非対称ベンゾキサンテン染料
【課題】蛍光染料として有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料を提供すること。
【解決手段】以下の式（Ａ）を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物であって、Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、またはアミンである。Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基またはそれらの組合せである。そしてＲ９は、アセチレン、アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せであり、この置換フェニルは、以下の式（Ｂ）の構造を有し、Ｘ１は、カルボン酸またはスルホン酸であり；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、または低級アルキルであり；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、または連結基である、化合物。
【解決手段】以下の式（Ａ）を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物であって、Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、またはアミンである。Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基またはそれらの組合せである。そしてＲ９は、アセチレン、アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せであり、この置換フェニルは、以下の式（Ｂ）の構造を有し、Ｘ１は、カルボン酸またはスルホン酸であり；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、または低級アルキルであり；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、または連結基である、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子プローブとして有用な蛍光染料化合物に関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用な非対称ベンゾキサンテン染料に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
生物学的分析物の非放射性検出は、現在の分析バイオテクノロジーにおいて、重要な技術である。放射性標識の必要性をなくすことにより、安全性が高まり、試薬廃棄物の環境上の影響が著しく低下し、その結果、分析コストが低減される。このような非放射性検出方法を使用する方法の例には、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ鎖反応生成物の検出、イムノアッセイなどが包含される。
【０００３】
多くの用途では、混合物中の複数の空間的に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮＡ配列決定法などが必要である。複数座のＤＮＡプローブアッセイの場合には、多色検出を提供することにより、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの製造が促進される。自動化したＤＮＡ配列決定の場合には、多色標識化により、単一ラインの４個の塩基全ての分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力が増え、レーン間の電気泳動の可動性の変化に付随した不確実性がなくなる。
【０００４】
多重検出では、特に、電気泳動分離および酵素処理が必要な分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）に対して、染料標識の選択について、非常に多くの厳しい制約が課せられている。第１に、有機蛍光染料の典型的な発光バンドの半値幅は、約４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源により制限されるので、その発光スペクトルが分光的に分解される一連の染料を見つけるのは困難である。１組の染料に関連して、本明細書中で使用する「スペクトル分解」との用語は、これらの染料の蛍光発光バンドが充分に異なること、すなわち、充分に重なりがないことを意味し、個々の染料が結合している試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、米国特許第４，２３０，５５８号、第４，８１１，２１８号またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１〜７６ページ、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５）に記述の系によって例示されるように、例えば、バンドパスフィルターおよび光電子増倍管、帯電カップルド装置（ｃｈａｒｇｅｄ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）、および分光器のシステムを使用する標準的な光検出システムを用いて、個々の染料により発生する蛍光信号を基準にして、識別できることを意味する。第２に、たとえ、非重複発光スペクトルを有する染料を見出しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、そのセットは、依然として、適当ではない。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合には、試料の充填を多くしても、低い蛍光効率を補填できない（Ｐｒｉｎｇｌｅら、ＤＮＡ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、１：１５〜２１（１９８８））。第３に、数個の蛍光染料を同時に使用するとき、これらの染料の吸収バンドが広範囲に分離するために、同時励起が困難となる。第４に、これらの染料の電荷、分子サイズおよび立体配座は、そのフラグメントの電気泳動可動性に悪影響を与えてはならない。最後に、これらの蛍光染料は、これらのフラグメントを製造するかまたは操作するのに使用する化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合性でなければならない。
【０００５】
これらの厳しい制約のために、多色用途（特に、４色ＤＮＡ配列決定の領域）で使用できる蛍光染料のセットは、少数発見されているにすぎない（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１３；２３９９〜２４１２（１９８５）；Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：３３６〜３４１（１９８７）；およびＣｏｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５：３４２〜３４８（１９８７））。図１は、２種のローダミンベースの染料であるＴＡＭＲＡ（２２）およびＲＯＸ（２６）および２種のフルオレセインベースの染料であるＨＥＸ（２３）およびＮＡＮ（２４）を含めて、５５０ｎｍを超えると発光する長波長標識として使用される蛍光キサンテン染料の例を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、複数の空間的に重複した分析物の同時検出に有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料であって、上記制約を満たし、４８０ｎｍと５５０ｎｍの間の波長を有する励起光を照射したとき、５５０ｎｍを超える蛍光発光最大を与えるものを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、複数の空間的に重複した分析物の同時検出に有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料であって、上記制約を満たし、その蛍光特性が、種々の位置における置換基の操作により調整できるものを提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の合成に有用な方法および中間体化合物を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料で標識化したヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を含むホスホロアミデート化合物を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を使用して、ＤＮＡ配列決定法を含めたフラグメント解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物により、達成される：
【００１３】
【化３】
ここで、Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、またはアミンである。Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基またはそれらの組合せである。そしてＲ９は、アセチレン、アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せであり、この置換フェニルは、以下の構造を有する：
【００１４】
【化４】
ここで、Ｘ１は、カルボン酸またはスルホン酸であり；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、または低級アルキルであり；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、または連結基である。
【００１５】
第２の局面では、本発明は、次式を有するホスホロアミダイト化合物を包含する：
【００１６】
【化５】
ここで、Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）であり；Ｙは、連結基であり；Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；Ｂ２、およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アリールアルキル、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルであり；そしてＤは、上記非対称ベンゾキサンテン染料化合物である。ＹおよびＤは、連結基およびその相補官能基（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の反応により形成した連結基を介して結合されており、このような連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、染料Ｄに結合している。
【００１７】
第３の局面では、本発明は、次式を有するホスホルアミダイト化合物を包含する：
【００１８】
【化６】
ここで、Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり、Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アリールアルキル、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルであり；Ｂ５は、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり；Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そしてＤは、上記染料化合物である。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している。ＢおよびＤは、連結基およびその相補官能基の反応により形成した連結基を介して結合されており、このような連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置の１個で、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンからなる群から選択される。
【００１９】
第４の局面では、本発明は、上記非対称ベンゾキサンテン染料の合成で中間体として有用な化合物を包含し、このような化合物は、次式を有する：
【００２０】
【化７】
ここで、Ｒ３〜Ｒ７は、上で記述のものと同じであり、そしてＹ２は、ヒドロキシルまたはアミンである。本局面の特に好ましい実施形態では、Ｒ３は、フッ素であり、そしてＹ２は、ヒドロキシルである。
【００２１】
第５の局面では、本発明は、本発明の上記非対称ベンゾキサンテン染料で標識化したヌクレオチドを包含し、このヌクレオチドは、次式を有する：
【００２２】
【化８】
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基である；Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨまたはＯＨである；Ｗ３は、ＯＨ、
【００２３】
【化９】
であり、そしてＤは、本発明の染料化合物である。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している。ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から選択される。
【００２４】
第６の局面では、本発明は、次式を有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチドを包含する：
【００２５】
【化１０】
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ１は、ＨまたはＯＨであり；Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４、およびＮｕｃであり、ここで、「Ｎｕｃ」は、ヌクレオチドを意味する。このヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの５’−位置に結合している；Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３およびそれらのホスフェートアナログ、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル連結基により連結されており、この連結基は、Ｎｕｃの３’−位置に結合している；そしてＤは、本発明の染料化合物である。ＨＰＯ３のホスフェートアナログには、非架橋酸素を非酸素部分（例えば、イオウ、アミノ、アニリデート、アニリンチオエートなど）で置き換えたアナログが挙げられる。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している。ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置の１個で、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から選択される。
【００２６】
第７の局面では、本発明は、本発明の染料を用いたポリヌクレオチド配列決定方法を包含する。この方法は、第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を以下のように形成する工程を包含する：第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識化されている；第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標識化されている；第３のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染料で標識化されている；そして第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、第４染料で標識化されている。この方法では、第１染料、第２染料、第３染料、または第４染料の１種以上は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料である。これらの染料の他のものは、それらが、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから分光的に分解可能なように、選択される。上記混合物を形成した後、このポリヌクレオチドは、電気泳動的に分離され、それにより、類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドが形成される。次に、これらのバンドは、これらの染料に蛍光を起こすことができる照射ビームで照射される。最後に、これらのポリヌクレオチドのクラスは、各バンド中の標識化ポリヌクレオチドの蛍光スペクトルにより、同定される。
【００２７】
第８の局面では、本発明は、本発明の染料化合物を使用するフラグメント解析方法を包含する。この局面の方法は、以下の工程を包含する：標識化ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、このフラグメントが、本発明の染料化合物で標識化されている、工程；この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；およびこの分離プロセスに引き続いて、この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。
１つの局面において、本発明は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物：
【００２８】
【化１１】
を提供し、
ここで、
Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムおよびアミンからなる群から選択され；
Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択され；そして
Ｒ９は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、置換フェニル、複素環芳香族およびそれらの組合せからなる群から選択され、この置換フェニルは、以下の構造を有し：
【００２９】
【化１２】
ここで、
Ｘ１〜Ｘ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、または連結基である。
【００３０】
１つの実施形態において、上記の化合物は、Ｙ１およびＹ２の１個が、酸素であり得、そして他が、ヒドロキシルであり得る。
【００３１】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ１は、カルボン酸、スルホン酸、および−ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され得；
Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、および低級アルキルからなる群から選択され得；そして
Ｘ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、および連結基からなる群から選択され得る。
【００３２】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ２およびＸ５が、塩素であり得る。
【００３３】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ１が、カルボン酸であり得る。
【００３４】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ３またはＸ４の一方が、連結基であり得、そして他方が、水素であり得る。
【００３５】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ１またはＸ５の一方が、カルボン酸、スルホン酸、および−ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され得る。
【００３６】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｒ１〜Ｒ３の１個が、フッ素であり得る。好ましい実施形態において、上記の化合物は、Ｒ３が、フッ素であり得る。
【００３７】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、塩素であり得；
Ｒ３は、フッ素であり得；
Ｒ２、およびＲ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００３８】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１およびＲ３は、フッ素であり得；
Ｒ２、およびＲ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００３９】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、メトキシであり得、Ｒ２は、塩素であり得、Ｒ３は、フッ素であり得；
Ｒ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４０】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ３は、フッ素であり得；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４１】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４２】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、塩素であり；Ｒ２〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４３】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、メトキシであり；Ｒ２は、塩素であり得；
Ｒ３〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４４】
別の局面において、本発明は、次式を有するホスホルアミダイト化合物：
【００４５】
【化１３】
を提供し、ここで、
Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）であり；
Ｙは、連結基であり；
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；そして
Ｄは、上記の染料化合物である；
ここで、ＹおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位置のうち１つで染料Ｄに結合した連結基を介して、連結されている。
【００４６】
１つの実施形態において、上記の化合物は、Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、その主鎖に５個までの炭素原子を含み、かつ全体で１０個までの炭素原子を含有するアルケン鎖であり得、この鎖の両末端の原子価結合は、この窒素原子に結合されており得るか；あるいはＢ２およびＢ３は、窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し得、これは、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し得る。好ましい実施形態において、上記の化合物は、
Ｂ１は、メチル、β−シアノエチル、または４−ニトロフェニルエチルからなる群から選択され得；
Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル、およびｓｅｃ−ブチルからなる群から選択され得；そして
Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノであり得る。
【００４７】
別の実施形態において、上記の化合物は、ＸおよびＹが、一緒になって、以下の式であり得、ここで、ｎが、２〜１０の範囲であり得る：
【００４８】
【化１４】
。
【００４９】
別の実施形態において、上記の化合物は、ＸおよびＹが、一緒になって、以下の式であり得、ここで、ｎが、２〜１０の範囲であり得る：
【００５０】
【化１５】
。
【００５１】
別の局面において、本発明は、次式を有するホスホロアミダイト化合物：
【００５２】
【化１６】
を提供し、ここで：
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２、およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｂ５は、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり；
Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そして
Ｄは、上記の染料化合物である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している；
ここで、ＢおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位置のうち１つでＤに結合した連結基により、連結されている；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。
【００５３】
１つの実施形態において、上記の化合物は、上記連結基が、以下の式であり得る：
【００５４】
【化１７】
。
【００５５】
別の実施形態において、上記の化合物は、上記連結基が、以下であり得る
【００５６】
【化１８】
。
【００５７】
別の実施形態において、上記の化合物は、上記連結基が、以下であり得る：
【００５８】
【化１９】
。
【００５９】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００６０】
別の局面において、本発明は、次式を有する化合物：
【００６１】
【化２０】
を提供し、ここで：
Ｒ３は、フッ素、塩素、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され；
Ｒ４〜Ｒ７は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され；そして
Ｙ２は、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択される。
【００６２】
１つの実施形態において、上記の化合物は、Ｒ３が、フッ素であり得る。
【００６３】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｙ２が、ヒドロキシルであり得る。
【００６４】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｒ３が、塩素であり得る。
【００６５】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｙ２が、アミンであり得る。
【００６６】
別の局面において、本発明は、次式を有する標識化ヌクレオチド：
【００６７】
【化２１】
を提供し、ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｗ３は、ＯＨ、
【００６８】
【化２２】
からなる群から選択され；
Ｄは、上記の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している；
ここで、ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合している；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位置に結合している。
【００６９】
１つの実施形態において、上記の標識化ヌクレオチドは、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００７０】
別の実施形態において、上記の標識ヌクレオチドは、上記連結基が、以下の式であり得る：
【００７１】
【化２３】
。
【００７２】
別の実施形態において、上記の標識化ヌクレオチドは、Ｗ１およびＷ２の両方が、Ｈであり得、そしてＷ３が、以下の式であり得る：
【００７３】
【化２４】
。
【００７４】
別の実施形態において、上記の標識化ヌクレオチドは、Ｗ１が、Ｈであり得、Ｗ２が、ＯＨであり得、そしてＷ３が、以下の式であり得る：
【００７５】
【化２５】
。
【００７６】
別の局面において、本発明は、次式を有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチド：
【００７７】
【化２６】
を提供し、ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｚ１は、ＨまたはＯＨからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの５’−位置に結合している；
Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの３’−位置に結合している；そして
Ｄは、上記の染料化合物である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している；
ここで、ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合している；
ここで、Ｂがプリンである場合、この連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位置に結合している。
【００７８】
１つの実施形態において、上記の標識化ポリヌクレオチドは、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００７９】
別の実施形態において、上記の標識化ポリヌクレオチドは、上記連結基が、以下の式であり得る：
【００８０】
【化２７】
。
【００８１】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、ポリヌクレオチド配列決定方法を提供する：
第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を以下：
この第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識されており；
この第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標識されており；
この第３のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染料で標識されており；そして
この第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、第４染料で標識されており；
ここで、この第１染料、この第２染料、この第３染料、またはこの第４染料のうちの１種は、上記の非対称ベンゾキサンテン染料であり；
この染料の他のものは、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから、分光的に分解可能である、
ように形成する工程；
このポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それにより、同様にサイズ分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；
このバンドを、この染料が蛍光を発するのを引き起こすことができる照射ビームで照射する工程；ならびに
このバンド中のこのポリヌクレオチドのクラスを、この染料の蛍光スペクトルにより同定する工程。
【００８２】
１つの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列決定方法は、上記染料の他のものが、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン、および６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセインからなる群から選択され得る。
【００８３】
別の局面において、本発明は、以下を包含する、フラグメント解析方法を提供する：
標識化ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、このフラグメントが、上記の染料化合物で標識化されている、工程；
この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性（ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）分離プロセスに供する工程；および
この分離プロセスに引き続いて、この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。
【００８４】
１つの実施形態において、上記のフラグメント解析方法は、上記サイズ依存性分離プロセスが、電気泳動であり得、そして上記検出する工程が、蛍光によって検出する工程であり得る。
