２次元電気泳動方法
【課題】２次元目電気泳動におけるスポットの広がりを抑制し、検出蛋白質を増加させ、更にプロセス実施上の困難さを解消する。
【解決手段】１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置する際、接着用アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃のアガロースを用い、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に１次元目電気泳動ゲルを設置する２次元電気泳動方法。
【解決手段】１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置する際、接着用アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃のアガロースを用い、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に１次元目電気泳動ゲルを設置する２次元電気泳動方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は２次元電気泳動方法に関する。更に詳しくは本発明は、２次元電気泳動において、１次元目の電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目の電気泳動用のゲル上へ設置するプロセスを改良した２次元電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞抽出物などから蛋白質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した析出、遠心分離などはその一例であるといえる。
【０００３】
また、蛋白質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量篩によるカラムクロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥを例示できる。
【０００４】
近年、少量のサンプルから多様な蛋白質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。
【０００５】
２次元電気泳動法においては、１次元目の電気泳動の完了後に、その１次元目電気泳動ゲルを（場合によりＳＤＳ平衡化したもとで）２次元目の電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスを含む。このプロセスでは、１次元目電気泳動ゲルを気泡等が介在しないように２次元目電気泳動用ゲル上に完全に接触させて定着させる必要があるため、実際上、熟練を要する困難なプロセスであるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５０３８１３号公報。 この特許文献１は、肝細胞性のガンの診断のために被験者の血清又は血漿について行う２次元電気泳動を開示している。特許文献１の段落「0104」には、１次元目電気泳動ゲルを２次元目の電気泳動用のゲル上へ設置するプロセスに関して簡単な記載がある。
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】David R.M.Graham et al. 「Improvementsin two-dimensional gel electrophoresis by utilizing a low cost “in-house”neutral pH sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis system」 Proteomics 2005,5,2309-2314。 この非特許文献１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む２次元電気泳動における「イン−ハウス・システム」と称する一定の改良について開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、いわゆる接着用（封入用）アガロースとしては、ゲル化温度、融解温度の低いものを使用する場合が多い。「ゲル化温度」とは、アガロース粉末を水に加熱溶解させた後、冷却し、固化する時の温度をいう。又、「融解温度」とは、一度ゲル化させたアガロースゲルを再融解させた時の温度をいう。
【０００９】
１次元目電気泳動完了後のゲルをＳＤＳ平衡化する際にＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えることが多いが、その場合は特に尿素の熱分解を避けるため、アガロースとしてゲル化温度の低いものを使用するのが通常である。しかし、ゲル化温度の低いアガロースは２次元目の電気泳動中に発生する熱によってゲル化が弱くなって（ゲルがゆるくなること）しまう恐れがある。その結果、２次元目の電気泳動において検出されるスポットの広がり（ブロード）を来たして、検出限界の上昇や、検出される蛋白質の減少等の不具合が懸念される。
【００１０】
又、１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ載置した後で、その上から溶融状態の接着用アガロースを注入して、これを冷却・固化させる場合も多い。しかし、本願発明者の研究によれば、このような方法では、分離対象物質（蛋白質等）の１次元目のゲルから２次元目のゲルへの移行の際に漏れが多く、検出蛋白質の減少等が懸念される。
【００１１】
更に、接着用アガロースは通常は電気泳動用緩衝液の溶液として調製されるが、この溶液のアガロース濃度については、必ずしも十分に検討されていない。アガロース濃度が不適当であると、ゲル間の接着用成分としての効果が不十分となったり、その固化時間に大きく影響して１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセスを一層困難なものにする恐れがある。
【００１２】
そこで本発明は、１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスを改良することにより、２次元目電気泳動におけるスポットの広がりを抑制し、検出蛋白質を増加させ、更にプロセス実施上の困難さを解消することを、解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、接着用アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃のアガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置する、２次元電気泳動方法である。
【００１４】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明において、接着用アガロースが電気泳動用緩衝液の０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液である、２次元電気泳動方法である。
【発明の効果】
【００１５】
（第１発明）
第１発明によれば、接着用アガロースとして、ゲル化温度が３５〜４０℃と高いアガロースの溶液を用いるので、２次元目電気泳動中に発生する熱によって溶解してしまう恐れが少ない。従って、そのような溶解に起因する、２次元目電気泳動における検出スポットの広がり、検出限界の上昇、検出される蛋白質の減少等の不具合が起こり難い。
【００１６】
又、第１発明では、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に、１次元目電気泳動ゲルを設置する。つまり、接着用アガロースを先入れする。そのため、接着用アガロースを後入れする場合、つまり、１次元目ゲルを２次元目ゲル上へ載置した後で溶融状態の接着用アガロースを注入する場合について前記したような不具合が抑制される。即ち、１次元目ゲルから２次元目ゲルへの移行の際の分離対象物質の漏れが抑制され、結果的に検出蛋白質の増大につながる。更に、ゲル化温度の高い接着用アガロースであっても、このように「先入れ」すると、２次元目電気泳動用ゲルとの接触により迅速に冷却される。従ってＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えていた場合でも、その熱分解が起こりにくい。
【００１７】
（第２発明）
第２発明によれば、接着用アガロースとして電気泳動用緩衝液の０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液を用いるので、アガロース濃度不足により１次元目電気泳動ゲルの接着・定着効果が不足したり、アガロース濃度の過剰によって１次元目ゲルの設置前に接着用アガロースが固化したりする恐れがない。従って１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセスにおける技術的、時間的制約が減少し、このプロセスの実施上の困難さが緩和される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】第１実施例に係る２次元電気泳動の結果を示す。
【００１９】
【図２】第１実施例に対する比較例１に係る２次元電気泳動の結果を示す。
