せずにＤＮＡ／ＦｕＧＥＮＥ複合体を２９３Ｔ細胞に滴下して加え、細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１５９】
リポフェクタミンを用いたトランスフェクションでは、試薬（２５μｌ）を無血清培地５００μｌで希釈し、室温で５分間インキュベートした。ＤＮＡを添加し、その混合物を室温で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞から増殖培地を除去した後に無血清培地５００μｌをトランスフェクション試薬に滴下して加えた。その後細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。トランスフェクションから２４時間後に培地を交換した。
【０１６０】
感染から２日後、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって細胞から上清を収集した。上清中に収集されたウイルスをフォーカス形成アッセイに使用した。さらに、感染した細胞を溶解させ、それをウェスタンブロット分析に使用した。
【０１６１】
（ウェスタンブロット分析）
標準的なプロトコールに従って、２９３ＴおよびＭＤＣＫ細胞を溶解しそれをウェスタンブロット分析に供した。ＭおよびＮＰタンパク質に対する抗体を使用して、膜上のこれらのタンパク質を検出した。Ｓ６に対する抗体をローディング対照として使用した。「ＷＳＮ」とラベルを付けたレーンに、レスキューされたウイルス由来のタンパク質をロードした。「Ｍ」および「ＮＰ」のラベルを付けたレーンは、対照として組換えＭおよびＮＰタンパク質を含有する。これらの組換えタンパク質は異なる遺伝子から発現したので、ゲル中でわずかにゆっくりと移動する。
【０１６２】
分析の結果は図８に示され、ヒトｐｏｌＩプロモーターの調節下にある発現構築物が２９３ＴならびにＭＤＣＫ細胞中でのウイルスレスキューを可能とすることが明らかである。
【０１６３】
（フォーカス形成アッセイ）
１０％ＦＣＳを入れたＤＭＥＭ５００μｌの入った４８ウェルプレート中の１ウェル当たり細胞６．２５×１０４個の密度に、感染していないＭＤＣＫ細胞を入れた。次の日に、細胞に１００〜１５０μｌの容積のウイルスを３７℃で２時間感染させた。それによって細胞は様々な希釈のウイルスに感染した。感染から２時間後、培地を吸引し１０％ＦＣＳを入れたＤＭＥＭ５００μｌを各ウェルに添加した。細胞を３７℃で次の日までインキュベートした。
【０１６４】
感染から２４時間後、培地を吸引し細胞をＰＢＳで１回洗浄した。ＰＢＳ中８０％の氷冷アセトン５００μｌを各ウェルに添加し、その後４℃で３０分間インキュベーションを行った。アセトン混合物を吸引し、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ）で１回洗浄した。ＰＢＳ中２％のＢＳＡ５００μｌを各ウェルに添加し、その後室温（ＲＴ）で３０分間インキュベーションを行った。ブロッキング緩衝液中１：６０００希釈の抗ＮＰを５００μｌ添加し、その後ＲＴで２時間インキュベーションを行った。抗体溶液を吸引し、細胞をＰＢＳＴで２回洗浄した。５００μｌのブロッキング緩衝液中１：２０００の希釈で二次抗体（ヤギ抗マウス）を添加し、プレートをＲＴで２時間インキュベートした。抗体溶液を吸引し、細胞をＰＢＳＴで３回洗浄した。ＫＰＬ Ｔｒｕｅ Ｂｌｕｅ ５００μｌを各ウェルに添加し１０分間インキュベートした。Ｔｒｕｅ−Ｂｌｕｅを吸引し、ｄＨ２Ｏで１回洗浄することによって反応を停止した。水を吸引し、細胞を乾燥させた。
【０１６５】
アッセイの結果は図９に示され、それから、２９３ＴならびにＭＤＣＫ細胞から感染性ウイルスが得られたことがはっきりと実証される。
【０１６６】
参考文献７０に記載されているように、ヒトｐｏｌＩ逆遺伝学系を使用したＡ／プエルトリコ／８／３４インフルエンザ株のウイルスレスキューもＭＤＣＫ ＡＴＣＣ、ＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦおよび２９３Ｔ細胞で試験した。セリンプロテアーゼをコードするヘルパープラスミドＴＭＰＲＳＳ２の存在下および不在下でウイルスがレスキューされる実験を行った。さらに、ウイルスレスキューから２４時間後にフィーダー細胞を添加して、および添加せずにウイルスレスキューを行った。その結果は図１２に示され、それから、ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用して様々な条件下で効率的なウイルスレスキューをＭＤＣＫ細胞で実現できることが実証される。
【０１６７】
ヒトｐｏｌＩプロモーターを使用したＭＤＣＫ３３０１６−ＰＦでのウイルスレスキューの効率がイヌｐｏｌＩプロモーターを使用したレスキューと同等であるかどうかを比較するため、参考文献７０に記載されているように、細胞にヒトｐｏｌＩ ＲＧ系またはイヌｐｏｌＩ ＲＧ系をトランスフェクトした。ＴＭＰＲＳＳヘルパープラスミドの存在下および不在下で実験を行った。その結果（図１３）は、ヒトｐｏｌＩ系を使用したときイヌｐｏｌＩ系と同等の効率でＡ／プエルトリコ／８／３４株がレスキューされたことを実証している。
【０１６８】
本発明がほんの一例として記載されており、本発明の範囲および精神の中にとどまりつつ改変をなすことができることが理解される。
【０１６９】
（参考文献）
【０１７０】
【数１】
【０１７１】
【数２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞であって、該構築物からの該ウイルスＲＮＡ分子の発現は、該宿主細胞の分類学上の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって調節される、宿主細胞。
【請求項２】
内因性ｒＲＮＡの発現を調節する少なくとも１つの内因性ｐｏｌＩプロモーター、および、ウイルスＲＮＡまたはその相補体の発現を調節する少なくとも１つの非内因性ｐｏｌＩプロモーターを有する細胞。
【請求項３】
ウイルスを産生させるためにウイルスＲＮＡ分子が発現される条件下で請求項１または請求項２に記載の細胞を増殖させるステップを含む、組換えウイルスを産生するための方法。
【請求項４】
（ｉ）請求項３に記載の方法によって組換えウイルスを産生するステップと、（ｉｉ）培養宿主にステップ（ｉ）で得られたウイルスを感染させるステップと、（ｉｉｉ）さらなるウイルスを産生させるためにステップ（ｉｉ）の宿主を培養するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたウイルスを精製するステップとを含む、ウイルスを調製する方法。
【請求項５】
（ａ）請求項４に記載の方法によってウイルスを調製するステップと、（ｂ）該ウイルスからワクチンを調製するステップとを含む、ワクチンを調製するための方法。
【請求項６】
