高収率でグルタミン酸を生産する微生物およびこれを用いたグルタミン酸生産方法
微生物コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４から遺伝子操作によって得た変異菌株ＫＣＣＭ−１０７８４ＰとＫＣＣＭ−１０７８５Ｐ、およびそれを用いたグルタミン酸生産方法を開示する。前記変異菌株はグルタミン酸を高収率で生産することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率でＬ−グルタミン酸を生産する微生物、および前記微生物を用いてＬ−グルタミン酸を生産する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４の変異株であって、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）および／またはクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃａｌ）に対する耐性を有し且つＬ−グルタミン酸を高収率で生産する微生物、および前記変異株を用いたＬ−グルタミン酸生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、発酵により生産される代表的なアミノ酸であって、全世界の年間生産量が１００万トンを超えて規模の側面で化学産業の汎用化合物と比較すべきものであり、例えば医薬品、食品、その他の動物飼料などに広く用いられる重要なアミノ酸である。
【０００３】
従来から知られているＬ−グルタミン酸の製造方法としては、主にブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはその変異体に属するいわゆるコリネ型（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ）のグルタミン酸生産バクテリアを用いる発酵による生産が通常的であり（“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”， Ｇａｋｋａｉ Ｓｈｕｐｐａｎ Ｃｅｎｔｅｒ， ｐｐ．１９５−２１５， １９８６）、他のバクテリア菌株を発酵させてＬ−グルタミン酸を生産する方法としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フェニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）属などの微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）、バチルス、シュードモナス、セラチア属などの微生物またはアエロバクターアエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（現在、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）と称する）を用いる方法（日本特開昭３２−９３９３号（１９５７））、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）の変異体菌株を用いる方法（日本特開平５−２４４９７０号（１９９３））などがある。
【０００４】
また、グルタミン酸の生産量を増加させるための方法として、培地造成の変化や耐性菌株の開発などに関する多くの研究も行われてきた。一例として、グルタミン酸生成代謝経路上で中間物質として使用されるピルビン酸の供給を増やすために、β−フルオロピルビン酸耐性を持つ菌株が開発された。
【０００５】
前述した方法によってもＬ−グルタミン酸の生産性が相当改善されたが、アミノ酸の需要が相当増加するものと予想されるところ、これを充足させるためにはより低廉で効率的なＬ−グルタミン酸生産方法の開発が必要である。
【０００６】
本発明者らは、より収率のよいＬ−グルタミン酸生産菌株を得るための鋭意研究を行った結果、ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５遺伝子がノックアウトされて発現しないように変異された菌株は、Ｌ−グルタミン酸生成能を有する親株に比べて、向上したグリセロール利用能力を有するうえ、少ない菌体量でも高濃度のＬ−グルタミン酸を生産することを見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号
【特許文献３】日本特開昭３２−９３９３号
【特許文献４】日本特開平５−２４４９７０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”， Ｇａｋｋａｉ Ｓｈｕｐｐａｎ Ｃｅｎｔｅｒ， ｐｐ．１９５−２１５， １９８６
【発明の概要】
【０００９】
〔技術的課題〕
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産する、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４の変異株を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記変異株を製造する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、前記変異株を使用してＬ−グルタミン酸を高収率で生産する方法を提供することにある。
【００１２】
〔技術的解決方法〕
一つの様態において、本発明は、Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産することが可能なコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４の変異株を提供する。
【００１３】
前記コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６５６を親株として紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異誘発剤を処理したもののうち、β−フルオロピルビン酸入りの培地で生育することが可能なＬ−グルタミン酸生産菌株であって、韓国特許出願第１９９９−０９６７５号に開示されている。したがって、前記特許出願の全体内容は本願明細書に参考資料として含まれる。
【００１４】
本発明に係るＫＦＣＣ−１１０７４の変異株は、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子がノックアウトされて発現しないようにＫＦＣＣ−１１０７４を変異させた変異株である。本発明者らは、グルタミン酸の生産量を増加させるために、グルタミン酸を生産するにおいてさらに効率よく炭素源を使用し、炭素源がグルタミン酸以外の経路として使用されることを減らすことが可能であれば、グルタミン酸の生産量を増加させることができるだろうと予想し、他の種類の炭素源としてグリセロールを使用しようとした。したがって、ＫＦＣＣ−１１７０４にグリセロール利用性を与えるために、ＮＴＧを用いた変異処理を施した後、グリセロール最小培地に塗抹して成長の速い菌株を選別した。選別された変異株を親株と共にＤＮＡアレイ実験に提供し、ＤＮＡアレイ実験の結果、ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５の両遺伝子の発現量が親株に比べて約２倍程度低くなったことを確認した。これにより、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子が発現しないようにＫＦＣＣ−１１０７４菌株を変異させると、グリセロールを炭素源として使用することができるため、向上したグリセロール利用能力を有するうえ、グルタミン酸の生産量も増加させることができることを予想し、これを実験によって確認した。したがって、本発明の好適な様態では、ｃｇ２６２４遺伝子が発現しないＫＦＣＣ−１１０７４の変異株であるＫＣＣＭ−１０７８４Ｐを提供する。また、さらに好適な様態では、ｃｇ２６２４およびｃｇ２１１５遺伝子が発現しないＫＦＣＣ−１１０７４の変異株であるＫＣＣＭ−１０７８５Ｐを提供する。ＫＣＣＭ−１０７８４ＰおよびＫＣＣＭ−１０７８５は韓国微生物保存センターに２００６年９月２８日付で寄託した。本発明に係る前記変異株は、また、親株ＫＦＣＣ−１１０７４がカナマイシンに対する耐性を有することにより、カナマイシン含有培地で成長させて一次選別した。ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐの場合（ＩＢＴ０３）、クロラムフェニコール耐性遺伝子も含む。
【００１５】