【００８５】
本発明はさらに、以下を提供する：
（項目１）次式：
【化１】
を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物であって、
ここで、
Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムおよびアミンからなる群から選択され；
Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択され；そして
Ｒ９は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、複素環式芳香族、および以下の構造：
【化２】
を有する置換フェニルからなる群より選択され、
ここで、
Ｘ１〜Ｘ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、または連結基であり、
ここで、この連結基は、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、活性カルボキシレート、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドおよび活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからなる群より選択される、
化合物。
（項目２）次式を有するホスホロアミダイト化合物であって：
【化１００】
ここで、
Ｘは、線状低級アルキル、環状低級アルキル、線状置換低級アルキル、環状置換低級アルキル、ポリエチレンオキシド、１個と８個との間の炭素原子を有する低級アリール、ペプチドおよびポリエーテルからなる群より選択される、スペーサーアームであり；
Ｙは、アミド、スルホンアミド、尿素、ウレタンおよびチオ尿素からなる群より選択される、結合であり；
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；そして
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、ＹおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位のうち１つで染料Ｄに結合した結合を介して、連結されている、
化合物。
（項目３）次式を有するホスホロアミダイト化合物であって：
【化１０１】
ここで：
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２、およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｂ５は、トリフェニルメチルラジカル、トリフェニルメチルラジカルの電子供与性置換誘導体、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、モノメトキシトリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチルおよびトリ（ｐ−メトキシフェニルメチル）からなる群より選択される、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり、この電子供与性置換基は、アミノ、低級アルキル、１個と８個との間の炭素原子を有する低級アリール、低級アルコキシおよびメトキシからなる群より選択され；
Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そして
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合しており；
ここで、ＢおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位置のうち１つでＤに結合した結合により、連結されており；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この結合は、このプリンの８−位にて結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この結合は、このピリミジンの５−位にて結合している、
化合物。
（項目４）次式を有する化合物であって：
【化１０２】
ここで：
Ｒ３は、フッ素、塩素、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され；
Ｒ４〜Ｒ７は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され、この連結基は、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、活性カルボキシレート、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドおよび活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからなる群より選択され；そして
Ｙ２は、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択され、
ただし、Ｙ２がヒドロキシルである場合、Ｒ３はアミドではない、
化合物。
（項目５）次式を有する標識ヌクレオチドであって：
【化１０３】
ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｗ３は、ＯＨ、
【化１０４】
からなる群から選択され；
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合しており；
ここで、ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合しており；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この結合は、このピリミジンの５−位に結合している、
標識ヌクレオチド。
（項目６）次式を有するヌクレオチドを含有する標識ポリヌクレオチドであって：
【化１０５】
ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｚ１は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結され、このホスホジエステル結合は、Ｎｕｃの５’−位に結合しており；
Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結され、このホスホジエステル結合は、Ｎｕｃの３’−位に結合しており；そして
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合しており；
ここで、ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合しており；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、このＢおよびＤを連結している結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、このＢおよびＤを連結している結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、このＢおよびＤを連結している結合は、このピリミジンの５−位に結合している、標識ポリヌクレオチド。
（項目７）ポリヌクレオチド配列決定方法であって：
第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を以下：
この第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識されており；
この第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標識されており；
この第３のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染料で標識されており；そして
この第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、第４染料で標識されており；
ここで、この第１染料、この第２染料、この第３染料、またはこの第４染料のうちの１種は、項目１に記載の非対称ベンゾキサンテン染料であり；
この染料の他のものは、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから、分光的に分解可能である、
ように形成する工程；
このポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それにより、同様にサイズ分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；
このバンドを、この染料が蛍光を発するのを引き起こすことができる照射ビームで照射する工程；ならびに
このバンド中のこのポリヌクレオチドのクラスを、この染料の蛍光スペクトルにより同定する工程、
を包含する方法。
（項目８）以下を包含する、フラグメント解析方法：
標識ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、このフラグメントが、項目１に記載の染料化合物で標識されている、工程；
この標識ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；および
この分離プロセスに引き続いて、この標識ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。
【発明の効果】
【００８６】
本発明により、蛍光染料として有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、長波長標識（すなわち、５５０ｎｍを超えると発光する標識）として以前に使用されている種々の蛍光染料の構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の好ましい合成を描写する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の好ましい合成を描写する。
【図３】図３は、本発明の染料で標識化したオリゴヌクレオチドの好ましい合成を示す。
【図４】図４は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの励起スペクトルを示す。
【図５】図５は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの量子収量の比較を示す。
【図６】図６は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの等モル発光強度の比較を示す。
【図７】図７は、４プレックス（ｐｌｅｘ）のセットの染料標識化ＤＮＡ配列決定プライマーのメンバーの蛍光発光スペクトルを示す。
【図８】図８は、本発明の２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン中間体の合成を示す。
【図９】図９は、本発明の染料化合物で標識化したオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを使用したＤＮＡ配列決定実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の染料化合物で標識化したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用したマイクロサテライト分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の合成の４個の好ましい合成経路を示す。
【図１２】図１２は、本発明の１−置換３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成の３個の好ましい合成経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
（発明の要旨）
本発明は、蛍光染料として有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料を本発明者が発見したことに関する。
本発明の染料は、特に、多色蛍光ベースのＤＮＡ配列決定の領域において、複数の空間的に重複した分析物の同時検出に使用する現在利用可能な染料よりも、少なくとも７個の重要な利点を提供する。第１に、本発明の染料は、所望のスペクトル特性を有する現在利用可能な染料よりも、ＤＮＡ合成条件に対して、ずっと安定である。このＤＮＡ合成条件に対する高い安定性により、自動化ＤＮＡ合成技術（例えば、標識化ＰＣＲプライマー、ＤＮＡ配列決定プライマーおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ）を用いて、標識化オリゴヌクレオチド試薬をずっと容易に調製することが可能となる。第２に、本発明の染料は、約５５０ｎｍを超える波長範囲で以前に使用されているフルオレセインベースの染料よりも、著しく光安定性である。第３に、本発明の染料は、青い「肩部」のある吸収スペクトルを有し、それにより、ジベンゾキサンテン染料またはローダミンベースの染料よりも短い波長で、この染料のより効率的な励起が可能となる。第４に、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料は、分光的に類似のローダミンベースの染料よりも著しく高い量子収量を有する。第５に、本発明の染料の高い量子収量と相まって、典型的な光源による高い励起効率により、この染料は、所望のスペクトル特性を有する現在利用可能な染料よりも、著しく明るくなる。ＤＮＡ配列決定用途（この場合、分析物の量は、電気泳動負荷因子により制限され、その全蛍光は、数百の空間的に分離された種に分配されている）の状況では、明度は、特に重要である。本明細書中で使用する「明度」とは、最終的な蛍光発光強度に対する、吸光係数および蛍光量子収量を合わせた効果を意味する。この蛍光標識の明度を高くすることにより、より大きく数の少ないフラグメントが容易に検出でき、この電気泳動に充填する必要がある試料が少なくなり、それにより、優れた電気泳動解像度が得られる。さらに、これらの分析物の高い明度は、高い信号：ノイズ比に寄与し、空間的かつ分光的に近接した種の改良された解析を生じる。第６に、本発明の染料の非対称性により、この染料の置換基Ｒ１〜Ｒ９、特に、そのレゾルシノール誘導部分の置換基Ｒ１〜Ｒ３を変えることにより、これらの染料の発光スペクトルの調整が可能となる。対称ベンゾキサンテン化合物では、１個の等価の置換基位置だけが利用可能であり、それにより、この染料のスペクトル調整に利用できる自由度が大きく制限される。第７に、本発明の染料は、安定なホスホロアミダイト誘導体に容易に転化され、これは、標識化オリゴヌクレオチドの自動化化学合成に使用できる。
【００８９】
本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および利点は、以下の記載、図面、および添付の請求の範囲を参照すると、よく理解される。
（好適な実施形態の詳細な説明）
本発明のある好ましい実施形態を、ここで、詳細に言及する。本発明は、その好ましい実施形態に関連して記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施形態に限定する意図はないことが分かる。逆に、本発明は、添付の請求の範囲で規定した本発明の範囲内に含まれ得る代替、改良および等価物を含むことを意図している。
【００９０】
一般に、本発明は、蛍光染料として有用な新規なクラスの非対称ベンゾキサンテン化合物、このような染料を合成するための方法および中間体、このような染料を分子標識として使用する試薬、およびこのような染料および試薬を分析生物工学の領域で使用する方法を包含する。本発明の化合物は、多色蛍光ＤＮＡ配列決定およびフラグメント解析の領域で、特に用途が見出されている。
【００９１】
（Ｉ．非対称ベンゾキサンテン染料化合物）
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラスの非対称ベンゾキサンテン染料化合物を包含する。（本明細書中で提供した全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造およびプロトン付加状態を含むことを意図している）。
【００９２】
【化２８】
式１
式Ｉでは、Ｙ１およびＹ２は、独立して、ヒドロキシル、酸素、アミンまたはイミニウムである。Ｙ１がヒドロキシルであり、そしてＹ２が酸素のとき、この化合物は、フルオレセインに類似しており、これに対して、Ｙ１がアミンであり、そしてＹ２がイミニウムのとき、この化合物は、ローダミンに類似している。好ましくは、Ｙ１は、ヒドロキシルであり、そしてＹ２は、酸素である。
【００９３】
Ｒ１〜Ｒ９部分は、この分子の基底状態および励起状態の電子構造を変えることにより、この染料の種々の特性を調節するのに使用される置換基である。特に、Ｒ１〜Ｒ９部分を変えることは、この化合物のスペクトル特性、化学的安定性および光安定性に影響を与える。置換基Ｒ１〜Ｒ３およびＲ９は、式Ｉの化合物の特性を規定する際に、特に重要である。例えば、Ｒ１〜Ｒ３位の１つにフッ素原子を配置すると、化学的安定性および光安定性が高まること、およびＲ９が置換フェニルなら、置換基Ｘ２およびＸ５を塩素にすることにより、より狭い発光バンドが生じることが観察されている。（置換基Ｘ２およびＸ５の定義については、以下を参照）。
【００９４】
好ましくは、置換基Ｒ１〜Ｒ８は、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、アリール、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組合せであり、本明細書中で使用する「連結基」との用語は、試薬に結合した「相補官能性」と反応できる官能性を意味し、このような反応は、この染料をこの試薬に連結する「結合」を形成する。本開示の次の節では、特定の連結基、相補官能性および結合について、さらに詳しく述べる。好ましくは、Ｒ１は、低級アルコキシ、塩素、フッ素または水素である；Ｒ２は、低級アルキル、フッ素または塩素である；そしてＲ３は、低級アルキルまたはフッ素である。より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個は、フッ素である。特に好ましい実施形態では、少なくともＲ３は、フッ素である。
【００９５】
本明細書中で使用する「低級アルキル」との用語は、１個〜８個の炭素原子を含有する直鎖および分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなど）を表わす。「低級置換アルキル」とは、電子吸引性置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホなど）を含む低級アルキルを表わす。「低級ハロアルキル」とは、１個またはそれ以上のハロゲン原子置換基（通常、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）を有する低級置換アルキルを表わす。「低級アルケン」とは、１個〜８個の炭素原子を含有する炭化水素であって、ここで、その炭素−炭素結合の１個またはそれ以上が二重結合であり、ここで、その非二重結合炭素が、低級アルキルまたは低級置換アルキルを包含するものを表わす。「低級アルキン」とは、１個〜８個の炭素原子を含有する炭化水素であって、ここで、１個またはそれ以上の炭素が三重結合で結合しており、ここで、その非三重結合炭素が、低級アルキルまたは低級置換アルキルを包含するものを表わす。「スルホネート」とは、３個の酸素原子に結合したイオウ原子を含有する部分を意味し、これには、それらのモノ塩およびジ塩が含まれる（例えば、スルホン酸ナトリウム、スルホン酸カリウム、スルホン酸二ナトリウムなど）。「アミノ」とは、２個の水素原子、低級アルキル部分またはそれらの任意の組合せに結合した窒素原子を含有する部分を意味する。「アミド」とは、酸素原子に二重結合しアミノ部分に単結合した炭素原子を含有する部分を意味する。「ニトリル」とは、窒素原子に三重結合した炭素原子を含有する部分を意味する。「低級アルコキシ」とは、酸素原子に単結合した低級アルキルを含有する部分を意味する。「アリール」とは、単一または複数のフェニルまたは置換フェニル（例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなど）を意味する。
【００９６】
好ましくは、Ｒ９は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニルまたは置換フェニル、複素環式芳香族、またはそれらの組合せであり、この置換フェニルは、以下の構造を有する：
【００９７】
【化２９】
ここで、Ｘ１〜Ｘ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨまたは連結基である。本明細書中で使用する「複素環式芳香族」との用語は、その環式構造の一部としてヘテロ原子を有する芳香族部分（例えば、ピロール、フラン、インドールなど）を意味する。好ましくは、Ｘ１は、カルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ２ＯＨである；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素または低級アルキルである；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸または連結基である。より好ましくは、Ｘ２およびＸ５は、塩素である。さらに別の好ましい実施形態では、Ｘ３またはＸ４の１個は、連結基である。好ましくは、Ｘ１は、カルボン酸である。本発明の染料化合物を含むホスホロアミダイト化合物を形成するのに特に適切なさらに別の好ましい実施形態では、Ｘ１またはＸ５の１個は、環状エステルまたは環状エーテルを形成できる部分（例えば、カルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ２ＯＨ）、またはスピロ環系（すなわち、両方の環に共通の１個の炭素原子を有する二環式化合物、例えば、スピロ［４，５］デカン）を形成するいずれかの他の基である。
【００９８】
好ましくは、本発明の連結基は、その相補官能性がアミンであるときは、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、または他の活性カルボキシレートである。好ましくは、この連結基は、その相補官能性がスルフヒドリルであるときは、マレイミド、ハロアセチルまたはヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照せよ。特に好ましい実施形態では、この連結基は、アミン相補官能性と反応する活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、ここで、この活性化ＮＨＳエステルを形成するには、カルボキシレート連結基を含む本発明の染料は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳエステルを形成する。図３を参照せよ。
【００９９】
本発明の非対称ベンゾキサンテン染料化合物を合成するには、いくつかの可能な一般化した方法が使用でき、その４つは、図１１を参照して、本明細書中で記述する。図１１で経路Ａとして表わされる第一の好ましい方法では、化合物２７は、酸触媒および熱の存在下にて、１，３−ジヒドロキシまたは１，３−アミノヒドロキシベンゼン誘導体２８および１，３−ジヒドロキシまたは１，３−アミノヒドロキシナフタレン誘導体２９と、それぞれ同じ当量を使用して反応させ、非対称染料化合物３０が得られる。好ましくは、化合物２７は、環状または直鎖無水物（例えば、ＬＶＧは、ＯＣＯＲ９である）；エステル（例えば、ＬＶＧは、ＯＲであり、ここで、Ｒは、低級アルキル、フェニルまたはスルホネートである）；または酸塩化物（例えば、ＬＶＧは、塩素または他のハロゲンである）である。
【０１００】
図１１で経路Ｂとして表わされる別の好ましい合成方法では、化合物２７は、２当量の１，３−ジヒドロキシベンゼン誘導体（すなわち、Ｙ１は、ヒドロキシである）または１，３−アミノヒドロキシベンゼン誘導体（すなわち、Ｙ１は、アミノである）２８と反応させて、対称キサンテン染料３１が得られる。化合物３１は、次いで、塩基加水分解により分解されて、中間体ベンゾイル縮合生成物３２が形成される。縮合生成物３２は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて、化合物２９と反応させて、非対称染料３０が得られ、ここで、２９は、Ｙ２がヒドロキシのとき、１，３−ジヒドロキシナフタレンであり、またはＹ２がアミノのとき、１，３−アミノヒドロキシナフタレンである。
【０１０１】
さらに、図１１の経路Ｃとして表わされる第三の一般化した合成方法では、化合物２７は、熱と共に、１当量の２８と反応させ、中間体ベンゾイル縮合生成物３２が得られる。化合物３２は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて、２９と反応させ、非対称染料３０が得られる。
【０１０２】
図１１で経路Ｄとして表わされる第四の一般化した方法では、酸触媒および熱の存在下にて、同じ当量の化合物３３、化合物２８および化合物２９を反応させ、非対称キサントン中間体３４が得られる。好ましくは、３３は、カーボネート（例えば、ＬＶＧは、ＯＲであり、ここで、Ｒは、好ましくは、低級アルキルまたはフェニルである）；またはホルメート（例えば、ＬＶＧは、ハロゲンおよびＯＲであり、ここで、Ｒは、好ましくは、低級アルキルまたはフェニルである）である。化合物３４は、次いで、アニオン性有機金属Ｒ９誘導体（例えば、Ｒ９Ｌｉ、Ｒ９ＭｇＸであり、ここで、Ｘは、ハライド（例えば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）などである）と反応させ、非対称染料３０が得られる。
【０１０３】
図２Ａおよび２Ｂは、本発明の特に好ましい非対称染料化合物の一組の合成を示す。この合成では、１，３−ジヒドロキシナフタレン誘導体（例えば、１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ｂ）または２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ））は、１当量の無水フタル酸誘導体（例えば、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（１０ａ））および１当量のレゾルシノール誘導体（１１ａ、１１ｂ、１１ｃまたは１１ｄ）と反応させ、そしてアルゴン下にて、正味の有機酸（例えば、ＭｅＳＯ３Ｈ）中で１６時間加熱される。この粗染料は、次いで、氷／水混合物への添加により沈殿され、そして濾過により単離される。この粗染料は、次いで、分取薄層クロマトグラフィーにより、異性体１および２にさらに精製される。
【０１０４】
この非対称ベンゾキサンテン染料の非置換誘導体（Ｒ２および／またはＲ３は、Ｈである）は、ハロゲン化試薬（例えば、市販の陽性フッ素（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｉｎｅ）源、ＮａＯＣｌ、ＮａＯＨ／Ｂｒ２、ＮａＯＨ／Ｉ２）とさらに反応させて、１０％ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃでの抽出仕上げ、Ｎａ２ＳＯ４での乾燥、濾過および真空中での濃縮後に、定量的にハロゲン化した誘導体（例えば、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦである）を生成し得る。図２Ｂ中の挿入図を参照のこと。
【０１０５】
（ＩＩ．置換ナフタレン中間体）
第二の局面では、本発明は、主題発明の非対称ベンゾキサンテン化合物の合成に有用な新規な中間体化合物を包含し、このような中間体は、すぐ下の式ＩＩに示す一般構造を有する。特に、本発明の中間体化合物は、２−置換非対称ベンゾキサンテン化合物の２位にて、置換基（例えば、ハロゲン原子）の位置選択的含入を伴う非対称ベンゾキサンテン化合物の合成を可能にし、この場合、この２位は、式Ｉおよび式ＩＩの化合物では、Ｒ３位置に対応する。
【０１０６】
【化３０】
式ＩＩ
式ＩＩの構造において、置換基Ｒ３〜Ｒ７は、上記式Ｉの構造において、同じ番号を付けた置換基に対応し、そしてＹ２は、ヒドロキシルまたはアミンである。好ましくは、Ｒ３は、フッ素であり、そしてＹ２は、ヒドロキシルである。
【０１０７】
図１２は、本発明の置換ナフタレン中間体の合成について、３つの別の一般化した合成スキームを示す。図１２で経路Ａとして示す第一の方法では、置換エステルエノレート誘導体３５は、例えば、ＣＯ２の自発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、活性化ホモフタル酸エステル誘導体３６と反応させて、β−ケトエステル誘導体３７が得られる。好ましくは、化合物３５では、Ｒ’は、水素、カルボキシレートまたはハロゲンであり、そしてＲは、低級アルキルである。好ましくは、化合物３６では、ＬＶＧは、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フェノキシド、ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはカルボキシレートである。化合物３７は、次いで、塩基触媒および熱の存在下にて環化されて、置換１，３−ナフタレンジオール３８（すなわち、Ｙ２は、ＯＨである）が得られる。
【０１０８】
図１２にて経路Ｂとして示す第二の好ましい合成方法では、化合物３５は、例えば、ＣＯ２の自発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、活性化フェニルアセテート誘導体３９（ここで、ＬＶＧは、経路Ａにおいて、化合物３６について上で記述のものと同じである）と反応させて、β−ケトエステル誘導体４０が得られる。化合物４０は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて環化されて、置換１，３−ナフタレンジオール３８（すなわち、Ｙ２は、ＯＨである）が得られる。
【０１０９】
経路Ｃとして示す第三の好ましい合成方法では、化合物３５は、例えば、ＣＯ２の自発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、シアノフェニルアセテート誘導体４１（ここで、ＬＶＧは、経路Ａにおいて、化合物３６について上で記述のものと同じである）と反応させて、β−ケトエステル誘導体４２が得られる。化合物４２は、次いで、塩基触媒および熱の存在下にて環化されて、置換１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン３８（すなわち、Ｙ２は、ＮＨ２である）が得られる。
【０１１０】
（ＩＩＩ．染料化合物を使用する試薬）
他の局面では、本発明は、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン染料化合物で標識した試薬を包含する。本発明の試薬は、事実上、本発明の染料が結合できるいずれのものでもよい。好ましくは、この染料は、この試薬に共有結合される。試薬には、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機重合体、およびそれらの組合せおよび集合（例えば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌、他の微生物、哺乳類細胞、組織）など）が挙げられる。
【０１１１】
（Ａ．ヌクレオチド試薬）
本発明の好ましい種類の試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を含有するヌクレオチドおよびヌクレオシドを包含する。このようなヌクレオシド試薬は、酵素合成により形成した標識ポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ増幅、サンガー型ポリヌクレオチド配列決定およびニック翻訳反応の文脈で使用されるヌクレオチド三リン酸）の文脈で、特に有用である。
【０１１２】
本明細書中で使用する「ヌクレオシド」とは、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２）に記述のように、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシル形態を含めて、その１’位でペントースに結合したプリン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物を意味する。本明細書中で使用する「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）を意味し、ここで、最も一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位に結合した水酸基である。ヌクレオシドに関する「アナログ」には、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）により一般的に記述のように、変性塩基部位および／または変性糖部位を有する合成ヌクレオシドが挙げられる。「標識ヌクレオシド」との用語は、結合を介して式Ｉの染料化合物に共有結合したヌクレオシドを意味する。
【０１１３】
本発明の好ましいヌクレオチドは、式ＩＩＩで以下に示されており、ここで、Ｂは、ヌクレオチド塩基（例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシン）である。
