ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する免疫原性組成物および腫瘍の治療方法
【課題】ガストリン依存性腫瘍の治療の為の免疫学的方法の提供、特に免疫原、免疫性の組成、およびガストリン依存性腫瘍の処理方法を提供する。
【解決手段】免疫原は、スペーサーおよび免疫性キャリアに接合するＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−レセプターからのペプチドを含む。この免疫原は、腫瘍細胞においてＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−レセプターに結合するインビボの抗体を誘導でき、これにより、成長を刺激するペプチドホルモンがレセプターに結合するのを防止し、腫瘍細胞の成長を抑制できる。また、この免疫原は、パッシブな免疫化のためのＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−レセプターに対する抗体を含む。更に、インビボでまたは本発明の抗体を用いた組織片検査からガストリン依存性腫瘍を検出するための診断方法に利用することができる。
【解決手段】免疫原は、スペーサーおよび免疫性キャリアに接合するＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−レセプターからのペプチドを含む。この免疫原は、腫瘍細胞においてＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−レセプターに結合するインビボの抗体を誘導でき、これにより、成長を刺激するペプチドホルモンがレセプターに結合するのを防止し、腫瘍細胞の成長を抑制できる。また、この免疫原は、パッシブな免疫化のためのＣＣＫ−Ｂ／ガストリン−レセプターに対する抗体を含む。更に、インビボでまたは本発明の抗体を用いた組織片検査からガストリン依存性腫瘍を検出するための診断方法に利用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性組成物およびガストリン依存性腫瘍の治療のための免疫学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンであるガストリンは、その５カルボキシ末端アミノ酸を介して高い親和性でガストリン／コレシストキニン（ＣＣＫ）−Ｂ受容体と結合する。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（レセプター）は、また種々の遺伝子の発現を制御する細胞内シグナル導入経路にＧタンパク質を介して連結される細胞質膜タンパク質である。
【０００３】
ガストリンは、テトラトリアコンタガストリン（Ｇ３４）とヘプタデカガストリン（Ｇ１７）の２つの形態で生じるペプチドホルモンであって、胃の幽門洞に位置する特殊化細胞であるＧ細胞により合成され、そして分泌される。ホルモンは循環血液中に分泌され、胃酸の分泌量に間接的または直接的に影響を及ぼす胃の中の特定の細胞、即ちエンテロクロマフィン様（ＥＣＬ）細胞および壁細胞と結合する。歴史的に、ガストリンホルモンは胃酸分泌の刺激と関連づけられてきた（Edkins,J.S．1905）（本明細書中で引用した参考文献の全引用は、発明の開示の末尾に提示される）。
【０００４】
近年、ガストリンが胃腸管内で栄養因子として作用することが可能であり（Johnson,L．1997）、そしてそれは胃腸癌（Watson et al.1989，Dickinson,C.J.1995）、ならびに肺の小細胞癌を含む非胃腸癌（Rehfeld et al.1989）の増殖を促し得るという証拠が蓄積されている。ガストリンの翻訳後プロセッシングでは、それはカルボキシ末端を介してガストリン／ＣＣＫ−Ｂ受容体と結合する「成熟」カルボキシアミド化形態である（Kopin et al.1992）。
【０００５】
いくつかの種類の腫瘍、例えば結腸直腸、胃、膵臓および肝細胞腺癌は、それらの形質膜中にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を保有し、そしてそれらはガストリンに反応して強力な細胞増殖性を有するということが示されている（Rehfeld,J.F．1972，Upp et al.1989およびWatson et al.1993）。さらに、もっと最近になって、これらの癌細胞の多くがガストリンの分泌をも行い、従って自律性増殖経路に影響を与えることが発見された（Van-Solinge et al.1993，Nemeth et al．1993およびSeva et al．1994）。
【０００６】
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は、７つの膜内外トメインを有し、ＣＣＫおよびガストリンの両方に対して等しい親和性を有するＧタンパク質結合受容体の一族に属する（Soll et al．1984）。この受容体は、それが脳中で主として見出されたために、ＣＣＫ Ｂ型受容体と命名された（Wank et al．1992）。その受容体はその後、胃の壁およびＥＣＬ細胞中の周辺ＣＣＫ／ガストリン受容体と同一であることが判明した（Nakata et al．1992）。この受容体は、多数の正常組織（Fourmy et al．1984、Grider et al．1990）および腫瘍組織（Singh et al．1990、Watson et al．1993）において十分特性化され、ラット膵臓腺癌細胞株ＡＲ４２Ｊを用いて大規模に研究された（Scemama et al．1987）。ＡＲ４２Ｊ ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡは、クローン化され、シーケンシングされており、そしてそれはラットおよびヒトの脳におけるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体とは９０％より多くのＤＮＡ配列が相同であり、イヌ壁細胞ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡとは８４％より多くの配列が相同であって（Wank,S.A．1995）、これは種間でも高度の配列相同性を実証している。
【０００７】
ペプチドホルモンＧ１７およびＧ３４は、正常細胞の細胞膜上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合する。しかしながら、Ｇ１７はガストリン依存性癌細胞の増殖を刺激するが、Ｇ３４はそうではないということが判明している。血清関連Ｇ１７は、特に、腫瘍細胞中でＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体により媒介される内分泌様式で（Watson et al．1993）結腸直腸腫瘍の増殖を刺激する能力を有する。ガストリン−１７は、その他のガストリンホルモン種を上回る、腫瘍細胞におけるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する親和性増大の可能性のために、結腸直腸腺癌の増殖を刺激する場合に特に関係があると考えられる（Rehfeld 1972および1993）。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は、ヒト原発性結腸直腸腫瘍の５６．７％で高親和性形態で発現されることが判明した（Upp et al.1989）。このような腫瘍による前駆体ガストリンペプチドの内因性産生のために、オートクラインループの可能性も存在し得る、と仮定される（Van-Solinge et al．1993およびNemeth et al．1993）。その結果生じるＧ１７配位子／受容体抱合体は、細胞機能を調節するための二次メッセンジャーにより細胞増殖を刺激する（Ullrich et al.1990）。Ｇ１７のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体との結合は、ホスファチジルイノシトール分解の活性化、その結果生じる細胞内カルシウムイオン濃度増大を伴うプロテインキナーゼＣ活性化、ならびに細胞増殖の調節に関連があるとされたミトゲン活性化プロテインキナーゼによる、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ遺伝子の誘導を引き起こす（Tadisco et al.1995）。さらに、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合するガストリンは、ミトゲンシグナルの伝達にある役割を有し得るチロシンキナーゼｐｐ１２５ＦＡＤＫ（フォーカルアトヒーションキナーゼ）によるリン酸化におけるその後の増大に関連づけられている（Tanaguchi et al．1994）。
