骨芽細胞の評価方法
【課題】短時間で間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を評価して、時間の無駄をなくし、患者にかかる負担を軽減することを目的とする。
【解決手段】骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップＳ１と、前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップＳ２と、前記第１のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現と、前記第２のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現とを比較する第３のステップとＳ３を備える骨芽細胞の評価方法を提供する。
【解決手段】骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップＳ１と、前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップＳ２と、前記第１のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現と、前記第２のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現とを比較する第３のステップとＳ３を備える骨芽細胞の評価方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる場合に、骨芽細胞への分化を評価するには、骨分化を誘導する培養により細胞内に形成される、骨特異的なタンパク質により評価する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−４６０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞内に骨特異的なタンパク質が形成されるには、分化誘導剤を用いた培養を開始してから４〜７日以上経過することが必要であり、長時間を要するという不都合がある。また、この方法では長時間経過後に何らかの理由により分化が行われていないことが判明した場合には、その後に再度の培養が必要となり、患者に負担がかかるという不都合がある。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、短時間で間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を評価して、時間の無駄をなくし、患者にかかる負担を軽減する骨芽細胞の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップと、前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップと、測定された細胞培養開始前の前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現と、細胞培養開始後の前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を比較する第３のステップとを備える骨芽細胞の評価方法を提供する。
【０００７】
発明者らは骨分化培地による培養後３日以内に、培養細胞の表面抗原マーカＣＤ７３（抗原：グリコシル‐フォスファチジル‐イノシトール）の発現が大きく変化することを見出した。
本発明によれば、前記間葉系幹細胞について、骨分化誘導開始前および開始後の表面抗原マーカＣＤ７３の発現を比較することにより、短時間で間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化していることを確認することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記第２のステップが、細胞培養開始後１日目から３日目に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定するステップであってもよい。
また、上記発明においては、前記骨分化培地が、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に、１０ｍＭグリセロール２‐リン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０−７Ｍデキサメタゾンを添加してなる培地であってもよい。
また、上記発明においては、前記第１のステップおよび前記第２のステップが、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現をフローサイトメトリによって測定するステップであってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、骨分化誘導開始後３日目以内に表面抗原マーカＣＤ７３の発現の変動がみられることにより、短時間に間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認することができる。したがって、時間の無駄をなくし、患者にかかる負担を軽減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法について、図１を参照して説明する。
以下、本発明の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法は、例えば、間葉系幹細胞について、骨分化培地を用いて分化誘導培養した骨芽細胞の評価方法である。この評価方法は、骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップＳ１と、前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップＳ２と、測定された細胞培養開始前後の前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現とを比較する第３のステップＳ３とを備えている。
【００１１】
前記第１のステップＳ１は、上記の方法で増殖培養された間葉系幹細胞についてフローサイトメトリにより前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する。すなわち、細胞の膜表面で発現している前記表面抗原マーカＣＤ７３に対して、前記表面抗原マーカＣＤ７３に対する抗体（細胞表面マーカ）であって、予め蛍光色素等で標識されているＣＤ７３抗体が結合される。該ＣＤ７３抗体が結合されている細胞に、フローサイトメータ等から発せられた励起光が照射されると、前記ＣＤ７３抗体が結合している細胞から蛍光が発せられ、この蛍光を測定することにより前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を確認することができる。次に、増殖培地を骨分化培地に培地交換して、分化誘導培養を開始した後に行う前記第２のステップＳ２は、前記第１のステップＳ１と同様にして、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する。