【０１１４】
【化３１】
式ＩＩＩ
Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨまたはＯＨである。Ｗ３は、ＯＨ、
【０１１５】
【化３２】
であり、これには、もし存在するなら、会合対イオン（例えば、Ｈ、Ｎａ、ＮＨ４など）が含まれる。Ｄは、式Ｉの染料化合物である。特に好ましい１実施形態では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＩＩ．１に示した構造を有するジデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオンを含めて）。
【０１１６】
【化３３】
式ＩＩＩ．１
式ＩＩＩ．１に示したもののような標識ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型ＤＮＡ配列決定法において、鎖停止剤として、特定の用途が見出されている。第二の特に好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＩＩ．２に示した構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオンを含めて）。
【０１１７】
【化３４】
式ＩＩＩ．２
式ＩＩＩ．２に示したもののような標識デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応において、ポリメラーゼ伸長産物を標識する手段として、特定の用途が見出されている。
【０１１８】
Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、プリンまたはデアザプリンのＮ９−位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、ピリミジンのＮ１−位にて結合している。
【０１１９】
ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ９位の１つで、Ｄに結合している。好ましくは、この結合は、Ｒ１〜Ｒ３では結合していない。本発明の染料が、無水トリメリト酸から合成されるなら、Ｒ９は、好ましくは、置換フェニルであり、この結合は、この置換フェニルのＸ３またはＸ４位の１つで、この染料に結合しており、他の位置は、水素原子である。
【０１２０】
Ｂがプリンのとき、ＢおよびＤを結合している結合は、プリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、結合は、７−デアザプリンの７−位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、結合は、ピリミジンの５−位にて結合している。
【０１２１】
ヌクレオシド標識化は、公知の結合、連結基および関連する相補官能性を用いて、非常に多くの公知のヌクレオシド標識化技術のいずれかを使用して、達成できる。この染料およびヌクレオシドを結合する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せず、（ｉｉｉ）適切な酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と相溶性であり、そして（ｉｖ）この染料の蛍光を消失させてはならない。
【０１２２】
好ましくは、この染料は、ピリミジン塩基の５−炭素および７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合される。本発明で使用できる数個の適当な塩基標識化操作が報告されている（例えば、
【０１２３】
【表１】
従って、これらの参考文献の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１２４】
好ましくは、この結合は、アセチレン性アミド結合またはアルケン性アミド結合であり、この染料とヌクレオチド塩基との間の結合は、この染料の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと、ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルケニルアミノ誘導体化塩基とを反応させることにより、形成される。より好ましくは、得られた結合は、３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノ−１−プロピン−１−イルである（式ＩＩＩ．３）。本発明の染料をヌクレオシド塩基に結合するための数個の好ましい結合は、式ＩＩＩ．３、式ＩＩＩ．４および式ＩＩＩ．５にて、以下に示す。
【０１２５】
【化３５】
アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、Ｈｏｂｂｓら、ヨーロッパ特許出願第８７３０５８４４．０号およびＨｏｂｂｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４：３４２０（１９８９）に教示され、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。要約すると、このアルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常、Ｈｏｂｂｓら（前出）により教示されるように、５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、アルゴンをフラッシュして空気を取り除き、無水ＤＭＦを添加し、続いて、アルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（０）を添加することにより、形成される。この反応混合物は、数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌し得る。未保護のアルキニルアミンを使用するとき、このアルキニルアミノヌクレオシドは、この反応混合物を濃縮し、そして水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、カップリング反応で生成したヒドロハライドを中和することにより、単離できる。保護アルキニルアミンを使用するとき、この反応混合物には、メタノール／塩化メチレンを添加し得、続いて、重炭酸塩形態の強塩基性アニオン交換樹脂を添加し得る。次いで、このスラリーは、約４５分間撹拌し得、濾過し得、樹脂は、追加のメタノール／塩化メチレンで洗浄し得る。合わせた濾液は濃縮し得、そしてメタノール−塩化メチレン勾配を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。トリホスフェートは、標準的な方法により得られる。
【０１２６】
（Ｂ．ホスホロアミダイト試薬）
他の好ましい種類の試薬には、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を含有するホスホロアミダイト化合物が包含される。このようなホスホロアミダイト試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料で標識したポリヌクレオチドの自動化化学合成に、特に有用である。このようなホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの５’−水酸基と反応させたとき、亜リン酸エステルリンカーを形成し、これは、次に、酸化されて、リン酸エステルリンカーが得られる（例えば、米国特許第４，４５８，０６６号および第４，４１５，７３２号；両特許は、本明細書中で参考として援用されている）。
【０１２７】
（１．非ヌクレオチドホスホロアミダイト試薬）：一般に、１局面では、本発明のホスホロアミダイト試薬は、すぐ下の式ＩＶの構造を有する：
【０１２８】
【化３６】
式ＩＶ
ここで、Ｘは、スペーサーアームである；Ｄは、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン染料またはそれらの保護誘導体である；Ｙは、この染料上の連結基を用いて形成した結合である；Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり、そしてＢ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アラルキル、または１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルである。式ＩＶで示した非ヌクレオチドホスホロアミダイトは、ヌクレオチドの糖部分を介して、化学的に合成したポリヌクレオチドの５’−末端を標識するのに、特によく適合する。
【０１２９】
スペーサーＸおよび結合Ｙは、種々の形態をとり得るが、しかしながら、構造Ｘ−Ｙは、（ｉ）ＤＮＡ合成条件に対して安定であり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せず、そして（ｉｉｉ）それが結合する染料の蛍光を消失させてはならない（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号、第５，２５８，５３８号、および第４，７５７，１４１号、第５，２１２，３０４号；全ての特許は、本明細書中で参考として援用されている）。
【０１３０】
好ましくは、Ｘは、線状または環状の低級アルキル、線状または環状の置換低級アルキル、ポリエチレンオキシド、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、ペプチド、またはポリエーテルである。好ましくは、結合Ｙは、アミド、スルホンアミド、尿素、ウレタンまたはチオ尿素である。特に好ましい実施形態では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸは、式ＩＶ．１の以下の構造を有する線状アルキルである：
【０１３１】
【化３７】
式ＩＶ．１
ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より好ましくは、２〜６である。第二の特に好ましい実施形態では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸは、式ＩＶ．２で以下に示す構造を有する線状ポリエチレンオキシドである：
【０１３２】
【化３８】
式ＩＶ．２
ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より好ましくは、２〜６である。
【０１３３】
好ましくは、Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、その主鎖に５個までの炭素原子および全体で１０個までの炭素原子を含有するアルキル鎖を形成し、この鎖の両方の末端原子価結合は、窒素原子に結合されている。他方、Ｂ２およびＢ３は、窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し、これは、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択した１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する。好ましくは、Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルであり、そしてＢ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノである。
【０１３４】
Ｂ１は、ホスホロアミダイトが結合したポリヌクレオチドの不要な伸長を防止する亜リン酸エステル保護基である。Ｂ１は、ポリヌクレオチド合成条件に対して安定であるが、このポリヌクレオチドまたは染料の完全性に悪影響を及ぼさない試薬を用いて、このポリヌクレオチド生成物から除去できる。好ましくは、Ｂ１は、メチル、β−シアノエチルまたは４−ニトロフェニルエチルである。Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルであり、そしてＢ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノである。
【０１３５】
ＹおよびＤを結合する結合は、Ｒ１〜Ｒ９位の１つで、Ｄに結合している。好ましくは、この結合は、Ｒ１〜Ｒ３では結合していない。本発明の染料が、無水トリメリト酸から合成されるとき、Ｒ９は、好ましくは、置換フェニルであり、そして結合は、この置換フェニルのＸ３またはＸ４位の１つで、この染料に結合している。
【０１３６】
このようなホスホロアミダイト化合物は、公知の方法により合成できる。一般に、合成は、以下のように進行する。この染料のフェノール性ヒドロキシルは、ＤＮＡ合成脱保護剤（例えば、アンモニア、エタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：２：１）混合物）で除去できる染料保護基で保護される（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号を参照せよ；その内容は、本明細書中で参考として援用されている）。そのように保護した染料は、この染料の「保護誘導体」と呼ばれる。好ましい保護基には、安息香酸またはピバル酸のエステルが挙げられる。この保護染料の連結基（例えば、カルボン酸）は、次いで、例えば、カルボジイミドで活性化され、そしてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または他の非プロトン性溶媒中にて、アルコールリンカー誘導体（例えば、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン、ヘキサノールアミンなど））と反応させて、遊離アルコール官能性（例えば、アルコール−アミド誘導体）を有する保護染料が生じる。この遊離アルコールは、次いで、触媒量のテトラゾールジイソプロピルアミンを含有するアセトニトリル中にて、標準操作を用いて、ホスフィチル化剤（例えば、ジ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン）と反応させて、ホスホロアミダイトが生じる（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号）。
【０１３７】
（２．ヌクレオチドホスホルアミダイト試薬）：一般に、第二の局面では、本発明のホスホルアミダイト剤は、すぐ下の式Ｖの構造を有する：
【０１３８】
【化３９】
式Ｖ
ここで、Ｂ１〜Ｂ３は、上で記述のものと同じである。Ｂ５は、水素またはヒドロキシル保護基であり、Ｂは、ヌクレオチド塩基であり、そしてＤは、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン染料またはそれらの保護誘導体である。式Ｖのようなヌクレオチドホスホルアミダイトは、化学的に合成したポリヌクレオチドの内部標識化に特によく適合する。
【０１３９】
Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位にて結合している。他方、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位にて結合している。ＢおよびＤは、連結基およびその相補官能性の反応により形成した結合により結合されており、染料とヌクレオチド塩基との間のこのような結合は、上で詳細に記述されている。Ｂがプリンなら、その結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンなら、その結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合している。Ｂがピリミジンなら、その結合は、このピリミジンの５−位にて結合している。
【０１４０】
Ｂ５は、一般に、水素または酸切断可能なヒドロキシル保護基を表わす。好ましくは、Ｂ５は、トリフェニルメチルラジカルおよびその電子供与性置換した誘導体であり、この場合、本明細書中で使用する「電子供与性」との用語は、それが一部をなす分子内において、近接原子に原子価電子を放出するという置換基の傾向を表わし、すなわち、それは、近接原子に関して、電子的に正である。好ましくは、電子供与性置換基には、アミノ、低級アルキル、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、低級アルコキシなどが挙げられる。さらに好ましくは、この電子供与性置換基は、メトキシである。代表的なトリチルには、４，４’−ジメトキシトリチル、すなわち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチルなどが挙げられる。これらのトリチルおよび他のトリチルの結合条件および切断条件は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）に見出される。
【０１４１】
一般に、本発明のヌクレオチドホスホルアミダイトは、以下のようにして合成できる。その５’−ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基およびその塩基上に保護相補的官能性を有するヌクレオシドは、この相補的官能性だけを暴露するように、選択的に脱保護される。次に、（上記のようにして）保護した染料は、連結基をその反応形状に転化することにより、活性化される。この染料の活性化連結基は、次いで、このヌクレオシドの相補的官能性と反応されて、この染料の５’−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する染料標識ヌクレオシドが形成される。この染料標識ヌクレオシドは、次いで、上記のホスフィチル化剤と反応されて、このヌクレオチドホスホルアミダイトが生成される。
【０１４２】
その相補的官能性がアミンでありかつ連結基がカルボキシルである好ましい方法では、この合成は、以下のようにして進行する。その５’−ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基（例えば、トリチル基）を有し、その塩基上に保護アミノ−窒素相補的官能性を有する保護ヌクレオシドは、そのアミンを暴露するように選択的に脱保護され、このような選択的脱保護は、その保護５’−ヒドロキシル部分を脱保護することなく、そのアミノ官能性のみを脱保護するように供される。（上記のように）保護した染料は、カルボキシ連結基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、そのＮＨＳエステルに転化することにより、活性化される。このＮＨＳエステルは、このヌクレオシドのアミノ基と反応されて、この染料の５’−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する染料標識ヌクレオシドが形成される。次いで、この染料標識ヌクレオシドは、上記のホスフィチル化剤と反応される。
【０１４３】
（Ｃ．ポリヌクレオチド試薬）
本発明のさらに他の好ましい種類の試薬には、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料で標識したポリヌクレオチドが包含される。このような標識ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブなどを含めた非常に多くの状況で、有用である。
【０１４４】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、天然または変性ヌクレオシドモノマーの線状ポリマーを意味し、これには、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形状などが含まれる。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合により連結されており、本明細書中で使用する用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合またはそれらのアナログを意味し、これには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホロアミデートなどが含まれ、これは、会合した対イオンが存在するなら、このような対イオン（Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）を含む。このポリヌクレオチドの大きさは、数個（例えば、８個〜４０個）のモノマー単位から、数千個のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような一連の文字で表わされるときは、常に、このヌクレオチドは、他に指示がなければ、５’→３’の順序で左から右に配列されており、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表わし、「Ｃ」は、デオキシシチジンを表わし、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表わし、そして「Ｔ」は、チミジンを表わすことが分かる。
【０１４５】
本発明の標識ポリヌクレオチドには、次式を有するヌクレオチドが挙げられる：
【０１４６】
【化４０】
式ＶＩ
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基である。Ｚ１は、ＨまたはＯＨである。Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４およびＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃは、ヌクレオシドまたはポリヌクレオチドを意味する。式ＶＩのヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホジエステル結合により連結され、この結合は、Ｎｕｃの５’−位に結合している。Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３またはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結されており、この結合は、Ｎｕｃの３’−位に結合している。そしてＤは、式Ｉの染料化合物である。塩基Ｂは、本発明のヌクレオチドホスホルアミダイト試薬について記述のようにして、この糖部分および染料化合物に結合される。ここで定義されるように、式ＶＩの標識ヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチド、３’−末端ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドのいずれかの内部ヌクレオチドであり得る。
【０１４７】
好ましい１実施形態では、本発明の標識ポリヌクレオチドには、供与体染料と受容体染料との間で、蛍光エネルギーの移動が起こるように配置した複数の染料が挙げられる。このような複数染料ポリヌクレオチドは、分光調整可能な配列決定プライマーとして（例えば、Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４３４７〜４３５１（１９９５））およびハイブリダイゼーションプローブとして（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：３７６１〜３７６６（１９９３））、用途が見出されている。
【０１４８】
標識ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを用いて、酵素的に合成するか（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２４、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８１））または例えば、ホスホルアミダイト法、亜リン酸トリエステル法などによる化学合成によるか（例えば、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））いずれかにより、合成できる。標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使用して、酵素合成中に導入してもよく、または上記の標識非ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホルアミダイトを用いて、化学合成中に導入してもよく、または合成に引き続いて導入してもよい。
【０１４９】
一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵素合成により製造されるなら、以下の操作が使用できる。テンプレートＤＮＡが変性され、このテンプレートＤＮＡに、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールされる。この反応系に、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含めて）が添加され、この場合、このデオキシヌクレオチドの１個の少なくとも断片は、上記の本発明の染料化合物で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下にて、ポリメラーゼ酵素は活性である。ポリメラーゼ鎖合成中に、この標識デオキシヌクレオチドの混入により、標識ポリヌクレオチドが形成される。別の酵素的合成法では、１個のプライマーの代わりに２個のプライマーが使用され、１個のプライマーは、この標的の＋（プラス）鎖に相補的であり、他は、この標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、このポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、その反応温度は、変性温度と延長温度の間で反復され、それにより、ＰＣＲによって、標識成分が標的配列へと急激に合成される（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））。
【０１５０】
標識ポリヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法を用いて、化学的に合成できる。このホスホルアミダイト法によりポリヌクレオチドを形成するのに使用される化学の詳細な説明は、例えば、
【０１５１】
【表２】
に提供されている。従って、これらの参考文献の各内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１５２】
ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その効率および急速なカップリングおよび出発物質の安定性のために、好ましい方法である。この合成は、固体支持体に結合した成長ポリヌクレオチド鎖を用いて行われ、その結果、過剰の試薬は、液相にあるので、濾過により容易に除去でき、それにより、サイクル間の精製工程の必要性がなくなる。
【０１５３】
以下は、このホスホルアミダイト法を用いる、典型的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記述する。まず、保護ヌクレオチドモノマーを含めた固体支持体は、酸（例えば、トリクロロ酢酸）で処理されて、５’−ヒドロキシル保護基が除去され、このヒドロキシルは、引き続くカップリング反応のために、遊離される。次いで、この反応系に、保護ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーおよび弱酸（例えば、テトラゾール）を同時に添加することにより、活性化中間体が形成される。この弱酸は、このホスホルアミダイトの窒素にプロトンを付加して、反応性中間体を形成する。ヌクレオシド付加は、３０秒以内に完結する。次に、ヌクレオシド付加を受けなかったいずれかのポリヌクレオチド鎖を停止するキャップ化工程が行なわれる。キャップ化は、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて行われる。このインターヌクレオチド結合は、次いで、好ましい酸化剤としてのヨウ化物および酸素供与体としての水を用いる酸化により、この亜リン酸エステルから、より安定なホスホジエステルに転化される。酸化後、このヒドロキシル保護基は、プロトン酸（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）で除去され、このサイクルは、鎖の延長が完結するまで、繰り返される。合成後、このポリヌクレオチド鎖は、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミン）を用いて、この支持体から切断される。この切断反応はまた、いずれのリン酸エステル保護基（例えば、シアノエチル）も除去する。最後に、この塩基の環外アミン上の保護基およびこの染料上のヒドロキシル保護基は、塩基中にて、このポリヌクレオチド溶液を高温（例えば、５５℃）で処理することにより、除去される。
【０１５４】
このホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーのいずれかは、上記の染料標識したホスホルアミダイトであり得る。このヌクレオチドの５’−末端位置が標識されているなら、この最終縮合工程中に、本発明の標識した非ヌクレオチドホスホルアミダイトを使用してもよい。このオリゴヌクレオチドの内部位置が標識されるなら、いずれかの縮合工程中に、本発明の標識ヌクレオチドホスホルアミダイトが使用できる。
【０１５５】
合成に引き続いて、このポリヌクレオチドは、非常に多くの位置で標識でき、これらの位置には、５’−末端（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｃｈａｐｔｅｒ ８、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）およびＯｒｇｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（１８）：６５１３（１９８３）；米国特許第５，１１８，８００号；これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている）；ホスホジエステル骨格（例えば、同書、Ｃｈａｐｔｅｒ ９）；３’−末端（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２５３−６２５９、および米国特許第５，４０１，８３７号および第５，１４１，８１３号；両方の特許の内容は、本明細書中で参考として援用されている）が含まれる。オリゴヌクレオチド標識化操作の総説については、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ ｉｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｓｔｅｉｎｅｒ編、Ｐｌｅｍｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８３）を参照のこと。
【０１５６】
１つの好ましい合成後化学標識化法では、オリゴヌクレオチドは、以下のようにして標識化される。カルボキシ連結基を含む染料は、無水酢酸エチル中にて、室温で３時間にわたり、およそ１当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびおよそ３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、そのｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転化される。この反応混合物は、５％ ＨＣｌで洗浄され、硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、そして固形物になるまで濃縮され、この固形物は、ＤＭＳＯに再懸濁される。このＤＭＳＯ染料ストックは、次いで、過剰で（１０〜２０倍）、ｐＨ ９．４にて、０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加され、そして６時間反応される（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。この染料標識したオリゴヌクレオチドは、緩衝液（例えば、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸塩（ＴＥＡＡ））で溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、未反応染料から分離される。この粗標識オリゴヌクレオチドを含有する画分は、勾配溶離液を使用する逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製される。
（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）
本発明の染料および試薬は、蛍光検出を使用するいずれかの方法（特に、複数の空間的に重複した分析物の同時検出を必要とする方法）によく適合される。本発明の染料および試薬は、生化学分離操作（例えば、電気泳動）を受けるポリヌクレオチドの種類を同定するのに、特によく適合され、この場合、類似の物理化学的特性（例えば、サイズ、コンホメーション、電荷、疎水性など）を有する標的物質のバンドまたはスポットが、線状または平面状の配列において存在する。ここで使用する「バンド」との用語は、類似のまたは同一の物理化学的な特性を基準にして、いずれかの空間的な配置または集塊を含む。通常、バンドは、染料−ポリヌクレオチド複合体の電気泳動による分離において、生じる。
