２’−デオキシヌクレオシドの製造方法
【課題】工業生産に適した２'−デオキシヌクレオシド（ｄＮＳ）の製造方法を提供する。
【解決手段】少なくとも下記（i）、（ii）及び（iii）のいずれか１つを実行することにより、２−デオキシリボース（ｄＲ）を経由してｄＮＳを製造する方法である。（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸（ＫＤＧ）の二価金属塩を脱カルボキシル化反応に付してｄＲを合成し、得られるｄＲを反応中間体としてｄＮＳを合成する；（ii）ｄＲ合成能を有する変異型酵素を使用して、ＫＤＧ又はその塩からｄＲを合成し、得られるｄＲを反応中間体としてｄＮＳを合成する；（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル（ｄＲ５Ｐ）合成能を有する変異型酵素を使用してｄＲからｄＲ５Ｐを合成し、得られるｄＲ５ＰからｄＮＳを合成する。
【解決手段】少なくとも下記（i）、（ii）及び（iii）のいずれか１つを実行することにより、２−デオキシリボース（ｄＲ）を経由してｄＮＳを製造する方法である。（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸（ＫＤＧ）の二価金属塩を脱カルボキシル化反応に付してｄＲを合成し、得られるｄＲを反応中間体としてｄＮＳを合成する；（ii）ｄＲ合成能を有する変異型酵素を使用して、ＫＤＧ又はその塩からｄＲを合成し、得られるｄＲを反応中間体としてｄＮＳを合成する；（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル（ｄＲ５Ｐ）合成能を有する変異型酵素を使用してｄＲからｄＲ５Ｐを合成し、得られるｄＲ５ＰからｄＮＳを合成する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも下記（i）、（ii）及び（iii）のいずれか１つを実行することにより、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを製造する２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を酵素による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボ−スを合成する；
（ii）基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボ−スを合成する；
（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用して２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
【請求項２】
２−デオキシリボースを出発物質又は中間体とし、複数の酵素反応を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造する、請求項１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３】
前記２'−デオキシヌクレオシドがチミジンである、請求項１又は２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項４】
少なくとも前記（i）を実行する、請求項１乃至３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項５】
前記（i）を実行するとき使用する２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩が、周期表第２族に属する金属から選択された少なくとも１種の二価金属の塩である、請求項４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項６】
前記周期表第２族に属する金属が、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項７】
前記（i）で示す脱カルボキシル化反応が、ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、請求項１乃至６いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項８】
ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する前記酵素が、ベンゾイルホルメ−トデカルボキシラ−ゼである、請求項７に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項９】
グルコン酸の二価金属塩を脱水反応に付する工程をさらに含み、
脱水反応に付する前記工程において、グルコン酸の二価金属塩から得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いて、脱カルボキシル化反応に付する前記（i）を実行する、請求項１乃至８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１０】
少なくとも前記（ii）を実行する、請求項１乃至９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１１】
前記（ii）で使用する前記変異型酵素が野生型のベンゾイルホルメ−トデカルボキシラ−ゼ（ＥＣ４．１．１．７）を変異させたものである、請求項１乃至１０いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１２】
前記（ii）で使用する前記変異型酵素が、配列表の配列番号２で示す配列の２８１番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、請求項１乃至１１いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１３】
前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、請求項１２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１４】
少なくとも前記（iii）を実行する、請求項１乃至１３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１５】
前記（iii）で示す前記野生型酵素が野生型の酸性ホスファタ−ゼ（ＥＣ ３．１．３．２）である、請求項１乃至１４いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１６】
前記（iii）で使用する前記変異型酵素が、配列表の配列番号１で示す配列の５７番目に相当するアミノ酸をトレオニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の６８番目に相当するアミノ酸をアスパラギン酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の８９番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２２番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２６番目に相当するアミノ酸を脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３０番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３１番目に相当するアミノ酸をアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３６番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１７１番目に相当するアミノ酸を酸性アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１９７番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、請求項１乃至１５いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１７】
前記脂肪族アミノ酸がグリシンであり、分岐鎖アミノ酸がバリン又はロイシンである、請求項１６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１８】
前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１６又は１７に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１９】
