Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチド
【課題】 ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプを有する患者に適用することができる，ＨＣＶ関連疾患の治療法を提供すること。
【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下のいずれかのアミノ酸配列：IVGGVYLLPR（配列番号１），YLLPRRGPR（配列番号２），YLLPRRGPRL（配列番号３）またはLIRACMLVR（配列番号４）を有するペプチドが開示される。これらのペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物，ならびにＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物も提供される。
【解決手段】 Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下のいずれかのアミノ酸配列：IVGGVYLLPR（配列番号１），YLLPRRGPR（配列番号２），YLLPRRGPRL（配列番号３）またはLIRACMLVR（配列番号４）を有するペプチドが開示される。これらのペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物，ならびにＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣ型肝炎ウイルス関連疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，ＨＣＶ感染者は世界では約１．７−２億人，本邦では約１５０−２００万人以上いるといわれている。その多くは慢性肝炎を発症し，さらに病状が進行すると肝硬変そして肝細胞癌へ移行する。慢性肝炎から年率１〜２％，肝硬変からは年率６―８％に肝細胞癌が発症する。本邦での肝細胞癌発症患者のうち約７０％がＨＣＶ１ｂに感染している。ＨＣＶ１ｂ感染に起因する肝硬変と肝癌での年間死亡者数は４万人近くに及ぶ。
【０００３】
現在，Ｃ型肝炎ウイルス慢性感染患者に対しては，インターフェロン（ＩＦＮ）療法が広く行われており，全体では約３０％の完全著効が得られている（Kasahara et al., Hepatology 27, 1394-1402, 1998：非特許文献１）。しかし本邦で多いとされるウイルスのタイプ（ＨＣＶ１ｂ型）はこれらの現行治療法に抵抗性であり奏効率は約５０−６０％である。とりわけ高ウイルス血症状態（血中ＲＮＡ値が５００ＫＩＵ／ｍｌ以上）の慢性肝炎症例への奏効率は３０％以下である。また，ＩＦＮ治療の適応外の症例やＩＦＮの有害事象により治療完了できない症例も多数存在する。インターフェロンとリバビリンの併用は，ウイルス量が多い症例でもある程度効果が認められているが，その奏功率は２０％程度である（非特許文献２）。
【０００４】
本発明者らは，先に，ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen: ＨＬＡ）の型であるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるいくつかのペプチドと反応性を有するＩｇＧが，ＨＣＶ感染患者の大多数に検出されること，さらにこれらのペプチドが対応するＨＬＡ型を有するＨＣＶ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを見出した。これらの結果に基づいて，ＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ２を有する患者で標準治療（ＩＦＮ療法もしくはリバビリン併用療法）が無効な症例に対し，ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドを投与したところ，ペプチドによる免疫賦活作用は大多数の症例にて，またウイルス量の低下は半数以上の症例で認められた（WO2005/028503：特許文献１）。しかし，ＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４陽性者を対象とする抗原ペプチドは，日本人患者の７割しかカバーできない。
【０００５】
ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３，ならびにＨＬＡ−Ａ０３０１およびＨＬＡ−Ａ６８０１は，類似する抗原結合モチーフを共有しており，したがって，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプとして分類される（Takedatsu H, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120：非特許文献２）。このスーパータイプは，ヒト集団の中で比較的優勢であり，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプの表現型の頻度は，ＨＬＡ−Ａ６８０１を除き，白色人種，北アメリカのアフリカ系黒人，日本人，中国人，ヒスパニックの間でそれぞれ約３０％，約３５％，約４４％，約５２％，および約３５％である（Sette, A., and Sidney, J., Immunogenetics, 50: 201-212, 1999：非特許文献３）。これまでに，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性抗原ペプチドに関する報告はない。
【０００６】
【特許文献１】WO2005/028503
【非特許文献１】Kasahara et al., Hepatology 27, 1394-1402, 1998
【非特許文献２】Takedatsu H, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120
【非特許文献３】Sette, A., and Sidney, J., Immunogenetics, 50: 201-212, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプの患者に適用することができる，ＨＣＶ関連疾患の治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は，Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを提供する：
コア30-39：IVGGVYLLPR（配列番号１）
コア35-43：YLLPRRGPR（配列番号２）
コア35-44：YLLPRRGPRL（配列番号３）
NS2 918-926：LIRACMLVR（配列番号４）。
【０００９】
好ましくは，本発明のペプチドは，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明のペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物を提供する。好ましくは、患者ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する。本発明はまた，上述の本発明のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物を提供する。
【００１１】
本明細書において用いる場合，「ＨＣＶ関連疾患」とは，Ｃ型肝炎ウイルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。ＨＣＶ関連疾患の進行は，典型的には，慢性肝炎から肝硬変への進行，さらに肝硬変から肝癌への進行である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は，ＨＣＶに感染したＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者の治療に用いることができる免疫原性ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドを提供する。以下の実施例に示されるように，本発明においては，ＨＣＶ１ｂ関連疾患を有するＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３を有する患者におけるＣＴＬの認識する抗原ペプチド（ＣＴＬエピトープ）を調べた結果，ＨＣＶ−１ｂに広く保存されており，かつＨＬＡ−Ａ１１，Ａ３１，またはＡ３３に結合するモチーフを有するペプチド４８種の中より，４種の新規候補ペプチドが同定された。３０−３９番に位置するコアータンパク由来ペプチド（IVGGVYLLPR（配列番号１））はＨＬＡ−Ａ１１，Ａ３１，およびＡ３３陽性患者末梢血単核球（ＰＢＭＣ）よりペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。一方，コアータンパク由来の３５−４３ペプチド（YLLPRRGPR（配列番号２））および３５−４４ペプチド（YLLPRRGPRL（配列番号３））はＨＬＡ−Ａ３１およびＡ３３陽性患者ＰＢＭＣから，非構造タンパクＮＳ−２由来の９１８−９２６ペプチド（LIRACMLVR（配列番号４））はＨＬＡ−Ａ１１およびＡ３３陽性患者ＰＢＭＣよりペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。これらのペプチドに反応性のＩｇＧ抗体がＨＣＶ−１ｂ感染患者血漿中から検出された。