【０１５７】
ポリヌクレオチドの分類は、種々の状況において生じ得る。「フラグメント解析」法または「遺伝解析」法と呼ぶ好ましいカテゴリーの方法では、標識プライマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート定方向酵素的合成（例えば、結合またはポリメラーゼ定方向プライマー伸長による）により、標識ポリヌクレオチド断片が生じる。これらの断片は、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）にかけられる。分離した断片は、この分離に引き続いて、例えば、レーザー誘発した蛍光により、検出される。特に好ましい実施形態では、複数の種類のポリヌクレオチドが同時に分離され、異なる種類のものは、分光学的に分析可能な標識により、識別される。
【０１５８】
このようなフラグメント解析の１方法は、増幅断片長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として知られているが、ＰＣＲにより増幅した増幅断片長の多型現象（すなわち、制限断片長の多型現象）に基づいている。種々のサイズのこれらの増幅断片は、系統による次の突然変異遺伝子のための連結マーカーとして役立つ。増幅断片が、染色体上の突然変異遺伝子に近づくほど、この結合の相関が高くなる。多く遺伝的疾患に対する遺伝子は、同定されていないので、これらの結合マーカーは、疾患のリスクまたは起源を評価するのに役立つ。このＡｍｐＦＬＰ方法では、このポリヌクレオチドは、標識ポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いることにより、またはＰＣＲ中の標識ヌクレオチド三リン酸を使用することにより、標識できる。
【０１５９】
ニック（ｎｉｃｋ）翻訳として知られているような他のフラグメント解析では、二本鎖ＤＮＡ分子内の未標識ヌクレオシド三リン酸を標識したものに置き換えるために、反応が使用される。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）処理により生じる「ニック」によって、未標識ＤＮＡ内に、遊離の３’−水酸基が作られる。ＤＮＡポリメラーゼＩは、次いで、このニックの３’−ヒドロキシル末端への標識ヌクレオチドの付加を触媒する。同時に、この酵素の５’−〜３’−エクソヌクレアーゼ活性は、このニックの５’−ホスホリル末端からこのヌクレオチド単位を取り除く。最初に切開したヌクレオチドの位置には、遊離の３’−ＯＨを有する新しいヌクレオチドが取り込まれ、このニックは、３’方向に沿って、１ヌクレオチド単位だけシフトする。この３’シフトの結果、既存の未標識ヌクレオチドの除去を伴って、新しく標識したヌクレオチドのＤＮＡへの連続付加が生じる。このニック翻訳したポリヌクレオチドは、次いで、分離プロセス（例えば、電気泳動）を用いて分析される。
【０１６０】
他の代表的なフラグメント解析法は、可変数のタンデム繰り返し、すなわち、ＶＮＴＲを基準にしている。ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接した複数コピーを含有する二本鎖ＤＮＡの領域であり、繰り返し単位の数は、可変である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例には、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８およびＡｐｏ Ｂがある。ＶＮＴＲ法のサブセットには、微小サテライト繰り返しまたは短タンデム繰り返し（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２個〜４個の塩基）繰り返し配列により特徴付けられるＤＮＡのタンデム繰り返しの検出を基準にしている。ヒトにて最も豊富に点在した繰り返しＤＮＡファミリーの１つには、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリー（これはまた、（ＣＡ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトのゲノムには、５０，０００個〜１００，０００個程度の（ＣＡ）ｎ繰り返し領域があると考えられ、典型的には、１ブロックあたり、１５個〜３０個の繰り返しを有する。これらの繰り返し領域の多くは、長さが多様であり、従って、有用な遺伝子マーカーとして供され得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法では、染料標識ＰＣＲプライマーを用いることにより、ポリヌクレオチド断片に標識が導入される。
【０１６１】
特に好ましいフラグメント解析法では、本発明に従って確認した種類のものは、４個の可能な末端塩基と分光学的に分析可能な染料のセットのメンバーとの間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチドによって規定される。このようなセットは、市販の分光光度計を用いて、発光および吸収バンド幅を測定することにより、本発明の染料から容易に組み立てられる。さらに好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖停止法の状況にて、種類が生じ、最も好ましくは、この鎖停止法、すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定またはサンガー配列決定の状況において、種類が生じる。この方法は、配列が決定されるべき一本鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートを用いた、インビボでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を包含する。合成は、このテンプレートにオリゴヌクレオチドプライマーがアニールする１個の部位だけで、開始される。この合成反応は、連続ＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチド類似物の含入により、停止される。この鎖停止ヌクレオチド類似物には、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）があり、これは、３’から５’へのＤＮＡ鎖の伸長に必要な３’−ＯＨ基がない。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸）および４個のｄｄＮＴＰの１個を使用すると、酵素触媒した重合は、このｄｄＮＴＰが含入できる各部位で、鎖集団の断片において、停止される。各反応に対して、標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰを使用するなら、この配列情報は、高分解能電気泳動による分離後、蛍光により検出できる。この鎖停止法では、本発明の染料は、配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合できる。染料は、例えば、Ｆｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）での教示に従って、このプライマーの５’末端にて；プライマーの塩基にて；または例えば、Ｈｏｂｂｓら、ヨーロッパ特許出願第８７３０５８４４．０号（その内容は上述され、本明細書中で参考として援用されている）に開示のアルキニルアミノ連結基を介して、ジデオキシヌクレオチドの塩基にて、相補的官能基と連結できる。
【０１６２】
上記フラグメント解析法のそれぞれでは、標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動操作により、分離される（例えば、
【０１６３】
【表３】
好ましくは、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜２０重量％の間の濃度（重量対容量）を有する架橋または非架橋ポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、このポリアクリルアミド濃度は、約４〜８重量％の間である。好ましくは、ＤＮＡ配列決定の状況では、特に、この電気泳動マトリックスは、鎖分離または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含有する。このようなマトリックスを構築する詳細な操作は、
【０１６４】
【表４】
により示されている。従って、これらの参考文献の内容は、本明細書中で参考として援用されている。特定の分離における最適なポリマー濃度、ｐＨ、温度、使用する変性剤の濃度などは、多くの要因に依存し、これらには、分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖か二本鎖か、およびその情報が電気泳動により追究される分類の性質が含まれる。従って、本発明の適用には、特定の分離のための条件を最適化する標準予備試験が必要な場合がある。例によれば、約２０個〜３００個の間の塩基範囲のサイズのオリゴヌクレオチドは、以下のマトリックスにおいて、本発明に従って分離され、そして検出される：１９部：１部のアクリルアミド：ビスアクリルアミドから製造した６％ポリアクリルアミドであって、ｐＨ ８．３のトリス−ボレートＥＤＴＡ緩衝液中で形成したもの。
【０１６５】
電気泳動分離に引き続いて、染料−ポリヌクレオチド複合体は、この染料標識ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することにより、検出される。このような検出を行うために、この標識ポリヌクレオチドは、標準的な手段、例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなどにより照射される。好ましくは、この照射手段は、４８８ｎｍと５５０ｎｍの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。さらに好ましくは、この染料−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー（特に、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍの発光系列のアルゴンイオンレーザー）、または５３２ｎｍの発光系列のネオジム固相ＹＡＧレーザーにより発生したレーザー光によって、照射される。いくつかのアルゴンイオンレーザーが市販されており、これらは、これらの系列で、同時にレーザーとして使える（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ、Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）のＭｏｄｅｌ ２００１など）。次いで、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電結合素子など）により、その蛍光が検出される。
【実施例】
【０１６６】
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確となるが、これらの実施例は、単に、本発明の例示であることを意図し、いずれの点でも、本発明の範囲を限定しない。
【０１６７】
他に指示がなければ、全てのケミカルは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手し、購入した状態で使用した。３−フルオロレゾルシノール（１１ａ）は、文献の操作（Ｐｅｒｋｉｎ、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：１６５８−１６６６ （１９８０））に従って、２，４−ジメトキシアニリンから合成した。２−クロロ−４−メトキシレゾルシノール（１１ｃ）は、米国特許第４，３１８，８４６号に従って、３−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒドから合成した。３，６−ジクロロトリメリト酸は、米国特許第４，３１８，８４６号に従って合成し、そして純粋な無水酢酸中で４時間還流してその冷却混合物をジエチルエーテルで沈殿させることにより、その無水物１０ａに転化した。フルオロマロン酸水素エチルは、文献（Ｏｒｇ． Ｓｙｎ． Ｃｏｌｌ． ４：４１７−４１９ （１９６３））に従って、フルオロマロン酸ジエチルから合成した。トリブチルホスホニウム−フルオロ酢酸エチル（１９）は、文献（Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３０：６１１３（１９８０））に従って、合成した。２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）は、本明細書開示に記述のようにして、合成した。乾燥ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、使用前に、水素化カルシウム上で蒸留し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）上で蒸留した。無水エタノールは、購入した状態で使用するか、またはナトリウム上の蒸留により乾燥し、そして活性化モレキュラーシーブ上で保存した。乾燥酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）は、ＭｇＳＯ４で予備乾燥した後、Ｐ２Ｏ５上で蒸留した。乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、硫酸マグネシウムで予備乾燥した後、蒸留し、そして活性化モレキュラーシーブ上で保存した。全ての反応は、乾燥アルゴン下にて、無水条件で行った。反応は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカゲル６０、Ａ２５４）によりモニターした。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（２００〜４００メッシュ、Ｂａｘｔｅｒ）上で行った。「１」および「２」で明示される純粋な異性体を得るための非対称ベンゾキサンテン染料の最終精製は、シリカゲル６０ ＰＴＬＣプレート（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上の予備ＴＬＣでＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（７：３：０．１）で溶出して行った。純粋な染料異性体は、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（７：３：０．１）を使用してＴＬＣ上に単一斑点を作り、そして短波長および長波長ＵＶ照射で視覚化することにより、同定した。異性体２は、通常媒体および逆層媒体の両方でより遅く処理した。中間体生成物は、Ｖａｒｉａｎ ３００ ＭＨｚ ＮＭＲによる１ＨＮＭＲスペクトルにより同定した。精製した染料の吸収スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５１Ａダイオードアレイ分光光度計で記録し、蛍光発光スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ ５０−Ｂ発光分光光度計で記録した。染料標識オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は、２チャンネルのＰＥ １０２２積分計に接続されたＰＥＬＣ ２４０蛍光検出器およびＰＥＬＣ ２９５ ＵＶ／ＶＩＳ検出器に接続されたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２００シリーズのポンプで行った。染料標識オリゴヌクレオチドの精製および同定に使用される緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）が挙げられる。緩衝液は、１０倍溶液として０℃で保存し、そして使用前に新しく希釈する。ＨＰＬＣ精製は、逆相ＲＰ−１８カラムを使用した。
【０１６８】
（実施例１）
（非対称ベンゾキサンテンの合成）
１，３−ジヒドロキシナフタレン誘導体（例えば、１，３−ジヒドロキシナフタレン９ｂまたは２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン９ａ）（０．２モル）と、１．１当量の無水フタル酸誘導体３，６−ジクロロトリメリト酸無水物１０ａおよび１当量のレゾルシノール誘導体１１（０．２モル）、（所望の最終生成物によって１１ａ、１１ｂ、１１ｃまたは１１ｄ）とを反応させることにより、図２Ａおよび２Ｂの化合物１〜７を合成し、そしてアルゴン下、１１０℃で、純粋なＭｅＳＯ３Ｈ（３ｍｌ）中１６時間加熱した。この粗染料（１０ａを使用する反応における位置（ｒｅｇｉｏ）異性体の混合物）を、氷／水混合物への添加により沈殿させ、そして濾過により単離した。この粗染料を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：酢酸（７０：３０：１）の混合物で溶出する調製薄層クロマトグラフィーにより、２種の異性体１および２に精製した。
【０１６９】
図２Ｂの差込図は、染料５の異性体２について示した非対称ベンゾキサンテン染料のＲ２および／またはＲ３が非置換の（Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ）誘導体が、さらに、ハロゲン化試薬（ＮａＯＣｌ、ＮａＯＨ／Ｂｒ２、ＮａＯＨ／Ｉ２）と０℃で３時間、反応し、続いて１０％ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃでの抽出処理、Ｎａ２ＳＯ４での乾燥、濾過および真空中での濃縮で、そのハロゲン化誘導体（例えば、８（Ｒ２＝Ｒ３＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ））を定量的に生成することを示している。
【０１７０】
（実施例２）
（染料標識オリゴヌクレオチドの合成）
本発明の染料標識オリゴヌクレオチドの合成を、図３を参照して記述する。Ｃｌ−ＦＬＡＮ、染料２を、乾燥酢酸エチル中にて、室温で３時間にわたって、１．２当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、そのｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１２に転化した。この反応混合物を５％ ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして固形物になるまで濃縮し、これを、ＤＭＳＯ中に再懸濁した（１０ｍｇの染料／５０μＬのＤＭＳＯ）。このＤＭＳＯ染料ストック（５〜１０μＬ）を、ｐＨ ９．４にて、０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中、アミノヘキシル誘導化−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドプライマー（１×１０−３Ｍ）に、過剰に（１０〜２０倍）添加し、そして６時間反応させた。アミノヘキシル誘導化プライマーは、最終サイクルにＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２を用いた自動固相ＤＮＡ合成により、調製した（ＰＥ ｐ／ｎ ４００８０８）。染料標識オリゴヌクレオチドは、０．１モルのトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）で溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通すことにより、未反応染料から分離した。粗標識オリゴヌクレオチドを含有するフラクションは、ＲＰ−１８クロマトグラフィーカラムを用い、２５分間かけて、０．１ Ｍ ＴＥＡＡ中８％〜２５％ ＡｃＣＮの勾配溶出を使用した逆相ＨＰＬＣにより、精製した。この純粋な染料標識オリゴヌクレオチド１３は、凍結乾燥で固形物にし、そして１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）に再懸濁した。この染料標識オリゴヌクレオチドの濃度は、添加物根絶係数（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）がＴに対して６，６５０、Ｃに対して７，３５０、Ｇに対して１１，７５０およびＡに対して１４，９００であると仮定して、２６０ｎｍでのＵＶ吸収により決定し、２６０ｎｍでの染料吸収の相対寄与を、同じ緩衝液中で測定した遊離染料のスペクトルから決定した。
【０１７１】
（実施例３）
（実施例２のＴＡＭＰＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの励起スペクトルの比較）
１×ＴＢＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で各染料について、励起スペクトルを記録した。染料は、等モル濃度（約１×１０−６Ｍ）で存在していた。各染料について、その発光強度を、λｍａｘＥｍで記録した。図４は、４８８ｎｍでの励起について、Ｃｌ−ＦＬＡＮの相対励起効率は、ＴＡＭＲＡ染料のそれのおよそ２．５倍であるのに対して、５１４ｎｍでの励起については、Ｃｌ−ＦＬＡＮの相対励起効率は、ＴＡＭＲＡ染料のそれのおよそ１．５倍であることを示している。
【０１７２】
（実施例４）
（実施例２のＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの量子収率の比較）
図５は、各染料の吸収最大で励起したＴＡＭＲＡ（２２）標識−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドおよびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドの蛍光発光強度の発光スペクトルを示す。オリゴヌクレオチドは実施例２中のように調製された。このデータは、ＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドと比較して、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドでは６０％より多い量子収率を示している。スペクトルは、各標識オリゴヌクレオチドについて、同じλｍａｘＡｂｓ（０．０５）となる濃度で、１×ＴＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で記録した。発光スペクトルは、各染料のλｍａｘＡｂｓでの照射により、各染料について記録した。
【０１７３】
（実施例５）
（Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）およびＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドのモル発光強度の比較）
１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解した等モル濃度（約１×１０−６Ｍ）のＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドおよびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの発光スペクトルを、各オリゴヌクレオチドを４８８ｎｍおよび５１４ｎｍで照射し、そしてこのスペクトルに付加することにより測定し、複数ラインのアルゴンレーザーの照射を概算した。図６は、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの蛍光強度が、ＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドの蛍光強度の２倍以上であることを明らかにしている。
【０１７４】
（実施例６）
（多重染料標識オリゴヌクレオチドセット）
Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチド−２１Ｍ１３配列プライマーの長波長蛍光発光を、６−ＦＡＭ、ＴＥＴおよびＨＥＸ ２３染料で標識した−２１Ｍ１３配列プライマーからの発光と比較した。ここで、６−ＦＡＭは、６−カルボキシフルオレセインを示し、「ＴＥＴ」は、６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセインを示し、そして「ＨＥＸ」は、６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセインを示す。上記の実施例２のように、プライマーを標識した。その励起波長は４９０ｎｍであった。発光スペクトルは、１×ＴＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で測定し、そして同じ強度（約１×１０−６Ｍ）に規格化した。図７は、このＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの発光スペクトルの５７３ｎｍ発光最大ピークおよび狭い幅によって、このＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドが、このセット内の他の３種の染料の発光スペクトルから、スペクトル的に分離されていることを示す。このスペクトルの分離は、ＦＡＭ、ＴＥＴおよびＨＥＸ標識オリゴヌクレオチドを含む染料セットのＣｌ−ＦＬＡＮ（２）非対称ベンゾキサンテン染料との適合を示している。
【０１７５】
（実施例７）
（２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン中間体の合成）
図８参照。市販の無水ホモフタル酸（１４）（１００ｇｍ）を、酸触媒下（ＴＦＡ ０．５ｍＬ）、エタノール（３００ｍＬ）と反応させ、還流３時間、固形物への濃縮およびトルエンから再結晶し、中間体エチルエステル１５（収率９５％）を生成した。次いで、中間体１５（１０ｇｍ）を、１．１当量の塩化オキサリルとＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中、室温で４時間、反応させ、高真空下、室温で濃縮し、粗固形物として、酸塩化物１６（収率８０％）を生成した。粗生成物１６をＴＨＦ中に懸濁させ、そして以下の二つの方法のいずれかにより、フルオロ酢酸エステル等価物と反応させて、化合物２０を生成した。
【０１７６】
方法Ａ：フルオロ酢酸エチルのカリウム塩（１７）（３当量）（ＴＨＦ中、０℃で、フルオロ酢酸エチルおよびカリウムｔ−ブトキシドの反応により生成）またはフルオロマロン酸水素エチルのマグネシウム塩（１８）（１．５当量）（−６０℃で、臭化イソプロピルマグネシウム（２当量）およびフルオロマロン酸水素エチルの反応により生成）を１６のＴＨＦ懸濁液に徐々に添加し、そして０℃で６時間反応させた。反応系を、５％ ＨＣｌの添加によりクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し（３回）、有機層を乾燥し、濃縮し、そして得られた粗混合物を、ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２６：４〜ＣＨ２Ｃｌ２ １００％の勾配溶出液を使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物２０（収率３５〜５０％）を得た。
【０１７７】
方法Ｂ：リンイリド１９を、−７０℃で、１６のＴＨＦ懸濁液に徐々に添加し、次いで、室温まで暖め、そして１６時間反応させた。この反応系を、５％ ＮａＨＣＯ３の添加によりクエンチし、そして６時間撹拌した。この反応系をＴＨＦ／水で抽出し（３回）、そして生成物を方法Ａと同様に単離して、中間体２０（収率＞５０％）を生成した。精製した２０を、塩基触媒下（ＮａＯＥｔ ２当量）、分子内環化して、環状中間体２１を得、これを、インサイチュで脱カルボキシル化して、２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）（収率５０％）を得た。他方、この環状中間体２１は、ＴＨＦ中、カリウムｔ−ブトキシドを使用すると、単離でき（収率＞８０％）、そして２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）に脱カルボキシル化できる。
【０１７８】
（実施例８）
（非対称ベンゾキサンテン化合物２を使用したＤＮＡ配列決定）
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｙｓｔ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓｔａｔｉｏｎ（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ（ＰＥ））を用いて、自動サイクル配列決定を行った。以下に記載のように６−ＦＡＭ（Ｃ末端停止剤）、ＴＥＴ（Ａ末端停止剤）、ＨＥＸ（Ｇ末端停止剤）またはＣｌ−ＦＬＡＮ
２（Ｔ末端停止剤）で標識した同一の−２１ Ｍ１３プライマーを使用し、４個の別個のサンガー配列決定反応を行った。４個の反応物の混合物を充填しＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３７７ ＤＮＡ配列決定器および付随のデータ分析ソフトウェアにより、データを得た。
【０１７９】
サイクル配列決定反応は、３．０２プラットホームソフトウェアを用いたＣａｔａｌｙｓｔ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓｔａｔｉｏｎで行った。このＣａｔａｌｙｓｔは、１００ｎｇ／μＬの濃度でｐＧＥＭ
３Ｚ＋テンプレートＤＮＡ ０．６μＬ、および以下で規定したプレミックス
１．９μＬを分配するように、プログラム化した。配列決定データは、５％のＬｏｎｇ
Ｒａｎｇｅｒゲル（ＦＭＣ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ）を用いて、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３７７ ＤＮＡ配列決定器で作成した。４個の配列決定プレミックスのそれぞれは、表Ｉで、以下に規定される。
【０１８０】
【表５】
サイクル配列決定は、上記のテンプレートおよびプレミックスの混合物で行った。このＣａｔａｌｙｓｔのサイクル条件は、以下のようであった：９６℃で２０秒間の１サイクル；９４℃で２０秒間、５５℃で４０秒間および６８℃で６０秒間の１５サイクル；および９４℃で２０秒間および６８℃で６０秒間の１５サイクル。
【０１８１】
熱サイクルに続いて、４個の別個の反応物を濃厚緩衝液（８３％ ＤＭＳＯ／２５ｍＭ
ＥＤＴＡ／８ｍｇ／ｍｌ Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ）中で混合し、そして標準Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌｏａｄ法（ｖ ２．０２ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｍａｎｎｕａｌ、ＰＥ）を用いて濃縮した。濃縮試料２ｍＬを、３７７配列決定器のウェルに充填し、操作し、そしてｖｅｒｓｉｏｎ １．１ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。塩基２３３と２６３との間の配列を、図９に示す。
【０１８２】
（実施例９）
（Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）、ＨＥＸおよびＴＥＴ標識プライマーを用いて標識し、ＲＯＸ標識内部サイズ標準で同時に分離したマイクロサテライトフラグメント）
染料標識プライマーを用いたヒトＣＥＰＨ族ＤＮＡの４個の座のＰＣＲ反応を、以下に記載するように行った。これらのＰＣＲ生成物をプールし、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＴＭ ＤＮＡ配列決定器（ＰＥ）にて、電気泳動で分離した。各染料標識フラグメントピークの独特の蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ． ２．０．２（ＰＥ）を用いて分析した。図１０を参照すると、赤色のピーク（Ｒと表示）は、ＲＯＸ（２６）標識した内部標準フラグメントに対応し、青色のピーク（Ｂと表示）は、ＴＥＴ標識フラグメントに対応し、緑色のピーク（Ｇと表示）は、ＨＥＸ標識フラグメントに対応し、そして黒色のピーク（Ｋと表示）は、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識フラグメントに対応する。
【０１８３】
これらのＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラー（ＰＥ）で行った。以下のカクテルを使用して、各染料標識プライマーについて、別の反応を行った：
【０１８４】
【表６】
これらの混合物を、以下のサイクル条件を用いて、増幅した：９５℃で５分間の１サイクル；９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間および７２℃で３０秒間の１０サイクル；８９℃で１５秒間、５５℃で１５秒間および７２℃で３０秒間の２０サイクル；および７２℃で１０分間の１サイクル。
【０１８５】
