高濃度のセロビオースを蓄積できる酵素組成物、及びそれを用いたセロオリゴ糖の製造方法
【課題】セルロース系物質を原料としセルラーゼの存在下で酵素分解することでセロビオースを選択的に生産する際に、煩雑な工程を経ることなくセロビオース蓄積濃度を高めることができるセルラーゼを含む酵素組成物を提供すること。
【解決手段】セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
【解決手段】セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロオリゴ糖の中でも特にセロビオースを高濃度に蓄積できるセルラーゼを含む酵素組成物、該酵素組成物の製造方法、並びに該酵素組成物を用いた効率的なセロオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロオリゴ糖は、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオースの総称であり、グルコピラノース単位が１〜６個、β−１，４結合した少糖類である。近年、セロオリゴ糖は、他のオリゴ糖と同様に、その生理機能が明らかになりつつあり、機能性食品の新素材として期待されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一般に、セロビオースを得る方法としては、セルロース系物質をセルラーゼにより分解する方法が知られている。セルラーゼによるセルロースの分解機構は、（１）まず、セルロース分解酵素の作用で、セルロースからセロビオースを含むセロオリゴ糖が生成する反応、（２）セルロースから直接グルコースを生成する反応、（３）β−グルコシダーゼの作用で、セロオリゴ糖からグルコースが生成する反応が含まれる（非特許文献２）。この反応系において、セロオリゴ糖の生産性を高めるには、（ａ）セロオリゴ糖からグルコースへの分解を抑制し、セロオリゴ糖の選択率を高めること、（ｂ）セロビオースの蓄積濃度を高めることが有効である。
【０００４】
従来、（ａ）の観点で、セロオリゴ糖の選択率を高めることにより、セロオリゴ糖の生産性を高める検討は、数多くなされてきた（特許文献１〜７）。一方で、（ｂ）の視点に立つと、セロビオースの蓄積濃度を高められれば、反応液当たりに多くの生成物が得られるため、セロオリゴ糖の生産性向上に非常に効果がある。しかし、セルラーゼは、セロビオースによる生成物阻害（生成物が高濃度になると酵素の作用が休止する現象）を生じることも知られている。（非特許文献３、４）このため、セロビオースの蓄積濃度を高める有効な手段は知られていなかった。
【０００５】
本発明は、セルラーゼの結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）、及びβ―グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の活性比を特定の範囲に制御することで、セロビオース蓄積濃度を高められることを見出したものである。以下に、従来技術と本発明の違いについて説明する。特定のセルラーゼを使用し、セルロースを酵素分解することで、セロオリゴ糖の選択率を向上させる方法としては、以下のものが挙げられる。
【０００６】
特許文献１は、セロビブリオ属に属する微生物が生産するセルラーゼの作用により、水性反応液中にてセルロース系物質からセロオリゴ糖を製造する方法において、限外ろ過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除して、セロオリゴ糖を生成蓄積せしめるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この方法を用いると、限外ろ過により、酵素と生成物を分離し、酵素の活性低下を防ぐことができる。しかし、この方法では、酵素の本質的な組成を制御できないため、セロビオース濃度を高めることはできない。
【０００７】
特許文献２には、セルロースをセルラーゼで分解し、セロオリゴ糖を生成させる方法において、予めセルラーゼをｐＨ３．５〜５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させることにより、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを選択的に除去し、かかるβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼをセルロースに接触させるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この製造方法によると、セルロースの酵素分解により、グルコースを低減し、セロオリゴ糖が６０％以上の分解生成物を得ることができる。しかしながら、該製造方法では、セルロース中のβ−グルコシダーゼを除去する工程が必要となり、セロオリゴ糖製造工程が複雑になるという問題があった。また、このセルラーゼ精製工程では、未処理セルラーゼに対し、７５〜１０００倍の陽イオン交換樹脂が必要となるため、セルラーゼ処理量が制限され、セロオリゴ糖の生産性が充分ではなく、セルラーゼ精製コスト、陽イオン交換樹脂の分離精製剤コストが高くなるという問題があった。
【０００８】
特許文献３には、不溶性セルロースまたはセルロース含有物質とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のセルラーゼを水性媒体中で保温した後、固形画分を分離し、該固形画分に水溶性溶液を加え、セロビオースを得る方法が開示されている。特許文献４には、セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着し、その後、酵素分解するセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。特許文献５には、セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含みかつ不純物としてβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β−グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とするセルラーゼからのβ−グルコシダーゼの分離除去方法が記載されている。
これらの製造方法では、セロビオース製造工程に混入するβ-グルコシダーゼを低減することが可能となり、選択的にセロビオースを得ることができる。しかしながら、β−グルコシダーゼ以外の酵素成分の活性の制御については、記載も示唆もなく、これらの方法により、それらを制御することは困難である。また、これらの方法は、固形画分へのセルラーゼ吸着工程および固形画分分離工程が必要となるため、プロセスが複雑となる問題があった。
【０００９】
特許文献６には、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液中の、β−グルコシダーゼ活性と結晶性セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）が０．３５以下であるセルラーゼの製造方法、及び培養液中のｐＨをｐＨ３．５未満に制御するセルラーゼの製造方法が開示されている。また、特許文献７には、綿実粕を０．１〜１０質量％含有する液体培地にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、これを培養することにより製造するセルラーゼを含む酵素液の製造方法、及び液体培地が、さらに０．０１〜１０質量％の硫酸アンモニウムを含有するセルラーゼを含む酵素液の製造方法が開示されている。これらの文献は、セルロース分解活性が高く、β−グルコシダーゼ活性が低いセルラーゼの製造を目的とするため、本発明のように、セロビオース蓄積濃度を高めるために、β−グルコシダーゼ活性のみならず、結晶セルロース分解活性、水溶性セルロース分解活性を高度に制御したものとは異なる。
【００１０】
従って、従来は、特定の活性比を有し、セロビオース蓄積濃度が高められるセルラーゼ、その製造方法、及び該セルラーゼを用いた効率的なセロオリゴ糖の製造方法は知られていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５，Ｎｏ２，９１−９７（１９９８）
【非特許文献２】「セルラーゼ」講談社サイエンティフィック発行、９７−１０４（１９８７）
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ１０１， ｐ４１−６０，２００２
【非特許文献４】Ｆｏｏｄ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ −１９７６／７７，Ｎｏ１７２，ｖｏｌ７４，ｐ７７−８１
【特許文献１】特開平０１−２５６３９４号公報
【特許文献２】特開平０５−１１５２９３号公報
【特許文献３】特開昭６３−２２６２９４号公報
【特許文献４】特開２００６−２０４２９４号公報
【特許文献５】特開２００６−３４２０６号公報
【特許文献６】特開２００６−２９６３５８号公報
【特許文献７】特開２００７−２１５５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、セルロース系物質を原料としセルラーゼの存在下で酵素分解することでセロビオースを選択的に生産する際に、煩雑な工程を経ることなくセロビオース蓄積濃度を高めることができるセルラーゼを含む酵素組成物、該酵素組成物の製造方法、並びに該酵素組成物を用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、セルロース系物質を酵素分解するセロオリゴ糖の製造において、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が、０．０１６以下であるセルラーゼが、セロビオースを高濃度蓄積できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
【００１４】
（１） セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
（２） 前記結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）が９．０Ｕ／ｍＬ以上である、（１）に記載の酵素組成物。
（３） 前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する菌株である、（１）又は（２）に記載の酵素組成物。
（４） 前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株及び／又はＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株から変異させて得られる変異株である、（１）から（３）の何れかに記載の酵素組成物。
（５） 前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）である、（１）から（３）の何れかに記載の酵素組成物。
（６） セルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することを含む、（１）から（５）の何れかに記載の酵素組成物の製造方法。
（７） （１）から（５）の何れかに記載の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、セロビオース蓄積濃度が高い酵素組成物を製造することができ、該酵素組成物をセロオリゴ糖の製造に使用することで、酵素の分画等の煩雑な工程を経ることなくセロオリゴ糖を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明におけるセルラーゼとは、セルロースを分解する酵素の総称であり、セルロースの分解活性を有していれば、本発明でいうセルラーゼに含まれる。また、本発明におけるセルラーゼ活性は、水溶性セルロース（カルボキシメチルセルロースナトリウム塩）を分解する酵素活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と、結晶セルロース（ＭＣＣ）を分解する酵素活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）で表すことができ、下記に記す方法で測定することができる。これらのセルラーゼ活性は高い程、セルロースの分解速度、分解率が向上する。また、セロオリゴ糖をグルコースに分解する酵素活性は、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）として表すことができる。
【００１７】
