１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法
【課題】１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを有機溶媒を使用せずに製造する方法を提供すること。
【解決手段】１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールに変換する能力を持つ微生物と接触させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを生成させ、そして生成した１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを採取する１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法。
【解決手段】１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールに変換する能力を持つ微生物と接触させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを生成させ、そして生成した１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを採取する１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの微生物による製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール（以下１，５−ＡＧ）は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物が生合成することから、食品中にも広く分布している物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり４８時間の呼気に排出される量は全体の１％以下であるとの報告があり（非特許文献１参照）、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料として利用できる。更に産業上、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートからの化学合成法が報告されている（非特許文献２参照）。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素によるＢｒ化、水素化アルミニウムリチウムによる脱アセチル化することにより行われる。
【０００３】
その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で１．５−ＡＧの抽出、単離、晶析して１，５−ＡＧを調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。
これらの化学合成や植物からの抽出は、プロセスが多段的で煩雑であり、エーテルやヘキサン等の有機溶媒を用いているため、１，５−ＡＧを食品とするには、それらの分離、処理の必要性が生じる。更には安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められる。
【０００４】
１，５−ＡＧは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）により生合成されることが報告されている（非特許文献１参照）。しかし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）による生合成は工業生産を目的としておらず、１，５−ＡＧ生成量はμｇ／Ｌ程度であり、工業生産的に満足できるものではない。
１，５−ＡＧのその他の調製法として、パラディウム触媒存在下での１，５−ＡＦへの水素添加が報告されているが（非特許文献４参照）１，５−ＡＧのみならずその他の反応生成物が生じ、１，５−ＡＧは反応生成物の１／５程度であり効率的に獲得することが困難である。
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下１，５−ＡＦ）は、澱粉などのα−１，４−グルカンをα−１，４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、近年、安価に大量に生産できる技術が提案された（特許文献１参照）。この１，５−ＡＦを出発物質として利用し、製造プロセスが簡便で、更にエーテル等の有機溶媒を用いない製造法について検討した。
【特許文献１】特開２００５−１６８４５４号公報
【非特許文献１】生化学第６９巻 第１２号，ｐｐ．１３６１−１３７２，（１９９７）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２，４５４７−４５５３（１９５４）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ９，１９５９−１９６０（１９８３）
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７（２００２）８７３−８９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記観点からなされたものであり、本発明の目的は、１，５−ＡＦを出発物質として利用し１，５−ＡＦから１，５−ＡＧを生成する能力をもつ微生物を用いて製造する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
鋭意検討した結果、本発明者らは１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物を見出し、単純なプロセスでしかも有機溶媒を用いないで１，５−ＡＧを製造する本発明に到達した。
すなわち、本発明は１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物と接触せしめて１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換せしめ、生じた１，５−ＡＧを採取することを特徴とする１，５−ＡＧの製造法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、有機溶剤を使用することなく、１，５−ＡＦから微生物培養法により１，５−アンヒドログルシトールを工業的に有利に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力をもつ微生物としては、具体的にはサッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノマイセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプロコッカス属、ツチヤエヤ属またはオーレオバシディウム属に属する微生物が挙げられる。
