黄色ブドウ球菌検出用プライマーセット
【課題】食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を迅速かつ特異的に、高感度で検出するためのＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法による黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び該黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出のためのＰＣＲ試薬キットを提供すること。
【解決手段】黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な特定の塩基配列ｆｅｍ−ＡＦ及びｆｅｍ−ＲＫＫからなる２種のプライマーのセットからなる。本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットは、特に、マルチプレックスＰＣＲ法のようなＰＣＲ法のプライマーとして用いて、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌の存在を特異的かつ高感度で検出することを可能とする。
【解決手段】黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な特定の塩基配列ｆｅｍ−ＡＦ及びｆｅｍ−ＲＫＫからなる２種のプライマーのセットからなる。本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットは、特に、マルチプレックスＰＣＲ法のようなＰＣＲ法のプライマーとして用いて、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌の存在を特異的かつ高感度で検出することを可能とする。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を迅速かつ特異的に、高感度で検出するためのＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法による黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び該黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出のためのＰＣＲ試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は食中毒の主要な原因菌であることから病原性の面で非常に重要な菌種であると考えられている。この細菌は、鶏肉や豚肉などの食肉及びその加工品、乳及びその加工品、卵及びその加工品、魚介類、野菜類、パン、缶詰製品などの食品、飼料や更に下水などの各種環境、ヒトでは鼻咽腔粘膜、皮膚や腸管内などに存在し、環境中に広く分布している（非特許文献１）。
【０００３】
黄色ブドウ球菌は、通性嫌気性のグラム陽性球菌である。従来、黄色ブドウ球菌を生化学性状で判定する場合、コアグラーゼ、耐塩性、溶血性、糖分解性試験などを行い判定していた（非特許文献２）。従来、黄色ブドウ球菌の検出には、検体中に存在する菌を、増菌や分離培養などを経て、各種生化学試験などを行い、検出していたが、これらの手法では結果を得るまでに多くの時間を要する。したがって、現在では、遺伝子を用いた検出法が注目されている。例えば、黄色ブドウ球菌に特異的な遺伝子領域を増幅し、確認するＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が用いられている（特許文献１、５、非特許文献３）。
【０００４】
黄色ブドウ球菌に関しては、これまでｇａｐＡ、ｎｕｃ、ｆｅｍＡ、ｍｅｃＡ遺伝子を標的としたＰＣＲ法による検出が報告されている（特許文献１、４及び非特許文献３、４）。しかしながら、選択した増幅対象遺伝子又はプライマー設計部位によっては、特異性又は感度の点で問題があった。
【０００５】
最近、このＰＣＲ法の一種であるマルチプレックスＰＣＲ法を用いて、複数の微生物を同時に検出しようとする試みが提案されている（特許文献２、３）。この方法を用いれば、複数の有害菌を検出する上では、それぞれの微生物に対して別々に検出するよりも遥かに効率的である。更に、懸案であった検出感度についても近年改善されてきており、食品製造現場においても適用可能な技術として実用化され、その検出キットは市販されるまでに至っている（非特許文献５）。
【０００６】
このように、食中毒の主要な原因菌等の遺伝子を用いた検出法として、ＰＣＲを用いた検出法についても上記のような改良が行われ、その検出感度の向上も図られたが、しかし、その特異的かつ高感度の検出を可能とするためには、何よりも、かかる特異的かつ高感度の検出を可能とするプライマーの開発が必要となる。例えば、上記のようにマルチプレックスＰＣＲ法を用いて、複数の微生物を同時に検出する方法のための検出キットが市販されているが（非特許文献５）、該市販キットには食中毒有害菌としては非常に重要な黄色ブドウ球菌に対する検出用プライマーが含まれておらず、したがって、該検出方法を黄色ブドウ球菌の検出に適用して、特異的かつ高感度の検出を可能とするためには、かかる検出法に用いて、特異的かつ高感度の検出を可能とする黄色ブドウ球菌検出用プライマーの開発が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３３２１４号公報。
【特許文献２】ＷＯ２００５／０６４０１６号公報。
【特許文献３】特開２００７−２７４９３４号公報。
【特許文献４】特開２００６−２７１３７０号公報。
【特許文献５】特開２００７−４４０１３号公報。
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】食品汚染病原微生物, 2003, 235-265。
【非特許文献２】食水系感染症と細菌性食中毒, 1991, 336-359。
【非特許文献３】Tetuya IKEDAら, J. Vet. Med. Sci., 2005, 67, 1037-1041。
【非特許文献４】Paule S. M.ら, J. Mol. Diagn., 2004, 6, 191-196。
