（リグノ）セルロース材料の酵素による加水分解物のエタノール発酵からの蒸留残渣を用いてセルロース分解性およびヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法
【課題】セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法を提供する。
【解決手段】本方法は、（リグノ）セルロース性の材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いる。本方法は、（リグノ）セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、（リグノ）セルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて前処理された材料を酵素加水分解する工程と、適切なアルコール生成性の微生物によって前記加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、前記アルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を生産する工程とを包含し、該残渣は、工程２）のセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のために機能する、方法に統合されてもよい。
【解決手段】本方法は、（リグノ）セルロース性の材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いる。本方法は、（リグノ）セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、（リグノ）セルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて前処理された材料を酵素加水分解する工程と、適切なアルコール生成性の微生物によって前記加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、前記アルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を生産する工程とを包含し、該残渣は、工程２）のセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のために機能する、方法に統合されてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料からのエタノールの生産に係わる、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７０年代以来、成分多糖類の発酵可能な糖類への加水分解後のリグノ−セルロース性バイオマスのエタノールへの変換によって、非常に多くの研究の基礎が形成された。
【０００３】
落葉性樹木の木材および穀類のわらが最も広範に用いられる基質である。それらは、主として、約４０〜５０％のセルロース、２０〜２５％のヘミ−セルロースおよび１５〜２５％のリグニンによって構成される。
【０００４】
他の資源、専用の森林栽培物、アルコール生成性の植物、精糖所および穀類加工業者からの残渣、製紙産業からの残渣およびセルロース性またはリグノ−セルロース性材料からの変換産物が用いられ得る。
【０００５】
セルロース、ヘミ−セルロースおよびリグニンの３つのポリマーの中で、セルロースは、サッカロマイセス・セリビジェー（Saccharomyces cerevisiae）によってエタノールに容易に発酵するグルコースによって構成されるので、証明された高性能の産業プロセスにおいてエタノールに発酵させるための発酵可能な糖の主たる供給源である。ヘミ−セルロースに含まれるペントースは、エタノールに効率良く転換されるわけではない。エタノールへのバイオマスから誘導される単量体の糖の品質を向上させるためにサッカロマイセス、ピチア（Pichia）、カンジダ（Candida）、パチソレン（Pachysolen）、ザイモモナス（Zymomonas）、クレプシエラ（Klebsiella）、エシェリキア（Esherichia）属からの他の微生物が選択されてよい。
【０００６】
リグノ−セルロース性材料をエタノールに変換する方法（図１参照）は、物理化学的な前処理工程と、これに続けて行われる酵素的または化学的加水分解工程と、放出された糖をエタノール発酵させる工程と、エタノールを回収する工程とを包含する。
【０００７】
前処理工程の目的は、ヘミ−セルロースに含まれる糖、特には、ペントース（キシロースおよびアラビノース等）、ヘキソース（ガラクトース、マンノースおよびグルコース等）をモノマーの形態に遊離させ、リグニンおよびヘミ−セルロースのマトリクス中にゴム状になっているセルロースの利便性（accessibility）を向上させることにある。多くの技術が存在しており、酸性煮沸、アルカリ性煮沸、水蒸気爆砕、有機溶解方法等がある。前処理の効力は、ヘミ−セルロース回収度およびセルロース性残渣の加水分解に対する感受性によって測定される。緩和な酸性の前処理および水蒸気爆砕が最良の技術である。それらにより、ペントースを完全に回収し、加水分解に対してセルロースを良好に利用することが可能になる。
【０００８】
酸性による方法またはセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いる酵素的な方法のいずれかによって、セルロース性の残渣は加水分解される。トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）またはスエヒロタケ（Schizophyllum）属からの菌類または例えばクロストリジウム（Clostridium）属からの嫌気性菌等の微生物は、このような酵素を生じさせ、主として、植物を構成するポリマーの完全な加水分解に適したセルラーゼおよびキシラナーゼを含む。
【０００９】
強酸、特には硫酸により行われる酸性の方法は有効であるが、大量の化学薬品を必要とする（酸、次いで中和のための塩基）。酵素による加水分解は、このような不利な点を受けない；それは、緩和な条件下に行われ、かつ有効である。対照的に、酵素のコストは依然として非常に高い。この理由のため、コストを低減させるために非常に多くの研究が行われた：第一には、超生産性の株を選択することおよび発酵条件を改善することによって酵素の生産量を増大させること、第二には、前処理の段階を最適化することまたは前記酵素の特定の活性を改善することによって加水分解における酵素の量を低減させることである。最近の１０年の間、大部分の研究は、分子生物学的手段を備えた株を改変することによって排出されるリグノ−セルロース性の基質の加水分解に最も適切な酵素複合体を引き起こすセルラーゼの働きおよび酵素の発現の機構を理解することに関係する。
【００１０】
セルラーゼの生産のために最も一般的に用いられる微生物は、菌類トリコデルマ・リーゼイ（reesei）である。野生型の株は、誘導基質、例えばセルロースの存在下に、セルロースの加水分解に最良に適合されていると考えられる酵素複合体を排出することができる。酵素複合体の酵素は、３つの主要なタイプの活性種：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびセロビアーゼを含む。リグノ−セルロース分解性材料の加水分解に活性な性質を有する他のタンパク質もトリコデルマ・リーゼイによって生産される。例えば、キシラーゼである。誘導基質の存在は、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素の発現に重要である。炭素含有基質の性質は、酵素複合体の組成に大きな影響を有している。これは、セルロースまたはラクトース等の炭素含有誘導基質と関連してキシラーゼ活性を有意に改善し得るキシロースについての場合のことである。
【００１１】
従来の遺伝子突然変異技術により、セルラーゼにおいて超生産性であるトリコデルマ・リーゼイの株が生産されることが可能になり、例えば、ＭＣＧ７７（特許文献１，Ｇａｌｌｏ）、ＭＣＧ８０（非特許文献１）、ＲＵＴ Ｃ３０（非特許文献２）およびＣＬ８４７（非特許文献３）がある。改善により、野生型の株と比較してモノマーの糖、例えばグルコースに関する異化抑制に対する感受性が低い超生産性の株が生産された。
【００１２】
