５−／６−ニトロフルオレセインの製造方法
【課題】５−／６−ニトロフルオレセインの製造方法の提供
【解決手段】３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）における反応を溶媒でクエンチして生成物を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿物を単離する工程
（ｄ）存在するあらゆるメタンスルホン酸エステルを加水分解するために、水中で前記沈殿物を加熱する工程
を含む方法。
【解決手段】３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）における反応を溶媒でクエンチして生成物を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿物を単離する工程
（ｄ）存在するあらゆるメタンスルホン酸エステルを加水分解するために、水中で前記沈殿物を加熱する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された５−／６−ニトロフルオレセインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−ニトロフルオレセイン（３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン）は、５−アミノフルオレセイン（５−アミノ−３´，６´−ジヒドロキシ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９´−キサンテン］−３−オン）、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ；３´，６´−ジヒドロキシ−５−イソチオシアナト−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９´−キサンテン］−３−オン）、及びフルオレセインリシコール（コリル−リシルフルオレセイン又はＣＬＦ；Ｎ６−（｛３´，６´−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９´−キサンテン］−５−イル｝チオカルバモイル）−Ｎ２−（３，７，１２−トリヒドロキシ−５−コラン−２４−オイル）−Ｌ−リシン）のような種々の蛍光化合物の合成における鍵中間体である。フルオレセイン５−イソチオシアネートは、タンパク質のための蛍光標識剤としての、タンパク質追跡のための蛍光試薬としての、及び病原体の迅速同定のための蛍光抗体技術における試薬としての使用を含む広範な生物学的な用途を有する。加えて、特に、ヒト又は動物患者の肝機能を決定するための方法において、蛍光胆汁酸誘導体及びＣＬＦの使用が欧州特許第１，００３，４５８号明細書（ノージーン ヨーロピ ビーブイ）に記載されている。
【０００３】
Ａ．Ｈ．クーンズ（Ｃｏｏｎｓ）及びＭ．Ｈ．カプラン（Ｃａｐｌａｎ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５０，９１，１−１３）は、１９５−２００℃で１２ないし１８時間、４−ニトロフタル酸及びレゾルシノールの乾燥混合物の熱縮合により、９８％収率で粗５−／６−ニトロフルオレセインを与える、５−／６−ニトロフルオレセインの合成を記載する。異性体比率又は転換の程度に関して該文献中には何らの示唆も示されていない。しかしながら、これに続くアセチル化及び異性体の分離において、クーンズ及びカプランは、２６％収率の５−ニトロフルオレセインジアセテートを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第１，００３，４５８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５０，９１，１−１３
【発明の概要】
【０００６】
重要なことには、該反応混合物は熱縮合反応の間に固体の塊となり、反応がスケールアップされた場合、生成物の回収が極端に困難になることが分る。クーンズ及びカプランは、１００ｇスケールの反応、即ち、出発物質としての、４−ニトロフタル酸１００ｇ及びレゾルシノール１００ｇを報告し、固化した溶融物は、その中で反応が実施されたビーカーから細断されたことを記載する。しかしながら、反応のスケールが増大された場合、及び、反応が不活性雰囲気下で実施される場合、我々の経験では、回収は、更なる加工に先立って固体生成物を細断することができるようにするため、必然的に反応用器の破壊を必要とする。中間体をキロの量で製造するよう反応がスケールアップされる場合、このことは不経済となる。
【０００７】
更に、重要なことには、我々は、スケールアップにおいて爆発の危険性に起因する深刻な健康及び安全性に対する懸念が存在することに気付いた。我々の研究において、該反応が５０ｇ−１００ｇスケールで行われる場合、制御不能で強烈な発熱反応が起こり得る。
【０００８】
詳細には、先行技術の方法はスケールアップにおいて実行不可能であり、そして、５−／６−ニトロフルオレセインのキロ又は数−キロのバッチを製造するのに安全に使用することができ且つ長引く反応時間や複雑な後処理手順を必要としない方法を提供することに、該産業において長年に亘る要求が存在する。
【０００９】