別の様態において、本発明は、前記変異株ＫＣＣＭ−１０７８４Ｐ（ＩＢＴ０２）およびＫＣＣＭ−０７８５Ｐ（ＩＢＴ０３）を製造する方法を提供する。
【００１６】
本発明の好適な様態において、前記変異菌株は、グルタミン酸生成能を有する親株ＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４遺伝子および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせることにより製造できる。したがって、本発明の具体的な一様態では、ｃｇ２６２４遺伝子および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせるためのベクターを提供する。
【００１７】
本発明において、「ベクター」は、当業界における公知の意味で使用される。「ベクター」は、一般に細胞の中心代謝の一部分ではない遺伝子を含む外来染色体要素であって、通常、円形の二本鎖ＤＮＡである。前記要素は、自己複製配列、ゲノム挿入配列、またはファージヌクレオチド配列を含む、線形または円形、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。一般に、前記ベクターは、適切な遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択性マーカー、および自己複製または染色体挿入を許容する配列を含む。適切なベクターは、転写開始調節を含む遺伝子の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。
【００１８】
前記「適切な調節配列」とは、前記ポリヌクレオチドが転写および翻訳できるように調節機能を行う配列をいう。前記調節配列には、例えば、リポソーム結合配列（ＲＢＳ）、プロモーターおよびタミネーターが含まれる。前記プロモーターは、本発明の遺伝子の転写開始を指示することが可能な配列であればいずれでもよいが、例えば、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスにおける発現に有用である）、ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａおよびｔｒｃ（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に有用である）が使用できる。また、前記タミネーター領域は、好適な宿主細胞の多様な遺伝子に由来するものであってもよく、選択的に必要ではなくてもよい。
【００１９】
本発明の好適な様態において、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせるためのコリネバクテリウムグルタミカムに存在するｃｇ２６２４および／またはｃｇ２６１５遺伝子の一部のポリヌクレオチドを含む。好適な一実施例において、ｃｇ２６２４遺伝子の一部の配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドであり、ｃｇ２１１５および／または配列番号２のポリヌクレオチドである。ところが、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせるためのこれら遺伝子の一部配列がこれらに限定されないことは当業者には自明であり、相同組み換えによって形質転換された菌株のゲノム内のｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせることが可能なものであれば、任意のこれら遺伝子の一部配列を含むポリヌクレオチドは全て含まれ得る。
【００２０】
また、これら遺伝子の一部配列だけでなく全体配列を含んでも、これらの一部のヌクレオチド配列が置換されることにより、正常的なｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子のタンパク質が生成できないようにノックアウトされたｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５の遺伝子配列を含むこともできる。このようなノックアウト遺伝子の製造は、当該分野の技術者における公知の方法で製造できる。
【００２１】
本発明の実施例では、配列番号１のポリヌクレオチドを含むｃｇ２６２４遺伝子をノックアウトさせるためのベクターを製作し、これをｐＣＪ２００ベクターと命名した。また、本発明の実施例では、配列番号２と配列番号３のポリヌクレオチドを含むｃｇ２１１５遺伝子のノックアウトベクターを提供する。ここで、配列番号３のポリヌクレオチドはｃｍｒをコードする遺伝子の塩基配列である。前記配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドを含むノックアウトベクターをｐＣＪ２０１と命名した。
【００２２】
前述したように、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子の一部のポリヌクレオチドを含むベクターをコリネバクテリウムに形質転換すると、前記ベクターに含まれたポリヌクレオチドが相同組み換えによって菌株の染色体に挿入され、菌株のｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）させる。この際、前記ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのみ作用するｐＵＣオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）を持つので、コリネバクテリウム内では複製できず、菌株の染色体に挿入される場合にのみ複製可能である。したがって、本発明のベクターは、ベクターそれ自体またはそれに含まれている外来遺伝子をコリネバクテリウム属微生物の染色体に安定的に挿入することに使用できる。
【００２３】
したがって、ｐＣＪ２００ベクターを菌株に挿入すると、菌株内にあるｃｇ２６２４遺伝子のノックアウトが発生し、ｐＣＪ２０１ベクターを菌株に挿入すると、菌株内のｃｇ２６２４およびｃｇ２１１５遺伝子の作用が起こらない遺伝子ノックアウトが発生する。したがって、形質転換されたこれらの変異株は、前記遺伝子のｍＲＮＡを全く発現することができなくなる。このような方法によって、ｃｇ２６２４が破壊された菌株ＩＢＴ０２とｃｇ２１１５およびｃｇ２６２４が破壊された菌株ＩＢＴ０３を得た。これらの菌株をそれぞれ韓国微生物保存センターに寄託した。これらの変異株は、親株に比べてＯＤが減少し、グルタミン酸生産量がそれぞれ約２０％約３７％増加した（実施例参照）。
【００２４】
別の様態において、本発明は、これらの変異株を培養してＬ−グルタミン酸を生産する方法を提供する。具体的に、本発明に係るＬ−グルタミン酸生産方法は、親株としてのコリネバクテリウムＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４遺伝子および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせ、前記遺伝子のノックアウトされた菌株を培養する段階を含む。好適な一様態において、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子のノックアウトは、前述したように、これら遺伝子の一部のみを含むベクターをＫＦＣＣ−１１０７４菌株に導入して相同組み換えによってＫＦＣＣ−１１０７４菌株のゲノムに前記ｃｇ２６２４遺伝子の一部および／またはｃｇ２１１５遺伝子の一部のみを挿入することにより、これらの遺伝子が発現しないようにしてなされ得る。こうして製造された変異株を適切な培地で培養してＬ−グルタミン酸を製造することができる。
【００２５】
本発明の具体的実施例では、ｃｇ２６２４遺伝子の一部を含むベクター（ｐＣＪ２００）をコリネバクテリウムに形質転換して、ｃｇ２６２４遺伝子の破壊された菌株ＩＢＴ０２を得た。また、ｃｍｒ遺伝子とｃｇ２１１５遺伝子の一部を含むベクター（ｐＣＪ２０１）を前記ＩＢＴ０２菌株に形質転換して、ｃｇ２６２４遺伝子およびｃｇ２１１５遺伝子が全て破壊された菌株としてのＩＢＴ０３を得た。こうして得られたＫＦＣＣ−１１７０４の変異株、ＫＦＣＣ−０００（ＩＢＴ０２）およびＫＦＣＣ−０００（ＩＢＴ０３）は、親株としてのＫＦＣＣ−１１７０４に比べてグルタミン酸生産能が増加することを確認した（表１）。
【００２６】
〔有利な効果〕