これらの増幅ＰＣＲ生成物を、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）およびＴＥＴ標識ＰＣＲ生成物（０．５μＬ）を各ＨＥＸ標識ＰＣＲ生成物１．０μＬと混合することによりプールし全体の比がＣｌ−ＦＬＡＮ：ＨＥＸ：ＴＥＸ（１：２：１）からなる混合染料標識フラグメントを得た。プールしたＰＣＲフラグメントを、ホルムアミド２．５μＬ、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ）０．５μＬのおよびＳｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＧＳ−３５０ ＲＯＸ、ＰＥ ｐ／ｎ ４０１７３５）０．５μＬからなる充填カクテルと混合した。プールした混合物を９５℃で５分間変性し、次いで、ＰＥ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ３７７ ＤＮＡ配列決定器の１ゲル列に充填した。これらのフラグメントを電気泳動で分離し、そして以下の特性を有するアクリルアミドゲルを用いて検出した：厚さ０．２０ｍｍ、アクリルアミド４．２５％（ｗｔ）、アクリルアミド／ビスアクリルアミド１９：１（ｗｔ／ｗｔ）、３４ウェルの四角い目の細かい篩、１０ＸＴＢＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ ８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）（ｐＨ ８．３）。この器具は、Ｆｉｌｔｅｒ Ｗｈｅｅｌ ＡおよびＧＳ
３６Ｄ−２４００ Ｍｏｄｕｌｅ（これは、以下の操作パラメーターを有する）を用いて操作した：ＥＰ電圧 ３０００ Ｖ、ＥＰ電流６０．０ｍＡ、ＥＰ電力２００Ｗ、ゲル温度５１℃およびレーザー出力４０ｍＷ。
【０１８６】
（実施例１０）
（本発明のローダミン染料、キサンテン染料および非対称キサンテン染料のスペクトル特性、光安定性および化学安定性の比較）
以下の表ＩＩは、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料および他のスペクトル的に類似のキサンテン染料およびローダミンベース染料の種々のスペクトル特性および化学特性を要約し、そして比較する。
【０１８７】
【表７】
この表で示した染料の構造については、図１および２を参照せよ。全てのデータは、純粋な染料異性体２について報告している。全ての発光スペクトルを、室温で、λｍａｘＡｂｓ（約１×１０−６Ｍ）で吸光度０．０５を有する染料溶液にて、１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）で記録した。λｍａｘＡｂｓで初期１吸収単位にて、等容量のこれらの染料に対して、光分解速度を決定し、そして１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）中、３５℃で、等しい高強度の白色光照射下にて、等容量で、ペアで操作した。アリコートの吸収スペクトルを１時間間隔で取り出し、λｍａｘＥｍでの強度を一次指数曲線に適合させて、染料損失速度ｔ１／２を決定した。ほぼ等しい濃度で、染料の５１４ｎｍ励起を用いて、λｍａｘＥｍでの相対明度を決定した。（λｍａｘＡｂｓ＝０．０５）。ＮＨ４ＯＨ安定性測定については、染料はほぼ同じ濃度の濃水酸化アンモニウムに希釈し（λｍａｘＡｂｓ＝１）、そして密封バイアルにて、６０℃で２０時間インキュベートした。アリコートの吸収スペクトルを１時間間隔で取り出し、λｍａｘＥｍでの強度を一次指数曲線に適合させて、染料分解に対するｔ１／２を決定した。
【０１８８】
全ての文献および特許出願の内容は、各個々の文献または特許出願の内容が具体的かつ独立して参考として援用されているのと同じ程度まで、本明細書中で参考として援用されている。
【０１８９】
化学および生化学の当業者は、その好ましい実施形態において、それらの教示から逸脱することなく、多くの改良が可能であることを、充分に理解している。このような改良の全ては、以下の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図している。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分子プローブとして有用な蛍光染料化合物に関する。より詳細には、本発明は、蛍光標識試薬として有用な非対称ベンゾキサンテン染料に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
生物学的分析物の非放射性検出は、現在の分析バイオテクノロジーにおいて、重要な技術である。放射性標識の必要性をなくすことにより、安全性が高まり、試薬廃棄物の環境上の影響が著しく低下し、その結果、分析コストが低減される。このような非放射性検出方法を使用する方法の例には、ＤＮＡ配列決定、オリゴヌクレオチドプローブ法、ポリメラーゼ鎖反応生成物の検出、イムノアッセイなどが包含される。
【０００３】
多くの用途では、混合物中の複数の空間的に重複した分析物の独立した検出、例えば、単一管の多重ＤＮＡプローブアッセイ、イムノアッセイ、多色ＤＮＡ配列決定法などが必要である。複数座のＤＮＡプローブアッセイの場合には、多色検出を提供することにより、反応管の数を減らすことができ、それにより、実験プロトコルが簡潔化され、そして適用特異的なキットの製造が促進される。自動化したＤＮＡ配列決定の場合には、多色標識化により、単一ラインの４個の塩基全ての分析が可能となり、それにより、単色法よりも処理能力が増え、レーン間の電気泳動の可動性の変化に付随した不確実性がなくなる。
【０００４】
多重検出では、特に、電気泳動分離および酵素処理が必要な分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）に対して、染料標識の選択について、非常に多くの厳しい制約が課せられている。第１に、有機蛍光染料の典型的な発光バンドの半値幅は、約４０〜８０ナノメーター（ｎｍ）であり、利用できるスペクトルの幅は、励起光源により制限されるので、その発光スペクトルが分光的に分解される一連の染料を見つけるのは困難である。１組の染料に関連して、本明細書中で使用する「スペクトル分解」との用語は、これらの染料の蛍光発光バンドが充分に異なること、すなわち、充分に重なりがないことを意味し、個々の染料が結合している試薬（例えば、ポリヌクレオチド）が、米国特許第４，２３０，５５８号、第４，８１１，２１８号またはＷｈｅｅｌｅｓｓら、２１〜７６ページ、Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５）に記述の系によって例示されるように、例えば、バンドパスフィルターおよび光電子増倍管、帯電カップルド装置（ｃｈａｒｇｅｄ−ｃｏｕｐｌｅｄ ｄｅｖｉｃｅ）、および分光器のシステムを使用する標準的な光検出システムを用いて、個々の染料により発生する蛍光信号を基準にして、識別できることを意味する。第２に、たとえ、非重複発光スペクトルを有する染料を見出しても、個々の蛍光効率が低すぎるなら、そのセットは、依然として、適当ではない。例えば、ＤＮＡ配列決定の場合には、試料の充填を多くしても、低い蛍光効率を補填できない（Ｐｒｉｎｇｌｅら、ＤＮＡ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ、１：１５〜２１（１９８８））。第３に、数個の蛍光染料を同時に使用するとき、これらの染料の吸収バンドが広範囲に分離するために、同時励起が困難となる。第４に、これらの染料の電荷、分子サイズおよび立体配座は、そのフラグメントの電気泳動可動性に悪影響を与えてはならない。最後に、これらの蛍光染料は、これらのフラグメントを製造するかまたは操作するのに使用する化学物質（例えば、ＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、リガーゼ酵素など）と適合性でなければならない。
【０００５】
これらの厳しい制約のために、多色用途（特に、４色ＤＮＡ配列決定の領域）で使用できる蛍光染料のセットは、少数発見されているにすぎない（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１３；２３９９〜２４１２（１９８５）；Ｐｒｏｂｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：３３６〜３４１（１９８７）；およびＣｏｎｎｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、５：３４２〜３４８（１９８７））。図１は、２種のローダミンベースの染料であるＴＡＭＲＡ（２２）およびＲＯＸ（２６）および２種のフルオレセインベースの染料であるＨＥＸ（２３）およびＮＡＮ（２４）を含めて、５５０ｎｍを超えると発光する長波長標識として使用される蛍光キサンテン染料の例を示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、複数の空間的に重複した分析物の同時検出に有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料であって、上記制約を満たし、４８０ｎｍと５５０ｎｍの間の波長を有する励起光を照射したとき、５５０ｎｍを超える蛍光発光最大を与えるものを提供することにある。
【０００７】
本発明の他の目的は、複数の空間的に重複した分析物の同時検出に有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料であって、上記制約を満たし、その蛍光特性が、種々の位置における置換基の操作により調整できるものを提供することにある。
【０００８】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の合成に有用な方法および中間体化合物を提供することにある。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料で標識化したヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを提供することにある。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を含むホスホロアミデート化合物を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらに他の目的は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を使用して、ＤＮＡ配列決定法を含めたフラグメント解析法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１の局面では、本発明の上述の目的および他の目的は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物により、達成される：
【００１３】
【化３】
ここで、Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウム、またはアミンである。Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、アルコキシ、連結基またはそれらの組合せである。そしてＲ９は、アセチレン、アルカン、アルケン、シアノ、置換フェニル、またはそれらの組合せであり、この置換フェニルは、以下の構造を有する：
【００１４】
【化４】
ここで、Ｘ１は、カルボン酸またはスルホン酸であり；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、または低級アルキルであり；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、または連結基である。
【００１５】
第２の局面では、本発明は、次式を有するホスホロアミダイト化合物を包含する：
【００１６】
【化５】
ここで、Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）であり；Ｙは、連結基であり；Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；Ｂ２、およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アリールアルキル、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルであり；そしてＤは、上記非対称ベンゾキサンテン染料化合物である。ＹおよびＤは、連結基およびその相補官能基（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）の反応により形成した連結基を介して結合されており、このような連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、染料Ｄに結合している。
【００１７】
第３の局面では、本発明は、次式を有するホスホルアミダイト化合物を包含する：
【００１８】
【化６】
ここで、Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり、Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アリールアルキル、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルであり；Ｂ５は、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり；Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そしてＤは、上記染料化合物である。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している。ＢおよびＤは、連結基およびその相補官能基の反応により形成した連結基を介して結合されており、このような連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置の１個で、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、７−デアザアデニン、および７−デアザグアノシンからなる群から選択される。
【００１９】
第４の局面では、本発明は、上記非対称ベンゾキサンテン染料の合成で中間体として有用な化合物を包含し、このような化合物は、次式を有する：
【００２０】
【化７】
ここで、Ｒ３〜Ｒ７は、上で記述のものと同じであり、そしてＹ２は、ヒドロキシルまたはアミンである。本局面の特に好ましい実施形態では、Ｒ３は、フッ素であり、そしてＹ２は、ヒドロキシルである。
【００２１】
第５の局面では、本発明は、本発明の上記非対称ベンゾキサンテン染料で標識化したヌクレオチドを包含し、このヌクレオチドは、次式を有する：
【００２２】
【化８】
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基である；Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨまたはＯＨである；Ｗ３は、ＯＨ、
【００２３】
【化９】
であり、そしてＤは、本発明の染料化合物である。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している。ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から選択される。
【００２４】
第６の局面では、本発明は、次式を有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチドを包含する：
【００２５】
【化１０】
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；Ｚ１は、ＨまたはＯＨであり；Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４、およびＮｕｃであり、ここで、「Ｎｕｃ」は、ヌクレオチドを意味する。このヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの５’−位置に結合している；Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３およびそれらのホスフェートアナログ、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル連結基により連結されており、この連結基は、Ｎｕｃの３’−位置に結合している；そしてＤは、本発明の染料化合物である。ＨＰＯ３のホスフェートアナログには、非架橋酸素を非酸素部分（例えば、イオウ、アミノ、アニリデート、アニリンチオエートなど）で置き換えたアナログが挙げられる。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している。ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置の１個で、Ｄに結合している。Ｂがプリンである場合、その連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、その連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、その連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。好ましくは、Ｂは、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシンからなる群から選択される。
【００２６】
第７の局面では、本発明は、本発明の染料を用いたポリヌクレオチド配列決定方法を包含する。この方法は、第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を以下のように形成する工程を包含する：第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識化されている；第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標識化されている；第３のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染料で標識化されている；そして第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、第４染料で標識化されている。この方法では、第１染料、第２染料、第３染料、または第４染料の１種以上は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料である。これらの染料の他のものは、それらが、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから分光的に分解可能なように、選択される。上記混合物を形成した後、このポリヌクレオチドは、電気泳動的に分離され、それにより、類似のサイズのポリヌクレオチドのバンドが形成される。次に、これらのバンドは、これらの染料に蛍光を起こすことができる照射ビームで照射される。最後に、これらのポリヌクレオチドのクラスは、各バンド中の標識化ポリヌクレオチドの蛍光スペクトルにより、同定される。
【００２７】
第８の局面では、本発明は、本発明の染料化合物を使用するフラグメント解析方法を包含する。この局面の方法は、以下の工程を包含する：標識化ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、このフラグメントが、本発明の染料化合物で標識化されている、工程；この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；およびこの分離プロセスに引き続いて、この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。
１つの局面において、本発明は、次式を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物：
【００２８】
【化１１】
を提供し、
ここで、
Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムおよびアミンからなる群から選択され；
Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択され；そして
Ｒ９は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、置換フェニル、複素環芳香族およびそれらの組合せからなる群から選択され、この置換フェニルは、以下の構造を有し：
【００２９】
【化１２】
ここで、
Ｘ１〜Ｘ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、または連結基である。
【００３０】
１つの実施形態において、上記の化合物は、Ｙ１およびＹ２の１個が、酸素であり得、そして他が、ヒドロキシルであり得る。
【００３１】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｘ１は、カルボン酸、スルホン酸、および−ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され得；
Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、および低級アルキルからなる群から選択され得；そして
Ｘ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、および連結基からなる群から選択され得る。
【００３２】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ２およびＸ５が、塩素であり得る。
【００３３】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ１が、カルボン酸であり得る。
【００３４】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ３またはＸ４の一方が、連結基であり得、そして他方が、水素であり得る。
【００３５】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｘ１またはＸ５の一方が、カルボン酸、スルホン酸、および−ＣＨ２ＯＨからなる群から選択され得る。
【００３６】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｒ１〜Ｒ３の１個が、フッ素であり得る。好ましい実施形態において、上記の化合物は、Ｒ３が、フッ素であり得る。
【００３７】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、塩素であり得；
Ｒ３は、フッ素であり得；
Ｒ２、およびＲ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００３８】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１およびＲ３は、フッ素であり得；
Ｒ２、およびＲ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００３９】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、メトキシであり得、Ｒ２は、塩素であり得、Ｒ３は、フッ素であり得；
Ｒ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４０】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ３は、フッ素であり得；Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４１】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４２】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、塩素であり；Ｒ２〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４３】
別の実施形態において、上記の化合物は、
Ｙ１およびＹ２の一方は、酸素であり得、そして他方は、ヒドロキシルであり得；
Ｒ１は、メトキシであり；Ｒ２は、塩素であり得；
Ｒ３〜Ｒ８は、水素であり得；そして
Ｒ９は、置換フェニルであり得、ここで、Ｘ１は、カルボキシルであり得、Ｘ２およびＸ５は、塩素であり得、そしてＸ３およびＸ４の一方は、カルボキシルであり得、そして他方は、水素であり得る。
【００４４】
別の局面において、本発明は、次式を有するホスホルアミダイト化合物：
【００４５】
【化１３】
を提供し、ここで、
Ｘは、スペーサーアーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）であり；
Ｙは、連結基であり；
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；そして
Ｄは、上記の染料化合物である；
ここで、ＹおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位置のうち１つで染料Ｄに結合した連結基を介して、連結されている。
【００４６】
１つの実施形態において、上記の化合物は、Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、その主鎖に５個までの炭素原子を含み、かつ全体で１０個までの炭素原子を含有するアルケン鎖であり得、この鎖の両末端の原子価結合は、この窒素原子に結合されており得るか；あるいはＢ２およびＢ３は、窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し得、これは、窒素、酸素、およびイオウからなる群から選択される１個以上のヘテロ原子を含有し得る。好ましい実施形態において、上記の化合物は、
Ｂ１は、メチル、β−シアノエチル、または４−ニトロフェニルエチルからなる群から選択され得；
Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチル、およびｓｅｃ−ブチルからなる群から選択され得；そして
Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノであり得る。
【００４７】
別の実施形態において、上記の化合物は、ＸおよびＹが、一緒になって、以下の式であり得、ここで、ｎが、２〜１０の範囲であり得る：
【００４８】
【化１４】
。
【００４９】
別の実施形態において、上記の化合物は、ＸおよびＹが、一緒になって、以下の式であり得、ここで、ｎが、２〜１０の範囲であり得る：
【００５０】
【化１５】
。
【００５１】
別の局面において、本発明は、次式を有するホスホロアミダイト化合物：
【００５２】
【化１６】
を提供し、ここで：
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２、およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｂ５は、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり；
Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そして
Ｄは、上記の染料化合物である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している；
ここで、ＢおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位置のうち１つでＤに結合した連結基により、連結されている；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位置にて結合している。
【００５３】
１つの実施形態において、上記の化合物は、上記連結基が、以下の式であり得る：
【００５４】
【化１７】
。
【００５５】
別の実施形態において、上記の化合物は、上記連結基が、以下であり得る
【００５６】
【化１８】
。
【００５７】
別の実施形態において、上記の化合物は、上記連結基が、以下であり得る：
【００５８】
【化１９】
。
【００５９】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００６０】
別の局面において、本発明は、次式を有する化合物：
【００６１】
【化２０】
を提供し、ここで：
Ｒ３は、フッ素、塩素、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され；
Ｒ４〜Ｒ７は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され；そして
Ｙ２は、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択される。
【００６２】
１つの実施形態において、上記の化合物は、Ｒ３が、フッ素であり得る。
【００６３】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｙ２が、ヒドロキシルであり得る。
【００６４】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｒ３が、塩素であり得る。
【００６５】
別の実施形態において、上記の化合物は、Ｙ２が、アミンであり得る。
【００６６】
別の局面において、本発明は、次式を有する標識化ヌクレオチド：
【００６７】
【化２１】
を提供し、ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｗ３は、ＯＨ、
【００６８】
【化２２】
からなる群から選択され；
Ｄは、上記の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している；
ここで、ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合している；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位置に結合している。
【００６９】
１つの実施形態において、上記の標識化ヌクレオチドは、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００７０】
別の実施形態において、上記の標識ヌクレオチドは、上記連結基が、以下の式であり得る：
【００７１】
【化２３】
。
【００７２】
別の実施形態において、上記の標識化ヌクレオチドは、Ｗ１およびＷ２の両方が、Ｈであり得、そしてＷ３が、以下の式であり得る：
【００７３】
【化２４】
。
【００７４】
別の実施形態において、上記の標識化ヌクレオチドは、Ｗ１が、Ｈであり得、Ｗ２が、ＯＨであり得、そしてＷ３が、以下の式であり得る：
【００７５】
【化２５】
。
【００７６】
別の局面において、本発明は、次式を有するヌクレオチドを含有する標識化ポリヌクレオチド：
【００７７】
【化２６】
を提供し、ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｚ１は、ＨまたはＯＨからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの５’−位置に結合している；
Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル連結基により連結され、この連結基は、Ｎｕｃの３’−位置に結合している；そして
Ｄは、上記の染料化合物である；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合している；
ここで、ＢおよびＤを連結している連結基は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合している；
ここで、Ｂがプリンである場合、この連結基は、このプリンの８−位置に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この連結基は、この７−デアザプリンの７−位置に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この連結基は、このピリミジンの５−位置に結合している。
【００７８】
１つの実施形態において、上記の標識化ポリヌクレオチドは、Ｂが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択され得る。
【００７９】
別の実施形態において、上記の標識化ポリヌクレオチドは、上記連結基が、以下の式であり得る：
【００８０】
【化２７】
。
【００８１】
別の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、ポリヌクレオチド配列決定方法を提供する：
第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を以下：
この第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識されており；
この第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標識されており；
この第３のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染料で標識されており；そして
この第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、第４染料で標識されており；