前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、請求項１６乃至１８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２０】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に由来する２−デオキシリボ−ス合成酵素を用いて、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボ−スを合成する、請求項１乃至１９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２１】
グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を得る工程をさらに含み、得られた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボ−スを合成する、請求項１乃至２０いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２２】
グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を得る前記工程において、前記脱水反応を酵素反応により実行する、請求項２１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２３】
脱水反応に付する前記工程における前記酵素反応が、グルコン酸デヒドラタ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、請求項２２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２４】
グルコン酸デヒドラタ−ゼ活性を有する前記酵素が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である、請求項２３に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２５】
前記脱水反応と、前記脱水反応により得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボ−スを合成する反応とをワンポットで行う、請求項２２乃至２４いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２６】
２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、リン酸転移酵素及びヌクレオシド合成酵素を用いて、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項１乃至２５いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオシド合成酵素がヌクレオシドホスホリラ−ゼである、請求項２６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオシド合成酵素が、チミジンホスホリラ−ゼ（ＥＣ２．４．２．４）、ウリジンホスホリラ−ゼ（ＥＣ２．４．２．３）及びプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＥＣ２．４．２．１）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２６又は２７に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２９】
前記リン酸転移酵素がホスホペントムタ−ゼである、請求項２６乃至２８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３０】
２−デオキシリボ−スと、ピロリン酸又はその塩とを反応させることにより、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項１乃至２９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３１】
２−デオキシリボ−スに酸性ピロリン酸ナトリウムを作用させて、２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムを合成し、得られた２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを含む反応終了物から、前記酸性ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンが除去されていないとき、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムとナトリウムイオンとを含む粗精製物を用いてｐＨ調整剤によってｐＨを調整しながら２'−デオキシヌクレオシドを製造する、請求項３０に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３２】
前記ｐＨ調整剤が二価金属塩である、請求項３１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３３】
前記二価金属塩が硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム又はこれらの混合物である、請求項３２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３４】
２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムを合成する反応の反応生成物から、前記ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンを除去されたとき、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸ナトリウムを用いた２'−デオキシヌクレオシドを合成する反応において、前記ｐＨ調整剤によるｐＨの調整を実行しない、請求項３１乃至３３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３５】
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムから２'−デオキシヌクレオシドを合成する前記反応を行う前に、陽イオン交換樹脂を用いて前記反応生成物からナトリウムイオンを除去する、請求項３４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３６】
２−デオキシリボ−スに対して過剰のピロリン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成したとき、二価金属の水酸化物を用いて、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを含む水溶液から、前記ピロリン酸又はその塩に由来するリン酸を沈殿により除去し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を用いて２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項３０乃至３５いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３７】
前記二価金属の水酸化物が水酸化マグネシウム又は水酸化カルシウムである、請求項３６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３８】
請求項１乃至３７いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に用いる、変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素。
【請求項３９】
２−デオキシリボ−ス合成能を有し、配列表の配列番号２乃至４いずれかに示す配列において、少なくとも１以上のアミノ酸から他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項３８記載の変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素。
【請求項４０】
請求項１乃至３７いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に用いる、変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素。
【請求項４１】
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
【請求項１】
少なくとも下記（i）、（ii）及び（iii）のいずれか１つを実行することにより、２−デオキシリボースを経由して２'−デオキシヌクレオシドを製造する２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
（i）２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を酵素による脱カルボキシル化反応に付して２−デオキシリボ−スを合成する；
（ii）基質ポケットを形成するアミノ酸残基が野生型と比して少なくとも一つ以上変異している２−デオキシリボ−ス合成能を有する変異型酵素を使用して、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボ−スを合成する；