【００１０】
さらに具体的にはサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディまたはオーレオバシディウム・ミクロスティクタムなどの微生物が挙げられる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に用いられる微生物としては、例えばサッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプロコッカス属、ツチヤエヤ属及びオーレオバシディウム属に属し１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物が挙げられる。
【００１２】
上記微生物として、具体的にはサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ-アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタムが挙げられる。
さらに、本発明に用いられる微生物としては具体的に、以下のような菌株が挙げられる。
【００１３】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０、サッカロマイコデス・ルディジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ）ＮＢＲＣ １０４３、ウィリオプシス・プランテンシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １１０１５、ブレタノマイセス・ブルキシレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ） ＮＢＲＣ ０６２８、カンディダ・ヴァリダ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖａｌｉｄａ） ＮＢＲＣ ０１５９、ＮＢＲＣ １１０１５、カンディダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ） ＮＢＲＣ ０４３２、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ） ＮＢＲＣ １０８２１ 、ピティア・アノマラ （Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ） ＮＢＲＣ ０７０７、チゴサッカロマイセス・ルキシ−（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）ＮＢＲＣ １９１４、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＢＲＣ １６０８、ティレティオプシス・ワシントネンシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ６８３１、ステリマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ １８４４ 、クルツマノマイセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｎｅｃｔａｉｒｅｉ） ＮＢＲＣ １０１１８、リューコスポリディウム・スコッティ（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｃｏｔｔｉｉ）ＮＢＲＣ １２１２、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｈａｓｅｇａｗａｎｕｒｎ） ＮＢＲＣ １０５８ 、フィロバシディウム・フロリフォルメ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ）ＮＢＲＣ １６０３、トリコスポロン・キュータネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＮＢＲＣ １１９８、ココヴァエラ・タイランディカ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃａ）ＮＢＲＣ １０５２１、フェロマイセス・ポリボーラス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｂｏｒｕｓ） ＮＢＲＣ １０１２０、ブレロマイセス・アルブス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）ＮＢＲＣ １１９２、クリプロコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ） ＮＢＲＣ ０４３４、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ ｗｉｎｇｆｉｅｌｄｉｉ） ＮＢＲＣ １０２０４及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｍｉｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ） ＮＢＲＣ ３２０７０等である。これらの菌株は、デパートメント・オブ・バイオテクノロジー ナショナル・インシュティテュ−ト・オブ・テクノロジー・アンド・エバーリュエーション（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ） 住所C/OＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ，５−８，Ｋａｚｕｓａ−ｋａｍａｔａｒｉ ２−ｃｈｏｍｅ，Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ，２９２−０８１８ Ｊａｐａｎ）から入手可能である。本発明に用いられる微生物は、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を有する微生物であれば全てが使用可能であり、上記微生物に限定されるものではない。
【００１４】
例えば本発明で用いられる微生物は、前記の微生物を、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等に付して変異させた変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などの菌株であってもよい。
【００１５】