ここで、この第１染料、この第２染料、この第３染料、またはこの第４染料のうちの１種は、上記の非対称ベンゾキサンテン染料であり；
この染料の他のものは、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから、分光的に分解可能である、
ように形成する工程；
このポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それにより、同様にサイズ分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；
このバンドを、この染料が蛍光を発するのを引き起こすことができる照射ビームで照射する工程；ならびに
このバンド中のこのポリヌクレオチドのクラスを、この染料の蛍光スペクトルにより同定する工程。
【００８２】
１つの実施形態において、上記のポリヌクレオチド配列決定方法は、上記染料の他のものが、６−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセイン、および６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセインからなる群から選択され得る。
【００８３】
別の局面において、本発明は、以下を包含する、フラグメント解析方法を提供する：
標識化ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、このフラグメントが、上記の染料化合物で標識化されている、工程；
この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性（ｓｉｚｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）分離プロセスに供する工程；および
この分離プロセスに引き続いて、この標識化ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。
【００８４】
１つの実施形態において、上記のフラグメント解析方法は、上記サイズ依存性分離プロセスが、電気泳動であり得、そして上記検出する工程が、蛍光によって検出する工程であり得る。
【００８５】
本発明はさらに、以下を提供する：
（項目１）次式：
【化１】
を有する非対称ベンゾキサンテン染料化合物であって、
ここで、
Ｙ１およびＹ２は、別個に、ヒドロキシル、酸素、イミニウムおよびアミンからなる群から選択され；
Ｒ１〜Ｒ８は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、連結基およびそれらの組合せからなる群から選択され；そして
Ｒ９は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニル、複素環式芳香族、および以下の構造：
【化２】
を有する置換フェニルからなる群より選択され、
ここで、
Ｘ１〜Ｘ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨ、または連結基であり、
ここで、この連結基は、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、活性カルボキシレート、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドおよび活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからなる群より選択される、
化合物。
（項目２）次式を有するホスホロアミダイト化合物であって：
【化１００】
ここで、
Ｘは、線状低級アルキル、環状低級アルキル、線状置換低級アルキル、環状置換低級アルキル、ポリエチレンオキシド、１個と８個との間の炭素原子を有する低級アリール、ペプチドおよびポリエーテルからなる群より選択される、スペーサーアームであり；
Ｙは、アミド、スルホンアミド、尿素、ウレタンおよびチオ尿素からなる群より選択される、結合であり；
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；そして
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、ＹおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位のうち１つで染料Ｄに結合した結合を介して、連結されている、
化合物。
（項目３）次式を有するホスホロアミダイト化合物であって：
【化１０１】
ここで：
Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり；
Ｂ２、およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、アリール、および１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｂ５は、トリフェニルメチルラジカル、トリフェニルメチルラジカルの電子供与性置換誘導体、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、モノメトキシトリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチルおよびトリ（ｐ−メトキシフェニルメチル）からなる群より選択される、酸切断可能なヒドロキシル保護基であり、この電子供与性置換基は、アミノ、低級アルキル、１個と８個との間の炭素原子を有する低級アリール、低級アルコキシおよびメトキシからなる群より選択され；
Ｂは、ヌクレオチド塩基であり；そして
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたは７−デアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合しており；
ここで、ＢおよびＤは、Ｒ１〜Ｒ９位置のうち１つでＤに結合した結合により、連結されており；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この結合は、このプリンの８−位にて結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この結合は、このピリミジンの５−位にて結合している、
化合物。
（項目４）次式を有する化合物であって：
【化１０２】
ここで：
Ｒ３は、フッ素、塩素、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され；
Ｒ４〜Ｒ７は、別個に、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、アミノ、アミド、ニトリル、低級アルコキシ、および連結基からなる群から選択され、この連結基は、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、活性カルボキシレート、マレイミド、ハロアセチル、ヨードアセトアミドおよび活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルからなる群より選択され；そして
Ｙ２は、ヒドロキシルおよびアミンからなる群から選択され、
ただし、Ｙ２がヒドロキシルである場合、Ｒ３はアミドではない、
化合物。
（項目５）次式を有する標識ヌクレオチドであって：
【化１０３】
ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｗ３は、ＯＨ、
【化１０４】
からなる群から選択され；
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合しており；
ここで、ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合しており；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、この結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、この結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、この結合は、このピリミジンの５−位に結合している、
標識ヌクレオチド。
（項目６）次式を有するヌクレオチドを含有する標識ポリヌクレオチドであって：
【化１０５】
ここで：
Ｂは、７−デアザプリン、プリン、またはピリミジンヌクレオチド塩基であり；
Ｚ１は、ＨおよびＯＨからなる群から選択され；
Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４、およびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結され、このホスホジエステル結合は、Ｎｕｃの５’−位に結合しており；
Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３、ホスフェートアナログおよびＮｕｃからなる群から選択され、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結され、このホスホジエステル結合は、Ｎｕｃの３’−位に結合しており；そして
Ｄは、項目１に記載の染料化合物であり；
ここで、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位置にて結合しており、Ｂがピリミジンである場合、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位置にて結合しており；
ここで、ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ９位置のうちの１つで、Ｄに結合しており；そして
ここで、Ｂがプリンである場合、このＢおよびＤを連結している結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンである場合、このＢおよびＤを連結している結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合しており、そしてＢがピリミジンである場合、このＢおよびＤを連結している結合は、このピリミジンの５−位に結合している、標識ポリヌクレオチド。
（項目７）ポリヌクレオチド配列決定方法であって：
第１、第２、第３、および第４のクラスのポリヌクレオチドの混合物を以下：
この第１のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシアデノシンを含有し、第１染料で標識されており；
この第２のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシシチジンを含有し、第２染料で標識されており；
この第３のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシグアノシンを含有し、第３染料で標識されており；そして
この第４のクラスの各ポリヌクレオチドは、３’−末端ジデオキシチミジンを含有し、第４染料で標識されており；
ここで、この第１染料、この第２染料、この第３染料、またはこの第４染料のうちの１種は、項目１に記載の非対称ベンゾキサンテン染料であり；
この染料の他のものは、この非対称ベンゾキサンテン染料からおよび互いから、分光的に分解可能である、
ように形成する工程；
このポリヌクレオチドを電気泳動的に分離し、それにより、同様にサイズ分類されたポリヌクレオチドのバンドを形成する工程；
このバンドを、この染料が蛍光を発するのを引き起こすことができる照射ビームで照射する工程；ならびに
このバンド中のこのポリヌクレオチドのクラスを、この染料の蛍光スペクトルにより同定する工程、
を包含する方法。
（項目８）以下を包含する、フラグメント解析方法：
標識ポリヌクレオチドフラグメントを形成する工程であって、このフラグメントが、項目１に記載の染料化合物で標識されている、工程；
この標識ポリヌクレオチドフラグメントを、サイズ依存性分離プロセスに供する工程；および
この分離プロセスに引き続いて、この標識ポリヌクレオチドフラグメントを検出する工程。
【発明の効果】
【００８６】
本発明により、蛍光染料として有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、長波長標識（すなわち、５５０ｎｍを超えると発光する標識）として以前に使用されている種々の蛍光染料の構造を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の好ましい合成を描写する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の好ましい合成を描写する。
【図３】図３は、本発明の染料で標識化したオリゴヌクレオチドの好ましい合成を示す。
【図４】図４は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの励起スペクトルを示す。
【図５】図５は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの量子収量の比較を示す。
【図６】図６は、ＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）で標識化したオリゴヌクレオチドの等モル発光強度の比較を示す。
【図７】図７は、４プレックス（ｐｌｅｘ）のセットの染料標識化ＤＮＡ配列決定プライマーのメンバーの蛍光発光スペクトルを示す。
【図８】図８は、本発明の２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン中間体の合成を示す。
【図９】図９は、本発明の染料化合物で標識化したオリゴヌクレオチド配列決定プライマーを使用したＤＮＡ配列決定実験の結果を示す。
【図１０】図１０は、本発明の染料化合物で標識化したオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用したマイクロサテライト分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料の合成の４個の好ましい合成経路を示す。
【図１２】図１２は、本発明の１−置換３−ヒドロキシナフタレン中間体の合成の３個の好ましい合成経路を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
（発明の要旨）
本発明は、蛍光染料として有用な種類の非対称ベンゾキサンテン染料を本発明者が発見したことに関する。
本発明の染料は、特に、多色蛍光ベースのＤＮＡ配列決定の領域において、複数の空間的に重複した分析物の同時検出に使用する現在利用可能な染料よりも、少なくとも７個の重要な利点を提供する。第１に、本発明の染料は、所望のスペクトル特性を有する現在利用可能な染料よりも、ＤＮＡ合成条件に対して、ずっと安定である。このＤＮＡ合成条件に対する高い安定性により、自動化ＤＮＡ合成技術（例えば、標識化ＰＣＲプライマー、ＤＮＡ配列決定プライマーおよびオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ）を用いて、標識化オリゴヌクレオチド試薬をずっと容易に調製することが可能となる。第２に、本発明の染料は、約５５０ｎｍを超える波長範囲で以前に使用されているフルオレセインベースの染料よりも、著しく光安定性である。第３に、本発明の染料は、青い「肩部」のある吸収スペクトルを有し、それにより、ジベンゾキサンテン染料またはローダミンベースの染料よりも短い波長で、この染料のより効率的な励起が可能となる。第４に、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料は、分光的に類似のローダミンベースの染料よりも著しく高い量子収量を有する。第５に、本発明の染料の高い量子収量と相まって、典型的な光源による高い励起効率により、この染料は、所望のスペクトル特性を有する現在利用可能な染料よりも、著しく明るくなる。ＤＮＡ配列決定用途（この場合、分析物の量は、電気泳動負荷因子により制限され、その全蛍光は、数百の空間的に分離された種に分配されている）の状況では、明度は、特に重要である。本明細書中で使用する「明度」とは、最終的な蛍光発光強度に対する、吸光係数および蛍光量子収量を合わせた効果を意味する。この蛍光標識の明度を高くすることにより、より大きく数の少ないフラグメントが容易に検出でき、この電気泳動に充填する必要がある試料が少なくなり、それにより、優れた電気泳動解像度が得られる。さらに、これらの分析物の高い明度は、高い信号：ノイズ比に寄与し、空間的かつ分光的に近接した種の改良された解析を生じる。第６に、本発明の染料の非対称性により、この染料の置換基Ｒ１〜Ｒ９、特に、そのレゾルシノール誘導部分の置換基Ｒ１〜Ｒ３を変えることにより、これらの染料の発光スペクトルの調整が可能となる。対称ベンゾキサンテン化合物では、１個の等価の置換基位置だけが利用可能であり、それにより、この染料のスペクトル調整に利用できる自由度が大きく制限される。第７に、本発明の染料は、安定なホスホロアミダイト誘導体に容易に転化され、これは、標識化オリゴヌクレオチドの自動化化学合成に使用できる。
【００８９】
本発明のこれらの目的および他の目的、特徴および利点は、以下の記載、図面、および添付の請求の範囲を参照すると、よく理解される。
（好適な実施形態の詳細な説明）
本発明のある好ましい実施形態を、ここで、詳細に言及する。本発明は、その好ましい実施形態に関連して記述されているものの、それらは、本発明をこれらの実施形態に限定する意図はないことが分かる。逆に、本発明は、添付の請求の範囲で規定した本発明の範囲内に含まれ得る代替、改良および等価物を含むことを意図している。
【００９０】
一般に、本発明は、蛍光染料として有用な新規なクラスの非対称ベンゾキサンテン化合物、このような染料を合成するための方法および中間体、このような染料を分子標識として使用する試薬、およびこのような染料および試薬を分析生物工学の領域で使用する方法を包含する。本発明の化合物は、多色蛍光ＤＮＡ配列決定およびフラグメント解析の領域で、特に用途が見出されている。
【００９１】
（Ｉ．非対称ベンゾキサンテン染料化合物）
第一の局面では、本発明は、すぐ下の式Ｉで示す一般構造を有する新規なクラスの非対称ベンゾキサンテン染料化合物を包含する。（本明細書中で提供した全ての分子構造は、提示した正確な電子構造だけでなく、それらの全ての共鳴構造およびプロトン付加状態を含むことを意図している）。
【００９２】
【化２８】
式１
式Ｉでは、Ｙ１およびＹ２は、独立して、ヒドロキシル、酸素、アミンまたはイミニウムである。Ｙ１がヒドロキシルであり、そしてＹ２が酸素のとき、この化合物は、フルオレセインに類似しており、これに対して、Ｙ１がアミンであり、そしてＹ２がイミニウムのとき、この化合物は、ローダミンに類似している。好ましくは、Ｙ１は、ヒドロキシルであり、そしてＹ２は、酸素である。
【００９３】
Ｒ１〜Ｒ９部分は、この分子の基底状態および励起状態の電子構造を変えることにより、この染料の種々の特性を調節するのに使用される置換基である。特に、Ｒ１〜Ｒ９部分を変えることは、この化合物のスペクトル特性、化学的安定性および光安定性に影響を与える。置換基Ｒ１〜Ｒ３およびＲ９は、式Ｉの化合物の特性を規定する際に、特に重要である。例えば、Ｒ１〜Ｒ３位の１つにフッ素原子を配置すると、化学的安定性および光安定性が高まること、およびＲ９が置換フェニルなら、置換基Ｘ２およびＸ５を塩素にすることにより、より狭い発光バンドが生じることが観察されている。（置換基Ｘ２およびＸ５の定義については、以下を参照）。
【００９４】
好ましくは、置換基Ｒ１〜Ｒ８は、水素、フッ素、塩素、低級アルキル、低級アルケン、低級アルキン、スルホネート、スルホン、アミノ、イミニウム、アミド、ニトリル、アリール、低級アルコキシ、連結基、またはそれらの組合せであり、本明細書中で使用する「連結基」との用語は、試薬に結合した「相補官能性」と反応できる官能性を意味し、このような反応は、この染料をこの試薬に連結する「結合」を形成する。本開示の次の節では、特定の連結基、相補官能性および結合について、さらに詳しく述べる。好ましくは、Ｒ１は、低級アルコキシ、塩素、フッ素または水素である；Ｒ２は、低級アルキル、フッ素または塩素である；そしてＲ３は、低級アルキルまたはフッ素である。より好ましくは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の１個は、フッ素である。特に好ましい実施形態では、少なくともＲ３は、フッ素である。
【００９５】
本明細書中で使用する「低級アルキル」との用語は、１個〜８個の炭素原子を含有する直鎖および分枝炭化水素部分（すなわち、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなど）を表わす。「低級置換アルキル」とは、電子吸引性置換基（例えば、ハロ、シアノ、ニトロ、スルホなど）を含む低級アルキルを表わす。「低級ハロアルキル」とは、１個またはそれ以上のハロゲン原子置換基（通常、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）を有する低級置換アルキルを表わす。「低級アルケン」とは、１個〜８個の炭素原子を含有する炭化水素であって、ここで、その炭素−炭素結合の１個またはそれ以上が二重結合であり、ここで、その非二重結合炭素が、低級アルキルまたは低級置換アルキルを包含するものを表わす。「低級アルキン」とは、１個〜８個の炭素原子を含有する炭化水素であって、ここで、１個またはそれ以上の炭素が三重結合で結合しており、ここで、その非三重結合炭素が、低級アルキルまたは低級置換アルキルを包含するものを表わす。「スルホネート」とは、３個の酸素原子に結合したイオウ原子を含有する部分を意味し、これには、それらのモノ塩およびジ塩が含まれる（例えば、スルホン酸ナトリウム、スルホン酸カリウム、スルホン酸二ナトリウムなど）。「アミノ」とは、２個の水素原子、低級アルキル部分またはそれらの任意の組合せに結合した窒素原子を含有する部分を意味する。「アミド」とは、酸素原子に二重結合しアミノ部分に単結合した炭素原子を含有する部分を意味する。「ニトリル」とは、窒素原子に三重結合した炭素原子を含有する部分を意味する。「低級アルコキシ」とは、酸素原子に単結合した低級アルキルを含有する部分を意味する。「アリール」とは、単一または複数のフェニルまたは置換フェニル（例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなど）を意味する。
【００９６】
好ましくは、Ｒ９は、アセチレン、低級アルキル、低級アルケン、シアノ、フェニルまたは置換フェニル、複素環式芳香族、またはそれらの組合せであり、この置換フェニルは、以下の構造を有する：
【００９７】
【化２９】
ここで、Ｘ１〜Ｘ５は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸、−ＣＨ２ＯＨまたは連結基である。本明細書中で使用する「複素環式芳香族」との用語は、その環式構造の一部としてヘテロ原子を有する芳香族部分（例えば、ピロール、フラン、インドールなど）を意味する。好ましくは、Ｘ１は、カルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ２ＯＨである；Ｘ２およびＸ５は、別個に、水素、塩素、フッ素または低級アルキルである；そしてＸ３およびＸ４は、別個に、水素、塩素、フッ素、低級アルキル、カルボン酸、スルホン酸または連結基である。より好ましくは、Ｘ２およびＸ５は、塩素である。さらに別の好ましい実施形態では、Ｘ３またはＸ４の１個は、連結基である。好ましくは、Ｘ１は、カルボン酸である。本発明の染料化合物を含むホスホロアミダイト化合物を形成するのに特に適切なさらに別の好ましい実施形態では、Ｘ１またはＸ５の１個は、環状エステルまたは環状エーテルを形成できる部分（例えば、カルボン酸、スルホン酸または−ＣＨ２ＯＨ）、またはスピロ環系（すなわち、両方の環に共通の１個の炭素原子を有する二環式化合物、例えば、スピロ［４，５］デカン）を形成するいずれかの他の基である。
【００９８】
好ましくは、本発明の連結基は、その相補官能性がアミンであるときは、イソチオシアネート、スルホニルクロライド、４，６−ジクロロトリアジニルアミン、スクシンイミジルエステル、または他の活性カルボキシレートである。好ましくは、この連結基は、その相補官能性がスルフヒドリルであるときは、マレイミド、ハロアセチルまたはヨードアセトアミドである。Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９２）を参照せよ。特に好ましい実施形態では、この連結基は、アミン相補官能性と反応する活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステルであり、ここで、この活性化ＮＨＳエステルを形成するには、カルボキシレート連結基を含む本発明の染料は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳエステルを形成する。図３を参照せよ。
【００９９】
本発明の非対称ベンゾキサンテン染料化合物を合成するには、いくつかの可能な一般化した方法が使用でき、その４つは、図１１を参照して、本明細書中で記述する。図１１で経路Ａとして表わされる第一の好ましい方法では、化合物２７は、酸触媒および熱の存在下にて、１，３−ジヒドロキシまたは１，３−アミノヒドロキシベンゼン誘導体２８および１，３−ジヒドロキシまたは１，３−アミノヒドロキシナフタレン誘導体２９と、それぞれ同じ当量を使用して反応させ、非対称染料化合物３０が得られる。好ましくは、化合物２７は、環状または直鎖無水物（例えば、ＬＶＧは、ＯＣＯＲ９である）；エステル（例えば、ＬＶＧは、ＯＲであり、ここで、Ｒは、低級アルキル、フェニルまたはスルホネートである）；または酸塩化物（例えば、ＬＶＧは、塩素または他のハロゲンである）である。
【０１００】
図１１で経路Ｂとして表わされる別の好ましい合成方法では、化合物２７は、２当量の１，３−ジヒドロキシベンゼン誘導体（すなわち、Ｙ１は、ヒドロキシである）または１，３−アミノヒドロキシベンゼン誘導体（すなわち、Ｙ１は、アミノである）２８と反応させて、対称キサンテン染料３１が得られる。化合物３１は、次いで、塩基加水分解により分解されて、中間体ベンゾイル縮合生成物３２が形成される。縮合生成物３２は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて、化合物２９と反応させて、非対称染料３０が得られ、ここで、２９は、Ｙ２がヒドロキシのとき、１，３−ジヒドロキシナフタレンであり、またはＹ２がアミノのとき、１，３−アミノヒドロキシナフタレンである。
【０１０１】
さらに、図１１の経路Ｃとして表わされる第三の一般化した合成方法では、化合物２７は、熱と共に、１当量の２８と反応させ、中間体ベンゾイル縮合生成物３２が得られる。化合物３２は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて、２９と反応させ、非対称染料３０が得られる。
【０１０２】
図１１で経路Ｄとして表わされる第四の一般化した方法では、酸触媒および熱の存在下にて、同じ当量の化合物３３、化合物２８および化合物２９を反応させ、非対称キサントン中間体３４が得られる。好ましくは、３３は、カーボネート（例えば、ＬＶＧは、ＯＲであり、ここで、Ｒは、好ましくは、低級アルキルまたはフェニルである）；またはホルメート（例えば、ＬＶＧは、ハロゲンおよびＯＲであり、ここで、Ｒは、好ましくは、低級アルキルまたはフェニルである）である。化合物３４は、次いで、アニオン性有機金属Ｒ９誘導体（例えば、Ｒ９Ｌｉ、Ｒ９ＭｇＸであり、ここで、Ｘは、ハライド（例えば、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ）などである）と反応させ、非対称染料３０が得られる。
【０１０３】
図２Ａおよび２Ｂは、本発明の特に好ましい非対称染料化合物の一組の合成を示す。この合成では、１，３−ジヒドロキシナフタレン誘導体（例えば、１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ｂ）または２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ））は、１当量の無水フタル酸誘導体（例えば、無水３，６−ジクロロトリメリト酸（１０ａ））および１当量のレゾルシノール誘導体（１１ａ、１１ｂ、１１ｃまたは１１ｄ）と反応させ、そしてアルゴン下にて、正味の有機酸（例えば、ＭｅＳＯ３Ｈ）中で１６時間加熱される。この粗染料は、次いで、氷／水混合物への添加により沈殿され、そして濾過により単離される。この粗染料は、次いで、分取薄層クロマトグラフィーにより、異性体１および２にさらに精製される。
【０１０４】
この非対称ベンゾキサンテン染料の非置換誘導体（Ｒ２および／またはＲ３は、Ｈである）は、ハロゲン化試薬（例えば、市販の陽性フッ素（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｉｎｅ）源、ＮａＯＣｌ、ＮａＯＨ／Ｂｒ２、ＮａＯＨ／Ｉ２）とさらに反応させて、１０％ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃでの抽出仕上げ、Ｎａ２ＳＯ４での乾燥、濾過および真空中での濃縮後に、定量的にハロゲン化した誘導体（例えば、Ｒ２＝Ｒ３＝Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＦである）を生成し得る。図２Ｂ中の挿入図を参照のこと。
【０１０５】
（ＩＩ．置換ナフタレン中間体）
第二の局面では、本発明は、主題発明の非対称ベンゾキサンテン化合物の合成に有用な新規な中間体化合物を包含し、このような中間体は、すぐ下の式ＩＩに示す一般構造を有する。特に、本発明の中間体化合物は、２−置換非対称ベンゾキサンテン化合物の２位にて、置換基（例えば、ハロゲン原子）の位置選択的含入を伴う非対称ベンゾキサンテン化合物の合成を可能にし、この場合、この２位は、式Ｉおよび式ＩＩの化合物では、Ｒ３位置に対応する。
【０１０６】
【化３０】
式ＩＩ
式ＩＩの構造において、置換基Ｒ３〜Ｒ７は、上記式Ｉの構造において、同じ番号を付けた置換基に対応し、そしてＹ２は、ヒドロキシルまたはアミンである。好ましくは、Ｒ３は、フッ素であり、そしてＹ２は、ヒドロキシルである。
【０１０７】
図１２は、本発明の置換ナフタレン中間体の合成について、３つの別の一般化した合成スキームを示す。図１２で経路Ａとして示す第一の方法では、置換エステルエノレート誘導体３５は、例えば、ＣＯ２の自発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、活性化ホモフタル酸エステル誘導体３６と反応させて、β−ケトエステル誘導体３７が得られる。好ましくは、化合物３５では、Ｒ’は、水素、カルボキシレートまたはハロゲンであり、そしてＲは、低級アルキルである。好ましくは、化合物３６では、ＬＶＧは、ハロゲン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、フェノキシド、ヒドロキシベンゾトリアゾールまたはカルボキシレートである。化合物３７は、次いで、塩基触媒および熱の存在下にて環化されて、置換１，３−ナフタレンジオール３８（すなわち、Ｙ２は、ＯＨである）が得られる。
【０１０８】
図１２にて経路Ｂとして示す第二の好ましい合成方法では、化合物３５は、例えば、ＣＯ２の自発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、活性化フェニルアセテート誘導体３９（ここで、ＬＶＧは、経路Ａにおいて、化合物３６について上で記述のものと同じである）と反応させて、β−ケトエステル誘導体４０が得られる。化合物４０は、次いで、酸触媒および熱の存在下にて環化されて、置換１，３−ナフタレンジオール３８（すなわち、Ｙ２は、ＯＨである）が得られる。
【０１０９】
経路Ｃとして示す第三の好ましい合成方法では、化合物３５は、例えば、ＣＯ２の自発損失により（Ｒ’がカルボキシレートのとき）、シアノフェニルアセテート誘導体４１（ここで、ＬＶＧは、経路Ａにおいて、化合物３６について上で記述のものと同じである）と反応させて、β−ケトエステル誘導体４２が得られる。化合物４２は、次いで、塩基触媒および熱の存在下にて環化されて、置換１−アミノ−３−ヒドロキシナフタレン３８（すなわち、Ｙ２は、ＮＨ２である）が得られる。
【０１１０】
（ＩＩＩ．染料化合物を使用する試薬）
他の局面では、本発明は、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン染料化合物で標識した試薬を包含する。本発明の試薬は、事実上、本発明の染料が結合できるいずれのものでもよい。好ましくは、この染料は、この試薬に共有結合される。試薬には、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、脂質、固体支持体、有機および無機重合体、およびそれらの組合せおよび集合（例えば、染色体、核、生存細胞（例えば、細菌、他の微生物、哺乳類細胞、組織）など）が挙げられる。
【０１１１】
（Ａ．ヌクレオチド試薬）
本発明の好ましい種類の試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を含有するヌクレオチドおよびヌクレオシドを包含する。このようなヌクレオシド試薬は、酵素合成により形成した標識ポリヌクレオチド（例えば、ＰＣＲ増幅、サンガー型ポリヌクレオチド配列決定およびニック翻訳反応の文脈で使用されるヌクレオチド三リン酸）の文脈で、特に有用である。
【０１１２】