本発明は、これらのＭＣＣ−ａｓｅが高く、かつＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの酵素活性を高度に制御されたセルラーゼを、セルロース系物質の酵素分解に用いることで、セロオリゴ糖の選択率を高めることに加え、セロビオースの蓄積濃度を高蓄積できるという抜群の効果を奏するものである。
【００１８】
以下にそれぞれの酵素活性について説明する。
本発明のＣＭＣ−ａｓｅは、水溶性セルロースを分解するセルラーゼ活性のことであり、基質としてカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）として測定される。このＣＭＣ−ａｓｅ活性は、セルロース系物質を酵素分解する際に、非晶質の分解が促進する。このため、本発明のセルラーゼは、この活性を有することが必要である。好ましい範囲としては、０．００１Ｕ／ｍＬ以上である。
【００１９】
本発明のＭＣＣ−ａｓｅは、結晶セルロースを分解するセルラーゼ活性のことであり、基質として前処理を施した結晶セルロースを分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）として測定される。このＭＣＣ−ａｓｅ活性が高い程、セルロース系物質を酵素分解する際の、結晶質の分解が促進される。好ましい範囲は、９Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは、１０Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１５Ｕ／ｍＬ以上である。
【００２０】
本発明におけるβ−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖を分解し、グルコースを生成する酵素のことであり、β−グルコシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）で定量される。セロオリゴ糖を高収率で得るためには、上述のセルラーゼ活性が高く、かつβ−グルコシダーゼ活性が低い酵素液を使用することが効率的である。β−グルコシダーゼ活性の好ましい範囲は、０．２０Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは、０．１６Ｕ／ｍＬ以下である。特に好ましくは、０．１５Ｕ以下である。
上述のＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ及びβ−グルコシダーゼにおける、それぞれの活性の絶対値は、後述する培養方法において、培養液の上澄み１ｍＬ中に含まれる活性量のことを差す。ただし、本発明でいう酵素活性比は、上述の培養液の上澄みに限らず、培養液を濃縮・分離・乾燥等の加工を施したものを用いて測定してもよい。
【００２１】
本発明は、セルラーゼ活性の中でも、特に、ＣＭＣ−ａｓｅとＭＣＣ−ａｓｅとの活性比に着目したものである。この活性比は、ＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅとして、個別に測定された酵素活性値（Ｕ／ｍＬ）から、（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）の式を用いて得られるものである。本発明のセルラーゼは、この活性比として８．０以下を満たす必要がある。本活性比が８．０を超えると、ＣＭＣ−ａｓｅとＭＣＣ−ａｓｅの相乗効果が得られなくなり、セロビオースの蓄積濃度が低下するため好ましくない。好ましい範囲は７．０以下であり、さらに好ましくは６．５以下である。下限は、特に設定されないが、セルロース系物質を分解できる現実的な範囲としては０．５以上である。
【００２２】
また、本発明のセルラーゼは、β−ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとＭＣＣ−ａｓｅの活性比も特定の範囲を満たす必要がある。この活性比も、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅとして、個別に測定された酵素活性値（Ｕ／ｍＬ）から、（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）の式を用いて得られるものである。本発明のセルラーゼは、この活性比として０．０１６以下を満たす必要がある。この活性比が、０．０１６を超えると、セルラーゼ中のβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの作用が大きくなり、セロオリゴ糖の分解が進むため、結果としてセロビオースの蓄積濃度が低くなる。好ましい範囲は、０．０１５以下であり、より好ましい範囲は、０．０１０以下である。この活性比は小さい程、セロビオースの蓄積濃度が高くなるため、下限と特に設定されないが、工業的に得られる範囲としては０．００１以上である。
【００２３】
以下に本発明のＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−グルコシダーゼの測定方法を示す。
（１）ＣＭＣ−ａｓｅ活性
２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した１％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を４８０μｌ用意する。これに適当に希釈した酵素液２０μｌを加え、４０℃で３０分間反応させる。９５℃、１５分間加熱して反応を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２４】
（２）ＭＣＣ−ａｓｅ活性
５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に懸濁した１．２５質量％の結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名：セオラスＰＨ−１０１を水分６０％として、三英製作所製、商品名：万能攪拌混合機でフック羽根により、９０分間、１２６ｒｐｍで混練攪拌したもの）の基質液０．４ｍｌに適当に希釈した酵素液を０．１ｍｌ添加し、４０℃で３０分間反応後、９５℃で１５分間加熱して反応を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２５】
（３）β−グルコシダーゼ活性
２００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した２．０質量％のセロビオース（Ａｌｄｒｉｃｈ製：特級グレード）の基質液０．３ｍｌに酵素液０．３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間反応後、９５℃で１５分間加熱し反応を停止させた後、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法試薬であるグルコース定量キット（グルコースCII-テストワコー、和光純薬工業社製）を用いて、反応液中のグルコース濃度を定量する。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２６】
本発明のセルラーゼは、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来のものである。
本発明で使用されるセルラーゼ生産菌は、酵素を分泌し、その酵素がセルロース系物質を分解するものであれば、その菌種は特に限定されない。セルラーゼの起源は、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物として以下のものがある。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の「セルラーゼ」（講談社サイエンティフィック発行（１９８７））、「セルロースの事典」（朝倉書店発行（２０００））に記載される菌が生産するセルラーゼを挙げることができるが、セルロースを分解する酵素であれば、上記公知の菌由来の酵素に限らず、新規の菌由来の酵素も、本発明のセルラーゼに含まれる。
【００２７】
上記のうち特に適しているのは、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物である。すなわち、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、培養することにより、本発明のセルラーゼ活性の高い酵素を製造することができる。
【００２８】
本発明の酵素液を、セロオリゴ糖の製造に使用する場合は、上記のＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物の中でも、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株を用いることが好ましい。さらに上述のＮＢＲＣ３１３２９株に公知の変異処理が施された、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３）またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）を使用することが好ましい。上記の方法において、さらにセロオリゴ糖を高収率で製造する為には、上記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株あるいはＡＫＣ−０１５株を親株として、セロオリゴ糖を高収率かつ高選択率で得られるよう、公知の変異処理を施された変異株を使用することが好ましい。
【００２９】
なお、ＧＬ−１株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に、２００５年４月１５日に、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３として、ＡＫＣ−０１５株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に、２００７年６月１３日に、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９としてそれぞれ寄託されている。また、ＧＬ−１株は、中華民国（台湾）食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に、２００５年１０月７日に受託番号ＢＣＲＣ９３００８２として寄託されている。
【００３０】
ここでいう公知の変異処理とは、セルラーゼ生産能を有する微生物を、必要であれば紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤を使用し、変異誘導処理し、それらの菌株からセロオリゴ糖生産効率の高い菌株を選ぶ処理のことである。変異誘導処理に用いる微生物としては、親株としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３）、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）を用いることが好ましい。
【００３１】
変異処理の一例としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株またはＡＫＣ−０１５株を、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で２８℃、３〜１０日間培養する。生成した胞子を生理的食塩水に１００，０００〜１００，０００，０００ 個／ｍｌになるよう懸濁し、ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）で変異処理を施す（１００〜５００μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０、２８℃、５〜２４時間）。セロオリゴ糖生産性の高いセルラーゼを分泌する菌株の選択は、この変異誘発処理胞子の懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、グルコースなどを炭素源として培養し、培養物の酵素活性を公知の方法で測定することで達成される。例えば、各変異処理菌株の培養物を用いて、セロビオースまたは結晶セルロースを基質として酵素分解し、生成した還元糖を定量してもよく、公知の発色基質を使用し培養物と酵素反応させることで定性的に目的の菌株を選択してもよい。
【００３２】
本発明の酵素組成物は、上記したセルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することによって製造することができる。
【００３３】