微生物培養のための１，５−ＡＦを含む培養液としては、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。有機栄養源としては、例えばビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオン、その他などが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して１，５−ＡＧ採取用の培地を調製することができる。
培養条件は特別な制限もなく、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で行い、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行うことができる。
【００１６】
このようにして培養液中に生成した１，５−ＡＧを通常実施される周知の手段で培養物より分離、精製する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮してシロップ状とする。次いでイオン交換や吸着、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離などの操作を適宜組み合わせて１，５−ＡＧを分離、濃縮し、冷却して結晶化させて取得することができる。更に得られた結晶を水に溶解し再結晶させて多面体様の白色結晶として得ることができる。このサンプルの高速液体クロマトグラフィー（以後ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴スペクトル（以後１Ｈ−ＮＭＲ）及びエレクトリスプレーイオン化マススペクトロメトリー（以後ＥＳＩ−ＭＳ）での測定結果から、この結晶は１，５−ＡＧであると同定された。
【００１７】
培養液中の１，５−ＡＧ生成量はＨＰＬＣで速やかに測定することができるので、１，５−ＡＧ生成量が最高に達した時点で培養を終了することができる。ＨＰＬＣ測定の詳細条件を以下に示す。
分離カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ連結 （昭和電工（株）、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、検出：示差屈折率検出器、サンプル供与量：２０μＬ。具体例として市販標準試薬の１，５−ＡＧ と１，５−ＡＦを含む培地でサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を５日間培養した培養液の測定結果を（図１）に示す。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ／ｖ）％である。
【００１９】
実施例１
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を１Ｌの培養フラスコに５００ｍＬ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。
【００２０】
上記培地に、斜面培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）で培養したサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を１白金耳採取し、２５℃、３日間振盪培養した。これを種培養液とした。上記と同じ組成を有する培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μｍフィルターを通し除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度２．５％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養液５００ｍＬを加え、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分、２５℃で５日間振盪培養して１，５−ＡＧを含む培養液を得た（図１）。その培養液から菌体を遠心分離（３，０００ｒｐｍ−１０分）と珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭（蒸気炭）とイオン交換樹脂（ＳＫ−１Ｂ：ＳＡ１０ＡＰ＝２：１ 三菱化学（株）製）で脱色、脱塩を行った。この精製した溶液を濃縮後、Ｎａ＋型イオン交換樹脂（ＵＢＫ５３０ 三菱化学（株）製）を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーに供し１，５−ＡＧを分離した。再度、糖濃度４５％以上まで濃縮後、４℃で冷却し結晶を析出させ、その結晶を更に蒸留水に溶解して再結晶化させて、多面体様の白色結晶を４．５ｇ得た。この結晶をミリ−Ｑ水に溶解しＨＰＬＣで分析した結果、単一なシンメトリーピークとなり、この結晶が単一成分であることが確認できた。更に１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳで以下の条件で分析し物質同定を行った。
【００２１】
１Ｈ−ＮＭＲ
市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶を、観測周波数：４９９．８ＭＨｚ、溶媒Ｄ２Ｏ、濃度１０ｍｇ／７００μＬ、基準ＴＳＰ−ｄ４（（ＣＨ３）３ＣＤ２ＣＤ２ＣＯＯＮａ）、温度：２５℃、観測幅：５ＫＨｚ、データ点：６４Ｋ（１２８Ｋでフーリエ変換）、パルス幅：３０°、パルス繰り返し時間：１０ｓｅｃ、積算回数：８回で測定した結果、市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶は同一スペクトルを示した（図２）。
【００２２】
ＥＳＩ−ＭＳ
先の白色結晶をミリ−Ｑ水に５０ｎｍｏｌ／ｍｌとなるように溶解し、最終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）となるようにメタノールを添加した。その後、０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸を添加してイオン化電圧：８５０Ｖで質量分析を実施した結果、イオン質量電荷比：１６５（ｍ／ｚ）のスペクトルを得た（図３）。これは、ｍ＝１６４（１，５−ＡＧの質量）＋１（プロトン１個分の質量）、ｚ＝１（電荷数）である。ｍ／ｚ＝（１６４＋１）／１＝１６５となり、先のＨＰＬＣ（図１）、１Ｈ−ＮＭＲ（図２）、ＥＳＩ−ＭＳ（図３）の結果から、白色結晶が１，５−ＡＧであると同定された。
【００２３】
実施例２