（iii）２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する変異型酵素を使用して２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
【請求項２】
２−デオキシリボースを出発物質又は中間体とし、複数の酵素反応を実行して２'−デオキシヌクレオシドを製造する、請求項１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３】
前記２'−デオキシヌクレオシドがチミジンである、請求項１又は２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項４】
少なくとも前記（i）を実行する、請求項１乃至３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項５】
前記（i）を実行するとき使用する２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩が、周期表第２族に属する金属から選択された少なくとも１種の二価金属の塩である、請求項４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項６】
前記周期表第２族に属する金属が、カルシウム、ストロンチウム及びバリウムからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項５に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項７】
前記（i）で示す脱カルボキシル化反応が、ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、請求項１乃至６いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項８】
ケト酸デカルボキシラ−ゼ活性を有する前記酵素が、ベンゾイルホルメ−トデカルボキシラ−ゼである、請求項７に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項９】
グルコン酸の二価金属塩を脱水反応に付する工程をさらに含み、
脱水反応に付する前記工程において、グルコン酸の二価金属塩から得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸の二価金属塩を用いて、脱カルボキシル化反応に付する前記（i）を実行する、請求項１乃至８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１０】
少なくとも前記（ii）を実行する、請求項１乃至９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１１】
前記（ii）で使用する前記変異型酵素が野生型のベンゾイルホルメ−トデカルボキシラ−ゼ（ＥＣ４．１．１．７）を変異させたものである、請求項１乃至１０いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１２】
前記（ii）で使用する前記変異型酵素が、配列表の配列番号２で示す配列の２８１番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、請求項１乃至１１いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１３】
前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、請求項１２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１４】
少なくとも前記（iii）を実行する、請求項１乃至１３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１５】
前記（iii）で示す前記野生型酵素が野生型の酸性ホスファタ−ゼ（ＥＣ ３．１．３．２）である、請求項１乃至１４いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１６】
前記（iii）で使用する前記変異型酵素が、配列表の配列番号１で示す配列の５７番目に相当するアミノ酸をトレオニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の６８番目に相当するアミノ酸をアスパラギン酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の８９番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２２番目に相当するアミノ酸をグリシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１２６番目に相当するアミノ酸を脂肪族アミノ酸又は分岐鎖アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３０番目に相当するアミノ酸をヒスチジンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３１番目に相当するアミノ酸をアスパラギン、フェニルアラニン又はイソロイシンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１３６番目に相当するアミノ酸をフェニルアラニンに置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１７１番目に相当するアミノ酸を酸性アミノ酸に置換したもの、及び／又は、配列表の配列番号１で示す配列の１９７番目に相当するアミノ酸を芳香族アミノ酸に置換したものである、請求項１乃至１５いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１７】
前記脂肪族アミノ酸がグリシンであり、分岐鎖アミノ酸がバリン又はロイシンである、請求項１６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１８】
前記酸性アミノ酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である、請求項１６又は１７に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項１９】
前記芳香族アミノ酸がフェニルアラニン又はチロシンである、請求項１６乃至１８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２０】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に由来する２−デオキシリボ−ス合成酵素を用いて、２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩から２−デオキシリボ−スを合成する、請求項１乃至１９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２１】
グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を得る工程をさらに含み、得られた２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボ−スを合成する、請求項１乃至２０いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２２】
グルコン酸又はその塩を脱水反応に付して２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を得る前記工程において、前記脱水反応を酵素反応により実行する、請求項２１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２３】
脱水反応に付する前記工程における前記酵素反応が、グルコン酸デヒドラタ−ゼ活性を有する酵素により触媒される、請求項２２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２４】
グルコン酸デヒドラタ−ゼ活性を有する前記酵素が、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓに由来する酵素である、請求項２３に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２５】
前記脱水反応と、前記脱水反応により得られる２−デヒドロ−３−デオキシグルコン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボ−スを合成する反応とをワンポットで行う、請求項２２乃至２４いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２６】
