４−ヒドロキシタモキシフェンによる乳癌の予防および治療
本発明は、４−ヒドロキシタモキシフェンを患者に投与することにより乳癌を治療または予防する方法を提供する。本発明はまた、経皮投与に好適な４−ヒドロキシタモキシフェンを含む医薬組成物を提供する。患者の乳房に経皮投与されると、４−ヒドロキシタモキシフェンは局所的に集中し、抗エストロゲン効果を発揮する。乳癌の患者では、この効果は腫瘍細胞増殖を減少させる。乳癌になるリスクがある患者では、抗エストロゲン効果は腫瘍細胞形成を予防する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）による乳癌の治療および予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、米国および世界全体の女性にとって重大な健康上の問題となっている。この疾患の発見および治療においては進歩があるものの、乳癌は現在も、女性における２番目に多い癌関連の死亡原因であり、毎年米国のみで１８万人を超える女性がそれを患っている。北米の女性の場合、乳癌に罹る生涯確率は８人に１人である。
【０００３】
現在のところ、乳癌の予防方法または治療方法で普遍的に奏功するものは存在しない。この疾患の治療技術は、早期診断（通常の乳房スクリーニング法による）と、手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法などの様々な治療１つ以上を含み得る積極的治療との組合せに依存している。これらの療法は、危険で、毒性があり、高価で、しかも多くの場合、特に転移疾患の治療の場合には効果がない。
【０００４】
乳癌に最も一般的に処方されるホルモン薬はタモキシフェンである。この薬剤は、乳癌細胞の増殖を促進するエストロゲンの作用を遮断することで作用する。乳癌の治療として、タモキシフェンは、身体内に既に存在する癌細胞の増殖を遅延または停止させ、再発および新たな癌の発生を防止するのを助ける。タモキシフェンを５年間服用することで、エストロゲン受容体陽性癌の患者において再発のリスクは約半分に低下する。タモキシフェンはまた、閉経前および閉経後の女性の両方で、反対側の乳房が関与する乳癌（対側性）の発生率も低下させる。さらに、タモキシフェンは最近、この疾患を発症するリスクが高い女性において乳癌の発生率を低下させることが認められている。
【０００５】
その利益にも関わらず、タモキシフェンは重大な欠点を有する。それの作用は、身体内の全てのエストロゲン受容体を有する細胞に影響を与える可能性があり、作働薬と拮抗薬の両方として、タモキシフェンは非常に広範囲の全身効果を誘発する。これらの効果は、子宮体癌、子宮内膜増殖症およびポリープ、深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症、肝臓酵素レベルにおける変化、ならびに白内障などの眼球障害のリスクを高めるものである。さらに、経口タモキシフェン治療を受けた患者は、一過性熱感、膣帯下、抑鬱、無月経および吐き気があったと報告している（Ibis, 2002; Fentiman 1986, 1988, 1989）。
【０００６】
タモキシフェンが持つ欠点のために、一部の癌研究者は、乳癌に対してタモキシフェンの代謝物である４−ヒドロキシタモキシフェンを用いることを提案している。in vitro試験で、４−ヒドロキシタモキシフェンは、正常および癌性の両方の乳房細胞の増殖を阻害する（Nomura, 1985; Malet, 1988, 2002; Charlier, 1995）。さらに、経皮的に投与された４−ヒドロキシタモキシフェンは、マウスで皮下増殖させたヒト乳房腫瘍に対して抗腫瘍効果を示す（米国特許第５，９０４，９３０号）。
【０００７】
ヒトでの限られた実験から、経皮的に投与された４−ヒドロキシタモキシフェンが局所の乳房腫瘍に集中して、全身への分布が非常に少なくなり得ることが明らかになっている（Mauvais-Jarvis, 1986）。しかしながら、患者を３週間治療した、この種の最も長期にわたる報告された試験から、経皮的に投与された４−ヒドロキシタモキシフェンの乳房組織濃度が経口タモキシフェン治療後に認められた濃度よりも低いままであることが明らかになった（Pujol, 1995）。従って、その研究者らは、代替のタモキシフェン治療法として経皮４−ヒドロキシタモキシフェンを提案することはできないという結論に至っている。
【０００８】
重要なことには、ヒトでの４−ヒドロキシタモキシフェンに関する報告されている試験で、抗腫瘍効果を評価したものがない。それがないために、経皮投与される４−ヒドロキシタモキシフェンが実際にヒトの乳癌に対して効果を発揮するか否かという最も重要な疑問が全くわからない状態である。従って、現在もなお、全身的な副作用をほとんど引き起こさない乳癌の治療および予防法に対する強いニーズが存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、４−ヒドロキシタモキシフェンを投与することにより乳癌を治療する方法を含む。この治療方法は、好ましくは局所的に実施され、腫瘍組織の増殖を効果的に減少させ、経口タモキシフェンと比べて血漿薬物レベルが低くなる。
【００１０】
本発明はまた、４−ヒドロキシタモキシフェンを投与することにより乳癌を予防する方法を含む。前記治療方法と同様に、予防方法も好ましくは局所的に実施される。
【００１１】
本発明はさらに、４−ヒドロキシタモキシフェンおよび少なくとも１種類の浸透促進剤を含む経皮投与用医薬組成物を含む。
【００１２】
予防または治療の目的のために、４−ヒドロキシタモキシフェンは、in vivoでエストロゲン受容体を有する細胞にその薬剤を送達させるどのような手段によっても投与することができる。前述のように、投与を経皮的に（局所的に）行って、４−ヒドロキシタモキシフェンの一次通過効果および関連する肝臓代謝を回避することが好ましい。経皮投与においては、４−ヒドロキシタモキシフェンはいずれの皮膚表面にも塗布することができる。４−ヒドロキシタモキシフェンは、経皮的に投与すると、エストロゲン受容体を有する局所皮下組織に集中する傾向があることから、乳房に塗布することが有利である。
【００１３】
本発明を実施する上で、広範囲の局所的配合が好適であるが、水性アルコール溶液および水性アルコールゲルが好ましい。それらの製剤における４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度は変動し得るものであるが、用量は、エストロゲン誘発効果に有効に対抗する局所４−ヒドロキシタモキシフェン組織濃度を生じるものでなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の重要な面は、経皮投与した場合に４−ヒドロキシタモキシフェンが乳癌の治療だけでなく、その予防にも有効であるという驚くべき発見である。さらに、経皮投与された４−ヒドロキシタモキシフェンによって、経口タモキシフェンの標準的用量と比較して血漿薬剤レベルが低くなり、それはすなわち有害な副作用が少ないということである。従って、経皮４−ヒドロキシタモキシフェンは、この文脈において治療と予防の両方でタモキシフェンの代替薬となる。
【００１５】
本発明者らは、４−ヒドロキシタモキシフェンがヒトにおいてin vivoでの乳房腫瘍増殖を減少させることを証明するために第１の試験を行った（下記の実施例４を参照）。手短に言えば、本発明者らは、エストロゲン受容体陽性乳癌と診断されたヒト患者に４−ヒドロキシタモキシフェンゲルを経皮投与した。投与からわずか２〜３週間後に、本発明者らは用量に関連した腫瘍組織増殖指数の低下を認め、最も高い用量（２．０ｍｇ／日）は標準的な用量の経口タモキシフェンとほぼ同等の効果を示した。評価した腫瘍組織増殖指数はＫｉ６７（Gerdes 1984; Schluter 1993）および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（Waseem, 1990）である。経皮４−ヒドロキシタモキシフェンゲルおよび経口タモキシフェンは、腫瘍組織増殖低下において同等であったが、４−ヒドロキシタモキシフェン血漿レベルは４−ヒドロキシタモキシフェンゲルが投与された患者の方が一貫して低かった。
【００１６】
化合物４−ヒドロキシタモキシフェン、すなわち１−［４−（２−Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニルブト−１−エンは、特性がよく分かっている抗エストロゲン化合物であるタモキシフェンの活性代謝物である。２個の炭素原子間に二重結合が存在することから、４−ヒドロキシタモキシフェンは２つの立体異性体の形態で存在する。医学文献および生化学文献によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンの異性体は一般に、シスおよびトランス異性体と称される。しかしながら、純粋に化学的な観点からすると、二重結合している炭素原子それぞれは同一の化学基を持たないので、この呼称は厳密に正確なものではない。従って、異性体をＥ（いわゆるシス型）およびＺ（いわゆるトランス型）の配置と称する方がより適切である。本発明によれば、単独または組み合わせでの４−ヒドロキシタモキシフェンのＥ異性体およびＺ異性体の両方が有用である。しかしながら、Ｚ異性体の方がＥ異性体より活性が高いことから、Ｚ異性体が好ましい。
【００１７】
４−ヒドロキシタモキシフェンは、エストロゲン受容組織に対する組織特異性を示す選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）として作用する。乳房組織ではそれは、エストロゲン拮抗薬として機能する。４−ヒドロキシタモキシフェンが組織特異的活性に寄与する可能性があるエストロゲン関連受容体の転写活性を調節し得ることが、研究から明らかになっている。in vitroにおいて４−ヒドロキシタモキシフェンは、エストロゲン受容体すなわちＥＲに対する結合アフィニティによる測定でタモキシフェンより高い効力と、エストロゲン受容体に関してエストラジオールと同様の結合アフィニティを示す（Robertson et al., 1982; Kuiper et al., 1997）。Ｚ−４−ヒドロキシタモキシフェンは、Ｚ−タモキシフェンと比較して、正常ヒト上皮乳房細胞の培養での増殖を１００倍阻害する（Malet et al., 1988）。
【００１８】
４−ヒドロキシタモキシフェンはタモキシフェン代謝物であるが、乳癌に対してのそれの有用性は、タモキシフェン自体での以前の経験では予測されないものである。タモキシフェンは、図１に示すように、ヒトにおいて広範囲にわたって代謝される。従って、それのin vivoでの作用は、標的組織内における受容体の占有に関して競合する親化合物とそれの代謝化合物による個々の作用の正味の結果である。例えば、ジョーダンの報告（Jordan, 1982）を参照のこと。これらの各化合物は、各種細胞で多様かつ予測できない生物活性を示し、その一部は各化合物のエストロゲン受容体配座に対する個々の効果によって測定される。すなわち、各化合物のエストロゲン受容体結合により、特有の受容体−リガンド配座が生じ、それが各種補因子を召集することで、異なる化合物では薬理特性が変動することになる（Wijayaratne et al., 1999; Giambiagi et al., 1988）。
【００１９】
その変動する効果の例がいくつか報告されている。例えば、タモキシフェンは強力なラット肝臓発癌物質であるが、４−ヒドロキシタモキシフェンはそうではない（Carthew et al., 2001; Sauvez et al., 1999）。さらに、伝えられるところによれば、タモキシフェンはｐ５３（−）正常ヒト乳房上皮細胞でのアポプトシスを起こすが、４−ヒドロキシタモキシフェンはそうではない（Dietze et al., 2001）。対照的に、４−ヒドロキシタモキシフェンは乳癌細胞系でエストロンスルファターゼ活性に対するかなりの阻害効果を示すが、一方、それに関してタモキシフェンはほとんど、または全く効果がない（Chetrite et al., 1993）。
【００２０】
４−ヒドロキシタモキシフェンを用いた以前の試験も、乳癌の治療および予防についてのそれの有効性を予見するものではなかった。薬剤がin vitroまたは異種移植片アッセイでの腫瘍細胞増殖を阻害する能力は、その薬剤がヒトでどのように作用すると考えられるかを示す指標としては十分なものではない（Gura, 1997）。人工的な環境である細胞培養は、完全な生体系で薬剤がどのように作用するかについて情報を提供するものではなく、多くの場合、動物による薬物の処理はヒトの場合と同様ではない。さらに、以前の４−ヒドロキシタモキシフェンを用いたヒト試験は薬剤送達のみを評価しており、乳房腫瘍に対するこの薬剤の効果に関する情報は提供されていなかった。これとは対照的に、本発明者らが行った実験では、驚くべきことに、経皮投与された４−ヒドロキシタモキシフェンが、腫瘍組織増殖指数において用量に関連した低下を引き起こすことが示された。
【００２１】
４−ヒドロキシタモキシフェンの製造方法は、よく知られている。例えば、米国特許第４，９１９，９３７号には、ロバートソンらの報告（Robertson and Katzenellenbogen, 1982）に由来する合成が記載されている。その合成は、下記の数段階で行われる。
【００２２】
段階１ − ４−（β−ジメチルアミノエトキシ）−α−エチルデオキシベンゾインとｐ−（２−テトラヒドロピラニルオキシ）フェニルマグネシウムブロミドとの反応；
段階２ − 段階１とは別に、１，２−ジフェニル−１−ブタノンのヒドロキシル化による１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブタノンの形成；
段階３ − 段階１の生成物と段階２の生成物との反応による１−（４−ジメチルアミノエトキシフェニル）−１−［ｐ−２−テトラヒドロピラニルオキシ）フェニル］−２−フェニルブタン−１−オールの形成；
段階４ − メタノール／塩酸による脱水による、Ｅ異性体およびＺ異性体の混合物である１−［ｐ−（β−ジメチルアミノエトキシ）フェニル］−Ｚ−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブト−１−エン ＝４−ＯＨ−タモキシフェンの生成；
段階５ − クロマトグラフィーおよび結晶化によるＥ異性体およびＺ異性体の分離による一定の比活性の実現。
【００２３】
本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンを乳癌と診断された患者に投与することができる。４−ヒドロキシタモキシフェンが主としてエストロゲン受容体に対して作用することにより、その効果を発揮すると考えられることから、その癌は好ましくはエストロゲン受容体陽性である。さらに、乳癌が乳房に局在していることが好ましい。例えば、乳房のみに局在している原発性乳房腫瘍および／または転移性腫瘍は、局所投与によって治療することができる。しかしながら、局所投与された４−ヒドロキシタモキシフェンが到達可能な他の箇所での乳癌腫瘍も、このようにして治療することができる。
【００２４】