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃、２０分間加熱滅菌後、表１に示す斜面培養菌体をそれぞれ１白金耳摂取し、２５℃、３日間、１００ｒｐｍで振盪培養した。これを種培養とした。上記と同組成培地４５ｍｌを３００ｍｌ振盪フラスコに分注し、先の種培養液を５ｍｌ添加して２５℃で６日間、１００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後培地から遠心分離で菌体を除去した後、１，５−ＡＧの生成量をＨＰＬＣで測定した（１，５−ＡＦ無添加：１，５−ＡＦ（−））。それとは別に上記の種培養と同じ条件で表１に示す斜面培養菌体をそれぞれ１白金耳摂取し２５℃、３日間振盪培養した。同組成培地４５ｍｌを３００ｍｌ振盪フラスコに分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を２．５％となるように添加した。この培地に、前記種培養を５ｍｌ添加し２５℃で３〜６日間、１００ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量し生成量が最大に達した時点で培養を終了した。（１，５−ＡＦ添加：１，５−ＡＦ（＋））培養液中の１，５−ＡＧ量は１，５−ＡＦを添加群では３．５〜１１．４ｇ／Ｌであったのに対して、１，５−ＡＦ無添加群では、いづれも１，５−ＡＧは検出されなかった。その結果を表１に示す。また、具体例としてサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０の１，５−ＡＦ添加、無添加で５日間培養した培養液中のＨＰＬＣ測定結果を図４に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
実施例３
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を１Ｌの培養フラスコに５００ｍｌ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。先の実施例２で１，５−ＡＧ以外の反応生成物が認められなかった菌株：ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ）ＮＢＲＣ １０８２１の斜面培養（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）菌株を１白金耳採取し、２５℃、３日間振盪培養した。これを種培養とした。上記と同じ組成を有する培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度２．５％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養５００ｍｌを接種し、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分、２５℃で６日間振盪培養して、１，５−ＡＧ以外の反応生成物を含まない培養液を得た（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、１，５−ＡＦを出発物質として微生物を利用することで１，５−ＡＧを単純な操作でしかも有機溶媒等を使用せずに、食品として工業的に生産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】１，５−ＡＦを含む培地で５日間、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を振盪培養した培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトル。
【図２】標準１，５−ＡＧ試薬と実施例１で得られた結晶品の５００ＭＨｚ １Ｈ−ＮＭＲスペクトル（核磁気共鳴スペクトル）。
【図３】同上結晶品のＥＳＩ−ＭＳスペクトル（エレクトロスプレーイオン化マススペクトル）。
【図４】１，５−ＡＦを含む培地（１，５−ＡＦ（＋））と１，５−ＡＦを含まない培地（１，５−ＡＦ（−））で５日間、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を振盪培養して得られた培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトル。
【図５】１，５−ＡＦを含む培養液で５日間、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ） ＮＢＲＣ １０８２１を振盪培養した培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトル。
【符号の説明】
【００２８】
１，５−ＡＦ：１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース
１，５−ＡＧ：１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
１Ｈ−ＮＭＲ：プロトン−核磁気共鳴スペクトル
ＥＳＩ−ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの微生物による製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール（以下１，５−ＡＧ）は、グルコースの１位の水酸基が還元された構造をもつポリオールであり、多くの動植物が生合成することから、食品中にも広く分布している物質である。１，５−ＡＧは動物体内で代謝的に安定であり４８時間の呼気に排出される量は全体の１％以下であるとの報告があり（非特許文献１参照）、低カロリーあるいはノンカロリー甘味料として利用できる。更に産業上、研究試薬や臨床検査試薬として利用されている。
１，５−ＡＧの調製法としてはβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートからの化学合成法が報告されている（非特許文献２参照）。その合成法はβ−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテートをエーテルに溶解後、臭化水素によるＢｒ化、水素化アルミニウムリチウムによる脱アセチル化することにより行われる。
【０００３】
その他の調製法としてプロテア種の葉から１，５−ＡＧをエタノール、ヘキサン等の有機溶媒で１．５−ＡＧの抽出、単離、晶析して１，５−ＡＧを調製する方法も報告されている（非特許文献３参照）。
これらの化学合成や植物からの抽出は、プロセスが多段的で煩雑であり、エーテルやヘキサン等の有機溶媒を用いているため、１，５−ＡＧを食品とするには、それらの分離、処理の必要性が生じる。更には安全性の点からも疑問が残る。
これらの問題点を解決する手段として、製造プロセスが簡略で、かつエーテル等の有機溶媒を用いない製造法が求められる。