【００１３】
本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド（ＨＣＶペプチド）は，Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，かつ，患者のＨＬＡと適合するＨＬＡ結合モチーフを配列中に含む。このペプチドは，Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されることができる。
【００１４】
好ましくは，本発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＣＴＬを誘導することができ，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。
【００１５】
本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付加的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原ペプチドとして所望の作用効果を奏するためには，そのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがって，例えば，本発明にかかるペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されていてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されていてもよい。
【００１６】
本発明に係るＨＣＶペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。
【００１７】
目的とするペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。
【００１８】
一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローニングした目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。
【００１９】
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。
【００２０】
本発明のペプチドは，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物，すなわちペプチドワクチンとして有用である。Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および／または担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。
【００２１】
ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，ペプチド量として０．１−１０ｍｇが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ヶ月に１回投与することが好ましい。また，ペプチドワクチンとインターフェロンとを併用してもよい。
【００２２】
好ましい態様においては，投与されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくはＣＴＬの存在に基づいて選択される。更に好ましくは抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性とＣＴＬの両方の存在に基づいて選択される。ここで，「抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドのいずれかが，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体により認識されることをいう。それぞれの患者における抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性を検査して，各人に適するペプチドのみを投与する，いわゆるテーラーメイド型の投与により，より高い治療効果を期待することができる。癌ペプチドワクチン臨床試験における経験により，テーラーメイド型投与により二次免疫の賦活が速やかに誘導されるため，より安全により良い臨床効果が発現することが立証されている（Mine et al., Clin. Can. Res. 929-937,2004）。
【００２３】
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を，ＥＬＩＳＡ等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また，ＨＣＶ ＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ等の慣用の方法により測定することにより，ウイルス量をモニターすることができる。
【００２４】
本発明のペプチドはまた，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を診断し，あるいは疾患の進行を予測するための組成物としても有用である。本発明のペプチドを用いて，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，被験者の血液中の抗体価を測定することができる。例えば，典型的なＥＬＩＳＡ法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを９６ウェルなどの慣用のＥＬＩＳＡプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に被験者の血液から調製した血清を適宜希釈してプレートの各ウェルに加えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体（例えばウサギ抗ヒト抗体）を加える。ＩｇＧを検出することが望まれる場合には，γ鎖特異的抗ヒトＩｇＧを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し，検出可能なように標識した抗体（例えば抗ウサギＩｇＧ）を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，被験者の血清における特定のペプチドに対する抗体の量を測定することができる。さらに，抗体の量をモニターすることにより，ＨＣＶ関連疾患の進行の予測を行うことができる。
【００２５】
このような抗原抗体反応により抗体を検出する方法のうち，感度の高い方法の１つとしてｘＭＡＰ技術がある。これは，Luminex社が開発した蛍光マイクロビーズアレイシステムによるフローメトリー測定法であり，ペプチドを結合させたマイクロビーズと血清とを接触させ，次に，蛍光標識二次抗体を結合させて，フローメトリーにより蛍光強度を測定する。
【００２６】
また，病院の検査室などで抗体価を測定する場合には，免疫クロマト法を用いることができる。この方法は，試験紙上に抗原（または抗体）を線状に分布させた部分を作っておき，検体中の抗体と着色粒子で標識された抗原との複合体が試験紙上を移動する際に，抗原（または抗体）に集中的に捕捉されることで現れる色付きのラインの有無によって定性分析を行う方法である。この方法を用いれば，簡便な設備で短時間（２０〜３０分以内）に結果を得ることができる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。
【００２８】
被験者