２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、リン酸転移酵素及びヌクレオシド合成酵素を用いて、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項１乃至２５いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２７】
前記ヌクレオシド合成酵素がヌクレオシドホスホリラ−ゼである、請求項２６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２８】
前記ヌクレオシド合成酵素が、チミジンホスホリラ−ゼ（ＥＣ２．４．２．４）、ウリジンホスホリラ−ゼ（ＥＣ２．４．２．３）及びプリンヌクレオシドホスホリラ−ゼ（ＥＣ２．４．２．１）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２６又は２７に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項２９】
前記リン酸転移酵素がホスホペントムタ−ゼである、請求項２６乃至２８いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３０】
２−デオキシリボ−スと、ピロリン酸又はその塩とを反応させることにより、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩から２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項１乃至２９いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３１】
２−デオキシリボ−スに酸性ピロリン酸ナトリウムを作用させて、２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムを合成し、得られた２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを含む反応終了物から、前記酸性ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンが除去されていないとき、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムとナトリウムイオンとを含む粗精製物を用いてｐＨ調整剤によってｐＨを調整しながら２'−デオキシヌクレオシドを製造する、請求項３０に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３２】
前記ｐＨ調整剤が二価金属塩である、請求項３１に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３３】
前記二価金属塩が硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム又はこれらの混合物である、請求項３２に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３４】
２−デオキシリボ−スから２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムを合成する反応の反応生成物から、前記ピロリン酸ナトリウムに由来するナトリウムイオンを除去されたとき、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸ナトリウムを用いた２'−デオキシヌクレオシドを合成する反応において、前記ｐＨ調整剤によるｐＨの調整を実行しない、請求項３１乃至３３いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３５】
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルナトリウムから２'−デオキシヌクレオシドを合成する前記反応を行う前に、陽イオン交換樹脂を用いて前記反応生成物からナトリウムイオンを除去する、請求項３４に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３６】
２−デオキシリボ−スに対して過剰のピロリン酸又はその塩を用いて２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を合成したとき、二価金属の水酸化物を用いて、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステルを含む水溶液から、前記ピロリン酸又はその塩に由来するリン酸を沈殿により除去し、得られる２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル又はその塩を用いて２'−デオキシヌクレオシドを合成する、請求項３０乃至３５いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３７】
前記二価金属の水酸化物が水酸化マグネシウム又は水酸化カルシウムである、請求項３６に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法。
【請求項３８】
請求項１乃至３７いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に用いる、変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素。
【請求項３９】
２−デオキシリボ−ス合成能を有し、配列表の配列番号２乃至４いずれかに示す配列において、少なくとも１以上のアミノ酸から他のアミノ酸に置換したアミノ酸配列を持つことを特徴とする請求項３８記載の変異型２−デオキシリボ−ス合成酵素。
【請求項４０】
請求項１乃至３７いずれか１項に記載の２'−デオキシヌクレオシドの製造方法に用いる、変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素。
【請求項４１】
２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有する野生型酵素に対して少なくとも配列表の配列番号１で示す配列の５７番目、６８番目、８９番目、１２２番目、１２６番目、１３０番目、１３１番目、１３６番目、１７１番目及び１９７番目のいずれかに相当するアミノ酸の１つ以上の変異を含み、かつ、２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成能を有し、
前記野生型酵素は、下記のアミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を有し、前記野生型酵素において、前記アミノ酸配列（ｂ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ａ）とアミノ酸配列（ｃ）とを連結し、前記アミノ酸配列（ｃ）は、少なくとも１以上のアミノ酸を介して、アミノ酸配列（ｂ）とアミノ酸配列（ｄ）とを連結している変異型２−デオキシリボ−ス−５−リン酸エステル合成酵素。
（ａ）ＧＳＩＸＦＬＮＤＱＡＭＹＥＸＧＲ
（ｂ）ＤＡＯＬ（Ａ／Ｓ）ＸＧＧＶＡＸＸＦＳＸＡＦＧＪＰＩ
（ｃ）ＫＬＬＴＮＭＩＥＤＡＧＤＬＡＴＲ（Ｓ／Ｇ）ＡＫＢＸＹＭＲＩＲＰＦＡＦＹＧ
（ｄ）ＮＧＳＹＰＳＧＨＴＸＩＧＷＡＪＡＬＶＬＸＥＵＮＰＸＸＱＯＸＩＬＫＲＧＹＺＬＧＸＳＲＶＩＣＧＹＨＷＱＳＤＶＤＡＡＲ
［アミノ酸配列（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）中、Ｂは、アスパラギン酸又はグルタミン酸であり、Ｊは、セリン、トレオニン又はチロシンであり、Ｕは、バリン、ロイシン又はイソロイシンであり、Ｏは、アスパラギン酸又はアスパラギンであり、Ｚは、グルタミン酸又はグルタミンであり、Ｘは任意のアミノ酸である。アミノ酸配列（ｂ）中、Ａ／Ｓは、アラニン又はセリンであることを示し、（ｃ）中、Ｓ／Ｇは、セリン又はグリシンであることを示す。］
【図１】
【図４】
【図５】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
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【公開番号】特開２０１２−８０８７５（Ｐ２０１２−８０８７５Ａ）
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１５２３１（Ｐ２０１１−１１５２３１）
【出願日】平成２３年５月２３日（２０１１．５．２３）
【出願人】（０００００５８８７）三井化学株式会社 (2,318)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年４月２６日（２０１２．４．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２３日（２０１１．５．２３）
【出願人】（０００００５８８７）三井化学株式会社 (2,318)
【Ｆターム（参考）】
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