【０００４】
１，５−ＡＧは大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）により生合成されることが報告されている（非特許文献１参照）。しかし、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ．ｃｏｌｉ）による生合成は工業生産を目的としておらず、１，５−ＡＧ生成量はμｇ／Ｌ程度であり、工業生産的に満足できるものではない。
１，５−ＡＧのその他の調製法として、パラディウム触媒存在下での１，５−ＡＦへの水素添加が報告されているが（非特許文献４参照）１，５−ＡＧのみならずその他の反応生成物が生じ、１，５−ＡＧは反応生成物の１／５程度であり効率的に獲得することが困難である。
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下１，５−ＡＦ）は、澱粉などのα−１，４−グルカンをα−１，４−グルカンリアーゼで分解することによって調製できる糖質であり、近年、安価に大量に生産できる技術が提案された（特許文献１参照）。この１，５−ＡＦを出発物質として利用し、製造プロセスが簡便で、更にエーテル等の有機溶媒を用いない製造法について検討した。
【特許文献１】特開２００５−１６８４５４号公報
【非特許文献１】生化学第６９巻 第１２号，ｐｐ．１３６１−１３７２，（１９９７）
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７２，４５４７−４５５３（１９５４）
【非特許文献３】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ９，１９５９−１９６０（１９８３）
【非特許文献４】Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３７（２００２）８７３−８９０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は上記観点からなされたものであり、本発明の目的は、１，５−ＡＦを出発物質として利用し１，５−ＡＦから１，５−ＡＧを生成する能力をもつ微生物を用いて製造する方法を提供することにある。
【０００６】
本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかになろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
鋭意検討した結果、本発明者らは１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物を見出し、単純なプロセスでしかも有機溶媒を用いないで１，５−ＡＧを製造する本発明に到達した。
すなわち、本発明は１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物と接触せしめて１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換せしめ、生じた１，５−ＡＧを採取することを特徴とする１，５−ＡＧの製造法である。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、有機溶剤を使用することなく、１，５−ＡＦから微生物培養法により１，５−アンヒドログルシトールを工業的に有利に製造することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力をもつ微生物としては、具体的にはサッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノマイセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプロコッカス属、ツチヤエヤ属またはオーレオバシディウム属に属する微生物が挙げられる。
【００１０】
さらに具体的にはサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディまたはオーレオバシディウム・ミクロスティクタムなどの微生物が挙げられる。
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。本発明に用いられる微生物としては、例えばサッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプロコッカス属、ツチヤエヤ属及びオーレオバシディウム属に属し１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を持つ微生物が挙げられる。
【００１２】
上記微生物として、具体的にはサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ-アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタムが挙げられる。
さらに、本発明に用いられる微生物としては具体的に、以下のような菌株が挙げられる。
【００１３】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０、サッカロマイコデス・ルディジー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ）ＮＢＲＣ １０４３、ウィリオプシス・プランテンシス（Ｗｉｌｌｉｏｐｓｉｓ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ １１０１５、ブレタノマイセス・ブルキシレンシス（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ） ＮＢＲＣ ０６２８、カンディダ・ヴァリダ（Ｃａｎｄｉｄａ ｖａｌｉｄａ） ＮＢＲＣ ０１５９、ＮＢＲＣ １１０１５、カンディダ・ケフィア（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ） ＮＢＲＣ ０４３２、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ） ＮＢＲＣ １０８２１ 、ピティア・アノマラ （Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ） ＮＢＲＣ ０７０７、チゴサッカロマイセス・ルキシ−（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）ＮＢＲＣ １９１４、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＢＲＣ １６０８、ティレティオプシス・ワシントネンシス（Ｔｉｌｌｅｔｉｏｐｓｉｓ ｗａｓｈｉｇｔｏｎｅｎｓｉｓ）ＮＢＲＣ ６８３１、ステリマトマイセス・ハロフィラス（Ｓｔｅｒｉｇｍａｔｏｍｙｃｅｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＢＲＣ １８４４ 、クルツマノマイセス・ネクタイレイ（Ｋｕｒｔｚｍａｎｏｍｙｃｅｓ ｎｅｃｔａｉｒｅｉ） ＮＢＲＣ １０１１８、リューコスポリディウム・スコッティ（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｃｏｔｔｉｉ）ＮＢＲＣ １２１２、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｈａｓｅｇａｗａｎｕｒｎ） ＮＢＲＣ １０５８ 、フィロバシディウム・フロリフォルメ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｆｌｏｒｉｆｏｒｍｅ）ＮＢＲＣ １６０３、トリコスポロン・キュータネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ）ＮＢＲＣ １１９８、ココヴァエラ・タイランディカ（Ｋｏｃｋｏｖａｅｌｌａ ｔｈａｉｌａｎｄｉｃａ）ＮＢＲＣ １０５２１、フェロマイセス・ポリボーラス（Ｆｅｌｌｏｍｙｃｅｓ ｐｏｌｙｂｏｒｕｓ） ＮＢＲＣ １０１２０、ブレロマイセス・アルブス（Ｂｕｌｌｅｒｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ）ＮＢＲＣ １１９２、クリプロコッカス・アルビダス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ） ＮＢＲＣ ０４３４、ツチヤエヤ・ウィングフィールディ（Ｔｓｕｃｈｉｙａｅａ ｗｉｎｇｆｉｅｌｄｉｉ） ＮＢＲＣ １０２０４及びオーレオバシディウム・ミクロスティクタム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｍｉｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ） ＮＢＲＣ ３２０７０等である。これらの菌株は、デパートメント・オブ・バイオテクノロジー ナショナル・インシュティテュ−ト・オブ・テクノロジー・アンド・エバーリュエーション（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ） 住所C/OＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ａｇｅｎｃｙ，５−８，Ｋａｚｕｓａ−ｋａｍａｔａｒｉ ２−ｃｈｏｍｅ，Ｋｉｓａｒａｚｕ−ｓｈｉ，Ｃｈｉｂａ，２９２−０８１８ Ｊａｐａｎ）から入手可能である。本発明に用いられる微生物は、１，５−ＡＦを１，５−ＡＧに変換する能力を有する微生物であれば全てが使用可能であり、上記微生物に限定されるものではない。
【００１４】
例えば本発明で用いられる微生物は、前記の微生物を、紫外線照射、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等に付して変異させた変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組み換え法などの遺伝学的手法により誘導される遺伝子組み換え株などの菌株であってもよい。
【００１５】
微生物培養のための１，５−ＡＦを含む培養液としては、通常の炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要に応じて有機栄養源を含む培地を用いることができる。炭素源としては、例えばグルコース等の炭水化物、グリセロール等のアルコール類、有機酸、その他が適宜使用される。有機栄養源としては、例えばビタミン、アミノ酸等を含有する酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、カゼイン分解物、その他などが適宜使用される。無機イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、リン酸イオン、カルシウムイオン、その他などが適宜使用される。その培地に、別にフィルター滅菌した１，５−ＡＦ水溶液を添加して１，５−ＡＧ採取用の培地を調製することができる。
培養条件は特別な制限もなく、例えば好気条件下でｐＨ３〜７及び温度２０〜４０℃の範囲で行い、適当なｐＨと温度を保ちながら２〜７日程度培養を行うことができる。
【００１６】
このようにして培養液中に生成した１，５−ＡＧを通常実施される周知の手段で培養物より分離、精製する。具体的には、遠心分離、珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭で脱色、イオン交換樹脂で脱塩し、濃縮してシロップ状とする。次いでイオン交換や吸着、ゲルろ過クロマトグラフィーによる分離などの操作を適宜組み合わせて１，５−ＡＧを分離、濃縮し、冷却して結晶化させて取得することができる。更に得られた結晶を水に溶解し再結晶させて多面体様の白色結晶として得ることができる。このサンプルの高速液体クロマトグラフィー（以後ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴スペクトル（以後１Ｈ−ＮＭＲ）及びエレクトリスプレーイオン化マススペクトロメトリー（以後ＥＳＩ−ＭＳ）での測定結果から、この結晶は１，５−ＡＧであると同定された。
【００１７】
培養液中の１，５−ＡＧ生成量はＨＰＬＣで速やかに測定することができるので、１，５−ＡＧ生成量が最高に達した時点で培養を終了することができる。ＨＰＬＣ測定の詳細条件を以下に示す。
分離カラム：ＳｈｏｄｅｘＳＰ８１０−ＭＣＩＧＥＬＣＫ０８Ｓ連結 （昭和電工（株）、三菱化学（株）製）、移動相：蒸留水、流速：１．０ｍＬ／分、カラム温度：４０℃、検出：示差屈折率検出器、サンプル供与量：２０μＬ。具体例として市販標準試薬の１，５−ＡＧ と１，５−ＡＦを含む培地でサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を５日間培養した培養液の測定結果を（図１）に示す。
【実施例】
【００１８】
以下、実施例にて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以後の説明中に用いる％は、特に断りがない限り容量（ｗ／ｖ）％である。
【００１９】
実施例１
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を１Ｌの培養フラスコに５００ｍＬ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。