【００２０】
【図３】第１実施例に対する比較例２に係る２次元電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００２２】
〔１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセス〕
本発明においては、１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、１次元目ゲルを２次元目ゲル上へ接触させて定着させるための接着用（封入用）アガロースとして、ゲル化温度が３５〜４０℃であるゲル化温度の高いアガロースを用いる。
【００２３】
接着用アガロースは、通常は２次元目の電気泳動に用いる緩衝液にアガロースを溶解させた溶液であり、その融解温度以上の温度における溶融状態で適用され、冷却することにより固化して電気泳動用ゲルを固定するものである。環境温度がゲル化温度以上になると、ゲル状態がゆるくなり、電気泳動用ゲルに対する固定力を失う。
【００２４】
接着用アガロースのゲル化温度は、主として溶解させるアガロースの種類／分子量／
濃度により規定される。ゲル化温度が３５〜４０℃である接着用アガロースとして、例えばニッポンジーン社製の高融点アガロースであるアガロースＳ（ゲルの融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃）を挙げることができる。
【００２５】
接着用アガロースにおけるアガロース濃度は必ずしも限定されないが、前記した理由から、０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。とりわけ、０．５〜０．８％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後、その接着用アガロースが冷却・固化する前に、１次元目電気泳動を完了したゲルを接着用アガロース中に埋め込んだ状態で、２次元目電気泳動用ゲル上に設置する。その際には、１次元目ゲルが２次元目ゲルに対して完全に接触し、両者間に気泡等が介在しないように、ピンセット、ペーパーナイフ等の適宜な道具を用いて慎重に処理する必要がある。１次元目電気泳動を完了したゲルは、好ましくは、予めＳＤＳ平衡化処理等を施される。
【００２７】
〔等電点電気泳動用ゲル〕
等電点電気泳動用ゲルは、必ずしも限定されないが、ゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内、特に５〜８ｃｍの範囲内であることが、ゲル長の短縮化に基く電気泳動時間の短縮、高スループット化のために好ましい。ゲルのｐＨの範囲は、例えば３〜１０にわたるものとすることができる。泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配も限定されないが、好ましくは、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合に、「ａ＜ｂ」及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たすものであり、より好ましくは、ゲルの全長を１とした場合に、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内であるものであり、とりわけ好ましくは、「ａ+ｃ≦ｂ」の関係を満たすものである。
【００２８】
このようなゲルのｐＨ勾配の設定は、例えば生物細胞の抽出物に含まれる各種蛋白質の等電点の分布が、蛋白質の種類においても、その量においてもｐＨ５〜７の領域に相対的に集中していることに対応したものであり、実質的に高分離能を損なうことなくゲル長を短縮化できる。
【００２９】
ゲルの種類は、等電点電気泳動用ゲルとして利用できるものである限りにおいて限定されないが、例えば、ポリアクリルアミドゲルを好ましく例示することができる。
【００３０】
等電点電気泳動に用いられるゲルは、例えば、両性担体（キャリアアンフォライト）をポリアクリルアミドゲルに添加して、電場をかけて所望のｐＨ勾配を形成する手法や、種々の等電点の側鎖を持つアクリルアミド誘導体等のモノマー誘導体を用いてポリアクリルアミドゲル等のゲル作成と同時にｐＨ勾配を固定的に形成する手法（ＩＰＧ法）により作成したゲルが好ましく用いられる。
【００３１】
〔等電点電気泳動方法〕
本発明の等電点電気泳動方法において、泳動に用いられる機器は特に限定されない。しかし、小型装置・高分解能・高スループットを実現するためには、ゲル長５〜１０ｃｍのゲルの使用に合致した電気泳動用機器が好ましい。
【００３２】
等電点電気泳動のプロトコルは特に限定されないが、高分解能、高スループットを実現するためには、電気泳動のプロトコルにも留意する必要がある。検体溶液を調製する段階において、分離・精製の対象とならない荷電性の物質である粗雑物はできるだけ除くことが好ましい。例えば、分離・精製の対象が蛋白質である場合は、リン脂質、ゲノムＤＮＡやＲＮＡを含む核酸、脂肪酸、金属イオン、抽出用の界面活性剤等が粗雑物に含まれる。しかし、検体中に当該粗雑物が少量残存することがあるので、等電点電気泳動において機器に大きな負荷を与えることなく除くことが好ましい。粗雑物はゲル中の移動速度が速い。よって、等電点電気泳動のプロトコルの早い段階に、比較的弱い電圧を１時間半〜３時間半ほどかける定電圧工程を行うことで、粗雑物を機器に負荷をかけることなく除くことができる。仮に、この工程において高い電圧を使用すると、粗雑物が急速に電極側に移動し、強い電流が流れることになるので機器に負荷がかかるとともに、蛋白質ごとの分離が悪くなる（ゲル中のスポットの詰まりが生じる）おそれがある。
【００３３】
等電点電気泳動では、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇工程を始め、当該電圧上昇工程の最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内とすることが好ましい。また、分離対象物質の等電点がずれないように、ゲルの温度を一定に保つことが好ましい。
【００３４】
上記の実施形態により、以下の効果を期待できる。即ち、電圧が上昇し始める前に１００Ｖ〜６００Ｖという低い定電圧で定電圧工程を行うことで、正に荷電した粗雑物は陰極に素早く移動させ、負に荷電した粗雑物は陽極に素早く移動させる。このことにより、機器や検体中の分離対象物質に負荷をかけずにゲルから粗雑物を除くことができる。又、単位時間当たりの電流変化の測定により粗雑物の除去を判断できるので、不十分な定電圧工程となることはなく、かつ、長すぎる定電圧工程となることもない。更に、最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖという高い値に設定することで、より短い泳動時間で高いＶｈｒ値を得ることができ、等電点電気泳動の高スループットを実現できる。
【００３５】
電圧上昇工程における電圧上昇の態様は特に限定されないが、電圧の上昇を徐々に行うことが好ましい。具体的には、電気泳動装置の電流値の上限をゲル１本につき４０〜８０μＡの範囲内の値に設定する。そして、ゲル温度が一定に保たれるようにして、最終電圧まで電圧を上昇させることが好ましい。
【００３６】
〔２次元電気泳動方法〕
本発明の２次元電気泳動方法は、１次元目の電気泳動の完了後、上記した「１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセス」を経て、接着用アガロースの冷却・固化による１次元目ゲルの定着完了を待って、２次元目の電気泳動を行う方法である。
【００３７】
１次元目電気泳動の種類は限定されないが、通常は等電点電気泳動が行われる。２次元目電気泳動の種類も限定されないが、好ましくはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、特に好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。
【００３８】
〔２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
２次元目の電気泳動は、前記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥであることが好ましい。１次元目の等電点電気泳動が小型装置で行われ、高分解能を有し、高スループットを実現している場合、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥも装置を小型化でき、高分解能、高スループットを実現できる。
【００３９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う機器は特に限定されない。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うＰＡＧ（ポリアクリルアミドゲル）に関し、モノマーであるアクリルアミドと架橋剤の総濃度（Ｔ％）や、アクリルアミドと架橋剤の総重量中で架橋剤が占める割合（Ｃ％）等は特に限定されない。
【００４０】
〔２次元目電気泳動用ゲル基端部のゲル濃度〕