本発明の主な目的は、３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの高収率の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、比較的短い反応時間ですむ３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる別の目的は、複雑な後処理手順を伴わずに、実質的に純粋な形態で、３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物を製造するような方法を提供することである。用語“実質的に純粋”とは、８５％以上の純度である物質を言及する。本発明の方法から導かれる生成物のための、より好ましい純度は、８９％以上の純度であり、典型的にはそのようにして製造された生成物は、約８９ないし９４％の純度を有する。純度は、ＨＰＬＣやＮＭＲ解析を含む、数多くの従来の分析方法により決定され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は以下の反応スキームにより記載され得る：
【化１】
従って、メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させることを含む、３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、
それは以下の工程：
（ａ）メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）における反応を溶媒でクエンチして生成物を沈殿する工程
（ｃ）沈殿物を単離する工程
（ｄ）存在するあらゆるメタンスルホン酸エステル加水分解するために、水中で前記沈殿物を加熱する工程
を含む方法が提供される。
【００１３】
注目すべきは、４−ニトロフタル酸無水物が、この縮合反応において、出発物質としての４−ニトロフタル酸と交換可能に使用され得ることである。実際、必要であれば、４−ニトロフタル酸と４−ニトロフタル酸無水物との混合物を出発物質として使用することができる。
【００１４】
熱溶融の代わりにメタンスルホン酸中で縮合反応を行うことにより、非常に短い反応時間で、非常に緩和で安全な反応条件が提供される。
【００１５】
縮合反応の間のあらゆる潜在的な発熱は、反応温度を調節することにより、任意には水浴で加熱することにより、制御し得る。
好ましくは、反応は、約６０℃ないし約１２０℃の、より好ましくは約９０℃を超える範囲の温度で行われる。縮合反応を行うための特に好ましい温度範囲は、約９５℃ないし１００℃である。
【００１６】
好ましくは、メタンスルホン酸は実質的に純粋である。より好ましくは、メタンスルホン酸は９５％ｗ／ｗ以上である。特に好ましい態様において、メタンスルホン酸は９８％ｗ／ｗ以上である。
【００１７】
好ましくは、反応環境は、生成物が反応混合物から沈殿するように選択される。従って、反応混合物は、より好ましくは溶媒でクエンチされ、より好ましくはクエンチされて反応混合物から生成物が沈殿する。特に好ましい態様において、使用される溶媒は水性媒体を含む。更に好ましい態様において、反応混合物は水に添加されて生成物が沈殿する。方法の最終工程は、生成物が反応混合物から単離されることを可能にする工程であり、好ましくは濾過である。しかしながら、生成物は、生成物の沈殿後、反応混合物の遠心分離によってもまた得られ得る。
【００１８】
反応をクエンチするために溶媒として水が使用される場合、反応混合物をクエンチするのに先立って、水の温度は、好ましくは０℃ないし１０℃であり、好ましくは、添加工程の間、水相の温度は３０℃以下に維持される。
好ましくは、クエンチにおけるメタンスルホン酸に対する水の比率は、約４．５ｗ／ｗ以下であり、より好ましくは約３ｗ／ｗ以下である。
【００１９】
特に好ましい態様において、生成物中に存在するあらゆるメタンスルホン酸エステルは加水分解される。従って、特に好ましいものは、沈殿した生成物が好ましくは、水中、８０℃ないし１００℃で、より好ましくは攪拌を伴って加熱される場合である。水性の加水分解工程は、好ましくは、残余のメタンスルホン酸エステルの量が、所定のレベルより低くなるまで繰り返される。残余のメタンスルホン酸エステルの量のための、好適な所定のレベルは、約５％以下である。この加水分解工程からの生成物は、濾過又は遠心分離により単離され得る。
好ましくは、単離された生成物は、約６５℃ないし７０℃までの真空中で乾燥される。
【００２０】
縮合反応において、反応物中のメタンスルホン酸の体積は、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物の質量に基づき、好ましくは約２ないし１０ｖ／ｗ、より好ましくは約３ないし５ｖ／ｗである。
【００２１】
所望の混合されたニトロフルオレセイン異性体の形成を達成するために、メタンスルホ
ン酸中の４−ニトロフタル酸及びレゾルシノール（ベンゼン−１，３−ジオール）を含む反応器が、好ましくは９０℃を超えて、より好ましくは９５ないし１００℃で加熱される。温度又は反応時間の維持の不良は、結果として不完全な反応を生じ得る。
【００２２】
合成の間、反応の終点（４−ニトロフタル酸のＨＰＬＣ領域が好ましくは２％領域未満となる時間として決定される）は反応混合物の工程内分析により決定される。この制限は、規格に適合する中間体生成物の獲得において重要である。
【００２３】