本発明によれば、ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５遺伝子を破壊したとき、親株に比べてグルタミン酸生産量がさらに増加した。したがって、このような遺伝子操作は、コリネバクテリウム属微生物の菌体量を調節しながら代謝産物の量を増加させることに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】コリネバクテリウムにおいてｃｇ２６２４遺伝子を破壊するために製造したｐＣＪ２００ベクターの切断地図である。
【図２】コリネバクテリウムにおいてｃｇ２１１５遺伝子を破壊するために製造したｐＣＪ２０１ベクターの切断地図である。
【図３】ｐＣＪ２００ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無をＰＣＲ反応によって確認した電気泳動写真である。
【図４】ｐＣＪ２０１ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無をＰＣＲ反応によって確認した電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の内容を実施例によってより詳細に説明する。これらの実施例は本発明の内容を理解するために例示的に説明するためのもので、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【００２９】
〔実施例１：ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５変異遺伝子の選別〕
親株としてのコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４にグリセロール利用性を与えるために、ＮＴＧを用いた変異処理を施した後、グリセロール最小培地（グリセロール１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）１ｇ／Ｌ、リン酸水素ニカリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ、チアミン３ｍｇ／Ｌ、銅１ｍｇ／Ｌ、ＮＣＡ５ｍｇ／Ｌ、微量元素１ｍＬ／Ｌ）（微量元素塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅２７０ｍｇ／Ｌ、塩化鉄１ｇ／Ｌ、塩化マンガン１０ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム４０ｍｇ／Ｌ、硼砂９０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ）に塗抹して成長の速い菌株を選別した。こうして選別された菌株をＩＢＴ０１と命名した。ＩＢＴ０１菌株を親株と共にＤＮＡアレイ実験に提供した結果、ＩＢＴ０１菌株のｃｇ２６２４とｃｇ２１１５の両遺伝子の発現量が親株に比べて約２倍程度低くなったことを確認した。
【００３０】
〔実施例２：ｃｇ２６２４遺伝子のクローニング〕
本実施例では、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からヌクレオチド検索によってコリネバクテリウムグルタミカムのｃｇ２６２４遺伝子配列を確認し、それから配列番号６および７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを製作した。
【００３１】
次いで、コリネバクテリウムグルタミカム菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として配列番号６および７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、ｃｇ２６２４遺伝子の一部のヌクレオチド配列（配列番号１）を増幅した。
【００３２】
増幅された前記ｃｇ２６２４遺伝子の一部のヌクレオチド配列をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（前記ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキットに含まれているベクターである）にクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ２６２４（ｐＣＪ２００）を製造した。
【００３３】
〔実施例３：ｃｇ２１１５遺伝子のクローニング〕
本実施例では、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からヌクレオチド検索によってコリネバクテリウムグルタミカムのｃｇ２１１５遺伝子配列を確認し、それから配列番号８および９のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを製作した。次いで、コリネバクテリウムグルタミカム菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として配列番号８および９のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、ｃｇ２１１５遺伝子の一部のヌクレオチド配列（配列番号２）を増幅した。
【００３４】
増幅された前記ｃｇ２１１５遺伝子の一部の配列をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ２１１５を製造した。
【００３５】
次いで、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からヌクレオチド検索によってクロラムフェニコール耐性タンパク質をコードする遺伝子配列を確認し、それから配列番号１０および１１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを製作した。その後、ｐＡＣＹＣ−ｄｕｅｔベクターを鋳型とし、配列番号１０および１１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行ってクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍｒ）を増幅した。
【００３６】
増幅されたクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍｒ）をｐＧＥＭ−Ｔベクターキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｍｒを製造した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ２１１５をＮｓｉＩとＳａｃＩで処理してｃｇ２１１５遺伝子を分離精製し、これを、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｍｒをＮｓｉＩとＳａｃＩで処理して分離精製したものとライゲーションさせてｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｍｒ−ｃｇ２１１５（ｐＣＪ２０１）を製造した。
【００３７】
〔実施例４：ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ｃｇ２６２４によるコリネバクテリウムの形質転換〕
コリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＫＦＣＣ−１１０７４）を＃２培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵素エキス５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、 尿素１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）４ｇ／Ｌ、リン酸水素ニカリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、チアミン１ｍｇ／Ｌ、銅２ｍｇ／Ｌ、ＮＣＡ２ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ）に接種して３０℃で１２時間培養した後、＃２ＥＰＯ培地（＃２＋イソニアジド４ｇ／Ｌ、グリシン２５ｇ／Ｌ、ツイン８０の１ｇ／Ｌ）にＯＤ＝０．３となるように接種した後、３０℃でＯＤ＝１．０となるまで培養する。その後、氷で１０分間静置した後、１５００ｇ、５分の条件で遠心分離して冷たい１０％グリセロールバッファ５０ｍＬで４回洗浄した。その後、０．５ｍＬの１０％グリセロールバッファに再懸濁した後、１００μＬずつ１．５ｍＬの微小遠心管（ｍｉｃｒｏ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に分注した。
【００３８】