１次元目電気泳動用ゲルのゲル長が短く設定されている場合には、2次元目として行うＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、その電気泳動用ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度が３〜６％程度の低濃度であることが好ましい。ゲル濃度とは、直接的には当該ゲルの重合反応時のモノマー濃度を意味するが、重合反応時のモノマー濃度が高い程ゲルの網目構造は密になるので、実質的にはゲルの網目構造の密度を意味する。
【００４１】
上記の実施形態によれば、次の効果を期待できる。即ち、１次元目等電点電気泳動用ゲルのゲル長を、例えば５〜１０ｃｍ程度と短くすると、１次元目の電気泳動時間を短縮してハイスループット化等が可能となる一方、蛋白質のスポットの相互間隔がコンパクトになり、スポット中の蛋白質濃度も高くなる。これに対して2次元目電気泳動用ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度が高い（ゲルの網目が密である）と、スポット中に濃縮された蛋白質の2次元目電気泳動用ゲルへの移行に対して高いバリア性を示し、蛋白質の移行漏れが顕著になったり、スポットが泳動方向に対して横向きにブロードしてしまう。上記の実施形態により、このような不具合が解消される。
【００４２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、検体に界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、検体に含まれる蛋白質の高次構造を解くと共に、蛋白質のアミノ酸残基の荷電もＳＤＳによって相対的に減少させたもとで、分子篩い効果を利用して電気泳動を行うものである。
【００４３】
〔検体の調製〕
等電点電気泳動に適用される検体は特に限定されないが、動物、植物、微生物由来の抽出物や、化学、生化学的に合成された化合物、蛋白質、核酸等を含む種々の検体が適用できる。検体が生物細胞、特に動物細胞、とりわけヒト細胞の抽出物であることが好ましい
等電点電気泳動においては、検体中の蛋白質等の分離対象物質が有する等電点を利用して分離を行う。正に荷電した分離対象物質は陰極側に移動し、他方、負に荷電した分離対象物質は陽極側に移動する。そして、等電点（ｐＩ）と等しいｐＨのゲルの位置で分離対象物質の正味の電荷がゼロとなり、泳動を止める。よって泳動開始後は荷電状態の化合物が移動するので、電流が流れることとなる。
【００４４】
泳動用ゲルにおいては分子量により泳動の速度が異なるが、ナトリウムイオン等の分子量の小さい物質は篩にかからないので素早くゲル中を移動する。また、ゲノムＤＮＡは分子量が大きいが、大きく負に荷電しているため、陽極に素早く移動する。よって、検体の調製においては、機器への負荷を軽減し、また、ゲル中のスポットの詰まりを抑制するために、分離・精製の対象とならない粗雑物を除くことが好ましい。そのために、透析、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、親水−疎水相互作用を利用した分画等、種々の前処理を適用することができる。蛋白質が分離・精製の対象となる場合は、酸による沈殿及び有機溶媒による沈殿を好ましく例示できる。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）による沈殿及びアセトンによる沈殿を更に好ましい手法として例示できる。
【００４５】
分離・精製に供される検体は、等電点電気泳動に使用するゲルの膨潤用の緩衝液に溶解して膨潤用検体溶液としゲルの膨潤とともにゲル中に検体を取り込ませることができる。また、検体を適当な溶液に溶解し、膨潤後のゲルに適用することもできる。
【００４６】
少量の検体を効率的にゲルに取り込むために、ゲル全体に膨潤用検体溶液を適用した後、当該ゲルの両端部側からシリコンオイルを流し込み、シリコンオイルをゲルの内側に向かって広げることが好ましい。シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩・室温にて放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。
【００４７】
即ち、このような等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成においては、ゲル全体に膨潤用検体溶液を適用した後、当該ゲルにオイルを流し込むことが行われるが、その際、従来のようにゲル表面に油性成分を流し込むのではなく、ゲルの長手方向の側端部から、とりわけゲルの長手方向の両側の側端部から同時に、油性成分を流し込むという方法が特に好ましい。油性成分としては、シリコンオイル又はミネラルオイル、とりわけ前者が好ましい。
【００４８】
上記の実施形態により、油性成分はゲルの側端部から中央部に向かって広がりゲルを覆う。油性成分がゲルを覆った状態でしばらく放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。その際、ゲルの側端部から中央部に向かって広がる油性成分によって膨潤用検体溶液がはじかれるため、膨潤用検体溶液のゲルへの染み込みが促進され、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了する。従来のようにゲル表面に油性成分を流し込んだ場合、油性成分がゲルから広がるので、その流れに押されてはじかれた、染み込みきれていない膨潤用検体溶液の一部がゲルから拡散してしまい、検出できる蛋白質等の減少及びゲルの膨潤不足につながっていたと考えられるが、上記の実施形態によれば、このような検体成分の脱落を生じない。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例と比較例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例、比較例によって限定されない。
【００５０】
〔第１実施例〕
(蛋白質の抽出)
ヒトケラチノサイトからなる再構成３次元培養皮膚（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製の商品名LabCyte EPI-MODEL 12）の培養物１枚（約１ｃｍ２）を、蛋白質抽出液であるmammalian
cell lysis kit；MCL1（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH社製）５００μｌに浸漬し、４℃で２時間、ｖｏｌｔｅｘを使用して振とう破砕した。この振とう破砕の後、蛋白質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ
２５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
０．５％（ｗ／ｖ） Deoxycholic acid sodium salt
１％（ｖ／ｖ） Igepal CA-630（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol）
適量のProtease Inhibitor
その後、2D-CleanUPキット〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製〕を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡを加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。回収した当該検体は全量５００μｇであった。
【００５１】
（検体溶液の調製）
得られた検体の一部３０μｇを、１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１３０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。
DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ
２Ｍ Ｕｒｅａ
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ：
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
０．５％（ｖ／ｖ） ＩＰＧbuffer；ＧＥ社製
適量のDeStreakReagent；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
（１次元目等電点電気泳動用ゲルの調製）
前記したＩＰＧ法により、本実施例で用いる１次元目の等電点電気泳動用ゲル（ポリアクリルアミドゲル）を調製した。このゲルは長さが７ｃｍで径が約０．３cmの棒状ゲルであり、Ｔ=４％、Ｃ＝３％であって、次のｐＨ勾配上の特徴を備えている。
ｐＨの範囲：３〜１０
ｐＨ３〜５のゲル長：１．７ｃｍ
ｐＨ５〜７のゲル長：３．６ｃｍ
ｐＨ７〜１１のゲル長：１．７ｃｍ
（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）