好適なＨＰＬＣ条件は、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（登録商標）ＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄ ＲＰ１８ ３．５μｍの粒径を用いる、直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍのカラムを使用することを含む。移動相は、２５分間に亘って、１００％水相と１００％アセトニトリル相の間の混合比で、０．１％ Ｈ3ＰＯ4を含む水及び／又は０．１％ Ｈ3ＰＯ4を含むアセトニトリルであり得る。
【００２４】
反応が完結したら、冷却し、溶媒、例えば水の中へ注ぐことによりクエンチされ得る。得られた個体は濾過されて反応容器に戻され、水が添加されて混合物が、好ましくは９５−１００℃で及び好ましくは少なくとも３０分かけて加水分解される。冷却において固体が、好ましくは濾過又は遠心分離により単離され、反応容器に再充填され、更なる水の部分で、再度、好ましくは９５−１００℃で３０分間加水分解される。加水分解のための最適な温度及び時間の維持の不良は、結果として、いくらかのメタンスルホン酸エステルが存在する、不完全な加水分解となり得る。
【００２５】
反応は再び冷却され、固体が濾過又は遠心分離により単離され、６５−７０℃で真空オーブン中で一定重量になるまで乾燥される。温度の維持の不良は、万が一加熱し過ぎた場合に、生成物の分解を生じる結果となり得る。
【００２６】
詳細には、粗縮合生成物のメタンスルホン酸不純物で出現してくるものは、一方又は両方のフェノール基のメタンスルホン酸エステルの形成に起因することが分った。このエステル化された生成物は実質的に水に不溶性であるものの、あらゆるメタンスルホン酸エステルの完全な加水分解が、冷水クエンチからの沈殿物を水中で加熱又は還流し、必要であればこの水性の加水分解を繰り返すことにより簡単に達成されることが、予想外に及び反−直感的に見出されてきた。水性の加水分解は、熱的縮合工程の後の必要条件である、塩酸を用いる分解を回避するＡ．Ｈ．クーンズ（Ｃｏｏｎｓ）及びＭ．Ｈ．カプラン（Ｋａｐｌａｎ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５０，９１，１−１３）。
【００２７】
メタンスルホン酸が触媒する縮合において製造される５−／６−ニトロフルオレセインの異性体比は、５−ニトロフルオレセイン：６−ニトロフルオレセインで、ほぼ、約６０：４０ないし約７０：３０程度のである。
【００２８】
本発明に従って製造される５−／６−ニトロフルオレセインの混合物は、多くの用途を有する。例えば、上記で言及されるように、以下の反応スキーム１に従って、フルオレセイン５−イソチオシアネートを合成するために使用し得る：
【化２】
試薬：（ｉ）メタンスルホン酸、（ｉｉ）ＡｃＯ2、還流、その後ＡｃＯＨ再結晶、（ｉｉｉ）ＭｅＯＨ、ＮａＯＨ、（ｉｖ）Ｐｄ／Ｃ、シクロヘキセン、メタノール、還流、（ｖ）チオホスゲン、アセトン。
【００２９】
フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びよって５−／６−ニトロフルオレセインは、以下に示されるスキーム２に従って、フルオレセインリシコール（コリル−リシルフルオレセイン（ＣＬＦ）として既知）を合成するために使用し得る。
【化３】
スキーム２：（ｉ）ＮａＯＨ、水、メタノール；（ｉｉ）ＦＩＴＣ、クロロホルム、ジイソプロピルエチルアミン
【実施例】
【００３０】
実施例１
５−／６−ニトロフルオレセインの製造
反応器１
窒素で事前に不活性化した反応器に、メタンスルホン酸（２．４３Ｌ）を充填した。４−ニトロフタル酸（６００ｇ）を添加し、温度を２０−２５℃の間に維持した。続いて１０分間攪拌し、レゾルシノール（ベンゼン−１，３−ジオール）（６５７ｇ）を添加し、反応混合物を慎重に７０℃まで、その後９５−１００℃に加熱した。反応混合物を９５−１００℃で攪拌し、攪拌及び加熱を最低でも２時間続けた。工程内分析のために、反応混合物を２時間毎にサンプリングした。ＨＰＬＣによる２％以下の４−ニトロフタル酸の制限により示される反応の完結に続いて、反応を６０−７０℃に冷却した。
【００３１】
反応器２
第二反応器に、冷たい（０−１０℃）脱イオン水（７．２Ｌ）を充填した。６０−７０℃の反応混合物を冷水に充填し、溶液の温度を３０℃未満に維持した。混合物を最低でも３０分間攪拌し、沈殿した生成物を濾過により単離した。単離された物質を脱イオン水（０．３６Ｌ）で洗浄し、真空下で減圧乾燥した。
【００３２】
湿った生成物を反応器に再充填し、脱イオン水（４．８Ｌ）を添加し、混合物を３０分間攪拌しながら９５−１００℃に加熱した。懸濁液を２０−３０℃に冷却し、固体生成物を濾過により単離し、脱イオン水（０．４８Ｌ）で洗浄し、減圧乾燥した。湿った生成物をプロトンＮＭＲで解析してメタンスルホン酸エステル含有量を決定した。生成物に対して５％未満のメタンスルホン酸エステル含有量が好ましい。加水分解の手順を、エステル
含有量がこの制限内になるまで繰り返した。固体を真空オーブンに移し、一定重量になるまで６５−７０℃で乾燥して、生成物を暗橙色固体として得た。
【００３３】
ｍ．ｐ．＝３４６−３４９℃
1Ｈ（ＤＭＳＯ−Ｄ6）６．５４−６．５８（６Ｈ、ｍ、６−異性体）、６．５８−６．７２（６Ｈ、ｍ、５−異性体）、７．５７（１Ｈ、ｄ、５−異性体）、８．１（１Ｈ、ｄ、６−異性体）、８．２６（１Ｈ、ｄ、６−異性体）、８．５（１Ｈ、ｄｄ、６−異性体）、８．５７（１Ｈ、ｄｄ、５−異性体）、８．６６（１Ｈ、ｄ、５−異性体）、（１Ｈ、ｍ）、４．１５（１Ｈ、ｄ）