【０００８】
多数の高親和性ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬は、多数の実験的胃腸癌でインビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）の両方で療法的に評価されてきた。例えば、グルタミン酸誘導体であるプログルミド（Seva et al.190；Harrison et al.1990およびWatson et al.1991a）；トリプトファンのＮ−アシル誘導体であるベンゾトリプト；アスペルシリンの誘導体である、Ｌ−３６５，２６０（Bock et al．1989；およびＣＣＫのＣ末端ペンタペプチド配列に似せた分子であるＣＩ−９８８（Hughes et al．1990）は、in vitroとin vivoの両方で胃腸腫瘍の増殖に及ぼす外因性ガストリンの作用を有効に中和することが示されている（Watson et al．およびRomani et al．1994）。しかし、これらの拮抗薬は正常細胞におけるＧ３４およびＣＣＫのような受容体の可能性のあるすべての配位子の作用をブロックするので、深刻な毒性の副作用を有し、そして特異性を欠いている。近年、非常に有効且つ選択的ＣＣＫＢ／ガストリン受容体拮抗薬、例えばＹＭ０２２（Yuki et al.1997）およびＹＦ４７６（Takinami et al.1997）も記載されている。
【０００９】
プログルミドおよびベンゾトリプトは、前臨床試験で広範に評価されている。
これらの化合物に伴う主な問題はそれらの効力不足であり、Ｇ１７に取って代わるには相対的に高濃度を要する（Watson et al.,1992a;Watson et al.,1992b）。これにもかかわらず、プログルミドおよびベンゾトリプトは多数の細胞株の基本的およびガストリン刺激性増殖を阻害した（Seva et al.,1990;Watson et al.,1991a）。さらに、プログルミドは、ガストリン感受性マウス結腸腫瘍ＭＣ２６を有する異種移植マウスの生存を、対照動物の２５日から処置動物では３９日に増大した。
【００１０】
ガストリン／ＣＣＫＢ受容体に対するこの種のガストリン拮抗剤の低特異性のために、腫瘍増殖の阻害はガストリン拮抗薬による有効な制御であり得ない。さらに、ガストリンを認識し結合する細胞受容体は、試験したすべての阻害剤を結合するわけではない（Seva et al.1994）。したがって、受容体に結合するガストリンの完全な阻害がオートクライン増殖カスケードで起きない場合には、ガストリン拮抗薬は腫瘍増殖促進のこのメカニズムをブロックできないこともある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、免疫原性組成物およびガストリン依存性腫瘍の治療のための免疫学的方法を提供する。本方法は、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原または抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体による患者の能動性または受動性免疫感作を包含する。免疫原により産生される抗体は腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対して特異的であり、そして受容体に及ぼすガストリンの増殖促進作用をブロックする。抗体はペプチドホルモンがガストリン依存性腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合するのを阻止し、したがって腫瘍の増殖が抑制される。
【００１２】
さらに、意外にも、受容体と結合する場合に、受容体のＮＨ2末端に特異的な抗体は内在化され、腫瘍細胞の細胞質中に、そして核中に迅速に転位される。この内在化は、細胞を抗体に曝露後１０秒という初期に起こり得る。抗体／受容体抱合体のこの迅速な内在化は、また罹患腫瘍細胞にアポトーシスまたは自殺を起こさせる。
【００１３】
本発明の免疫原は、免疫原の免疫模擬部分として、ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に由来する天然または合成ペプチドを包含する。免疫原は、免疫模擬ペプチドの末端に結合したスペーサーペプチド配列も包含し得る。免疫原はまた、タンパク質担体、例えばジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミン等と結合され得る。
一実施態様では、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する免疫感作の方法は、患者が本発明の免疫原により免疫感作される、能動性免疫感作を包含する。免疫原は、腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する抗体の産生を刺激する。
【００１４】
抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原により産生される抗体は腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合して、ペプチドホルモンの受容体との結合を有効に阻止し、それにより腫瘍細胞分裂のオートクライン増殖刺激経路を、そして結局は腫瘍の増殖を阻害する。
【００１５】
本発明の別の実施態様では、治療方法は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する抗体が腫瘍細胞のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合するのに十分な濃度で患者に投与され、抗体がペプチドホルモンの受容体との結合をブロックする受動性免疫感作を包含する。ホルモンのそれらの受容体との結合の阻止は、腫瘍細胞の増殖刺激経路を阻害し、それによりホルモン依存性腫瘍の増殖を阻害する。本発明のこの態様の好ましい実施例では、ヒトの療法のための抗体は、当業者に周知の方法により産生され得るキメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体であり得る。さらに、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、腫瘍細胞の殺害を増強するために、コレラ毒素のような細胞毒性分子と、または125Ｉおよび131Ｉのような放射性核種で標識化された放射性分子とさらに結合され得る。
【００１６】
本発明は、ガストリン反応性腫瘍を診断するための方法であり、本発明の抗体を用いた組織生検からのガストリン依存性（ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン含有）腫瘍の免疫化学的検出を包含する方法も提供する。本発明の特異的抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、標準免疫化学手法を用いて腫瘍組織中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を検出するためのビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびフルオレセインのような化合物を利用する検出系により標識化され得る。
【００１７】
本発明はガストリン依存性腫瘍の診断方法であって、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を用いたガストリン依存性（ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体含有）腫瘍のin vivo検出を包含する方法も提供する。該方法は、結腸直腸腫瘍を有する患者に有効用量の放射能標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を静脈注射により投与し、標準シンチグラフィー走査法によりそれらの細胞膜と結合した抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を有する腫瘍細胞を画像化しまたは検出する工程を包含する。本発明のこの態様では、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は111インジウム、90イットリウムおよび131Ｉのような放射性核種で標識化される必要がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の方法は、ヒトを含めた動物におけるガストリンホルモン依存性腫瘍の治療に向けられ、そしてホルモンの増殖促進作用を阻害するために、ホルモンの受容体との結合を阻止するよう、腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合する、免疫感作患者において抗体を産生する抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を患者に投与することを包含する。さらに重要なのは、臨床的見地から受容体／抗ＧＲＰＩ抱合体が迅速に内在化され、細胞質を横断して核に入ることである。これは、明らかに罹患腫瘍細胞が自殺（アポトーシス）するのを誘発する。