本明細書中で使用する「ヌクレオシド」とは、例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ、ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９９２）に記述のように、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシル形態を含めて、その１’位でペントースに結合したプリン、デアザプリンまたはピリミジンヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなど）からなる化合物を意味する。本明細書中で使用する「ヌクレオチド」との用語は、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）を意味し、ここで、最も一般的なエステル化部位は、ペントースのＣ−５位に結合した水酸基である。ヌクレオシドに関する「アナログ」には、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８０）により一般的に記述のように、変性塩基部位および／または変性糖部位を有する合成ヌクレオシドが挙げられる。「標識ヌクレオシド」との用語は、結合を介して式Ｉの染料化合物に共有結合したヌクレオシドを意味する。
【０１１３】
本発明の好ましいヌクレオチドは、式ＩＩＩで以下に示されており、ここで、Ｂは、ヌクレオチド塩基（例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニンおよびデアザグアノシン）である。
【０１１４】
【化３１】
式ＩＩＩ
Ｗ１およびＷ２は、別個に、ＨまたはＯＨである。Ｗ３は、ＯＨ、
【０１１５】
【化３２】
であり、これには、もし存在するなら、会合対イオン（例えば、Ｈ、Ｎａ、ＮＨ４など）が含まれる。Ｄは、式Ｉの染料化合物である。特に好ましい１実施形態では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＩＩ．１に示した構造を有するジデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオンを含めて）。
【０１１６】
【化３３】
式ＩＩＩ．１
式ＩＩＩ．１に示したもののような標識ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型ＤＮＡ配列決定法において、鎖停止剤として、特定の用途が見出されている。第二の特に好ましい実施形態では、本発明のヌクレオチドは、以下の式ＩＩＩ．２に示した構造を有するデオキシヌクレオチド三リン酸である（もし存在するなら、会合対イオンを含めて）。
【０１１７】
【化３４】
式ＩＩＩ．２
式ＩＩＩ．２に示したもののような標識デオキシヌクレオチドは、例えば、ポリメラーゼ鎖反応において、ポリメラーゼ伸長産物を標識する手段として、特定の用途が見出されている。
【０１１８】
Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、プリンまたはデアザプリンのＮ９−位にて結合しており、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、ピリミジンのＮ１−位にて結合している。
【０１１９】
ＢおよびＤを連結している結合は、Ｒ１〜Ｒ９位の１つで、Ｄに結合している。好ましくは、この結合は、Ｒ１〜Ｒ３では結合していない。本発明の染料が、無水トリメリト酸から合成されるなら、Ｒ９は、好ましくは、置換フェニルであり、この結合は、この置換フェニルのＸ３またはＸ４位の１つで、この染料に結合しており、他の位置は、水素原子である。
【０１２０】
Ｂがプリンのとき、ＢおよびＤを結合している結合は、プリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンのとき、結合は、７−デアザプリンの７−位に結合しており、Ｂがピリミジンのとき、結合は、ピリミジンの５−位にて結合している。
【０１２１】
ヌクレオシド標識化は、公知の結合、連結基および関連する相補官能性を用いて、非常に多くの公知のヌクレオシド標識化技術のいずれかを使用して、達成できる。この染料およびヌクレオシドを結合する結合は、（ｉ）オリゴヌクレオチド合成条件に対して安定であり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せず、（ｉｉｉ）適切な酵素（例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなど）と相溶性であり、そして（ｉｖ）この染料の蛍光を消失させてはならない。
【０１２２】
好ましくは、この染料は、ピリミジン塩基の５−炭素および７−デアザプリン塩基の７−炭素に共有結合される。本発明で使用できる数個の適当な塩基標識化操作が報告されている（例えば、
【０１２３】
【表１】
従って、これらの参考文献の内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１２４】
好ましくは、この結合は、アセチレン性アミド結合またはアルケン性アミド結合であり、この染料とヌクレオチド塩基との間の結合は、この染料の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルと、ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルケニルアミノ誘導体化塩基とを反応させることにより、形成される。より好ましくは、得られた結合は、３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピニルまたは３−アミノ−１−プロピン−１−イルである（式ＩＩＩ．３）。本発明の染料をヌクレオシド塩基に結合するための数個の好ましい結合は、式ＩＩＩ．３、式ＩＩＩ．４および式ＩＩＩ．５にて、以下に示す。
【０１２５】
【化３５】
アルキニルアミノ誘導体化ヌクレオシドの合成は、Ｈｏｂｂｓら、ヨーロッパ特許出願第８７３０５８４４．０号およびＨｏｂｂｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４：３４２０（１９８９）に教示され、その内容は、本明細書中で参考として援用されている。要約すると、このアルキニルアミノ誘導体化ヌクレオチドは、適当なハロジデオキシヌクレオシド（通常、Ｈｏｂｂｓら（前出）により教示されるように、５−ヨードピリミジンおよび７−ヨード−７−デアザプリンジデオキシヌクレオシド）およびＣｕ（Ｉ）をフラスコに入れ、アルゴンをフラッシュして空気を取り除き、無水ＤＭＦを添加し、続いて、アルキニルアミン、トリエチルアミンおよびＰｄ（０）を添加することにより、形成される。この反応混合物は、数時間、または薄層クロマトグラフィーがハロジデオキシヌクレオシドの消費を示すまで、撹拌し得る。未保護のアルキニルアミンを使用するとき、このアルキニルアミノヌクレオシドは、この反応混合物を濃縮し、そして水酸化アンモニウムを含有する溶出溶媒を用いてシリカゲル上でクロマトグラフィーにかけて、カップリング反応で生成したヒドロハライドを中和することにより、単離できる。保護アルキニルアミンを使用するとき、この反応混合物には、メタノール／塩化メチレンを添加し得、続いて、重炭酸塩形態の強塩基性アニオン交換樹脂を添加し得る。次いで、このスラリーは、約４５分間撹拌し得、濾過し得、樹脂は、追加のメタノール／塩化メチレンで洗浄し得る。合わせた濾液は濃縮し得、そしてメタノール−塩化メチレン勾配を用いたシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製し得る。トリホスフェートは、標準的な方法により得られる。
【０１２６】
（Ｂ．ホスホロアミダイト試薬）
他の好ましい種類の試薬には、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料を含有するホスホロアミダイト化合物が包含される。このようなホスホロアミダイト試薬は、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料で標識したポリヌクレオチドの自動化化学合成に、特に有用である。このようなホスホロアミダイト化合物は、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの５’−水酸基と反応させたとき、亜リン酸エステルリンカーを形成し、これは、次に、酸化されて、リン酸エステルリンカーが得られる（例えば、米国特許第４，４５８，０６６号および第４，４１５，７３２号；両特許は、本明細書中で参考として援用されている）。
【０１２７】
（１．非ヌクレオチドホスホロアミダイト試薬）：一般に、１局面では、本発明のホスホロアミダイト試薬は、すぐ下の式ＩＶの構造を有する：
【０１２８】
【化３６】
式ＩＶ
ここで、Ｘは、スペーサーアームである；Ｄは、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン染料またはそれらの保護誘導体である；Ｙは、この染料上の連結基を用いて形成した結合である；Ｂ１は、亜リン酸エステル保護基であり、そしてＢ２およびＢ３は、別個に、低級アルキル、低級アルケン、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、アラルキル、または１０個までの炭素原子を含有するシクロアルキルである。式ＩＶで示した非ヌクレオチドホスホロアミダイトは、ヌクレオチドの糖部分を介して、化学的に合成したポリヌクレオチドの５’−末端を標識するのに、特によく適合する。
【０１２９】
スペーサーＸおよび結合Ｙは、種々の形態をとり得るが、しかしながら、構造Ｘ−Ｙは、（ｉ）ＤＮＡ合成条件に対して安定であり、（ｉｉ）オリゴヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨害せず、そして（ｉｉｉ）それが結合する染料の蛍光を消失させてはならない（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号、第５，２５８，５３８号、および第４，７５７，１４１号、第５，２１２，３０４号；全ての特許は、本明細書中で参考として援用されている）。
【０１３０】
好ましくは、Ｘは、線状または環状の低級アルキル、線状または環状の置換低級アルキル、ポリエチレンオキシド、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、ペプチド、またはポリエーテルである。好ましくは、結合Ｙは、アミド、スルホンアミド、尿素、ウレタンまたはチオ尿素である。特に好ましい実施形態では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸは、式ＩＶ．１の以下の構造を有する線状アルキルである：
【０１３１】
【化３７】
式ＩＶ．１
ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より好ましくは、２〜６である。第二の特に好ましい実施形態では、結合Ｙは、アミドであり、そしてスペーサーＸは、式ＩＶ．２で以下に示す構造を有する線状ポリエチレンオキシドである：
【０１３２】
【化３８】
式ＩＶ．２
ここで、ｎは、２〜３０、好ましくは、２〜１０、より好ましくは、２〜６である。
【０１３３】
好ましくは、Ｂ２およびＢ３は、一緒になって、その主鎖に５個までの炭素原子および全体で１０個までの炭素原子を含有するアルキル鎖を形成し、この鎖の両方の末端原子価結合は、窒素原子に結合されている。他方、Ｂ２およびＢ３は、窒素原子と一緒になって、飽和窒素複素環を形成し、これは、窒素、酸素およびイオウからなる群から選択した１個またはそれ以上のヘテロ原子を含有する。好ましくは、Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルであり、そしてＢ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノである。
【０１３４】
Ｂ１は、ホスホロアミダイトが結合したポリヌクレオチドの不要な伸長を防止する亜リン酸エステル保護基である。Ｂ１は、ポリヌクレオチド合成条件に対して安定であるが、このポリヌクレオチドまたは染料の完全性に悪影響を及ぼさない試薬を用いて、このポリヌクレオチド生成物から除去できる。好ましくは、Ｂ１は、メチル、β−シアノエチルまたは４−ニトロフェニルエチルである。Ｂ２およびＢ３は、別個に、イソプロピル、ｔ−ブチル、イソブチルまたはｓｅｃ−ブチルであり、そしてＢ２およびＢ３は、一緒になって、モルホリノである。
【０１３５】
ＹおよびＤを結合する結合は、Ｒ１〜Ｒ９位の１つで、Ｄに結合している。好ましくは、この結合は、Ｒ１〜Ｒ３では結合していない。本発明の染料が、無水トリメリト酸から合成されるとき、Ｒ９は、好ましくは、置換フェニルであり、そして結合は、この置換フェニルのＸ３またはＸ４位の１つで、この染料に結合している。
【０１３６】
このようなホスホロアミダイト化合物は、公知の方法により合成できる。一般に、合成は、以下のように進行する。この染料のフェノール性ヒドロキシルは、ＤＮＡ合成脱保護剤（例えば、アンモニア、エタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：２：１）混合物）で除去できる染料保護基で保護される（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号を参照せよ；その内容は、本明細書中で参考として援用されている）。そのように保護した染料は、この染料の「保護誘導体」と呼ばれる。好ましい保護基には、安息香酸またはピバル酸のエステルが挙げられる。この保護染料の連結基（例えば、カルボン酸）は、次いで、例えば、カルボジイミドで活性化され、そしてＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）または他の非プロトン性溶媒中にて、アルコールリンカー誘導体（例えば、アミノアルコール（例えば、エタノールアミン、ヘキサノールアミンなど））と反応させて、遊離アルコール官能性（例えば、アルコール−アミド誘導体）を有する保護染料が生じる。この遊離アルコールは、次いで、触媒量のテトラゾールジイソプロピルアミンを含有するアセトニトリル中にて、標準操作を用いて、ホスフィチル化剤（例えば、ジ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィン）と反応させて、ホスホロアミダイトが生じる（例えば、米国特許第５，２３１，１９１号）。
【０１３７】
（２．ヌクレオチドホスホルアミダイト試薬）：一般に、第二の局面では、本発明のホスホルアミダイト剤は、すぐ下の式Ｖの構造を有する：
【０１３８】
【化３９】
式Ｖ
ここで、Ｂ１〜Ｂ３は、上で記述のものと同じである。Ｂ５は、水素またはヒドロキシル保護基であり、Ｂは、ヌクレオチド塩基であり、そしてＤは、式Ｉの非対称ベンゾキサンテン染料またはそれらの保護誘導体である。式Ｖのようなヌクレオチドホスホルアミダイトは、化学的に合成したポリヌクレオチドの内部標識化に特によく適合する。
【０１３９】
Ｂがプリンまたは７−デアザプリンのとき、その糖部分は、このプリンまたはデアザプリンのＮ９−位にて結合している。他方、Ｂがピリミジンのとき、その糖部分は、このピリミジンのＮ１−位にて結合している。ＢおよびＤは、連結基およびその相補官能性の反応により形成した結合により結合されており、染料とヌクレオチド塩基との間のこのような結合は、上で詳細に記述されている。Ｂがプリンなら、その結合は、このプリンの８−位に結合しており、Ｂが７−デアザプリンなら、その結合は、この７−デアザプリンの７−位に結合している。Ｂがピリミジンなら、その結合は、このピリミジンの５−位にて結合している。
【０１４０】
Ｂ５は、一般に、水素または酸切断可能なヒドロキシル保護基を表わす。好ましくは、Ｂ５は、トリフェニルメチルラジカルおよびその電子供与性置換した誘導体であり、この場合、本明細書中で使用する「電子供与性」との用語は、それが一部をなす分子内において、近接原子に原子価電子を放出するという置換基の傾向を表わし、すなわち、それは、近接原子に関して、電子的に正である。好ましくは、電子供与性置換基には、アミノ、低級アルキル、１個と８個の間の炭素原子を有する低級アリール、低級アルコキシなどが挙げられる。さらに好ましくは、この電子供与性置換基は、メトキシである。代表的なトリチルには、４，４’−ジメトキシトリチル、すなわち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチルなどが挙げられる。これらのトリチルおよび他のトリチルの結合条件および切断条件は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）に見出される。
【０１４１】
一般に、本発明のヌクレオチドホスホルアミダイトは、以下のようにして合成できる。その５’−ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基およびその塩基上に保護相補的官能性を有するヌクレオシドは、この相補的官能性だけを暴露するように、選択的に脱保護される。次に、（上記のようにして）保護した染料は、連結基をその反応形状に転化することにより、活性化される。この染料の活性化連結基は、次いで、このヌクレオシドの相補的官能性と反応されて、この染料の５’−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する染料標識ヌクレオシドが形成される。この染料標識ヌクレオシドは、次いで、上記のホスフィチル化剤と反応されて、このヌクレオチドホスホルアミダイトが生成される。
【０１４２】
その相補的官能性がアミンでありかつ連結基がカルボキシルである好ましい方法では、この合成は、以下のようにして進行する。その５’−ヒドロキシル上にヒドロキシル保護基（例えば、トリチル基）を有し、その塩基上に保護アミノ−窒素相補的官能性を有する保護ヌクレオシドは、そのアミンを暴露するように選択的に脱保護され、このような選択的脱保護は、その保護５’−ヒドロキシル部分を脱保護することなく、そのアミノ官能性のみを脱保護するように供される。（上記のように）保護した染料は、カルボキシ連結基を、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて、そのＮＨＳエステルに転化することにより、活性化される。このＮＨＳエステルは、このヌクレオシドのアミノ基と反応されて、この染料の５’−ヒドロキシル上（およびＲＮＡの場合には、２’−ヒドロキシル上）およびフェノール基上に保護基を有する染料標識ヌクレオシドが形成される。次いで、この染料標識ヌクレオシドは、上記のホスフィチル化剤と反応される。
【０１４３】
（Ｃ．ポリヌクレオチド試薬）
本発明のさらに他の好ましい種類の試薬には、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料で標識したポリヌクレオチドが包含される。このような標識ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブなどを含めた非常に多くの状況で、有用である。
【０１４４】
本明細書中で使用する用語「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、天然または変性ヌクレオシドモノマーの線状ポリマーを意味し、これには、二本鎖および一本鎖のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、それらのα−アノマー形状などが含まれる。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合により連結されており、本明細書中で使用する用語「ホスホジエステル結合」は、ホスホジエステル結合またはそれらのアナログを意味し、これには、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニリデート、ホスホロアミデートなどが含まれ、これは、会合した対イオンが存在するなら、このような対イオン（Ｈ、ＮＨ４、Ｎａなど）を含む。このポリヌクレオチドの大きさは、数個（例えば、８個〜４０個）のモノマー単位から、数千個のモノマー単位までに及ぶ。ポリヌクレオチドが「ＡＴＧＣＣＴＧ」のような一連の文字で表わされるときは、常に、このヌクレオチドは、他に指示がなければ、５’→３’の順序で左から右に配列されており、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表わし、「Ｃ」は、デオキシシチジンを表わし、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表わし、そして「Ｔ」は、チミジンを表わすことが分かる。
【０１４５】
本発明の標識ポリヌクレオチドには、次式を有するヌクレオチドが挙げられる：
【０１４６】
【化４０】
式ＶＩ
ここで、Ｂは、７−デアザプリン、プリンまたはピリミジンヌクレオチド塩基である。Ｚ１は、ＨまたはＯＨである。Ｚ２は、Ｈ、ＯＨ、ＨＰＯ４およびＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃは、ヌクレオシドまたはポリヌクレオチドを意味する。式ＶＩのヌクレオシドおよびＮｕｃは、ホスホジエステル結合により連結され、この結合は、Ｎｕｃの５’−位に結合している。Ｚ３は、Ｈ、ＨＰＯ３またはＮｕｃであり、ここで、Ｎｕｃおよびこのヌクレオシドは、ホスホジエステル結合により連結されており、この結合は、Ｎｕｃの３’−位に結合している。そしてＤは、式Ｉの染料化合物である。塩基Ｂは、本発明のヌクレオチドホスホルアミダイト試薬について記述のようにして、この糖部分および染料化合物に結合される。ここで定義されるように、式ＶＩの標識ヌクレオチドは、５’−末端ヌクレオチド、３’−末端ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドのいずれかの内部ヌクレオチドであり得る。
【０１４７】
好ましい１実施形態では、本発明の標識ポリヌクレオチドには、供与体染料と受容体染料との間で、蛍光エネルギーの移動が起こるように配置した複数の染料が挙げられる。このような複数染料ポリヌクレオチドは、分光調整可能な配列決定プライマーとして（例えば、Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：４３４７〜４３５１（１９９５））およびハイブリダイゼーションプローブとして（例えば、Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１：３７６１〜３７６６（１９９３））、用途が見出されている。
【０１４８】
標識ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはリガーゼを用いて、酵素的に合成するか（例えば、Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ ２４、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９８１））または例えば、ホスホルアミダイト法、亜リン酸トリエステル法などによる化学合成によるか（例えば、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））いずれかにより、合成できる。標識は、上記の標識ヌクレオチド三リン酸モノマーを使用して、酵素合成中に導入してもよく、または上記の標識非ヌクレオチドまたはヌクレオチドホスホルアミダイトを用いて、化学合成中に導入してもよく、または合成に引き続いて導入してもよい。
【０１４９】
一般に、この標識ポリヌクレオチドが、酵素合成により製造されるなら、以下の操作が使用できる。テンプレートＤＮＡが変性され、このテンプレートＤＮＡに、オリゴヌクレオチドプライマーがアニールされる。この反応系に、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰを含めて）が添加され、この場合、このデオキシヌクレオチドの１個の少なくとも断片は、上記の本発明の染料化合物で標識される。次に、ポリメラーゼ酵素が活性である条件下にて、ポリメラーゼ酵素は活性である。ポリメラーゼ鎖合成中に、この標識デオキシヌクレオチドの混入により、標識ポリヌクレオチドが形成される。別の酵素的合成法では、１個のプライマーの代わりに２個のプライマーが使用され、１個のプライマーは、この標的の＋（プラス）鎖に相補的であり、他は、この標的の−（マイナス）鎖に相補的であり、このポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼであり、その反応温度は、変性温度と延長温度の間で反復され、それにより、ＰＣＲによって、標識成分が標的配列へと急激に合成される（例えば、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））。
【０１５０】
標識ポリヌクレオチドは、ホスホルアミダイト法を用いて、化学的に合成できる。このホスホルアミダイト法によりポリヌクレオチドを形成するのに使用される化学の詳細な説明は、例えば、
【０１５１】
【表２】
に提供されている。従って、これらの参考文献の各内容は、本明細書中で参考として援用されている。
【０１５２】
ポリヌクレオチド合成のホスホルアミダイト法は、その効率および急速なカップリングおよび出発物質の安定性のために、好ましい方法である。この合成は、固体支持体に結合した成長ポリヌクレオチド鎖を用いて行われ、その結果、過剰の試薬は、液相にあるので、濾過により容易に除去でき、それにより、サイクル間の精製工程の必要性がなくなる。
【０１５３】
以下は、このホスホルアミダイト法を用いる、典型的なポリヌクレオチド合成サイクルの工程を簡単に記述する。まず、保護ヌクレオチドモノマーを含めた固体支持体は、酸（例えば、トリクロロ酢酸）で処理されて、５’−ヒドロキシル保護基が除去され、このヒドロキシルは、引き続くカップリング反応のために、遊離される。次いで、この反応系に、保護ホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーおよび弱酸（例えば、テトラゾール）を同時に添加することにより、活性化中間体が形成される。この弱酸は、このホスホルアミダイトの窒素にプロトンを付加して、反応性中間体を形成する。ヌクレオシド付加は、３０秒以内に完結する。次に、ヌクレオシド付加を受けなかったいずれかのポリヌクレオチド鎖を停止するキャップ化工程が行なわれる。キャップ化は、好ましくは、無水酢酸および１−メチルイミダゾールを用いて行われる。このインターヌクレオチド結合は、次いで、好ましい酸化剤としてのヨウ化物および酸素供与体としての水を用いる酸化により、この亜リン酸エステルから、より安定なホスホジエステルに転化される。酸化後、このヒドロキシル保護基は、プロトン酸（例えば、トリクロロ酢酸またはジクロロ酢酸）で除去され、このサイクルは、鎖の延長が完結するまで、繰り返される。合成後、このポリヌクレオチド鎖は、塩基（例えば、水酸化アンモニウムまたはｔ−ブチルアミン）を用いて、この支持体から切断される。この切断反応はまた、いずれのリン酸エステル保護基（例えば、シアノエチル）も除去する。最後に、この塩基の環外アミン上の保護基およびこの染料上のヒドロキシル保護基は、塩基中にて、このポリヌクレオチド溶液を高温（例えば、５５℃）で処理することにより、除去される。
【０１５４】
このホスホルアミダイトヌクレオシドモノマーのいずれかは、上記の染料標識したホスホルアミダイトであり得る。このヌクレオチドの５’−末端位置が標識されているなら、この最終縮合工程中に、本発明の標識した非ヌクレオチドホスホルアミダイトを使用してもよい。このオリゴヌクレオチドの内部位置が標識されるなら、いずれかの縮合工程中に、本発明の標識ヌクレオチドホスホルアミダイトが使用できる。
【０１５５】
合成に引き続いて、このポリヌクレオチドは、非常に多くの位置で標識でき、これらの位置には、５’−末端（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ編、Ｃｈａｐｔｅｒ ８、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）およびＯｒｇｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１（１８）：６５１３（１９８３）；米国特許第５，１１８，８００号；これらの内容は、本明細書中で参考として援用されている）；ホスホジエステル骨格（例えば、同書、Ｃｈａｐｔｅｒ ９）；３’−末端（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０（２３）：６２５３−６２５９、および米国特許第５，４０１，８３７号および第５，１４１，８１３号；両方の特許の内容は、本明細書中で参考として援用されている）が含まれる。オリゴヌクレオチド標識化操作の総説については、Ｒ．Ｈａｕｇｌａｎｄ ｉｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、Ｓｔｅｉｎｅｒ編、Ｐｌｅｍｕｍ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８３）を参照のこと。
【０１５６】
１つの好ましい合成後化学標識化法では、オリゴヌクレオチドは、以下のようにして標識化される。カルボキシ連結基を含む染料は、無水酢酸エチル中にて、室温で３時間にわたり、およそ１当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびおよそ３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、そのｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転化される。この反応混合物は、５％ ＨＣｌで洗浄され、硫酸マグネシウムで乾燥され、濾過され、そして固形物になるまで濃縮され、この固形物は、ＤＭＳＯに再懸濁される。このＤＭＳＯ染料ストックは、次いで、過剰で（１０〜２０倍）、ｐＨ ９．４にて、０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中のアミノヘキシル誘導体化オリゴヌクレオチドに添加され、そして６時間反応される（例えば、米国特許第４，７５７，１４１号）。この染料標識したオリゴヌクレオチドは、緩衝液（例えば、０．１Ｍトリエチルアミン酢酸塩（ＴＥＡＡ））で溶出するサイズ排除クロマトグラフィーカラムに通すことにより、未反応染料から分離される。この粗標識オリゴヌクレオチドを含有する画分は、勾配溶離液を使用する逆相ＨＰＬＣにより、さらに精製される。
（ＩＶ．本発明の化合物および試薬を使用する方法）
本発明の染料および試薬は、蛍光検出を使用するいずれかの方法（特に、複数の空間的に重複した分析物の同時検出を必要とする方法）によく適合される。本発明の染料および試薬は、生化学分離操作（例えば、電気泳動）を受けるポリヌクレオチドの種類を同定するのに、特によく適合され、この場合、類似の物理化学的特性（例えば、サイズ、コンホメーション、電荷、疎水性など）を有する標的物質のバンドまたはスポットが、線状または平面状の配列において存在する。ここで使用する「バンド」との用語は、類似のまたは同一の物理化学的な特性を基準にして、いずれかの空間的な配置または集塊を含む。通常、バンドは、染料−ポリヌクレオチド複合体の電気泳動による分離において、生じる。
【０１５７】
ポリヌクレオチドの分類は、種々の状況において生じ得る。「フラグメント解析」法または「遺伝解析」法と呼ぶ好ましいカテゴリーの方法では、標識プライマーまたはヌクレオチドを用いたテンプレート定方向酵素的合成（例えば、結合またはポリメラーゼ定方向プライマー伸長による）により、標識ポリヌクレオチド断片が生じる。これらの断片は、サイズ依存性分離プロセス（例えば、電気泳動またはクロマトグラフィー）にかけられる。分離した断片は、この分離に引き続いて、例えば、レーザー誘発した蛍光により、検出される。特に好ましい実施形態では、複数の種類のポリヌクレオチドが同時に分離され、異なる種類のものは、分光学的に分析可能な標識により、識別される。
【０１５８】
このようなフラグメント解析の１方法は、増幅断片長多型検出（ＡｍｐＦＬＰ）として知られているが、ＰＣＲにより増幅した増幅断片長の多型現象（すなわち、制限断片長の多型現象）に基づいている。種々のサイズのこれらの増幅断片は、系統による次の突然変異遺伝子のための連結マーカーとして役立つ。増幅断片が、染色体上の突然変異遺伝子に近づくほど、この結合の相関が高くなる。多く遺伝的疾患に対する遺伝子は、同定されていないので、これらの結合マーカーは、疾患のリスクまたは起源を評価するのに役立つ。このＡｍｐＦＬＰ方法では、このポリヌクレオチドは、標識ポリヌクレオチドＰＣＲプライマーを用いることにより、またはＰＣＲ中の標識ヌクレオチド三リン酸を使用することにより、標識できる。
【０１５９】
ニック（ｎｉｃｋ）翻訳として知られているような他のフラグメント解析では、二本鎖ＤＮＡ分子内の未標識ヌクレオシド三リン酸を標識したものに置き換えるために、反応が使用される。デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮＡａｓｅＩ）処理により生じる「ニック」によって、未標識ＤＮＡ内に、遊離の３’−水酸基が作られる。ＤＮＡポリメラーゼＩは、次いで、このニックの３’−ヒドロキシル末端への標識ヌクレオチドの付加を触媒する。同時に、この酵素の５’−〜３’−エクソヌクレアーゼ活性は、このニックの５’−ホスホリル末端からこのヌクレオチド単位を取り除く。最初に切開したヌクレオチドの位置には、遊離の３’−ＯＨを有する新しいヌクレオチドが取り込まれ、このニックは、３’方向に沿って、１ヌクレオチド単位だけシフトする。この３’シフトの結果、既存の未標識ヌクレオチドの除去を伴って、新しく標識したヌクレオチドのＤＮＡへの連続付加が生じる。このニック翻訳したポリヌクレオチドは、次いで、分離プロセス（例えば、電気泳動）を用いて分析される。