ｍ／ｚ＝３７８．１（Ｍ＋１）
【００３４】
上記の実施例において、沈殿した生成物を濾過により反応混合物から単離した。沈殿した生成物の単離はまた、遠心分離によっても達成され得ると理解される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された５−／６−ニトロフルオレセインの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
５−ニトロフルオレセイン（３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン）は、５−アミノフルオレセイン（５−アミノ−３´，６´−ジヒドロキシ−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９´−キサンテン］−３−オン）、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ；３´，６´−ジヒドロキシ−５−イソチオシアナト−３Ｈ−スピロ［イソベンゾフラン−１，９´−キサンテン］−３−オン）、及びフルオレセインリシコール（コリル−リシルフルオレセイン又はＣＬＦ；Ｎ６−（｛３´，６´−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９´−キサンテン］−５−イル｝チオカルバモイル）−Ｎ２−（３，７，１２−トリヒドロキシ−５−コラン−２４−オイル）−Ｌ−リシン）のような種々の蛍光化合物の合成における鍵中間体である。フルオレセイン５−イソチオシアネートは、タンパク質のための蛍光標識剤としての、タンパク質追跡のための蛍光試薬としての、及び病原体の迅速同定のための蛍光抗体技術における試薬としての使用を含む広範な生物学的な用途を有する。加えて、特に、ヒト又は動物患者の肝機能を決定するための方法において、蛍光胆汁酸誘導体及びＣＬＦの使用が欧州特許第１，００３，４５８号明細書（ノージーン ヨーロピ ビーブイ）に記載されている。
【０００３】
Ａ．Ｈ．クーンズ（Ｃｏｏｎｓ）及びＭ．Ｈ．カプラン（Ｃａｐｌａｎ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５０，９１，１−１３）は、１９５−２００℃で１２ないし１８時間、４−ニトロフタル酸及びレゾルシノールの乾燥混合物の熱縮合により、９８％収率で粗５−／６−ニトロフルオレセインを与える、５−／６−ニトロフルオレセインの合成を記載する。異性体比率又は転換の程度に関して該文献中には何らの示唆も示されていない。しかしながら、これに続くアセチル化及び異性体の分離において、クーンズ及びカプランは、２６％収率の５−ニトロフルオレセインジアセテートを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第１，００３，４５８号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５０，９１，１−１３
【発明の概要】
【０００６】
重要なことには、該反応混合物は熱縮合反応の間に固体の塊となり、反応がスケールアップされた場合、生成物の回収が極端に困難になることが分る。クーンズ及びカプランは、１００ｇスケールの反応、即ち、出発物質としての、４−ニトロフタル酸１００ｇ及びレゾルシノール１００ｇを報告し、固化した溶融物は、その中で反応が実施されたビーカーから細断されたことを記載する。しかしながら、反応のスケールが増大された場合、及び、反応が不活性雰囲気下で実施される場合、我々の経験では、回収は、更なる加工に先立って固体生成物を細断することができるようにするため、必然的に反応用器の破壊を必要とする。中間体をキロの量で製造するよう反応がスケールアップされる場合、このことは不経済となる。
【０００７】
更に、重要なことには、我々は、スケールアップにおいて爆発の危険性に起因する深刻な健康及び安全性に対する懸念が存在することに気付いた。我々の研究において、該反応が５０ｇ−１００ｇスケールで行われる場合、制御不能で強烈な発熱反応が起こり得る。
【０００８】
詳細には、先行技術の方法はスケールアップにおいて実行不可能であり、そして、５−／６−ニトロフルオレセインのキロ又は数−キロのバッチを製造するのに安全に使用することができ且つ長引く反応時間や複雑な後処理手順を必要としない方法を提供することに、該産業において長年に亘る要求が存在する。
【０００９】
本発明の主な目的は、３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの高収率の製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、比較的短い反応時間ですむ３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明の更なる別の目的は、複雑な後処理手順を伴わずに、実質的に純粋な形態で、３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物を製造するような方法を提供することである。用語“実質的に純粋”とは、８５％以上の純度である物質を言及する。本発明の方法から導かれる生成物のための、より好ましい純度は、８９％以上の純度であり、典型的にはそのようにして製造された生成物は、約８９ないし９４％の純度を有する。純度は、ＨＰＬＣやＮＭＲ解析を含む、数多くの従来の分析方法により決定され得る。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は以下の反応スキームにより記載され得る：
【化１】
従って、メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させることを含む、３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、
それは以下の工程：
（ａ）メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）における反応を溶媒でクエンチして生成物を沈殿する工程
（ｃ）沈殿物を単離する工程
（ｄ）存在するあらゆるメタンスルホン酸エステル加水分解するために、水中で前記沈殿物を加熱する工程
を含む方法が提供される。
【００１３】
注目すべきは、４−ニトロフタル酸無水物が、この縮合反応において、出発物質としての４−ニトロフタル酸と交換可能に使用され得ることである。実際、必要であれば、４−ニトロフタル酸と４−ニトロフタル酸無水物との混合物を出発物質として使用することができる。
【００１４】
熱溶融の代わりにメタンスルホン酸中で縮合反応を行うことにより、非常に短い反応時間で、非常に緩和で安全な反応条件が提供される。
【００１５】
縮合反応の間のあらゆる潜在的な発熱は、反応温度を調節することにより、任意には水浴で加熱することにより、制御し得る。
好ましくは、反応は、約６０℃ないし約１２０℃の、より好ましくは約９０℃を超える範囲の温度で行われる。縮合反応を行うための特に好ましい温度範囲は、約９５℃ないし１００℃である。
【００１６】
好ましくは、メタンスルホン酸は実質的に純粋である。より好ましくは、メタンスルホン酸は９５％ｗ／ｗ以上である。特に好ましい態様において、メタンスルホン酸は９８％ｗ／ｗ以上である。
【００１７】
好ましくは、反応環境は、生成物が反応混合物から沈殿するように選択される。従って、反応混合物は、より好ましくは溶媒でクエンチされ、より好ましくはクエンチされて反応混合物から生成物が沈殿する。特に好ましい態様において、使用される溶媒は水性媒体を含む。更に好ましい態様において、反応混合物は水に添加されて生成物が沈殿する。方法の最終工程は、生成物が反応混合物から単離されることを可能にする工程であり、好ましくは濾過である。しかしながら、生成物は、生成物の沈殿後、反応混合物の遠心分離によってもまた得られ得る。
【００１８】
反応をクエンチするために溶媒として水が使用される場合、反応混合物をクエンチするのに先立って、水の温度は、好ましくは０℃ないし１０℃であり、好ましくは、添加工程の間、水相の温度は３０℃以下に維持される。
好ましくは、クエンチにおけるメタンスルホン酸に対する水の比率は、約４．５ｗ／ｗ以下であり、より好ましくは約３ｗ／ｗ以下である。
【００１９】
特に好ましい態様において、生成物中に存在するあらゆるメタンスルホン酸エステルは加水分解される。従って、特に好ましいものは、沈殿した生成物が好ましくは、水中、８０℃ないし１００℃で、より好ましくは攪拌を伴って加熱される場合である。水性の加水分解工程は、好ましくは、残余のメタンスルホン酸エステルの量が、所定のレベルより低くなるまで繰り返される。残余のメタンスルホン酸エステルの量のための、好適な所定のレベルは、約５％以下である。この加水分解工程からの生成物は、濾過又は遠心分離により単離され得る。
好ましくは、単離された生成物は、約６５℃ないし７０℃までの真空中で乾燥される。
【００２０】
縮合反応において、反応物中のメタンスルホン酸の体積は、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物の質量に基づき、好ましくは約２ないし１０ｖ／ｗ、より好ましくは約３ないし５ｖ／ｗである。
【００２１】
所望の混合されたニトロフルオレセイン異性体の形成を達成するために、メタンスルホ
ン酸中の４−ニトロフタル酸及びレゾルシノール（ベンゼン−１，３−ジオール）を含む反応器が、好ましくは９０℃を超えて、より好ましくは９５ないし１００℃で加熱される。温度又は反応時間の維持の不良は、結果として不完全な反応を生じ得る。
【００２２】
合成の間、反応の終点（４−ニトロフタル酸のＨＰＬＣ領域が好ましくは２％領域未満となる時間として決定される）は反応混合物の工程内分析により決定される。この制限は、規格に適合する中間体生成物の獲得において重要である。
【００２３】
好適なＨＰＬＣ条件は、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）（登録商標）ＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄ ＲＰ１８ ３．５μｍの粒径を用いる、直径４．６ｍｍ、長さ１００ｍｍのカラムを使用することを含む。移動相は、２５分間に亘って、１００％水相と１００％アセトニトリル相の間の混合比で、０．１％ Ｈ3ＰＯ4を含む水及び／又は０．１％ Ｈ3ＰＯ4を含むアセトニトリルであり得る。
【００２４】