【非特許文献５】月刊ＨＡＣＣＰ, 2009年3月号, 53-57。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を迅速かつ特異的に、高感度で検出するためのＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法による黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び該黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出のためのＰＣＲ試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、黄色ブドウ球菌をＰＣＲ法を用いて特異的かつ高感度で検出することができるプライマーセットについて鋭意探索する中で、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列を用いることにより、該配列をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌を検体中から特異的に、迅速かつ高感度に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列表の配列番号１及び配列番号２に示されるそれぞれ塩基配列ｆｅｍ−ＡＦ及びｆｅｍ−ＲＫＫからなる２種のプライマーのセットからなる。本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットは、特に、マルチプレックスＰＣＲ法のようなＰＣＲ法のプライマーとして用いて、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌の存在を特異的かつ高感度で検出することを可能とする。
本発明の黄色ブドウ球菌ｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットは、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌を高感度で検出することが可能であるが、種々の細菌株について試験した結果、本発明のプライマーセットによってそのすべての黄色ブドウ球菌株が陽性に検出され、一方、他のスタフィロコッカス属細菌種に対してはいずれも陰性の結果が得られたことに示されるように、本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットは、黄色ブドウ球菌を極めて特異的に検出することができる。
【００１２】
また本発明は、本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することからなる黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び、プライマーセットとして、本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キットを包含する。
【００１３】
すなわち具体的には本発明は、［１］配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットや、［２］上記［１］記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することを特徴とする黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法や、［３］プライマーセットとして、上記［１］記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キットからなる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用いることにより、ＰＣＲ法により、食品検体やその他の各種の検体において、食中毒やその他の障害の原因菌となる黄色ブドウ球菌の存在を特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することが可能となる。特に、本発明のプライマーセットをマルチプレックスＰＣＲと組み合わせることで、他の有害菌と同時に検出することが可能となり、食品検体やその他の各種の検体における有害菌の検出に効果的かつ有力な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例において、本発明のプライマーセットを用いた黄色ブドウ球菌及びその他のスタフィロコッカス属菌についてのＰＣＲ反応を行った結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、本発明のプライマーセットを用いて、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、リステリア、腸管出血性大腸菌について、マルチプレックスＰＣＲ反応を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することからなる黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び、該黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キットからなる。本発明において、黄色ブドウ球菌の検出の対象となるｆｅｍＡ遺伝子は、メチシリン耐性に必須の因子であり、全ての黄色ブドウ球菌に存在している（J. Clin. Microbiol. 2000 38(3) 1032-1035）。
【００１７】
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１及び配列番号２で示されるが、該塩基配列はプライマーとしての機能を変更しない範囲で適宜変更することができる。例えば、選択性や検出感度及び再現性から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチド断片とすることができ、塩基配列は、化学合成或いは天然のどちらでもよく、プライマーが標識されているか否かは問わない。また、プライマーとしても機能を果たす限り、プライマー（オリゴヌクレオチド）に１又は２以上の塩基が付加していてもよく、また１又は２の塩基が置換、欠失していても良い。
【００１８】
本発明のプライマーを、食中毒菌検出用マルチプレックスＰＣＲに組み込んで使用する際には、各食中毒菌のＰＣＲ産物の塩基長が１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の差を生じるようにプライマーを設計する。このようにすることにより、供試プライマー特異的なＰＣＲ増幅産物の全てを肉眼的に識別可能なバンドを形成することができる。
【００１９】