組み換え型の株も、異種遺伝子をクローニングすることによって、Ｑｍ９４１４、Ｒｕｔ Ｃ３０、ＣＬ８４７のトリコデルマ・リーゼイ株から得られた。例えば、セルラーゼの生産に必要な炭素源を多様化させるためのアスペルギルス・ニガー（niger）・インベルターゼおよび／または酵素加水分解の収率を改善するための過剰発現セロビアーゼがある。セロビアーゼは、反応中の酵素を制限すると考えられる。前記株は、発酵槽における培養のためのそれらの超生産性および適性を維持した。
【００１３】
トリコデルマ・リーゼイによってセルラーゼを生産する方法により、工業スケールへの延長に関する主要な改善の主題が形成された。
【００１４】
良好な酵素の生産性を得るために、トリコデルマ・リーゼイが生育することを可能にするような容易に吸収され得る炭素源およびセルラーゼの発現および培地への分泌を可能にする誘導基質を加えることが必要である。セルロースは、両方の役割を果たし得る。しかしながら、工業スケールで用いることは困難であり、可溶な炭素源であるグルコース、キシロースまたはラクトースによって置き換えられている。ラクトースは誘導基質としても作用する。セロビオースおよびソホロース等の他の可溶な糖が誘導物質として記載されているが、それらは高価過ぎて工業スケールで用いられ得ない。しかしながら、可溶な基質を用いたトリコデルマ・リーゼイによるセルビアーゼの生産物はバッチプロセスにおいてセルロースにより得られるものよりも遙かに劣っていることが分かった。これは、高濃度での容易に吸収可能な糖の抑制因子の作用に起因する。可能な炭素含有基質を連続的に供給すると、培地における残渣の濃度が制限され、糖の量が最適化されることによって異化抑制が大きくなり、より良好な収率およびより良好な酵素生産性を生じさせる（特許文献２を参照のこと。）
セルロース分解性酵素の生産のための工業的な方法において、ラクトースは、相変わらず、最も適切な基質の一つおよび最も安価なものの一つであるが、しかしながら、依然として高価であり、酵素の費用価格の約３分の１を示す。なされた進歩全てにも拘わらず、セルロース性のバイオマスをエタノールに変換する場合の酵素の費用は相変わらず高く、３０〜５０％であり、さらに、セルラーゼの生産のための炭素源としてラクトースを用いる場合に、この方法は外的な炭素源に依存する。この理由のために、紡績糸（spinning）、例えば加水分解されたヘミ−セルロースからの炭素含有基質の使用は、誘導炭素源が容易に入手可能であれば大きな前進である。
【特許文献１】米国特許第４２７５１６７号明細書
【特許文献２】仏国特許第２５５５６０３号明細書
【非特許文献１】アレン・エイ・エル（Allen A L）およびアンドレッティイ・アール・イー（Andreotti R E）著，「バイオテクノル−バイオエング（Biotechnol-Bioeng）」，第１２巻，１９８２年，ｐ．４５１−４５９
【非特許文献２】モンテネコート・ビー・エス（Montenecourt,B S）およびエブライ・ディー・イー（Eveleigh D E）著，「アプライ・エンビロン・ミクロバイオロ（Appl Environ Microbiol）」，第３４巻，１９９７年，ｐ．７７７−７８２
【非特許文献３】デュランド（Durand）ら著，プロク・コロスク（Proc Colloque）ＳＦＭ，「ジェネチーク・デス・ミクロオーガニズムス・インダストリエル（Genetique des microorganismes industriels）」，パリ，エイチ・ヘスロット（H HESLOT）出版，１９８４年，ｐ．３９−５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、特に、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料からのエタノールの生産に係わる、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産の方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するため、本発明は、セルロース分解性の微生物によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法であって、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いることを特徴とするものである。
【００１７】
上記本発明の方法において、前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための炭素源として用いられることが好ましい。
【００１８】
上記本発明の方法において、前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育のために用いられる他の炭素源への補給としての誘導炭素源として用いられることが好ましい。
【００１９】
上記本発明の方法において、前記残渣は、セルロース分解性の微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための唯一の炭素源として用いられることが好ましい。
【００２０】
上記本発明の方法において、セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウムおよびスエヒロタケ属からの菌類から選択されることが好ましい。
【００２１】
上記本発明の方法において、セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ・リーゼイ種に属することが好ましい。
【００２２】
上記本発明の方法において、セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料は、わら、木材、森林栽培物、アルコール生成性植物、精糖所および穀類加工業者からの残渣、製紙産業からの残渣およびセルロース性またはリグノ−セルロース性材料からの変換産物から選択されることが好ましい。
【００２３】
また、本発明は、セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、１）セルロース性またはリグノセルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、２）セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて、前処理された材料を酵素加水分解する工程と、３）適切なアルコール生成性の微生物によって、工程２）からの加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、４）工程３）において用いられたアルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を得る工程とを包含する方法において、該方法は、工程２）において用いられたセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を上記本発明の方法によって生産するために、該残渣が用いられることを特徴とするものである。
【００２４】
上記本発明において、工程４）において、蒸留によってエタノールが発酵マストから分離され、残渣は蒸留残液によって構成されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法を提供する。本方法は、（リグノ）セルロース性の材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いる。本方法は、（リグノ）セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、（リグノ）セルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて前処理された材料を酵素加水分解する工程と、適切なアルコール生成性の微生物によって前記加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、前記アルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を生産する工程とを包含し、該残渣は、工程２）のセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のために機能する、方法に統合されてもよい。