反応が完結したら、冷却し、溶媒、例えば水の中へ注ぐことによりクエンチされ得る。得られた個体は濾過されて反応容器に戻され、水が添加されて混合物が、好ましくは９５−１００℃で及び好ましくは少なくとも３０分かけて加水分解される。冷却において固体が、好ましくは濾過又は遠心分離により単離され、反応容器に再充填され、更なる水の部分で、再度、好ましくは９５−１００℃で３０分間加水分解される。加水分解のための最適な温度及び時間の維持の不良は、結果として、いくらかのメタンスルホン酸エステルが存在する、不完全な加水分解となり得る。
【００２５】
反応は再び冷却され、固体が濾過又は遠心分離により単離され、６５−７０℃で真空オーブン中で一定重量になるまで乾燥される。温度の維持の不良は、万が一加熱し過ぎた場合に、生成物の分解を生じる結果となり得る。
【００２６】
詳細には、粗縮合生成物のメタンスルホン酸不純物で出現してくるものは、一方又は両方のフェノール基のメタンスルホン酸エステルの形成に起因することが分った。このエステル化された生成物は実質的に水に不溶性であるものの、あらゆるメタンスルホン酸エステルの完全な加水分解が、冷水クエンチからの沈殿物を水中で加熱又は還流し、必要であればこの水性の加水分解を繰り返すことにより簡単に達成されることが、予想外に及び反−直感的に見出されてきた。水性の加水分解は、熱的縮合工程の後の必要条件である、塩酸を用いる分解を回避するＡ．Ｈ．クーンズ（Ｃｏｏｎｓ）及びＭ．Ｈ．カプラン（Ｋａｐｌａｎ）（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９５０，９１，１−１３）。
【００２７】
メタンスルホン酸が触媒する縮合において製造される５−／６−ニトロフルオレセインの異性体比は、５−ニトロフルオレセイン：６−ニトロフルオレセインで、ほぼ、約６０：４０ないし約７０：３０程度のである。
【００２８】
本発明に従って製造される５−／６−ニトロフルオレセインの混合物は、多くの用途を有する。例えば、上記で言及されるように、以下の反応スキーム１に従って、フルオレセイン５−イソチオシアネートを合成するために使用し得る：
【化２】
試薬：（ｉ）メタンスルホン酸、（ｉｉ）ＡｃＯ2、還流、その後ＡｃＯＨ再結晶、（ｉｉｉ）ＭｅＯＨ、ＮａＯＨ、（ｉｖ）Ｐｄ／Ｃ、シクロヘキセン、メタノール、還流、（ｖ）チオホスゲン、アセトン。
【００２９】
フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、及びよって５−／６−ニトロフルオレセインは、以下に示されるスキーム２に従って、フルオレセインリシコール（コリル−リシルフルオレセイン（ＣＬＦ）として既知）を合成するために使用し得る。
【化３】
スキーム２：（ｉ）ＮａＯＨ、水、メタノール；（ｉｉ）ＦＩＴＣ、クロロホルム、ジイソプロピルエチルアミン
【実施例】
【００３０】
実施例１
５−／６−ニトロフルオレセインの製造
反応器１
窒素で事前に不活性化した反応器に、メタンスルホン酸（２．４３Ｌ）を充填した。４−ニトロフタル酸（６００ｇ）を添加し、温度を２０−２５℃の間に維持した。続いて１０分間攪拌し、レゾルシノール（ベンゼン−１，３−ジオール）（６５７ｇ）を添加し、反応混合物を慎重に７０℃まで、その後９５−１００℃に加熱した。反応混合物を９５−１００℃で攪拌し、攪拌及び加熱を最低でも２時間続けた。工程内分析のために、反応混合物を２時間毎にサンプリングした。ＨＰＬＣによる２％以下の４−ニトロフタル酸の制限により示される反応の完結に続いて、反応を６０−７０℃に冷却した。
【００３１】
反応器２
第二反応器に、冷たい（０−１０℃）脱イオン水（７．２Ｌ）を充填した。６０−７０℃の反応混合物を冷水に充填し、溶液の温度を３０℃未満に維持した。混合物を最低でも３０分間攪拌し、沈殿した生成物を濾過により単離した。単離された物質を脱イオン水（０．３６Ｌ）で洗浄し、真空下で減圧乾燥した。
【００３２】
湿った生成物を反応器に再充填し、脱イオン水（４．８Ｌ）を添加し、混合物を３０分間攪拌しながら９５−１００℃に加熱した。懸濁液を２０−３０℃に冷却し、固体生成物を濾過により単離し、脱イオン水（０．４８Ｌ）で洗浄し、減圧乾燥した。湿った生成物をプロトンＮＭＲで解析してメタンスルホン酸エステル含有量を決定した。生成物に対して５％未満のメタンスルホン酸エステル含有量が好ましい。加水分解の手順を、エステル
含有量がこの制限内になるまで繰り返した。固体を真空オーブンに移し、一定重量になるまで６５−７０℃で乾燥して、生成物を暗橙色固体として得た。
【００３３】
ｍ．ｐ．＝３４６−３４９℃
1Ｈ（ＤＭＳＯ−Ｄ6）６．５４−６．５８（６Ｈ、ｍ、６−異性体）、６．５８−６．７２（６Ｈ、ｍ、５−異性体）、７．５７（１Ｈ、ｄ、５−異性体）、８．１（１Ｈ、ｄ、６−異性体）、８．２６（１Ｈ、ｄ、６−異性体）、８．５（１Ｈ、ｄｄ、６−異性体）、８．５７（１Ｈ、ｄｄ、５−異性体）、８．６６（１Ｈ、ｄ、５−異性体）、（１Ｈ、ｍ）、４．１５（１Ｈ、ｄ）
ｍ／ｚ＝３７８．１（Ｍ＋１）
【００３４】
上記の実施例において、沈殿した生成物を濾過により反応混合物から単離した。沈殿した生成物の単離はまた、遠心分離によっても達成され得ると理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、
以下の工程：
（ａ）メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）における反応を溶媒でクエンチして生成物を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿物を単離する工程