本発明において、ＰＣＲ法により食中毒細菌の検出を行うには、該ＰＣＲ法に用いるプライマーとして、本発明のプライマーセットを用いる点を除いて、通常行われるＰＣＲ法により食中毒細菌の検出方法と変わるところはない。すなわち、（ａ）検体からＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）当該ＤＮＡを鋳型として、前述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、（ｃ）ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含む、黄色ブドウ球菌を検出する方法である。
【００２０】
本発明において、黄色ブドウ球菌の検出の対象となる検体としては、食中毒やその他の障害の原因菌となる黄色ブドウ球菌の存在が問題となる検体が対象となり、特に制限はない。核酸増幅による黄色ブドウ球菌の同定のための検体としては、食品検体、例えば乳製品、食肉製品、野菜類、魚介類など、また環境検体、例えば土壌、水など、また臨床検体、例えば種々の化膿性部位（皮膚、耳漏など）、血液などを挙げることができる。
【００２１】
これら検体をＰＣＲ法の試料として用いる場合には、検体中に存在する菌の濃縮、分離、菌体からの核酸分離や、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うこともできる。菌の濃縮、分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが知られており、適宜選択できる。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の遊離には、例えばLysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法もある。また、特に食品検体によってはさらなる精製の必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（J. Appl. Bacteriol, 1991,70,121-126；J. Clin. Pathol, 1996,49,861-863）。
【００２２】
例えば食品中に存在すると考えられる黄色ブドウ球菌を適切な培地で増菌培養し、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡ試料を調製しても良い。
【００２３】
次いで、上記で調製した試料中のＤＮＡを鋳型として、本発明のＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲを行う。係るＰＣＲ工程は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)などの標準的なプロトコール集に記載の方法、或いはそれを修飾したり、改変した方法を用い、既に市販されているＰＣＲ装置などを用いて行うことができる。
【００２４】
より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に使用される反応液は、市販のＰＣＲ測定キットなどに添付されている反応液を使用すればよい。また、ＰＣＲ反応に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、何れの生物種由来でもよい。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGene Taq、TaKaRa Taq、TaKaRa ExTaq HSなどが例示できる。
【００２５】
ＰＣＲ条件としては、熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。プライマーセットの使用量は、０．０１μＭ〜１００μＭ、好ましくは０．０６μＭである。
【００２６】
マルチプレックスＰＣＲによって複数の食中毒菌を同時に検査する際には、検出を目的とする食中毒菌の検出用プライマーを混合してＰＣＲ反応に供する。ＰＣＲ反応に使用される反応液、ＰＣＲの条件、プライマーセットの使用量は、ＰＣＲ法を実施する際の条件と同じである。
【００２７】
ＰＣＲによる増幅が終了した後、反応液中の増幅ＤＮＡを検出する。ＤＮＡの検出は常法に準じて行えばよく、例えば、ＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のＤＮＡ断片をエチジウムブロマイド染色、蛍光試薬などで検出する方法が例示され、増幅されたＤＮＡ断片の存在及びその長さを確認できる。また、インターカレーターとしての効果を示す蛍光色素を、あらかじめＰＣＲ反応液中に添加し、ＰＣＲ反応産物の二重鎖ＤＮＡを経時的に検出するリアルタイムＰＣＲ法、あるいはＰＣＲ反応産物と特異的に結合する、蛍光を付加したヌクレオチドプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ法を用いてもよい。
【００２８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［ＤＮＡの抽出］
黄色ブドウ球菌および他のスタフィロコッカス属菌をTryptic Soy Agarにて３５℃、２４時間培養した。培地上に形成された菌体からDNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN社製）を用いてＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとした。
【００３０】
［ＰＣＲ反応］
鋳型ＤＮＡ０．５μｌを用い、滅菌蒸留水１３．４μｌ、１０×反応用緩衝液２μｌ、ｄＮＴＰ混合溶液１．６μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物：各２．５ｍＭ）、１μＭプライマー（配列番号１、２）各１．２μｌおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq（５Ｕ／μｌ）：タカラバイオ社製）０．１μｌを加えて全量２０μｌの反応液を調製した。これを９５℃、１分の熱変性後、９５℃、２０秒、６０℃、３０秒、７２℃、３０秒の過程を４０サイクル行い、７２℃、７分インキュベートしＰＣＲ反応を行った。この反応は、ＰＣＲ装置DNA Engine Dyad PTC-220（Bio-Rad社製）にて行った。
【００３１】
［増幅ＤＮＡの確認］
増幅されたヌクレオチド断片を確認するため、濃度１．５％（Ｗ／Ｖ）のアガロースゲルにて定電圧１００Ｖ、３５分の電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）にて染色し、ＵＶ照射下で断片を確認した。なお、反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、２９６ｂｐ相当の断片が検出された場合を陽性とした。