こうして作られたコンピテント細胞に、実施例１で製作されたｐＣＪ２００ベクターを添加した後、氷に保管している２ｍｍの電気穿孔キュベットに入れ、１．５ｋＶ、２５ｕＦ、６００Ωで電気穿孔した後、直ちにＢＨＩＳ培地（ブレインハートインフュージョン３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ）１ｍＬを添加した。その後、４６℃で６分間静置した後、氷で冷やし、しかる後に、カナマイシン２５μｇ／ｍＬの含まれたアクティブＢＨＩＳ培地（肉汁１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、ブレインハートインフュージョン１８．５ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）に塗抹してコロニーを獲得した。
【００３９】
〔実施例５：ｐＣＪ２００ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無の確認〕
本実施例では、実施例４で得た、形質転換されたコリネバクテリウム菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号６および配列番号７（Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒ）のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、ｐＣＪ２００ベクターが染色体に挿入されているか否かを最終確認した。すなわち、各ＰＣＲ産物を電気泳動し、それからｐＣＪ２００ベクターに該当するバンドがあるか否かを確認することにより、前記ベクターが染色体に挿入されているかを確認した。
【００４０】
図３はｐＣＪ２００ベクターで形質転換されたコリネバクテリウム菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および配列番号７（Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒ）のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲした結果を示す電気泳動写真である。図３に示すように、レーン１〜５の菌株全てがｐＣＪ２００ベクターを染色体への挿入状態で保有していることが分かる。したがって、相同組み換えによってｃｇ２６２４遺伝子が破壊されたこれらの菌株をＩＢＴ０２と命名し、これを韓国微生物保存センターに寄託した。
【００４１】
〔実施例６：ｐＣＪ２０１ベクターのコリネバクテリウム形質転換〕
本実施例では、実施例５で得たＩＢＴ０２菌株にｐＣＪ２０１ベクターを形質転換した。形質転換方法は実施例４と同様に行った。形質転換させた後、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）７μｇ／ｍＬの含まれたアクティブＢＨＩＳ培地でコロニーを獲得した。
【００４２】
〔実施例７：ｐＣＪ２０１ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無の確認〕
本実施例では、実施例６で得た、形質転換されたコリネバクテリウム菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８、配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、前記ベクターが染色体に挿入されているか否かを最終確認した。本実施例で使用した配列番号１２と配列番号１３は、ｐＧＥＭ−Ｔベクターの一部分を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
図４はｐＣＪ２０１ベクターで形質転換されたコリネバクテリウム菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８、配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲした結果を示す電気泳動写真である。図４に示すように、レーン１〜３の菌株全てがｐＣＪ２０１ベクターを染色体への挿入状態で保有していることが分かる。したがって、ｃｇ２６２４遺伝子およびｃｇ２１１５遺伝子が破壊された菌株をＩＢＴ０３と命名し、これを韓国微生物保存センターに寄託した。
【００４４】
〔実施例８：グルタミン酸力価実験〕
本実施例では、実施例１、実施例５および実施例６から得たＩＢＴ０１、ＩＢＴ０２およびＩＢＴ０３菌株を親株菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４菌株と共にグルタミン酸力価実験に提供した。力価実験は、フラスコで行い、菌株をアクティブプレート（肉汁１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）に接種して３０℃で１２時間培養した後、フラスコ力価培地（ブドウ糖３％、糖蜜１％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第２カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．３％、硫酸鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、ビオチン５００μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩２ｍｇ／Ｌ、尿素０．１％、ｐＨ７．１）４０ｍＬ（２５０ｍＬのフラスコ）に１ループ（ｌｏｏｐ）接種して３０℃で４０時間培養した後、グルタミン酸の量を測定した。表１に示すように、ＩＢＴ０１菌株の場合、親株に比べてＯＤが減少し、グルタミン酸の量が若干増加することを確認した。ＩＢＴ０２とＩＢＴ０３菌株の場合は親株に比べてＯＤが減少し、グルタミン酸の生産がそれぞれ約２０％および３７％増加する様相を示した。上記結果より、変異株ＩＢＴ０２およびＩＢＴ０３が親株よりさらに高い収率でＬ−グルタミン酸を生成するという事実が分かる。
【００４５】
【表１】
【受託番号】
【００４６】
ＫＣＣＭ１０７８４Ｐ
ＫＣＣＭ１０７８５Ｐ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高収率でＬ−グルタミン酸を生産する微生物、および前記微生物を用いてＬ−グルタミン酸を生産する方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４の変異株であって、カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ）および／またはクロラムフェニコール（Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃａｌ）に対する耐性を有し且つＬ−グルタミン酸を高収率で生産する微生物、および前記変異株を用いたＬ−グルタミン酸生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−グルタミン酸は、発酵により生産される代表的なアミノ酸であって、全世界の年間生産量が１００万トンを超えて規模の側面で化学産業の汎用化合物と比較すべきものであり、例えば医薬品、食品、その他の動物飼料などに広く用いられる重要なアミノ酸である。
【０００３】
従来から知られているＬ−グルタミン酸の製造方法としては、主にブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはその変異体に属するいわゆるコリネ型（ｃｏｒｙｎｅｆｏｒｍ）のグルタミン酸生産バクテリアを用いる発酵による生産が通常的であり（“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”， Ｇａｋｋａｉ Ｓｈｕｐｐａｎ Ｃｅｎｔｅｒ， ｐｐ．１９５−２１５， １９８６）、他のバクテリア菌株を発酵させてＬ−グルタミン酸を生産する方法としては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フェニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ）属などの微生物を用いる方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属などの微生物を用いる方法（米国特許第３，５６３，８５７号）、バチルス、シュードモナス、セラチア属などの微生物またはアエロバクターアエロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（現在、エンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）と称する）を用いる方法（日本特開昭３２−９３９３号（１９５７））、エシェリキアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ）の変異体菌株を用いる方法（日本特開平５−２４４９７０号（１９９３））などがある。