（ｄ）存在するあらゆるメタンスルホン酸エステルを加水分解するために、水中で前記沈殿物を加熱する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）における前記反応が、約６０℃ないし１２０℃で行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）における前記反応が、約９０℃で行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）における前記反応が、約９５℃ないし１００℃で行われる請求項１ないし３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記メタンスルホン酸が９５％ ｗ／ｗ以上である請求項１ないし４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記メタンスルホン酸が９８％ ｗ／ｗ以上である請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）における前記反応が、前記反応を前記溶媒に添加することによりクエンチされる請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における前記反応が、生成物を沈殿させるために水でクエンチされる請求項７記載の方法。
【請求項９】
メタンスルホン酸に対する水の比率が、約４．５ｗ／ｗ以下である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
メタンスルホン酸に対する水の比率が、約３ｗ／ｗ以下である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記反応がクエンチされる前の前記水の温度が、０℃ないし１０℃である請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記水の温度が、前記反応がクエンチされる期間、３０℃以下に維持される請求項９ないし１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）における沈殿させた生成物が、濾過により単離される請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）における沈殿させた生成物が、遠心分離により単離される請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）における前記沈殿物が、約８０℃ないし１００℃で水中で加熱される請求項１ないし１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）における前記沈殿物が、攪拌と共に加熱される請求項１ないし１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）からの前記沈殿物が単離され且つ水中で前記沈殿物を加熱する工程が繰り返される請求項１ないし１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
水中で前記沈殿物を加熱する前記工程が、存在するメタンスルホン酸エステルが約５％以下しかないレベルになるまで繰り返される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）からの前記生成物が、真空中で乾燥される請求項１ないし１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生成物が、室温と７０℃の間で乾燥される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）における４−ニトロフタル酸／４−ニトロフタル酸無水物に対するメタンスルホン酸の比率が、約２ないし１０ｖ／ｗである請求項１ないし２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記４−ニトロフタル酸／４−ニトロフタル酸無水物に対するメタンスルホン酸の比率が、約３ないし５ｖ／ｗである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、実質的に、ここに記載されるような方法。
【請求項１】
３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、
以下の工程：
（ａ）メタンスルホン酸中、４−ニトロフタル酸又は４−ニトロフタル酸無水物とベンゼン−１，３−ジオールを反応させる工程
（ｂ）工程（ａ）における反応を溶媒でクエンチして生成物を沈殿させる工程
（ｃ）沈殿物を単離する工程
（ｄ）存在するあらゆるメタンスルホン酸エステルを加水分解するために、水中で前記沈殿物を加熱する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程（ａ）における前記反応が、約６０℃ないし１２０℃で行われる請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程（ａ）における前記反応が、約９０℃で行われる請求項２記載の方法。
【請求項４】