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプを有するＨＣＶ１ｂ感染患者および健康なドナーを被験者とした。これらの被験者は，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３のいずれかのＨＬＡタイプを有しており，いずれもＨＩＶには感染していなかった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためには，２０ｍｌの末梢血を採取し，フィコール−コンレー密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを調製した。すべてのサンプルは実験に用いるまで低温保存した。ＨＣＶ１ｂ患者のＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の発現は，以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した：抗ＨＬＡ−Ａ１１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｃａｔ＃０２８４ＨＡ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ．，Ｃａｎｏｇａ，ＣＡ），抗ＨＬＡ−Ａ３１ｍＡｂ（Ｃａｔ＃０２７３ＨＡ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ），および抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂ（Ｃａｔ＃０６１２ＨＡ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）。
【００２９】
細胞株
使用した細胞株，Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，およびＣ１Ｒ−Ａ３３は，それぞれＨＬＡ−Ａ１１０１，ＨＬＡ−Ａ３１０１，およびＨＬＡ−Ａ３３０３遺伝子で恒常的にトランスフェクトされたＣ１Ｒリンパ腫のサブラインである。これらのサブラインにおけるＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の発現は先に報告されている（Takedatsu H, et al., Clinical Cancer Research 2004; 10: 1112-20）。すべての細胞株は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。
【００３０】
ペプチド
ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の結合モチーフ（Parker KC et al., J Immunol 1994; 152: 163-75）に基づいて，４７種類のＨＣＶ−１ｂ蛋白質由来ペプチドを用意した。すべてのペプチドはＢｉｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏ．（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）より購入し，９０％以上の純度であった。ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに結合する対照ペプチドとして，インフルエンザ（Ｆｌｕ）ウイルス由来ペプチド（ＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫ（配列番号５）），エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号６）），チロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ２）由来ペプチド（ＬＬＧＰＧＲＰＹＲ（配列番号７）），およびＨＩＶ由来ペプチド（ＲＬＲＤＬＬＬＩＶＴＲ（配列番号８））を用いた。すべてのペプチドはジメチルスルホキシドで溶解後，10μｇ／ｍｌに希釈して用いた。
【００３１】
統計学
統計学的分析は，スチューデントｔ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
【００３２】
ペプチド特異的ＩｇＧの検出
最初に，ＨＣＶ−１ｂに感染した１２名の患者の血清の１：１００希釈サンプルを用いて，４８種のペプチドのそれぞれに対して反応性のペプチド特異的ＩｇＧのレベルを測定した。ペプチド特異的ＩｇＧの血漿レベルは，先に記載された方法にしたがってルミネックス（登録商標）法により測定した（Komatsu N. et al., Scand J Clin Lab Invest, 64, 535-546, (2004)）。簡単には，２００μＬの血漿（１：１００希釈）を２５μＬのペプチド結合カラーコードビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））とともに９６ウエルフィルタープレート（ＭＡＢＶＮ１２５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中で，プレート振盪器で室温にて２時間インキュベートした。２時間後，プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳで洗浄し，１００μＬのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧとともにプレート振盪器で室温にて１時間インキュベートした。次に，プレートを洗浄し，１００μＬのストレプトアビジン−ＰＥ（５μｇ／ｍｌ）をウエルに加え，プレート振盪器で室温にて３０分間インキュベートした。蛍光強度（ＦＩ）をルミネックス（登録商標）により測定し，ペプチド特異的抗体のレベルを求めた。１５名の健康なドナーの血漿を負対照として用いた。カットオフＦＩ値は，健康なドナーのＦＩ値の平均＋２ＳＤより高い値として決定した。
【００３３】
その結果，ＨＣＶコア３０−３９，３５−４３，３５−４４，およびＨＣＶＮＳ２９１８−９２６ペプチドに対して反応性のＩｇＧが，１２名の患者中それぞれ７，７，７，および９名の血漿において検出された。これに対し，これらの各ペプチドは，１５名の健康なドナーのいずれからの血漿にも反応性ではなかった。患者における，ＨＣＶコア３０−３９，ＨＣＶコア３５−４３，３５−４４，およびＨＣＶＮＳ２９１６−９２６ペプチドに対して反応性である平均ＩｇＧのレベルは，それぞれ健康なドナーに比べて統計学的に有意に高かった（図１）。
【００３４】
ＨＣＶ１ｂ感染患者のＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導
ＨＣＶ１ｂ感染患者血中のＩｇＧにより高頻度に認識された上述の４種類のペプチドがＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，もしくはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ−１ｂ患者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＰＢＭＣをインビトロでＨＣＶ由来ペプチドまたは対照ペプチドで刺激・培養し，対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する反応性をＩＦＮ−γ産生を指標として調べた。
【００３５】
ペプチド特異的ＣＴＬを検出するためのアッセイは，先に報告されている方法にしたがい，若干の改変を加えた（Hida N et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 219-28）。簡単には，ＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウエル）をＵ底９６ウエルマイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で２００μｌの培養液中で，１０μｌ／ｍｌの各ペプチドとともにインキュベートした。実験は４重に行った。培養液は，４５％ＲＰＭＩ１６４０，４５％ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２），および０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなるものであった。３日ごとに，培養液の半分を除去し，対応するペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地に置き換えた。培養第１５日に，培養細胞の半分を，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で刺激し，残りの半分の細胞はＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞とともに培養した。１８時間のインキュベートの後，上清を回収し，ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γのレベルを測定した。