【０００４】
また、グルタミン酸の生産量を増加させるための方法として、培地造成の変化や耐性菌株の開発などに関する多くの研究も行われてきた。一例として、グルタミン酸生成代謝経路上で中間物質として使用されるピルビン酸の供給を増やすために、β−フルオロピルビン酸耐性を持つ菌株が開発された。
【０００５】
前述した方法によってもＬ−グルタミン酸の生産性が相当改善されたが、アミノ酸の需要が相当増加するものと予想されるところ、これを充足させるためにはより低廉で効率的なＬ−グルタミン酸生産方法の開発が必要である。
【０００６】
本発明者らは、より収率のよいＬ−グルタミン酸生産菌株を得るための鋭意研究を行った結果、ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５遺伝子がノックアウトされて発現しないように変異された菌株は、Ｌ−グルタミン酸生成能を有する親株に比べて、向上したグリセロール利用能力を有するうえ、少ない菌体量でも高濃度のＬ−グルタミン酸を生産することを見出し、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第３，２２０，９２９号
【特許文献２】米国特許第３，５６３，８５７号
【特許文献３】日本特開昭３２−９３９３号
【特許文献４】日本特開平５−２４４９７０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】“Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ”， Ｇａｋｋａｉ Ｓｈｕｐｐａｎ Ｃｅｎｔｅｒ， ｐｐ．１９５−２１５， １９８６
【発明の概要】
【０００９】
〔技術的課題〕
本発明の目的は、Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産する、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４の変異株を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、前記変異株を製造する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は、前記変異株を使用してＬ−グルタミン酸を高収率で生産する方法を提供することにある。
【００１２】
〔技術的解決方法〕
一つの様態において、本発明は、Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産することが可能なコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４の変異株を提供する。
【００１３】
前記コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４は、コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ１０６５６を親株として紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）などの変異誘発剤を処理したもののうち、β−フルオロピルビン酸入りの培地で生育することが可能なＬ−グルタミン酸生産菌株であって、韓国特許出願第１９９９−０９６７５号に開示されている。したがって、前記特許出願の全体内容は本願明細書に参考資料として含まれる。
【００１４】
本発明に係るＫＦＣＣ−１１０７４の変異株は、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子がノックアウトされて発現しないようにＫＦＣＣ−１１０７４を変異させた変異株である。本発明者らは、グルタミン酸の生産量を増加させるために、グルタミン酸を生産するにおいてさらに効率よく炭素源を使用し、炭素源がグルタミン酸以外の経路として使用されることを減らすことが可能であれば、グルタミン酸の生産量を増加させることができるだろうと予想し、他の種類の炭素源としてグリセロールを使用しようとした。したがって、ＫＦＣＣ−１１７０４にグリセロール利用性を与えるために、ＮＴＧを用いた変異処理を施した後、グリセロール最小培地に塗抹して成長の速い菌株を選別した。選別された変異株を親株と共にＤＮＡアレイ実験に提供し、ＤＮＡアレイ実験の結果、ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５の両遺伝子の発現量が親株に比べて約２倍程度低くなったことを確認した。これにより、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子が発現しないようにＫＦＣＣ−１１０７４菌株を変異させると、グリセロールを炭素源として使用することができるため、向上したグリセロール利用能力を有するうえ、グルタミン酸の生産量も増加させることができることを予想し、これを実験によって確認した。したがって、本発明の好適な様態では、ｃｇ２６２４遺伝子が発現しないＫＦＣＣ−１１０７４の変異株であるＫＣＣＭ−１０７８４Ｐを提供する。また、さらに好適な様態では、ｃｇ２６２４およびｃｇ２１１５遺伝子が発現しないＫＦＣＣ−１１０７４の変異株であるＫＣＣＭ−１０７８５Ｐを提供する。ＫＣＣＭ−１０７８４ＰおよびＫＣＣＭ−１０７８５は韓国微生物保存センターに２００６年９月２８日付で寄託した。本発明に係る前記変異株は、また、親株ＫＦＣＣ−１１０７４がカナマイシンに対する耐性を有することにより、カナマイシン含有培地で成長させて一次選別した。ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐの場合（ＩＢＴ０３）、クロラムフェニコール耐性遺伝子も含む。
【００１５】
別の様態において、本発明は、前記変異株ＫＣＣＭ−１０７８４Ｐ（ＩＢＴ０２）およびＫＣＣＭ−０７８５Ｐ（ＩＢＴ０３）を製造する方法を提供する。
【００１６】
本発明の好適な様態において、前記変異菌株は、グルタミン酸生成能を有する親株ＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４遺伝子および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせることにより製造できる。したがって、本発明の具体的な一様態では、ｃｇ２６２４遺伝子および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせるためのベクターを提供する。
【００１７】
本発明において、「ベクター」は、当業界における公知の意味で使用される。「ベクター」は、一般に細胞の中心代謝の一部分ではない遺伝子を含む外来染色体要素であって、通常、円形の二本鎖ＤＮＡである。前記要素は、自己複製配列、ゲノム挿入配列、またはファージヌクレオチド配列を含む、線形または円形、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。一般に、前記ベクターは、適切な遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、選択性マーカー、および自己複製または染色体挿入を許容する配列を含む。適切なベクターは、転写開始調節を含む遺伝子の５’領域および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。
【００１８】
前記「適切な調節配列」とは、前記ポリヌクレオチドが転写および翻訳できるように調節機能を行う配列をいう。前記調節配列には、例えば、リポソーム結合配列（ＲＢＳ）、プロモーターおよびタミネーターが含まれる。前記プロモーターは、本発明の遺伝子の転写開始を指示することが可能な配列であればいずれでもよいが、例えば、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセスにおける発現に有用である）、ｌａｃ、ｔｒｐ、λＰＬ、λＰＲ、Ｔ７、ｔａおよびｔｒｃ（Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に有用である）が使用できる。また、前記タミネーター領域は、好適な宿主細胞の多様な遺伝子に由来するものであってもよく、選択的に必要ではなくてもよい。