【００２６】
本発明の方法は、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いて、セルロース分解性の微生物によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産するので、酵素生産のための炭素源の入手が容易であり、工業スケールでの生産に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、セルロース性バイオマスの酵素加水分解物のモノマーの糖のエタノール発酵後に得られる残渣の、セルロース分解性の菌類株、特には、トリコデルマ属リーゼイからのものを用いるセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素の生産のための誘導炭素源としての使用に関する。主たる炭素源は、可溶な工業用糖（例えばグルコース、ラクトースまたはキシロース）または前処理されたバイオマスからのモノマーの形態のヘミセルロースフラクションの抽出物であってよい。残渣はまた、全体的な炭素源として、すなわち、微生物の生育および発現系の誘導のために用いられてよい。この炭素源は、遺伝子的に強化された株、特には組み換え株によって用いられ得る。
【００２８】
本発明の目的の一つは、容易に入手可能な誘導炭素または全体的な炭素の供給源を提案すること、セルロース性のバイオマスの加水分解に適切な活性を備えたセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産することである。本発明によるエタノール発酵残渣からのセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のためのフローチャートが図２に示されている。本発明はまた、品質向上できないエタノール共生産物の品質を内部的に向上させ得る。
【００２９】
バイオマスを前処理する際の第１工程は、セルロース性フラクションの酵素加水分解フラクションの感受性を改善し、ヘミセルロース性フラクションを加水分解するために行われる。最も適切な方法は、酸性条件下の水蒸気爆砕である。１５０〜２５０℃の数分にわたる最適条件下、それは、ヘミセルロースをモノマーに変換するが、損失、特には、主要な糖であるフルフラール、キシロースの損失を最小にする。放出される糖は、水相中の洗浄によって抽出されてよく、その後、抽出からの固体の残渣は、セルロースおよびリグニンのみを含む。抽出後、放出された糖は、酵素の生産のために、主たる炭素源として用いられるか、または、適切な株を用いる発酵によってエタノールに品質が向上させられる。
【００３０】
セルロースフラクション（加水分解されたヘミセルロース分解性フラクションおよび可能性としてのリグニンを含んでも含んでいなくてもよい）は、特定の株によって生産されるセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素によって加水分解される。トリコデルマ・リーゼイ・セルラーゼは、炭素含有基質がセルロース性またはリグノ−セルロース性のバイオマスから誘導される場合に最も有効であり最も適切である。加水分解されるべき材料は、乾燥した物質の６〜２５％、好ましくは１０〜２０％の量で水相中に懸濁させられ、ｐＨは、４〜５．５、好ましくは４．８〜５．２に調整され、温度は、４０〜６０℃、好ましくは４５〜５０℃に調整される。加水分解反応は、セルラーゼを加えることによって開始され、通常用いられる量は、前処理された基質のグラム当たり放出されたタンパク質 １０〜３０ｍｇである。反応は、概して、前処理の効力、セルラーゼの混合物の組成および加えられる酵素の量に応じて１５〜４８時間を要する。反応の後、放出された糖、特にはグルコースのアッセイが行われる。ろ過または遠心分離によって加水分解されていない固体フラクション（実質的にリグニンによって構成される）から糖溶液が分離される：これは、エタノール発酵のために用いられる。処理工程においてセルロース性フラクションが加水分解されたヘミセルロースを含まない場合、グルコースがこの工程で抜き出される主要な糖である。エタノール発酵からの残渣は、エタノールを分離した後、誘導炭素源または酵素生産のための主要な炭素源として用いられる。前記残渣の濃度は、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素を生産する方法に最良に適合された炭素源の濃度を得るように調整される。
【００３１】
一般的に、エタノールは、蒸留によって発酵マストから分離され、残渣は、蒸留障害物（distillation stop）によって構成される。
【００３２】
セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のために用いられる株は、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウムまたはスエヒロタケ属から、好ましくは、トリコデルマ・リーゼイ種からの菌類の株である。最良の性能の工業用株は、突然変異−選択方法によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素を改善するように改変されたトリコデルマ・リーゼイ種に属する株、例えばＩＦＰ ＣＬ８４７株（仏国特許第２５５５８０３号明細書）である：遺伝子組み換え技術によって改善された株も用いられてよい。
【００３３】
これらの株は、攪拌されかつ曝気された発酵槽において、それらの生育および酵素の生産に適合性のある条件下に培養される。その性質に応じて、バイオマスを生産するように選択される炭素含有基質は、滅菌前に発酵槽に導入されるか、または、該炭素含有基質は、別に滅菌され、滅菌後に２０〜３５ｇ／ｌの初期濃度を生じさせるように発酵槽に導入される。誘導源は、この相に加えられる必要はない。酵素の生産ために選択された基質を含む水溶液が、２００〜２５０ｇ／ｌの濃度に調製される。この溶液は、誘導基質を含まなければならない。これは、初期の基質の排出後に、最適化された量である３５〜４５ｍｇ／（細胞のｇ）を供給するために注入される（供給バッチ（fed batch））。培地中の糖の残渣濃度は、この供給バッチ期の間１ｇ／ｌ未満である。
【００３４】
下記実施例では、実施例１〜３は、適用のために与えられ、実施例４および５は本発明を例示する。
【００３５】
（実施例１：ラクトースによる酵素の生産）
セルラーゼの生産は、機械的に攪拌された発酵槽において行われた。培地は、以下の組成を有する：ＫＯＨ，１．６６ｇ／ｌ； ８５％Ｈ３ＰＯ４，２ｍｌ／ｌ， （ＮＨ４）２ＳＯ４，２．８ｇ／ｌ； ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．６ｇ／ｌ； ＣａＣｌ２，０．６ｇ／ｌ； ＭｎＳＯ４，３．２ｍｇ／ｌ； ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２．８ｍｇ／ｌ； ＣｏＣｌ２，４．０ｍｇ／ｌ； ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１０ｍｇ／ｌ； コーン・スティープ，１．２ｇ／ｌ； 消泡剤，０．５ｍｌ／ｌ。
【００３６】
１．７５リットルのミネラル培地および７０ｇのラクトースを含む発酵槽が１２０℃で滅菌され、次いで、ＣＬ８４７ トリコデルマ・リーゼイ株の液体前培養物 ０．２５リットルにより播種した。ｐＨの変動を制御するために５ｇ／ｌのフタル酸カリウムにより補給された前培養培地は、発酵槽のものと同一であった。前培養菌類は、ラクトースにより３０ｇ／ｌの濃度まで生育された。播種物のための生育期間は２〜３日であり、生育は２７〜３０℃で振とう台上で行われた。
【００３７】
４６時間の生育後、発酵槽からの初期の基質が排出され、２５０ｇ／ｌのラクトース溶液が４．５ｍｌ／ｈの流量で１４２時間の経過時間までに連続的に注入された。
【００３８】
温度は、バイオマスの生育期の間２７℃に維持され、その後、培養終了時まで２５℃にされた。ｐＨは、生育期の間５に調整され、その後、放出されるタンパク質の合成のために必要な窒素が供給されたアンモニア性溶液を加えることによって培養終了時まで４にされた。溶存酸素含有量は、曝気および攪拌を調整することによって１５〜２０％を超えるように維持された。
【００３９】