本発明の酵素組成物の製造方法で使用する本培養用培地は、炭素源を１質量％以上であることが好ましい。炭素源濃度を高めることで、セルラーゼの生産性が向上するのみならず、特にＭＣＣ−ａｓｅを高めることができる。この炭素源濃度が高い程、上述の効果が高まるため、上限は特に設定されないが、現実的な範囲としては、９９質量％以下である。
【００３４】
本発明で用いる炭素源としては、特に制限はないが、例えば、パルプ、セルロースパウダー、結晶セルロース、セロビオース、濾紙、一般紙類、おがくず、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー粕、澱粉、ラクトース、グルコース、グリセロール、エタノール、有機酸等が挙げられる。等が使用することができる。その中でも、特に、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等のセルロース系物質を多く含むものが、セルラーゼ誘導剤としても作用するため好ましい。
【００３５】
本発明で用いるその他の培地成分は、セルラーゼ活性を高められるものであれば、何も用いても自由であるが、例えば次のものが挙げられる。窒素源としては、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、植物加工品、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白分解物等の有機窒素含有物を添加することができる。無機塩類としては、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、ＭｎＣｌ3 ・４Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ等が使用される。必要ならば有機微量栄養物を含有する培地が使用される。上述の窒素源でも特に、アオイ科に属する植物の種子由来の成分を含有することが好ましい。アオイ科に属する植物の種子としては、ワタ、オクラ、ハイビスカス、ムクゲ、フヨウ、タチアオイなどの種子が挙げられ、好ましくは、綿実などを使用できる。アオイ科に属する植物の種子由来の成分としては、例えば、綿実粕を用いるこができる。ここでいう綿実とは、アオイ科ワタ属に属する植物の種子、およびその外皮のことであり、綿実粕とは、綿実から綿実油を搾取した残さのことである。本発明の綿実粕は、上述の綿実に加え、種子、綿実殻、リンター、綿花、花弁等を含んでもよい。Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を培養するための培地における綿実の添加量は、酵素液のセルラーゼ活性と密接に関連するものであり、高力価のセルラーゼを得る為には、培地における綿実粕の添加量は、０．１〜１０質量％が好ましい。培地における綿実粕のより好ましい添加量としては、０．２〜７質量％であり、さらに好ましくは２〜５質量％である。
【００３６】
本発明のセロオリゴ糖を選択的に製造するためのβ−グルコシダーゼ活性の低減された酵素組成物を得るためには、アオイ科に属する植物の種子由来の成分に加えて、硫酸イオン、硫酸水素イオンおよびアンモニウムイオンから選ばれる少なくとも一つを液体培地に添加することが好ましく、特に、硫酸アンモニウムを液体培地に添加することが好ましい。培地における硫酸アンモニウムの添加量としては、０．０１〜１０質量％がβ−グルコシダーゼ活性を低減させるために好ましく、０．０２〜２質量％がより好ましい。特に好ましい範囲としては０．１〜０．５質量％である。
【００３７】
以下に培養方法について、説明する。
培養には通常の通気撹拌培養装置あるいは固体培養装置が用いられ、前記培地を使用して、温度２０〜４０℃で培養すれば、３〜１０日間でセルラーゼ活性は最高となる。次いで、培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上澄液を得る。この上澄液は、このまま粗酵素液として使用することができる。
【００３８】
本発明で用いる培養方法としては、特に通気攪拌培養装置が適しており、通気状態、攪拌状態を制御することで、酸素移動係数（ＫＬａ）を適切な範囲制御することが好ましい。このＫＬａは、全容１０Ｌの通気攪拌培養装置（丸菱エンジ製、６枚羽根フラットタービン二段）を用いて、０．２ｖｖｍ、イオン交換水を６Ｌ仕込んだ場合に、スタティックメソッドで測定されるものであり、培養時の通気攪拌状態を表す指標となる。好ましいＫＬａの範囲は、２０〜３００であり、より好ましい範囲は、５０〜２８０である。このＫＬａは、培養槽のスケール、攪拌翼が変わっても、適宜調製されるものである。
【００３９】
本発明で用いる培養方法において、培養液のｐＨを制御することが好ましい。好ましいｐＨの範囲としては、２．８〜３．５である。この範囲にｐＨを制御することで、セルラーゼ生産菌の生育およびＭＣＣ−ａｓｅの生産と、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの抑制のバランスがとれる。セロビオースの蓄積濃度を高めることを目的とするが、このことによりβ−グルコシダーゼを抑え、結果として、セロオリゴ糖の生産を高めることに繋がる。より好ましい範囲は、２．９〜３．１である。
【００４０】
なお、本発明は、特定の活性比を有するセルラーゼが、セロビオース蓄積性、セロオリゴ糖選択性を向上することを見出したものであり、この酵素をセルロース系物質の酵素分解に用いることでセロオリゴ糖の生産性を高めたセロオリゴ糖の製造方法である。従って、セルラーゼは、本発明の活性比の範囲を満たすものであれば、上記の方法に関わらずとも、市販セルラーゼ等の公知の手段で得られた酵素を、公知の精製、分画方法を組み合わせて得られたものでもよい。
【００４１】
本発明においては、上記した本発明の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することによってセロオリゴ糖を製造することができる。以下にセロオリゴ糖の製造方法を説明する。
【００４２】
酵素分解方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明のセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
【００４３】
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。
本発明でいうＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株、ＧＬ−１株、ＡＫＣ−０１５株、またはそれらの変異株をセルラーゼ生産菌とし、得られたセルラーゼを用いる場合には、セルロースの酵素分解は、緩衝液中で、温度５０〜７０℃、ｐＨ３．０〜８．０の範囲で行うことが好ましい。
【００４４】
本発明で使用するセルロース系物質は、セルロースを含有する水不溶性繊維質物質であることが好ましい。その由来は、植物性でも動物性でもよく、それを産生する動植物としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等の各種セルロース誘導体系原料のいずれでもよい。但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
【００４５】
この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。酵素分解反応において、セロビオースによる生成物阻害を回避するためには、反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つことが、セロオリゴ糖の生産性を向上する上で重要である。反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つ方法としては、限外ろ過、逆浸透ろ過等の膜ろ過により、反応系から生成したセロビオースを抜き出す方法でもよく、活性炭、竹、木材等の乾燥植物粉等の有機多孔質基材、二酸化珪素等の無機多孔質基材等を反応系に導入し、それらにセロビオースを吸着させる方法でもよく、セルロース基質をカラム等に固定化し、セルラーゼを含む反応液を流通させる方法でもよく、セルラーゼを高分子等に固定化し、セルロースを含む反応液を流通させる方法でもよい。
但し、上述の酵素分解方法において、反応系内のセルロース系物質の濃度を高濃度にすることは、セロビオース蓄積をより高める上で重要である。好ましいセルロース系物質濃度は、反応液中に２質量％以上であり、より好ましくは５質量％以上であり、さらに好ましくは７．５質量％以上である。この濃度は高いほど、セロビオースの蓄積濃度を高められるため、上限は特に設定されないが、通常の反応系で、均一攪拌が得られる範囲としては、３０質量％以下が好ましい。上述のセルロース系物質の濃度は、バッチ式反応においては、仕込み時の濃度として設定してもよく、連続式の反応系では、分解に伴い減少したセルロース分を、適宜、添加（追加）して反応系内のセルロース系物質濃度を高めてもよい。
【００４６】
上述の酵素分解により得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４７】
上記の方法で精製されたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４８】
上記の精製、乾燥処理時のセロオリゴ糖の媒体としては、水以外に、必要に応じて、有機溶剤等を使用してもよい。ここで使用される有機溶剤にも、特に制限されないが、例えば、医薬品、食品およびそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
【００４９】
上記の工程を経たセロオリゴ糖の形態には、特に制限はないが、例えば、常温で固体、懸濁液、エマルジョン、シロップ、溶液状で使用できる。固体状セロオリゴ糖の一例としては、粉末、顆粒、ペレット、成形体、積層体、固体分散体等が挙げられる。
【００５０】
本発明により得られるセロオリゴ糖の用途は、特に制限されないが、例えば、食品、化粧品、医薬品、一般工業製品等の分野で、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、および添加剤、中間原料、発酵原料等として使用してもよい。
【００５１】
本発明により得られるセロオリゴ糖は、食品では、例えば、ゼリー、プリン、ヨーグルト等のゲル、マヨネーズ、ドレッシング、ソース類、たれ類、スープ、野菜加工品等の調味料、カレー、ハヤシ、ミートソース、シチュー、スープ等のレトルト食品、チルド食品、ハンバーグ、ベーコン、ソーセージ、サラミソーセージ、ハム類等の畜産加工品、蒲鉾、ちくわ、魚肉ハム・ソーセージ、揚げ蒲鉾等の水練製品、パン、生麺、乾麺、マカロニ、スパゲッティ、中華饅頭の皮、ケーキミックス、プレミックス、ホワイトソース、餃子・春巻等の皮類などの小麦加工食品、カレー、ソース、スープ、佃煮、ジャムなどの缶詰、瓶詰類、キャンデー、トローチ、錠菓、チョコレート、ビスケット、クッキー、米菓、和洋菓子、洋生菓子、スナック菓子、砂糖菓子、プリンなどの菓子類、フライ類、コロッケ、餃子、中華饅頭等の調理加工品、野菜ペースト、肉のミンチ、果実ペースト、魚介類のペースト等のペースト類などに使用される。また、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ホイップクリーム、練乳、バター、ヨーグルト、チーズ、ホワイトソース等の乳製品、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の油脂加工品等に使用される。さらに、コーラ等の炭酸飲料、炭酸入り、アルコール入り、乳製品と混合した果実飲料、果汁又は、果実入り飲料、乳性飲料等の飲料、コーヒー、牛乳、豆乳、ココア牛乳、フルーツ牛乳、ヨーグルト等の乳酸／乳性飲料等、煎茶、ウーロン茶、抹茶、紅茶等の茶飲料等に使用してもよい。
【００５２】
本発明で得られたセロオリゴ糖は、乳酸菌、乳酸かん菌等の活性化等の腸内有用細菌叢賦活、血中糖濃度、血中インシュリン濃度の低減、血中コレステロールの低減、体脂肪率の低減、脂質・糖質代謝促進機能、便通・便臭改善、抗う触性等の各種生理活性が期待できるため、上記の通常食品用途に加え、生理活性物質として、機能性食品、健康食品、ダイエット食品等の用途で使用してもよい。
【００５３】
また、本発明により得られるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
【００５４】