【００３６】
対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答して，対照群のＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞と比較してＰ値が０．０５より低い場合に，かつ５０ｐｇ／ｍｌより多いＩＦＮ−γが産生された場合に，ペプチド特異的ＣＴＬの誘導が成功したと判定した。その結果，ＨＣＶペプチド（コア蛋白質の３０−３９，３５−４３，および非構造蛋白質２の９１８−９２６）では，それぞれ，ＨＬＡ−Ａ１１陽性ＨＣＶ１ｂ患者の３／７，０／７，および２／７，ＨＬＡ−Ａ３１陽性ＨＣＶ１ｂ患者の１／４，０／４，および０／４，ＨＬＡ−Ａ３３陽性ＨＣＶ−１ｂ患者の３／５，３／５，および３／５のＰＢＭＣから，対応するペプチドに反応性のＣＴＬが誘導された（図２）。
【００３７】
ＨＣＶコア３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導しうることは既に知られている（Takao Y et al., Microbiol. Immunol., 48(7), 507-517, 2004）。上述の結果は，ＨＣＶコア３５−４３ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＨＣＶ１ｂ患者からもＣＴＬを誘導しうることを示す。
【００３８】
次に，ＨＣＶコア３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＨＣＶ１ｂ患者のＰＢＭＣを，インビトロでＨＣＶコア３５−４３および３５−４４ペプチドまたは対照ペプチドで刺激して，対応するペプチドをパルスしたＴ２（ＨＬＡ−Ａ２を有する），Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，Ｃ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答したＩＦＮ−γ産生について調べた。その結果，コア蛋白質３５−４４のペプチドは，ＨＬＡ−Ａ１１陽性ＨＣＶ１ｂ患者（０／７），ＨＬＡ−Ａ３１陽性ＨＣＶ１ｂ患者（１／２），およびＨＬＡ−Ａ３３陽性ＨＣＶ−１ｂ患者（１／２）のＰＢＭＣからペプチド反応性ＣＴＬを誘導した（図２）。陽性対照として，ＨＣＶコア３５−４３またはコア３５−４４ペプチドは，それぞれＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ−１ｂ患者３名中０名または３名中２名においてペプチド特異的ＣＴＬを誘導した（データ示さず）。
【００３９】
これらの知見は，ＨＣＶコア３０−３９，３５−４３，コア３５−４４，およびＨＣＶＮＳ２９１８−９２６ペプチドがＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ−１ｂ患者のＰＢＭＣにおいてペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを示す。
【００４０】
ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性
ペプチドで刺激したＰＢＭＣを，標準的な６時間の51Ｃｒ−放出アッセイにより，対応するペプチドまたはＨＩＶペプチドのいずれかで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，およびＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する細胞傷害活性について調べた。ウエルあたり２０００個の51Ｃｒ標識細胞をエフェクター細胞とともに，所定のエフェクター／標的細胞比で９６丸底ウエルプレートで培養した。特異的51Ｃｒ−放出は，以下の式にしたがって計算した：（試験群ｃ．ｐ．ｍ．−自然放出ｃ．ｐ．ｍ．）。自然放出はエフェクター細胞なしでインキュベートした標的細胞の上清により決定した。総放出は，１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）とともにインキュベートした標的細胞の上清により決定した。いくつかの実験においては，培養の最初に，１０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２：マウスＩｇＧ２ａ），抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３：マウスＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ４（ＮＵ−ＴＨ／Ｉ：マウスＩｇＧ１），抗ＣＤ８（ＮＵ−ＴＳ／Ｃ：マウスＩｇＧ２ａ），または抗ＣＤ１４（Ｈ１４：マウスＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体をウエルに加えた。
【００４１】
ＨＣＶペプチドで刺激・培養したＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＰＢＭＣは，対応するペプチドを予め負荷したＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対して細胞傷害活性を示すことができたが，ＨＩＶペプチドについては示さなかった（図３）。
【００４２】
さらに，各ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する細胞傷害活性は，ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２）またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により阻害されるが，試験したＨＬＡ−クラスＩＩ（ＤＲ−１）またはＣＤ４またはＣＤ１４ｍＡｂでは阻害されなかった。このことは，ペプチド特異的細胞傷害活性は主としてＣＤ８+Ｔ細胞によりＨＬＡ−クラスＩ拘束性に発現することを示す（図４）。
【００４３】
以上の結果より，これら４種のペプチドはＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，またはＨＬＡ−Ａ３３陽性のＨＣＶ−１ｂ関連疾患患者に対するペプチド免疫療法に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のペプチドはＨＣＶ関連疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は，ＨＣＶ感染患者におけるペプチド特異的ＩｇＧの検出を示す。
【図２】図２は，ＨＣＶ１ｂ患者のＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導を示す。
【図３】図３は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。
【図４】図４は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明はＣ型肝炎ウイルス関連疾患の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は，フラビウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり，ＨＣＶ感染者は世界では約１．７−２億人，本邦では約１５０−２００万人以上いるといわれている。その多くは慢性肝炎を発症し，さらに病状が進行すると肝硬変そして肝細胞癌へ移行する。慢性肝炎から年率１〜２％，肝硬変からは年率６―８％に肝細胞癌が発症する。本邦での肝細胞癌発症患者のうち約７０％がＨＣＶ１ｂに感染している。ＨＣＶ１ｂ感染に起因する肝硬変と肝癌での年間死亡者数は４万人近くに及ぶ。
【０００３】