【００１９】
免疫原は、免疫模擬物質として作用するヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の天然または合成ペプチドを包含する。特に２つの合成ペプチドが免疫模擬物質として開発されている。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ酸配列から発現されるこれらのペプチドは免疫原性であり、in vivoとin vitroの両方で腫瘍細胞の内因性ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と交差反応性である。ペプチド１はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体配列のアミノ酸５〜２１で構成される：ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（ペプチド１、配列表の配列番号：１）。ペプチド１は、受容体のアミノ末端を構成し、細胞膜の細胞外表面に位置する（第１図参照）。
【００２０】
別の実施態様では、免疫原は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の以下のアミノ酸配列から成るペプチド４を包含する：ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（ペプチト４、配列表の配列番号：２）。ペプチド４は受容体の四番目の細胞外ドメインの一部であり、それも形質膜の外側にある（第１図参照）。
【００２１】
免疫原は、タンパク質担体から離れて免疫模擬ペプチドを突き出し、リンパ球受容体を結合するその能力を増強するのに適した延長またはスペーサーペプチドも包含し得る。適切なスペーサーペプチドは、アミノ酸配列ＳＳＰＰＰＣ（セリン（Ｓｅｒ）スペーサー、配列表の配列番号：３）の配列を有する。しかしなからその他のスペーサーペプチドも適している。スペーサーの有無に関わらず、免疫模擬ペプチドを次に、カルボキシ末端のシステイン残基を介してタンパク質担体、例えばジフテリアトキソイドと結合させる。スペーサーペプチドはＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体由来ペプチドとは免疫学的に関連せず、したがって受容体由来ペプチドの特異的免疫原性を増強すべきであるが、しかし確定はしない。
【００２２】
患者における腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の存在および密度は、標識化抗受容体抗体を腫瘍生検標本から得られた標本と反応させることにより確定され得る。抗受容体抗体は、放射能トレーサー、染料または蛍光標識により標識化され得る。さらに、ガストリンに対する腫瘍細胞の反応性は標準技法を用いて患者の腫瘍生検標本からin vitroで評価され得る。腫瘍を有し、生検標本がＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体検定に陽性である患者は、本発明の方法による治療のための典型的候補者である。
【００２３】
０．００１〜２ｍｇの範囲の有効投与量の免疫原性組成物が、胃腸癌の治療のために患者に投与される。免疫原性組成物の有効投与量は、免疫感作後１〜３ヶ月目にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対して有効レベルの抗体力価から成る、患者における免疫反応を引き出し得るべきである。患者の免疫感作後、免疫原の有効性は、腫瘍の存在およびサイズを検出するために、標準臨床手法、例えば超音波および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によりモニタリングされる。受容体に対する抗体力価レベルも、患者から採取した血液の標本からモニタリングし得る。ブースター免疫感作は、有効な抗体力価を保持する必要がある場合に投与されるべきである。ガストリン依存性癌、例えば胃、肝臓、膵臓および結腸直腸腺癌の本方法による有効な治療は、腫瘍増殖の阻害および腫瘍のサイズ低減を生じる。
【００２４】
本発明の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原により生じた抗体は、３つの可能なメカニズムによりガストリン依存性腫瘍に対する抗栄養作用を有し得る：（ｉ）その受容体と結合するガストリンの阻害、（ｉｉ）腫瘍細胞増殖のシグナル導入経路の分解または崩壊、および（ｉｉｉ）受容体／抗体抱合体が内在化され、核中に移動する細胞におけるアポトーシス（または細胞自殺）の誘発。
【００２５】
本発明の別の実施態様では、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体反応性腫瘍を有する患者に投与される。抗体は、腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と特異的に結合する。抗体の受容体との結合は、細胞の膜中でのその配位子とのガストリンの結合を阻止し、したがって、ガストリン依存性腫瘍細胞に対する増殖シグナルが阻害され、腫瘍の増殖が抑制される。抗体は、好ましくはキメラまたはヒト化抗体、またはその断片であり、それらは標的受容体と有効に結合し、例えば米国特許第5,023,077号、第5,468,494号、第5,607,676号、第5,609,870号、第5,688,506号および第5,662,702号に開示されているような標準技法によって製造され得る。これらの外因的に製造された抗体も、腫瘍細胞の増殖のそれらによる阻害または腫瘍細胞への毒性物質の送達の観点から、それらの形質膜上にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を保有する腫瘍細胞を殺害するのに有用であり得る。治療のための好ましい抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体は、それぞれＧＲＰ−１およびＧＲＰ−４として図１に示した受容体タンパク質の細胞外ドメイン１および４と反応性のものである。特に好ましいのは、ペプチド１および４に対応する受容体タンパク質のアミノ酸配列を特異的に認識し、結合する抗体である。免疫感作のこの方法での腫瘍増殖の阻害も超音波画像およびＭＲＩによりモニタリングされ、患者により必要な場合には、繰り返し免疫感作が投与される。
【００２６】
腫瘍細胞増殖を抑制し腫瘍細胞を殺害する場合の抗体の有効性は細胞毒性分子を抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体と抱合させることにより増強され得る。細胞毒性分子は、毒素、例えばコレラ毒素、リシン、α−アマニチン、あるいは125Ｉまたは131Ｉで標識化された放射性分子、あるいは化学療法薬、例えばシトシンアラビノシドまたは５−フルオロウリジンであり得る。
【００２７】
125Ｉまたは131Ｉで放射能標識化された抗体の他に、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体も111インジウムまたは90イットリウムのような放射性核種で標識化され得る。本発明のこの局面では、抗体は、これらの抗体を患者に投与することによるin vivoでのＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体保有腫瘍の検出および診断に、そしてＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体含有腫瘍細胞上の結合した抗体の検出に有用である。放射能標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体を腫瘍に到達させた後、注射の約１〜２時間後に、以前に開示されたような標準シンチグラフィー法を用いて、放射性「ホットスポット」を画像化する（Harrison's Principles of Internal Medicine,Isselbacher et al．eds．13thEd.1994）。
【００２８】