酵素の生産の後、ろ過または遠心分離により菌糸から細胞外タンパク質を分離した後にフォーリン（ローリー）法を用いて細胞外のタンパク質のアッセイが行われた。セルロース分解活性が、全体的な活性およびセロビアーゼ活性（リグノ−セルロース性バイオマスの酵素加水分解を制限すると考えられる）についてろ紙活性（ＦＰＵ：filter paper unit）法（filter paper activity method）を用いて測定された。ＦＰＵ活性は、５０ｇ／ｌの初期濃度でワットマン（登録商標）番号１ペーパーを用いて測定された；６０分中、等価な２ｇ／ｌのグルコースを遊離した、分析される酵素溶液の試験サンプルが決定された（比色アッセイ）。セロビアーゼ活性は、セロビオースを用いて２０ｍＭの濃度で測定された；３０分で０．５ｇ／ｌのグルコースを遊離したサンプルの量が測定された（酵素アッセイ）。
【００４０】
Ｕ／ｍｌを単位とする活性は、分当たりかつ酵素溶液のミリリットル当たりの遊離されたグルコースのマイクロモルで表現される。
【００４１】
最終マストの分析は、下記結果を生じさせた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（実施例２：キシロースによる酵素の生産）
酵素の生産は、実施例１と同一の条件下に行われた。
【００４４】
４０ｇの純粋なキシロースと共に１．７５リットルのミネラル培地を含む発酵槽がＣＬ８４７ トリコデルマ・リーゼイ株の液体前培地 ０．２５リットルにより播種された。前培養の炭素含有基質は、２０ｇ／ｌの濃度のグルコースであった。２７時間の生育後、初期の基質の排出の後に、２００ｇ／ｌのキシロース溶液が、５ｍｌ／時の流量で１６４時間の経過時間まで連続的に注入された。
【００４５】
最終マストの分析は、次の結果を生じさせた。
【００４６】
【表２】
【００４７】
（実施例３：２５〜７５％のラクトース−キシロース混合物による酵素の生産）
この実施例では、誘導基質としてラクトースが用いられ、初期のキシロース排出後の酵素生産期に単独で注入された。
【００４８】
実施例２に記載された条件下に発酵が行われた。酵素の生産のために注入された基質溶液は、２００ｇ／ｌの濃度のラクトースおよびキシロースの混合物（ラクトースの濃度は５０ｇ／ｌである）によって置き換えられた。注入は、１６４時間が経過した後に停止された。
【００４９】
最終マストの分析は、次の結果を生じさせた。
【００５０】
【表３】
【００５１】
（実施例４：処理されかつ脱ペントース化されたセルロース性材料の部分的な酵素加水分解物のエタノール発酵によって生産された残渣を誘導源として用いるキシロースによる酵素の生産）
実施例２に記載された条件下に発酵が行われた。バイオマスは、２０ｇ／ｌのキシロースにより生産されたバッチであった。キシロースが加えられた残渣から調製された溶液を有する供給バッチにおいて酵素が生産された。参照符号Ｈ１を有する残渣の溶液が次のようにして調製された。
【００５２】
酸性条件下の水蒸気爆砕およびペントース抽出による麦わらの処理の後に得られた６ｋｇの湿性の固体材料、すなわち、乾燥させられかつ洗浄された材料 １．４ｋｇが、０．７５リットルの０．５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ４．８）および０．７５リットルの市販のセルラーゼの溶液（すなわち、タンパク質 ３０ｇ）に溶解させられた。機械的に攪拌された反応器中で行われ、５０℃に維持された、２４時間にわたる酵素加水分解の後、遠心分離によって懸濁液が分離された。回収された液体フラクションは、９２ｇ／ｌのグルコース、１０．３ｇ／ｌのキシロース、１．０ｇ／ｌのアラビノースを含んでいた。サッカロマイセス・セリビジェー（Saccharomyces cerevisiae）を用いて前記フラクションについてエタノール発酵が行われた。パン酵母を用いてグルコースにより攪拌されたフラスコにおいて容量０．４リットルの播種物が調製された。加水分解物であるグルコースは、完全にエタノールに発酵させられた。得られたマストは、１００℃に加熱し遠心分離することによってタンパク質および酵母を含んでいなかった。減圧下に濃縮した後、０．８５リットルのエタノール不含有の残液（slop）Ｈ１が得られた。酵素の生産のために用いられた容量１．５リットルの基質溶液が、キシロースにより補給されたこの残液から、２００ｇ／ｌの炭素含有基質の最終濃度を得るように調製された。実施例１〜３に記載された条件下に発酵が行われた。１３６時間後に発酵は停止された。
【００５３】
最終マストの分析は、下記表に示される結果を生じさせた。残渣中の不純物に関連する所望でない着色反応を避けるためにタンパク質がトリクロロ酢酸により沈殿させられた。
【００５４】
【表４】
【００５５】
（実施例５：処理されかつ脱ペントースされたセルロース性材料の完全な加水分解物のエタノール発酵によって生産された残渣を誘導源として用いたキシロースによる酵素の生産）
実施例４に記載されたように、バイオマスは、２０ｇ／ｌのキシロースにより生産されたバッチであった。キシロースが加えられた残液から調製された基質の溶液を有する供給バッチにおいて酵素が生産された。本実施例の場合、参照符号Ｈ２を有する残液の溶液は、Ｈ１について記載されたように調製されたが、加水分解は、２４時間の加水分解後の初期添加と同一の酵素を加えながら４８時間まで延長された。加水分解物は、１１０．８ｇ／ｌのグルコース、１１．８ｇ／ｌのキシロースを含んでいた。エタノールを除去し濃縮した後の残液Ｈ２が、全糖 ２００ｇ／ｌを含む１．５リットルの基質溶液を調製するために用いられた。実施例４の条件下に発酵が行われた。発酵は、１５８時間後に停止された。
【００５６】
最終マストの分析は、次の結果を生じさせた。
【００５７】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】リグノ−セルロース性材料をエタノールに変換する方法を示すフローシートである。
【図２】本発明によるエタノール発酵残渣からのセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産を示すフローシートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料からのエタノールの生産に係わる、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
１９７０年代以来、成分多糖類の発酵可能な糖類への加水分解後のリグノ−セルロース性バイオマスのエタノールへの変換によって、非常に多くの研究の基礎が形成された。
【０００３】
落葉性樹木の木材および穀類のわらが最も広範に用いられる基質である。それらは、主として、約４０〜５０％のセルロース、２０〜２５％のヘミ−セルロースおよび１５〜２５％のリグニンによって構成される。
【０００４】
他の資源、専用の森林栽培物、アルコール生成性の植物、精糖所および穀類加工業者からの残渣、製紙産業からの残渣およびセルロース性またはリグノ−セルロース性材料からの変換産物が用いられ得る。
【０００５】
セルロース、ヘミ−セルロースおよびリグニンの３つのポリマーの中で、セルロースは、サッカロマイセス・セリビジェー（Saccharomyces cerevisiae）によってエタノールに容易に発酵するグルコースによって構成されるので、証明された高性能の産業プロセスにおいてエタノールに発酵させるための発酵可能な糖の主たる供給源である。ヘミ−セルロースに含まれるペントースは、エタノールに効率良く転換されるわけではない。エタノールへのバイオマスから誘導される単量体の糖の品質を向上させるためにサッカロマイセス、ピチア（Pichia）、カンジダ（Candida）、パチソレン（Pachysolen）、ザイモモナス（Zymomonas）、クレプシエラ（Klebsiella）、エシェリキア（Esherichia）属からの他の微生物が選択されてよい。
【０００６】
リグノ−セルロース性材料をエタノールに変換する方法（図１参照）は、物理化学的な前処理工程と、これに続けて行われる酵素的または化学的加水分解工程と、放出された糖をエタノール発酵させる工程と、エタノールを回収する工程とを包含する。
【０００７】