現在，Ｃ型肝炎ウイルス慢性感染患者に対しては，インターフェロン（ＩＦＮ）療法が広く行われており，全体では約３０％の完全著効が得られている（Kasahara et al., Hepatology 27, 1394-1402, 1998：非特許文献１）。しかし本邦で多いとされるウイルスのタイプ（ＨＣＶ１ｂ型）はこれらの現行治療法に抵抗性であり奏効率は約５０−６０％である。とりわけ高ウイルス血症状態（血中ＲＮＡ値が５００ＫＩＵ／ｍｌ以上）の慢性肝炎症例への奏効率は３０％以下である。また，ＩＦＮ治療の適応外の症例やＩＦＮの有害事象により治療完了できない症例も多数存在する。インターフェロンとリバビリンの併用は，ウイルス量が多い症例でもある程度効果が認められているが，その奏功率は２０％程度である（非特許文献２）。
【０００４】
本発明者らは，先に，ヒト白血球抗原（Human Leukocyte Antigen: ＨＬＡ）の型であるＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ２４拘束性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識されるいくつかのペプチドと反応性を有するＩｇＧが，ＨＣＶ感染患者の大多数に検出されること，さらにこれらのペプチドが対応するＨＬＡ型を有するＨＣＶ患者の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）からペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを見出した。これらの結果に基づいて，ＨＬＡ−Ａ２４もしくはＨＬＡ−Ａ２を有する患者で標準治療（ＩＦＮ療法もしくはリバビリン併用療法）が無効な症例に対し，ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドを投与したところ，ペプチドによる免疫賦活作用は大多数の症例にて，またウイルス量の低下は半数以上の症例で認められた（WO2005/028503：特許文献１）。しかし，ＨＬＡ−Ａ２およびＡ２４陽性者を対象とする抗原ペプチドは，日本人患者の７割しかカバーできない。
【０００５】
ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１およびＨＬＡ−Ａ３３，ならびにＨＬＡ−Ａ０３０１およびＨＬＡ−Ａ６８０１は，類似する抗原結合モチーフを共有しており，したがって，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプとして分類される（Takedatsu H, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120：非特許文献２）。このスーパータイプは，ヒト集団の中で比較的優勢であり，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプの表現型の頻度は，ＨＬＡ−Ａ６８０１を除き，白色人種，北アメリカのアフリカ系黒人，日本人，中国人，ヒスパニックの間でそれぞれ約３０％，約３５％，約４４％，約５２％，および約３５％である（Sette, A., and Sidney, J., Immunogenetics, 50: 201-212, 1999：非特許文献３）。これまでに，ＨＣＶ由来のＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性抗原ペプチドに関する報告はない。
【０００６】
【特許文献１】WO2005/028503
【非特許文献１】Kasahara et al., Hepatology 27, 1394-1402, 1998
【非特許文献２】Takedatsu H, et al., Clin Cancer Res 2004; 10: 1112-1120
【非特許文献３】Sette, A., and Sidney, J., Immunogenetics, 50: 201-212, 1999
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は，ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプの患者に適用することができる，ＨＣＶ関連疾患の治療法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は，Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，以下のいずれかのアミノ酸配列を有するペプチドを提供する：
コア30-39：IVGGVYLLPR（配列番号１）
コア35-43：YLLPRRGPR（配列番号２）
コア35-44：YLLPRRGPRL（配列番号３）
NS2 918-926：LIRACMLVR（配列番号４）。
【０００９】
好ましくは，本発明のペプチドは，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導することができる。
【００１０】
別の観点においては，本発明は，上述の本発明のペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物を提供する。好ましくは、患者ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する。本発明はまた，上述の本発明のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物を提供する。
【００１１】
本明細書において用いる場合，「ＨＣＶ関連疾患」とは，Ｃ型肝炎ウイルスの感染によって引き起こされる疾患を意味し，例えば，急性および慢性の肝炎，肝硬変，および肝細胞癌が含まれる。ＨＣＶ関連疾患の進行は，典型的には，慢性肝炎から肝硬変への進行，さらに肝硬変から肝癌への進行である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は，ＨＣＶに感染したＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者の治療に用いることができる免疫原性ＨＣＶ１ｂ由来ペプチドを提供する。以下の実施例に示されるように，本発明においては，ＨＣＶ１ｂ関連疾患を有するＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３を有する患者におけるＣＴＬの認識する抗原ペプチド（ＣＴＬエピトープ）を調べた結果，ＨＣＶ−１ｂに広く保存されており，かつＨＬＡ−Ａ１１，Ａ３１，またはＡ３３に結合するモチーフを有するペプチド４８種の中より，４種の新規候補ペプチドが同定された。３０−３９番に位置するコアータンパク由来ペプチド（IVGGVYLLPR（配列番号１））はＨＬＡ−Ａ１１，Ａ３１，およびＡ３３陽性患者末梢血単核球（ＰＢＭＣ）よりペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。一方，コアータンパク由来の３５−４３ペプチド（YLLPRRGPR（配列番号２））および３５−４４ペプチド（YLLPRRGPRL（配列番号３））はＨＬＡ−Ａ３１およびＡ３３陽性患者ＰＢＭＣから，非構造タンパクＮＳ−２由来の９１８−９２６ペプチド（LIRACMLVR（配列番号４））はＨＬＡ−Ａ１１およびＡ３３陽性患者ＰＢＭＣよりペプチド特異的ＣＴＬを誘導した。これらのペプチドに反応性のＩｇＧ抗体がＨＣＶ−１ｂ感染患者血漿中から検出された。
【００１３】
本発明のＣ型肝炎ウイルス由来ペプチド（ＨＣＶペプチド）は，Ｃ型肝炎ウイルス由来の蛋白質の部分アミノ酸配列を含み，かつ，患者のＨＬＡと適合するＨＬＡ結合モチーフを配列中に含む。このペプチドは，Ｃ型肝炎ウイルス感染患者の血中抗体により認識されることができる。
【００１４】
好ましくは，本発明に係るＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，ＣＴＬを誘導することができ，このようにして誘導されたＣＴＬは，ＨＣＶ感染細胞を標的にしてこの細胞を攻撃する。
【００１５】
本発明のペプチドは，所望の作用効果を奏する程度に上記のアミノ酸配列を有していればよく，付加的な配列がさらに含まれていてもよい。当業者であれば，抗原ペプチドとして所望の作用効果を奏するためには，そのＮ末端側およびＣ末端側にそれぞれどの程度の配列の付加が許容されるかを当然に理解することができる。したがって，例えば，本発明にかかるペプチドのＮ末端側および／またはＣ末端側に，免疫感作を促進するのに有用なアミノ酸配列や，製剤化を容易にするアミノ酸配列や，融合蛋白質としてペプチドを発現させるのに便利なアミノ酸配列や，ペプチドの製造および精製に便利なアミノ酸配列などが付加されていてもよい。また，本発明にかかるペプチドは，抗体との結合の特異性が失われない限り，化学的に修飾されていてもよく，ポリマーや糖鎖が付加されていてもよい。