本発明を実施例などに基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例などにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳を綿実粕（ファーマメディア、トレダース社製）：０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．２０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：０．１５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．０３０ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：０．０３０ｇ、アデカノールＬＧ１０９：０．１０ｍＬ、微量元素液（Ｈ3ＢＯ3６ｍｇ （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ２６ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １００ｍｇ ＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ ４０ｍｇ ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８ｍｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解並びに懸濁した液）：０．１０ｍｌに水を加え全量を９９．０ｇに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、３００ｍｌ容三角フラスコに導入し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）１．０ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、２８℃で３日間前培養した。
【００５６】
次に、この培養液３本分を、綿実粕：７５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：１２.０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：１．８０ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：１．８０ｇ、アデカノールＬＧ１０９：６．０ｍｌ、微量元素液：６．０ｍｌに水を加え、５８８０ｇに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、１０Ｌ容の通気攪拌培養装置（丸菱エンジ製）に導入し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）１５０ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した本培養用培地に接種して、２８℃、０．６ｖｖｍで、６００ｒｐｍで攪拌（水を用いたＫＬａの測定結果は２５０）しながら、６日間培養した。培養中のｐＨは１０％リン酸水溶液、又は１０％水酸化ナトリウム水溶液で適宜調整され、最終的に培養が終了した際のｐＨを測定した。（ｐＨ＝３．０）
【００５７】
６日目に培養液を遠心分離し、その上澄液１ｍＬにおける、各セルラーゼ活性（ＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を測定した。その結果を表１に示す。
【００５８】
〔実施例２〕
実施例１から、通気攪拌培養時の結晶セルロース濃度を４．０％、綿実粕濃度を２．０％に変更し、それ以外は同様の操作で培養した。得られた結果を表１に示す。（ｐＨ＝３．０）
〔実施例３〕
実施例１から、通気攪拌培養時の結晶セルロース濃度を２．０％、綿実粕濃度を１．０％に変更し、２８℃、０．６ｖｖｍで、５００ｒｐｍで攪拌（水を用いたＫＬａの測定結果は２３０）それ以外は同様の操作で培養した。得られた結果を表１に示す。（ｐＨ＝３．１４）
【００５９】
［比較例１］
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳を綿実粕（ファーマメディア、トレダース社製）：０．１５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．０６ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：０．０４５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．００９ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：０．００９ｇ、アデカノールＬＧ１０９：０．０３ｍｌ、微量元素液（Ｈ3ＢＯ3６ｍｇ （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ２６ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １００ｍｇ ＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ ４０ｍｇ ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８ｍｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解並びに懸濁した液）：０．０３ｍｌを水３０ｍｌに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、１５０ｍｌ容三角フラスコに３０ｍｌ分注し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）０．３ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、２８℃で３日間前培養した。
【００６０】
次にこの培養液を綿実粕：１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．０３ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：０．０３ｇ、アデカノールＬＧ１０９：０．１ｍｌ、微量元素液０．１ｍｌを水１００ｍｌに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）２ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した本培養用培地に接種して、２８℃で６日間培養した。
培養後は、実施例１と同様に、各種活性を測定した。結果を表１に示す。
【００６１】
〔比較例２〕
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来の市販酵素「スミチームＣＳ：粉末グレード（新日本化学製）」を用いて、１０％濃度で水に懸濁し、それを用いて、各酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
【００６２】
＜セルロース系物質の調整、およびセロビオース蓄積濃度の測定方法＞
実施例１〜４、比較例１〜３で得られた酵素液を用いて、実際に、セルロース系物質として前処理した結晶セルロースを分解し、生成した糖をＨＰＬＣで定量する方法で、セロビオースの蓄積濃度を測定した。
【００６３】
（１）セルロース基質
市販の結晶セルロース「セオラスＰＨ−１０１（旭化成ケミカルズ製）」を７．５質量％濃度で水に懸濁し、市販のビーズミルを用いて、湿式で微粉砕した。粉砕装置は、アシザワファインテック製ビーズミル「スターミル２Ｌ容」を用いて、ビーズ径φ０．５ｍｍのジルコニアビーズを、８０容積％充填し、所定時間循環することで、平均径（Ｄ５０）で４μｍ以下に微粉砕した。
【００６４】
（２）酵素分解
上記で得られた微粉砕セルローススラリー、及び各実施例、比較例で得られた上澄液を、１００ｍＬ容の三角フラスコに全量２５ｇとなるように導入し、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、スターラー攪拌しながら、５５℃の水浴中で４時間反応した。４時間反応後は、反応を停止し、遠心分離により得られた上澄み液を、ＨＰＬＣで測定し、セロビオース濃度を測定した。結果を表１に示す。ここでセルロース濃度は、５質量％、反応液１ｍＬ当たりのＭＣＣ−ａｓｅが４Ｕになるように、各実施例及び比較例で得た培養液を添加した。
【００６５】
表１から、セルラーゼ生産菌の培養において、菌種、炭素源濃度、ＫＬａ、ｐＨを制御し、各セルラーゼ酵素活性（ＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の活性比を特定の範囲を満たす実施例１〜４は、セロビオースの蓄積濃度が、比較例に対し、格段に優れていることが分かる。
【００６６】
【表１】
【００６７】
〔実施例４〕
セルロース系物質として、市販の結晶セルロース「セオラスＰＨ−１０１（旭化成ケミカルズ製）」を、１５％濃度の水酸化ナトリウム水溶液中で、１０質量％濃度で懸濁し、３０分間攪拌した。攪拌後、遠心式ろ過装置（１μｍ）で、固形分を回収し、水洗した後、１０質量％で水懸濁液を作成し、酢酸水溶液で中和した。中和後、上述と同様にろ過し、基質を調製した（水分６６．３％）。
【００６８】
この基質を用い、セルロース系物質濃度が１０質量％として、実施例１及び２と同様の操作で、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、スターラー攪拌しながら、５５℃の水浴中で４時間反応した。４時間反応後は、反応を停止し、遠心分離により得られた上澄み液を、ＨＰＬＣで測定し、セロビオース濃度を測定した。ここで、反応液１ｍＬ当たりのＭＣＣ−ａｓｅは４Ｕであった。結果より、セロビオース蓄積濃度は、３．４８％であった。
【００６９】
〔実施例４〕
実施例３と同様の操作で、基質を調製し、セルロース系物質濃度を１５質量％にする以外は、実施例３と同様の操作で酵素反応を行った。結果より、セロビオース蓄積濃度は、３．６６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の製造方法により得られるセロオリゴ糖は、通常の食品素材に加え、機能性食品素材、医薬品およびその他化学品の中間体合成材料等の化学変換原料、発酵原料として食品、医薬品、一般工業製品分野で好適に利用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セロオリゴ糖の中でも特にセロビオースを高濃度に蓄積できるセルラーゼを含む酵素組成物、該酵素組成物の製造方法、並びに該酵素組成物を用いた効率的なセロオリゴ糖の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロオリゴ糖は、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、セロヘキサオースの総称であり、グルコピラノース単位が１〜６個、β−１，４結合した少糖類である。近年、セロオリゴ糖は、他のオリゴ糖と同様に、その生理機能が明らかになりつつあり、機能性食品の新素材として期待されている（非特許文献１参照）。
【０００３】
一般に、セロビオースを得る方法としては、セルロース系物質をセルラーゼにより分解する方法が知られている。セルラーゼによるセルロースの分解機構は、（１）まず、セルロース分解酵素の作用で、セルロースからセロビオースを含むセロオリゴ糖が生成する反応、（２）セルロースから直接グルコースを生成する反応、（３）β−グルコシダーゼの作用で、セロオリゴ糖からグルコースが生成する反応が含まれる（非特許文献２）。この反応系において、セロオリゴ糖の生産性を高めるには、（ａ）セロオリゴ糖からグルコースへの分解を抑制し、セロオリゴ糖の選択率を高めること、（ｂ）セロビオースの蓄積濃度を高めることが有効である。
【０００４】
従来、（ａ）の観点で、セロオリゴ糖の選択率を高めることにより、セロオリゴ糖の生産性を高める検討は、数多くなされてきた（特許文献１〜７）。一方で、（ｂ）の視点に立つと、セロビオースの蓄積濃度を高められれば、反応液当たりに多くの生成物が得られるため、セロオリゴ糖の生産性向上に非常に効果がある。しかし、セルラーゼは、セロビオースによる生成物阻害（生成物が高濃度になると酵素の作用が休止する現象）を生じることも知られている。（非特許文献３、４）このため、セロビオースの蓄積濃度を高める有効な手段は知られていなかった。
【０００５】
本発明は、セルラーゼの結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）、及びβ―グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の活性比を特定の範囲に制御することで、セロビオース蓄積濃度を高められることを見出したものである。以下に、従来技術と本発明の違いについて説明する。特定のセルラーゼを使用し、セルロースを酵素分解することで、セロオリゴ糖の選択率を向上させる方法としては、以下のものが挙げられる。
【０００６】