【００１９】
本発明の好適な様態において、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせるためのコリネバクテリウムグルタミカムに存在するｃｇ２６２４および／またはｃｇ２６１５遺伝子の一部のポリヌクレオチドを含む。好適な一実施例において、ｃｇ２６２４遺伝子の一部の配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号１のポリヌクレオチドであり、ｃｇ２１１５および／または配列番号２のポリヌクレオチドである。ところが、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせるためのこれら遺伝子の一部配列がこれらに限定されないことは当業者には自明であり、相同組み換えによって形質転換された菌株のゲノム内のｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせることが可能なものであれば、任意のこれら遺伝子の一部配列を含むポリヌクレオチドは全て含まれ得る。
【００２０】
また、これら遺伝子の一部配列だけでなく全体配列を含んでも、これらの一部のヌクレオチド配列が置換されることにより、正常的なｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子のタンパク質が生成できないようにノックアウトされたｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５の遺伝子配列を含むこともできる。このようなノックアウト遺伝子の製造は、当該分野の技術者における公知の方法で製造できる。
【００２１】
本発明の実施例では、配列番号１のポリヌクレオチドを含むｃｇ２６２４遺伝子をノックアウトさせるためのベクターを製作し、これをｐＣＪ２００ベクターと命名した。また、本発明の実施例では、配列番号２と配列番号３のポリヌクレオチドを含むｃｇ２１１５遺伝子のノックアウトベクターを提供する。ここで、配列番号３のポリヌクレオチドはｃｍｒをコードする遺伝子の塩基配列である。前記配列番号２および配列番号３のポリヌクレオチドを含むノックアウトベクターをｐＣＪ２０１と命名した。
【００２２】
前述したように、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子の一部のポリヌクレオチドを含むベクターをコリネバクテリウムに形質転換すると、前記ベクターに含まれたポリヌクレオチドが相同組み換えによって菌株の染色体に挿入され、菌株のｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウト（Ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）させる。この際、前記ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのみ作用するｐＵＣオリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）を持つので、コリネバクテリウム内では複製できず、菌株の染色体に挿入される場合にのみ複製可能である。したがって、本発明のベクターは、ベクターそれ自体またはそれに含まれている外来遺伝子をコリネバクテリウム属微生物の染色体に安定的に挿入することに使用できる。
【００２３】
したがって、ｐＣＪ２００ベクターを菌株に挿入すると、菌株内にあるｃｇ２６２４遺伝子のノックアウトが発生し、ｐＣＪ２０１ベクターを菌株に挿入すると、菌株内のｃｇ２６２４およびｃｇ２１１５遺伝子の作用が起こらない遺伝子ノックアウトが発生する。したがって、形質転換されたこれらの変異株は、前記遺伝子のｍＲＮＡを全く発現することができなくなる。このような方法によって、ｃｇ２６２４が破壊された菌株ＩＢＴ０２とｃｇ２１１５およびｃｇ２６２４が破壊された菌株ＩＢＴ０３を得た。これらの菌株をそれぞれ韓国微生物保存センターに寄託した。これらの変異株は、親株に比べてＯＤが減少し、グルタミン酸生産量がそれぞれ約２０％約３７％増加した（実施例参照）。
【００２４】
別の様態において、本発明は、これらの変異株を培養してＬ−グルタミン酸を生産する方法を提供する。具体的に、本発明に係るＬ−グルタミン酸生産方法は、親株としてのコリネバクテリウムＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４遺伝子および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせ、前記遺伝子のノックアウトされた菌株を培養する段階を含む。好適な一様態において、ｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子のノックアウトは、前述したように、これら遺伝子の一部のみを含むベクターをＫＦＣＣ−１１０７４菌株に導入して相同組み換えによってＫＦＣＣ−１１０７４菌株のゲノムに前記ｃｇ２６２４遺伝子の一部および／またはｃｇ２１１５遺伝子の一部のみを挿入することにより、これらの遺伝子が発現しないようにしてなされ得る。こうして製造された変異株を適切な培地で培養してＬ−グルタミン酸を製造することができる。
【００２５】
本発明の具体的実施例では、ｃｇ２６２４遺伝子の一部を含むベクター（ｐＣＪ２００）をコリネバクテリウムに形質転換して、ｃｇ２６２４遺伝子の破壊された菌株ＩＢＴ０２を得た。また、ｃｍｒ遺伝子とｃｇ２１１５遺伝子の一部を含むベクター（ｐＣＪ２０１）を前記ＩＢＴ０２菌株に形質転換して、ｃｇ２６２４遺伝子およびｃｇ２１１５遺伝子が全て破壊された菌株としてのＩＢＴ０３を得た。こうして得られたＫＦＣＣ−１１７０４の変異株、ＫＦＣＣ−０００（ＩＢＴ０２）およびＫＦＣＣ−０００（ＩＢＴ０３）は、親株としてのＫＦＣＣ−１１７０４に比べてグルタミン酸生産能が増加することを確認した（表１）。
【００２６】
〔有利な効果〕
本発明によれば、ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５遺伝子を破壊したとき、親株に比べてグルタミン酸生産量がさらに増加した。したがって、このような遺伝子操作は、コリネバクテリウム属微生物の菌体量を調節しながら代謝産物の量を増加させることに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】コリネバクテリウムにおいてｃｇ２６２４遺伝子を破壊するために製造したｐＣＪ２００ベクターの切断地図である。
【図２】コリネバクテリウムにおいてｃｇ２１１５遺伝子を破壊するために製造したｐＣＪ２０１ベクターの切断地図である。
【図３】ｐＣＪ２００ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無をＰＣＲ反応によって確認した電気泳動写真である。
【図４】ｐＣＪ２０１ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無をＰＣＲ反応によって確認した電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の内容を実施例によってより詳細に説明する。これらの実施例は本発明の内容を理解するために例示的に説明するためのもので、本発明の権利範囲を限定するものではない。
【００２９】
〔実施例１：ｃｇ２６２４とｃｇ２１１５変異遺伝子の選別〕
親株としてのコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４にグリセロール利用性を与えるために、ＮＴＧを用いた変異処理を施した後、グリセロール最小培地（グリセロール１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）１ｇ／Ｌ、リン酸水素ニカリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）２ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．４ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム０．５ｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ、チアミン３ｍｇ／Ｌ、銅１ｍｇ／Ｌ、ＮＣＡ５ｍｇ／Ｌ、微量元素１ｍＬ／Ｌ）（微量元素塩化カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅２７０ｍｇ／Ｌ、塩化鉄１ｇ／Ｌ、塩化マンガン１０ｍｇ／Ｌ、モリブデン酸アンモニウム４０ｍｇ／Ｌ、硼砂９０ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１０ｍｇ／Ｌ）に塗抹して成長の速い菌株を選別した。こうして選別された菌株をＩＢＴ０１と命名した。ＩＢＴ０１菌株を親株と共にＤＮＡアレイ実験に提供した結果、ＩＢＴ０１菌株のｃｇ２６２４とｃｇ２１１５の両遺伝子の発現量が親株に比べて約２倍程度低くなったことを確認した。