【００１６】
本発明に係るＨＣＶペプチドは，通常の化学的合成法，タンパク分子の酵素的分解法，目的のアミノ酸配列をコードする塩基配列を発現するように形質転換した宿主を用いる遺伝子組換え技術などにより製造することができる。
【００１７】
目的とするペプチドを化学的合成法で製造する場合には，通常のペプチド化学においてそれ自体公知の慣用されている手法によって製造することができ，例えば，ペプチド合成機を使用して，固相合成法により合成することができる。このようにして得られた粗ペプチドは，タンパク質化学において通常使用されている精製方法，例えば，塩析法，限外ろ過法，逆相クロマトグラフィー法，イオン交換クロマトグラフィー法，アフィニティークロマトグラフィー法などによって精製することができる。
【００１８】
一方，所望のペプチドを遺伝子組換え技術で生産する場合には，例えば，合成またはクローニングした目的のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片を適当な発現ベクターに組込み，この発現ベクターを用いて微生物や動物細胞を形質転換して，得られた形質転換体を培養することによって，所望のペプチドを得ることができる。使用できる発現ベクターとしては，当該技術分野において公知であるプラスミド，ウイルスベクターなどを用いることができる。
【００１９】
このペプチド生産技術における発現ベクターを用いた宿主細胞の形質転換方法としては，それ自体公知の方法，例えば，塩化カルシウム法，リン酸カルシウム共沈殿法，ＤＥＡＥデキストラン法，リポフェクチン法，エレクトロポレーション法などが使用でき，使用する宿主細胞に基づいて適宜選択するのがよい。得られたペプチドの精製は，培養した培地から回収した細胞抽出液もしくは培養上清から上記精製法により行うことができる。
【００２０】
本発明のペプチドは，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を治療するための医薬組成物，すなわちペプチドワクチンとして有用である。Ｃ型肝炎ウイルス由来ペプチドからなるワクチンは，上記のようにして製造したペプチドを，医薬的に許容される補助剤および／または担体と適宜混合することにより調製する。補助剤としては，免疫応答を強化し得るアジュバント，例えばフロイントの不完全アジュバント，水酸化アルミニウムゲルなどを使用することができる。また，担体としては，例えば，リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ），蒸留水などの希釈剤，生理食塩水などを使用することができる。
【００２１】
ペプチドワクチンは，その使用形態に応じて，例えば，経口または静脈投与や皮下投与など経皮経路で投与することができる。その剤形としては，例えば，錠剤，顆粒剤，ソフトカプセル剤，ハードカプセル剤，液剤，油剤，乳化剤などが挙げられる。かかる医薬組成物の投与量は，投与する患者の症状などにより，適宜変動し得るが，一般的には，成人に対して１日当たり，ペプチド量として０．１−１０ｍｇが好ましく，投与間隔としては数日ないし数ヶ月に１回投与することが好ましい。また，ペプチドワクチンとインターフェロンとを併用してもよい。
【００２２】
好ましい態様においては，投与されるＣ型肝炎ウイルス由来ペプチドは，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性もしくはＣＴＬの存在に基づいて選択される。更に好ましくは抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性とＣＴＬの両方の存在に基づいて選択される。ここで，「抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性」とは，投与すべきペプチドのいずれかが，患者の血液中に存在する抗ＨＣＶ抗体により認識されることをいう。それぞれの患者における抗ＨＣＶ抗体のペプチド反応性を検査して，各人に適するペプチドのみを投与する，いわゆるテーラーメイド型の投与により，より高い治療効果を期待することができる。癌ペプチドワクチン臨床試験における経験により，テーラーメイド型投与により二次免疫の賦活が速やかに誘導されるため，より安全により良い臨床効果が発現することが立証されている（Mine et al., Clin. Can. Res. 929-937,2004）。
【００２３】
ＨＣＶ関連疾患の治療効果の確認は，ＨＣＶ関連疾患に罹患している被験者の血中抗体価，すなわちペプチドに対する反応性を有する抗体の血中濃度を，ＥＬＩＳＡ等の慣用の方法によりモニターすることによって行うことができる。また，ＨＣＶ ＲＮＡの量をＲＴ−ＰＣＲ等の慣用の方法により測定することにより，ウイルス量をモニターすることができる。
【００２４】
本発明のペプチドはまた，ＨＣＶ関連疾患を有する患者を診断し，あるいは疾患の進行を予測するための組成物としても有用である。本発明のペプチドを用いて，当該技術分野においてよく知られる抗原抗体反応を用いて，被験者の血液中の抗体価を測定することができる。例えば，典型的なＥＬＩＳＡ法を用いる場合には，以下のようにして測定を行うことができる。抗原であるペプチドを９６ウェルなどの慣用のＥＬＩＳＡプレートに結合させ，非特異的吸着を防止するためにプレートを適宜ブロッキングする。次に被験者の血液から調製した血清を適宜希釈してプレートの各ウェルに加えて，所定時間反応する。プレートを洗浄して未結合成分を除去した後，ヒト抗体と結合しうる抗体（例えばウサギ抗ヒト抗体）を加える。ＩｇＧを検出することが望まれる場合には，γ鎖特異的抗ヒトＩｇＧを用いることができる。所定時間反応した後，プレートを洗浄し，検出可能なように標識した抗体（例えば抗ウサギＩｇＧ）を加える。標識は，酵素，蛍光色素，化学発光物質，ビオチン，放射線化合物等を用いて，当業者によく知られる方法により行うことができる。プレートを所定時間反応した後，適当な基質を加えて基質の減少もしくは生成物の増加を測定するか，または蛍光，発光，放射活性を測定することにより，標識を検出する。このようにして，被験者の血清における特定のペプチドに対する抗体の量を測定することができる。さらに，抗体の量をモニターすることにより，ＨＣＶ関連疾患の進行の予測を行うことができる。
【００２５】
このような抗原抗体反応により抗体を検出する方法のうち，感度の高い方法の１つとしてｘＭＡＰ技術がある。これは，Luminex社が開発した蛍光マイクロビーズアレイシステムによるフローメトリー測定法であり，ペプチドを結合させたマイクロビーズと血清とを接触させ，次に，蛍光標識二次抗体を結合させて，フローメトリーにより蛍光強度を測定する。
【００２６】
また，病院の検査室などで抗体価を測定する場合には，免疫クロマト法を用いることができる。この方法は，試験紙上に抗原（または抗体）を線状に分布させた部分を作っておき，検体中の抗体と着色粒子で標識された抗原との複合体が試験紙上を移動する際に，抗原（または抗体）に集中的に捕捉されることで現れる色付きのラインの有無によって定性分析を行う方法である。この方法を用いれば，簡便な設備で短時間（２０〜３０分以内）に結果を得ることができる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。ただし，これらの実施例は本発明をより具体的に説明するために例示的に示したものであり，本発明は実施例により限定されるものではない。
【００２８】
被験者
ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプを有するＨＣＶ１ｂ感染患者および健康なドナーを被験者とした。これらの被験者は，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３のいずれかのＨＬＡタイプを有しており，いずれもＨＩＶには感染していなかった。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得るためには，２０ｍｌの末梢血を採取し，フィコール−コンレー密度勾配遠心分離によりＰＢＭＣを調製した。すべてのサンプルは実験に用いるまで低温保存した。ＨＣＶ１ｂ患者のＰＢＭＣにおけるＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の発現は，以下の抗体を用いてフローサイトメトリーにより測定した：抗ＨＬＡ−Ａ１１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｃａｔ＃０２８４ＨＡ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ Ｉｎｃ．，Ｃａｎｏｇａ，ＣＡ），抗ＨＬＡ−Ａ３１ｍＡｂ（Ｃａｔ＃０２７３ＨＡ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ），および抗ＨＬＡ−Ａ３３ｍＡｂ（Ｃａｔ＃０６１２ＨＡ；Ｏｎｅ Ｌａｍｂｄａ）。