【００１２】
発明者らは骨分化培地による培養後３日以内に、培養細胞の表面抗原マーカＣＤ７３の発現が大きく変化することを見出した。したがって、前記第３のステップＳ３において、培養開始後１〜３日で骨芽細胞の評価を行うことができる。
前記第３のステップＳ３の比較による評価は、一定細胞数について測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の蛍光強度をヒストグラムとして表し、該ヒストグラムのピーク位置およびピークの形状等によって前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を比較することにより行う。これにより、間葉系幹細胞の分化誘導開始前後で、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現が変動しているかどうかについて確認することができる。
【００１３】
次に、本実施形態に係る骨芽細胞の評価方法の一実施例について図２および図３を参照して説明する。
図２は間葉系幹細胞について、分化誘導培養開始前後に測定された、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を示すヒストグラムである。縦軸は細胞量、横軸は蛍光強度を表している。
【００１４】
間葉系幹細胞は、５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように培養容器に播種し、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０ｎｇ／ｍＬの繊維芽細胞増殖因子を加えた増殖培地を用いて２４時間培養し、分化誘導培養開始前にフローサイトメトリによる前記表面抗原マーカＣＤ７３の測定を行った。次に、増殖培地を、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に１０ｍＭグリセロール２‐リン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０−７Ｍデキサメタゾンが加えられた骨分化培地に培地交換して、分化誘導培養を開始し、分化誘導培養開始後１日目および３日目にフローサイトメトリによる前記表面抗原マーカＣＤ７３の測定を行った。
【００１５】
図２に示されるように、分化誘導培養開始後１日目および３日目の細胞群は、分化誘導培養開始前の細胞群と比較して前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現が減少していることがわかる。分化誘導培養開始後３日目のピークは、分化誘導培養開始前と比較して全く別の位置にピークが検出されている。また、分化誘導培養開始後１日目のピークは、分化誘導培養開始前のピークと部分的に重なっているが、分化誘導培養開始前と比較してピークの位置が変動していることが確認できる。このことから、分化誘導培養開始からわずか１日目から３日目であっても、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を培養開始前と比較することによって、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認することができる。さらに、分化開始を確認して早期に移植できるという効果を奏する。
【００１６】
図３は、参考例として、前記骨分化培地、または比較例として前記増殖培地を用いて培養した間葉系幹細胞について、分化誘導培養開始後１日目、４日目、７日目および１４日目のＡＬＰ活性を示すグラフである。
図３に示されるように、前記増殖培地を用いて培養した細胞と比較して、前記骨分化培地によって培養した細胞は、培養開始４日目、７日目および１４日目について高いＡＬＰ活性値を示していることがわかる。このことから、前記骨分化培地を用いれば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化されることが従来の評価方法によっても観察された。
なお、前記骨分化培地を用いて培養した間葉系幹細胞について、Ｃａ測定により、分化誘導培養開始後１４日目にＣａの蓄積が観察された（図示せず）。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態に係る骨芽細胞の評価方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法において、フローサイトメトリによって測定された間葉系幹細胞について、表面抗原マーカＣＤ７３抗体の発現を示すヒストグラムである。
【図３】図１の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法の参考例であって、従来の評価方法による、骨分化誘導された間葉系幹細胞のＡＬＰ活性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１８】
Ｓ１ 第１のステップ
Ｓ２ 第２のステップ
Ｓ３ 第３のステップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨芽細胞の評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、間葉系幹細胞を骨芽細胞に分化させる場合に、骨芽細胞への分化を評価するには、骨分化を誘導する培養により細胞内に形成される、骨特異的なタンパク質により評価する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
【特許文献１】特開２００５−４６０５８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、細胞内に骨特異的なタンパク質が形成されるには、分化誘導剤を用いた培養を開始してから４〜７日以上経過することが必要であり、長時間を要するという不都合がある。また、この方法では長時間経過後に何らかの理由により分化が行われていないことが判明した場合には、その後に再度の培養が必要となり、患者に負担がかかるという不都合がある。
【０００５】