免疫原が患者におけるガストリン依存性腫瘍の治療のために投与される組成物は、種々の形態であり得る。これらの例としては、例えば固体、半固体および液体投与形態、例えば粉末、液体溶液、懸濁液、座薬、ならびに注射用および注入用溶液が挙げられる。好ましい形態は意図される投与方式および治療用途によっている。組成物は本発明の免疫原および適切な製薬上許容可能な成分を包含し、その他の医薬剤、担体、アジュバント、賦形剤等を含み得る。適切なアジュバントとして、ノルムラミルジペプチド（ノル−ＭＤＰ、Peninsula Labs.,CA）および油、例えば、モンタニドＩＳＡ７０３（Seppic，Inc.，Paris,France）が挙げられるが、これらは標準手法を用いて混合され得る。好ましくは、組成物は単位用量の形態である。免疫感作のために、あるいは一度にまたは一定期間中に薬物として投与される活性化合物の量は、治療される被験者、投与の方式および形態、ならびに治療担当医の判断による。
【００２９】
受動性免疫感作のための本発明の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、好ましくは製薬上許容可能な担体、例えば生理食塩水、例えばリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、静脈注射により患者に投与される。
【００３０】
実施例１
ＧＲＰ１−ＤＴおよびＧＲＰ４−ＤＴ抱合体の調製
標準固体状態ペプチド合成により、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ペプチドを調製した。特異的免疫反応を誘発し得る免疫原を作製するために、そのカルボキシ末端にスペーサー配列ＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列番号：３）を含有するペプチト１および４の各々を合成した。これらのペプチドをその後、下記の方法Ａまたは方法Ｂのいずれかにより、カップリング剤の一端にスクシンイミジルエステルを、そして他端にマレイミドを含有するヘテロ二官能性カップリング剤を用いて、スペーサーの末端ペプチドアミノ酸残基システインを介して、担体であるジフテリアトキソイド（「ＤＴ」）上に存在するアミノ基と結合させた。
【００３１】
方法Ａ：米国特許第5,023,077号で以前に記載されているように、前記のペプチド１または４と担体との抱合は、以下のように成し遂げられる。乾燥ペプチドを、３０倍のモル過剰量のジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）とともに、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０中に溶解した。溶液を水飽和窒素ガス雰囲気下で４時間攪拌した。０．２Ｍ酢酸で平衡させたＧ１０セファデックスカラム上でのクロマトグラフィーにより、還元システインを含有するペプチドを他の成分から分離した。ペプチドを凍結乾燥し、使用されるまで真空中で保存した。
【００３２】
分子量１０5の担体当たり約２５個の遊離アミノ基の活性化を成し遂げるのに十分な割合のヘテロ二官能性カップリング剤、例えばイプシロン−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＥＭＣＳ」）で処理することにより、担体を活性化した。ジフテリアトキソイドの特定の例では、これは２０ｍｇのジフテリアトキソイドの各々に６．１８ｍｇのＥＭＣＳ（純度７５％）を付加するという量であった。
【００３３】
１ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．４５中にジフテリアトキソイドのアリコート各々２０ｍｇを溶解することにより、ジフテリアトキソイドの活性化を成し遂げた。６．１８ｍｇのＥＭＣＳのアリコートを０．２ｍｌのシメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）中に溶解した。暗化条件下で、ＥＭＣＳを攪拌しながら５０マイクロリットル（「μｌ」）量でＤＴに滴下した。暗所で２時間インキュベーション後、混合物を、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０で平衡させたＧ５０セファデックスカラム上でクロマトグラフィー処理した。
【００３４】
ＥＭＣＳ活性化ジフテリアトキソイドを含有する分画を、暗化条件下でＰＭ１０限外濾過膜上で濃縮した。ロウリー法またはブラッドフォード法のいずれかにより、濃縮物のタンパク質含量を確定した。システイン−ＨＣｌとともに活性化担体をインキュベートし、その後１０ｍＭのエルマン試薬５，５’シチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させることにより、担体のＥＭＣＳ含量を確定した。システイン−ＨＣｌを含有するブランク管とシステイン−ＨＣｌおよび担体を含有する標本管との間の光学密度差を、４１２ｎｍでの５−チオ−２−ニトロ安息香酸に関する１３．６×１０3というモル吸光係数を用いることによりＥＭＣＳ基含量に翻訳した。
【００３５】
エルマン試薬を用いてペプチドの還元システイン含量（−ＳＨ）も確定した。約１ｍｇのペプチドを１ｍｌの窒素ガス飽和水中に溶解し、この溶液の０．１ｍｌアリコートをエルマン試薬と反応させた。５−チオ−２−ニトロ安息香酸のモル吸光係数（１３．６×１０3）を用いて、遊離システイン−ＳＨを算出した。
【００３６】
担体上の２５個のＥＭＣＳ活性化アミノ基の各々と反応するのに十分な遊離−ＳＨを含有する量のペプチトを、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解し、暗化条件下でＥＭＣＳ活性化担体に滴下した。ペプチド溶液すべてを担体に付加した後、混合物を水−飽和窒素ガス雰囲気下で暗所で一夜インキュベートした。
０．２Ｍの重炭酸アンモニウムで平衡させたＧ５０セファデックスカラム上でのクロマトグラフィーにより、ＥＭＣＳを介して担体に結合したペプチドの抱合体を混合物の他の成分から分離した。カラム放出容積中に溶離した抱合体を凍結乾燥し、使用するまで２０℃でデシケーター保存した。
得られた抱合体は、重量増加、アミノ酸分析等を含めた当業者に既知の多数の方法により、ペプチド含量に関して特性化され得る。この方法により製造されたスペーサーを有するペプチド１および４ならびにジフテリアトキソイドの抱合体は、１００ＫＤ ＭＷの担体当たり５〜３５モルのペプチドという有効ペプチド／担体比を有することが確定され、すべてが被験動物の免疫感作のための免疫原として適切であると考えられた。好ましくは、１００ＫＤ ＭＷのＤＴ当たり１０〜３０モルの範囲のペプチドが有効な免疫応答を生じた。
【００３７】
方法Ｂ：好ましい方法では、ＤＴとカップリングしたＧＲＰ１およびＤＴとカップリングしたＧＲＰ４ペプチドを包含する抱合体を室温で以下のように調製した。精製したＤＴ（４００ｍｇ）を窒素ガスで飽和した２０ｍｌの０．５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．６中に溶解して、２０ｍｇ／ｍｌのＤＴ溶液を得た。ＤＴ溶液を６０ｍｌ暗琥珀色ガラス瓶（反応容器および濾過溜めとして役立つ）に入れた。ＥＭＣＳカップリング試薬（１２３．６ｍｇ）を２．０ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解した。ＥＭＣＳ溶液を連続的に攪拌しなから１５分間掛けてＤＴ溶液に滴下した。瓶に蓋をして、混合物を室温でさらに１時間４５分攪拌して、活性化ＤＴ（Ｍ−ＤＴ）を生成した。次に、ＸＭ５０ダイアフロー限外濾過膜を用いた操作マニュアルＩ−１１３Ｇ通りに、アミコンＴＦＣ１０型薄チャンネル限外濾過システムを用いたダイアフィルトレーションにより、Ｍ−ＤＴを精製した。Ｍ−ＤＴを４２０ｍｌのリン酸緩衝液の容積に対して２回洗浄し、毎回２０ｍｌに濃縮して、次に０．１ＭのＥＤＴＡを含有する４２０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝６．０に対して１回洗浄して、溶液を２０ｍｌに濃縮した。
【００３８】
ＧＲＰ１−ＤＴ抱合体を作製するために、２．０２ｍｌのＭ−ＤＴ溶液（２２．３ｍｇのＭ−ＤＴを含有）を１０ｍｌ暗琥珀色ガラスバイアルに入れた後、１３ｍｇのＧＲＰ１ペプチドをクエン酸緩衝液中に溶解して、４０ｍｇ／ｍｌのペプチドを生成し、攪拌しなからＭ−ＤＴ溶液に滴下した。ＧＲＰ４−ＤＴ抱合体を作製するために、２．２１ｍｌのＭ−ＤＴ溶液（２４．４ｍｇのＭ−ＤＴを含有）を１０ｍｌ暗琥珀色ガラスバイアルに入れた後、１３ｍｇのＧＲＰ４ペプチドをクエン酸緩衝液中に溶解して、４０ｍｇ／ｍｌペプチドを生成し、攪拌しながらＭ−ＤＴ溶液に滴下した。
【００３９】
反応を暗所で一夜進行させた。各々の抱合体を反応容器から取り出して、１２，０００〜１４，０００ＭＷ分離透析管中で、５回交換する５００ｍｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液に対して別々に透析した。各抱合体を凍結乾燥した。