特許文献１は、セロビブリオ属に属する微生物が生産するセルラーゼの作用により、水性反応液中にてセルロース系物質からセロオリゴ糖を製造する方法において、限外ろ過反応器を組み合わせることにより生成物阻害を解除して、セロオリゴ糖を生成蓄積せしめるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この方法を用いると、限外ろ過により、酵素と生成物を分離し、酵素の活性低下を防ぐことができる。しかし、この方法では、酵素の本質的な組成を制御できないため、セロビオース濃度を高めることはできない。
【０００７】
特許文献２には、セルロースをセルラーゼで分解し、セロオリゴ糖を生成させる方法において、予めセルラーゼをｐＨ３．５〜５．０に平衡化した弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させることにより、セルラーゼ中のβ−グルコシダーゼを選択的に除去し、かかるβ−グルコシダーゼを除去したセルラーゼをセルロースに接触させるセロオリゴ糖の製造方法が開示されている。この製造方法によると、セルロースの酵素分解により、グルコースを低減し、セロオリゴ糖が６０％以上の分解生成物を得ることができる。しかしながら、該製造方法では、セルロース中のβ−グルコシダーゼを除去する工程が必要となり、セロオリゴ糖製造工程が複雑になるという問題があった。また、このセルラーゼ精製工程では、未処理セルラーゼに対し、７５〜１０００倍の陽イオン交換樹脂が必要となるため、セルラーゼ処理量が制限され、セロオリゴ糖の生産性が充分ではなく、セルラーゼ精製コスト、陽イオン交換樹脂の分離精製剤コストが高くなるという問題があった。
【０００８】
特許文献３には、不溶性セルロースまたはセルロース含有物質とＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ由来のセルラーゼを水性媒体中で保温した後、固形画分を分離し、該固形画分に水溶性溶液を加え、セロビオースを得る方法が開示されている。特許文献４には、セルロースまたはセルロース含有物質に対し、セルラーゼに含まれる酵素成分のうちβ−グルコシダーゼ以外の酵素成分を予め吸着し、その後、酵素分解するセロオリゴ糖の製造方法が記載されている。特許文献５には、セルロース性原料を管式あるいは塔式反応器に充填し、セロビオハイドロラーゼを含みかつ不純物としてβ−グルコシダーゼを含むセルラーゼ溶液を一方向から連続的に通液させ、β−グルコシダーゼを含む画分を選択的に分離除去することを特徴とするセルラーゼからのβ−グルコシダーゼの分離除去方法が記載されている。
これらの製造方法では、セロビオース製造工程に混入するβ-グルコシダーゼを低減することが可能となり、選択的にセロビオースを得ることができる。しかしながら、β−グルコシダーゼ以外の酵素成分の活性の制御については、記載も示唆もなく、これらの方法により、それらを制御することは困難である。また、これらの方法は、固形画分へのセルラーゼ吸着工程および固形画分分離工程が必要となるため、プロセスが複雑となる問題があった。
【０００９】
特許文献６には、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液中の、β−グルコシダーゼ活性と結晶性セルロース分解活性の活性比（β−グルコシダーゼ活性／結晶性セルロース分解活性）が０．３５以下であるセルラーゼの製造方法、及び培養液中のｐＨをｐＨ３．５未満に制御するセルラーゼの製造方法が開示されている。また、特許文献７には、綿実粕を０．１〜１０質量％含有する液体培地にＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、これを培養することにより製造するセルラーゼを含む酵素液の製造方法、及び液体培地が、さらに０．０１〜１０質量％の硫酸アンモニウムを含有するセルラーゼを含む酵素液の製造方法が開示されている。これらの文献は、セルロース分解活性が高く、β−グルコシダーゼ活性が低いセルラーゼの製造を目的とするため、本発明のように、セロビオース蓄積濃度を高めるために、β−グルコシダーゼ活性のみならず、結晶セルロース分解活性、水溶性セルロース分解活性を高度に制御したものとは異なる。
【００１０】
従って、従来は、特定の活性比を有し、セロビオース蓄積濃度が高められるセルラーゼ、その製造方法、及び該セルラーゼを用いた効率的なセロオリゴ糖の製造方法は知られていなかった。
【００１１】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５，Ｎｏ２，９１−９７（１９９８）
【非特許文献２】「セルラーゼ」講談社サイエンティフィック発行、９７−１０４（１９８７）
【非特許文献３】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ１０１， ｐ４１−６０，２００２
【非特許文献４】Ｆｏｏｄ， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｅｎｅｅｒｉｎｇ −１９７６／７７，Ｎｏ１７２，ｖｏｌ７４，ｐ７７−８１
【特許文献１】特開平０１−２５６３９４号公報
【特許文献２】特開平０５−１１５２９３号公報
【特許文献３】特開昭６３−２２６２９４号公報
【特許文献４】特開２００６−２０４２９４号公報
【特許文献５】特開２００６−３４２０６号公報
【特許文献６】特開２００６−２９６３５８号公報
【特許文献７】特開２００７−２１５５０５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、セルロース系物質を原料としセルラーゼの存在下で酵素分解することでセロビオースを選択的に生産する際に、煩雑な工程を経ることなくセロビオース蓄積濃度を高めることができるセルラーゼを含む酵素組成物、該酵素組成物の製造方法、並びに該酵素組成物を用いたセロオリゴ糖の製造方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、セルロース系物質を酵素分解するセロオリゴ糖の製造において、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が、０．０１６以下であるセルラーゼが、セロビオースを高濃度蓄積できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、下記の通りである。
【００１４】
（１） セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
（２） 前記結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）が９．０Ｕ／ｍＬ以上である、（１）に記載の酵素組成物。
（３） 前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する菌株である、（１）又は（２）に記載の酵素組成物。
（４） 前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株及び／又はＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株から変異させて得られる変異株である、（１）から（３）の何れかに記載の酵素組成物。
（５） 前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）である、（１）から（３）の何れかに記載の酵素組成物。
（６） セルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することを含む、（１）から（５）の何れかに記載の酵素組成物の製造方法。
（７） （１）から（５）の何れかに記載の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、セロビオース蓄積濃度が高い酵素組成物を製造することができ、該酵素組成物をセロオリゴ糖の製造に使用することで、酵素の分画等の煩雑な工程を経ることなくセロオリゴ糖を効率よく製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明におけるセルラーゼとは、セルロースを分解する酵素の総称であり、セルロースの分解活性を有していれば、本発明でいうセルラーゼに含まれる。また、本発明におけるセルラーゼ活性は、水溶性セルロース（カルボキシメチルセルロースナトリウム塩）を分解する酵素活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と、結晶セルロース（ＭＣＣ）を分解する酵素活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）で表すことができ、下記に記す方法で測定することができる。これらのセルラーゼ活性は高い程、セルロースの分解速度、分解率が向上する。また、セロオリゴ糖をグルコースに分解する酵素活性は、β−グルコシダーゼ（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）として表すことができる。
【００１７】
本発明は、これらのＭＣＣ−ａｓｅが高く、かつＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの酵素活性を高度に制御されたセルラーゼを、セルロース系物質の酵素分解に用いることで、セロオリゴ糖の選択率を高めることに加え、セロビオースの蓄積濃度を高蓄積できるという抜群の効果を奏するものである。
【００１８】
以下にそれぞれの酵素活性について説明する。
本発明のＣＭＣ−ａｓｅは、水溶性セルロースを分解するセルラーゼ活性のことであり、基質としてカルボキシメチルセルロースナトリウム塩を分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）として測定される。このＣＭＣ−ａｓｅ活性は、セルロース系物質を酵素分解する際に、非晶質の分解が促進する。このため、本発明のセルラーゼは、この活性を有することが必要である。好ましい範囲としては、０．００１Ｕ／ｍＬ以上である。
【００１９】
本発明のＭＣＣ−ａｓｅは、結晶セルロースを分解するセルラーゼ活性のことであり、基質として前処理を施した結晶セルロースを分解する酵素活性（Ｕ／ｍＬ）として測定される。このＭＣＣ−ａｓｅ活性が高い程、セルロース系物質を酵素分解する際の、結晶質の分解が促進される。好ましい範囲は、９Ｕ／ｍＬ以上であり、より好ましくは、１０Ｕ／ｍＬ以上であり、さらに好ましくは１５Ｕ／ｍＬ以上である。
【００２０】
本発明におけるβ−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖を分解し、グルコースを生成する酵素のことであり、β−グルコシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）で定量される。セロオリゴ糖を高収率で得るためには、上述のセルラーゼ活性が高く、かつβ−グルコシダーゼ活性が低い酵素液を使用することが効率的である。β−グルコシダーゼ活性の好ましい範囲は、０．２０Ｕ／ｍＬ以下であり、より好ましくは、０．１６Ｕ／ｍＬ以下である。特に好ましくは、０．１５Ｕ以下である。
上述のＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ及びβ−グルコシダーゼにおける、それぞれの活性の絶対値は、後述する培養方法において、培養液の上澄み１ｍＬ中に含まれる活性量のことを差す。ただし、本発明でいう酵素活性比は、上述の培養液の上澄みに限らず、培養液を濃縮・分離・乾燥等の加工を施したものを用いて測定してもよい。
【００２１】
本発明は、セルラーゼ活性の中でも、特に、ＣＭＣ−ａｓｅとＭＣＣ−ａｓｅとの活性比に着目したものである。この活性比は、ＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅとして、個別に測定された酵素活性値（Ｕ／ｍＬ）から、（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）の式を用いて得られるものである。本発明のセルラーゼは、この活性比として８．０以下を満たす必要がある。本活性比が８．０を超えると、ＣＭＣ−ａｓｅとＭＣＣ−ａｓｅの相乗効果が得られなくなり、セロビオースの蓄積濃度が低下するため好ましくない。好ましい範囲は７．０以下であり、さらに好ましくは６．５以下である。下限は、特に設定されないが、セルロース系物質を分解できる現実的な範囲としては０．５以上である。
【００２２】