本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであって、短時間で間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を評価して、時間の無駄をなくし、患者にかかる負担を軽減する骨芽細胞の評価方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップと、前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップと、測定された細胞培養開始前の前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現と、細胞培養開始後の前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を比較する第３のステップとを備える骨芽細胞の評価方法を提供する。
【０００７】
発明者らは骨分化培地による培養後３日以内に、培養細胞の表面抗原マーカＣＤ７３（抗原：グリコシル‐フォスファチジル‐イノシトール）の発現が大きく変化することを見出した。
本発明によれば、前記間葉系幹細胞について、骨分化誘導開始前および開始後の表面抗原マーカＣＤ７３の発現を比較することにより、短時間で間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化していることを確認することができる。
【０００８】
上記発明においては、前記第２のステップが、細胞培養開始後１日目から３日目に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定するステップであってもよい。
また、上記発明においては、前記骨分化培地が、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に、１０ｍＭグリセロール２‐リン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０−７Ｍデキサメタゾンを添加してなる培地であってもよい。
また、上記発明においては、前記第１のステップおよび前記第２のステップが、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現をフローサイトメトリによって測定するステップであってもよい。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、骨分化誘導開始後３日目以内に表面抗原マーカＣＤ７３の発現の変動がみられることにより、短時間に間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認することができる。したがって、時間の無駄をなくし、患者にかかる負担を軽減することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下に、本発明の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法について、図１を参照して説明する。
以下、本発明の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法は、例えば、間葉系幹細胞について、骨分化培地を用いて分化誘導培養した骨芽細胞の評価方法である。この評価方法は、骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップＳ１と、前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップＳ２と、測定された細胞培養開始前後の前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現とを比較する第３のステップＳ３とを備えている。
【００１１】
前記第１のステップＳ１は、上記の方法で増殖培養された間葉系幹細胞についてフローサイトメトリにより前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する。すなわち、細胞の膜表面で発現している前記表面抗原マーカＣＤ７３に対して、前記表面抗原マーカＣＤ７３に対する抗体（細胞表面マーカ）であって、予め蛍光色素等で標識されているＣＤ７３抗体が結合される。該ＣＤ７３抗体が結合されている細胞に、フローサイトメータ等から発せられた励起光が照射されると、前記ＣＤ７３抗体が結合している細胞から蛍光が発せられ、この蛍光を測定することにより前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を確認することができる。次に、増殖培地を骨分化培地に培地交換して、分化誘導培養を開始した後に行う前記第２のステップＳ２は、前記第１のステップＳ１と同様にして、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する。
【００１２】
発明者らは骨分化培地による培養後３日以内に、培養細胞の表面抗原マーカＣＤ７３の発現が大きく変化することを見出した。したがって、前記第３のステップＳ３において、培養開始後１〜３日で骨芽細胞の評価を行うことができる。
前記第３のステップＳ３の比較による評価は、一定細胞数について測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の蛍光強度をヒストグラムとして表し、該ヒストグラムのピーク位置およびピークの形状等によって前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を比較することにより行う。これにより、間葉系幹細胞の分化誘導開始前後で、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現が変動しているかどうかについて確認することができる。
【００１３】
次に、本実施形態に係る骨芽細胞の評価方法の一実施例について図２および図３を参照して説明する。
図２は間葉系幹細胞について、分化誘導培養開始前後に測定された、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を示すヒストグラムである。縦軸は細胞量、横軸は蛍光強度を表している。
【００１４】
間葉系幹細胞は、５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２になるように培養容器に播種し、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０ｎｇ／ｍＬの繊維芽細胞増殖因子を加えた増殖培地を用いて２４時間培養し、分化誘導培養開始前にフローサイトメトリによる前記表面抗原マーカＣＤ７３の測定を行った。次に、増殖培地を、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に１０ｍＭグリセロール２‐リン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０−７Ｍデキサメタゾンが加えられた骨分化培地に培地交換して、分化誘導培養を開始し、分化誘導培養開始後１日目および３日目にフローサイトメトリによる前記表面抗原マーカＣＤ７３の測定を行った。