【００２０】
上記培地に、斜面培地（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）で培養したサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を１白金耳採取し、２５℃、３日間振盪培養した。これを種培養液とした。上記と同じ組成を有する培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μｍフィルターを通し除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度２．５％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養液５００ｍＬを加え、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分、２５℃で５日間振盪培養して１，５−ＡＧを含む培養液を得た（図１）。その培養液から菌体を遠心分離（３，０００ｒｐｍ−１０分）と珪藻土ろ過で菌体及び固形物を除去した後、活性炭（蒸気炭）とイオン交換樹脂（ＳＫ−１Ｂ：ＳＡ１０ＡＰ＝２：１ 三菱化学（株）製）で脱色、脱塩を行った。この精製した溶液を濃縮後、Ｎａ＋型イオン交換樹脂（ＵＢＫ５３０ 三菱化学（株）製）を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーに供し１，５−ＡＧを分離した。再度、糖濃度４５％以上まで濃縮後、４℃で冷却し結晶を析出させ、その結晶を更に蒸留水に溶解して再結晶化させて、多面体様の白色結晶を４．５ｇ得た。この結晶をミリ−Ｑ水に溶解しＨＰＬＣで分析した結果、単一なシンメトリーピークとなり、この結晶が単一成分であることが確認できた。更に１Ｈ−ＮＭＲ、ＥＳＩ−ＭＳで以下の条件で分析し物質同定を行った。
【００２１】
１Ｈ−ＮＭＲ
市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶を、観測周波数：４９９．８ＭＨｚ、溶媒Ｄ２Ｏ、濃度１０ｍｇ／７００μＬ、基準ＴＳＰ−ｄ４（（ＣＨ３）３ＣＤ２ＣＤ２ＣＯＯＮａ）、温度：２５℃、観測幅：５ＫＨｚ、データ点：６４Ｋ（１２８Ｋでフーリエ変換）、パルス幅：３０°、パルス繰り返し時間：１０ｓｅｃ、積算回数：８回で測定した結果、市販標準試薬の１，５−ＡＧと先の白色結晶は同一スペクトルを示した（図２）。
【００２２】
ＥＳＩ−ＭＳ
先の白色結晶をミリ−Ｑ水に５０ｎｍｏｌ／ｍｌとなるように溶解し、最終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）となるようにメタノールを添加した。その後、０．１％（Ｖ／Ｖ）ギ酸を添加してイオン化電圧：８５０Ｖで質量分析を実施した結果、イオン質量電荷比：１６５（ｍ／ｚ）のスペクトルを得た（図３）。これは、ｍ＝１６４（１，５−ＡＧの質量）＋１（プロトン１個分の質量）、ｚ＝１（電荷数）である。ｍ／ｚ＝（１６４＋１）／１＝１６５となり、先のＨＰＬＣ（図１）、１Ｈ−ＮＭＲ（図２）、ＥＳＩ−ＭＳ（図３）の結果から、白色結晶が１，５−ＡＧであると同定された。
【００２３】
実施例２
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を試験管に５ｍｌづつ分注して、１２０℃、２０分間加熱滅菌後、表１に示す斜面培養菌体をそれぞれ１白金耳摂取し、２５℃、３日間、１００ｒｐｍで振盪培養した。これを種培養とした。上記と同組成培地４５ｍｌを３００ｍｌ振盪フラスコに分注し、先の種培養液を５ｍｌ添加して２５℃で６日間、１００ｒｐｍで振盪培養した。培養終了後培地から遠心分離で菌体を除去した後、１，５−ＡＧの生成量をＨＰＬＣで測定した（１，５−ＡＦ無添加：１，５−ＡＦ（−））。それとは別に上記の種培養と同じ条件で表１に示す斜面培養菌体をそれぞれ１白金耳摂取し２５℃、３日間振盪培養した。同組成培地４５ｍｌを３００ｍｌ振盪フラスコに分注し、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を２．５％となるように添加した。この培地に、前記種培養を５ｍｌ添加し２５℃で３〜６日間、１００ｒｐｍで振盪培養した。遠心分離で菌体を除去した後、ＨＰＬＣにて培養液中に生成した１，５−ＡＧを定量し生成量が最大に達した時点で培養を終了した。（１，５−ＡＦ添加：１，５−ＡＦ（＋））培養液中の１，５−ＡＧ量は１，５−ＡＦを添加群では３．５〜１１．４ｇ／Ｌであったのに対して、１，５−ＡＦ無添加群では、いづれも１，５−ＡＧは検出されなかった。その結果を表１に示す。また、具体例としてサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０の１，５−ＡＦ添加、無添加で５日間培養した培養液中のＨＰＬＣ測定結果を図４に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】
実施例３
グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、ｐＨ６．０の培地を１Ｌの培養フラスコに５００ｍｌ分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌した。先の実施例２で１，５−ＡＧ以外の反応生成物が認められなかった菌株：ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ）ＮＢＲＣ １０８２１の斜面培養（グルコース１．０％、ペプトン０．５％、酵母エキス０．３％、麦芽エキス０．３％、寒天粉末１．５％、ｐＨ６．０）菌株を１白金耳採取し、２５℃、３日間振盪培養した。これを種培養とした。上記と同じ組成を有する培地５Ｌを容量１０Ｌのミニジャーファーメンターに入れ、孔径０．４５μｍフィルターで除菌処理した１，５−ＡＦ水溶液を最終濃度２．５％となるように添加した。その１，５−ＡＦを含む培地に、前記種培養５００ｍｌを接種し、攪拌速度２００ｒｐｍ、通気量１Ｌ／分、２５℃で６日間振盪培養して、１，５−ＡＧ以外の反応生成物を含まない培養液を得た（図５）。
【産業上の利用可能性】
【００２６】
本発明によれば、１，５−ＡＦを出発物質として微生物を利用することで１，５−ＡＧを単純な操作でしかも有機溶媒等を使用せずに、食品として工業的に生産することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】１，５−ＡＦを含む培地で５日間、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を振盪培養した培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトル。