工程（ａ）における前記反応が、約９５℃ないし１００℃で行われる請求項１ないし３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記メタンスルホン酸が９５％ ｗ／ｗ以上である請求項１ないし４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記メタンスルホン酸が９８％ ｗ／ｗ以上である請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程（ａ）における前記反応が、前記反応を前記溶媒に添加することによりクエンチされる請求項１ないし６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）における前記反応が、生成物を沈殿させるために水でクエンチされる請求項７記載の方法。
【請求項９】
メタンスルホン酸に対する水の比率が、約４．５ｗ／ｗ以下である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
メタンスルホン酸に対する水の比率が、約３ｗ／ｗ以下である請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記反応がクエンチされる前の前記水の温度が、０℃ないし１０℃である請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記水の温度が、前記反応がクエンチされる期間、３０℃以下に維持される請求項９ないし１１の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）における沈殿させた生成物が、濾過により単離される請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｃ）における沈殿させた生成物が、遠心分離により単離される請求項１ないし１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）における前記沈殿物が、約８０℃ないし１００℃で水中で加熱される請求項１ないし１４の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｄ）における前記沈殿物が、攪拌と共に加熱される請求項１ないし１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｄ）からの前記沈殿物が単離され且つ水中で前記沈殿物を加熱する工程が繰り返される請求項１ないし１６の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
水中で前記沈殿物を加熱する前記工程が、存在するメタンスルホン酸エステルが約５％以下しかないレベルになるまで繰り返される請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｄ）からの前記生成物が、真空中で乾燥される請求項１ないし１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記生成物が、室温と７０℃の間で乾燥される請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
工程（ａ）における４−ニトロフタル酸／４−ニトロフタル酸無水物に対するメタンスルホン酸の比率が、約２ないし１０ｖ／ｗである請求項１ないし２０の何れか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記４−ニトロフタル酸／４−ニトロフタル酸無水物に対するメタンスルホン酸の比率が、約３ないし５ｖ／ｗである請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
３´，６´−ジヒドロキシ−６−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オン及び３´，６´−ジヒドロキシ−５−ニトロスピロ［２−ベンゾフラン−３，９´−キサンテン］−１−オンの混合物の製造方法であって、実質的に、ここに記載されるような方法。
【公表番号】特表２０１２−５１７４６４（Ｐ２０１２−５１７４６４Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４９６６８（Ｐ２０１１−５４９６６８）
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０２０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９２３８２
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（５０９２８６３０７）ノージーン ビーブイ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１０日（２０１０．２．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２０１０／０５０２０６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９２３８２
【国際公開日】平成２２年８月１９日（２０１０．８．１９）
【出願人】（５０９２８６３０７）ノージーン ビーブイ (4)
【Ｆターム（参考）】
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