上記の１次元目等電点電気泳動用ゲルを前記した１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）１３０μｌに浸漬した後、当該ゲルの両端部側からシリコンオイルを流し込んだ。両端部側から流し込んだシリコンオイルは、ゲルの内側に向かって広がった。シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩、室温にて検体溶液をゲルに浸透させた。その後シリコンオイルは廃棄した。
【００５２】
（一次元目の等電点電気泳動）
本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphor と Cup Loading Manifold Light
Kitを使用した。
【００５３】
検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせた濾紙を設け、電極はゲルとの間に当該濾紙を挟んだ状態でセットした。その後、ゲル及び濾紙の全体をシリコンオイルで浸漬した。
【００５４】
等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。
【００５５】
（等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化）
上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ） Iodoacetamide
（２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
本実施例においては、電気泳動機器としてInvitrogen社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはInvitrogen社製NuPAGE 4-12%
Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ ＭＯＰＳ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）
本実施例においては、上記のアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
【００５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ｗｅｌｌの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化した１次元目ゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
【００５７】
（ゲルの蛍光染色）
SyproRuby（Invitrogen社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。
【００５８】
まず、使用するタッパーを事前に９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄したタッパーにおき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｃｃのSyproRuby（Invitrogen社製）に浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SyproRubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。
【００５９】
（解析）
上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図１に示す。図１の左端はマーカーである。
【００６０】
〔第２実施例〕
第２実施例では、２Ｄ−ＤＩＧＥを行った。第２実施例においては、第１実施例に記載した手順の内、「（検体溶液の調製）」の項の手順を下記「（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）」の項の手順に変更し、又、「（ゲルの蛍光染色）」のプロセスを省略した以外は、第１実施例と同様の手順の操作を行った。
【００６１】
（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）
得られた検体の全量を下記の組成の溶液１００μｌに溶解した。
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
２Ｍ ThioUrea
７Ｍ Urea
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ
溶解したサンプル２０μｇに対しCydye（ＧＥ社製）１６０ｐｍｏｌを添加し、その溶液の入った容器を氷上で３０分間静置した。その後１０ｍＭリジン水溶液を０．５μｌ添加して更に１０分間、容器を氷上で静置した。このような処理を行った後、溶液を等電点電気泳動に適した量である１３０μｌまでDeStreak Rehydration Solutionでメスアップした。メスアップ後充分に攪拌し、氷上で１０分以上静置して、１次元目の等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。
【００６２】
〔第１実施例に対する比較例１〕
この比較例では、第１実施例の「（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）」の項で用いた接着用アガロース溶液を下記のものに変更した点以外は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。
【００６３】
接着用アガロース溶液：第１実施例の場合と同じアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に対して、０．５％（ｗ／ｖ）のアガロース（Fluka社製Cat 05075：融解温度≦６５℃、ゲル化温度３０℃のいわゆる低融点アガロース）を溶解させた接着用アガロース溶液。
【００６４】
本比較例における２次元電気泳動の結果を図２に示す。図２の左端はマーカーである。図１との対比では、図２においてスポットの横に広がった線が認められる。即ち、アガロースゲルが低融点であるため、２次元電気泳動中に発生した熱によりアガロースゲルが液化してきていると考えられる。
【００６５】
〔第１実施例に対する比較例２〕
この比較例では、第１実施例の「（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）」の項の実施要領を以下のように変更した。その他の点は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。
【００６６】
（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）
第１実施例の場合と同じアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次にＳＤＳ平衡化した１次元目泳動ゲルをピンセットで２次元目泳動用ゲルに密着させた。次に、当該両ゲルが密着した状態で上記の接着用アガロース溶液を充分に溶解させた状態で添加した。そして、アガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
【００６８】
本比較例における２次元電気泳動の結果を図３に示す。図３の左端はマーカーである。図１との対比では図３においてスポットの横に広がった線が認められる。また、高分子量域、低分子量域のスポットが薄くなっていることが認められる。その理由は、本比較例では接着用アガロースが「後入れ」であり、分離対象物質の漏れや拡散が生じているためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によって、２次元目電気泳動におけるスポットの広がりを抑制し、検出蛋白質を増加させ、更にプロセス実施上の困難さを解消できる２次元電気泳動方法が提供される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は２次元電気泳動方法に関する。更に詳しくは本発明は、２次元電気泳動において、１次元目の電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目の電気泳動用のゲル上へ設置するプロセスを改良した２次元電気泳動方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞抽出物などから蛋白質や核酸を分離・精製する方法が種々に検討されてきている。塩濃度を利用した析出、遠心分離などはその一例であるといえる。
【０００３】
また、蛋白質や核酸の残基が有する電荷や、分子量の違いを利用した精製方法も多数検討されている。電荷を利用した精製方法としては、イオン交換樹脂を用いたカラムクロマトグラフィーや等電点電気泳動を例示できる。分子量の違いを利用した精製方法としては遠心分離、分子量篩によるカラムクロマトグラフィーやＳＤＳ−ＰＡＧＥを例示できる。
【０００４】
近年、少量のサンプルから多様な蛋白質を分離精製する方法として、１次元目に等電点電気泳動を行い、２次元目にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う２次元電気泳動法が用いられている。
【０００５】