また、本発明のセルラーゼは、β−ＧｌｕｃｏｓｉｄａｓｅとＭＣＣ−ａｓｅの活性比も特定の範囲を満たす必要がある。この活性比も、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅとして、個別に測定された酵素活性値（Ｕ／ｍＬ）から、（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）の式を用いて得られるものである。本発明のセルラーゼは、この活性比として０．０１６以下を満たす必要がある。この活性比が、０．０１６を超えると、セルラーゼ中のβ−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの作用が大きくなり、セロオリゴ糖の分解が進むため、結果としてセロビオースの蓄積濃度が低くなる。好ましい範囲は、０．０１５以下であり、より好ましい範囲は、０．０１０以下である。この活性比は小さい程、セロビオースの蓄積濃度が高くなるため、下限と特に設定されないが、工業的に得られる範囲としては０．００１以上である。
【００２３】
以下に本発明のＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−グルコシダーゼの測定方法を示す。
（１）ＣＭＣ−ａｓｅ活性
２０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した１％カルボキシメチルセルロースナトリウム塩溶液を４８０μｌ用意する。これに適当に希釈した酵素液２０μｌを加え、４０℃で３０分間反応させる。９５℃、１５分間加熱して反応を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２４】
（２）ＭＣＣ−ａｓｅ活性
５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に懸濁した１．２５質量％の結晶性セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名：セオラスＰＨ−１０１を水分６０％として、三英製作所製、商品名：万能攪拌混合機でフック羽根により、９０分間、１２６ｒｐｍで混練攪拌したもの）の基質液０．４ｍｌに適当に希釈した酵素液を０．１ｍｌ添加し、４０℃で３０分間反応後、９５℃で１５分間加熱して反応を停止させた後、３，５−ジニトロサリチル酸法により還元糖を比色定量する。セロビオース標準液を用いて標準曲線を作成し、セロビオース換算で１分間に１μｍｏｌの還元糖を遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２５】
（３）β−グルコシダーゼ活性
２００ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）に溶解した２．０質量％のセロビオース（Ａｌｄｒｉｃｈ製：特級グレード）の基質液０．３ｍｌに酵素液０．３ｍｌを添加し、４０℃で３０分間反応後、９５℃で１５分間加熱し反応を停止させた後、ムタロターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせた酵素法試薬であるグルコース定量キット（グルコースCII-テストワコー、和光純薬工業社製）を用いて、反応液中のグルコース濃度を定量する。１分間に１μｍｏｌのグルコースを遊離する酵素量を１酵素単位（１Ｕ）と定義する。
【００２６】
本発明のセルラーゼは、セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来のものである。
本発明で使用されるセルラーゼ生産菌は、酵素を分泌し、その酵素がセルロース系物質を分解するものであれば、その菌種は特に限定されない。セルラーゼの起源は、例えば、公知のセルラーゼを生産する微生物として以下のものがある。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅ−ｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎｕｓ）属、イルペックス（Ｉｒｐｅｘ）属、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属等の「セルラーゼ」（講談社サイエンティフィック発行（１９８７））、「セルロースの事典」（朝倉書店発行（２０００））に記載される菌が生産するセルラーゼを挙げることができるが、セルロースを分解する酵素であれば、上記公知の菌由来の酵素に限らず、新規の菌由来の酵素も、本発明のセルラーゼに含まれる。
【００２７】
上記のうち特に適しているのは、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物である。すなわち、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を接種し、培養することにより、本発明のセルラーゼ活性の高い酵素を製造することができる。
【００２８】
本発明の酵素液を、セロオリゴ糖の製造に使用する場合は、上記のＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物の中でも、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株を用いることが好ましい。さらに上述のＮＢＲＣ３１３２９株に公知の変異処理が施された、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３）またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）を使用することが好ましい。上記の方法において、さらにセロオリゴ糖を高収率で製造する為には、上記のＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株あるいはＡＫＣ−０１５株を親株として、セロオリゴ糖を高収率かつ高選択率で得られるよう、公知の変異処理を施された変異株を使用することが好ましい。
【００２９】
なお、ＧＬ−１株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に、２００５年４月１５日に、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３として、ＡＫＣ−０１５株は、独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６））に、２００７年６月１３日に、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９としてそれぞれ寄託されている。また、ＧＬ−１株は、中華民国（台湾）食品工業発展研究所（ＦＩＲＤＩ）に、２００５年１０月７日に受託番号ＢＣＲＣ９３００８２として寄託されている。
【００３０】
ここでいう公知の変異処理とは、セルラーゼ生産能を有する微生物を、必要であれば紫外線照射やニトロソグアニジンのような変異誘発剤を使用し、変異誘導処理し、それらの菌株からセロオリゴ糖生産効率の高い菌株を選ぶ処理のことである。変異誘導処理に用いる微生物としては、親株としてＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０３２３）、またはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センター、受託番号；ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）を用いることが好ましい。
【００３１】
変異処理の一例としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株またはＡＫＣ−０１５株を、ポテトデキストロース寒天斜面培地上で２８℃、３〜１０日間培養する。生成した胞子を生理的食塩水に１００，０００〜１００，０００，０００ 個／ｍｌになるよう懸濁し、ＥＭＳ（ｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎａｔｅ）で変異処理を施す（１００〜５００μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．０、２８℃、５〜２４時間）。セロオリゴ糖生産性の高いセルラーゼを分泌する菌株の選択は、この変異誘発処理胞子の懸濁液から遠心分離により胞子を集め、よく洗浄し、グルコースなどを炭素源として培養し、培養物の酵素活性を公知の方法で測定することで達成される。例えば、各変異処理菌株の培養物を用いて、セロビオースまたは結晶セルロースを基質として酵素分解し、生成した還元糖を定量してもよく、公知の発色基質を使用し培養物と酵素反応させることで定性的に目的の菌株を選択してもよい。
【００３２】
本発明の酵素組成物は、上記したセルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することによって製造することができる。
【００３３】
本発明の酵素組成物の製造方法で使用する本培養用培地は、炭素源を１質量％以上であることが好ましい。炭素源濃度を高めることで、セルラーゼの生産性が向上するのみならず、特にＭＣＣ−ａｓｅを高めることができる。この炭素源濃度が高い程、上述の効果が高まるため、上限は特に設定されないが、現実的な範囲としては、９９質量％以下である。
【００３４】
本発明で用いる炭素源としては、特に制限はないが、例えば、パルプ、セルロースパウダー、結晶セルロース、セロビオース、濾紙、一般紙類、おがくず、ふすま、もみがら、バガス、大豆粕、コーヒー粕、澱粉、ラクトース、グルコース、グリセロール、エタノール、有機酸等が挙げられる。等が使用することができる。その中でも、特に、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等のセルロース系物質を多く含むものが、セルラーゼ誘導剤としても作用するため好ましい。
【００３５】
本発明で用いるその他の培地成分は、セルラーゼ活性を高められるものであれば、何も用いても自由であるが、例えば次のものが挙げられる。窒素源としては、硝酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、植物加工品、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、蛋白分解物等の有機窒素含有物を添加することができる。無機塩類としては、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、ＭｎＣｌ3 ・４Ｈ2Ｏ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ等が使用される。必要ならば有機微量栄養物を含有する培地が使用される。上述の窒素源でも特に、アオイ科に属する植物の種子由来の成分を含有することが好ましい。アオイ科に属する植物の種子としては、ワタ、オクラ、ハイビスカス、ムクゲ、フヨウ、タチアオイなどの種子が挙げられ、好ましくは、綿実などを使用できる。アオイ科に属する植物の種子由来の成分としては、例えば、綿実粕を用いるこができる。ここでいう綿実とは、アオイ科ワタ属に属する植物の種子、およびその外皮のことであり、綿実粕とは、綿実から綿実油を搾取した残さのことである。本発明の綿実粕は、上述の綿実に加え、種子、綿実殻、リンター、綿花、花弁等を含んでもよい。Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する微生物を培養するための培地における綿実の添加量は、酵素液のセルラーゼ活性と密接に関連するものであり、高力価のセルラーゼを得る為には、培地における綿実粕の添加量は、０．１〜１０質量％が好ましい。培地における綿実粕のより好ましい添加量としては、０．２〜７質量％であり、さらに好ましくは２〜５質量％である。
【００３６】
本発明のセロオリゴ糖を選択的に製造するためのβ−グルコシダーゼ活性の低減された酵素組成物を得るためには、アオイ科に属する植物の種子由来の成分に加えて、硫酸イオン、硫酸水素イオンおよびアンモニウムイオンから選ばれる少なくとも一つを液体培地に添加することが好ましく、特に、硫酸アンモニウムを液体培地に添加することが好ましい。培地における硫酸アンモニウムの添加量としては、０．０１〜１０質量％がβ−グルコシダーゼ活性を低減させるために好ましく、０．０２〜２質量％がより好ましい。特に好ましい範囲としては０．１〜０．５質量％である。
【００３７】
以下に培養方法について、説明する。
培養には通常の通気撹拌培養装置あるいは固体培養装置が用いられ、前記培地を使用して、温度２０〜４０℃で培養すれば、３〜１０日間でセルラーゼ活性は最高となる。次いで、培養液から遠心分離、濾過などの公知の方法によって菌体を除去し上澄液を得る。この上澄液は、このまま粗酵素液として使用することができる。
【００３８】