【００３２】
［結果］
配列番号１、２によるプライマーセットは、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。表１に示した黄色ブドウ球菌６株、その他のスタフィロコッカス属菌２１株を用いてＰＣＲ反応を行った結果、黄色ブドウ球菌のみ２９６ｂｐ相当の増幅断片が検出された。結果を、表１（使用菌株及び評価結果）及び図１（ＰＣＲ検出結果）に示した。
【００３３】
既に報告されている黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマー（J. Food Prot. 2007，70，1656-1662 ; J. Mol. Diagn. 2004，6，191-196）では、一部の黄色ブドウ球菌から増幅産物が得られない或いは非特異的増幅産物が検出されるということがあった。表１及び図１に示されるように、本発明によるｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットを使用してＰＣＲ法を実施することにより、黄色ブドウ球菌を特異的に検出することが可能であった。このことから、ｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットは、黄色ブドウ球菌を特異的に検出するためのプライマーとして有効であることが示された。
【００３４】
【表１】
【実施例２】
【００３５】
［ＤＮＡの抽出］
黄色ブドウ球菌及びサルモネラ、リステリア、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をTryptic Soy Brothにて３５℃、２４時間培養した。２０ｍｌの菌体を１５，０００ｒｐｍ、２分の遠心により集菌し、上澄を除去した。ＴＥ緩衝液（LysozymeおよびAchromopeptidase １ｍｇ／ｍｌを含む）５００μｌに懸濁し、３７℃、３０分インキュベートした。反応後、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.のPreparation of Genomic DNA from Bacteriaに従いＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとした。
【００３６】
［マルチプレックスＰＣＲ反応］
既に報告されている３種の食中毒菌をマルチプレックスＰＣＲにて検出する方法（J. Food Prot., 2005, 68, 551-556）に本発明プライマーセット（配列番号１、２）を追加した反応を行った。
【００３７】
鋳型ＤＮＡ １μｌを用い、滅菌蒸留水１９．７５μｌ、１０×反応用緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ混合溶液５μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物：各２ｍＭ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μｌ、１μＭプライマー（配列番号１、２）各３μｌ、１０μＭサルモネラ用プライマー各０．６μｌ、１０μＭリステリア用プライマー各０．５μｌ、１０μＭ腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７用プライマー各０．４μｌおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold（登録商標）DNA Polymerase（５Ｕ／μｌ）：Applied Biosystems社製）０．２５μｌを加えて全量５０μｌの反応液を調製した。これを９５℃、１０分の熱変性後、９５℃、２０秒、６０℃、３０秒、７２℃、３０秒の過程を４０サイクル行い、７２℃、７分インキュベートしマルチプレックスＰＣＲ反応を行った。この反応は、ＰＣＲ装置DNA Engine Dyad PTC-220（Bio-Rad社製）にて行った。
【００３８】
［増幅ＤＮＡの確認］
増幅されたヌクレオチド断片を確認するため、濃度１．５％（Ｗ／Ｖ）のアガロースゲルにて定電圧１００Ｖ、３５分の電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）にて染色し、ＵＶ照射下で断片を確認した。なお、反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、黄色ブドウ球菌は２９６ｂｐ相当、サルモネラは３７５ｂｐ相当、リステリアは２３４ｂｐ相当、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は１２０ｂｐ相当の断片が検出された場合を陽性とした。
【００３９】
［結果］
表２に示した黄色ブドウ球菌、サルモネラ、リステリア、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を用いてマルチプレックスＰＣＲ反応を行った結果、それぞれ２９６ｂｐ、３７５ｂｐ、２３４ｂｐ、１２０ｂｐ相当の増幅断片が検出された。また、４菌種のＤＮＡを混合しマルチプレックスＰＣＲ反応を行った結果、２９６ｂｐ、３７５ｂｐ、２３４ｂｐ、１２０ｂｐ相当の増幅断片が全て検出された。結果を図２に示した。
【００４０】
図２に示されるように、本発明においてｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットを使用してマルチプレックスＰＣＲ法を実施することにより、黄色ブドウ球菌だけでなく、その他食中毒菌であるサルモネラ、リステリア、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を同時に検出することが可能であった。