２次元電気泳動法においては、１次元目の電気泳動の完了後に、その１次元目電気泳動ゲルを（場合によりＳＤＳ平衡化したもとで）２次元目の電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスを含む。このプロセスでは、１次元目電気泳動ゲルを気泡等が介在しないように２次元目電気泳動用ゲル上に完全に接触させて定着させる必要があるため、実際上、熟練を要する困難なプロセスであるとされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２００２−５０３８１３号公報。 この特許文献１は、肝細胞性のガンの診断のために被験者の血清又は血漿について行う２次元電気泳動を開示している。特許文献１の段落「0104」には、１次元目電気泳動ゲルを２次元目の電気泳動用のゲル上へ設置するプロセスに関して簡単な記載がある。
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】David R.M.Graham et al. 「Improvementsin two-dimensional gel electrophoresis by utilizing a low cost “in-house”neutral pH sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis system」 Proteomics 2005,5,2309-2314。 この非特許文献１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む２次元電気泳動における「イン−ハウス・システム」と称する一定の改良について開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来、１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、いわゆる接着用（封入用）アガロースとしては、ゲル化温度、融解温度の低いものを使用する場合が多い。「ゲル化温度」とは、アガロース粉末を水に加熱溶解させた後、冷却し、固化する時の温度をいう。又、「融解温度」とは、一度ゲル化させたアガロースゲルを再融解させた時の温度をいう。
【０００９】
１次元目電気泳動完了後のゲルをＳＤＳ平衡化する際にＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えることが多いが、その場合は特に尿素の熱分解を避けるため、アガロースとしてゲル化温度の低いものを使用するのが通常である。しかし、ゲル化温度の低いアガロースは２次元目の電気泳動中に発生する熱によってゲル化が弱くなって（ゲルがゆるくなること）しまう恐れがある。その結果、２次元目の電気泳動において検出されるスポットの広がり（ブロード）を来たして、検出限界の上昇や、検出される蛋白質の減少等の不具合が懸念される。
【００１０】
又、１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ載置した後で、その上から溶融状態の接着用アガロースを注入して、これを冷却・固化させる場合も多い。しかし、本願発明者の研究によれば、このような方法では、分離対象物質（蛋白質等）の１次元目のゲルから２次元目のゲルへの移行の際に漏れが多く、検出蛋白質の減少等が懸念される。
【００１１】
更に、接着用アガロースは通常は電気泳動用緩衝液の溶液として調製されるが、この溶液のアガロース濃度については、必ずしも十分に検討されていない。アガロース濃度が不適当であると、ゲル間の接着用成分としての効果が不十分となったり、その固化時間に大きく影響して１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセスを一層困難なものにする恐れがある。
【００１２】
そこで本発明は、１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスを改良することにより、２次元目電気泳動におけるスポットの広がりを抑制し、検出蛋白質を増加させ、更にプロセス実施上の困難さを解消することを、解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（第１発明）
上記課題を解決するための本願第１発明の構成は、１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、接着用アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃のアガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置する、２次元電気泳動方法である。
【００１４】
（第２発明）
上記課題を解決するための本願第２発明の構成は、前記第１発明において、接着用アガロースが電気泳動用緩衝液の０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液である、２次元電気泳動方法である。
【発明の効果】
【００１５】
（第１発明）
第１発明によれば、接着用アガロースとして、ゲル化温度が３５〜４０℃と高いアガロースの溶液を用いるので、２次元目電気泳動中に発生する熱によって溶解してしまう恐れが少ない。従って、そのような溶解に起因する、２次元目電気泳動における検出スポットの広がり、検出限界の上昇、検出される蛋白質の減少等の不具合が起こり難い。
【００１６】
又、第１発明では、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に、１次元目電気泳動ゲルを設置する。つまり、接着用アガロースを先入れする。そのため、接着用アガロースを後入れする場合、つまり、１次元目ゲルを２次元目ゲル上へ載置した後で溶融状態の接着用アガロースを注入する場合について前記したような不具合が抑制される。即ち、１次元目ゲルから２次元目ゲルへの移行の際の分離対象物質の漏れが抑制され、結果的に検出蛋白質の増大につながる。更に、ゲル化温度の高い接着用アガロースであっても、このように「先入れ」すると、２次元目電気泳動用ゲルとの接触により迅速に冷却される。従ってＳＤＳ平衡化緩衝液に尿素を加えていた場合でも、その熱分解が起こりにくい。
【００１７】
（第２発明）
第２発明によれば、接着用アガロースとして電気泳動用緩衝液の０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液を用いるので、アガロース濃度不足により１次元目電気泳動ゲルの接着・定着効果が不足したり、アガロース濃度の過剰によって１次元目ゲルの設置前に接着用アガロースが固化したりする恐れがない。従って１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセスにおける技術的、時間的制約が減少し、このプロセスの実施上の困難さが緩和される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】第１実施例に係る２次元電気泳動の結果を示す。
【００１９】
【図２】第１実施例に対する比較例１に係る２次元電気泳動の結果を示す。
【００２０】
【図３】第１実施例に対する比較例２に係る２次元電気泳動の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
次に、本発明を実施するための形態を、その最良の形態を含めて説明する。
【００２２】
〔１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセス〕
本発明においては、１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、１次元目ゲルを２次元目ゲル上へ接触させて定着させるための接着用（封入用）アガロースとして、ゲル化温度が３５〜４０℃であるゲル化温度の高いアガロースを用いる。
【００２３】
接着用アガロースは、通常は２次元目の電気泳動に用いる緩衝液にアガロースを溶解させた溶液であり、その融解温度以上の温度における溶融状態で適用され、冷却することにより固化して電気泳動用ゲルを固定するものである。環境温度がゲル化温度以上になると、ゲル状態がゆるくなり、電気泳動用ゲルに対する固定力を失う。
【００２４】
接着用アガロースのゲル化温度は、主として溶解させるアガロースの種類／分子量／
濃度により規定される。ゲル化温度が３５〜４０℃である接着用アガロースとして、例えばニッポンジーン社製の高融点アガロースであるアガロースＳ（ゲルの融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃）を挙げることができる。
【００２５】
接着用アガロースにおけるアガロース濃度は必ずしも限定されないが、前記した理由から、０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。とりわけ、０．５〜０．８％（Ｗ／Ｖ）であることが好ましい。
【００２６】
本発明においては、接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後、その接着用アガロースが冷却・固化する前に、１次元目電気泳動を完了したゲルを接着用アガロース中に埋め込んだ状態で、２次元目電気泳動用ゲル上に設置する。その際には、１次元目ゲルが２次元目ゲルに対して完全に接触し、両者間に気泡等が介在しないように、ピンセット、ペーパーナイフ等の適宜な道具を用いて慎重に処理する必要がある。１次元目電気泳動を完了したゲルは、好ましくは、予めＳＤＳ平衡化処理等を施される。