本発明はまた、乳癌になるリスクが高い患者に４−ヒドロキシタモキシフェンを予防的に投与することを意図するものである。乳癌の多くの危険因子について、よく確認されている。例えば、乳癌の家族歴、乳癌の個人歴、非定型過形成などの増殖性乳房疾患の過去の乳房生検による検出、および過去の乳房放射線照射はいずれも、患者を、乳癌発症リスクを高くする状態に置くものである。特定の遺伝的危険因子には、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＣＨＥＫ−２およびｐ５３突然変異体などがある。女性における、ある種の生活様式に関連した危険因子には、３０歳を超えた高齢出産、長期間の経口避妊薬の使用および長期間のホルモン置換療法の使用などがある。熟練の医師であれば、これらの危険因子および他の危険因子を評価して、患者が４−ヒドロキシタモキシフェンの予防的使用によって利益を得られるか否かを決定することができる。そのような評価をするにおいて、医師はゲイルモデル（Gail model）を用いることができる。
【００２５】
４−ヒドロキシタモキシフェンは、閉経前の女性において乳癌を予防するのに特に有用である。この個体群では、抗エストロゲンが多量の循環エストロゲンと競合して、エストロゲン受容体を占有するはずである。４−ヒドロキシタモキシフェンはタモキシフェンと比較してエストロゲン受容体に対して１００倍の親和性を有することから、低用量で、より良好に受容体について競合することができる。低用量を用いることができるという点は、薬剤への患者の曝露が長期間であり、副作用の耐容性が比較的低い予防の状況において特に重要である。
【００２６】
本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンは、in vivoで活性化合物を乳房および／または腫瘍エストロゲン受容体に送達するどのような剤形でも、およびどのような系を経てでも投与することができる。好ましくは、４−ヒドロキシタモキシフェンは「経皮投与」によって送達される。その表現は、患者の皮膚の表面から、角質層、表皮層および真皮層を通って、微小循環系に至る薬剤の送達方法すべてを意味する。それは典型的には、濃度勾配の下降に沿う拡散によって得られる。その拡散は、細胞内浸透（細胞を通って）、細胞間浸透（細胞間で）、経付属器浸透（毛嚢、汗および皮脂腺を通って）、またはそれらのいずれかの組合せを介して生じ得る。
【００２７】
４−ヒドロキシタモキシフェンの経皮投与には、いくつか利点がある。第１に、それは、経口投与後に起こる肝臓代謝を回避するものである（Mauvais-Jarvis et al., 1986）。第２に、経皮投与は、全身薬剤曝露およびそれに伴う身体全体での非特異的なエストロゲン受容体の活性化によるリスクを大幅に低減させる。これは、局所４−ヒドロキシタモキシフェンが主として局所組織に吸収されるためである。特に、４−ヒドロキシタモキシフェンを乳房に経皮的に塗ると、おそらく多くのエストロゲン受容体が乳房組織内にあるために、高濃度が乳房組織に蓄積して、血漿濃度が高くならない（Mauvais-Jarvis et al., supra）。従って、本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンはいずれの皮膚表面にも塗布することができるが、好ましくは片方または両方の乳房に塗布する。
【００２８】
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、抗エストロゲン剤が標的外の組織でエストラジオールに置き換わると、その薬剤の臨床的に重大な副作用が生じる。４−ヒドロキシタモキシフェンおよびエストラジオールはエストロゲン受容体に対して同様の結合アフィニティを有することから、受容体結合についてのそれらの間の競合は、各化合物の濃度が他方のものとほぼ同じである場合には、ほぼ同等であると考えられる。４−ヒドロキシタモキシフェン濃度がエストラジオール濃度より高い場合、前者の方が優先的にエストロゲン受容体に結合し、その逆もまた同様である。
【００２９】
従って、約８０ｐｇ／ｍＬ未満の血漿濃度または正常な閉経前の女性での平均エストラジオール濃度未満になる４−ヒドロキシタモキシフェンの用量が好ましい。より好ましくは、４−ヒドロキシタモキシフェンの用量は、約５０ｐｇ／ｍＬ未満の血漿濃度になるものである。投与される１日用量は、最初に、４−ヒドロキシタモキシフェンの吸収係数、所望の乳房組織濃度および超えてはならない血漿濃度に基づいて推定することができる。当然のことながら、初期用量は、個々の応答に応じて、各患者で最適化してもよい。
【００３０】
上述のように、４−ヒドロキシタモキシフェンを乳房組織に向かわせることで、その組織で高濃度を達成しながら、同時にエストラジオール受容体に関する重大な全身的競合が起こるところまで４−ヒドロキシタモキシフェン血漿レベルが上昇しないようにすることができる。１ｍｇ／乳房／日の経皮用量で、乳房組織中の４−ヒドロキシタモキシフェン濃度は、乳房組織中の正常なエストラジオール濃度の４倍となる（Barrat et al., 1990; Pujol et al., supra）。さらに、このように塗布された４−ヒドロキシタモキシフェンは、乳房組織で、血漿中の濃度の一桁高い濃度、すなわち１０：１の濃度に達する。それとは対照的に、タモキシフェンの経口投与後における４−ヒドロキシタモキシフェンの乳房組織／血漿の比率は、約５：１である。
【００３１】
経皮製剤では、０．２５〜２．０ｍｇ／乳房／日のオーダーの４−ヒドロキシタモキシフェンの用量によって所望の結果が得られるはずであり、約０．５〜１．０ｍｇ／乳房／日の用量が好ましい。特定の態様においては、４−ヒドロキシタモキシフェンの用量は、約０．５ｍｇ／乳房／日、０．７５ｍｇ／乳房／日または１．０ｍｇ／乳房／日である。
【００３２】
経皮投与は、主として（ｉ）治療活性化合物または無毒で薬剤として許容されるそれの塩を好適な医薬担体および任意選択で浸透促進剤と混合して、軟膏、乳濁液、ローション、液剤、クリーム、ゲルなどを形成し、その調剤薬の所定量を皮膚の特定の領域に塗布する、あるいは（ｉｉ）公知の技術に従って貼付剤または経皮投与系に治療活性物質を組み込むという２つの異なる方法で行うことができる。
【００３３】
経皮薬剤投与の有効性は、薬剤濃度、塗布した表面積、塗布の時間および期間、皮膚水和、薬剤の物理化学特性ならびに調剤薬と皮膚の間の薬剤の分配などの多くの要素によって決まる。経皮での使用を意図した薬剤の製剤は、これらの要素を利用して、最適な送達を達成すものである。そのような製剤は、多くの場合、角質層の物理化学特性を可逆的に変えることにより角質層の抵抗を低下させることで、角質層の水化を変えることで、共溶媒として働くことで、あるいは細胞間の空間での脂質およびタンパク質の構成を変えることで経皮吸収を改善する浸透促進剤を含む。そのような経皮吸収の促進剤には、界面活性剤、ＤＭＳＯ、アルコール、アセトン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、脂肪酸、脂肪アルコール、およびそれらの誘導体、ヒドロキシ酸、ピロリドン類、尿素、精油、それらの混合物などがある。化学的促進剤以外に、物理的方法によって経皮吸収を増加させることができる。例えば、閉鎖包帯によって皮膚の水分増加が誘発される。他の物理的方法にはイオン導入および超音波導入などがあり、それらはそれぞれ電場および高周波数超音波を用いて、その大きさ及びイオン特性のためにほとんど吸収されない薬剤の吸収を高めるものである。
【００３４】
経皮薬剤送達に関係する多くの要素および方法については、文献に総説がある（REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, Alfonso R. Gennaro
(Lippincott Williams & Wilkins, 2000), pp.836-58; PERCUTANEOUS ABSORPTION:
DRUGS COSMETICS MECHANISMS METHODOLOGY, Bronaugh and Maibach (Marcel Dekker,
1999)）。これらの刊行物が明らかにしているように、医薬分野での当業者は、各種の要素および方法を駆使して、有効な経皮送達を達成することができる。
【００３５】
４−ヒドロキシタモキシフェンは、巨大で非常に親油性が高い分子である。このため、浸透促進剤の助けがなければ、それは皮膚にほとんど浸透しない。従って、本発明で用いられる４−ヒドロキシタモキシフェンの製剤は、好ましくは、１以上の浸透促進剤を含む。４−ヒドロキシタモキシフェンはアルコールに可溶であることから、アルコールが好ましい促進剤である。ミリスチン酸イソプロピルも好ましい促進剤である。
【００３６】
経皮投与のためには、４−ヒドロキシタモキシフェンは、軟膏、クリーム、ゲル、乳濁液（エマルジョン）、ローション、散剤、オイルまたは同様の製剤で送達することができる。そのために、前記製剤は通常の賦形剤添加物を含むことができ、それには扁桃油、オリーブ油、桃仁油、落花生油、ヒマシ油などの植物性油、動物性油、ＤＭＳＯ、脂肪および脂肪様物質、ラノリンリポイド類、ホスファチド類、パラフィン類などの炭化水素類、ワセリン、ワックス類、洗剤乳化剤、レシチン、アルコール類、カロチン、グリセロール（すなわちグリセリン）などのポリオール類またはポリグリコール類、グリセロールエーテル類、グリコール類、グリコールエーテル類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、非揮発性脂肪アルコール類、酸類、エステル類、揮発性アルコール系化合物、尿素、タルク、セルロース誘導体、着色剤、酸化防止剤および防腐剤などがある。
【００３７】
本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンはまた、経皮貼付剤を介して送達することもできる。一実施形態において、その貼付剤は、４−ヒドロキシタモキシフェン製剤のための貯留部を有する。その貼付剤は、（ａ）溶液不透過性の裏材ホイル、（ｂ）空洞部を有する層状様の要素、（ｃ）微孔性膜または半透膜、（ｄ）自己接着性層、および（ｅ）任意選択で、取り外し可能な裏材フィルムを有することができる。空洞部を有する層状様の要素は、裏材ホイルと膜によって形成することができる。あるいは、この貼付剤は、（ａ）溶液不透過性の裏材ホイル、（ｂ）貯留部としての開放孔発泡体、密閉孔発泡体、組織様層または繊維質のウェブ様層、（ｃ）（ｂ）による層が自己接着性でない場合には自己接着性層、および（ｄ）任意選択で、取り外し可能な裏材フィルムを有することができる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態においては、４−ヒドロキシタモキシフェンは水性アルコールゲル中に配合される。そのようなゲル中の４−ヒドロキシタモキシフェンの量は、ゲル１００ｇ当たり４−ヒドロキシタモキシフェンが約０．００１ｇ〜約１．０ｇの範囲とすることができる。好ましくは、ゲル１００ｇ当たり４−ヒドロキシタモキシフェンが約０．０１ｇ〜約０．１ｇの範囲である。
【００３９】
４−ヒドロキシタモキシフェン製剤が浸透促進剤として１以上の脂肪酸エステルを含むことも好ましい。脂肪酸エステル浸透促進剤の非常に好ましい一例は、ミリスチン酸イソプロピルである。ミリスチン酸イソプロピルをゲルで使用する場合、その量は、ゲル１００ｇ当たり約０．１〜約５．０ｇの範囲とすることができる。好ましくは、ミリスチン酸イソプロピルの量は、ゲル１００ｇ当たり約０．５〜約２．０ｇの範囲である。
【００４０】
本発明の４−ヒドロキシタモキシフェン製剤は通常、１以上の非水系媒体を含む。これらの媒体は、４−ヒドロキシタモキシフェンと使用される浸透促進剤のいずれも溶解できるものでなければならない。それらはまた、大気圧下で低い沸点、好ましくは１００℃未満の沸点を有し、皮膚と接触した時に急速に蒸発できるものでなければならない。好適な非水系媒体の例には、エタノール、イソプロパノールおよび酢酸エチルなどがある。エタノールおよびイソプロパノールが好ましい。特に、エタノールは、皮膚と接触した時に急速に蒸発することにより、４−ヒドロキシタモキシフェンの経皮吸収に効果的に寄与する。ゲル製剤中の非水系媒体の量は、通常、５４重量％〜８５重量％、好ましくは６５重量％〜７５重量％の範囲である。
【００４１】
製剤はまた、製剤中の任意の親水性分子の可溶化を可能とし、さらにその製剤から皮膚への親油性分子の拡散を促進する水系媒体を含むこともできる。水系媒体はまた、ｐＨを調節することができる。水系媒体には、アルカリ化および塩基性緩衝液などがあり、例えばリン酸緩衝液（例えば、リン酸二ナトリウムまたはリン酸一ナトリウム）、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム）および単なる純水がある。水系媒体の量は、好ましくはゲル製剤の１５重量％〜４５重量％、より好ましくは２５重量％〜３５重量％の範囲である。
【００４２】
さらに、４−ヒドロキシタモキシフェン製剤は、製剤の粘度を上昇させるため、および／または、可溶化剤として機能するための１以上のゲル化剤を含むことができる。ゲル化剤の性質に応じて、それは製剤の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．５重量％〜１０重量％、さらに好ましくは１重量％〜５重量％を構成する。好ましいゲル化剤には、カルボマー類、セルロース誘導体、ポロキサマー類およびポロキサミン類などがある。より詳細には、好ましいゲル化剤は、キトサン、デキストラン、ペクチン類、天然ゴムならびにエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などのセルロース誘導体である。一つの非常に好ましいゲル化剤は、ヒドロキシプロピルセルロースである。
【００４３】
製剤がゲル化剤、特に非前中和アクリルポリマーを含む場合、有利には、それは中和剤も含む。中和剤／ゲル化剤比は、好ましくは１０：１〜０．１：１、より好ましくは７：１〜０．５：１、さらに好ましくは４：１〜１：１である。中和剤は、ポリマーの存在下、媒体に可溶な塩を形成するものでなければならない。中和剤はまた、電荷の中和およびポリマー塩の形成中にポリマー鎖の最適な膨潤を可能とするものでなければならない。有用な中和剤には、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アルギニン、アミノメチルプロパノールおよびトロメタミンなどがある。当業者であれば、製剤で用いられるゲル化剤の種類に応じて中和剤を選択するであろう。しかしながら、セルロース誘導体をゲル化剤として用いる場合、中和剤は必要ない。
【００４４】
表１に、２つの非常に好ましい４−ヒドロキシタモキシフェンゲル製剤の組成を示す。
【００４５】
【表１】
下記の内容に関して、例示した実施例は本発明についての理解をさらに深める上で役立つものである。
【実施例】
【００４６】
実施例１：経皮４−ヒドロキシタモキシフェン投与の実証
乳癌患者４名に、１２時間〜７日間の所定の間隔で乳房に直接塗布することでアルコール溶液での［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェンを投与してから、患部組織の摘出手術を行った。手術後、摘出組織と腫瘍周囲の正常乳房組織の両方に放射能が含まれていた（Kuttenn et al., 1985）。
【００４７】