【００４１】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のプライマーセットによる黄色ブドウ球菌の検出法は、食品や環境検体、臨床検体などの検査対象物に存在する黄色ブドウ球菌の有無を迅速にかつ特異的に判別することができる検査法として用いることができ、本発明は、乳製品、食肉製品、野菜類や魚介類などでの黄色ブドウ球菌の汚染の検出に有効な手段を提供する。また、マルチプレックスＰＣＲ法に適用し、該プライマーセットをマルチプレックスＰＣＲに組み込んだ場合でも、他の汚染菌の検出感度に影響を与えることなく、黄色ブドウ球菌を高感度で検出する有効な方法を提供する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を迅速かつ特異的に、高感度で検出するためのＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法による黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び該黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出のためのＰＣＲ試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌は食中毒の主要な原因菌であることから病原性の面で非常に重要な菌種であると考えられている。この細菌は、鶏肉や豚肉などの食肉及びその加工品、乳及びその加工品、卵及びその加工品、魚介類、野菜類、パン、缶詰製品などの食品、飼料や更に下水などの各種環境、ヒトでは鼻咽腔粘膜、皮膚や腸管内などに存在し、環境中に広く分布している（非特許文献１）。
【０００３】
黄色ブドウ球菌は、通性嫌気性のグラム陽性球菌である。従来、黄色ブドウ球菌を生化学性状で判定する場合、コアグラーゼ、耐塩性、溶血性、糖分解性試験などを行い判定していた（非特許文献２）。従来、黄色ブドウ球菌の検出には、検体中に存在する菌を、増菌や分離培養などを経て、各種生化学試験などを行い、検出していたが、これらの手法では結果を得るまでに多くの時間を要する。したがって、現在では、遺伝子を用いた検出法が注目されている。例えば、黄色ブドウ球菌に特異的な遺伝子領域を増幅し、確認するＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法が用いられている（特許文献１、５、非特許文献３）。
【０００４】
黄色ブドウ球菌に関しては、これまでｇａｐＡ、ｎｕｃ、ｆｅｍＡ、ｍｅｃＡ遺伝子を標的としたＰＣＲ法による検出が報告されている（特許文献１、４及び非特許文献３、４）。しかしながら、選択した増幅対象遺伝子又はプライマー設計部位によっては、特異性又は感度の点で問題があった。
【０００５】
最近、このＰＣＲ法の一種であるマルチプレックスＰＣＲ法を用いて、複数の微生物を同時に検出しようとする試みが提案されている（特許文献２、３）。この方法を用いれば、複数の有害菌を検出する上では、それぞれの微生物に対して別々に検出するよりも遥かに効率的である。更に、懸案であった検出感度についても近年改善されてきており、食品製造現場においても適用可能な技術として実用化され、その検出キットは市販されるまでに至っている（非特許文献５）。
【０００６】
このように、食中毒の主要な原因菌等の遺伝子を用いた検出法として、ＰＣＲを用いた検出法についても上記のような改良が行われ、その検出感度の向上も図られたが、しかし、その特異的かつ高感度の検出を可能とするためには、何よりも、かかる特異的かつ高感度の検出を可能とするプライマーの開発が必要となる。例えば、上記のようにマルチプレックスＰＣＲ法を用いて、複数の微生物を同時に検出する方法のための検出キットが市販されているが（非特許文献５）、該市販キットには食中毒有害菌としては非常に重要な黄色ブドウ球菌に対する検出用プライマーが含まれておらず、したがって、該検出方法を黄色ブドウ球菌の検出に適用して、特異的かつ高感度の検出を可能とするためには、かかる検出法に用いて、特異的かつ高感度の検出を可能とする黄色ブドウ球菌検出用プライマーの開発が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−３３２１４号公報。
【特許文献２】ＷＯ２００５／０６４０１６号公報。
【特許文献３】特開２００７−２７４９３４号公報。
【特許文献４】特開２００６−２７１３７０号公報。
【特許文献５】特開２００７−４４０１３号公報。
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】食品汚染病原微生物, 2003, 235-265。
【非特許文献２】食水系感染症と細菌性食中毒, 1991, 336-359。
【非特許文献３】Tetuya IKEDAら, J. Vet. Med. Sci., 2005, 67, 1037-1041。
【非特許文献４】Paule S. M.ら, J. Mol. Diagn., 2004, 6, 191-196。
【非特許文献５】月刊ＨＡＣＣＰ, 2009年3月号, 53-57。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を迅速かつ特異的に、高感度で検出するためのＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用いたＰＣＲ法による黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び該黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出のためのＰＣＲ試薬キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の課題を解決するために、黄色ブドウ球菌をＰＣＲ法を用いて特異的かつ高感度で検出することができるプライマーセットについて鋭意探索する中で、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列を用いることにより、該配列をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌を検体中から特異的に、迅速かつ高感度に検出することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットであって、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域にアニーリング可能な配列表の配列番号１及び配列番号２に示されるそれぞれ塩基配列ｆｅｍ−ＡＦ及びｆｅｍ−ＲＫＫからなる２種のプライマーのセットからなる。本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットは、特に、マルチプレックスＰＣＲ法のようなＰＣＲ法のプライマーとして用いて、食品検体やその他の検体に存在する、黄色ブドウ球菌の存在を特異的かつ高感度で検出することを可能とする。
本発明の黄色ブドウ球菌ｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットは、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌を高感度で検出することが可能であるが、種々の細菌株について試験した結果、本発明のプライマーセットによってそのすべての黄色ブドウ球菌株が陽性に検出され、一方、他のスタフィロコッカス属細菌種に対してはいずれも陰性の結果が得られたことに示されるように、本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットは、黄色ブドウ球菌を極めて特異的に検出することができる。