【００２９】
細胞株
使用した細胞株，Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，およびＣ１Ｒ−Ａ３３は，それぞれＨＬＡ−Ａ１１０１，ＨＬＡ−Ａ３１０１，およびＨＬＡ−Ａ３３０３遺伝子で恒常的にトランスフェクトされたＣ１Ｒリンパ腫のサブラインである。これらのサブラインにおけるＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の発現は先に報告されている（Takedatsu H, et al., Clinical Cancer Research 2004; 10: 1112-20）。すべての細胞株は１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で維持した。
【００３０】
ペプチド
ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３分子の結合モチーフ（Parker KC et al., J Immunol 1994; 152: 163-75）に基づいて，４７種類のＨＣＶ−１ｂ蛋白質由来ペプチドを用意した。すべてのペプチドはＢｉｏｌｏｇｉｃａ Ｃｏ．（Ｎａｇｏｙａ，Ｊａｐａｎ）より購入し，９０％以上の純度であった。ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプに結合する対照ペプチドとして，インフルエンザ（Ｆｌｕ）ウイルス由来ペプチド（ＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫ（配列番号５）），エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来ペプチド（ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ（配列番号６）），チロシナーゼ関連蛋白質２（ＴＲＰ２）由来ペプチド（ＬＬＧＰＧＲＰＹＲ（配列番号７）），およびＨＩＶ由来ペプチド（ＲＬＲＤＬＬＬＩＶＴＲ（配列番号８））を用いた。すべてのペプチドはジメチルスルホキシドで溶解後，10μｇ／ｍｌに希釈して用いた。
【００３１】
統計学
統計学的分析は，スチューデントｔ検定を用いて行った。Ｐ＜０．０５の値を統計学的に有意とした。
【００３２】
ペプチド特異的ＩｇＧの検出
最初に，ＨＣＶ−１ｂに感染した１２名の患者の血清の１：１００希釈サンプルを用いて，４８種のペプチドのそれぞれに対して反応性のペプチド特異的ＩｇＧのレベルを測定した。ペプチド特異的ＩｇＧの血漿レベルは，先に記載された方法にしたがってルミネックス（登録商標）法により測定した（Komatsu N. et al., Scand J Clin Lab Invest, 64, 535-546, (2004)）。簡単には，２００μＬの血漿（１：１００希釈）を２５μＬのペプチド結合カラーコードビーズ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ））とともに９６ウエルフィルタープレート（ＭＡＢＶＮ１２５０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中で，プレート振盪器で室温にて２時間インキュベートした。２時間後，プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０−ＰＢＳで洗浄し，１００μＬのビオチン化ヤギ抗ヒトＩｇＧとともにプレート振盪器で室温にて１時間インキュベートした。次に，プレートを洗浄し，１００μＬのストレプトアビジン−ＰＥ（５μｇ／ｍｌ）をウエルに加え，プレート振盪器で室温にて３０分間インキュベートした。蛍光強度（ＦＩ）をルミネックス（登録商標）により測定し，ペプチド特異的抗体のレベルを求めた。１５名の健康なドナーの血漿を負対照として用いた。カットオフＦＩ値は，健康なドナーのＦＩ値の平均＋２ＳＤより高い値として決定した。
【００３３】
その結果，ＨＣＶコア３０−３９，３５−４３，３５−４４，およびＨＣＶＮＳ２９１８−９２６ペプチドに対して反応性のＩｇＧが，１２名の患者中それぞれ７，７，７，および９名の血漿において検出された。これに対し，これらの各ペプチドは，１５名の健康なドナーのいずれからの血漿にも反応性ではなかった。患者における，ＨＣＶコア３０−３９，ＨＣＶコア３５−４３，３５−４４，およびＨＣＶＮＳ２９１６−９２６ペプチドに対して反応性である平均ＩｇＧのレベルは，それぞれ健康なドナーに比べて統計学的に有意に高かった（図１）。
【００３４】
ＨＣＶ１ｂ感染患者のＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導
ＨＣＶ１ｂ感染患者血中のＩｇＧにより高頻度に認識された上述の４種類のペプチドがＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，もしくはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ−１ｂ患者のＰＢＭＣからペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＰＢＭＣをインビトロでＨＣＶ由来ペプチドまたは対照ペプチドで刺激・培養し，対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する反応性をＩＦＮ−γ産生を指標として調べた。
【００３５】
ペプチド特異的ＣＴＬを検出するためのアッセイは，先に報告されている方法にしたがい，若干の改変を加えた（Hida N et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51: 219-28）。簡単には，ＰＢＭＣ（１×１０5細胞／ウエル）をＵ底９６ウエルマイクロカルチャープレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で２００μｌの培養液中で，１０μｌ／ｍｌの各ペプチドとともにインキュベートした。実験は４重に行った。培養液は，４５％ＲＰＭＩ１６４０，４５％ＡＩＭ−Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ），１０％ＦＣＳ，１００Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２（ＩＬ−２），および０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）からなるものであった。３日ごとに，培養液の半分を除去し，対応するペプチド（１０μｇ／ｍｌ）を含む新たな培地に置き換えた。培養第１５日に，培養細胞の半分を，対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞で刺激し，残りの半分の細胞はＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞とともに培養した。１８時間のインキュベートの後，上清を回収し，ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γのレベルを測定した。
【００３６】
対応するペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答して，対照群のＨＩＶペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞と比較してＰ値が０．０５より低い場合に，かつ５０ｐｇ／ｍｌより多いＩＦＮ−γが産生された場合に，ペプチド特異的ＣＴＬの誘導が成功したと判定した。その結果，ＨＣＶペプチド（コア蛋白質の３０−３９，３５−４３，および非構造蛋白質２の９１８−９２６）では，それぞれ，ＨＬＡ−Ａ１１陽性ＨＣＶ１ｂ患者の３／７，０／７，および２／７，ＨＬＡ−Ａ３１陽性ＨＣＶ１ｂ患者の１／４，０／４，および０／４，ＨＬＡ−Ａ３３陽性ＨＣＶ−１ｂ患者の３／５，３／５，および３／５のＰＢＭＣから，対応するペプチドに反応性のＣＴＬが誘導された（図２）。
【００３７】