追跡調査試験で、ホルモン依存型乳癌の摘出手術の予定があった患者１２名中の９名に、Ｚ−［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェン（８０μＣｉ）の６０％アルコール溶液の投与を行い、患者３名に比較のためＺ−［３Ｈ］−タモキシフェン（８０μＣｉ）の投与を行った。患者には、１２時間〜７日間の所定の間隔で患部乳房に直接塗布することで［３Ｈ］−標識薬剤を投与してから、患部組織の摘出手術を行った。３つの領域からの乳房組織、すなわち腫瘍、その腫瘍を直接囲む組織および正常組織を摘出し、液体窒素で直ちに冷凍した。さらに、血漿および尿のサンプルを予定の間隔で採取し、分析まで冷凍した。
【００４８】
表２に、実施した分析からの結果を示す。４−ヒドロキシタモキシフェンは、エストロゲン受容体が存在する乳房組織のサイトゾル画分および核画分に主に濃縮されていた。これらの細胞内部位では、Ｚ体からＥ体への限定的な異性化があった以外は、４−ヒドロキシタモキシフェンが代謝されずに残っていた。乳房での保持は、４−ヒドロキシタモキシフェン群ではほぼ４日間続いたが、タモキシフェン群ではそれより短く、かなり弱かった。
【００４９】
【表２】
経皮投与後に乳房組織で［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェンとして確認された放射能のパーセントは、７日間かけて徐々に低下した（９７％から６５％）。その期間中、Ｚ異性体からＥ異性体への異性化が徐々に進行し、第７日目で同様のパーセントとなった（３２％と３３％）。
【００５０】
［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェンによる血液中の放射能は徐々に増え、第４日〜第６日では横這い状態であった。それは、血液中に急速に現れ、第２日目で横這い状態となった［３Ｈ］−タモキシフェンとは対照的である。経皮［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェン投与から３６時間後では、投与した放射能の０．５％のみが血液中で示された。
【００５１】
乳房組織では４−ヒドロキシタモキシフェンの代謝はほとんどなかったのとは対照的に、血液中ではそのような代謝が顕著に起こった。投与から２４時間後、血中放射能の６８％が４−ヒドロキシタモキシフェンによるものであり、１８％がＮ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェンによるものであり、１１％がビスフェノールによるものであった。
【００５２】
ピークの尿排出は、４−ヒドロキシタモキシフェンの経皮投与では、経皮タモキシフェンと比較して遅かった。４−ヒドロキシタモキシフェン投与後、ほとんどがＮ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェンとビスフェノールである代謝物の漸増が尿中において認められた。
【００５３】
本実施例は、４−ヒドロキシタモキシフェンの乳房への経皮投与により、薬剤の実質的かつ永続的局所組織集中が起こり、代謝はごく少量であり、安定かつ非常に低い血漿濃度であり、尿からの排出が遅いことを示している。
【００５４】
実施例２：２０ｍｇ経口タモキシフェンと比較した経皮投与４−ＯＨ−タモキシフェンの薬物動態および薬力学の実証
この試験では、タモキシフェンの経口投与後の４−ヒドロキシタモキシフェンの組織濃度および血漿濃度と、水性アルコールゲルでの経皮投与後の４−ヒドロキシタモキシフェンの組織濃度および血漿濃度とを比較した（Pujol, 1995）。
乳癌手術の予定がある患者３１名を５群中の１群に無作為に割り当てた。その患者に、表３に示したように経口タモキシフェンまたは経皮４−ヒドロキシタモキシフェンのいずれかの投与を行った。投与は１日１回行い、３〜４週間続けてから手術を行った。この試験では、３つの異なる用量の４−ヒドロキシタモキシフェン（０．５、１または２ｍｇ／日）および２種類の塗布面積（両方の乳房または両腕、両前腕および両肩などの大面積の皮膚表面のいずれか）を評価した。１群の患者には、２０ｍｇ／日（１０ｍｇを１日２回）の経口タモキシフェン（ノルバルデックス（Nolvaldex）；登録商標）の投与を行った。
【００５５】
【表３】
４−ヒドロキシタモキシフェンゲル（４−ヒドロキシタモキシフェン２０ｍｇ／水性アルコールゲル１００ｇ；Besins-International Laboratories）は、加圧計量式ポンプに充填し、それによってゲル１．２５ｇ／計量用量（すなわち４−ヒドロキシタモキシフェン０．２５ｍｇ／用量）を投薬した。
【００５６】
手術中、乳房組織の検体２種類（それぞれ１ｃｍ３）を摘出し、一方は腫瘍組織であり、他方は肉眼観察で正常な組織とした。それらは、液体窒素で直ちに冷凍して、分析評価まで保存した。手術当日および手術前日に採血を行った。全ての組織および血漿検体について、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって４−ヒドロキシタモキシフェン濃度を分析した。
【００５７】
投与前および投与後の血液検体について、全血球算定（ＣＢＣ）、ビリルビン、血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、血清グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、アルカリホスファターゼ、クレアチニン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トリグリセリド類、フィブリノゲンおよびアンチトロンビンＩＩＩの分析を行った。
【００５８】
下記の表４に、乳房組織および血漿で認められた４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度をまとめて示す。正常乳房組織および腫瘍乳房組織は、５つの投与群のいずれにおいても同様の濃度の４−ヒドロキシタモキシフェンを含んでいた。４−ヒドロキシタモキシフェンは、ゲルを他の広い皮膚表面よりも乳房に直接塗布した場合に、乳房組織で比較的多量に濃縮されていた。
【００５９】
【表４】
副作用による重大な問題は生じなかった。皮膚投与による局所刺激は起こらなかった。群２（０．５ｍｇ／日の４−ヒドロキシタモキシフェンゲル）の女性１名が、一時的な眩暈、膀胱炎および軽度の膣炎が投与第７日に起こったと報告した。群１（経口タモキシフェン）の女性１名が、投与第５日に一過性熱感および軽度の膣炎を報告した。
【００６０】
４−ヒドロキシタモキシフェンゲルの投与を受けた患者では、血液学的評価および血清化学評価のいずれにおいても投与前血液検体と投与後血液検体の間に差はなかった。しかしながら、アンチトロンビンＩＩＩおよびフィブリノゲンにおける統計的に有意な減少ならびに血小板数およびリンパ球数における統計的に有意な増加が経口タモキシフェン群で認められ、それは他の試験で認められたこの薬剤の生理効果と一致していた。
【００６１】
実施例３：健常女性での経皮投与４−ＯＨ−タモキシフェンの耐容性および薬物動態の実証
この試験は、年齢１８〜４５歳の健常閉経前女性における局所投与４−ヒドロキシタモキシフェンゲルの耐容性および薬物動態を示すものである。各参加者には、２月経周期の期間にわたり、１日１回、ゲルの投与を行った。
【００６２】
表５にまとめたように、３種類の用量および２種類のゲル濃度を調べた。群Ａ〜Ｃでは、４−ヒドロキシタモキシフェン２０ｍｇ／１００ｇを含むゲルを、４−ヒドロキシタモキシフェン０．２５ｍｇ／用量を放出する加圧計量式ポンプから投薬した。片方の乳房に投与するにはゲルの量が多すぎたことから、群Ｃの試験は中断した。群ＤおよびＥには、４−ヒドロキシタモキシフェンをほぼ３倍含む（４−ヒドロキシタモキシフェン５７ｍｇ／ゲル１００ｇまたは４−ヒドロキシタモキシフェン５０ｍｇ／ゲル１００ｍＬ）より濃度の高いゲルを投与した。この濃度のより高いゲルも、４−ヒドロキシタモキシフェン０．２５ｍｇ／用量を供給する計量式ポンプによって投薬した。
【００６３】
【表５】
以下の月経の第１日に、２月経周期にわたる１日１回のゲル投与からなる投与を開始した。第１および第２の周期の第７日、第２０日および第２５日の午前のゲル投与から２４時間後に採血を行った。投与最終日、すなわち第２の月経周期の第２５日に、投与前ならびにゲル投与から０．５、１、１．５、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、４８および７２時間後に順次採血を行った。検体について、４−ヒドロキシタモキシフェン、エストラジオール、プロゲステロン、ＦＳＨおよびＬＨを分析した。
【００６４】
最後のゲル投与から７２時間後でも、４−ヒドロキシタモキシフェンの血漿濃度は検出可能であった。従って、４−ヒドロキシタモキシフェンが血液中で検出できなくなるまでデータポイントを得るようにするため、最後のゲル投与から９２日後まで時々、一部の参加者から追加の採血を行った。
【００６５】
表６に、４−ヒドロキシタモキシフェンの平均±標準偏差（ＳＤ）血漿濃度を示し、括弧内に範囲を示した。単一０．５ｍｇ用量では４−ヒドロキシタモキシフェンの検出可能な血漿濃度は生じなかったが、１ｍｇの単一用量後では患者１２名中６名で血漿濃度は検出可能であった（＞５ｐｇ／ｍＬ）。
【００６６】
【表６】
【００６７】
【表７】
図２に、第２の月経周期の第２５日での最後の投与後における血漿濃度−時間曲線を示す。表７に、第２の月経周期の第２５日での最後の投与に関係する平均薬物動態パラメータを示す。
【００６８】
【表８】
データは、調べた３種類の用量（０．５、１および２ｍｇ）を通じて用量応答と一致している。ＡＵＣおよびＣａｖに基づいて、より濃度の高いゲルの方が、より濃度の低いゲルよりも良好に吸収されており、ほぼ２倍であった。
【００６９】
生物学的耐容性は、患者３６名全員で非常に良好であった。この投与は、月経周期中のＦＳＨ、ＬＨ、エストラジオールおよびプロゲステロンホルモンのレベルに影響を及ぼさなかった。さらに、投与終了後の卵巣の超音波検査は患者全員において正常であり、正常な大きさの発育卵胞を示した。１名の患者がゲルに対するアレルギー反応を発症し、１０名が顔面アクネを報告した（そのうち５名はアクネの既往歴を有していた）。
【００７０】
要約すると、本試験は、局所投与後の４−ヒドロキシタモキシフェンへの曝露が用量に応じて増加し、４−ヒドロキシタモキシフェンの血漿濃度が典型的なエストラジオール濃度（８０ｐｇ／ｍＬ）より低く、全身効果を示す検出可能な臨床検査的および臨床的証拠がないことを示している。
【００７１】
実施例４：経皮投与４−ヒドロキシタモキシフェンが用量に関連した腫瘍組織増殖指数の低下を引き起こすことの実証
本試験は、経皮投与４−ヒドロキシタモキシフェンが用量に関連した乳房腫瘍組織増殖指数の低下を引き起こすことを示すものである。それは、ヒトでの乳癌の生物学的終点に関するタモキシフェンおよび未投与対照と４−ヒドロキシタモキシフェンゲルとの最初の直接比較である。その結果から、乳癌手術を受ける予定になっている閉経後の女性において、２．０ｍｇ／日 ４−ヒドロキシタモキシフェン用量〜２０ｍｇ／日 経口タモキシフェンとほぼ等価な量で、２〜３週間にわたり４−ヒドロキシタモキシフェンゲルを経皮投与することで、腫瘍組織増殖指数（Ｋｉ−６７およびＰＣＮＡ）が用量に依存して低下することがわかる。エストロゲンおよびプロゲステロン受容体レベルは、４−ヒドロキシタモキシフェン治療によって用量に関連した低下を示さなかった。４−ヒドロキシタモキシフェンの血漿レベルは、４−ヒドロキシタモキシフェンゲル群の場合と比較して、経口タモキシフェン群の方が一貫して高く、４−ヒドロキシタモキシフェンの腫瘍組織濃度は、４−ヒドロキシタモキシフェンゲルの用量を多くするに連れて、高くなった。
【００７２】
本試験はまた、タモキシフェンの効果の基礎をなす生物学的プロセスに関する情報を提供するものでもある。２ｍｇ経皮４−ヒドロキシタモキシフェン投与を受けた群は、血漿４−ヒドロキシタモキシフェン濃度が顕著により低かったにも関わらず、経口タモキシフェン群と同等の乳癌細胞増殖に対する細胞増殖抑制効果を示した。この知見は、タモキシフェンの主要な効果に、腫瘍組織におけるエストロゲン受容体が局部的に介在していることを示している。
【００７３】
試験計画
無作為・非盲検・同時平行群のＩＩｂ相試験を計画して、腫瘍増殖のマーカー（Ｋｉ−６７およびＰＣＮＡ）に対する３種類の用量レベルの４−ヒドロキシタモキシフェン、経口タモキシフェンおよび治療（投与）なしの効果を比較した。Ｋｉ−６７抗原はＭＩＢ１抗体によって検出し、ＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）はＰＣ−１０モノクローナル抗体を用いて検出した。
【００７４】
患者
本試験の参加者は、Ｔｒｕ−ｃｕｔ生検（針生検）によって決定されたエストロゲン受容体陽性侵襲性乳癌と診断された閉経後の女性とした。登録基準は、年齢＞５０歳、組織検査で確認されたＴ１またはＴ２エストロゲン受容体陽性原発性乳癌、および生検の１ヶ月以内の手術適合などとした。以前に放射線療法または化学療法を行ったことがある患者、ならびに現在ホルモン置換療法を行っている患者と同様に、炎症性の癌、既知の転移またはリンパ節関与がある患者は除外した（Ｔｒｕ−ｃｕｔ生検の前に、８日間の最低ウォッシュアウト期間を遵守した）。他の除外基準は、抗凝血剤治療を必要とする血栓性静脈炎の病歴、網膜症、アルコールに対する皮膚アレルギーまたはゲル塗布に禁忌である乳房皮膚炎であった。
【００７５】
患者は、０．５ｍｇ／日４−ＯＨＴ（０．５ｍＬゲル［０．２５ｍｇ４−ＯＨＴ］を各乳房に１日１回塗布）；１．０ｍｇ／日４−ＯＨＴ（１ｍＬゲル［０．５ｍｇ４−ＯＨＴ］を各乳房に１日１回塗布）；２．０ｍｇ／日４−ＯＨＴ（２ｍＬゲル［１．０ｍｇ４−ＯＨＴ］を各乳房に１日１回塗布）；経口タモキシフェン（単回投与として２０ｍｇ／日）または処置なし（未投与対照）という５種類の治療群のいずれかに無作為に割り当てた。患者は、治療開始から１５日後〜２２日後に治療を目的とした腫瘍切除手術を受ける予定とした。手術前日に、４−ＯＨＴ濃度を測定するために、採血も行った。手術当日、患者について、併用療法、併発状態、血液検査、生化学検査、血漿４−ＯＨＴ、エストロン（Ｅ１）およびエストラジオール（Ｅ２）濃度の再評価を行った。
【００７６】
腫瘍サンプリング
診断を目的とした初回診療所来院時に採取したＴｒｕ−ｃｕｔ針／コア生検を、無作為化前の腫瘍サンプルとして用いた。治療後の検体は、最終的な切除手術時に得た。切除直後に、全ての組織サンプルは３．７％ホルマリンで固定し、その後、切片切り分けと続く生物学的マーカーの分析用にパラフィンワックスで包埋した。腫瘍摘出物（治療の前および後）も、後に行うエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のアッセイならびに４−ＯＨＴレベルのアッセイのために、液体窒素中で保存した。
【００７７】
腫瘍マーカー発現の分析
増殖関連抗原の発現