本発明で用いる培養方法としては、特に通気攪拌培養装置が適しており、通気状態、攪拌状態を制御することで、酸素移動係数（ＫＬａ）を適切な範囲制御することが好ましい。このＫＬａは、全容１０Ｌの通気攪拌培養装置（丸菱エンジ製、６枚羽根フラットタービン二段）を用いて、０．２ｖｖｍ、イオン交換水を６Ｌ仕込んだ場合に、スタティックメソッドで測定されるものであり、培養時の通気攪拌状態を表す指標となる。好ましいＫＬａの範囲は、２０〜３００であり、より好ましい範囲は、５０〜２８０である。このＫＬａは、培養槽のスケール、攪拌翼が変わっても、適宜調製されるものである。
【００３９】
本発明で用いる培養方法において、培養液のｐＨを制御することが好ましい。好ましいｐＨの範囲としては、２．８〜３．５である。この範囲にｐＨを制御することで、セルラーゼ生産菌の生育およびＭＣＣ−ａｓｅの生産と、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅの抑制のバランスがとれる。セロビオースの蓄積濃度を高めることを目的とするが、このことによりβ−グルコシダーゼを抑え、結果として、セロオリゴ糖の生産を高めることに繋がる。より好ましい範囲は、２．９〜３．１である。
【００４０】
なお、本発明は、特定の活性比を有するセルラーゼが、セロビオース蓄積性、セロオリゴ糖選択性を向上することを見出したものであり、この酵素をセルロース系物質の酵素分解に用いることでセロオリゴ糖の生産性を高めたセロオリゴ糖の製造方法である。従って、セルラーゼは、本発明の活性比の範囲を満たすものであれば、上記の方法に関わらずとも、市販セルラーゼ等の公知の手段で得られた酵素を、公知の精製、分画方法を組み合わせて得られたものでもよい。
【００４１】
本発明においては、上記した本発明の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することによってセロオリゴ糖を製造することができる。以下にセロオリゴ糖の製造方法を説明する。
【００４２】
酵素分解方法は、公知の方法を使用すればよく、特に制限されるものではないが、一例としては、基質としてセルロース系物質を水性媒体中に懸濁させ、本発明のセルラーゼを添加し、攪拌または振とうしながら、加温して糖化反応を行う方法が挙げられる。
【００４３】
上記方法において、懸濁方法、攪拌方法、セルラーゼ・基質の添加方法・添加順序、それらの濃度等の反応条件は、セロオリゴ糖がより高収率で得られるよう適宜調整されるものである。その際の、反応液のｐＨ及び温度は、酵素が失活しない範囲内であればよく、一般的には、常圧で反応を行う場合、温度は５〜９５℃、ｐＨは１〜１１の範囲でよい。
本発明でいうＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株、ＧＬ−１株、ＡＫＣ−０１５株、またはそれらの変異株をセルラーゼ生産菌とし、得られたセルラーゼを用いる場合には、セルロースの酵素分解は、緩衝液中で、温度５０〜７０℃、ｐＨ３．０〜８．０の範囲で行うことが好ましい。
【００４４】
本発明で使用するセルロース系物質は、セルロースを含有する水不溶性繊維質物質であることが好ましい。その由来は、植物性でも動物性でもよく、それを産生する動植物としては、例えば、木材、竹、麦藁、稲藁、コーンコブ、コットン、ラミー、バガス、ケナフ、ビート、ホヤ、バクテリアセルロース等が挙げられる。また、本発明には、上記の動植物が産生する天然セルロース系物質に加え、天然セルロース系物質を一旦、化学的・物理的に溶解、または膨潤させた後、再生して得られる再生セルロース系物質、およびセルロース系原料を化学的に修飾させたセルロース誘導体系物質を用いてもよい。これらのセルロース系物質は、工業的には、パルプ、セルロース粉末、結晶セルロース等の天然セルロース系原料、レーヨン等の再生セルロース、アルカリセルロース、リン酸膨潤セルロース等の各種再生セルロース系原料、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩等の各種セルロース誘導体系原料のいずれでもよい。但し、得られるセロオリゴ糖を医薬品、食品、化粧品に用いるには、天然セルロース系原料を使用することがより好ましい。原料としてこれらのうち１種のセルロース系物質を使用しても、２種以上を混合したものを使用することも可能である。
【００４５】
この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。酵素分解反応において、セロビオースによる生成物阻害を回避するためには、反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つことが、セロオリゴ糖の生産性を向上する上で重要である。反応系内のセロビオース濃度を特定範囲に保つ方法としては、限外ろ過、逆浸透ろ過等の膜ろ過により、反応系から生成したセロビオースを抜き出す方法でもよく、活性炭、竹、木材等の乾燥植物粉等の有機多孔質基材、二酸化珪素等の無機多孔質基材等を反応系に導入し、それらにセロビオースを吸着させる方法でもよく、セルロース基質をカラム等に固定化し、セルラーゼを含む反応液を流通させる方法でもよく、セルラーゼを高分子等に固定化し、セルロースを含む反応液を流通させる方法でもよい。
但し、上述の酵素分解方法において、反応系内のセルロース系物質の濃度を高濃度にすることは、セロビオース蓄積をより高める上で重要である。好ましいセルロース系物質濃度は、反応液中に２質量％以上であり、より好ましくは５質量％以上であり、さらに好ましくは７．５質量％以上である。この濃度は高いほど、セロビオースの蓄積濃度を高められるため、上限は特に設定されないが、通常の反応系で、均一攪拌が得られる範囲としては、３０質量％以下が好ましい。上述のセルロース系物質の濃度は、バッチ式反応においては、仕込み時の濃度として設定してもよく、連続式の反応系では、分解に伴い減少したセルロース分を、適宜、添加（追加）して反応系内のセルロース系物質濃度を高めてもよい。
【００４６】
上述の酵素分解により得られたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、必要に応じて、脱色、脱塩、酵素除去等の精製処理を施すことができる。精製方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、活性炭処理、イオン交換樹脂処理、クロマトグラフィー処理、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理、晶析処理等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４７】
上記の方法で精製されたセロオリゴ糖を主成分とする水溶液は、そのまま使用することができるが、必要に応じて、乾燥により固化させてもよい。乾燥方法は、公知の方法であれば特に制限されないが、例えば、噴霧乾燥、凍結乾燥、ドラム乾燥、薄膜乾燥、棚段乾燥、気流乾燥、真空乾燥等を使用してもよく、これらを単独で使用しても、２種以上を組み合わせてもよい。
【００４８】
上記の精製、乾燥処理時のセロオリゴ糖の媒体としては、水以外に、必要に応じて、有機溶剤等を使用してもよい。ここで使用される有機溶剤にも、特に制限されないが、例えば、医薬品、食品およびそれらの添加剤を製造する工程で使用されるものが好ましく、「医薬品添加物事典」（薬事日報社（株）発行）、「日本薬局方」、「食品添加物公定書」（いずれも廣川書店発行）に溶剤として分類されるものが挙げられる。水、有機溶剤は、それらを単独で使用しても、２種以上を併用することも自由であり、１種の媒体で一旦分散させた後、その媒体を除去し、異なる媒体に分散させてもよい。
【００４９】
上記の工程を経たセロオリゴ糖の形態には、特に制限はないが、例えば、常温で固体、懸濁液、エマルジョン、シロップ、溶液状で使用できる。固体状セロオリゴ糖の一例としては、粉末、顆粒、ペレット、成形体、積層体、固体分散体等が挙げられる。
【００５０】
本発明により得られるセロオリゴ糖の用途は、特に制限されないが、例えば、食品、化粧品、医薬品、一般工業製品等の分野で、食品成分、化粧品成分、色素成分、香料成分、医薬品薬効成分、農薬成分、飼料成分、肥料成分、培地成分、分析用試薬成分、および添加剤、中間原料、発酵原料等として使用してもよい。
【００５１】
本発明により得られるセロオリゴ糖は、食品では、例えば、ゼリー、プリン、ヨーグルト等のゲル、マヨネーズ、ドレッシング、ソース類、たれ類、スープ、野菜加工品等の調味料、カレー、ハヤシ、ミートソース、シチュー、スープ等のレトルト食品、チルド食品、ハンバーグ、ベーコン、ソーセージ、サラミソーセージ、ハム類等の畜産加工品、蒲鉾、ちくわ、魚肉ハム・ソーセージ、揚げ蒲鉾等の水練製品、パン、生麺、乾麺、マカロニ、スパゲッティ、中華饅頭の皮、ケーキミックス、プレミックス、ホワイトソース、餃子・春巻等の皮類などの小麦加工食品、カレー、ソース、スープ、佃煮、ジャムなどの缶詰、瓶詰類、キャンデー、トローチ、錠菓、チョコレート、ビスケット、クッキー、米菓、和洋菓子、洋生菓子、スナック菓子、砂糖菓子、プリンなどの菓子類、フライ類、コロッケ、餃子、中華饅頭等の調理加工品、野菜ペースト、肉のミンチ、果実ペースト、魚介類のペースト等のペースト類などに使用される。また、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ホイップクリーム、練乳、バター、ヨーグルト、チーズ、ホワイトソース等の乳製品、マーガリン、ファットスプレッド、ショートニング等の油脂加工品等に使用される。さらに、コーラ等の炭酸飲料、炭酸入り、アルコール入り、乳製品と混合した果実飲料、果汁又は、果実入り飲料、乳性飲料等の飲料、コーヒー、牛乳、豆乳、ココア牛乳、フルーツ牛乳、ヨーグルト等の乳酸／乳性飲料等、煎茶、ウーロン茶、抹茶、紅茶等の茶飲料等に使用してもよい。
【００５２】
本発明で得られたセロオリゴ糖は、乳酸菌、乳酸かん菌等の活性化等の腸内有用細菌叢賦活、血中糖濃度、血中インシュリン濃度の低減、血中コレステロールの低減、体脂肪率の低減、脂質・糖質代謝促進機能、便通・便臭改善、抗う触性等の各種生理活性が期待できるため、上記の通常食品用途に加え、生理活性物質として、機能性食品、健康食品、ダイエット食品等の用途で使用してもよい。
【００５３】
また、本発明により得られるセロオリゴ糖は、高純度であるため、各種セロオリゴ糖誘導体への化学変換原料として使用してもよい。
【００５４】
本発明を実施例などに基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例などにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
［実施例１］
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳を綿実粕（ファーマメディア、トレダース社製）：０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．２０ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：０．１５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．０３０ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：０．０３０ｇ、アデカノールＬＧ１０９：０．１０ｍＬ、微量元素液（Ｈ3ＢＯ3６ｍｇ （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ２６ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １００ｍｇ ＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ ４０ｍｇ ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８ｍｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解並びに懸濁した液）：０．１０ｍｌに水を加え全量を９９．０ｇに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、３００ｍｌ容三角フラスコに導入し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）１．０ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、２８℃で３日間前培養した。
【００５６】