【００３０】
〔実施例２：ｃｇ２６２４遺伝子のクローニング〕
本実施例では、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からヌクレオチド検索によってコリネバクテリウムグルタミカムのｃｇ２６２４遺伝子配列を確認し、それから配列番号６および７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを製作した。
【００３１】
次いで、コリネバクテリウムグルタミカム菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として配列番号６および７のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、ｃｇ２６２４遺伝子の一部のヌクレオチド配列（配列番号１）を増幅した。
【００３２】
増幅された前記ｃｇ２６２４遺伝子の一部のヌクレオチド配列をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（前記ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキットに含まれているベクターである）にクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ２６２４（ｐＣＪ２００）を製造した。
【００３３】
〔実施例３：ｃｇ２１１５遺伝子のクローニング〕
本実施例では、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からヌクレオチド検索によってコリネバクテリウムグルタミカムのｃｇ２１１５遺伝子配列を確認し、それから配列番号８および９のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを製作した。次いで、コリネバクテリウムグルタミカム菌株からゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型として配列番号８および９のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、ｃｇ２１１５遺伝子の一部のヌクレオチド配列（配列番号２）を増幅した。
【００３４】
増幅された前記ｃｇ２１１５遺伝子の一部の配列をＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国）を用いてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローニングし、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ２１１５を製造した。
【００３５】
次いで、米国国立生物情報センター（ＮＣＢＩ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）からヌクレオチド検索によってクロラムフェニコール耐性タンパク質をコードする遺伝子配列を確認し、それから配列番号１０および１１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーを製作した。その後、ｐＡＣＹＣ−ｄｕｅｔベクターを鋳型とし、配列番号１０および１１のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行ってクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍｒ）を増幅した。
【００３６】
増幅されたクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍｒ）をｐＧＥＭ−Ｔベクターキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｍｒを製造した。ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ−ｃｇ２１１５をＮｓｉＩとＳａｃＩで処理してｃｇ２１１５遺伝子を分離精製し、これを、ｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｍｒをＮｓｉＩとＳａｃＩで処理して分離精製したものとライゲーションさせてｐＧＥＭ−Ｔ−ｃｍｒ−ｃｇ２１１５（ｐＣＪ２０１）を製造した。
【００３７】
〔実施例４：ｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ−ｃｇ２６２４によるコリネバクテリウムの形質転換〕
コリネバクテリウムグルタミカム菌株（ＫＦＣＣ−１１０７４）を＃２培地（ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵素エキス５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、 尿素１．５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）４ｇ／Ｌ、リン酸水素ニカリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｉｂａｓｉｃ）８ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５ｇ／Ｌ、ビオチン１００μｇ／Ｌ、チアミン１ｍｇ／Ｌ、銅２ｍｇ／Ｌ、ＮＣＡ２ｍｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ）に接種して３０℃で１２時間培養した後、＃２ＥＰＯ培地（＃２＋イソニアジド４ｇ／Ｌ、グリシン２５ｇ／Ｌ、ツイン８０の１ｇ／Ｌ）にＯＤ＝０．３となるように接種した後、３０℃でＯＤ＝１．０となるまで培養する。その後、氷で１０分間静置した後、１５００ｇ、５分の条件で遠心分離して冷たい１０％グリセロールバッファ５０ｍＬで４回洗浄した。その後、０．５ｍＬの１０％グリセロールバッファに再懸濁した後、１００μＬずつ１．５ｍＬの微小遠心管（ｍｉｃｒｏ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）に分注した。
【００３８】
こうして作られたコンピテント細胞に、実施例１で製作されたｐＣＪ２００ベクターを添加した後、氷に保管している２ｍｍの電気穿孔キュベットに入れ、１．５ｋＶ、２５ｕＦ、６００Ωで電気穿孔した後、直ちにＢＨＩＳ培地（ブレインハートインフュージョン３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ）１ｍＬを添加した。その後、４６℃で６分間静置した後、氷で冷やし、しかる後に、カナマイシン２５μｇ／ｍＬの含まれたアクティブＢＨＩＳ培地（肉汁１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、ブレインハートインフュージョン１８．５ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）に塗抹してコロニーを獲得した。
【００３９】
〔実施例５：ｐＣＪ２００ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無の確認〕
本実施例では、実施例４で得た、形質転換されたコリネバクテリウム菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号６および配列番号７（Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒ）のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、ｐＣＪ２００ベクターが染色体に挿入されているか否かを最終確認した。すなわち、各ＰＣＲ産物を電気泳動し、それからｐＣＪ２００ベクターに該当するバンドがあるか否かを確認することにより、前記ベクターが染色体に挿入されているかを確認した。
【００４０】