【００１２】
また本発明は、本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することからなる黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び、プライマーセットとして、本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キットを包含する。
【００１３】
すなわち具体的には本発明は、［１］配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットや、［２］上記［１］記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することを特徴とする黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法や、［３］プライマーセットとして、上記［１］記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キットからなる。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用いることにより、ＰＣＲ法により、食品検体やその他の各種の検体において、食中毒やその他の障害の原因菌となる黄色ブドウ球菌の存在を特異的、簡便、迅速かつ高感度に検出することが可能となる。特に、本発明のプライマーセットをマルチプレックスＰＣＲと組み合わせることで、他の有害菌と同時に検出することが可能となり、食品検体やその他の各種の検体における有害菌の検出に効果的かつ有力な手段を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の実施例において、本発明のプライマーセットを用いた黄色ブドウ球菌及びその他のスタフィロコッカス属菌についてのＰＣＲ反応を行った結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例において、本発明のプライマーセットを用いて、黄色ブドウ球菌、サルモネラ菌、リステリア、腸管出血性大腸菌について、マルチプレックスＰＣＲ反応を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明は、配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセット、該プライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することからなる黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法、及び、該黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キットからなる。本発明において、黄色ブドウ球菌の検出の対象となるｆｅｍＡ遺伝子は、メチシリン耐性に必須の因子であり、全ての黄色ブドウ球菌に存在している（J. Clin. Microbiol. 2000 38(3) 1032-1035）。
【００１７】
本発明でプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号１及び配列番号２で示されるが、該塩基配列はプライマーとしての機能を変更しない範囲で適宜変更することができる。例えば、選択性や検出感度及び再現性から考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さを持ったヌクレオチド断片とすることができ、塩基配列は、化学合成或いは天然のどちらでもよく、プライマーが標識されているか否かは問わない。また、プライマーとしても機能を果たす限り、プライマー（オリゴヌクレオチド）に１又は２以上の塩基が付加していてもよく、また１又は２の塩基が置換、欠失していても良い。
【００１８】
本発明のプライマーを、食中毒菌検出用マルチプレックスＰＣＲに組み込んで使用する際には、各食中毒菌のＰＣＲ産物の塩基長が１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の差を生じるようにプライマーを設計する。このようにすることにより、供試プライマー特異的なＰＣＲ増幅産物の全てを肉眼的に識別可能なバンドを形成することができる。
【００１９】
本発明において、ＰＣＲ法により食中毒細菌の検出を行うには、該ＰＣＲ法に用いるプライマーとして、本発明のプライマーセットを用いる点を除いて、通常行われるＰＣＲ法により食中毒細菌の検出方法と変わるところはない。すなわち、（ａ）検体からＤＮＡを抽出する工程、（ｂ）当該ＤＮＡを鋳型として、前述のプライマーセットを用いてＰＣＲを行う工程、（ｃ）ＤＮＡの増幅の有無を検出する工程を含む、黄色ブドウ球菌を検出する方法である。
【００２０】
本発明において、黄色ブドウ球菌の検出の対象となる検体としては、食中毒やその他の障害の原因菌となる黄色ブドウ球菌の存在が問題となる検体が対象となり、特に制限はない。核酸増幅による黄色ブドウ球菌の同定のための検体としては、食品検体、例えば乳製品、食肉製品、野菜類、魚介類など、また環境検体、例えば土壌、水など、また臨床検体、例えば種々の化膿性部位（皮膚、耳漏など）、血液などを挙げることができる。
【００２１】
これら検体をＰＣＲ法の試料として用いる場合には、検体中に存在する菌の濃縮、分離、菌体からの核酸分離や、核酸の濃縮などの操作を前処理として行うこともできる。菌の濃縮、分離の方法としては、ろ過、遠心分離などが知られており、適宜選択できる。食品検体や環境検体などに存在する菌体からの核酸の遊離には、例えばLysozymeやProteinase Kなどによって菌体を処理し、１００℃での加熱により菌体から核酸を遊離させる方法もある。また、特に食品検体によってはさらなる精製の必要があれば、フェノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿や遠心等により核酸の精製を行い、最終的にＴＥ緩衝液などに再溶解させ鋳型ＤＮＡとして試験に供してもよい（J. Appl. Bacteriol, 1991,70,121-126；J. Clin. Pathol, 1996,49,861-863）。