【０１６０】
他の代表的なフラグメント解析法は、可変数のタンデム繰り返し、すなわち、ＶＮＴＲを基準にしている。ＶＮＴＲは、特定の配列の隣接した複数コピーを含有する二本鎖ＤＮＡの領域であり、繰り返し単位の数は、可変である。ＶＮＴＲ遺伝子座の例には、ｐＹＮＺ２２、ｐＭＣＴ１１８およびＡｐｏ Ｂがある。ＶＮＴＲ法のサブセットには、微小サテライト繰り返しまたは短タンデム繰り返し（ＳＴＲ）、すなわち、短い（２個〜４個の塩基）繰り返し配列により特徴付けられるＤＮＡのタンデム繰り返しの検出を基準にしている。ヒトにて最も豊富に点在した繰り返しＤＮＡファミリーの１つには、（ｄＣ−ｄＡ）ｎ−（ｄＧ−ｄＴ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリー（これはまた、（ＣＡ）ｎジヌクレオチド繰り返しファミリーとも呼ばれる）である。ヒトのゲノムには、５０，０００個〜１００，０００個程度の（ＣＡ）ｎ繰り返し領域があると考えられ、典型的には、１ブロックあたり、１５個〜３０個の繰り返しを有する。これらの繰り返し領域の多くは、長さが多様であり、従って、有用な遺伝子マーカーとして供され得る。好ましくは、ＶＮＴＲ法またはＳＴＲ法では、染料標識ＰＣＲプライマーを用いることにより、ポリヌクレオチド断片に標識が導入される。
【０１６１】
特に好ましいフラグメント解析法では、本発明に従って確認した種類のものは、４個の可能な末端塩基と分光学的に分析可能な染料のセットのメンバーとの間で、対応が確立されるように、末端ヌクレオチドによって規定される。このようなセットは、市販の分光光度計を用いて、発光および吸収バンド幅を測定することにより、本発明の染料から容易に組み立てられる。さらに好ましくは、ＤＮＡ配列決定の化学的方法または鎖停止法の状況にて、種類が生じ、最も好ましくは、この鎖停止法、すなわち、ジデオキシＤＮＡ配列決定またはサンガー配列決定の状況において、種類が生じる。この方法は、配列が決定されるべき一本鎖または二本鎖ＤＮＡテンプレートを用いた、インビボでのＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を包含する。合成は、このテンプレートにオリゴヌクレオチドプライマーがアニールする１個の部位だけで、開始される。この合成反応は、連続ＤＮＡ伸長を支持しないヌクレオチド類似物の含入により、停止される。この鎖停止ヌクレオチド類似物には、２’，３’−ジデオキシヌクレオシド５’−三リン酸（ｄｄＮＴＰ）があり、これは、３’から５’へのＤＮＡ鎖の伸長に必要な３’−ＯＨ基がない。適切な割合のｄＮＴＰ（２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸）および４個のｄｄＮＴＰの１個を使用すると、酵素触媒した重合は、このｄｄＮＴＰが含入できる各部位で、鎖集団の断片において、停止される。各反応に対して、標識プライマーまたは標識ｄｄＮＴＰを使用するなら、この配列情報は、高分解能電気泳動による分離後、蛍光により検出できる。この鎖停止法では、本発明の染料は、配列決定プライマーまたはジデオキシヌクレオチドのいずれかに結合できる。染料は、例えば、Ｆｕｎｇら、米国特許第４，７５７，１４１号（その内容は、本明細書中で参考として援用されている）での教示に従って、このプライマーの５’末端にて；プライマーの塩基にて；または例えば、Ｈｏｂｂｓら、ヨーロッパ特許出願第８７３０５８４４．０号（その内容は上述され、本明細書中で参考として援用されている）に開示のアルキニルアミノ連結基を介して、ジデオキシヌクレオチドの塩基にて、相補的官能基と連結できる。
【０１６２】
上記フラグメント解析法のそれぞれでは、標識ポリヌクレオチドは、好ましくは、電気泳動操作により、分離される（例えば、
【０１６３】
【表３】
好ましくは、電気泳動マトリックスのタイプは、約２〜２０重量％の間の濃度（重量対容量）を有する架橋または非架橋ポリアクリルアミドである。さらに好ましくは、このポリアクリルアミド濃度は、約４〜８重量％の間である。好ましくは、ＤＮＡ配列決定の状況では、特に、この電気泳動マトリックスは、鎖分離または変性剤（例えば、尿素、ホルムアミドなど）を含有する。このようなマトリックスを構築する詳細な操作は、
【０１６４】
【表４】
により示されている。従って、これらの参考文献の内容は、本明細書中で参考として援用されている。特定の分離における最適なポリマー濃度、ｐＨ、温度、使用する変性剤の濃度などは、多くの要因に依存し、これらには、分離されるべき核酸のサイズ範囲、それらの塩基組成、それらが一本鎖か二本鎖か、およびその情報が電気泳動により追究される分類の性質が含まれる。従って、本発明の適用には、特定の分離のための条件を最適化する標準予備試験が必要な場合がある。例によれば、約２０個〜３００個の間の塩基範囲のサイズのオリゴヌクレオチドは、以下のマトリックスにおいて、本発明に従って分離され、そして検出される：１９部：１部のアクリルアミド：ビスアクリルアミドから製造した６％ポリアクリルアミドであって、ｐＨ ８．３のトリス−ボレートＥＤＴＡ緩衝液中で形成したもの。
【０１６５】
電気泳動分離に引き続いて、染料−ポリヌクレオチド複合体は、この染料標識ポリヌクレオチドからの蛍光発光を測定することにより、検出される。このような検出を行うために、この標識ポリヌクレオチドは、標準的な手段、例えば、高強度水銀蒸気ランプ、レーザーなどにより照射される。好ましくは、この照射手段は、４８８ｎｍと５５０ｎｍの間の波長の照射ビームを有するレーザーである。さらに好ましくは、この染料−ポリヌクレオチドは、アルゴンイオンレーザー（特に、４８８ｎｍおよび５１４ｎｍの発光系列のアルゴンイオンレーザー）、または５３２ｎｍの発光系列のネオジム固相ＹＡＧレーザーにより発生したレーザー光によって、照射される。いくつかのアルゴンイオンレーザーが市販されており、これらは、これらの系列で、同時にレーザーとして使える（例えば、Ｃｙｏｎｉｃｓ、Ｌｔｄ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、Ｃａｌｉｆ．）のＭｏｄｅｌ ２００１など）。次いで、光感受性検出器（例えば、光電子増倍管、荷電結合素子など）により、その蛍光が検出される。
【実施例】
【０１６６】
本発明は、以下の実施例を考慮することにより、さらに明確となるが、これらの実施例は、単に、本発明の例示であることを意図し、いずれの点でも、本発明の範囲を限定しない。
【０１６７】
他に指示がなければ、全てのケミカルは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から入手し、購入した状態で使用した。３−フルオロレゾルシノール（１１ａ）は、文献の操作（Ｐｅｒｋｉｎ、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１０：１６５８−１６６６ （１９８０））に従って、２，４−ジメトキシアニリンから合成した。２−クロロ−４−メトキシレゾルシノール（１１ｃ）は、米国特許第４，３１８，８４６号に従って、３−ヒドロキシ−４−メトキシベンズアルデヒドから合成した。３，６−ジクロロトリメリト酸は、米国特許第４，３１８，８４６号に従って合成し、そして純粋な無水酢酸中で４時間還流してその冷却混合物をジエチルエーテルで沈殿させることにより、その無水物１０ａに転化した。フルオロマロン酸水素エチルは、文献（Ｏｒｇ． Ｓｙｎ． Ｃｏｌｌ． ４：４１７−４１９ （１９６３））に従って、フルオロマロン酸ジエチルから合成した。トリブチルホスホニウム−フルオロ酢酸エチル（１９）は、文献（Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ． ３０：６１１３（１９８０））に従って、合成した。２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）は、本明細書開示に記述のようにして、合成した。乾燥ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）は、使用前に、水素化カルシウム上で蒸留し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）は、水素化アルミニウムリチウム（ＬＡＨ）上で蒸留した。無水エタノールは、購入した状態で使用するか、またはナトリウム上の蒸留により乾燥し、そして活性化モレキュラーシーブ上で保存した。乾燥酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）は、ＭｇＳＯ４で予備乾燥した後、Ｐ２Ｏ５上で蒸留した。乾燥ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、硫酸マグネシウムで予備乾燥した後、蒸留し、そして活性化モレキュラーシーブ上で保存した。全ての反応は、乾燥アルゴン下にて、無水条件で行った。反応は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（シリカゲル６０、Ａ２５４）によりモニターした。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル６０（２００〜４００メッシュ、Ｂａｘｔｅｒ）上で行った。「１」および「２」で明示される純粋な異性体を得るための非対称ベンゾキサンテン染料の最終精製は、シリカゲル６０ ＰＴＬＣプレート（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上の予備ＴＬＣでＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（７：３：０．１）で溶出して行った。純粋な染料異性体は、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ（７：３：０．１）を使用してＴＬＣ上に単一斑点を作り、そして短波長および長波長ＵＶ照射で視覚化することにより、同定した。異性体２は、通常媒体および逆層媒体の両方でより遅く処理した。中間体生成物は、Ｖａｒｉａｎ ３００ ＭＨｚ ＮＭＲによる１ＨＮＭＲスペクトルにより同定した。精製した染料の吸収スペクトルは、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ８４５１Ａダイオードアレイ分光光度計で記録し、蛍光発光スペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ ５０−Ｂ発光分光光度計で記録した。染料標識オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ精製は、２チャンネルのＰＥ １０２２積分計に接続されたＰＥＬＣ ２４０蛍光検出器およびＰＥＬＣ ２９５ ＵＶ／ＶＩＳ検出器に接続されたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ２００シリーズのポンプで行った。染料標識オリゴヌクレオチドの精製および同定に使用される緩衝液は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン／ＥＤＴＡ（ＴＥ）、トリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）が挙げられる。緩衝液は、１０倍溶液として０℃で保存し、そして使用前に新しく希釈する。ＨＰＬＣ精製は、逆相ＲＰ−１８カラムを使用した。
【０１６８】
（実施例１）
（非対称ベンゾキサンテンの合成）
１，３−ジヒドロキシナフタレン誘導体（例えば、１，３−ジヒドロキシナフタレン９ｂまたは２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン９ａ）（０．２モル）と、１．１当量の無水フタル酸誘導体３，６−ジクロロトリメリト酸無水物１０ａおよび１当量のレゾルシノール誘導体１１（０．２モル）、（所望の最終生成物によって１１ａ、１１ｂ、１１ｃまたは１１ｄ）とを反応させることにより、図２Ａおよび２Ｂの化合物１〜７を合成し、そしてアルゴン下、１１０℃で、純粋なＭｅＳＯ３Ｈ（３ｍｌ）中１６時間加熱した。この粗染料（１０ａを使用する反応における位置（ｒｅｇｉｏ）異性体の混合物）を、氷／水混合物への添加により沈殿させ、そして濾過により単離した。この粗染料を、ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ：酢酸（７０：３０：１）の混合物で溶出する調製薄層クロマトグラフィーにより、２種の異性体１および２に精製した。
【０１６９】
図２Ｂの差込図は、染料５の異性体２について示した非対称ベンゾキサンテン染料のＲ２および／またはＲ３が非置換の（Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ）誘導体が、さらに、ハロゲン化試薬（ＮａＯＣｌ、ＮａＯＨ／Ｂｒ２、ＮａＯＨ／Ｉ２）と０℃で３時間、反応し、続いて１０％ ＨＣｌ／ＥｔＯＡｃでの抽出処理、Ｎａ２ＳＯ４での乾燥、濾過および真空中での濃縮で、そのハロゲン化誘導体（例えば、８（Ｒ２＝Ｒ３＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ））を定量的に生成することを示している。
【０１７０】
（実施例２）
（染料標識オリゴヌクレオチドの合成）
本発明の染料標識オリゴヌクレオチドの合成を、図３を参照して記述する。Ｃｌ−ＦＬＡＮ、染料２を、乾燥酢酸エチル中にて、室温で３時間にわたって、１．２当量の１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび３当量のｎ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させることにより、そのｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル１２に転化した。この反応混合物を５％ ＨＣｌで洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、そして固形物になるまで濃縮し、これを、ＤＭＳＯ中に再懸濁した（１０ｍｇの染料／５０μＬのＤＭＳＯ）。このＤＭＳＯ染料ストック（５〜１０μＬ）を、ｐＨ ９．４にて、０．２５Ｍ重炭酸塩／炭酸塩緩衝液中、アミノヘキシル誘導化−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドプライマー（１×１０−３Ｍ）に、過剰に（１０〜２０倍）添加し、そして６時間反応させた。アミノヘキシル誘導化プライマーは、最終サイクルにＡｍｉｎｏｌｉｎｋ−２を用いた自動固相ＤＮＡ合成により、調製した（ＰＥ ｐ／ｎ ４００８０８）。染料標識オリゴヌクレオチドは、０．１モルのトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）で溶出するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラムに通すことにより、未反応染料から分離した。粗標識オリゴヌクレオチドを含有するフラクションは、ＲＰ−１８クロマトグラフィーカラムを用い、２５分間かけて、０．１ Ｍ ＴＥＡＡ中８％〜２５％ ＡｃＣＮの勾配溶出を使用した逆相ＨＰＬＣにより、精製した。この純粋な染料標識オリゴヌクレオチド１３は、凍結乾燥で固形物にし、そして１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）に再懸濁した。この染料標識オリゴヌクレオチドの濃度は、添加物根絶係数（ａｄｄｉｔｉｖｅ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）がＴに対して６，６５０、Ｃに対して７，３５０、Ｇに対して１１，７５０およびＡに対して１４，９００であると仮定して、２６０ｎｍでのＵＶ吸収により決定し、２６０ｎｍでの染料吸収の相対寄与を、同じ緩衝液中で測定した遊離染料のスペクトルから決定した。
【０１７１】
（実施例３）
（実施例２のＴＡＭＰＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの励起スペクトルの比較）
１×ＴＢＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で各染料について、励起スペクトルを記録した。染料は、等モル濃度（約１×１０−６Ｍ）で存在していた。各染料について、その発光強度を、λｍａｘＥｍで記録した。図４は、４８８ｎｍでの励起について、Ｃｌ−ＦＬＡＮの相対励起効率は、ＴＡＭＲＡ染料のそれのおよそ２．５倍であるのに対して、５１４ｎｍでの励起については、Ｃｌ−ＦＬＡＮの相対励起効率は、ＴＡＭＲＡ染料のそれのおよそ１．５倍であることを示している。
【０１７２】
（実施例４）
（実施例２のＴＡＭＲＡ（２２）およびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの量子収率の比較）
図５は、各染料の吸収最大で励起したＴＡＭＲＡ（２２）標識−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドおよびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識−２１Ｍ１３オリゴヌクレオチドの蛍光発光強度の発光スペクトルを示す。オリゴヌクレオチドは実施例２中のように調製された。このデータは、ＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドと比較して、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドでは６０％より多い量子収率を示している。スペクトルは、各標識オリゴヌクレオチドについて、同じλｍａｘＡｂｓ（０．０５）となる濃度で、１×ＴＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で記録した。発光スペクトルは、各染料のλｍａｘＡｂｓでの照射により、各染料について記録した。
【０１７３】
（実施例５）
（Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）およびＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドのモル発光強度の比較）
１×ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶解した等モル濃度（約１×１０−６Ｍ）のＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドおよびＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの発光スペクトルを、各オリゴヌクレオチドを４８８ｎｍおよび５１４ｎｍで照射し、そしてこのスペクトルに付加することにより測定し、複数ラインのアルゴンレーザーの照射を概算した。図６は、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの蛍光強度が、ＴＡＭＲＡ（２２）標識オリゴヌクレオチドの蛍光強度の２倍以上であることを明らかにしている。
【０１７４】
（実施例６）
（多重染料標識オリゴヌクレオチドセット）
Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチド−２１Ｍ１３配列プライマーの長波長蛍光発光を、６−ＦＡＭ、ＴＥＴおよびＨＥＸ ２３染料で標識した−２１Ｍ１３配列プライマーからの発光と比較した。ここで、６−ＦＡＭは、６−カルボキシフルオレセインを示し、「ＴＥＴ」は、６−カルボキシ−４，７，２’，７’−テトラクロロフルオレセインを示し、そして「ＨＥＸ」は、６−カルボキシ−４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロフルオレセインを示す。上記の実施例２のように、プライマーを標識した。その励起波長は４９０ｎｍであった。発光スペクトルは、１×ＴＥ緩衝液中ｐＨ ８．４で測定し、そして同じ強度（約１×１０−６Ｍ）に規格化した。図７は、このＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドの発光スペクトルの５７３ｎｍ発光最大ピークおよび狭い幅によって、このＣｌ−ＦＬＡＮ（２）標識オリゴヌクレオチドが、このセット内の他の３種の染料の発光スペクトルから、スペクトル的に分離されていることを示す。このスペクトルの分離は、ＦＡＭ、ＴＥＴおよびＨＥＸ標識オリゴヌクレオチドを含む染料セットのＣｌ−ＦＬＡＮ（２）非対称ベンゾキサンテン染料との適合を示している。
【０１７５】
（実施例７）
（２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン中間体の合成）
図８参照。市販の無水ホモフタル酸（１４）（１００ｇｍ）を、酸触媒下（ＴＦＡ ０．５ｍＬ）、エタノール（３００ｍＬ）と反応させ、還流３時間、固形物への濃縮およびトルエンから再結晶し、中間体エチルエステル１５（収率９５％）を生成した。次いで、中間体１５（１０ｇｍ）を、１．１当量の塩化オキサリルとＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）中、室温で４時間、反応させ、高真空下、室温で濃縮し、粗固形物として、酸塩化物１６（収率８０％）を生成した。粗生成物１６をＴＨＦ中に懸濁させ、そして以下の二つの方法のいずれかにより、フルオロ酢酸エステル等価物と反応させて、化合物２０を生成した。
【０１７６】
方法Ａ：フルオロ酢酸エチルのカリウム塩（１７）（３当量）（ＴＨＦ中、０℃で、フルオロ酢酸エチルおよびカリウムｔ−ブトキシドの反応により生成）またはフルオロマロン酸水素エチルのマグネシウム塩（１８）（１．５当量）（−６０℃で、臭化イソプロピルマグネシウム（２当量）およびフルオロマロン酸水素エチルの反応により生成）を１６のＴＨＦ懸濁液に徐々に添加し、そして０℃で６時間反応させた。反応系を、５％ ＨＣｌの添加によりクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出し（３回）、有機層を乾燥し、濃縮し、そして得られた粗混合物を、ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２６：４〜ＣＨ２Ｃｌ２ １００％の勾配溶出液を使用したフラッシュクロマトグラフィーにより精製し、化合物２０（収率３５〜５０％）を得た。
【０１７７】
方法Ｂ：リンイリド１９を、−７０℃で、１６のＴＨＦ懸濁液に徐々に添加し、次いで、室温まで暖め、そして１６時間反応させた。この反応系を、５％ ＮａＨＣＯ３の添加によりクエンチし、そして６時間撹拌した。この反応系をＴＨＦ／水で抽出し（３回）、そして生成物を方法Ａと同様に単離して、中間体２０（収率＞５０％）を生成した。精製した２０を、塩基触媒下（ＮａＯＥｔ ２当量）、分子内環化して、環状中間体２１を得、これを、インサイチュで脱カルボキシル化して、２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）（収率５０％）を得た。他方、この環状中間体２１は、ＴＨＦ中、カリウムｔ−ブトキシドを使用すると、単離でき（収率＞８０％）、そして２−フルオロ−１，３−ジヒドロキシナフタレン（９ａ）に脱カルボキシル化できる。
【０１７８】
（実施例８）
（非対称ベンゾキサンテン化合物２を使用したＤＮＡ配列決定）
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃａｔａｌｙｓｔ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓｔａｔｉｏｎ（Ｔｈｅ Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ（ＰＥ））を用いて、自動サイクル配列決定を行った。以下に記載のように６−ＦＡＭ（Ｃ末端停止剤）、ＴＥＴ（Ａ末端停止剤）、ＨＥＸ（Ｇ末端停止剤）またはＣｌ−ＦＬＡＮ
２（Ｔ末端停止剤）で標識した同一の−２１ Ｍ１３プライマーを使用し、４個の別個のサンガー配列決定反応を行った。４個の反応物の混合物を充填しＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３７７ ＤＮＡ配列決定器および付随のデータ分析ソフトウェアにより、データを得た。
【０１７９】
サイクル配列決定反応は、３．０２プラットホームソフトウェアを用いたＣａｔａｌｙｓｔ ８００ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓｔａｔｉｏｎで行った。このＣａｔａｌｙｓｔは、１００ｎｇ／μＬの濃度でｐＧＥＭ
３Ｚ＋テンプレートＤＮＡ ０．６μＬ、および以下で規定したプレミックス
１．９μＬを分配するように、プログラム化した。配列決定データは、５％のＬｏｎｇ
Ｒａｎｇｅｒゲル（ＦＭＣ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ）を用いて、ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ３７７ ＤＮＡ配列決定器で作成した。４個の配列決定プレミックスのそれぞれは、表Ｉで、以下に規定される。
【０１８０】
【表５】
サイクル配列決定は、上記のテンプレートおよびプレミックスの混合物で行った。このＣａｔａｌｙｓｔのサイクル条件は、以下のようであった：９６℃で２０秒間の１サイクル；９４℃で２０秒間、５５℃で４０秒間および６８℃で６０秒間の１５サイクル；および９４℃で２０秒間および６８℃で６０秒間の１５サイクル。
【０１８１】
熱サイクルに続いて、４個の別個の反応物を濃厚緩衝液（８３％ ＤＭＳＯ／２５ｍＭ
ＥＤＴＡ／８ｍｇ／ｍｌ Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ）中で混合し、そして標準Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌｏａｄ法（ｖ ２．０２ Ｃａｔａｌｙｓｔ Ｍａｎｎｕａｌ、ＰＥ）を用いて濃縮した。濃縮試料２ｍＬを、３７７配列決定器のウェルに充填し、操作し、そしてｖｅｒｓｉｏｎ １．１ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて分析した。塩基２３３と２６３との間の配列を、図９に示す。
【０１８２】
（実施例９）
（Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）、ＨＥＸおよびＴＥＴ標識プライマーを用いて標識し、ＲＯＸ標識内部サイズ標準で同時に分離したマイクロサテライトフラグメント）
染料標識プライマーを用いたヒトＣＥＰＨ族ＤＮＡの４個の座のＰＣＲ反応を、以下に記載するように行った。これらのＰＣＲ生成物をプールし、そしてＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ＴＭ ＤＮＡ配列決定器（ＰＥ）にて、電気泳動で分離した。各染料標識フラグメントピークの独特の蛍光シグナルを、ＧｅｎｅＳｃａｎＴＭ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ． ２．０．２（ＰＥ）を用いて分析した。図１０を参照すると、赤色のピーク（Ｒと表示）は、ＲＯＸ（２６）標識した内部標準フラグメントに対応し、青色のピーク（Ｂと表示）は、ＴＥＴ標識フラグメントに対応し、緑色のピーク（Ｇと表示）は、ＨＥＸ標識フラグメントに対応し、そして黒色のピーク（Ｋと表示）は、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）標識フラグメントに対応する。
【０１８３】
これらのＰＣＲ反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラー（ＰＥ）で行った。以下のカクテルを使用して、各染料標識プライマーについて、別の反応を行った：
【０１８４】
【表６】
これらの混合物を、以下のサイクル条件を用いて、増幅した：９５℃で５分間の１サイクル；９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間および７２℃で３０秒間の１０サイクル；８９℃で１５秒間、５５℃で１５秒間および７２℃で３０秒間の２０サイクル；および７２℃で１０分間の１サイクル。
【０１８５】
これらの増幅ＰＣＲ生成物を、Ｃｌ−ＦＬＡＮ（２）およびＴＥＴ標識ＰＣＲ生成物（０．５μＬ）を各ＨＥＸ標識ＰＣＲ生成物１．０μＬと混合することによりプールし全体の比がＣｌ−ＦＬＡＮ：ＨＥＸ：ＴＥＸ（１：２：１）からなる混合染料標識フラグメントを得た。プールしたＰＣＲフラグメントを、ホルムアミド２．５μＬ、Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ（５０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍＬ Ｂｌｕｅ Ｄｅｘｔｒａｎ）０．５μＬのおよびＳｉｚｅ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＧＳ−３５０ ＲＯＸ、ＰＥ ｐ／ｎ ４０１７３５）０．５μＬからなる充填カクテルと混合した。プールした混合物を９５℃で５分間変性し、次いで、ＰＥ ＡＢＩ ＰｒｉｓｍＴＭ ３７７ ＤＮＡ配列決定器の１ゲル列に充填した。これらのフラグメントを電気泳動で分離し、そして以下の特性を有するアクリルアミドゲルを用いて検出した：厚さ０．２０ｍｍ、アクリルアミド４．２５％（ｗｔ）、アクリルアミド／ビスアクリルアミド１９：１（ｗｔ／ｗｔ）、３４ウェルの四角い目の細かい篩、１０ＸＴＢＥ緩衝液（Ｔｒｉｓ ８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＥＤＴＡ ２ｍＭ）（ｐＨ ８．３）。この器具は、Ｆｉｌｔｅｒ Ｗｈｅｅｌ ＡおよびＧＳ
３６Ｄ−２４００ Ｍｏｄｕｌｅ（これは、以下の操作パラメーターを有する）を用いて操作した：ＥＰ電圧 ３０００ Ｖ、ＥＰ電流６０．０ｍＡ、ＥＰ電力２００Ｗ、ゲル温度５１℃およびレーザー出力４０ｍＷ。
【０１８６】
（実施例１０）
（本発明のローダミン染料、キサンテン染料および非対称キサンテン染料のスペクトル特性、光安定性および化学安定性の比較）
以下の表ＩＩは、本発明の非対称ベンゾキサンテン染料および他のスペクトル的に類似のキサンテン染料およびローダミンベース染料の種々のスペクトル特性および化学特性を要約し、そして比較する。
【０１８７】
【表７】
この表で示した染料の構造については、図１および２を参照せよ。全てのデータは、純粋な染料異性体２について報告している。全ての発光スペクトルを、室温で、λｍａｘＡｂｓ（約１×１０−６Ｍ）で吸光度０．０５を有する染料溶液にて、１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）で記録した。λｍａｘＡｂｓで初期１吸収単位にて、等容量のこれらの染料に対して、光分解速度を決定し、そして１×ＴＢＥ緩衝液（ｐＨ ８．４）中、３５℃で、等しい高強度の白色光照射下にて、等容量で、ペアで操作した。アリコートの吸収スペクトルを１時間間隔で取り出し、λｍａｘＥｍでの強度を一次指数曲線に適合させて、染料損失速度ｔ１／２を決定した。ほぼ等しい濃度で、染料の５１４ｎｍ励起を用いて、λｍａｘＥｍでの相対明度を決定した。（λｍａｘＡｂｓ＝０．０５）。ＮＨ４ＯＨ安定性測定については、染料はほぼ同じ濃度の濃水酸化アンモニウムに希釈し（λｍａｘＡｂｓ＝１）、そして密封バイアルにて、６０℃で２０時間インキュベートした。アリコートの吸収スペクトルを１時間間隔で取り出し、λｍａｘＥｍでの強度を一次指数曲線に適合させて、染料分解に対するｔ１／２を決定した。
【０１８８】
全ての文献および特許出願の内容は、各個々の文献または特許出願の内容が具体的かつ独立して参考として援用されているのと同じ程度まで、本明細書中で参考として援用されている。
【０１８９】
化学および生化学の当業者は、その好ましい実施形態において、それらの教示から逸脱することなく、多くの改良が可能であることを、充分に理解している。このような改良の全ては、以下の請求の範囲の範囲内に包含されることを意図している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２０１０−７０７６９（Ｐ２０１０−７０７６９Ａ）
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８６９８９（Ｐ２００９−２８６９８９）
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【分割の表示】特願２００６−１２２７２８（Ｐ２００６−１２２７２８）の分割
【原出願日】平成９年４月１日（１９９７．４．１）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月２日（２０１０．４．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１２月１７日（２００９．１２．１７）
【分割の表示】特願２００６−１２２７２８（Ｐ２００６−１２２７２８）の分割
【原出願日】平成９年４月１日（１９９７．４．１）
【出願人】（５０９１３０４１３）アプライド バイオシステムズ， エルエルシー (48)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]