【００２７】
〔等電点電気泳動用ゲル〕
等電点電気泳動用ゲルは、必ずしも限定されないが、ゲル長が５〜１０ｃｍの範囲内、特に５〜８ｃｍの範囲内であることが、ゲル長の短縮化に基く電気泳動時間の短縮、高スループット化のために好ましい。ゲルのｐＨの範囲は、例えば３〜１０にわたるものとすることができる。泳動方向に対するゲルのｐＨ勾配も限定されないが、好ましくは、ｐＨ５までのゲル長をａ、ｐＨ５〜７のゲル長をｂ、ｐＨ７以上のゲル長をｃとした場合に、「ａ＜ｂ」及び「ｂ＞ｃ」の関係を満たすものであり、より好ましくは、ゲルの全長を１とした場合に、ａが０．１５〜０．３の範囲内、ｂが０．４〜０．７の範囲内、ｃが０．１５〜０．３の範囲内であるものであり、とりわけ好ましくは、「ａ+ｃ≦ｂ」の関係を満たすものである。
【００２８】
このようなゲルのｐＨ勾配の設定は、例えば生物細胞の抽出物に含まれる各種蛋白質の等電点の分布が、蛋白質の種類においても、その量においてもｐＨ５〜７の領域に相対的に集中していることに対応したものであり、実質的に高分離能を損なうことなくゲル長を短縮化できる。
【００２９】
ゲルの種類は、等電点電気泳動用ゲルとして利用できるものである限りにおいて限定されないが、例えば、ポリアクリルアミドゲルを好ましく例示することができる。
【００３０】
等電点電気泳動に用いられるゲルは、例えば、両性担体（キャリアアンフォライト）をポリアクリルアミドゲルに添加して、電場をかけて所望のｐＨ勾配を形成する手法や、種々の等電点の側鎖を持つアクリルアミド誘導体等のモノマー誘導体を用いてポリアクリルアミドゲル等のゲル作成と同時にｐＨ勾配を固定的に形成する手法（ＩＰＧ法）により作成したゲルが好ましく用いられる。
【００３１】
〔等電点電気泳動方法〕
本発明の等電点電気泳動方法において、泳動に用いられる機器は特に限定されない。しかし、小型装置・高分解能・高スループットを実現するためには、ゲル長５〜１０ｃｍのゲルの使用に合致した電気泳動用機器が好ましい。
【００３２】
等電点電気泳動のプロトコルは特に限定されないが、高分解能、高スループットを実現するためには、電気泳動のプロトコルにも留意する必要がある。検体溶液を調製する段階において、分離・精製の対象とならない荷電性の物質である粗雑物はできるだけ除くことが好ましい。例えば、分離・精製の対象が蛋白質である場合は、リン脂質、ゲノムＤＮＡやＲＮＡを含む核酸、脂肪酸、金属イオン、抽出用の界面活性剤等が粗雑物に含まれる。しかし、検体中に当該粗雑物が少量残存することがあるので、等電点電気泳動において機器に大きな負荷を与えることなく除くことが好ましい。粗雑物はゲル中の移動速度が速い。よって、等電点電気泳動のプロトコルの早い段階に、比較的弱い電圧を１時間半〜３時間半ほどかける定電圧工程を行うことで、粗雑物を機器に負荷をかけることなく除くことができる。仮に、この工程において高い電圧を使用すると、粗雑物が急速に電極側に移動し、強い電流が流れることになるので機器に負荷がかかるとともに、蛋白質ごとの分離が悪くなる（ゲル中のスポットの詰まりが生じる）おそれがある。
【００３３】
等電点電気泳動では、検体を含むゲル１本につき１００Ｖ〜６００Ｖの範囲内の値の定電圧の印加による定電圧工程を行い、泳動３０分間あたりの電流変化幅が５μＡの範囲内となった後に前記定電圧から電圧を上昇させる電圧上昇工程を始め、当該電圧上昇工程の最終電圧が３０００Ｖ〜６０００Ｖの範囲内とすることが好ましい。また、分離対象物質の等電点がずれないように、ゲルの温度を一定に保つことが好ましい。
【００３４】
上記の実施形態により、以下の効果を期待できる。即ち、電圧が上昇し始める前に１００Ｖ〜６００Ｖという低い定電圧で定電圧工程を行うことで、正に荷電した粗雑物は陰極に素早く移動させ、負に荷電した粗雑物は陽極に素早く移動させる。このことにより、機器や検体中の分離対象物質に負荷をかけずにゲルから粗雑物を除くことができる。又、単位時間当たりの電流変化の測定により粗雑物の除去を判断できるので、不十分な定電圧工程となることはなく、かつ、長すぎる定電圧工程となることもない。更に、最終電圧を３０００Ｖ〜６０００Ｖという高い値に設定することで、より短い泳動時間で高いＶｈｒ値を得ることができ、等電点電気泳動の高スループットを実現できる。
【００３５】
電圧上昇工程における電圧上昇の態様は特に限定されないが、電圧の上昇を徐々に行うことが好ましい。具体的には、電気泳動装置の電流値の上限をゲル１本につき４０〜８０μＡの範囲内の値に設定する。そして、ゲル温度が一定に保たれるようにして、最終電圧まで電圧を上昇させることが好ましい。
【００３６】
〔２次元電気泳動方法〕
本発明の２次元電気泳動方法は、１次元目の電気泳動の完了後、上記した「１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置プロセス」を経て、接着用アガロースの冷却・固化による１次元目ゲルの定着完了を待って、２次元目の電気泳動を行う方法である。
【００３７】
１次元目電気泳動の種類は限定されないが、通常は等電点電気泳動が行われる。２次元目電気泳動の種類も限定されないが、好ましくはポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、特に好ましくはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）存在下のＳＤＳ−ＰＡＧＥが挙げられる。
【００３８】
〔２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ〕
２次元目の電気泳動は、前記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥであることが好ましい。１次元目の等電点電気泳動が小型装置で行われ、高分解能を有し、高スループットを実現している場合、２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥも装置を小型化でき、高分解能、高スループットを実現できる。
【００３９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う機器は特に限定されない。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うＰＡＧ（ポリアクリルアミドゲル）に関し、モノマーであるアクリルアミドと架橋剤の総濃度（Ｔ％）や、アクリルアミドと架橋剤の総重量中で架橋剤が占める割合（Ｃ％）等は特に限定されない。
【００４０】
〔２次元目電気泳動用ゲル基端部のゲル濃度〕
１次元目電気泳動用ゲルのゲル長が短く設定されている場合には、2次元目として行うＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、その電気泳動用ゲルにおける泳動方向基端部のゲル濃度が３〜６％程度の低濃度であることが好ましい。ゲル濃度とは、直接的には当該ゲルの重合反応時のモノマー濃度を意味するが、重合反応時のモノマー濃度が高い程ゲルの網目構造は密になるので、実質的にはゲルの網目構造の密度を意味する。
【００４１】
上記の実施形態によれば、次の効果を期待できる。即ち、１次元目等電点電気泳動用ゲルのゲル長を、例えば５〜１０ｃｍ程度と短くすると、１次元目の電気泳動時間を短縮してハイスループット化等が可能となる一方、蛋白質のスポットの相互間隔がコンパクトになり、スポット中の蛋白質濃度も高くなる。これに対して2次元目電気泳動用ゲルの泳動方向基端部のゲル濃度が高い（ゲルの網目が密である）と、スポット中に濃縮された蛋白質の2次元目電気泳動用ゲルへの移行に対して高いバリア性を示し、蛋白質の移行漏れが顕著になったり、スポットが泳動方向に対して横向きにブロードしてしまう。上記の実施形態により、このような不具合が解消される。
【００４２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、検体に界面活性剤であるＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を加え、検体に含まれる蛋白質の高次構造を解くと共に、蛋白質のアミノ酸残基の荷電もＳＤＳによって相対的に減少させたもとで、分子篩い効果を利用して電気泳動を行うものである。
【００４３】
〔検体の調製〕
等電点電気泳動に適用される検体は特に限定されないが、動物、植物、微生物由来の抽出物や、化学、生化学的に合成された化合物、蛋白質、核酸等を含む種々の検体が適用できる。検体が生物細胞、特に動物細胞、とりわけヒト細胞の抽出物であることが好ましい
等電点電気泳動においては、検体中の蛋白質等の分離対象物質が有する等電点を利用して分離を行う。正に荷電した分離対象物質は陰極側に移動し、他方、負に荷電した分離対象物質は陽極側に移動する。そして、等電点（ｐＩ）と等しいｐＨのゲルの位置で分離対象物質の正味の電荷がゼロとなり、泳動を止める。よって泳動開始後は荷電状態の化合物が移動するので、電流が流れることとなる。
【００４４】