次に、この培養液３本分を、綿実粕：７５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：１２.０ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：１．８０ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：１．８０ｇ、アデカノールＬＧ１０９：６．０ｍｌ、微量元素液：６．０ｍｌに水を加え、５８８０ｇに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、１０Ｌ容の通気攪拌培養装置（丸菱エンジ製）に導入し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）１５０ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した本培養用培地に接種して、２８℃、０．６ｖｖｍで、６００ｒｐｍで攪拌（水を用いたＫＬａの測定結果は２５０）しながら、６日間培養した。培養中のｐＨは１０％リン酸水溶液、又は１０％水酸化ナトリウム水溶液で適宜調整され、最終的に培養が終了した際のｐＨを測定した。（ｐＨ＝３．０）
【００５７】
６日目に培養液を遠心分離し、その上澄液１ｍＬにおける、各セルラーゼ活性（ＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）を測定した。その結果を表１に示す。
【００５８】
〔実施例２〕
実施例１から、通気攪拌培養時の結晶セルロース濃度を４．０％、綿実粕濃度を２．０％に変更し、それ以外は同様の操作で培養した。得られた結果を表１に示す。（ｐＨ＝３．０）
〔実施例３〕
実施例１から、通気攪拌培養時の結晶セルロース濃度を２．０％、綿実粕濃度を１．０％に変更し、２８℃、０．６ｖｖｍで、５００ｒｐｍで攪拌（水を用いたＫＬａの測定結果は２３０）それ以外は同様の操作で培養した。得られた結果を表１に示す。（ｐＨ＝３．１４）
【００５９】
［比較例１］
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＧＬ−１株をポテトデキストロース寒天斜面培地上で、２８℃、７日間培養して胞子を十分形成させる。その１白金耳を綿実粕（ファーマメディア、トレダース社製）：０．１５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．０６ｇ、（ＮＨ4）2ＳＯ4：０．０４５ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．００９ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：０．００９ｇ、アデカノールＬＧ１０９：０．０３ｍｌ、微量元素液（Ｈ3ＢＯ3６ｍｇ （ＮＨ4）6Ｍｏ7Ｏ24・４Ｈ2Ｏ ２６ｍｇ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ １００ｍｇ ＣｕＳＯ4．５Ｈ2Ｏ ４０ｍｇ ＭｎＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８ｍｇ ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２００ｍｇを水１００ｍｌに溶解並びに懸濁した液）：０．０３ｍｌを水３０ｍｌに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、１５０ｍｌ容三角フラスコに３０ｍｌ分注し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）０．３ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した前培養用培地に接種して、２８℃で３日間前培養した。
【００６０】
次にこの培養液を綿実粕：１ｇ、ＫＨ2ＰＯ4：０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ：０．０３ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ：０．０３ｇ、アデカノールＬＧ１０９：０．１ｍｌ、微量元素液０．１ｍｌを水１００ｍｌに溶解及び懸濁させ、ｐＨ４．０に調整し、５００ｍｌ容三角フラスコに１００ｍｌ分注し、結晶セルロース（旭化成ケミカルズ製、商品名ＰＨ−１０１）２ｇを添加後、オートクレーブ滅菌した本培養用培地に接種して、２８℃で６日間培養した。
培養後は、実施例１と同様に、各種活性を測定した。結果を表１に示す。
【００６１】
〔比較例２〕
Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来の市販酵素「スミチームＣＳ：粉末グレード（新日本化学製）」を用いて、１０％濃度で水に懸濁し、それを用いて、各酵素活性を測定した。結果を表１に示す。
【００６２】
＜セルロース系物質の調整、およびセロビオース蓄積濃度の測定方法＞
実施例１〜４、比較例１〜３で得られた酵素液を用いて、実際に、セルロース系物質として前処理した結晶セルロースを分解し、生成した糖をＨＰＬＣで定量する方法で、セロビオースの蓄積濃度を測定した。
【００６３】
（１）セルロース基質
市販の結晶セルロース「セオラスＰＨ−１０１（旭化成ケミカルズ製）」を７．５質量％濃度で水に懸濁し、市販のビーズミルを用いて、湿式で微粉砕した。粉砕装置は、アシザワファインテック製ビーズミル「スターミル２Ｌ容」を用いて、ビーズ径φ０．５ｍｍのジルコニアビーズを、８０容積％充填し、所定時間循環することで、平均径（Ｄ５０）で４μｍ以下に微粉砕した。
【００６４】
（２）酵素分解
上記で得られた微粉砕セルローススラリー、及び各実施例、比較例で得られた上澄液を、１００ｍＬ容の三角フラスコに全量２５ｇとなるように導入し、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、スターラー攪拌しながら、５５℃の水浴中で４時間反応した。４時間反応後は、反応を停止し、遠心分離により得られた上澄み液を、ＨＰＬＣで測定し、セロビオース濃度を測定した。結果を表１に示す。ここでセルロース濃度は、５質量％、反応液１ｍＬ当たりのＭＣＣ−ａｓｅが４Ｕになるように、各実施例及び比較例で得た培養液を添加した。
【００６５】
表１から、セルラーゼ生産菌の培養において、菌種、炭素源濃度、ＫＬａ、ｐＨを制御し、各セルラーゼ酵素活性（ＣＭＣ−ａｓｅ、ＭＣＣ−ａｓｅ、β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）の活性比を特定の範囲を満たす実施例１〜４は、セロビオースの蓄積濃度が、比較例に対し、格段に優れていることが分かる。
【００６６】
【表１】
【００６７】
〔実施例４〕
セルロース系物質として、市販の結晶セルロース「セオラスＰＨ−１０１（旭化成ケミカルズ製）」を、１５％濃度の水酸化ナトリウム水溶液中で、１０質量％濃度で懸濁し、３０分間攪拌した。攪拌後、遠心式ろ過装置（１μｍ）で、固形分を回収し、水洗した後、１０質量％で水懸濁液を作成し、酢酸水溶液で中和した。中和後、上述と同様にろ過し、基質を調製した（水分６６．３％）。
【００６８】
この基質を用い、セルロース系物質濃度が１０質量％として、実施例１及び２と同様の操作で、酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、スターラー攪拌しながら、５５℃の水浴中で４時間反応した。４時間反応後は、反応を停止し、遠心分離により得られた上澄み液を、ＨＰＬＣで測定し、セロビオース濃度を測定した。ここで、反応液１ｍＬ当たりのＭＣＣ−ａｓｅは４Ｕであった。結果より、セロビオース蓄積濃度は、３．４８％であった。
【００６９】
〔実施例４〕
実施例３と同様の操作で、基質を調製し、セルロース系物質濃度を１５質量％にする以外は、実施例３と同様の操作で酵素反応を行った。結果より、セロビオース蓄積濃度は、３．６６％であった。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の製造方法により得られるセロオリゴ糖は、通常の食品素材に加え、機能性食品素材、医薬品およびその他化学品の中間体合成材料等の化学変換原料、発酵原料として食品、医薬品、一般工業製品分野で好適に利用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
【請求項２】
前記結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）が９．０Ｕ／ｍＬ以上である、請求項１に記載の酵素組成物。
【請求項３】
前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する菌株である、請求項１又は２に記載の酵素組成物。
【請求項４】
前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株及び／又はＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株から変異させて得られる変異株である、請求項１から３の何れかに記載の酵素組成物。
【請求項５】
前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）である、請求項１から３の何れかに記載の酵素組成物。
【請求項６】
セルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することを含む、請求項１から５の何れかに記載の酵素組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１から５の何れかに記載の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【請求項１】
セルラーゼ生産菌を培養して得られる培養液由来の酵素組成物であって、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む酵素組成物。
【請求項２】
前記結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）が９．０Ｕ／ｍＬ以上である、請求項１に記載の酵素組成物。
【請求項３】
前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ属に属する菌株である、請求項１又は２に記載の酵素組成物。
【請求項４】
前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株及び／又はＴｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＮＢＲＣ３１３２９株から変異させて得られる変異株である、請求項１から３の何れかに記載の酵素組成物。
【請求項５】
前記セルラーゼ生産菌が、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ＡＫＣ−０１５株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０８３９）である、請求項１から３の何れかに記載の酵素組成物。
【請求項６】
セルラーゼ生産菌を培養し、水溶性セルロース分解活性（ＣＭＣ−ａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（ＣＭＣ−ａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が８．０以下であり、β−グルコシダーゼ活性（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）と結晶セルロース分解活性（ＭＣＣ−ａｓｅ）との活性比（β−Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ／ＭＣＣ−ａｓｅ）が０．０１６以下であるセルラーゼを含む培養液を回収することを含む、請求項１から５の何れかに記載の酵素組成物の製造方法。
【請求項７】
請求項１から５の何れかに記載の酵素組成物の存在下で、セルロース系物質を酵素分解することを含む、セロオリゴ糖の製造方法。
【公開番号】特開２００９−１７８０５６（Ｐ２００９−１７８０５６Ａ）
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１７６６６（Ｐ２００８−１７６６６）
【出願日】平成２０年１月２９日（２００８．１．２９）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年８月１３日（２００９．８．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２９日（２００８．１．２９）
【出願人】（３０３０４６３１４）旭化成ケミカルズ株式会社 (2,513)
【Ｆターム（参考）】
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