図３はｐＣＪ２００ベクターで形質転換されたコリネバクテリウム菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および配列番号７（Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒ）のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲした結果を示す電気泳動写真である。図３に示すように、レーン１〜５の菌株全てがｐＣＪ２００ベクターを染色体への挿入状態で保有していることが分かる。したがって、相同組み換えによってｃｇ２６２４遺伝子が破壊されたこれらの菌株をＩＢＴ０２と命名し、これを韓国微生物保存センターに寄託した。
【００４１】
〔実施例６：ｐＣＪ２０１ベクターのコリネバクテリウム形質転換〕
本実施例では、実施例５で得たＩＢＴ０２菌株にｐＣＪ２０１ベクターを形質転換した。形質転換方法は実施例４と同様に行った。形質転換させた後、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）７μｇ／ｍＬの含まれたアクティブＢＨＩＳ培地でコロニーを獲得した。
【００４２】
〔実施例７：ｐＣＪ２０１ベクターのコリネバクテリウム染色体挿入有無の確認〕
本実施例では、実施例６で得た、形質転換されたコリネバクテリウム菌株からゲノムＤＮＡを抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８、配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲを行い、前記ベクターが染色体に挿入されているか否かを最終確認した。本実施例で使用した配列番号１２と配列番号１３は、ｐＧＥＭ−Ｔベクターの一部分を有するオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
図４はｐＣＪ２０１ベクターで形質転換されたコリネバクテリウム菌株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号８、配列番号１２および配列番号１３のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲした結果を示す電気泳動写真である。図４に示すように、レーン１〜３の菌株全てがｐＣＪ２０１ベクターを染色体への挿入状態で保有していることが分かる。したがって、ｃｇ２６２４遺伝子およびｃｇ２１１５遺伝子が破壊された菌株をＩＢＴ０３と命名し、これを韓国微生物保存センターに寄託した。
【００４４】
〔実施例８：グルタミン酸力価実験〕
本実施例では、実施例１、実施例５および実施例６から得たＩＢＴ０１、ＩＢＴ０２およびＩＢＴ０３菌株を親株菌株としてのコリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４菌株と共にグルタミン酸力価実験に提供した。力価実験は、フラスコで行い、菌株をアクティブプレート（肉汁１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ／Ｌ）に接種して３０℃で１２時間培養した後、フラスコ力価培地（ブドウ糖３％、糖蜜１％、硫酸マグネシウム０．０４％、リン酸第２カリウム０．１％、硫酸アンモニウム０．３％、硫酸鉄０．００１％、硫酸マンガン０．００１％、ビオチン５００μｇ／Ｌ、チアミン塩酸塩２ｍｇ／Ｌ、尿素０．１％、ｐＨ７．１）４０ｍＬ（２５０ｍＬのフラスコ）に１ループ（ｌｏｏｐ）接種して３０℃で４０時間培養した後、グルタミン酸の量を測定した。表１に示すように、ＩＢＴ０１菌株の場合、親株に比べてＯＤが減少し、グルタミン酸の量が若干増加することを確認した。ＩＢＴ０２とＩＢＴ０３菌株の場合は親株に比べてＯＤが減少し、グルタミン酸の生産がそれぞれ約２０％および３７％増加する様相を示した。上記結果より、変異株ＩＢＴ０２およびＩＢＴ０３が親株よりさらに高い収率でＬ−グルタミン酸を生成するという事実が分かる。
【００４５】
【表１】
【受託番号】
【００４６】
ＫＣＣＭ１０７８４Ｐ
ＫＣＣＭ１０７８５Ｐ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産する、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４遺伝子をノックアウトさせた変異株。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産する、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４とｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせた変異株。
【請求項３】
受託番号ＫＣＣＭ−１０７８４Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１に記載の変異株。
【請求項４】
受託番号ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項２に記載の変異株。
【請求項５】
クロラムフェニコール耐性を有する、請求項２に記載の変異株。
【請求項６】
コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせることを含む、向上したグリセロール利用性を有し且つＬ−グルタミン酸を高収率で生産する変異株の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項の変異株を培養してＬ−グルタミン酸を高収率で生産する方法。
【請求項１】
Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産する、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４遺伝子をノックアウトさせた変異株。
【請求項２】
Ｌ−グルタミン酸を高収率で生産する、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４とｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせた変異株。
【請求項３】
受託番号ＫＣＣＭ−１０７８４Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項１に記載の変異株。
【請求項４】
受託番号ＫＣＣＭ−１０７８５Ｐのコリネバクテリウムグルタミカムである、請求項２に記載の変異株。
【請求項５】
クロラムフェニコール耐性を有する、請求項２に記載の変異株。
【請求項６】
コリネバクテリウムグルタミカムＫＦＣＣ−１１０７４のｃｇ２６２４および／またはｃｇ２１１５遺伝子をノックアウトさせることを含む、向上したグリセロール利用性を有し且つＬ−グルタミン酸を高収率で生産する変異株の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項の変異株を培養してＬ−グルタミン酸を高収率で生産する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０６５８５（Ｐ２０１０−５０６５８５Ａ）
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３３２３７（Ｐ２００９−５３３２３７）
【出願日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００４９７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４８０１７
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０８０６４７２４）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (32)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年３月４日（２０１０．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００７／００４９７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０４８０１７
【国際公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【出願人】（５０８０６４７２４）シージェイ チェイルジェダン コーポレイション (32)
【Ｆターム（参考）】
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