【００４０】
次に、アミノ酸分析により抱合体を分析した結果、それらのペプチド対ＤＴの置換比はＧＲＰ１−ＤＴに関しては１０5ＭＷのＤＴ当たり２１．８ペプチド、ＧＲＰ４−ＤＴに関しては１０5ＭＷのＤＴ当たり２１．１ペプチドと確定された。
【００４１】
この方法により製造されたスペーサーを有するペプチド１および４ならびにＤＴの抱合体は、１００ＫＤ ＭＷの担体当たり５〜３５モルのペプチドという有効ペプチド／担体比を有し、すべてが免疫原として適切であると考えられる。有効免疫応答を生じるための好ましい比の範囲は、１００ＫＤ ＭＷのＤＴ当たり１０〜２５モルのペプチドである。
【００４２】
免疫原の調製
前記のようにＤＴと結合されたスペーサーを有するペプチド１またはペプチド４を含有する本発明の免疫原を用いて、ウサギを免疫感作した。以下のようにして、免疫原を調製した。抱合体を０．１５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．３中に溶解して３．７９ｍｇ／ｍｌの濃度とした。抱合体溶液をモンタニドＩＳＡ（７０３）アジュバント（Seppic，Inc.）に抱合体溶液：モンタニドＩＳＡ７０３＝３０：７０（ｗｔ：ｗｔ）比で付加した後、シルバーソンホモシナイサーを８，０００ＲＰＭで３分間用いて混合物を均質化し、１ｍｇ／ｍｌの抱合体を含有するエマルジョンを生成した。
【００４３】
免疫感作および標本収集
０．１ｍｇのＧＲＰ１−ＤＴまたはＧＲＰ４−ＤＴ抱合体から成る０．１ｍｌの免疫原をウサギに筋肉注射した。０および４週目に各ウサギに免疫原注射を施した。実験の６および８週目に、各ウサギから血液を採取した。各血液標本から血清を調製し、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体の存在を確定するための検定に使用するまで、−２０℃で保存した。
【００４４】
エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
固相ＥＬＩＳＡを用いて各免疫感作ウサギのペプチト１およびペプチド４に対して生じた抗血清の反応または交差反応に関してスクリーニングした。ポリスチレン９６ウエルプレート（IMMULON II，Dynatech）を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ９．５緩衝液中の１０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合されたペプチド１（「ＧＲＰ１−ＢＳＡ」）、またはＢＳＡに結合されたペプチド４（「ＧＲＰ４−ＢＳＡ」）抗原を２５μｌ／ウエルで被覆してＥＬＩＳＡを実施した。プレートを４℃で一夜インキュベートして、その後緩衝液中で洗浄した。
【００４５】
免疫感作したウザギから得られた抗血清を、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ血球凝集緩衝液、ｐＨ７．２中に１０-1〜１０-8の範囲に連続希釈した。ウエル当たり２５μｌの被験抗血清を各被験ペプチドとともに室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを緩衝液で十分洗浄して、結合しない抗体をすべて除去した。１％ＢＳＡ−ＦＴＡ希釈緩衝液中で１：１０００に希釈したビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２５μｌを用いて、室温で１時間各ウエルを処理した。非結合抗ウサギ試薬を除去するためにプレートを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ緩衝液中で１：１０００に希釈したアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体２５μｌを用いて室温で１時間、各ウエルをインキュベートした。非結合アビジン−アルカリホスファターゼ試薬を除去するためにプレートを十分洗浄し、０．０１％ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ９．８を含有する１０％ジエタノールアミン緩衝液中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（「ＰＮＰＰ」）２５μｌを用いてインキュベートした。４９０ｎｍ波長での反応の吸光度が０．８〜１．５の光学密度に達するまで、プレートを発現させた。ウサギにより産生される抗血清の特異性を試験するために、ウサギもＤＴを用いて、ＥＬＩＳＡ検定のために免疫感作し、担体に対して産生される抗血清の反応性を確定するための抗原としてＤＴでプレートを被覆した。
【００４６】
第２図は抗原としてペプチド１／ＧＲＰ１を用いたＥＬＩＳＡの結果を示し、第３図はペプチド４／ＧＲＰ４を用いたＥＬＩＳＡの結果を示している。第２図で観察されるように、ＥＬＩＳＡの結果は、ペプチド１−スペーサー−ＤＴ抱合体で免疫感作されたウサギが、抗血清の高（１：１００，０００）希釈でもペプチド１を結合する抗体により示されるように、ペプチド１と特異的に結合する高抗体力価を生じたことを示す。同様に、第３図は、ペプチド４−スペーサー−ＤＴ抱合体で免疫感作したウサギが高力価の抗ペプチド４抗体を産生したことを示している。第２図および第３図に認められるように、各ペプチドに対して免疫感作されたウサギは、低抗血清濃度で各ペプチドと特異的に結合した抗体を産生した。データは、抗ペプチド１および抗ペプチド４抗体が、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド１および４を結合する大きな能力を有することを示している。データは、本発明の抱合体によるウサギの免疫感作がそれぞれペプチド１およびペプチド４に対して強力な免疫応答を発揮することも示している。さらに、ペプチド−１またはペプチド−４抱合体のいずれかで免疫感作されたウサギは正常であると思われるし、そのように行動し、実験中は疾患または病理のいかなる症状も示さなかった。
【００４７】
実施例２
以下の実験を実施して、方法Ｂを用いて実施例１に記載したＳｅｒスペーサーを含有するＧＲＰ１−ＤＴペプチドに対してウサギ中に生じた抗体の特異性を確定した。一連の試験を実施して、ＧＲＰ１−ＤＴを用いた免疫感作により誘導され、ＧＲＰ１−Ｓｅｒセファロー−スカラム上での免疫吸着によりアフィニティー精製したされるウサギ抗体の特異性を評価した。
【００４８】
阻害ＥＬＩＳＡを用いて、ＧＲＰＩ−Ｓｅｒペプチドに関してアフィニティー精製した化抗体の特異性を評価した。検定は以下のように実施した：グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝９．５）中の抱合体の２μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを４℃で一夜インキュベートすることにより、ＧＲＰ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡ抱合体を９６ウエルプレート（Immulon U bottom）上に被覆した。アフィニティー精製した抗ＧＲＰ１Ａｂ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を種々の阻害剤（１：１０希釈シリーズ）と組合せて室温で１時間インキュベートした。阻害剤はＧＲＰ１−Ｓｅｒ、ＧＲＰ１ＥＰＴ、Ｓｅｒ、ヒトガストリン１７（１−９）−Ｓｅｒスペーサー（ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ）、ＧＲＰＩＥＰＴ＋Ｓｅｒおよび緩衝液（非阻害剤）を含んだ。インキュベーション緩衝液は、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％トゥイーン２０＋０．０２％ＮａＮ3で構成された。その後の工程は、ＢＳＡを含有しない同一緩衝液を使用した。９６ウエルプレートを洗浄して非結合ＧＲＰ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡを除去し、Ａｂ＋阻害剤混合物を付加した（５０μｌ／ウエル）。１時間後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ抱合体（Zymed）を付加した（１：２０００希釈）。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄して非結合試薬を除去し、５０μｌ／ウエルのｐＮＰＰ基質（Sigma）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を基質緩衝液（ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ2＋１０％シエタノールアミン＋０．０２％ＮａＮ3）中に付加した。６０分間インキュベーション後、ＭＲＸ読取り機（Dynatech Laboratories）で吸光度を測定した。標本は２回試験して、各濃度に関して平均を算出した。バックグラウンド結合（アフィニティー精製したウサギ抗ＧｎＲＨ抗体から確定）を全値から差し引いて、阻害剤を付加しないもの（抗ＧＲＰ１Ａｂ＋緩衝液）に対する阻害％を試験した各阻害剤に関して算出した：阻害％＝（１００）（１−（（Ａ非阻害−Ａ阻害）／Ａ非阻害））。式中、Ａ＝吸光度。結果を図４に示す。