【００２２】
例えば食品中に存在すると考えられる黄色ブドウ球菌を適切な培地で増菌培養し、寒天培地上に形成されたコロニーからＤＮＡ試料を調製しても良い。
【００２３】
次いで、上記で調製した試料中のＤＮＡを鋳型として、本発明のＰＣＲ用プライマーセットを用いてＰＣＲを行う。係るＰＣＲ工程は、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001)などの標準的なプロトコール集に記載の方法、或いはそれを修飾したり、改変した方法を用い、既に市販されているＰＣＲ装置などを用いて行うことができる。
【００２４】
より詳細には、例えば、ＰＣＲ反応に使用される反応液は、市販のＰＣＲ測定キットなどに添付されている反応液を使用すればよい。また、ＰＣＲ反応に用いる耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは９０〜９５℃の温度で活性を保持していれば、何れの生物種由来でもよい。使用される耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えばGene Taq、TaKaRa Taq、TaKaRa ExTaq HSなどが例示できる。
【００２５】
ＰＣＲ条件としては、熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。プライマーセットの使用量は、０．０１μＭ〜１００μＭ、好ましくは０．０６μＭである。
【００２６】
マルチプレックスＰＣＲによって複数の食中毒菌を同時に検査する際には、検出を目的とする食中毒菌の検出用プライマーを混合してＰＣＲ反応に供する。ＰＣＲ反応に使用される反応液、ＰＣＲの条件、プライマーセットの使用量は、ＰＣＲ法を実施する際の条件と同じである。
【００２７】
ＰＣＲによる増幅が終了した後、反応液中の増幅ＤＮＡを検出する。ＤＮＡの検出は常法に準じて行えばよく、例えば、ＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースなどを使用した慣用のゲル電気泳動に付し、泳動後のＤＮＡ断片をエチジウムブロマイド染色、蛍光試薬などで検出する方法が例示され、増幅されたＤＮＡ断片の存在及びその長さを確認できる。また、インターカレーターとしての効果を示す蛍光色素を、あらかじめＰＣＲ反応液中に添加し、ＰＣＲ反応産物の二重鎖ＤＮＡを経時的に検出するリアルタイムＰＣＲ法、あるいはＰＣＲ反応産物と特異的に結合する、蛍光を付加したヌクレオチドプローブを用いるリアルタイムＰＣＲ法を用いてもよい。
【００２８】
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は係る例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２９】
［ＤＮＡの抽出］
黄色ブドウ球菌および他のスタフィロコッカス属菌をTryptic Soy Agarにて３５℃、２４時間培養した。培地上に形成された菌体からDNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN社製）を用いてＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとした。
【００３０】
［ＰＣＲ反応］
鋳型ＤＮＡ０．５μｌを用い、滅菌蒸留水１３．４μｌ、１０×反応用緩衝液２μｌ、ｄＮＴＰ混合溶液１．６μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物：各２．５ｍＭ）、１μＭプライマー（配列番号１、２）各１．２μｌおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（TaKaRa Ex Taq（５Ｕ／μｌ）：タカラバイオ社製）０．１μｌを加えて全量２０μｌの反応液を調製した。これを９５℃、１分の熱変性後、９５℃、２０秒、６０℃、３０秒、７２℃、３０秒の過程を４０サイクル行い、７２℃、７分インキュベートしＰＣＲ反応を行った。この反応は、ＰＣＲ装置DNA Engine Dyad PTC-220（Bio-Rad社製）にて行った。
【００３１】
［増幅ＤＮＡの確認］
増幅されたヌクレオチド断片を確認するため、濃度１．５％（Ｗ／Ｖ）のアガロースゲルにて定電圧１００Ｖ、３５分の電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）にて染色し、ＵＶ照射下で断片を確認した。なお、反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、２９６ｂｐ相当の断片が検出された場合を陽性とした。
【００３２】
［結果］
配列番号１、２によるプライマーセットは、黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定領域を増幅するように設計してある。表１に示した黄色ブドウ球菌６株、その他のスタフィロコッカス属菌２１株を用いてＰＣＲ反応を行った結果、黄色ブドウ球菌のみ２９６ｂｐ相当の増幅断片が検出された。結果を、表１（使用菌株及び評価結果）及び図１（ＰＣＲ検出結果）に示した。
【００３３】
既に報告されている黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマー（J. Food Prot. 2007，70，1656-1662 ; J. Mol. Diagn. 2004，6，191-196）では、一部の黄色ブドウ球菌から増幅産物が得られない或いは非特異的増幅産物が検出されるということがあった。表１及び図１に示されるように、本発明によるｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットを使用してＰＣＲ法を実施することにより、黄色ブドウ球菌を特異的に検出することが可能であった。このことから、ｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットは、黄色ブドウ球菌を特異的に検出するためのプライマーとして有効であることが示された。
【００３４】
【表１】
【実施例２】
【００３５】
［ＤＮＡの抽出］