Ｋｉ６７および増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）標識指数（ＬＩ）を、治療前および治療後の組織検体のパラフィン包埋切片について評価した。Ｋｉ６７抗原は、病理学において通常の条件で用いられるモノクローナル抗体ＭＩＢ１（DAKO, デンマーク）を用いて評価した。抗ＰＣＮＡ（DAKO）は、固定化組織における増殖を分析するのに用いられる一連の抗体を完成した。検出は、熱変性させずに行った。サンプリングを標準化するために、症例ごとに６個の連続切片を分析した。解析は、コンピュータ支援システムを用いて行った（Systeme microphotometrique a balayage automatique; Samba-Alcatel, Grenoble,
France）。各組織標本について、基準として分析視野の実際の顕微鏡像を用いて、光学密度（ＯＤ）閾値を測定した。免疫染色の測定は、×２５で行った。各切片について２０の視野を分析した。染色された核表面を測定し（セグメント化および閾値化）、ＬＩの評点を付けた（染色された細胞／対比染色された要素）。ＯＤ免疫染色は、任意の単位で表した。免疫染色定量分析およびその手順の再現性の管理を、同じ組織標本について行った反復測定との比較によって、同じ検体の６個の連続切片について集められた測定値との比較によって行った。免疫染色定量分析における組織変動の評価は、各検体からの不連続切片から取った２０視野のＯＤ免疫染色測定値と比較することによって行った。リンパ節で活発に増殖する細胞（胚中心細胞）によって示されるＰＣＮＡ免疫反応性の強度を、乳房組織における閾値陽性染色の基準として用いた。結果はＬＩとして表した。
【００７８】
エストロゲンおよびプロゲステロン受容体の発現
デキストラン被覆炭末法（Dextran-Coated Charcoal method; Korenman, 1974）を用いるリガンド結合アッセイ（ligand binding assay; ＬＢＡ）および／またはパラフィン包埋切片についての免疫組織化学的（ＩＣＨ）方法によって、治療前および治療後の腫瘍組織で、エストロゲン（ＥＲ）およびプロゲステロン（ＰｇＲ）受容体濃度についての評価分析した。ＥＲ陽性のカットオフ値は、放射免疫検定を用いた測定で１０ｆｍｏｌ／ｍｇ超または免疫酵素分析（Bevitt, 1997）によって標識付された腫瘍細胞の１０％超であった。
【００７９】
４−ＯＨＴアッセイ
血漿、腫瘍組織および正常組織中の４−ＯＨＴ濃度測定は、負イオン化学イオン化モード（ＮＩＣＩ）（Girault, 1993）で用いられる質量分析（ＭＳ）を組み合わせたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて行った。この方法の定量限界は、それぞれ、血漿サンプルで５ｐｇ／ｍｌ、組織サンプルで５０ｐｇ／ｇであった。手術時（治療後）に得られた腫瘍摘出物および正常乳房組織は、後に行う４−ＯＨＴのアッセイまで液体窒素中で保存した。
【００８０】
統計的解析
対照群の患者１４名および４−ＯＨＴゲルに割り当てられた患者４２名（３つの群）という計画された標本数に基づき、この試験は良好な検出力（９０％）を有しており、５％の第一種過誤を有する両側検定を用いて、未投与群と比較して、４−ＯＨＴ群でＫｉ−６７標識指数において５０％を超える仮説相対低下を検出した。一次効力エンドポイントは腫瘍増殖マーカー発現における変化とした。他の試験変量は二次エンドポイントと考えた。この「プロトコルごと」の解析には、少なくとも１３日間の治療を受け、一次エンドポイントについての治療評価を終了し、重大なプロトコル逸脱や違反がない患者のみを含めた。
【００８１】
治療群の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。データの分布が非対称／非正規である場合には、クラスカル・ワリス検定を用いた。カテゴリ変数は、フィッシャーの直接確率検定を用いて解析した。仮説検定は、多重比較用に調節されたα＝０．０５有意差レベルで実施した。推論は、５つの治療群間の差についての検定；４−ＯＨＴの３つの用量レベル間の差の検査；４−ＯＨＴおよび経口タモキシフェンの各用量レベル間の差の検査という、測定された変数についてのカテゴリに分類された。
【００８２】
結果
患者の特徴
この試験には合計５５名の患者が登録された。患者６名は解析から除外した。１名（４−ＯＨＴ １．０ｍｇ／日群）は同意を撤回し、１名（０．５ｍｇ／日）は追跡調査に現れず、１名（２．０ｍｇ／日）は試験開始時にエストロゲン受容体陰性であり、１名（０．５ｍｇ／日）はホルモン置換療法を受けており、２名（０．５ｍｇ／日および１．０ｍｇ／日）はわずか６日後および１２日後に治療を中断した。従って、合計４９名の患者が効力に関して評価可能であった。腫瘍の大きさ、無月経期間および手術時点での腫瘍の悪性度に関して、群間のバランスは良好であった。未治療対照群の患者は、積極的治療群の患者よりも高齢であった（表７）。
【００８３】
【表９】
増殖関連抗原の発現
基準線レベルの調節を行った後、投与後の腫瘍組織Kｉ−６７ＬＩは５つの群間で有意に異なっていた（表８）。投与患者（４−ＯＨＴ［全ての用量］および経口タモキシフェン）では、未投与群と比較して、平均Ｋｉ−６７ＬＩスコアが有意に低かった（Ｐ＝０．００５４）。投与後の平均Ｋｉ−６７ＬＩスコアは、４−ＯＨＴ投与群については用量に依存していた。さらに、４−ＯＨＴ ２．０ｍｇ／日群と経口タモキシフェン群間でほぼ同等の用量−応答関係が表９Ａで示されており、その表は≧１、≧２または≧３の任意の単位でのＫｉ−６７ＬＩの低下があった患者のパーセントを示している（％）。タモキシフェンといずれの用量の４−ＯＨとの間でもＫｉ−６７標識に有意な差はなかった。ＰＣＮＡ ＬＩによって測定された各種投与に対する腫瘍組織応答は、Ｋｉ−６７ ＬＩによって評価されたものと同等であった（表８、９Ｂ）。投与後、４つの投与群についての腫瘍組織ＰＣＮＡ ＬＩは、未投与対照とは有意に異なっていた（Ｐ＝０．００２）。Ｋｉ−６７ＬＩで認められたように、≧１、≧２または≧３の単位のＰＣＮＡ指数の低下があった患者のパーセント（％）は、未投与対照と比較して、特に４−ＯＨＴ １ｍｇ／日群および２ｍｇ／日群の場合に４−ＯＨＴの強力な治療効果を示しており、経口タモキシフェンとほぼ同等であることを示した（表９Ｂ）。タモキシフェンといずれの用量の４−ＯＨＴとの間でもＰＣＮＡ標識に有意な差はなかった。３つの任意の単位のＰＣＮＡ ＬＩまたはＫｉ−６７ＬＩの低下があった腫瘍と定義される応答は、４−ＯＨＴ用量に伴って高くなる傾向を示した。しかしながら、サンプル数は、その関係についての有意差を証明するには十分でなかった。
【００８４】
【表１０】
【００８５】
【表１１】
ＥＲ発現
ＲＩＡを用いると、投与前のＥＲ濃度は群間で統計的に同様であり、平均群値は５〜５６ｆｍｏｌ／ｍｇの範囲であった。個々の値は広い範囲を示した（９〜３２１ｆｍｏｌ／ｍｇ）。ＥＲ陽性腫瘍のタモキシフェンまたは４−ＯＨＴによる治療によって、未投与対照群と比較して、ＥＲ濃度の有意な低下（Ｐ＝０．０１２）が得られた。ＩＣＨを用いると、ＥＲ濃度（標識細胞の％）は、群間にわたって基準線において同じ中央値を示し（７０〜８５％）、全ての群で投与後に統計的に有意な増加の傾向は示されなかった。
【００８６】
ＰｇＲ発現
ＰｇＲのＲＩＡ測定値は基準線で広範囲に及んでおり、全ての群で投与後に増加し、統計的有意差または用量に関連したパターンはなかった。ＩＣＨ測定値を伴うＰｇＲ結果では、一貫した治療効果または用量に関連した変化は全く示されなかった。
【００８７】
４−ＯＨＴ組織濃度および血漿濃度（表１０、図３）
４−ＯＨＴ中央値濃度は、２．０ｍｇ／日４−ＯＨＴ群（１６９８ｐｇ／ｇ）と比較して、経口タモキシフェン群（４２３７ｐｇ／ｇ）ではおおよそ２倍であった。経皮投与量に応じた中央値組織４−ＯＨＴ濃度（ｐｇ／ｇ）（０．５ｍｇ／日、１ｍｇ／日および２ｍｇ／日それぞれについて、６８７ｐｇ／ｇ、１３７７ｐｇ／ｇおよび１６９８ｐｇ／ｇ）の増加にも関わらず、３群間の差は統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．１３）。非腫瘍組織４−ＯＨＴ濃度は、０．５ｍｇ／日群を除く全てで腫瘍組織中の濃度の約半分であった。４−ＯＨＴ中央値血漿濃度については、４投与群間で有意差があり（Ｐ＝０．００１５）、経口タモキシフェン群の方が４−ＯＨＴゲル群より高レベルであった（１４９５ｐｇ／ｍＬと、それぞれ３１ｐｇ／ｍＬ、３５ｐｇ／ｍＬおよび１６４ｐｇ／ｍＬ）。さらに、４−ＯＨＴ経皮投与量を上昇させるに連れて、血漿４−ＯＨＴの有意な増加がある（Ｐ＝０．０３５）。
【００８８】
【表１２】
引用刊行物
【００８９】
【表１３】
【００９０】
【表１４】
【００９１】
【表１５】
【００９２】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】タモキシフェンの代謝を示す図である。
【図２】皮膚投与後の健常女性における４−ヒドロキシタモキシフェンの平均血漿濃度を示す図である。
【図３Ａ】投与形態および用量に応じた、組織中の４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す図である。パネルＡ（図３Ａ）は、腫瘍組織での４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示している。
【図３Ｂ】投与形態および用量に応じた、組織中の４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す図である。パネルＢ（図３Ｂ）は、血漿での４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示している。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）による乳癌の治療および予防に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、米国および世界全体の女性にとって重大な健康上の問題となっている。この疾患の発見および治療においては進歩があるものの、乳癌は現在も、女性における２番目に多い癌関連の死亡原因であり、毎年米国のみで１８万人を超える女性がそれを患っている。北米の女性の場合、乳癌に罹る生涯確率は８人に１人である。
【０００３】
現在のところ、乳癌の予防方法または治療方法で普遍的に奏功するものは存在しない。この疾患の治療技術は、早期診断（通常の乳房スクリーニング法による）と、手術、放射線療法、化学療法およびホルモン療法などの様々な治療１つ以上を含み得る積極的治療との組合せに依存している。これらの療法は、危険で、毒性があり、高価で、しかも多くの場合、特に転移疾患の治療の場合には効果がない。
【０００４】
乳癌に最も一般的に処方されるホルモン薬はタモキシフェンである。この薬剤は、乳癌細胞の増殖を促進するエストロゲンの作用を遮断することで作用する。乳癌の治療として、タモキシフェンは、身体内に既に存在する癌細胞の増殖を遅延または停止させ、再発および新たな癌の発生を防止するのを助ける。タモキシフェンを５年間服用することで、エストロゲン受容体陽性癌の患者において再発のリスクは約半分に低下する。タモキシフェンはまた、閉経前および閉経後の女性の両方で、反対側の乳房が関与する乳癌（対側性）の発生率も低下させる。さらに、タモキシフェンは最近、この疾患を発症するリスクが高い女性において乳癌の発生率を低下させることが認められている。
【０００５】
その利益にも関わらず、タモキシフェンは重大な欠点を有する。それの作用は、身体内の全てのエストロゲン受容体を有する細胞に影響を与える可能性があり、作働薬と拮抗薬の両方として、タモキシフェンは非常に広範囲の全身効果を誘発する。これらの効果は、子宮体癌、子宮内膜増殖症およびポリープ、深部静脈血栓症および肺動脈塞栓症、肝臓酵素レベルにおける変化、ならびに白内障などの眼球障害のリスクを高めるものである。さらに、経口タモキシフェン治療を受けた患者は、一過性熱感、膣帯下、抑鬱、無月経および吐き気があったと報告している（Ibis, 2002; Fentiman 1986, 1988, 1989）。
【０００６】
タモキシフェンが持つ欠点のために、一部の癌研究者は、乳癌に対してタモキシフェンの代謝物である４−ヒドロキシタモキシフェンを用いることを提案している。in vitro試験で、４−ヒドロキシタモキシフェンは、正常および癌性の両方の乳房細胞の増殖を阻害する（Nomura, 1985; Malet, 1988, 2002; Charlier, 1995）。さらに、経皮的に投与された４−ヒドロキシタモキシフェンは、マウスで皮下増殖させたヒト乳房腫瘍に対して抗腫瘍効果を示す（米国特許第５，９０４，９３０号）。
【０００７】
ヒトでの限られた実験から、経皮的に投与された４−ヒドロキシタモキシフェンが局所の乳房腫瘍に集中して、全身への分布が非常に少なくなり得ることが明らかになっている（Mauvais-Jarvis, 1986）。しかしながら、患者を３週間治療した、この種の最も長期にわたる報告された試験から、経皮的に投与された４−ヒドロキシタモキシフェンの乳房組織濃度が経口タモキシフェン治療後に認められた濃度よりも低いままであることが明らかになった（Pujol, 1995）。従って、その研究者らは、代替のタモキシフェン治療法として経皮４−ヒドロキシタモキシフェンを提案することはできないという結論に至っている。
【０００８】
重要なことには、ヒトでの４−ヒドロキシタモキシフェンに関する報告されている試験で、抗腫瘍効果を評価したものがない。それがないために、経皮投与される４−ヒドロキシタモキシフェンが実際にヒトの乳癌に対して効果を発揮するか否かという最も重要な疑問が全くわからない状態である。従って、現在もなお、全身的な副作用をほとんど引き起こさない乳癌の治療および予防法に対する強いニーズが存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、４−ヒドロキシタモキシフェンを投与することにより乳癌を治療する方法を含む。この治療方法は、好ましくは局所的に実施され、腫瘍組織の増殖を効果的に減少させ、経口タモキシフェンと比べて血漿薬物レベルが低くなる。
【００１０】
本発明はまた、４−ヒドロキシタモキシフェンを投与することにより乳癌を予防する方法を含む。前記治療方法と同様に、予防方法も好ましくは局所的に実施される。
【００１１】
本発明はさらに、４−ヒドロキシタモキシフェンおよび少なくとも１種類の浸透促進剤を含む経皮投与用医薬組成物を含む。
【００１２】
予防または治療の目的のために、４−ヒドロキシタモキシフェンは、in vivoでエストロゲン受容体を有する細胞にその薬剤を送達させるどのような手段によっても投与することができる。前述のように、投与を経皮的に（局所的に）行って、４−ヒドロキシタモキシフェンの一次通過効果および関連する肝臓代謝を回避することが好ましい。経皮投与においては、４−ヒドロキシタモキシフェンはいずれの皮膚表面にも塗布することができる。４−ヒドロキシタモキシフェンは、経皮的に投与すると、エストロゲン受容体を有する局所皮下組織に集中する傾向があることから、乳房に塗布することが有利である。
【００１３】