【００１５】
図２に示されるように、分化誘導培養開始後１日目および３日目の細胞群は、分化誘導培養開始前の細胞群と比較して前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現が減少していることがわかる。分化誘導培養開始後３日目のピークは、分化誘導培養開始前と比較して全く別の位置にピークが検出されている。また、分化誘導培養開始後１日目のピークは、分化誘導培養開始前のピークと部分的に重なっているが、分化誘導培養開始前と比較してピークの位置が変動していることが確認できる。このことから、分化誘導培養開始からわずか１日目から３日目であっても、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を培養開始前と比較することによって、間葉系幹細胞の骨芽細胞への分化を確認することができる。さらに、分化開始を確認して早期に移植できるという効果を奏する。
【００１６】
図３は、参考例として、前記骨分化培地、または比較例として前記増殖培地を用いて培養した間葉系幹細胞について、分化誘導培養開始後１日目、４日目、７日目および１４日目のＡＬＰ活性を示すグラフである。
図３に示されるように、前記増殖培地を用いて培養した細胞と比較して、前記骨分化培地によって培養した細胞は、培養開始４日目、７日目および１４日目について高いＡＬＰ活性値を示していることがわかる。このことから、前記骨分化培地を用いれば、間葉系幹細胞が骨芽細胞に分化されることが従来の評価方法によっても観察された。
なお、前記骨分化培地を用いて培養した間葉系幹細胞について、Ｃａ測定により、分化誘導培養開始後１４日目にＣａの蓄積が観察された（図示せず）。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の一実施形態に係る骨芽細胞の評価方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法において、フローサイトメトリによって測定された間葉系幹細胞について、表面抗原マーカＣＤ７３抗体の発現を示すヒストグラムである。
【図３】図１の実施形態に係る骨芽細胞の評価方法の参考例であって、従来の評価方法による、骨分化誘導された間葉系幹細胞のＡＬＰ活性を示すグラフである。
【符号の説明】
【００１８】
Ｓ１ 第１のステップ
Ｓ２ 第２のステップ
Ｓ３ 第３のステップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップと、
前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップと、
前記第１のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現と、前記第２のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現とを比較する第３のステップとを備える骨芽細胞の評価方法。
【請求項２】
前記第２のステップが、細胞培養開始後１日目から３日目に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する請求項１に記載の骨芽細胞の評価方法。
【請求項３】
前記骨分化培地が、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に、１０ｍＭグリセロール２‐リン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０−７Ｍデキサメタゾンを添加してなる請求項１に記載の骨芽細胞の評価方法。
【請求項４】
前記第１のステップおよび前記第２のステップが、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現をフローサイトメトリによって測定する請求項１に記載の骨芽細胞の評価方法。
【請求項１】
骨分化培地を用いた細胞培養の開始前に、間葉系幹細胞について表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第１のステップと、
前記骨分化培地を用いた細胞培養開始後に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する第２のステップと、
前記第１のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現と、前記第２のステップにおいて測定された前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現とを比較する第３のステップとを備える骨芽細胞の評価方法。
【請求項２】
前記第２のステップが、細胞培養開始後１日目から３日目に、前記間葉系幹細胞について前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現を測定する請求項１に記載の骨芽細胞の評価方法。
【請求項３】
前記骨分化培地が、１０％胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地に、１０ｍＭグリセロール２‐リン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍＬビタミンＣ及び１０−７Ｍデキサメタゾンを添加してなる請求項１に記載の骨芽細胞の評価方法。
【請求項４】
前記第１のステップおよび前記第２のステップが、前記表面抗原マーカＣＤ７３の発現をフローサイトメトリによって測定する請求項１に記載の骨芽細胞の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−１０３５９０（Ｐ２００９−１０３５９０Ａ）
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２７５９４５（Ｐ２００７−２７５９４５）
【出願日】平成１９年１０月２４日（２００７．１０．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月１４日（２００９．５．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月２４日（２００７．１０．２４）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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