黄色ブドウ球菌及びサルモネラ、リステリア、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７をTryptic Soy Brothにて３５℃、２４時間培養した。２０ｍｌの菌体を１５，０００ｒｐｍ、２分の遠心により集菌し、上澄を除去した。ＴＥ緩衝液（LysozymeおよびAchromopeptidase １ｍｇ／ｍｌを含む）５００μｌに懸濁し、３７℃、３０分インキュベートした。反応後、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.のPreparation of Genomic DNA from Bacteriaに従いＤＮＡを抽出・精製した。得られたＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとした。
【００３６】
［マルチプレックスＰＣＲ反応］
既に報告されている３種の食中毒菌をマルチプレックスＰＣＲにて検出する方法（J. Food Prot., 2005, 68, 551-556）に本発明プライマーセット（配列番号１、２）を追加した反応を行った。
【００３７】
鋳型ＤＮＡ １μｌを用い、滅菌蒸留水１９．７５μｌ、１０×反応用緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰ混合溶液５μｌ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物：各２ｍＭ）、２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ １０μｌ、１μＭプライマー（配列番号１、２）各３μｌ、１０μＭサルモネラ用プライマー各０．６μｌ、１０μＭリステリア用プライマー各０．５μｌ、１０μＭ腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７用プライマー各０．４μｌおよび耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold（登録商標）DNA Polymerase（５Ｕ／μｌ）：Applied Biosystems社製）０．２５μｌを加えて全量５０μｌの反応液を調製した。これを９５℃、１０分の熱変性後、９５℃、２０秒、６０℃、３０秒、７２℃、３０秒の過程を４０サイクル行い、７２℃、７分インキュベートしマルチプレックスＰＣＲ反応を行った。この反応は、ＰＣＲ装置DNA Engine Dyad PTC-220（Bio-Rad社製）にて行った。
【００３８】
［増幅ＤＮＡの確認］
増幅されたヌクレオチド断片を確認するため、濃度１．５％（Ｗ／Ｖ）のアガロースゲルにて定電圧１００Ｖ、３５分の電気泳動を行った。泳動後、エチジウムブロマイド水溶液（０．５μｇ／ｍｌ）にて染色し、ＵＶ照射下で断片を確認した。なお、反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、黄色ブドウ球菌は２９６ｂｐ相当、サルモネラは３７５ｂｐ相当、リステリアは２３４ｂｐ相当、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７は１２０ｂｐ相当の断片が検出された場合を陽性とした。
【００３９】
［結果］
表２に示した黄色ブドウ球菌、サルモネラ、リステリア、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を用いてマルチプレックスＰＣＲ反応を行った結果、それぞれ２９６ｂｐ、３７５ｂｐ、２３４ｂｐ、１２０ｂｐ相当の増幅断片が検出された。また、４菌種のＤＮＡを混合しマルチプレックスＰＣＲ反応を行った結果、２９６ｂｐ、３７５ｂｐ、２３４ｂｐ、１２０ｂｐ相当の増幅断片が全て検出された。結果を図２に示した。
【００４０】
図２に示されるように、本発明においてｆｅｍＡ遺伝子増幅用プライマーセットを使用してマルチプレックスＰＣＲ法を実施することにより、黄色ブドウ球菌だけでなく、その他食中毒菌であるサルモネラ、リステリア、腸管出血性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を同時に検出することが可能であった。
【００４１】
【表２】
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明のプライマーセットによる黄色ブドウ球菌の検出法は、食品や環境検体、臨床検体などの検査対象物に存在する黄色ブドウ球菌の有無を迅速にかつ特異的に判別することができる検査法として用いることができ、本発明は、乳製品、食肉製品、野菜類や魚介類などでの黄色ブドウ球菌の汚染の検出に有効な手段を提供する。また、マルチプレックスＰＣＲ法に適用し、該プライマーセットをマルチプレックスＰＣＲに組み込んだ場合でも、他の汚染菌の検出感度に影響を与えることなく、黄色ブドウ球菌を高感度で検出する有効な方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することを特徴とする黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法。
【請求項３】
プライマーセットとして、請求項１記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キット。
【請求項１】
配列表の配列番号１に示される塩基配列からなるプライマーと、配列表の配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーとからなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセット。
【請求項２】
請求項１記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを用い、ＰＣＲ法により黄色ブドウ球菌のｆｅｍＡ遺伝子の特定配列を増幅、検出することを特徴とする黄色ブドウ球菌の迅速かつ特異的検出方法。
【請求項３】
プライマーセットとして、請求項１記載の黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲプライマーセットを装備してなる黄色ブドウ球菌検出用ＰＣＲ試薬キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１２−３９９７７（Ｐ２０１２−３９９７７Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８６０３８（Ｐ２０１０−１８６０３８）
【出願日】平成２２年８月２３日（２０１０．８．２３）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月２３日（２０１０．８．２３）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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