本発明を実施する上で、広範囲の局所的配合が好適であるが、水性アルコール溶液および水性アルコールゲルが好ましい。それらの製剤における４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度は変動し得るものであるが、用量は、エストロゲン誘発効果に有効に対抗する局所４−ヒドロキシタモキシフェン組織濃度を生じるものでなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明の重要な面は、経皮投与した場合に４−ヒドロキシタモキシフェンが乳癌の治療だけでなく、その予防にも有効であるという驚くべき発見である。さらに、経皮投与された４−ヒドロキシタモキシフェンによって、経口タモキシフェンの標準的用量と比較して血漿薬剤レベルが低くなり、それはすなわち有害な副作用が少ないということである。従って、経皮４−ヒドロキシタモキシフェンは、この文脈において治療と予防の両方でタモキシフェンの代替薬となる。
【００１５】
本発明者らは、４−ヒドロキシタモキシフェンがヒトにおいてin vivoでの乳房腫瘍増殖を減少させることを証明するために第１の試験を行った（下記の実施例４を参照）。手短に言えば、本発明者らは、エストロゲン受容体陽性乳癌と診断されたヒト患者に４−ヒドロキシタモキシフェンゲルを経皮投与した。投与からわずか２〜３週間後に、本発明者らは用量に関連した腫瘍組織増殖指数の低下を認め、最も高い用量（２．０ｍｇ／日）は標準的な用量の経口タモキシフェンとほぼ同等の効果を示した。評価した腫瘍組織増殖指数はＫｉ６７（Gerdes 1984; Schluter 1993）および増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）（Waseem, 1990）である。経皮４−ヒドロキシタモキシフェンゲルおよび経口タモキシフェンは、腫瘍組織増殖低下において同等であったが、４−ヒドロキシタモキシフェン血漿レベルは４−ヒドロキシタモキシフェンゲルが投与された患者の方が一貫して低かった。
【００１６】
化合物４−ヒドロキシタモキシフェン、すなわち１−［４−（２−Ｎ−ジメチルアミノエトキシ）フェニル］−１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニルブト−１−エンは、特性がよく分かっている抗エストロゲン化合物であるタモキシフェンの活性代謝物である。２個の炭素原子間に二重結合が存在することから、４−ヒドロキシタモキシフェンは２つの立体異性体の形態で存在する。医学文献および生化学文献によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンの異性体は一般に、シスおよびトランス異性体と称される。しかしながら、純粋に化学的な観点からすると、二重結合している炭素原子それぞれは同一の化学基を持たないので、この呼称は厳密に正確なものではない。従って、異性体をＥ（いわゆるシス型）およびＺ（いわゆるトランス型）の配置と称する方がより適切である。本発明によれば、単独または組み合わせでの４−ヒドロキシタモキシフェンのＥ異性体およびＺ異性体の両方が有用である。しかしながら、Ｚ異性体の方がＥ異性体より活性が高いことから、Ｚ異性体が好ましい。
【００１７】
４−ヒドロキシタモキシフェンは、エストロゲン受容組織に対する組織特異性を示す選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）として作用する。乳房組織ではそれは、エストロゲン拮抗薬として機能する。４−ヒドロキシタモキシフェンが組織特異的活性に寄与する可能性があるエストロゲン関連受容体の転写活性を調節し得ることが、研究から明らかになっている。in vitroにおいて４−ヒドロキシタモキシフェンは、エストロゲン受容体すなわちＥＲに対する結合アフィニティによる測定でタモキシフェンより高い効力と、エストロゲン受容体に関してエストラジオールと同様の結合アフィニティを示す（Robertson et al., 1982; Kuiper et al., 1997）。Ｚ−４−ヒドロキシタモキシフェンは、Ｚ−タモキシフェンと比較して、正常ヒト上皮乳房細胞の培養での増殖を１００倍阻害する（Malet et al., 1988）。
【００１８】
４−ヒドロキシタモキシフェンはタモキシフェン代謝物であるが、乳癌に対してのそれの有用性は、タモキシフェン自体での以前の経験では予測されないものである。タモキシフェンは、図１に示すように、ヒトにおいて広範囲にわたって代謝される。従って、それのin vivoでの作用は、標的組織内における受容体の占有に関して競合する親化合物とそれの代謝化合物による個々の作用の正味の結果である。例えば、ジョーダンの報告（Jordan, 1982）を参照のこと。これらの各化合物は、各種細胞で多様かつ予測できない生物活性を示し、その一部は各化合物のエストロゲン受容体配座に対する個々の効果によって測定される。すなわち、各化合物のエストロゲン受容体結合により、特有の受容体−リガンド配座が生じ、それが各種補因子を召集することで、異なる化合物では薬理特性が変動することになる（Wijayaratne et al., 1999; Giambiagi et al., 1988）。
【００１９】
その変動する効果の例がいくつか報告されている。例えば、タモキシフェンは強力なラット肝臓発癌物質であるが、４−ヒドロキシタモキシフェンはそうではない（Carthew et al., 2001; Sauvez et al., 1999）。さらに、伝えられるところによれば、タモキシフェンはｐ５３（−）正常ヒト乳房上皮細胞でのアポプトシスを起こすが、４−ヒドロキシタモキシフェンはそうではない（Dietze et al., 2001）。対照的に、４−ヒドロキシタモキシフェンは乳癌細胞系でエストロンスルファターゼ活性に対するかなりの阻害効果を示すが、一方、それに関してタモキシフェンはほとんど、または全く効果がない（Chetrite et al., 1993）。
【００２０】
４−ヒドロキシタモキシフェンを用いた以前の試験も、乳癌の治療および予防についてのそれの有効性を予見するものではなかった。薬剤がin vitroまたは異種移植片アッセイでの腫瘍細胞増殖を阻害する能力は、その薬剤がヒトでどのように作用すると考えられるかを示す指標としては十分なものではない（Gura, 1997）。人工的な環境である細胞培養は、完全な生体系で薬剤がどのように作用するかについて情報を提供するものではなく、多くの場合、動物による薬物の処理はヒトの場合と同様ではない。さらに、以前の４−ヒドロキシタモキシフェンを用いたヒト試験は薬剤送達のみを評価しており、乳房腫瘍に対するこの薬剤の効果に関する情報は提供されていなかった。これとは対照的に、本発明者らが行った実験では、驚くべきことに、経皮投与された４−ヒドロキシタモキシフェンが、腫瘍組織増殖指数において用量に関連した低下を引き起こすことが示された。
【００２１】
４−ヒドロキシタモキシフェンの製造方法は、よく知られている。例えば、米国特許第４，９１９，９３７号には、ロバートソンらの報告（Robertson and Katzenellenbogen, 1982）に由来する合成が記載されている。その合成は、下記の数段階で行われる。
【００２２】
段階１ − ４−（β−ジメチルアミノエトキシ）−α−エチルデオキシベンゾインとｐ−（２−テトラヒドロピラニルオキシ）フェニルマグネシウムブロミドとの反応；
段階２ − 段階１とは別に、１，２−ジフェニル−１−ブタノンのヒドロキシル化による１−（４−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブタノンの形成；
段階３ − 段階１の生成物と段階２の生成物との反応による１−（４−ジメチルアミノエトキシフェニル）−１−［ｐ−２−テトラヒドロピラニルオキシ）フェニル］−２−フェニルブタン−１−オールの形成；
段階４ − メタノール／塩酸による脱水による、Ｅ異性体およびＺ異性体の混合物である１−［ｐ−（β−ジメチルアミノエトキシ）フェニル］−Ｚ−１−（ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−フェニル−１−ブト−１−エン ＝４−ＯＨ−タモキシフェンの生成；
段階５ − クロマトグラフィーおよび結晶化によるＥ異性体およびＺ異性体の分離による一定の比活性の実現。
【００２３】
本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンを乳癌と診断された患者に投与することができる。４−ヒドロキシタモキシフェンが主としてエストロゲン受容体に対して作用することにより、その効果を発揮すると考えられることから、その癌は好ましくはエストロゲン受容体陽性である。さらに、乳癌が乳房に局在していることが好ましい。例えば、乳房のみに局在している原発性乳房腫瘍および／または転移性腫瘍は、局所投与によって治療することができる。しかしながら、局所投与された４−ヒドロキシタモキシフェンが到達可能な他の箇所での乳癌腫瘍も、このようにして治療することができる。
【００２４】
本発明はまた、乳癌になるリスクが高い患者に４−ヒドロキシタモキシフェンを予防的に投与することを意図するものである。乳癌の多くの危険因子について、よく確認されている。例えば、乳癌の家族歴、乳癌の個人歴、非定型過形成などの増殖性乳房疾患の過去の乳房生検による検出、および過去の乳房放射線照射はいずれも、患者を、乳癌発症リスクを高くする状態に置くものである。特定の遺伝的危険因子には、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＡＴＭ、ＣＨＥＫ−２およびｐ５３突然変異体などがある。女性における、ある種の生活様式に関連した危険因子には、３０歳を超えた高齢出産、長期間の経口避妊薬の使用および長期間のホルモン置換療法の使用などがある。熟練の医師であれば、これらの危険因子および他の危険因子を評価して、患者が４−ヒドロキシタモキシフェンの予防的使用によって利益を得られるか否かを決定することができる。そのような評価をするにおいて、医師はゲイルモデル（Gail model）を用いることができる。
【００２５】
４−ヒドロキシタモキシフェンは、閉経前の女性において乳癌を予防するのに特に有用である。この個体群では、抗エストロゲンが多量の循環エストロゲンと競合して、エストロゲン受容体を占有するはずである。４−ヒドロキシタモキシフェンはタモキシフェンと比較してエストロゲン受容体に対して１００倍の親和性を有することから、低用量で、より良好に受容体について競合することができる。低用量を用いることができるという点は、薬剤への患者の曝露が長期間であり、副作用の耐容性が比較的低い予防の状況において特に重要である。
【００２６】
本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンは、in vivoで活性化合物を乳房および／または腫瘍エストロゲン受容体に送達するどのような剤形でも、およびどのような系を経てでも投与することができる。好ましくは、４−ヒドロキシタモキシフェンは「経皮投与」によって送達される。その表現は、患者の皮膚の表面から、角質層、表皮層および真皮層を通って、微小循環系に至る薬剤の送達方法すべてを意味する。それは典型的には、濃度勾配の下降に沿う拡散によって得られる。その拡散は、細胞内浸透（細胞を通って）、細胞間浸透（細胞間で）、経付属器浸透（毛嚢、汗および皮脂腺を通って）、またはそれらのいずれかの組合せを介して生じ得る。
【００２７】
４−ヒドロキシタモキシフェンの経皮投与には、いくつか利点がある。第１に、それは、経口投与後に起こる肝臓代謝を回避するものである（Mauvais-Jarvis et al., 1986）。第２に、経皮投与は、全身薬剤曝露およびそれに伴う身体全体での非特異的なエストロゲン受容体の活性化によるリスクを大幅に低減させる。これは、局所４−ヒドロキシタモキシフェンが主として局所組織に吸収されるためである。特に、４−ヒドロキシタモキシフェンを乳房に経皮的に塗ると、おそらく多くのエストロゲン受容体が乳房組織内にあるために、高濃度が乳房組織に蓄積して、血漿濃度が高くならない（Mauvais-Jarvis et al., supra）。従って、本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンはいずれの皮膚表面にも塗布することができるが、好ましくは片方または両方の乳房に塗布する。
【００２８】
本発明は特定の理論に拘束されるものではないが、抗エストロゲン剤が標的外の組織でエストラジオールに置き換わると、その薬剤の臨床的に重大な副作用が生じる。４−ヒドロキシタモキシフェンおよびエストラジオールはエストロゲン受容体に対して同様の結合アフィニティを有することから、受容体結合についてのそれらの間の競合は、各化合物の濃度が他方のものとほぼ同じである場合には、ほぼ同等であると考えられる。４−ヒドロキシタモキシフェン濃度がエストラジオール濃度より高い場合、前者の方が優先的にエストロゲン受容体に結合し、その逆もまた同様である。
【００２９】
従って、約８０ｐｇ／ｍＬ未満の血漿濃度または正常な閉経前の女性での平均エストラジオール濃度未満になる４−ヒドロキシタモキシフェンの用量が好ましい。より好ましくは、４−ヒドロキシタモキシフェンの用量は、約５０ｐｇ／ｍＬ未満の血漿濃度になるものである。投与される１日用量は、最初に、４−ヒドロキシタモキシフェンの吸収係数、所望の乳房組織濃度および超えてはならない血漿濃度に基づいて推定することができる。当然のことながら、初期用量は、個々の応答に応じて、各患者で最適化してもよい。
【００３０】
上述のように、４−ヒドロキシタモキシフェンを乳房組織に向かわせることで、その組織で高濃度を達成しながら、同時にエストラジオール受容体に関する重大な全身的競合が起こるところまで４−ヒドロキシタモキシフェン血漿レベルが上昇しないようにすることができる。１ｍｇ／乳房／日の経皮用量で、乳房組織中の４−ヒドロキシタモキシフェン濃度は、乳房組織中の正常なエストラジオール濃度の４倍となる（Barrat et al., 1990; Pujol et al., supra）。さらに、このように塗布された４−ヒドロキシタモキシフェンは、乳房組織で、血漿中の濃度の一桁高い濃度、すなわち１０：１の濃度に達する。それとは対照的に、タモキシフェンの経口投与後における４−ヒドロキシタモキシフェンの乳房組織／血漿の比率は、約５：１である。
【００３１】
経皮製剤では、０．２５〜２．０ｍｇ／乳房／日のオーダーの４−ヒドロキシタモキシフェンの用量によって所望の結果が得られるはずであり、約０．５〜１．０ｍｇ／乳房／日の用量が好ましい。特定の態様においては、４−ヒドロキシタモキシフェンの用量は、約０．５ｍｇ／乳房／日、０．７５ｍｇ／乳房／日または１．０ｍｇ／乳房／日である。
【００３２】
経皮投与は、主として（ｉ）治療活性化合物または無毒で薬剤として許容されるそれの塩を好適な医薬担体および任意選択で浸透促進剤と混合して、軟膏、乳濁液、ローション、液剤、クリーム、ゲルなどを形成し、その調剤薬の所定量を皮膚の特定の領域に塗布する、あるいは（ｉｉ）公知の技術に従って貼付剤または経皮投与系に治療活性物質を組み込むという２つの異なる方法で行うことができる。
【００３３】