泳動用ゲルにおいては分子量により泳動の速度が異なるが、ナトリウムイオン等の分子量の小さい物質は篩にかからないので素早くゲル中を移動する。また、ゲノムＤＮＡは分子量が大きいが、大きく負に荷電しているため、陽極に素早く移動する。よって、検体の調製においては、機器への負荷を軽減し、また、ゲル中のスポットの詰まりを抑制するために、分離・精製の対象とならない粗雑物を除くことが好ましい。そのために、透析、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー、親水−疎水相互作用を利用した分画等、種々の前処理を適用することができる。蛋白質が分離・精製の対象となる場合は、酸による沈殿及び有機溶媒による沈殿を好ましく例示できる。ＴＣＡ（トリクロロ酢酸）による沈殿及びアセトンによる沈殿を更に好ましい手法として例示できる。
【００４５】
分離・精製に供される検体は、等電点電気泳動に使用するゲルの膨潤用の緩衝液に溶解して膨潤用検体溶液としゲルの膨潤とともにゲル中に検体を取り込ませることができる。また、検体を適当な溶液に溶解し、膨潤後のゲルに適用することもできる。
【００４６】
少量の検体を効率的にゲルに取り込むために、ゲル全体に膨潤用検体溶液を適用した後、当該ゲルの両端部側からシリコンオイルを流し込み、シリコンオイルをゲルの内側に向かって広げることが好ましい。シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩・室温にて放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。
【００４７】
即ち、このような等電点電気泳動用膨潤ゲルの作成においては、ゲル全体に膨潤用検体溶液を適用した後、当該ゲルにオイルを流し込むことが行われるが、その際、従来のようにゲル表面に油性成分を流し込むのではなく、ゲルの長手方向の側端部から、とりわけゲルの長手方向の両側の側端部から同時に、油性成分を流し込むという方法が特に好ましい。油性成分としては、シリコンオイル又はミネラルオイル、とりわけ前者が好ましい。
【００４８】
上記の実施形態により、油性成分はゲルの側端部から中央部に向かって広がりゲルを覆う。油性成分がゲルを覆った状態でしばらく放置すると、検体は効率的にゲルに取り込まれる。その際、ゲルの側端部から中央部に向かって広がる油性成分によって膨潤用検体溶液がはじかれるため、膨潤用検体溶液のゲルへの染み込みが促進され、検体のゲル全体への染み込みが迅速かつ良好に完了する。従来のようにゲル表面に油性成分を流し込んだ場合、油性成分がゲルから広がるので、その流れに押されてはじかれた、染み込みきれていない膨潤用検体溶液の一部がゲルから拡散してしまい、検出できる蛋白質等の減少及びゲルの膨潤不足につながっていたと考えられるが、上記の実施形態によれば、このような検体成分の脱落を生じない。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明の実施例と比較例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例、比較例によって限定されない。
【００５０】
〔第１実施例〕
(蛋白質の抽出)
ヒトケラチノサイトからなる再構成３次元培養皮膚（株式会社ジャパン・ティッシュ・エンジニアリング製の商品名LabCyte EPI-MODEL 12）の培養物１枚（約１ｃｍ２）を、蛋白質抽出液であるmammalian
cell lysis kit；MCL1（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH社製）５００μｌに浸漬し、４℃で２時間、ｖｏｌｔｅｘを使用して振とう破砕した。この振とう破砕の後、蛋白質抽出液を回収した。上記のmammalian cell lysis kit；MCL1の組成は下記の通りである。
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５
１ｍＭ ＥＤＴＡ
２５０ｍＭ ＮａＣｌ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
０．５％（ｗ／ｖ） Deoxycholic acid sodium salt
１％（ｖ／ｖ） Igepal CA-630（ＳＩＧＭＡ−ALDRICH社製の界面活性剤(Octylphenoxy)polyethoxyethanol）
適量のProtease Inhibitor
その後、2D-CleanUPキット〔ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社（以下、ＧＥ社と省略する）製〕を使用して２回の沈殿操作を行った。第１回目の沈殿操作は、回収した上記蛋白質抽出液にＴＣＡを加えて沈殿を行い、当該操作で生じた沈殿（ＴＣＡ沈殿）を回収した。第２回目の沈殿操作は、回収した前記ＴＣＡ沈殿にアセトンを加えて沈殿を行い、当該操作で得られた沈殿（検体）を回収した。回収した当該検体は全量５００μｇであった。
【００５１】
（検体溶液の調製）
得られた検体の一部３０μｇを、１次元目等電点電気泳動用ゲルの膨潤用緩衝液であるDeStreak Rehydration Solution（ＧＥ社製）１３０μｌに溶解し、１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。
DeStreak Rehydration Solutionの組成は以下の通りである。
７Ｍ Ｔｈｉｏｕｒｅａ
２Ｍ Ｕｒｅａ
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ：
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonate
０．５％（ｖ／ｖ） ＩＰＧbuffer；ＧＥ社製
適量のDeStreakReagent；ＧＥ社製
適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）
（１次元目等電点電気泳動用ゲルの調製）
前記したＩＰＧ法により、本実施例で用いる１次元目の等電点電気泳動用ゲル（ポリアクリルアミドゲル）を調製した。このゲルは長さが７ｃｍで径が約０．３cmの棒状ゲルであり、Ｔ=４％、Ｃ＝３％であって、次のｐＨ勾配上の特徴を備えている。
ｐＨの範囲：３〜１０
ｐＨ３〜５のゲル長：１．７ｃｍ
ｐＨ５〜７のゲル長：３．６ｃｍ
ｐＨ７〜１１のゲル長：１．７ｃｍ
（１次元目等電点電気泳動用ゲルへの検体の浸透）
上記の１次元目等電点電気泳動用ゲルを前記した１次元目等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）１３０μｌに浸漬した後、当該ゲルの両端部側からシリコンオイルを流し込んだ。両端部側から流し込んだシリコンオイルは、ゲルの内側に向かって広がった。シリコンオイルがゲルを覆った状態で、一晩、室温にて検体溶液をゲルに浸透させた。その後シリコンオイルは廃棄した。
【００５２】
（一次元目の等電点電気泳動）
本実施例においては、電気泳動機器としてＧＥ社製のIPGphor と Cup Loading Manifold Light
Kitを使用した。
【００５３】
検体を浸透させたゲルの両端に水で湿らせた濾紙を設け、電極はゲルとの間に当該濾紙を挟んだ状態でセットした。その後、ゲル及び濾紙の全体をシリコンオイルで浸漬した。
【００５４】
等電点電気泳動機器の電流値の上限をゲル１本当たり７５μＡに設定し、電圧プログラムを、（１）３００Ｖ定電圧で７５０Ｖｈｒまで定電圧工程を行い（当該工程終了前の泳動３０分間の電流変化幅が５μＡであった）、（２）３００Ｖｈｒかけて１０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（３）更に４５００Ｖｈｒかけて５０００Ｖまで徐々に電圧を上昇させ、（４）その後５０００Ｖ定電圧で総Ｖｈｒが１２０００になるまで、１次元目の等電点電気泳動を行った。
【００５５】
（等電点電気泳動ゲルのＳＤＳ平衡化）
上記の１次元目の等電点電気泳動を行った後、等電点電気泳動機器からゲルを取り外し、還元剤を含む平衡化緩衝液に当該ゲルを浸漬して、１５分・室温にて振とうした。上記還元剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１％（ｗ／ｖ） ＤＴＴ
次に、上記還元剤を含む平衡化緩衝液を除き、ゲルをアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に浸漬して、１５分・室温にて振とうし、ＳＤＳ平衡化したゲルを得た。上記アルキル化剤を含む平衡化緩衝液の組成は以下の通りである。
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
６Ｍ Ｕｒｅａ
３０％（ｖ／ｖ） Glycerol
２％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
２．５％（ｗ／ｖ） Iodoacetamide
（２次元目のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
本実施例においては、電気泳動機器としてInvitrogen社製のXCell SureLock Mini-Cellを使用した。２次元目泳動用ゲルはInvitrogen社製NuPAGE 4-12%
Bis-Tris Gelsを使用した。また、以下の組成の泳動用緩衝液を調製し、使用した。