【００４９】
第４図は、阻害剤濃度の一関数としての抗体結合の阻害％を示している。図から分かるように、ＧＲＰ１−ＳｅｒペプチドはＧＲＰ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡに対する抗体結合を十分に阻害した。Ｓｅｒスペーサー配列を含有しないＧＲＰ１ＥＰＴペプチドを用いて、ＧＲＰ１ＥＰＴ＋Ｓｅｒスペーサーの等モル混合物により、約６０％阻害が得られた。これらのペプチドが完全な阻害を生じることができなかったことは、抗体の割合が、ＧＲＰ１およびＳｅｒスペーサー配列の両方を包含するエピトープに対して特異的であったことを示唆する。Ｓｅｒスペーサー配列それ自体により、またはＳｅｒスペーサーを保有する非関連ペプチドであり、（ｈＧ１７のアミノ末端の９残基とそれに続くＳｅｒスペーサーで構成される、「ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ」）によっては、阻害は全く得られなかった。これらのＥＬＩＳＡ結果は、アフィニティー精製した抗体調製物がＧＲＰ１−Ｓｅｒペプチドに特異的であり、そして結合活性の６０％がペプチドのガストリン−受容体エピトープ成分に向けられる、ということを実証する。
【００５０】
実施例３
ＡＲ４２Ｊ腫瘍細胞（European Collection of Animal Cellcultures，Porton Down,UK）は、ラット膵臓腺癌に由来し、十分特性化されたＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体であることが知られている。従って、ＡＲ４２Ｊを試験して放射性配位子阻害によるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の発現およびｈＧ１７に関する受容体の特異性を確認した。１０％ＦＣＳ（Gemini Bioproducts）、２ｍＭグルタミン（JRH Biosciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（JRHB）および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Gemini Bioproducts）を加えた完全なＲＰＭ１ １６４０（Sigma）中７％ＣＯ2で、ＡＲ４２Ｊ細胞を３７℃で培養した。０．２５％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて１７５ｃｍ2Ｔフラスコ（Falcon Plastics）から細胞を回収した後、遠心分離（４００×ｇで１０分間）によってＰＢＳ（ＥＤＴＡなし）で２回洗浄した。細胞は全操作中０〜４℃に保った。単一細胞懸濁液を緩衝液中に調製し、細胞濃度を１０6細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液の１ｍｌアリコートを１２×７５ｍｍ培養管に付加し、次に細胞を遠心分離して、上清を捨てた。ヒトＧ１７（ｈＧ１７）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）を含有するか、またはペプチドを含有しないＰＢＳ（０．１ｍｌ／管）中に細胞を再懸濁した。ペプチド濃度は１．０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった。約２６，３００ＣＰＭ（比活性、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する125Ｉ−ｈＧ１７（ＮＥＮ）の０．１ｍｌアリコートを各管に付加した。試験管をボルテックスした後、１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、γ計数器（Wallac）で計数した。標本は２回試験した。バックグラウンド数を差し引いた後、各阻害剤による125Ｉ−ｈＧ１７結合の阻害％を以下の等式を用いて算出した。阻害％＝（１００）（１−（（ＣＰＭ非阻害−ＣＰＭ阻害）／ＣＰＭ非阻害））。
【００５１】
放射性配位子結合阻害試験の結果を第５図に示すが、この場合、個々の値の平均（±ＳＥ）で表した。図から分かるように、125Ｉ−ｈＧ１７のＡＲ４２Ｊ細胞との結合はｈＧ１７によって阻害された。阻害程度は、付加される阻害剤の量に伴って、試験したペプチドの最高濃度である１μｇのｈＧ１７／管で３２％阻害まで増大した。逆に、ＧｎＲＨは試験した２つの最高濃度で全く阻害を生じなかった（１００ｐｇＧｎＲＨで得られた６％阻害は非特異的であると考えられた）が、このことは、ｈＧ１７による阻害がガストリンに特異的であったことを示す。これらの結果から、ＡＲ４２Ｊ腫瘍細胞によるガストリン−受容体の細胞表面発現が確認された。
【００５２】
実施例４
ＧＲＰ１−Ｓｅｒ特異的抗体のＡＲ４２Ｊ細胞との結合を、免疫蛍光により評価した。ＡＲ４２Ｊ細胞を前記の実施例と同様に増殖させて、１７５ｃｍ2Ｔフラスコから細胞スクレーパーで回収し、遠心分離（４００×ｇで７分間）によって緩衝液（０．０２％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ）で２回洗浄した。全操作に関して、細胞を０〜４℃に保持した。単一細胞懸濁液を緩衝液中に調製し、細胞濃度を１０6細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を１．５ｍｌ微小遠心管に付加した（１ｍｌ／管）。遠心分離により細胞をペレット化し、上清を吸引した。ペプチド阻害剤を含有する（１．０ｍｇ／ｍｌ）緩衝液（０．１ｍｌ／試験管）中に細胞を再懸濁した。阻害剤はＧＲＰ１−Ｓｅｒ、ＧｎＲＨ、ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒおよび緩衝液（阻害剤なし）を含んだ。ウサギ抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ（１００μｇ／ｍｌ）、アフィニティー精製したウサギ抗ＤＴ（陰性対照、１００μｇ／ｍｌ）、マウス抗ＡＲ４２Ｊ抗血清（陽性対照、１：１００希釈、熱不活性化）または正常マウス血清を含む抗体を適切な管に付加し、内容物を混合した。細胞を時々攪拌しながら１時間インキュベートした。次に細胞を緩衝液で３回洗浄し、管当たり０．１ｍｌのフルオレセイン標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Antibodies Incorporated）（１：５０に希釈）を付加した。マウス血清で処理した細胞をフルオレセイン抗マウスＩｇＧ試薬（Zymed）を用いて発現させた。ポルテックスにより細胞を再懸濁した後、１時間インキュベートした。細胞を再び３回洗浄し、グリセロール：ＰＢＳ（１：１、ｖ：ｖ）中に再懸濁した（５０μｌ／管）。各試験管の内容物を用いて湿潤標本を調製し、レーバーラックス（Laborlux）１２蛍光顕微鏡（Leitz）を用いて細胞を調べた。蛍光を０〜４のスケールで評価し、０はバックグラウンド蛍光（正常マウス血清を用いて得られる）を示し、４は最大蛍光（マウス抗ＡＲ４２Ｊ陽性対照抗血清を用いて得られる）を示した。
【００５３】
免疫蛍光試験の結果を、表１に示す。表から分かるように、ペプチド阻害剤の非存在下で抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ抗体で処理したＡＲ４２Ｊ細胞は強力に蛍光を放ったか、これは、抗体が細胞と結合したことを示す。ウサギ抗ＤＴ抗体は蛍光染色を生じなかったが、これは、抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ抗体で観察された染色がウサギイムノグロブリンによる非特異的細胞表面結合の結果でなかったことを実証する。さらに、結合は、ＧＲＰ１−Ｓｅｒペプチドに特異的であることが示された。ＧＲＰ１−Ｓｅｒの付加は結合を十分に阻害したが、一方、ｈＧ１７（９）−ＳｅｒおよびＧｎＲＨを含む非関連ペプチドは阻害できなかった。ＧＲＰ１エピトープは、ガストリン−受容体の５〜２１の残基を包含するので、抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ抗体は、ＡＲ４２Ｊ細胞により発現されたガストリン−受容体に特異的であると結論づけられた。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例５