【図２】標準１，５−ＡＧ試薬と実施例１で得られた結晶品の５００ＭＨｚ １Ｈ−ＮＭＲスペクトル（核磁気共鳴スペクトル）。
【図３】同上結晶品のＥＳＩ−ＭＳスペクトル（エレクトロスプレーイオン化マススペクトル）。
【図４】１，５−ＡＦを含む培地（１，５−ＡＦ（＋））と１，５−ＡＦを含まない培地（１，５−ＡＦ（−））で５日間、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＮＢＲＣ ０２１０を振盪培養して得られた培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトル。
【図５】１，５−ＡＦを含む培養液で５日間、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティー（Ｇａｌａｃｔｏｍｙｃｅｓ ｃｉｔｒｉ−ａｕｒａｎｔｉｉ） ＮＢＲＣ １０８２１を振盪培養した培養液の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）スペクトル。
【符号の説明】
【００２８】
１，５−ＡＦ：１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース
１，５−ＡＧ：１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
１Ｈ−ＮＭＲ：プロトン−核磁気共鳴スペクトル
ＥＳＩ−ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化−マススペクトロメトリー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールに変換する能力を持つ微生物と接触させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを生成させ、そして生成した１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを採取することを特徴とする１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法。
【請求項２】
前記の微生物が、サッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノマイセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプトコッカス属、ツチヤエヤ属またはオーレオバシディウム属に属するものである請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記微生物がサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディまたはオーレオバシディウム・ミクロスティクタムである請求項１記載の製造法。
【請求項４】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを微生物培養法により製造するための１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの使用。
【請求項１】
１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースを１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールに変換する能力を持つ微生物と接触させて１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを生成させ、そして生成した１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを採取することを特徴とする１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールの製造法。
【請求項２】
前記の微生物が、サッカロマイセス属、サッカロマイコデス属、ウィリオプシス属、ブレタノマイセス属、カンディダ属、ガラクトマイセス属、ピティア属、チゴサッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、ティレティオプシス属、ステリマトマイセス属、クルツマノマイセス属、リューコスポリディウム属、エリスロバシディウム属、フィロバシディウム属、トリコスポロン属、ココヴァエラ属、フェロマイセス属、ブレロマイセス属、クリプトコッカス属、ツチヤエヤ属またはオーレオバシディウム属に属するものである請求項１に記載の製造法。
【請求項３】
前記微生物がサッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイコデス・ルディジー、ウィリオプシス・プラテンシス、ブレタノマイセス・ブラキシレンシス、カンディダ・ヴァリダ、カンディダ・ケフィア、ガラクトマイセス・チトリ−アウランティ−、ピティア・アノマラ、チゴサッカロマイセス・ルキシ−、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ティレティオプシス・ワシントネンシス、ステリマトマイセス・ハロフィラス、クルツマノマイセス・ネクタイレイ、リューコスポリディウム・スコッティ、エリスロバシディウム・ハセガワヌラン、フィロバシディウム・フロリフォルメ、トリコスポロン・キュータネウム、ココヴァエラ・タイランディカ、フェロマイセス・ポリボーラス、ブレロマイセス・アルブス、クリプロコッカス・アルビダス、ツチヤエヤ・ウィングフィールディまたはオーレオバシディウム・ミクロスティクタムである請求項１記載の製造法。
【請求項４】
１，５−Ｄ−アンヒドログルシトールを微生物培養法により製造するための１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−５４５３１（Ｐ２００８−５４５３１Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２３２７０８（Ｐ２００６−２３２７０８）
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【出願人】（３９００１５００４）日本澱粉工業株式会社 (15)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年８月２９日（２００６．８．２９）
【出願人】（３９００１５００４）日本澱粉工業株式会社 (15)
【Ｆターム（参考）】
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