経皮薬剤投与の有効性は、薬剤濃度、塗布した表面積、塗布の時間および期間、皮膚水和、薬剤の物理化学特性ならびに調剤薬と皮膚の間の薬剤の分配などの多くの要素によって決まる。経皮での使用を意図した薬剤の製剤は、これらの要素を利用して、最適な送達を達成すものである。そのような製剤は、多くの場合、角質層の物理化学特性を可逆的に変えることにより角質層の抵抗を低下させることで、角質層の水化を変えることで、共溶媒として働くことで、あるいは細胞間の空間での脂質およびタンパク質の構成を変えることで経皮吸収を改善する浸透促進剤を含む。そのような経皮吸収の促進剤には、界面活性剤、ＤＭＳＯ、アルコール、アセトン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、脂肪酸、脂肪アルコール、およびそれらの誘導体、ヒドロキシ酸、ピロリドン類、尿素、精油、それらの混合物などがある。化学的促進剤以外に、物理的方法によって経皮吸収を増加させることができる。例えば、閉鎖包帯によって皮膚の水分増加が誘発される。他の物理的方法にはイオン導入および超音波導入などがあり、それらはそれぞれ電場および高周波数超音波を用いて、その大きさ及びイオン特性のためにほとんど吸収されない薬剤の吸収を高めるものである。
【００３４】
経皮薬剤送達に関係する多くの要素および方法については、文献に総説がある（REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, Alfonso R. Gennaro
(Lippincott Williams & Wilkins, 2000), pp.836-58; PERCUTANEOUS ABSORPTION:
DRUGS COSMETICS MECHANISMS METHODOLOGY, Bronaugh and Maibach (Marcel Dekker,
1999)）。これらの刊行物が明らかにしているように、医薬分野での当業者は、各種の要素および方法を駆使して、有効な経皮送達を達成することができる。
【００３５】
４−ヒドロキシタモキシフェンは、巨大で非常に親油性が高い分子である。このため、浸透促進剤の助けがなければ、それは皮膚にほとんど浸透しない。従って、本発明で用いられる４−ヒドロキシタモキシフェンの製剤は、好ましくは、１以上の浸透促進剤を含む。４−ヒドロキシタモキシフェンはアルコールに可溶であることから、アルコールが好ましい促進剤である。ミリスチン酸イソプロピルも好ましい促進剤である。
【００３６】
経皮投与のためには、４−ヒドロキシタモキシフェンは、軟膏、クリーム、ゲル、乳濁液（エマルジョン）、ローション、散剤、オイルまたは同様の製剤で送達することができる。そのために、前記製剤は通常の賦形剤添加物を含むことができ、それには扁桃油、オリーブ油、桃仁油、落花生油、ヒマシ油などの植物性油、動物性油、ＤＭＳＯ、脂肪および脂肪様物質、ラノリンリポイド類、ホスファチド類、パラフィン類などの炭化水素類、ワセリン、ワックス類、洗剤乳化剤、レシチン、アルコール類、カロチン、グリセロール（すなわちグリセリン）などのポリオール類またはポリグリコール類、グリセロールエーテル類、グリコール類、グリコールエーテル類、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、非揮発性脂肪アルコール類、酸類、エステル類、揮発性アルコール系化合物、尿素、タルク、セルロース誘導体、着色剤、酸化防止剤および防腐剤などがある。
【００３７】
本発明によれば、４−ヒドロキシタモキシフェンはまた、経皮貼付剤を介して送達することもできる。一実施形態において、その貼付剤は、４−ヒドロキシタモキシフェン製剤のための貯留部を有する。その貼付剤は、（ａ）溶液不透過性の裏材ホイル、（ｂ）空洞部を有する層状様の要素、（ｃ）微孔性膜または半透膜、（ｄ）自己接着性層、および（ｅ）任意選択で、取り外し可能な裏材フィルムを有することができる。空洞部を有する層状様の要素は、裏材ホイルと膜によって形成することができる。あるいは、この貼付剤は、（ａ）溶液不透過性の裏材ホイル、（ｂ）貯留部としての開放孔発泡体、密閉孔発泡体、組織様層または繊維質のウェブ様層、（ｃ）（ｂ）による層が自己接着性でない場合には自己接着性層、および（ｄ）任意選択で、取り外し可能な裏材フィルムを有することができる。
【００３８】
本発明の好ましい実施形態においては、４−ヒドロキシタモキシフェンは水性アルコールゲル中に配合される。そのようなゲル中の４−ヒドロキシタモキシフェンの量は、ゲル１００ｇ当たり４−ヒドロキシタモキシフェンが約０．００１ｇ〜約１．０ｇの範囲とすることができる。好ましくは、ゲル１００ｇ当たり４−ヒドロキシタモキシフェンが約０．０１ｇ〜約０．１ｇの範囲である。
【００３９】
４−ヒドロキシタモキシフェン製剤が浸透促進剤として１以上の脂肪酸エステルを含むことも好ましい。脂肪酸エステル浸透促進剤の非常に好ましい一例は、ミリスチン酸イソプロピルである。ミリスチン酸イソプロピルをゲルで使用する場合、その量は、ゲル１００ｇ当たり約０．１〜約５．０ｇの範囲とすることができる。好ましくは、ミリスチン酸イソプロピルの量は、ゲル１００ｇ当たり約０．５〜約２．０ｇの範囲である。
【００４０】
本発明の４−ヒドロキシタモキシフェン製剤は通常、１以上の非水系媒体を含む。これらの媒体は、４−ヒドロキシタモキシフェンと使用される浸透促進剤のいずれも溶解できるものでなければならない。それらはまた、大気圧下で低い沸点、好ましくは１００℃未満の沸点を有し、皮膚と接触した時に急速に蒸発できるものでなければならない。好適な非水系媒体の例には、エタノール、イソプロパノールおよび酢酸エチルなどがある。エタノールおよびイソプロパノールが好ましい。特に、エタノールは、皮膚と接触した時に急速に蒸発することにより、４−ヒドロキシタモキシフェンの経皮吸収に効果的に寄与する。ゲル製剤中の非水系媒体の量は、通常、５４重量％〜８５重量％、好ましくは６５重量％〜７５重量％の範囲である。
【００４１】
製剤はまた、製剤中の任意の親水性分子の可溶化を可能とし、さらにその製剤から皮膚への親油性分子の拡散を促進する水系媒体を含むこともできる。水系媒体はまた、ｐＨを調節することができる。水系媒体には、アルカリ化および塩基性緩衝液などがあり、例えばリン酸緩衝液（例えば、リン酸二ナトリウムまたはリン酸一ナトリウム）、クエン酸緩衝液（例えば、クエン酸ナトリウムまたはクエン酸カリウム）および単なる純水がある。水系媒体の量は、好ましくはゲル製剤の１５重量％〜４５重量％、より好ましくは２５重量％〜３５重量％の範囲である。
【００４２】
さらに、４−ヒドロキシタモキシフェン製剤は、製剤の粘度を上昇させるため、および／または、可溶化剤として機能するための１以上のゲル化剤を含むことができる。ゲル化剤の性質に応じて、それは製剤の０．１重量％〜２０重量％、好ましくは０．５重量％〜１０重量％、さらに好ましくは１重量％〜５重量％を構成する。好ましいゲル化剤には、カルボマー類、セルロース誘導体、ポロキサマー類およびポロキサミン類などがある。より詳細には、好ましいゲル化剤は、キトサン、デキストラン、ペクチン類、天然ゴムならびにエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）などのセルロース誘導体である。一つの非常に好ましいゲル化剤は、ヒドロキシプロピルセルロースである。
【００４３】
製剤がゲル化剤、特に非前中和アクリルポリマーを含む場合、有利には、それは中和剤も含む。中和剤／ゲル化剤比は、好ましくは１０：１〜０．１：１、より好ましくは７：１〜０．５：１、さらに好ましくは４：１〜１：１である。中和剤は、ポリマーの存在下、媒体に可溶な塩を形成するものでなければならない。中和剤はまた、電荷の中和およびポリマー塩の形成中にポリマー鎖の最適な膨潤を可能とするものでなければならない。有用な中和剤には、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アルギニン、アミノメチルプロパノールおよびトロメタミンなどがある。当業者であれば、製剤で用いられるゲル化剤の種類に応じて中和剤を選択するであろう。しかしながら、セルロース誘導体をゲル化剤として用いる場合、中和剤は必要ない。
【００４４】
表１に、２つの非常に好ましい４−ヒドロキシタモキシフェンゲル製剤の組成を示す。
【００４５】
【表１】
下記の内容に関して、例示した実施例は本発明についての理解をさらに深める上で役立つものである。
【実施例】
【００４６】
実施例１：経皮４−ヒドロキシタモキシフェン投与の実証
乳癌患者４名に、１２時間〜７日間の所定の間隔で乳房に直接塗布することでアルコール溶液での［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェンを投与してから、患部組織の摘出手術を行った。手術後、摘出組織と腫瘍周囲の正常乳房組織の両方に放射能が含まれていた（Kuttenn et al., 1985）。
【００４７】
追跡調査試験で、ホルモン依存型乳癌の摘出手術の予定があった患者１２名中の９名に、Ｚ−［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェン（８０μＣｉ）の６０％アルコール溶液の投与を行い、患者３名に比較のためＺ−［３Ｈ］−タモキシフェン（８０μＣｉ）の投与を行った。患者には、１２時間〜７日間の所定の間隔で患部乳房に直接塗布することで［３Ｈ］−標識薬剤を投与してから、患部組織の摘出手術を行った。３つの領域からの乳房組織、すなわち腫瘍、その腫瘍を直接囲む組織および正常組織を摘出し、液体窒素で直ちに冷凍した。さらに、血漿および尿のサンプルを予定の間隔で採取し、分析まで冷凍した。
【００４８】
表２に、実施した分析からの結果を示す。４−ヒドロキシタモキシフェンは、エストロゲン受容体が存在する乳房組織のサイトゾル画分および核画分に主に濃縮されていた。これらの細胞内部位では、Ｚ体からＥ体への限定的な異性化があった以外は、４−ヒドロキシタモキシフェンが代謝されずに残っていた。乳房での保持は、４−ヒドロキシタモキシフェン群ではほぼ４日間続いたが、タモキシフェン群ではそれより短く、かなり弱かった。
【００４９】
【表２】
経皮投与後に乳房組織で［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェンとして確認された放射能のパーセントは、７日間かけて徐々に低下した（９７％から６５％）。その期間中、Ｚ異性体からＥ異性体への異性化が徐々に進行し、第７日目で同様のパーセントとなった（３２％と３３％）。
【００５０】
［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェンによる血液中の放射能は徐々に増え、第４日〜第６日では横這い状態であった。それは、血液中に急速に現れ、第２日目で横這い状態となった［３Ｈ］−タモキシフェンとは対照的である。経皮［３Ｈ］−４−ヒドロキシタモキシフェン投与から３６時間後では、投与した放射能の０．５％のみが血液中で示された。
【００５１】
乳房組織では４−ヒドロキシタモキシフェンの代謝はほとんどなかったのとは対照的に、血液中ではそのような代謝が顕著に起こった。投与から２４時間後、血中放射能の６８％が４−ヒドロキシタモキシフェンによるものであり、１８％がＮ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェンによるものであり、１１％がビスフェノールによるものであった。
【００５２】
ピークの尿排出は、４−ヒドロキシタモキシフェンの経皮投与では、経皮タモキシフェンと比較して遅かった。４−ヒドロキシタモキシフェン投与後、ほとんどがＮ−デスメチル−４−ヒドロキシタモキシフェンとビスフェノールである代謝物の漸増が尿中において認められた。
【００５３】
本実施例は、４−ヒドロキシタモキシフェンの乳房への経皮投与により、薬剤の実質的かつ永続的局所組織集中が起こり、代謝はごく少量であり、安定かつ非常に低い血漿濃度であり、尿からの排出が遅いことを示している。
【００５４】
実施例２：２０ｍｇ経口タモキシフェンと比較した経皮投与４−ＯＨ−タモキシフェンの薬物動態および薬力学の実証
この試験では、タモキシフェンの経口投与後の４−ヒドロキシタモキシフェンの組織濃度および血漿濃度と、水性アルコールゲルでの経皮投与後の４−ヒドロキシタモキシフェンの組織濃度および血漿濃度とを比較した（Pujol, 1995）。
乳癌手術の予定がある患者３１名を５群中の１群に無作為に割り当てた。その患者に、表３に示したように経口タモキシフェンまたは経皮４−ヒドロキシタモキシフェンのいずれかの投与を行った。投与は１日１回行い、３〜４週間続けてから手術を行った。この試験では、３つの異なる用量の４−ヒドロキシタモキシフェン（０．５、１または２ｍｇ／日）および２種類の塗布面積（両方の乳房または両腕、両前腕および両肩などの大面積の皮膚表面のいずれか）を評価した。１群の患者には、２０ｍｇ／日（１０ｍｇを１日２回）の経口タモキシフェン（ノルバルデックス（Nolvaldex）；登録商標）の投与を行った。
【００５５】
【表３】
４−ヒドロキシタモキシフェンゲル（４−ヒドロキシタモキシフェン２０ｍｇ／水性アルコールゲル１００ｇ；Besins-International Laboratories）は、加圧計量式ポンプに充填し、それによってゲル１．２５ｇ／計量用量（すなわち４−ヒドロキシタモキシフェン０．２５ｍｇ／用量）を投薬した。
【００５６】
手術中、乳房組織の検体２種類（それぞれ１ｃｍ３）を摘出し、一方は腫瘍組織であり、他方は肉眼観察で正常な組織とした。それらは、液体窒素で直ちに冷凍して、分析評価まで保存した。手術当日および手術前日に採血を行った。全ての組織および血漿検体について、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ−ＭＳ）によって４−ヒドロキシタモキシフェン濃度を分析した。
【００５７】
投与前および投与後の血液検体について、全血球算定（ＣＢＣ）、ビリルビン、血清グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＳＧＰＴ）、血清グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＳＧＯＴ）、アルカリホスファターゼ、クレアチニン、エストラジオール、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）、コレステロール、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、トリグリセリド類、フィブリノゲンおよびアンチトロンビンＩＩＩの分析を行った。
【００５８】
下記の表４に、乳房組織および血漿で認められた４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度をまとめて示す。正常乳房組織および腫瘍乳房組織は、５つの投与群のいずれにおいても同様の濃度の４−ヒドロキシタモキシフェンを含んでいた。４−ヒドロキシタモキシフェンは、ゲルを他の広い皮膚表面よりも乳房に直接塗布した場合に、乳房組織で比較的多量に濃縮されていた。
【００５９】
【表４】
副作用による重大な問題は生じなかった。皮膚投与による局所刺激は起こらなかった。群２（０．５ｍｇ／日の４−ヒドロキシタモキシフェンゲル）の女性１名が、一時的な眩暈、膀胱炎および軽度の膣炎が投与第７日に起こったと報告した。群１（経口タモキシフェン）の女性１名が、投与第５日に一過性熱感および軽度の膣炎を報告した。
【００６０】