ＡＲ４２Ｊ細胞、継代数１６〜１８を、1０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2、空気中、湿度１００％で保持し、Ｔ７５フラスコ（Falcon，London，UK）中で集密度８０％に増殖させて、０．０２％ＥＤＴＡ処理後に継代して、付着細胞を懸濁液とした。細胞を１０、３０秒、３０分および１時間、ペプチド１を用いて調製したカラム中のアフィニティークロマトグラフィーにより精製されていた、実施例１に記載したような本発明のＣＣＫ−Ｂ／ガストリンペプチド１受容体免疫原を用いてウサギ中に生成した、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ａＧＲ）とともにインキュベートした。
【００５６】
標準技法を用いて、細胞を１％グルタルアルデヒドに１時間固定して、免疫電子顕微鏡（ImmunoEM）研究用に調製した。細胞懸濁液を２０００ｒｐｍで２分間を２回、遠心分離して、次に細胞ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞ペレットにＬＲ白色プラスチック樹脂を浸潤させた。７０〜９０ｎｍの厚みの超薄切片を切り出し、ピオロフオーム（Pioloform）被覆ニッケルグリッドに載せた。グリッドを０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma，Poole，Dorset）中の正常ヤギ血清（Dako，High Wycombe，UK）に入れて、室温で３０分間インキュベートした。グリッドをＰＢＳで濯いだ後、１％ＢＳＡ中に１：５０希釈した第二の抗体であるビオチン抱合ヤギ抗ウサギ抗体（金標識化）とともに室温で１時間インキュベートした。第二の抗体を用いずに、対照実験を実施した。最後にＰＢＳ洗浄した後、グリッドを飽和水性酢酸ウラニル中で３分間、そしてレイノルドクエン酸鉛中で３分間、対比染色した。細胞膜上、細胞質中、核膜上および核内の金粒子を計数した。２５個の細胞／グリッドを、別々の観察者で観察した。対照に関しては、ＡＲ４２Ｊ細胞を１秒間未満、抗体に曝露し、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を欠く肝細胞を用いた。正常ＩｇＧに曝露したＡＲ４２Ｊ細胞も、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体の非特異的結合を確定するための対照として用いた。これらの実験の結果を表２および第６図に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２および第６図に示したように、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合した免疫金抗体粒子は、腺癌細胞の形質膜、細胞質、核膜および核基質に局在し、このことはさらに、抗体／受容体抱合体が細胞に内在化されることを実証する。
【００５９】
表２でわかるように、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端に対する抗血清を用いた免疫ＥＭ研究は、１時間インキュベーション後、抗体受容体抱合体の１２％が細胞膜に関連し、３６．６％が細胞質内、７．９％が核膜、そして非常に意外なことに４３．５％が細胞核内であるので、免疫金標識化ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体の分布は迅速に内在化されることを示している。核内の強いＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫反応性の領域はクロマチン上に認められ、これはＤＮＡの調節に関する特異的な結合部位を示唆し得る。
【００６０】
金ビーズ（免疫金）と抱合した抗イムノグロブリンを用いたこれらの電子顕微鏡研究は、抗受容体／受容体抱合体の非常に迅速な回転が瘍細胞中で起こり、図６で分かるように、錯体が胞核内で検出可能であるのは抗体曝露後１０秒という早い時期である。
【００６１】
実施例６
腺癌細胞株、即ちＡＲ４２Ｊ、ＨＣＴ１１６、Ｃ１７０ＨＭ２、ＬｏＶｏ、ＳＴ１６およびＭＧＬＶＡ１を、実施例３に記載したようにin vitroで増殖させて回収した。３０×Ｔ−７５フラスコからの細胞を５ｍｌの均質化緩衝液（１ｍＭの炭酸水素ナトリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、１ｎＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０μｌのロイペプチン、１μＭのペプスタチン、５ｎＭのＥＤＴＡ［Sigma］）中に懸濁した。ホモジナイザー中で５秒間の継続時間の５回のバーストにより、均質化を実施した。核外膜に関しては、４℃で７分間、５００ｇで遠心分離することにより組織破砕屑をペレット化した。ペレットを捨て上清を４℃で５００ｇで遠心分離し、さらに破砕屑を除去した。上清を４℃で１時間、４８，０００９で再遠心分離した。核外膜調製物を含有するペレットをトリス／ＮＰ−４０溶液（０．１Ｍ ＴＲＩＺＭＡ、０．５％ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０［Sigma Chemical］）中に懸濁した。
【００６２】
核膜調製物に関しては、第二の均質化緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ＴＲＩＴＯＮ１００、０．３２Ｍのスクロース、３ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのスペルミンテトラヒドロクロリド、２ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭの塩酸ベゾミジン、３ｍＭのＥＧＴＡ塩酸アミノアセトニトリル［Sigma］）中で均質化後、組織破砕屑を４℃で１０分間、４００ｇで遠心分離してペレット化した。ペレットを、ＨＰＬＣ水中の５５％（０．２Ｍ）スクロース中に再懸濁した。この混合物を４℃で１時間、６０，０００ｇで回転させた。ペレットをＴＲＩＴＯＮ１００を含有しない均質化緩衝液中の０．４％ＮＯＮＩＤＥＴＰ４０で洗浄した。ペレットを４℃で１５分間、７００ｇで回転させて、ＴＲＩＴＯ、１００を含有しない均質化緩衝液中に再懸濁した。
【００６３】
ロウリー法（Pierceからのキットを使用）により、タンパク質含量を確定する。１０〜１５μｇのタンパク質を含有する標本を、トリス／グリシン緩衝液中の８〜１６％トリス／グリシン勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＡＧＥ（ノベックス（Novex）ＲおよびＤ系）に載せて、１２５定電圧、３６ｍＡで９０分間行った。ゲルを１０％氷酢酸中で１時間固定し、標本をニトロセルロース膜上でブロッティングした。膜を１％ＢＳＡ中で１時間インキュベートし、その後ＧＲＰ１抗血清（前吸収を用いて、または用いずに）を用いて１時間インキュベートした。基質としてジアミノ−ベジデンを用いて、アビジン：ビオチン−ペルオキシダーゼ錯体法により、抗体結合を検出した。ペプチド１に対して生じたウサギ抗血清（ウサギ抗ＧＲＰ１抗血清）を用いたウエスタンブロット分析結果を第７図および第８図に示す。
【００６４】
第７図に示すように、タンパク質分子量マーカーは、１１６、６６、４５および２９ｋＤａの範囲である。ブロットは、１つ（ＡＰ５ＬＶ）を除いて、試験したすべての腺癌細胞、即ちＨＣＴ１１６、Ｃ１７０ＨＭ２、ＬｏＶｏ、ＳＴ１６およびＭＧＬＶＡ１において、約４３ｋＤａに局在する顕著な抗ペプチド１免疫反応性バンドを示す。このタンパク質は、切頭形態のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対応する。いくつかの細胞株（ＨＣＴ１１６およびＣ１７０ＨＭ２）は、６０〜１００ｋＤａの分子量範囲の少なくとも３本のその他のバンドを示す。データは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体が、腫瘍細胞中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の種々のアイソフォームを認識し、結合し得ることを示す。
【００６５】