前処理工程の目的は、ヘミ−セルロースに含まれる糖、特には、ペントース（キシロースおよびアラビノース等）、ヘキソース（ガラクトース、マンノースおよびグルコース等）をモノマーの形態に遊離させ、リグニンおよびヘミ−セルロースのマトリクス中にゴム状になっているセルロースの利便性（accessibility）を向上させることにある。多くの技術が存在しており、酸性煮沸、アルカリ性煮沸、水蒸気爆砕、有機溶解方法等がある。前処理の効力は、ヘミ−セルロース回収度およびセルロース性残渣の加水分解に対する感受性によって測定される。緩和な酸性の前処理および水蒸気爆砕が最良の技術である。それらにより、ペントースを完全に回収し、加水分解に対してセルロースを良好に利用することが可能になる。
【０００８】
酸性による方法またはセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いる酵素的な方法のいずれかによって、セルロース性の残渣は加水分解される。トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus）、ペニシリウム（Penicillium）またはスエヒロタケ（Schizophyllum）属からの菌類または例えばクロストリジウム（Clostridium）属からの嫌気性菌等の微生物は、このような酵素を生じさせ、主として、植物を構成するポリマーの完全な加水分解に適したセルラーゼおよびキシラナーゼを含む。
【０００９】
強酸、特には硫酸により行われる酸性の方法は有効であるが、大量の化学薬品を必要とする（酸、次いで中和のための塩基）。酵素による加水分解は、このような不利な点を受けない；それは、緩和な条件下に行われ、かつ有効である。対照的に、酵素のコストは依然として非常に高い。この理由のため、コストを低減させるために非常に多くの研究が行われた：第一には、超生産性の株を選択することおよび発酵条件を改善することによって酵素の生産量を増大させること、第二には、前処理の段階を最適化することまたは前記酵素の特定の活性を改善することによって加水分解における酵素の量を低減させることである。最近の１０年の間、大部分の研究は、分子生物学的手段を備えた株を改変することによって排出されるリグノ−セルロース性の基質の加水分解に最も適切な酵素複合体を引き起こすセルラーゼの働きおよび酵素の発現の機構を理解することに関係する。
【００１０】
セルラーゼの生産のために最も一般的に用いられる微生物は、菌類トリコデルマ・リーゼイ（reesei）である。野生型の株は、誘導基質、例えばセルロースの存在下に、セルロースの加水分解に最良に適合されていると考えられる酵素複合体を排出することができる。酵素複合体の酵素は、３つの主要なタイプの活性種：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼおよびセロビアーゼを含む。リグノ−セルロース分解性材料の加水分解に活性な性質を有する他のタンパク質もトリコデルマ・リーゼイによって生産される。例えば、キシラーゼである。誘導基質の存在は、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素の発現に重要である。炭素含有基質の性質は、酵素複合体の組成に大きな影響を有している。これは、セルロースまたはラクトース等の炭素含有誘導基質と関連してキシラーゼ活性を有意に改善し得るキシロースについての場合のことである。
【００１１】
従来の遺伝子突然変異技術により、セルラーゼにおいて超生産性であるトリコデルマ・リーゼイの株が生産されることが可能になり、例えば、ＭＣＧ７７（特許文献１，Ｇａｌｌｏ）、ＭＣＧ８０（非特許文献１）、ＲＵＴ Ｃ３０（非特許文献２）およびＣＬ８４７（非特許文献３）がある。改善により、野生型の株と比較してモノマーの糖、例えばグルコースに関する異化抑制に対する感受性が低い超生産性の株が生産された。
【００１２】
組み換え型の株も、異種遺伝子をクローニングすることによって、Ｑｍ９４１４、Ｒｕｔ Ｃ３０、ＣＬ８４７のトリコデルマ・リーゼイ株から得られた。例えば、セルラーゼの生産に必要な炭素源を多様化させるためのアスペルギルス・ニガー（niger）・インベルターゼおよび／または酵素加水分解の収率を改善するための過剰発現セロビアーゼがある。セロビアーゼは、反応中の酵素を制限すると考えられる。前記株は、発酵槽における培養のためのそれらの超生産性および適性を維持した。
【００１３】
トリコデルマ・リーゼイによってセルラーゼを生産する方法により、工業スケールへの延長に関する主要な改善の主題が形成された。
【００１４】
良好な酵素の生産性を得るために、トリコデルマ・リーゼイが生育することを可能にするような容易に吸収され得る炭素源およびセルラーゼの発現および培地への分泌を可能にする誘導基質を加えることが必要である。セルロースは、両方の役割を果たし得る。しかしながら、工業スケールで用いることは困難であり、可溶な炭素源であるグルコース、キシロースまたはラクトースによって置き換えられている。ラクトースは誘導基質としても作用する。セロビオースおよびソホロース等の他の可溶な糖が誘導物質として記載されているが、それらは高価過ぎて工業スケールで用いられ得ない。しかしながら、可溶な基質を用いたトリコデルマ・リーゼイによるセルビアーゼの生産物はバッチプロセスにおいてセルロースにより得られるものよりも遙かに劣っていることが分かった。これは、高濃度での容易に吸収可能な糖の抑制因子の作用に起因する。可能な炭素含有基質を連続的に供給すると、培地における残渣の濃度が制限され、糖の量が最適化されることによって異化抑制が大きくなり、より良好な収率およびより良好な酵素生産性を生じさせる（特許文献２を参照のこと。）
セルロース分解性酵素の生産のための工業的な方法において、ラクトースは、相変わらず、最も適切な基質の一つおよび最も安価なものの一つであるが、しかしながら、依然として高価であり、酵素の費用価格の約３分の１を示す。なされた進歩全てにも拘わらず、セルロース性のバイオマスをエタノールに変換する場合の酵素の費用は相変わらず高く、３０〜５０％であり、さらに、セルラーゼの生産のための炭素源としてラクトースを用いる場合に、この方法は外的な炭素源に依存する。この理由のために、紡績糸（spinning）、例えば加水分解されたヘミ−セルロースからの炭素含有基質の使用は、誘導炭素源が容易に入手可能であれば大きな前進である。
【特許文献１】米国特許第４２７５１６７号明細書
【特許文献２】仏国特許第２５５５６０３号明細書
【非特許文献１】アレン・エイ・エル（Allen A L）およびアンドレッティイ・アール・イー（Andreotti R E）著，「バイオテクノル−バイオエング（Biotechnol-Bioeng）」，第１２巻，１９８２年，ｐ．４５１−４５９
【非特許文献２】モンテネコート・ビー・エス（Montenecourt,B S）およびエブライ・ディー・イー（Eveleigh D E）著，「アプライ・エンビロン・ミクロバイオロ（Appl Environ Microbiol）」，第３４巻，１９９７年，ｐ．７７７−７８２
【非特許文献３】デュランド（Durand）ら著，プロク・コロスク（Proc Colloque）ＳＦＭ，「ジェネチーク・デス・ミクロオーガニズムス・インダストリエル（Genetique des microorganismes industriels）」，パリ，エイチ・ヘスロット（H HESLOT）出版，１９８４年，ｐ．３９−５０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、特に、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料からのエタノールの生産に係わる、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産の方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記課題を解決するため、本発明は、セルロース分解性の微生物によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法であって、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いることを特徴とするものである。
【００１７】
上記本発明の方法において、前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための炭素源として用いられることが好ましい。
【００１８】
上記本発明の方法において、前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育のために用いられる他の炭素源への補給としての誘導炭素源として用いられることが好ましい。