前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法であって、前記ｐｏｌＩプロモーターが霊長目ｐｏｌＩプロモーターであり、該細胞が非霊長目細胞である、細胞または方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞または方法であって、前記ｐｏｌＩプロモーターが非イヌｐｏｌＩプロモーターであり、該細胞がイヌ細胞である、細胞または方法。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞または方法であって、前記ｐｏｌＩプロモーターがヒトｐｏｌＩプロモーターであり、該細胞がイヌ細胞である、細胞または方法。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞または方法であって、該細胞がＭＤＣＫ細胞である、細胞または方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞または方法であって、前記ＭＤＣＫ細胞が細胞系統ＭＤＣＫ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、細胞または方法。
【請求項１１】
前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法であって、該細胞が少なくとも１つの両方向性発現構築物を含む、細胞または方法。
【請求項１２】
前記発現構築物が発現ベクターまたは直鎖発現構築物である、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが分節型ウイルスである、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが非分節型ウイルスである、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１５】
前記ウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１６】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１５に記載の細胞または方法。
【請求項１】
ウイルスＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの発現構築物を含む宿主細胞であって、該構築物からの該ウイルスＲＮＡ分子の発現は、該宿主細胞の分類学上の目にとって内因性ではないｐｏｌＩプロモーターによって調節される、宿主細胞。
【請求項２】
内因性ｒＲＮＡの発現を調節する少なくとも１つの内因性ｐｏｌＩプロモーター、および、ウイルスＲＮＡまたはその相補体の発現を調節する少なくとも１つの非内因性ｐｏｌＩプロモーターを有する細胞。
【請求項３】
ウイルスを産生させるためにウイルスＲＮＡ分子が発現される条件下で請求項１または請求項２に記載の細胞を増殖させるステップを含む、組換えウイルスを産生するための方法。
【請求項４】
（ｉ）請求項３に記載の方法によって組換えウイルスを産生するステップと、（ｉｉ）培養宿主にステップ（ｉ）で得られたウイルスを感染させるステップと、（ｉｉｉ）さらなるウイルスを産生させるためにステップ（ｉｉ）の宿主を培養するステップと、（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）で得られたウイルスを精製するステップとを含む、ウイルスを調製する方法。
【請求項５】
（ａ）請求項４に記載の方法によってウイルスを調製するステップと、（ｂ）該ウイルスからワクチンを調製するステップとを含む、ワクチンを調製するための方法。
【請求項６】
前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法であって、前記ｐｏｌＩプロモーターが霊長目ｐｏｌＩプロモーターであり、該細胞が非霊長目細胞である、細胞または方法。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載の細胞または方法であって、前記ｐｏｌＩプロモーターが非イヌｐｏｌＩプロモーターであり、該細胞がイヌ細胞である、細胞または方法。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞または方法であって、前記ｐｏｌＩプロモーターがヒトｐｏｌＩプロモーターであり、該細胞がイヌ細胞である、細胞または方法。
【請求項９】
請求項８に記載の細胞または方法であって、該細胞がＭＤＣＫ細胞である、細胞または方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞または方法であって、前記ＭＤＣＫ細胞が細胞系統ＭＤＣＫ３３０１６（ＤＳＭ ＡＣＣ２２１９）である、細胞または方法。
【請求項１１】
前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法であって、該細胞が少なくとも１つの両方向性発現構築物を含む、細胞または方法。
【請求項１２】
前記発現構築物が発現ベクターまたは直鎖発現構築物である、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１３】
前記ウイルスが分節型ウイルスである、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１４】
前記ウイルスが非分節型ウイルスである、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１５】
前記ウイルスがマイナス鎖ＲＮＡウイルスである、前述の請求項のいずれかに記載の細胞または方法。
【請求項１６】
前記ウイルスがインフルエンザウイルスである、請求項１５に記載の細胞または方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５２７２２８（Ｐ２０１２−５２７２２８Ａ）
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１１３６４（Ｐ２０１２−５１１３６４）
【出願日】平成２２年５月２１日（２０１０．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００１３３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３３９６４
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１１月８日（２０１２．１１．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２１日（２０１０．５．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／００１３３２
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１３３９６４
【国際公開日】平成２２年１１月２５日（２０１０．１１．２５）
【出願人】（５０４３８９９９１）ノバルティス アーゲー (806)
【Ｆターム（参考）】
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