４−ヒドロキシタモキシフェンゲルの投与を受けた患者では、血液学的評価および血清化学評価のいずれにおいても投与前血液検体と投与後血液検体の間に差はなかった。しかしながら、アンチトロンビンＩＩＩおよびフィブリノゲンにおける統計的に有意な減少ならびに血小板数およびリンパ球数における統計的に有意な増加が経口タモキシフェン群で認められ、それは他の試験で認められたこの薬剤の生理効果と一致していた。
【００６１】
実施例３：健常女性での経皮投与４−ＯＨ−タモキシフェンの耐容性および薬物動態の実証
この試験は、年齢１８〜４５歳の健常閉経前女性における局所投与４−ヒドロキシタモキシフェンゲルの耐容性および薬物動態を示すものである。各参加者には、２月経周期の期間にわたり、１日１回、ゲルの投与を行った。
【００６２】
表５にまとめたように、３種類の用量および２種類のゲル濃度を調べた。群Ａ〜Ｃでは、４−ヒドロキシタモキシフェン２０ｍｇ／１００ｇを含むゲルを、４−ヒドロキシタモキシフェン０．２５ｍｇ／用量を放出する加圧計量式ポンプから投薬した。片方の乳房に投与するにはゲルの量が多すぎたことから、群Ｃの試験は中断した。群ＤおよびＥには、４−ヒドロキシタモキシフェンをほぼ３倍含む（４−ヒドロキシタモキシフェン５７ｍｇ／ゲル１００ｇまたは４−ヒドロキシタモキシフェン５０ｍｇ／ゲル１００ｍＬ）より濃度の高いゲルを投与した。この濃度のより高いゲルも、４−ヒドロキシタモキシフェン０．２５ｍｇ／用量を供給する計量式ポンプによって投薬した。
【００６３】
【表５】
以下の月経の第１日に、２月経周期にわたる１日１回のゲル投与からなる投与を開始した。第１および第２の周期の第７日、第２０日および第２５日の午前のゲル投与から２４時間後に採血を行った。投与最終日、すなわち第２の月経周期の第２５日に、投与前ならびにゲル投与から０．５、１、１．５、２、３、４、６、１２、１８、２４、３６、４８および７２時間後に順次採血を行った。検体について、４−ヒドロキシタモキシフェン、エストラジオール、プロゲステロン、ＦＳＨおよびＬＨを分析した。
【００６４】
最後のゲル投与から７２時間後でも、４−ヒドロキシタモキシフェンの血漿濃度は検出可能であった。従って、４−ヒドロキシタモキシフェンが血液中で検出できなくなるまでデータポイントを得るようにするため、最後のゲル投与から９２日後まで時々、一部の参加者から追加の採血を行った。
【００６５】
表６に、４−ヒドロキシタモキシフェンの平均±標準偏差（ＳＤ）血漿濃度を示し、括弧内に範囲を示した。単一０．５ｍｇ用量では４−ヒドロキシタモキシフェンの検出可能な血漿濃度は生じなかったが、１ｍｇの単一用量後では患者１２名中６名で血漿濃度は検出可能であった（＞５ｐｇ／ｍＬ）。
【００６６】
【表６】
【００６７】
【表７】
図２に、第２の月経周期の第２５日での最後の投与後における血漿濃度−時間曲線を示す。表７に、第２の月経周期の第２５日での最後の投与に関係する平均薬物動態パラメータを示す。
【００６８】
【表８】
データは、調べた３種類の用量（０．５、１および２ｍｇ）を通じて用量応答と一致している。ＡＵＣおよびＣａｖに基づいて、より濃度の高いゲルの方が、より濃度の低いゲルよりも良好に吸収されており、ほぼ２倍であった。
【００６９】
生物学的耐容性は、患者３６名全員で非常に良好であった。この投与は、月経周期中のＦＳＨ、ＬＨ、エストラジオールおよびプロゲステロンホルモンのレベルに影響を及ぼさなかった。さらに、投与終了後の卵巣の超音波検査は患者全員において正常であり、正常な大きさの発育卵胞を示した。１名の患者がゲルに対するアレルギー反応を発症し、１０名が顔面アクネを報告した（そのうち５名はアクネの既往歴を有していた）。
【００７０】
要約すると、本試験は、局所投与後の４−ヒドロキシタモキシフェンへの曝露が用量に応じて増加し、４−ヒドロキシタモキシフェンの血漿濃度が典型的なエストラジオール濃度（８０ｐｇ／ｍＬ）より低く、全身効果を示す検出可能な臨床検査的および臨床的証拠がないことを示している。
【００７１】
実施例４：経皮投与４−ヒドロキシタモキシフェンが用量に関連した腫瘍組織増殖指数の低下を引き起こすことの実証
本試験は、経皮投与４−ヒドロキシタモキシフェンが用量に関連した乳房腫瘍組織増殖指数の低下を引き起こすことを示すものである。それは、ヒトでの乳癌の生物学的終点に関するタモキシフェンおよび未投与対照と４−ヒドロキシタモキシフェンゲルとの最初の直接比較である。その結果から、乳癌手術を受ける予定になっている閉経後の女性において、２．０ｍｇ／日 ４−ヒドロキシタモキシフェン用量〜２０ｍｇ／日 経口タモキシフェンとほぼ等価な量で、２〜３週間にわたり４−ヒドロキシタモキシフェンゲルを経皮投与することで、腫瘍組織増殖指数（Ｋｉ−６７およびＰＣＮＡ）が用量に依存して低下することがわかる。エストロゲンおよびプロゲステロン受容体レベルは、４−ヒドロキシタモキシフェン治療によって用量に関連した低下を示さなかった。４−ヒドロキシタモキシフェンの血漿レベルは、４−ヒドロキシタモキシフェンゲル群の場合と比較して、経口タモキシフェン群の方が一貫して高く、４−ヒドロキシタモキシフェンの腫瘍組織濃度は、４−ヒドロキシタモキシフェンゲルの用量を多くするに連れて、高くなった。
【００７２】
本試験はまた、タモキシフェンの効果の基礎をなす生物学的プロセスに関する情報を提供するものでもある。２ｍｇ経皮４−ヒドロキシタモキシフェン投与を受けた群は、血漿４−ヒドロキシタモキシフェン濃度が顕著により低かったにも関わらず、経口タモキシフェン群と同等の乳癌細胞増殖に対する細胞増殖抑制効果を示した。この知見は、タモキシフェンの主要な効果に、腫瘍組織におけるエストロゲン受容体が局部的に介在していることを示している。
【００７３】
試験計画
無作為・非盲検・同時平行群のＩＩｂ相試験を計画して、腫瘍増殖のマーカー（Ｋｉ−６７およびＰＣＮＡ）に対する３種類の用量レベルの４−ヒドロキシタモキシフェン、経口タモキシフェンおよび治療（投与）なしの効果を比較した。Ｋｉ−６７抗原はＭＩＢ１抗体によって検出し、ＰＣＮＡ（増殖性細胞核抗原）はＰＣ−１０モノクローナル抗体を用いて検出した。
【００７４】
患者
本試験の参加者は、Ｔｒｕ−ｃｕｔ生検（針生検）によって決定されたエストロゲン受容体陽性侵襲性乳癌と診断された閉経後の女性とした。登録基準は、年齢＞５０歳、組織検査で確認されたＴ１またはＴ２エストロゲン受容体陽性原発性乳癌、および生検の１ヶ月以内の手術適合などとした。以前に放射線療法または化学療法を行ったことがある患者、ならびに現在ホルモン置換療法を行っている患者と同様に、炎症性の癌、既知の転移またはリンパ節関与がある患者は除外した（Ｔｒｕ−ｃｕｔ生検の前に、８日間の最低ウォッシュアウト期間を遵守した）。他の除外基準は、抗凝血剤治療を必要とする血栓性静脈炎の病歴、網膜症、アルコールに対する皮膚アレルギーまたはゲル塗布に禁忌である乳房皮膚炎であった。
【００７５】
患者は、０．５ｍｇ／日４−ＯＨＴ（０．５ｍＬゲル［０．２５ｍｇ４−ＯＨＴ］を各乳房に１日１回塗布）；１．０ｍｇ／日４−ＯＨＴ（１ｍＬゲル［０．５ｍｇ４−ＯＨＴ］を各乳房に１日１回塗布）；２．０ｍｇ／日４−ＯＨＴ（２ｍＬゲル［１．０ｍｇ４−ＯＨＴ］を各乳房に１日１回塗布）；経口タモキシフェン（単回投与として２０ｍｇ／日）または処置なし（未投与対照）という５種類の治療群のいずれかに無作為に割り当てた。患者は、治療開始から１５日後〜２２日後に治療を目的とした腫瘍切除手術を受ける予定とした。手術前日に、４−ＯＨＴ濃度を測定するために、採血も行った。手術当日、患者について、併用療法、併発状態、血液検査、生化学検査、血漿４−ＯＨＴ、エストロン（Ｅ１）およびエストラジオール（Ｅ２）濃度の再評価を行った。
【００７６】
腫瘍サンプリング
診断を目的とした初回診療所来院時に採取したＴｒｕ−ｃｕｔ針／コア生検を、無作為化前の腫瘍サンプルとして用いた。治療後の検体は、最終的な切除手術時に得た。切除直後に、全ての組織サンプルは３．７％ホルマリンで固定し、その後、切片切り分けと続く生物学的マーカーの分析用にパラフィンワックスで包埋した。腫瘍摘出物（治療の前および後）も、後に行うエストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のアッセイならびに４−ＯＨＴレベルのアッセイのために、液体窒素中で保存した。
【００７７】
腫瘍マーカー発現の分析
増殖関連抗原の発現
Ｋｉ６７および増殖性細胞核抗原（ＰＣＮＡ）標識指数（ＬＩ）を、治療前および治療後の組織検体のパラフィン包埋切片について評価した。Ｋｉ６７抗原は、病理学において通常の条件で用いられるモノクローナル抗体ＭＩＢ１（DAKO, デンマーク）を用いて評価した。抗ＰＣＮＡ（DAKO）は、固定化組織における増殖を分析するのに用いられる一連の抗体を完成した。検出は、熱変性させずに行った。サンプリングを標準化するために、症例ごとに６個の連続切片を分析した。解析は、コンピュータ支援システムを用いて行った（Systeme microphotometrique a balayage automatique; Samba-Alcatel, Grenoble,
France）。各組織標本について、基準として分析視野の実際の顕微鏡像を用いて、光学密度（ＯＤ）閾値を測定した。免疫染色の測定は、×２５で行った。各切片について２０の視野を分析した。染色された核表面を測定し（セグメント化および閾値化）、ＬＩの評点を付けた（染色された細胞／対比染色された要素）。ＯＤ免疫染色は、任意の単位で表した。免疫染色定量分析およびその手順の再現性の管理を、同じ組織標本について行った反復測定との比較によって、同じ検体の６個の連続切片について集められた測定値との比較によって行った。免疫染色定量分析における組織変動の評価は、各検体からの不連続切片から取った２０視野のＯＤ免疫染色測定値と比較することによって行った。リンパ節で活発に増殖する細胞（胚中心細胞）によって示されるＰＣＮＡ免疫反応性の強度を、乳房組織における閾値陽性染色の基準として用いた。結果はＬＩとして表した。
【００７８】
エストロゲンおよびプロゲステロン受容体の発現
デキストラン被覆炭末法（Dextran-Coated Charcoal method; Korenman, 1974）を用いるリガンド結合アッセイ（ligand binding assay; ＬＢＡ）および／またはパラフィン包埋切片についての免疫組織化学的（ＩＣＨ）方法によって、治療前および治療後の腫瘍組織で、エストロゲン（ＥＲ）およびプロゲステロン（ＰｇＲ）受容体濃度についての評価分析した。ＥＲ陽性のカットオフ値は、放射免疫検定を用いた測定で１０ｆｍｏｌ／ｍｇ超または免疫酵素分析（Bevitt, 1997）によって標識付された腫瘍細胞の１０％超であった。
【００７９】
４−ＯＨＴアッセイ
血漿、腫瘍組織および正常組織中の４−ＯＨＴ濃度測定は、負イオン化学イオン化モード（ＮＩＣＩ）（Girault, 1993）で用いられる質量分析（ＭＳ）を組み合わせたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）を用いて行った。この方法の定量限界は、それぞれ、血漿サンプルで５ｐｇ／ｍｌ、組織サンプルで５０ｐｇ／ｇであった。手術時（治療後）に得られた腫瘍摘出物および正常乳房組織は、後に行う４−ＯＨＴのアッセイまで液体窒素中で保存した。
【００８０】
統計的解析
対照群の患者１４名および４−ＯＨＴゲルに割り当てられた患者４２名（３つの群）という計画された標本数に基づき、この試験は良好な検出力（９０％）を有しており、５％の第一種過誤を有する両側検定を用いて、未投与群と比較して、４−ＯＨＴ群でＫｉ−６７標識指数において５０％を超える仮説相対低下を検出した。一次効力エンドポイントは腫瘍増殖マーカー発現における変化とした。他の試験変量は二次エンドポイントと考えた。この「プロトコルごと」の解析には、少なくとも１３日間の治療を受け、一次エンドポイントについての治療評価を終了し、重大なプロトコル逸脱や違反がない患者のみを含めた。
【００８１】
治療群の比較は、分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。データの分布が非対称／非正規である場合には、クラスカル・ワリス検定を用いた。カテゴリ変数は、フィッシャーの直接確率検定を用いて解析した。仮説検定は、多重比較用に調節されたα＝０．０５有意差レベルで実施した。推論は、５つの治療群間の差についての検定；４−ＯＨＴの３つの用量レベル間の差の検査；４−ＯＨＴおよび経口タモキシフェンの各用量レベル間の差の検査という、測定された変数についてのカテゴリに分類された。
【００８２】
結果
患者の特徴
この試験には合計５５名の患者が登録された。患者６名は解析から除外した。１名（４−ＯＨＴ １．０ｍｇ／日群）は同意を撤回し、１名（０．５ｍｇ／日）は追跡調査に現れず、１名（２．０ｍｇ／日）は試験開始時にエストロゲン受容体陰性であり、１名（０．５ｍｇ／日）はホルモン置換療法を受けており、２名（０．５ｍｇ／日および１．０ｍｇ／日）はわずか６日後および１２日後に治療を中断した。従って、合計４９名の患者が効力に関して評価可能であった。腫瘍の大きさ、無月経期間および手術時点での腫瘍の悪性度に関して、群間のバランスは良好であった。未治療対照群の患者は、積極的治療群の患者よりも高齢であった（表７）。
【００８３】
【表９】
増殖関連抗原の発現
基準線レベルの調節を行った後、投与後の腫瘍組織Kｉ−６７ＬＩは５つの群間で有意に異なっていた（表８）。投与患者（４−ＯＨＴ［全ての用量］および経口タモキシフェン）では、未投与群と比較して、平均Ｋｉ−６７ＬＩスコアが有意に低かった（Ｐ＝０．００５４）。投与後の平均Ｋｉ−６７ＬＩスコアは、４−ＯＨＴ投与群については用量に依存していた。さらに、４−ＯＨＴ ２．０ｍｇ／日群と経口タモキシフェン群間でほぼ同等の用量−応答関係が表９Ａで示されており、その表は≧１、≧２または≧３の任意の単位でのＫｉ−６７ＬＩの低下があった患者のパーセントを示している（％）。タモキシフェンといずれの用量の４−ＯＨとの間でもＫｉ−６７標識に有意な差はなかった。ＰＣＮＡ ＬＩによって測定された各種投与に対する腫瘍組織応答は、Ｋｉ−６７ ＬＩによって評価されたものと同等であった（表８、９Ｂ）。投与後、４つの投与群についての腫瘍組織ＰＣＮＡ ＬＩは、未投与対照とは有意に異なっていた（Ｐ＝０．００２）。Ｋｉ−６７ＬＩで認められたように、≧１、≧２または≧３の単位のＰＣＮＡ指数の低下があった患者のパーセント（％）は、未投与対照と比較して、特に４−ＯＨＴ １ｍｇ／日群および２ｍｇ／日群の場合に４−ＯＨＴの強力な治療効果を示しており、経口タモキシフェンとほぼ同等であることを示した（表９Ｂ）。タモキシフェンといずれの用量の４−ＯＨＴとの間でもＰＣＮＡ標識に有意な差はなかった。３つの任意の単位のＰＣＮＡ ＬＩまたはＫｉ−６７ＬＩの低下があった腫瘍と定義される応答は、４−ＯＨＴ用量に伴って高くなる傾向を示した。しかしながら、サンプル数は、その関係についての有意差を証明するには十分でなかった。
【００８４】
【表１０】
【００８５】
【表１１】
ＥＲ発現
ＲＩＡを用いると、投与前のＥＲ濃度は群間で統計的に同様であり、平均群値は５〜５６ｆｍｏｌ／ｍｇの範囲であった。個々の値は広い範囲を示した（９〜３２１ｆｍｏｌ／ｍｇ）。ＥＲ陽性腫瘍のタモキシフェンまたは４−ＯＨＴによる治療によって、未投与対照群と比較して、ＥＲ濃度の有意な低下（Ｐ＝０．０１２）が得られた。ＩＣＨを用いると、ＥＲ濃度（標識細胞の％）は、群間にわたって基準線において同じ中央値を示し（７０〜８５％）、全ての群で投与後に統計的に有意な増加の傾向は示されなかった。