【００１９】
上記本発明の方法において、前記残渣は、セルロース分解性の微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための唯一の炭素源として用いられることが好ましい。
【００２０】
上記本発明の方法において、セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウムおよびスエヒロタケ属からの菌類から選択されることが好ましい。
【００２１】
上記本発明の方法において、セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ・リーゼイ種に属することが好ましい。
【００２２】
上記本発明の方法において、セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料は、わら、木材、森林栽培物、アルコール生成性植物、精糖所および穀類加工業者からの残渣、製紙産業からの残渣およびセルロース性またはリグノ−セルロース性材料からの変換産物から選択されることが好ましい。
【００２３】
また、本発明は、セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、１）セルロース性またはリグノセルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、２）セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて、前処理された材料を酵素加水分解する工程と、３）適切なアルコール生成性の微生物によって、工程２）からの加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、４）工程３）において用いられたアルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を得る工程とを包含する方法において、該方法は、工程２）において用いられたセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を上記本発明の方法によって生産するために、該残渣が用いられることを特徴とするものである。
【００２４】
上記本発明において、工程４）において、蒸留によってエタノールが発酵マストから分離され、残渣は蒸留残液によって構成されることが好ましい。
【発明の効果】
【００２５】
本発明は、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法を提供する。本方法は、（リグノ）セルロース性の材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いる。本方法は、（リグノ）セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、（リグノ）セルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて前処理された材料を酵素加水分解する工程と、適切なアルコール生成性の微生物によって前記加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、前記アルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を生産する工程とを包含し、該残渣は、工程２）のセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のために機能する、方法に統合されてもよい。
【００２６】
本発明の方法は、セルロース性またはリグノ−セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いて、セルロース分解性の微生物によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産するので、酵素生産のための炭素源の入手が容易であり、工業スケールでの生産に適している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、セルロース性バイオマスの酵素加水分解物のモノマーの糖のエタノール発酵後に得られる残渣の、セルロース分解性の菌類株、特には、トリコデルマ属リーゼイからのものを用いるセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素の生産のための誘導炭素源としての使用に関する。主たる炭素源は、可溶な工業用糖（例えばグルコース、ラクトースまたはキシロース）または前処理されたバイオマスからのモノマーの形態のヘミセルロースフラクションの抽出物であってよい。残渣はまた、全体的な炭素源として、すなわち、微生物の生育および発現系の誘導のために用いられてよい。この炭素源は、遺伝子的に強化された株、特には組み換え株によって用いられ得る。
【００２８】
本発明の目的の一つは、容易に入手可能な誘導炭素または全体的な炭素の供給源を提案すること、セルロース性のバイオマスの加水分解に適切な活性を備えたセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産することである。本発明によるエタノール発酵残渣からのセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のためのフローチャートが図２に示されている。本発明はまた、品質向上できないエタノール共生産物の品質を内部的に向上させ得る。
【００２９】
バイオマスを前処理する際の第１工程は、セルロース性フラクションの酵素加水分解フラクションの感受性を改善し、ヘミセルロース性フラクションを加水分解するために行われる。最も適切な方法は、酸性条件下の水蒸気爆砕である。１５０〜２５０℃の数分にわたる最適条件下、それは、ヘミセルロースをモノマーに変換するが、損失、特には、主要な糖であるフルフラール、キシロースの損失を最小にする。放出される糖は、水相中の洗浄によって抽出されてよく、その後、抽出からの固体の残渣は、セルロースおよびリグニンのみを含む。抽出後、放出された糖は、酵素の生産のために、主たる炭素源として用いられるか、または、適切な株を用いる発酵によってエタノールに品質が向上させられる。
【００３０】
セルロースフラクション（加水分解されたヘミセルロース分解性フラクションおよび可能性としてのリグニンを含んでも含んでいなくてもよい）は、特定の株によって生産されるセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素によって加水分解される。トリコデルマ・リーゼイ・セルラーゼは、炭素含有基質がセルロース性またはリグノ−セルロース性のバイオマスから誘導される場合に最も有効であり最も適切である。加水分解されるべき材料は、乾燥した物質の６〜２５％、好ましくは１０〜２０％の量で水相中に懸濁させられ、ｐＨは、４〜５．５、好ましくは４．８〜５．２に調整され、温度は、４０〜６０℃、好ましくは４５〜５０℃に調整される。加水分解反応は、セルラーゼを加えることによって開始され、通常用いられる量は、前処理された基質のグラム当たり放出されたタンパク質 １０〜３０ｍｇである。反応は、概して、前処理の効力、セルラーゼの混合物の組成および加えられる酵素の量に応じて１５〜４８時間を要する。反応の後、放出された糖、特にはグルコースのアッセイが行われる。ろ過または遠心分離によって加水分解されていない固体フラクション（実質的にリグニンによって構成される）から糖溶液が分離される：これは、エタノール発酵のために用いられる。処理工程においてセルロース性フラクションが加水分解されたヘミセルロースを含まない場合、グルコースがこの工程で抜き出される主要な糖である。エタノール発酵からの残渣は、エタノールを分離した後、誘導炭素源または酵素生産のための主要な炭素源として用いられる。前記残渣の濃度は、セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素を生産する方法に最良に適合された炭素源の濃度を得るように調整される。
【００３１】
一般的に、エタノールは、蒸留によって発酵マストから分離され、残渣は、蒸留障害物（distillation stop）によって構成される。
【００３２】
セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のために用いられる株は、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウムまたはスエヒロタケ属から、好ましくは、トリコデルマ・リーゼイ種からの菌類の株である。最良の性能の工業用株は、突然変異−選択方法によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性酵素を改善するように改変されたトリコデルマ・リーゼイ種に属する株、例えばＩＦＰ ＣＬ８４７株（仏国特許第２５５５８０３号明細書）である：遺伝子組み換え技術によって改善された株も用いられてよい。
【００３３】
これらの株は、攪拌されかつ曝気された発酵槽において、それらの生育および酵素の生産に適合性のある条件下に培養される。その性質に応じて、バイオマスを生産するように選択される炭素含有基質は、滅菌前に発酵槽に導入されるか、または、該炭素含有基質は、別に滅菌され、滅菌後に２０〜３５ｇ／ｌの初期濃度を生じさせるように発酵槽に導入される。誘導源は、この相に加えられる必要はない。酵素の生産ために選択された基質を含む水溶液が、２００〜２５０ｇ／ｌの濃度に調製される。この溶液は、誘導基質を含まなければならない。これは、初期の基質の排出後に、最適化された量である３５〜４５ｍｇ／（細胞のｇ）を供給するために注入される（供給バッチ（fed batch））。培地中の糖の残渣濃度は、この供給バッチ期の間１ｇ／ｌ未満である。
【００３４】
下記実施例では、実施例１〜３は、適用のために与えられ、実施例４および５は本発明を例示する。
【００３５】
（実施例１：ラクトースによる酵素の生産）
セルラーゼの生産は、機械的に攪拌された発酵槽において行われた。培地は、以下の組成を有する：ＫＯＨ，１．６６ｇ／ｌ； ８５％Ｈ３ＰＯ４，２ｍｌ／ｌ， （ＮＨ４）２ＳＯ４，２．８ｇ／ｌ； ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．６ｇ／ｌ； ＣａＣｌ２，０．６ｇ／ｌ； ＭｎＳＯ４，３．２ｍｇ／ｌ； ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，２．８ｍｇ／ｌ； ＣｏＣｌ２，４．０ｍｇ／ｌ； ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１０ｍｇ／ｌ； コーン・スティープ，１．２ｇ／ｌ； 消泡剤，０．５ｍｌ／ｌ。
【００３６】
１．７５リットルのミネラル培地および７０ｇのラクトースを含む発酵槽が１２０℃で滅菌され、次いで、ＣＬ８４７ トリコデルマ・リーゼイ株の液体前培養物 ０．２５リットルにより播種した。ｐＨの変動を制御するために５ｇ／ｌのフタル酸カリウムにより補給された前培養培地は、発酵槽のものと同一であった。前培養菌類は、ラクトースにより３０ｇ／ｌの濃度まで生育された。播種物のための生育期間は２〜３日であり、生育は２７〜３０℃で振とう台上で行われた。
【００３７】
４６時間の生育後、発酵槽からの初期の基質が排出され、２５０ｇ／ｌのラクトース溶液が４．５ｍｌ／ｈの流量で１４２時間の経過時間までに連続的に注入された。
【００３８】
温度は、バイオマスの生育期の間２７℃に維持され、その後、培養終了時まで２５℃にされた。ｐＨは、生育期の間５に調整され、その後、放出されるタンパク質の合成のために必要な窒素が供給されたアンモニア性溶液を加えることによって培養終了時まで４にされた。溶存酸素含有量は、曝気および攪拌を調整することによって１５〜２０％を超えるように維持された。
【００３９】
酵素の生産の後、ろ過または遠心分離により菌糸から細胞外タンパク質を分離した後にフォーリン（ローリー）法を用いて細胞外のタンパク質のアッセイが行われた。セルロース分解活性が、全体的な活性およびセロビアーゼ活性（リグノ−セルロース性バイオマスの酵素加水分解を制限すると考えられる）についてろ紙活性（ＦＰＵ：filter paper unit）法（filter paper activity method）を用いて測定された。ＦＰＵ活性は、５０ｇ／ｌの初期濃度でワットマン（登録商標）番号１ペーパーを用いて測定された；６０分中、等価な２ｇ／ｌのグルコースを遊離した、分析される酵素溶液の試験サンプルが決定された（比色アッセイ）。セロビアーゼ活性は、セロビオースを用いて２０ｍＭの濃度で測定された；３０分で０．５ｇ／ｌのグルコースを遊離したサンプルの量が測定された（酵素アッセイ）。
【００４０】
Ｕ／ｍｌを単位とする活性は、分当たりかつ酵素溶液のミリリットル当たりの遊離されたグルコースのマイクロモルで表現される。
【００４１】
最終マストの分析は、下記結果を生じさせた。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（実施例２：キシロースによる酵素の生産）
酵素の生産は、実施例１と同一の条件下に行われた。
【００４４】
４０ｇの純粋なキシロースと共に１．７５リットルのミネラル培地を含む発酵槽がＣＬ８４７ トリコデルマ・リーゼイ株の液体前培地 ０．２５リットルにより播種された。前培養の炭素含有基質は、２０ｇ／ｌの濃度のグルコースであった。２７時間の生育後、初期の基質の排出の後に、２００ｇ／ｌのキシロース溶液が、５ｍｌ／時の流量で１６４時間の経過時間まで連続的に注入された。
【００４５】
最終マストの分析は、次の結果を生じさせた。
【００４６】
【表２】
【００４７】
（実施例３：２５〜７５％のラクトース−キシロース混合物による酵素の生産）
この実施例では、誘導基質としてラクトースが用いられ、初期のキシロース排出後の酵素生産期に単独で注入された。
【００４８】
実施例２に記載された条件下に発酵が行われた。酵素の生産のために注入された基質溶液は、２００ｇ／ｌの濃度のラクトースおよびキシロースの混合物（ラクトースの濃度は５０ｇ／ｌである）によって置き換えられた。注入は、１６４時間が経過した後に停止された。
【００４９】
最終マストの分析は、次の結果を生じさせた。
【００５０】
【表３】
【００５１】
（実施例４：処理されかつ脱ペントース化されたセルロース性材料の部分的な酵素加水分解物のエタノール発酵によって生産された残渣を誘導源として用いるキシロースによる酵素の生産）
実施例２に記載された条件下に発酵が行われた。バイオマスは、２０ｇ／ｌのキシロースにより生産されたバッチであった。キシロースが加えられた残渣から調製された溶液を有する供給バッチにおいて酵素が生産された。参照符号Ｈ１を有する残渣の溶液が次のようにして調製された。
【００５２】
酸性条件下の水蒸気爆砕およびペントース抽出による麦わらの処理の後に得られた６ｋｇの湿性の固体材料、すなわち、乾燥させられかつ洗浄された材料 １．４ｋｇが、０．７５リットルの０．５Ｍ酢酸ナトリウムバッファ（ｐＨ ４．８）および０．７５リットルの市販のセルラーゼの溶液（すなわち、タンパク質 ３０ｇ）に溶解させられた。機械的に攪拌された反応器中で行われ、５０℃に維持された、２４時間にわたる酵素加水分解の後、遠心分離によって懸濁液が分離された。回収された液体フラクションは、９２ｇ／ｌのグルコース、１０．３ｇ／ｌのキシロース、１．０ｇ／ｌのアラビノースを含んでいた。サッカロマイセス・セリビジェー（Saccharomyces cerevisiae）を用いて前記フラクションについてエタノール発酵が行われた。パン酵母を用いてグルコースにより攪拌されたフラスコにおいて容量０．４リットルの播種物が調製された。加水分解物であるグルコースは、完全にエタノールに発酵させられた。得られたマストは、１００℃に加熱し遠心分離することによってタンパク質および酵母を含んでいなかった。減圧下に濃縮した後、０．８５リットルのエタノール不含有の残液（slop）Ｈ１が得られた。酵素の生産のために用いられた容量１．５リットルの基質溶液が、キシロースにより補給されたこの残液から、２００ｇ／ｌの炭素含有基質の最終濃度を得るように調製された。実施例１〜３に記載された条件下に発酵が行われた。１３６時間後に発酵は停止された。
【００５３】
最終マストの分析は、下記表に示される結果を生じさせた。残渣中の不純物に関連する所望でない着色反応を避けるためにタンパク質がトリクロロ酢酸により沈殿させられた。
【００５４】
【表４】
【００５５】
（実施例５：処理されかつ脱ペントースされたセルロース性材料の完全な加水分解物のエタノール発酵によって生産された残渣を誘導源として用いたキシロースによる酵素の生産）
