【課題】大腸菌等の真正細菌宿主細胞又は酵母細胞等の真核宿主で産生された蛋白質に非天然アミノ酸を組込むことができるｔＲＮＡとアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの翻訳系の提供。
【解決手段】（ａ）ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と；（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；前記第１のＯ−ＲＳが前記第１の非天然アミノ酸と特定な配列からなるアミノ酸配列の前記第１のＯ−ｔＲＮＡおよびＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と；
（ｂ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）と；
（ｃ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を含み；
前記第１のＯ−ＲＳが前記第１の非天然アミノ酸と配列番号１に記載の前記第１のＯ−ｔＲＮＡおよび配列番号１０のアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記第１の非天然アミノ酸でアミノアシル化する翻訳系。
【請求項２】
前記第１のＯ−ＲＳがＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項３】
前記第１のＯ−ＲＳが野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項４】
前記第１のＯ−ＲＳが配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、かつＴｙｒ
３２ Ｌｅｕ，Ｇｌｕ １０７ Ｓｅｒ， ＡＳＰ １５８ Ｐｒｏ， Ｉｌｅ １５９ Ｌｅｕ， Ｈｉｓ １６０ Ａｓｎ， および Ｌｅｕ １６２ Ｇｌｕであるものと少なくとも９０％が一致するアミノ酸配列を含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項５】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡがアンバーサプレッサーｔＲＮＡである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項６】
前記第１のＯ−ｔＲＮＡが配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるものである請求項１に記載の翻訳系。
【請求項７】
該当蛋白質をコードする核酸を更に含み、その核酸が少なくとも１個のセレクターコドンを含み、そのセレクターコドンが前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される請求項１に記載の翻訳系。
【請求項８】
第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含み、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なるセレクターコドンを認識する請求項７に記載の翻訳系。
【請求項９】
前記翻訳系が宿主細胞を含み、その宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを含む請求項１に記載の翻訳系。
【請求項１０】
前記宿主細胞が真正細菌細胞である請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１１】
前記真正細菌細胞が大腸菌細胞ある請求項１０に記載の翻訳系。
【請求項１２】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含む請求項１２に記載の翻訳系。
【請求項１４】
前記宿主細胞が前記第１のＯ−ｔＲＮＳをコードするポリヌクレオチドを含む請求項９に記載の翻訳系。
【請求項１５】
特定位置に非天然アミノ酸を含む蛋白質を宿主細胞で生産する方法であって、
（ａ）（ｉ）ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニンである第１の非天然アミノ酸と；
（ｉｉ）第１の直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と；
（ｉｉｉ）第１の直交アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）（但し、前記第１のＯ−ＲＳは、前記第１の非天然アミノ酸と配列番号１に記載の前記第１のＯ−ｔＲＮＡおよび配列番号１０のアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを含む前記宿主細胞で観察される効率の少なくとも５０％の効率で、前記第１のＯ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する）と；
（ｉｖ）前記蛋白質をコードし、前記第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識される少なくとも１個のセレクターコドンを含む核酸と、
を含む宿主細胞を提供する段階と；
（ｂ）前記宿主細胞を増殖させる段階と；
（ｃ）前記蛋白質の翻訳中に前記核酸のセレクターコドンの位置に対応する前記蛋白質の前記選択位置に前記非天然アミノ酸を組込むことにより、前記選択位置に前記非天然アミノ酸を含む前記蛋白質を生産する段階とを含む前記方法。
【請求項１６】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
翻訳系を提供する前記段階がＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
翻訳系を提供する前記段階が野生型Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉチロシルｔＲＮＡシンテターゼから誘導されるＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有し、かつＴｙｒ ３２ Ｌｅｕ，Ｇｌｕ １０７ Ｓｅｒ， Ａｓｐ １５８ Ｐｒｏ， Ｉｌｅ １５９ Ｌｅｕ， Ｈｉｓ １６０ Ａｓｎ， および Ｌｅｕ １６２ Ｇｌｕ より成るものと少なくとも９０％が一致するアミノ酸配列を含むＯ−ＲＳを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
翻訳系を提供する前記段階が部位特異的突然変異誘発後により野生型のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合ポッケトを突然変異させる段階と、前記Ｏ−ｔＲＮＡを前記非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化する得られたＯ−ＲＳを選択する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択段階が部位特異的突然変異誘発後に得られた複数のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ分子を含むプールから前記Ｏ−ＲＳをポジティブ選択及びネガティブ選択する段階を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
翻訳系を提供する前記段階が前記Ｏ−ｔＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーサプレッサーｔＲＮＡであるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
翻訳系を提供する前記段階が配列番号１に記載のポリヌクレオチド配列を含むか又は前記配列によりコードされるＯ−ｔＲＮＡを提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
翻訳系を提供する前記段階がアンバーセレクターコドンを含む核酸を提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
前記蛋白質が第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸を更に含み、第２のＯ−ＲＳと第２のＯ−ｔＲＮＡを更に含む翻訳系を提供し、第２のＯ−ＲＳが第２のＯ−ｔＲＮＡを第１の非天然アミノ酸と異なる第２の非天然アミノ酸で優先的にアミノアシル化し、第２のＯ−ｔＲＮＡが第１のＯ−ｔＲＮＡにより認識されるセレクターコドンと異なる核酸中のセレクターコドンを認識する請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
翻訳系を提供する前記段階が宿主細胞を提供する段階を含み、前記宿主細胞が前記第１の非天然アミノ酸と、前記第１のＯ−ＲＳと、前記第１のＯ−ｔＲＮＡと、前記核酸を含み、前記組込み段階が前記宿主細胞を培養する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
宿主細胞を提供する前記段階が真正細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞を提供する段階を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
真正細菌宿主細胞を提供する前記段階が大腸菌宿主細胞を提供する段階を含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
宿主細胞を提供する前記段階が前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｏ−ＲＳをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する前記段階が配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する段階を含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
翻訳系を提供する前記段階が細胞抽出液を提供する段階を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項３３】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列で、Ｔｙｒ ３２ Ｌｅｕ，Ｇｌｕ １０７ Ｓｅｒ， ＡＳＰ １５８ Ｐｒｏ， Ｉｌｅ１５９ Ｌｅｕ， Ｈｉｓ １６０ Ａｓｎ， および Ｌｅｕ １６２ Ｇｌｕであるものと少なくとも９０％が一致するポリペプチドを含む組成物であり、前記ポリペプチドが配列番号１に記載のＯ−ｔＲＮＡ、前記非天然アミノ酸および配列番号７のアミノ酸配列を含むアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを含む翻訳系で観察される効率の少なくとも５０％の効率で、コグネイト直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を前記非天然アミノ酸でアミノアシル化する前記組成物生物。
【請求項３４】
請求項３３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが配列番号１１のものである請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記組成物がポリペプチドを含む細胞である請求項３３に記載の組成物。
【請求項３７】
配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む組成物。
【請求項３８】
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３９】
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３７に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを含む細胞。

【図１−１】

【図１−２】

【図１−３】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【公開番号】特開２０１２−２５４０７３（Ｐ２０１２−２５４０７３Ａ）
【公開日】平成２４年１２月２７日（２０１２．１２．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２５５１８０（Ｐ２０１１−２５５１８０）
【出願日】平成２３年１１月２２日（２０１１．１１．２２）
【分割の表示】特願２００７−５３９２２８（Ｐ２００７−５３９２２８）の分割
【原出願日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【出願人】（３９９０３８６２０）ザ　スクリプス　リサーチ　インスティチュート (51)
【Ｆターム（参考）】