５０ｍＭ ＭＯＰＳ
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ
０．１％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ
１ｍＭ ＥＤＴＡ
（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）
本実施例においては、上記のアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）と適量のＢＰＢ（ブロモフェノールブルー）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
【００５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に上記泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次に、ｗｅｌｌの中に充分に溶解させた接着用アガロース溶液を添加した。次に、ＳＤＳ平衡化した１次元目ゲルをアガロース中に浸漬させ、ピンセットでＳＤＳ平衡化したゲルと２次元目泳動用ゲルを密着させた。当該両ゲルが密着した状態でアガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
【００５７】
（ゲルの蛍光染色）
SyproRuby（Invitrogen社製）を用いてゲルの蛍光染色を行った。
【００５８】
まず、使用するタッパーを事前に９８％（ｖ／ｖ）のエタノールで十分に洗浄した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ機器から泳動後の２次元目泳動用ゲルを取り外して、洗浄したタッパーにおき、５０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液に３０分間浸漬する処理を２回行った。その後、当該水溶液を水に置換し、１０分間浸漬した。次に、２次元目泳動用ゲルを４０ｃｃのSyproRuby（Invitrogen社製）に浸漬し、室温で一晩振とうした。次に、SyproRubyを除き、２次元目泳動用ゲルを水で洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）メタノール及び７％（ｖ／ｖ）酢酸含有水溶液で３０分間振とうした。更に当該水溶液を水に置換し、３０分以上振とうした。
【００５９】
（解析）
上記一連の処理を施した２次元目泳動用ゲルをTyphoon9400（ＧＥ社製）を使用した蛍光イメージのスキャンに供した。２次元電気泳動の結果を図１に示す。図１の左端はマーカーである。
【００６０】
〔第２実施例〕
第２実施例では、２Ｄ−ＤＩＧＥを行った。第２実施例においては、第１実施例に記載した手順の内、「（検体溶液の調製）」の項の手順を下記「（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）」の項の手順に変更し、又、「（ゲルの蛍光染色）」のプロセスを省略した以外は、第１実施例と同様の手順の操作を行った。
【００６１】
（２Ｄ−ＤＩＧＥにおける検体溶液の調製）
得られた検体の全量を下記の組成の溶液１００μｌに溶解した。
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
２Ｍ ThioUrea
７Ｍ Urea
４％（ｗ／ｖ） ＣＨＡＰＳ
溶解したサンプル２０μｇに対しCydye（ＧＥ社製）１６０ｐｍｏｌを添加し、その溶液の入った容器を氷上で３０分間静置した。その後１０ｍＭリジン水溶液を０．５μｌ添加して更に１０分間、容器を氷上で静置した。このような処理を行った後、溶液を等電点電気泳動に適した量である１３０μｌまでDeStreak Rehydration Solutionでメスアップした。メスアップ後充分に攪拌し、氷上で１０分以上静置して、１次元目の等電点電気泳動用の検体溶液（膨潤用検体溶液）とした。
【００６２】
〔第１実施例に対する比較例１〕
この比較例では、第１実施例の「（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）」の項で用いた接着用アガロース溶液を下記のものに変更した点以外は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。
【００６３】
接着用アガロース溶液：第１実施例の場合と同じアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に対して、０．５％（ｗ／ｖ）のアガロース（Fluka社製Cat 05075：融解温度≦６５℃、ゲル化温度３０℃のいわゆる低融点アガロース）を溶解させた接着用アガロース溶液。
【００６４】
本比較例における２次元電気泳動の結果を図２に示す。図２の左端はマーカーである。図１との対比では、図２においてスポットの横に広がった線が認められる。即ち、アガロースゲルが低融点であるため、２次元電気泳動中に発生した熱によりアガロースゲルが液化してきていると考えられる。
【００６５】
〔第１実施例に対する比較例２〕
この比較例では、第１実施例の「（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）」の項の実施要領を以下のように変更した。その他の点は、検体の調製からゲルの蛍光染色及び解析に至る全てのステップを第１実施例と同様に行った。
【００６６】
（１次元目ゲルの２次元目ゲル上への設置）
第１実施例の場合と同じアルキル化剤を含む平衡化緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）のアガロースＳ（ニッポンジーン社製：融解温度≦９０℃、ゲル化温度３７℃〜３９℃のいわゆる高融点アガロース）を溶解させた接着用アガロース溶液を使用した。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのｗｅｌｌ中を十分に泳動用緩衝液で洗浄した後、当該洗浄に用いた緩衝液を取り除いた。次にＳＤＳ平衡化した１次元目泳動ゲルをピンセットで２次元目泳動用ゲルに密着させた。次に、当該両ゲルが密着した状態で上記の接着用アガロース溶液を充分に溶解させた状態で添加した。そして、アガロースが充分に固まったのを確認し、２００Ｖ定電圧で約４５分間泳動を行った。
【００６８】
本比較例における２次元電気泳動の結果を図３に示す。図３の左端はマーカーである。図１との対比では図３においてスポットの横に広がった線が認められる。また、高分子量域、低分子量域のスポットが薄くなっていることが認められる。その理由は、本比較例では接着用アガロースが「後入れ」であり、分離対象物質の漏れや拡散が生じているためであると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明によって、２次元目電気泳動におけるスポットの広がりを抑制し、検出蛋白質を増加させ、更にプロセス実施上の困難さを解消できる２次元電気泳動方法が提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、接着用アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃のアガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置することを特徴とする２次元電気泳動方法。
【請求項２】
前記２次元電気泳動方法において、接着用アガロースが電気泳動用緩衝液の０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液であることを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動方法。
【請求項１】
１次元目電気泳動の完了後、その１次元目電気泳動ゲルを２次元目電気泳動用ゲル上へ設置するプロセスにおいて、接着用アガロースとしてゲル化温度が３５〜４０℃のアガロースを用い、かつ、この接着用アガロースを予め２次元目電気泳動用ゲル上へ流し込んだ後に前記１次元目電気泳動ゲルを設置することを特徴とする２次元電気泳動方法。
【請求項２】
前記２次元電気泳動方法において、接着用アガロースが電気泳動用緩衝液の０．３〜１．５％（Ｗ／Ｖ）アガロース溶液であることを特徴とする請求項１に記載の２次元電気泳動方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−３３５４７（Ｐ２０１１−３３５４７Ａ）
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８１８１１（Ｐ２００９−１８１８１１）
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【出願人】（０００１１３２７４）ホーユー株式会社 (278)
【公開日】平成２３年２月１７日（２０１１．２．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月４日（２００９．８．４）
【出願人】（０００１１３２７４）ホーユー株式会社 (278)
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