実施例４に記載されたように、バイオマスは、２０ｇ／ｌのキシロースにより生産されたバッチであった。キシロースが加えられた残液から調製された基質の溶液を有する供給バッチにおいて酵素が生産された。本実施例の場合、参照符号Ｈ２を有する残液の溶液は、Ｈ１について記載されたように調製されたが、加水分解は、２４時間の加水分解後の初期添加と同一の酵素を加えながら４８時間まで延長された。加水分解物は、１１０．８ｇ／ｌのグルコース、１１．８ｇ／ｌのキシロースを含んでいた。エタノールを除去し濃縮した後の残液Ｈ２が、全糖 ２００ｇ／ｌを含む１．５リットルの基質溶液を調製するために用いられた。実施例４の条件下に発酵が行われた。発酵は、１５８時間後に停止された。
【００５６】
最終マストの分析は、次の結果を生じさせた。
【００５７】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】リグノ−セルロース性材料をエタノールに変換する方法を示すフローシートである。
【図２】本発明によるエタノール発酵残渣からのセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産を示すフローシートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロース分解性の微生物によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法であって、
セルロース性またはリグノ−セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための炭素源として用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育のために用いられる他の炭素源への補給としての誘導炭素源として用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記残渣は、セルロース分解性の微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための唯一の炭素源として用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウムおよびスエヒロタケ属からの菌類から選択される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ・リーゼイ種に属する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料は、わら、木材、森林栽培物、アルコール生成性植物、精糖所および穀類加工業者からの残渣、製紙産業からの残渣およびセルロース性またはリグノ−セルロース性材料からの変換産物から選択される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、
１）セルロース性またはリグノセルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、
２）セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて、前処理された材料を酵素加水分解する工程と、
３）適切なアルコール生成性の微生物によって、工程２）からの加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、
４）工程３）において用いられたアルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を得る工程と
を包含する方法において、
該方法は、工程２）において用いられたセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法によって生産するために、該残渣が用いられることを特徴とする方法。
【請求項９】
工程４）において、蒸留によってエタノールが発酵マストから分離され、残渣は蒸留残液によって構成される請求項８に記載の方法。
【請求項１】
セルロース分解性の微生物によってセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を生産する方法であって、
セルロース性またはリグノ−セルロース性材料の酵素加水分解物のエタノール発酵からの残渣を用いることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための炭素源として用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記残渣は、セルロース分解性微生物の生育のために用いられる他の炭素源への補給としての誘導炭素源として用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記残渣は、セルロース分解性の微生物の生育およびセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素の生産のための唯一の炭素源として用いられる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ、アスペルギルス、ペニシリウムおよびスエヒロタケ属からの菌類から選択される、請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
セルロース分解性の微生物は、トリコデルマ・リーゼイ種に属する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料は、わら、木材、森林栽培物、アルコール生成性植物、精糖所および穀類加工業者からの残渣、製紙産業からの残渣およびセルロース性またはリグノ−セルロース性材料からの変換産物から選択される、請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
セルロース性またはリグノ−セルロース性の材料からエタノールを生産する方法であって、
１）セルロース性またはリグノセルロース性の材料を化学的および／または物理的に前処理する工程と、
２）セルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を用いて、前処理された材料を酵素加水分解する工程と、
３）適切なアルコール生成性の微生物によって、工程２）からの加水分解物をエタノール発酵させ、発酵マストを生産する工程と、
４）工程３）において用いられたアルコール生成性の微生物を分離し、エタノールを分離／精製し、残渣を構成する水相を得る工程と
を包含する方法において、
該方法は、工程２）において用いられたセルロース分解性および／またはヘミセルロース分解性の酵素を請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法によって生産するために、該残渣が用いられることを特徴とする方法。
【請求項９】
工程４）において、蒸留によってエタノールが発酵マストから分離され、残渣は蒸留残液によって構成される請求項８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００６−２１７９１６（Ｐ２００６−２１７９１６Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１８３５（Ｐ２００６−３１８３５）
【出願日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５９１００７８２６）アンスティテュ フランセ デュ ペトロール (261)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＦＲＡＮＣＡＩＳ ＤＵ ＰＥＴＲＯＬ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月９日（２００６．２．９）
【出願人】（５９１００７８２６）アンスティテュ フランセ デュ ペトロール (261)
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＦＲＡＮＣＡＩＳ ＤＵ ＰＥＴＲＯＬ
【Ｆターム（参考）】
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