ＨＣＶコア３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬを誘導しうることは既に知られている（Takao Y et al., Microbiol. Immunol., 48(7), 507-517, 2004）。上述の結果は，ＨＣＶコア３５−４３ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＨＣＶ１ｂ患者からもＣＴＬを誘導しうることを示す。
【００３８】
次に，ＨＣＶコア３５−４４ペプチドがＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ拘束性ＣＴＬを誘導しうるか否かを調べた。ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＨＣＶ１ｂ患者のＰＢＭＣを，インビトロでＨＣＶコア３５−４３および３５−４４ペプチドまたは対照ペプチドで刺激して，対応するペプチドをパルスしたＴ２（ＨＬＡ−Ａ２を有する），Ｃ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，Ｃ１Ｒ−Ａ３３細胞に応答したＩＦＮ−γ産生について調べた。その結果，コア蛋白質３５−４４のペプチドは，ＨＬＡ−Ａ１１陽性ＨＣＶ１ｂ患者（０／７），ＨＬＡ−Ａ３１陽性ＨＣＶ１ｂ患者（１／２），およびＨＬＡ−Ａ３３陽性ＨＣＶ−１ｂ患者（１／２）のＰＢＭＣからペプチド反応性ＣＴＬを誘導した（図２）。陽性対照として，ＨＣＶコア３５−４３またはコア３５−４４ペプチドは，それぞれＨＬＡ−Ａ２陽性ＨＣＶ−１ｂ患者３名中０名または３名中２名においてペプチド特異的ＣＴＬを誘導した（データ示さず）。
【００３９】
これらの知見は，ＨＣＶコア３０−３９，３５−４３，コア３５−４４，およびＨＣＶＮＳ２９１８−９２６ペプチドがＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３を有するＨＣＶ−１ｂ患者のＰＢＭＣにおいてペプチド特異的ＣＴＬを誘導しうることを示す。
【００４０】
ペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性
ペプチドで刺激したＰＢＭＣを，標準的な６時間の51Ｃｒ−放出アッセイにより，対応するペプチドまたはＨＩＶペプチドのいずれかで予めパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，およびＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する細胞傷害活性について調べた。ウエルあたり２０００個の51Ｃｒ標識細胞をエフェクター細胞とともに，所定のエフェクター／標的細胞比で９６丸底ウエルプレートで培養した。特異的51Ｃｒ−放出は，以下の式にしたがって計算した：（試験群ｃ．ｐ．ｍ．−自然放出ｃ．ｐ．ｍ．）。自然放出はエフェクター細胞なしでインキュベートした標的細胞の上清により決定した。総放出は，１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）とともにインキュベートした標的細胞の上清により決定した。いくつかの実験においては，培養の最初に，１０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２：マウスＩｇＧ２ａ），抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３：マウスＩｇＧ２ａ），抗ＣＤ４（ＮＵ−ＴＨ／Ｉ：マウスＩｇＧ１），抗ＣＤ８（ＮＵ−ＴＳ／Ｃ：マウスＩｇＧ２ａ），または抗ＣＤ１４（Ｈ１４：マウスＩｇＧ２ａ）モノクローナル抗体をウエルに加えた。
【００４１】
ＨＣＶペプチドで刺激・培養したＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ陽性のＰＢＭＣは，対応するペプチドを予め負荷したＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対して細胞傷害活性を示すことができたが，ＨＩＶペプチドについては示さなかった（図３）。
【００４２】
さらに，各ペプチドでパルスしたＣ１Ｒ−Ａ１１，Ｃ１Ｒ−Ａ３１，またはＣ１Ｒ−Ａ３３細胞に対する細胞傷害活性は，ＨＬＡ−クラスＩ（Ｗ６／３２）またはＣＤ８モノクローナル抗体（ｍＡｂ）により阻害されるが，試験したＨＬＡ−クラスＩＩ（ＤＲ−１）またはＣＤ４またはＣＤ１４ｍＡｂでは阻害されなかった。このことは，ペプチド特異的細胞傷害活性は主としてＣＤ８+Ｔ細胞によりＨＬＡ−クラスＩ拘束性に発現することを示す（図４）。
【００４３】
以上の結果より，これら４種のペプチドはＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，またはＨＬＡ−Ａ３３陽性のＨＣＶ−１ｂ関連疾患患者に対するペプチド免疫療法に有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明のペプチドはＨＣＶ関連疾患の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は，ＨＣＶ感染患者におけるペプチド特異的ＩｇＧの検出を示す。
【図２】図２は，ＨＣＶ１ｂ患者のＰＢＭＣからのペプチド特異的ＣＴＬの誘導を示す。
【図３】図３は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。
【図４】図４は，ペプチドを予め負荷した細胞に対するペプチド刺激ＰＢＭＣの細胞傷害活性を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，配列番号１−４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうる，請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者においてＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載のペプチドを含有する，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者においてＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物。
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗体により認識されるペプチドであって，配列番号１−４のいずれかで表されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１またはＨＬＡ−Ａ３３拘束性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導しうる，請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含有する，ＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項４】
請求項１または２に記載のペプチドを有効成分として含有する，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者においてＨＣＶ関連疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項５】
請求項１または２に記載のペプチドを含有する，ＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物。
【請求項６】
請求項１または２に記載のペプチドを含有する，ＨＬＡ−Ａ１１，ＨＬＡ−Ａ３１，およびＨＬＡ−Ａ３３を有する患者においてＨＣＶ関連疾患を診断するかまたはＨＣＶ関連疾患の進行を予測するための組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００９−１８９９０（Ｐ２００９−１８９９０Ａ）
【公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３１０２０３（Ｐ２００５−３１０２０３）
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１月２９日（２００９．１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１０月２５日（２００５．１０．２５）
【出願人】（５９９０４５９０３）学校法人 久留米大学 (72)
【Ｆターム（参考）】
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