【００８６】
ＰｇＲ発現
ＰｇＲのＲＩＡ測定値は基準線で広範囲に及んでおり、全ての群で投与後に増加し、統計的有意差または用量に関連したパターンはなかった。ＩＣＨ測定値を伴うＰｇＲ結果では、一貫した治療効果または用量に関連した変化は全く示されなかった。
【００８７】
４−ＯＨＴ組織濃度および血漿濃度（表１０、図３）
４−ＯＨＴ中央値濃度は、２．０ｍｇ／日４−ＯＨＴ群（１６９８ｐｇ／ｇ）と比較して、経口タモキシフェン群（４２３７ｐｇ／ｇ）ではおおよそ２倍であった。経皮投与量に応じた中央値組織４−ＯＨＴ濃度（ｐｇ／ｇ）（０．５ｍｇ／日、１ｍｇ／日および２ｍｇ／日それぞれについて、６８７ｐｇ／ｇ、１３７７ｐｇ／ｇおよび１６９８ｐｇ／ｇ）の増加にも関わらず、３群間の差は統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．１３）。非腫瘍組織４−ＯＨＴ濃度は、０．５ｍｇ／日群を除く全てで腫瘍組織中の濃度の約半分であった。４−ＯＨＴ中央値血漿濃度については、４投与群間で有意差があり（Ｐ＝０．００１５）、経口タモキシフェン群の方が４−ＯＨＴゲル群より高レベルであった（１４９５ｐｇ／ｍＬと、それぞれ３１ｐｇ／ｍＬ、３５ｐｇ／ｍＬおよび１６４ｐｇ／ｍＬ）。さらに、４−ＯＨＴ経皮投与量を上昇させるに連れて、血漿４−ＯＨＴの有意な増加がある（Ｐ＝０．０３５）。
【００８８】
【表１２】
引用刊行物
【００８９】
【表１３】
【００９０】
【表１４】
【００９１】
【表１５】
【００９２】
【表１６】
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】タモキシフェンの代謝を示す図である。
【図２】皮膚投与後の健常女性における４−ヒドロキシタモキシフェンの平均血漿濃度を示す図である。
【図３Ａ】投与形態および用量に応じた、組織中の４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す図である。パネルＡ（図３Ａ）は、腫瘍組織での４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示している。
【図３Ｂ】投与形態および用量に応じた、組織中の４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示す図である。パネルＢ（図３Ｂ）は、血漿での４−ヒドロキシタモキシフェンの濃度を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌の治療および／または予防のための医薬の製造における４−ヒドロキシタモキシフェンの使用。
【請求項２】
前記医薬が経皮投与に好適な形態のものである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンが浸透促進剤を含む媒体中のものである請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬が、１日当たり約０．２５〜２．０ｍｇ／乳房、好ましくは約０．５〜１．０ｍｇ／乳房の４−ヒドロキシタモキシフェンを患者に投与できるような量の４−ヒドロキシタモキシフェンを含む請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬が、１日当たり約０．２５ｍｇ／乳房、好ましくは約０．５ｍｇ／乳房、より好ましくは約０．７５ｍｇ／乳房、更により好ましくは約１．０ｍｇ／乳房の４−ヒドロキシタモキシフェンを投与できるような量の４−ヒドロキシタモキシフェンを含む請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンがアルコール溶液で製剤されている請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンが水性アルコールゲルで製剤されている請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記水性アルコールゲルがエチルアルコール、ミリスチン酸イソプロピルおよびヒドロキシプロピルセルロースを含む請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記乳癌がエストロゲン受容体陽性である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
４−ヒドロキシタモキシフェンおよび少なくとも１種類の浸透促進剤を含む経皮投与用医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、水性アルコールゲル、水性アルコール溶液、貼付剤、軟膏、クリーム、乳濁液、ローション、散剤またはオイルからなる群から選択される形態のものである請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、浸透促進剤、水系媒体、アルコール系媒体およびゲル化剤を含む水性アルコール組成物である請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物がさらに中和剤を含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記浸透促進剤が少なくとも１種類の脂肪酸エステルを含む請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物が、
ａ）約０．０１重量％〜０．１重量％の４−ヒドロキシタモキシフェン、
ｂ）約０．５重量％〜２重量％のミリスチン酸イソプロピル、
ｃ）約６５重量％〜７５重量％のアルコール、
ｄ）約２５重量％〜３５重量％の水系媒体、
ｅ）約０．５重量％〜５重量％のゲル化剤
を含み；
成分の前記パーセントが、前記組成物の重量に対する重量である請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンが、前記組成物の約０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１０重量％を占める請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ミリスチン酸イソプロピルが、前記組成物の約０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％、１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％、１．６重量％、１．７重量％、１．８重量％、１．９重量％または２．０重量％を占める請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アルコールがエタノールまたはイソプロパノールであり、前記組成物の約６５重量％〜７５重量％を占める請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記水系媒体がリン酸緩衝液であり、前記組成物の約２５重量％〜３５重量％を占める請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記ゲル化剤がポリアクリル酸、ヒドロキシプロピルセルロース、またはその他のセルロース誘導体であり、前記組成物の約０．１重量％〜５重量％を占める請求項１５〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アルギニン、アミノメチルプロパノールおよびトロメタミンからなる群から選択される中和剤をさらに含み、
該中和剤が、ゲル化剤に関しての比で、１０：１〜０．１：１、好ましくは７：１〜０．５：１、さらに好ましくは４：１〜１：１で含まれている請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
単位用量小袋内または計量ポンプ付きの複数用量容器内に入れられている請求項１０〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１】
乳癌の治療および／または予防のための医薬の製造における４−ヒドロキシタモキシフェンの使用。
【請求項２】
前記医薬が経皮投与に好適な形態のものである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンが浸透促進剤を含む媒体中のものである請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬が、１日当たり約０．２５〜２．０ｍｇ／乳房、好ましくは約０．５〜１．０ｍｇ／乳房の４−ヒドロキシタモキシフェンを患者に投与できるような量の４−ヒドロキシタモキシフェンを含む請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記医薬が、１日当たり約０．２５ｍｇ／乳房、好ましくは約０．５ｍｇ／乳房、より好ましくは約０．７５ｍｇ／乳房、更により好ましくは約１．０ｍｇ／乳房の４−ヒドロキシタモキシフェンを投与できるような量の４−ヒドロキシタモキシフェンを含む請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンがアルコール溶液で製剤されている請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンが水性アルコールゲルで製剤されている請求項１〜５のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記水性アルコールゲルがエチルアルコール、ミリスチン酸イソプロピルおよびヒドロキシプロピルセルロースを含む請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記乳癌がエストロゲン受容体陽性である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
４−ヒドロキシタモキシフェンおよび少なくとも１種類の浸透促進剤を含む経皮投与用医薬組成物。
【請求項１１】
前記医薬組成物が、水性アルコールゲル、水性アルコール溶液、貼付剤、軟膏、クリーム、乳濁液、ローション、散剤またはオイルからなる群から選択される形態のものである請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、浸透促進剤、水系媒体、アルコール系媒体およびゲル化剤を含む水性アルコール組成物である請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物がさらに中和剤を含む請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記浸透促進剤が少なくとも１種類の脂肪酸エステルを含む請求項１０〜１３のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記医薬組成物が、
ａ）約０．０１重量％〜０．１重量％の４−ヒドロキシタモキシフェン、
ｂ）約０．５重量％〜２重量％のミリスチン酸イソプロピル、
ｃ）約６５重量％〜７５重量％のアルコール、
ｄ）約２５重量％〜３５重量％の水系媒体、
ｅ）約０．５重量％〜５重量％のゲル化剤
を含み；
成分の前記パーセントが、前記組成物の重量に対する重量である請求項１２〜１４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記４−ヒドロキシタモキシフェンが、前記組成物の約０．０１重量％、０．０２重量％、０．０３重量％、０．０４重量％、０．０５重量％、０．０６重量％、０．０７重量％、０．０８重量％、０．０９重量％または０．１０重量％を占める請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ミリスチン酸イソプロピルが、前記組成物の約０．５重量％、０．６重量％、０．７重量％、０．８重量％、０．９重量％、１．０重量％、１．１重量％、１．２重量％、１．３重量％、１．４重量％、１．５重量％、１．６重量％、１．７重量％、１．８重量％、１．９重量％または２．０重量％を占める請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記アルコールがエタノールまたはイソプロパノールであり、前記組成物の約６５重量％〜７５重量％を占める請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記水系媒体がリン酸緩衝液であり、前記組成物の約２５重量％〜３５重量％を占める請求項１５〜１８のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記ゲル化剤がポリアクリル酸、ヒドロキシプロピルセルロース、またはその他のセルロース誘導体であり、前記組成物の約０．１重量％〜５重量％を占める請求項１５〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アルギニン、アミノメチルプロパノールおよびトロメタミンからなる群から選択される中和剤をさらに含み、
該中和剤が、ゲル化剤に関しての比で、１０：１〜０．１：１、好ましくは７：１〜０．５：１、さらに好ましくは４：１〜１：１で含まれている請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
単位用量小袋内または計量ポンプ付きの複数用量容器内に入れられている請求項１０〜２１のいずれかに記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【公表番号】特表２００６−５１４９６７（Ｐ２００６−５１４９６７Ａ）
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７００４０（Ｐ２００４−５７００４０）
【出願日】平成１５年１２月１５日（２００３．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１５０２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７１２３
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５０５２３３５４９）ラボラトワール ブザン アンテルナスィヨナル (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年５月１８日（２００６．５．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月１５日（２００３．１２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１５０２９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８７１２３
【国際公開日】平成１６年１０月１４日（２００４．１０．１４）
【出願人】（５０５２３３５４９）ラボラトワール ブザン アンテルナスィヨナル (9)
【Ｆターム（参考）】
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