第８図はＣ１７０ＨＭ２およびＨＣＴ１１６腺癌細胞の核外膜（ＥＮＭ）および形質膜からのウエスタンブロットを示している。第８図に示したように、ＥＮＭ ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に関して試験した腺癌細胞株は２本の強く染色されたバンド、即ち約４３ｋＤａともう一つの約６６ｋＤａの存在を実証する。形質膜分画だけが染色された場合は、約６６ｋＤａの単一バンドが存在した。
【００６６】
従って、ウエスタンブロット試験により、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体が腺癌腫瘍細胞中に存在するという免疫ＥＭ結果が確認されるが、しかし免疫ＥＭ研究はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアイソフォーム間の識別をしない。データは、本発明の免疫原が、受容体の種々のアイソフォームを認識し、結合し得る抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を誘導することを示している。これは、これらの腫瘍の治療に有益であると思われる。
【００６７】
実施例７
Ｃ１７０ＨＭ２腺癌細胞をヌードマウスに腹腔内注入し、腫瘍を肝臓で増殖させた。対照マウスにはリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を注入し、実験マウスには抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を注入した。グループ１では、ペプチド１に対して生じたウサギ抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ウサギ抗ペプチド１、Ｒｂｔ＠ＧＲＰ１）０．５ｍｇを各マウスに毎日注入した。グループ２では、ペプチト４に対して生じたウサギ抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ウサギ抗ペプチド４、Ｒｂｔ＠ＧＲＰ４）０．５ｍｇを各マウスに毎日注入した。抗体注入後４０日間、マウスを調べ、屠殺して研究のために腫瘍を取り出した。腫瘍の重量、サイズおよび横断面積を標準技法により評価した。結果を第９図および第１０図に示す。
【００６８】
第９図および第１０図に示したように、処置しないマウスに結腸直腸腺癌細胞株Ｃ１７０ＨＭ２を移植すると、腫瘍の重量またはサイズおよび腫瘍の横断面積で確定した場合、大きい腫瘍塊が急速に増殖する。しかしなから、ウサギ抗ペプチド１またはウサギ抗ペプチド４抗体を動物に注入すると、何らかの検出可能な腫瘍を有する動物の数、ならびにそれらを有する動物における腫瘍の重量およびサイズに、対照と比較した場合に顕著な低減が生じる。平均腫瘍重量、平均腫瘍サイズまたは平均腫瘍数を算出する場合も、同じ効果が観察され得る。これらのデータを第１１図、第１２図、第１３図に示す。
【００６９】
腫瘍の数、重量およびサイズの中央値を算出することにより、集団内の分布のさらなる見識が得られる。結果を第１４図、第１５図および第１６図に示す。これらの図でわかるように、ウサギ抗ペプチド１免疫原は一貫して腫瘍増殖を抑制するのに、ウサギ抗ペプチド４より有効である。しかしなからウサギ抗ペプチド１およびウサギ抗ペプチド４抗体はともに、対照治療と比較した場合、強力な腫瘍抑制活性を示した。
【００７０】
実施例８
実施例７に記載したような方法により、しかしより多くの初期細胞接種物を用いて、結腸癌細胞株Ｃ１７０ＨＭ２を用いて、ヌードマウスにより大きい腫瘍負荷量を生じさせた。Ｃ１７０ＨＭ２は肝臓侵襲性異種移植片モデルである。対照および実験マウスは、実施例７に記載したように処置した。
抗体注入後４０日目に、マウスを屠殺して、肝臓腫瘍を取り出し、調べた。第１７図、第１８図および第１９図は、これらの実験結果を示す。第１７図は、対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体処置動物の平均および中央値肝腫瘍数を示している。データは、ウサギ抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（「ウサギ＠ＧＲＰ」）が肝臓中の転移腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることを示す。対照と比較して、ウサギ抗ペプチド１を用いたマウス肝臓における平均肝腫瘍数（スチューデントＴ検定）、ｐ＝０．００８４に、そして中央値肝腫瘍数、ｐ＝０．００１６（マン ホイットニー、Mann Whitney）に統計学的に有意な低減が認められる。抗ペプチド４抗体で処置したマウスも平均肝臓腫瘍数の低減を示すが、しかし、対照と比較した場合にこの動物の平均肝臓腫瘍数に差は認められなかった。
【００７１】
第１８図は、抗ペプチド１および抗ペプチド４抗体が、対照動物と比較して、肝臓転移の平均および中央値腫瘍重量も低減し得たことを示す。第１９図のデータは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置マウスも、対照動物と比較した場合に、肝臓腫瘍の平均および中央値横断面積の有意の低減を有したことを示している。
データは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、この癌の転移蔓延の主要部位を構成する、肝臓におけるガストリン依存性結腸癌の蔓延および増殖を制御するのに有効であることを示している。
【００７２】
実施例９
Ｃ１７０ＨＭ２細胞におけるＧＲＰ１免疫反応性を確認するために、これらの研究を実施した。研究の目的は、ＧＲＰ１に対して生じた抗血清の腫瘍局在化を評価し、そしてヌードマウスの肝臓内のＣ１７０ＨＭ２細胞の増殖に及ぼすその治療的効果を確定することであった。前記の実施例７と同様に、Ｃ１７０ＨＭ２細胞をヌードマウスに腹腔内注入した。ＧＲＰ１抗血清をウサギに生じさせた。
【００７３】
抗血清を125Ｉで放射能標識化して、尾部静脈注射により、樹立Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片とともにヌードマウスに投与した。対照マウスには、125Ｉ放射能標識化正常ウサギ血清を投与した。125Ｉ抗体の１回用量を注入後の種々の漸増時点でマウスを屠殺した。計数／分／組織１ｇ（ＣＰＭ／ｇ）として放射能を測定し、肝臓／肝臓腫瘍比を算出した。
【００７４】
第２０図は対照と比較した場合の肝臓腫瘍と結合した放射能標識化ウサギ抗ＧＲＰ１抗体を示すグラフである。図で分かるように、対照と比較して、より多くのウサギ抗ＧＲＰ１抗体が肝臓腫瘍組織と結合した。第２０図は、放射能標識化正常ウサギ血清およびＧＲＰ１抗血清の両方に関して、ｘ軸上の漸増時間に伴うｙ軸上での肝臓腫瘍／肝臓比をも示している。正常ウサギ血清は１日目からこの比が１に達し、これは５日目までずっと一定であった。これは、肝臓腫瘍および正常肝臓における放射能標識のレベルが等しいことを示す。ＧＲＰ１抗血清に関する比は累積して、５日目までに指数的に２に近づいた。これは、放射能標識化ＧＲＰ１抗血清が１７０ＨＭ２肝臓腫瘍内に特異的に局在することを示している。
【００７５】
実施例１０
Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片に及ぼすＧＲＰ１抗血清の治療的効果
細胞の腹腔内注入によりＣ１７０ＨＭ２腫瘍異種移植片は開始された。３つの異なる細胞接種物を用いて、３つのレベルの腫瘍負荷量を生じさせた。０日目から毎日、尾部静脈注射により受動的にＧＲＰ１抗血清を投与した。治療は４０日目に終了した。
【００７６】
腫瘍「取り込み率」に及ぼすＧＲＰ１抗血清の作用
評価した最初のパラメーターは、第２１図に示した肝臓内の平均腫瘍数であった。正常ウサギ抗血清処置対照を、細胞接種物を増大させてグループ分けした。
【００７７】
第２１図に示したように、対照群では、平均腫瘍数／肝臓は、１〜３の間であった。ＧＲＰ１抗血清処置群では、平均腫瘍数／肝臓は、３つの細胞接種物のすべてに関して１未満であり、これは３つの実験すべてに関して有意であった（接種物１、ｎ＝１８、ｐ＝０．００３；接種物２、ｎ＝１２、ｐ＝０．０００１；接種物３、ｎ＝２０、ｐ＝０．００６８、マンホイットニー分析）。
【００７８】
樹立腫瘍の腫瘍重量に及ぼすＧＲＰ１抗血清の作用
第２２図は３つの漸増細胞接種物に関する左パネルにおける正常ウサギ血清処置対照に関する平均腫瘍重量を示している。図はＧＲＰ１抗血清で処置後のヌードマウスの平均腫瘍重量も示している。平均肝臓重量は３つの細胞接種物のすべてに関して６０％低減したが、これは３つの実験すべてに関して有意であった（接種物１、ｐ＝０．００１６；接種物２、ｐ＝０．００８４；接種物３、ｐ＝０．０００１、マンホイットニー分析）。
【００７９】
ウエスタンブロッティングにより確定した場合のＣ１７０ＨＭ２異種移植片におけるＧＲＰ１免疫反応性
３つの実験の２つからのＣ１７０ＨＭ２異種移植片から、核外膜タンパク質を調製した。ＧＲＰ１抗血清を用いてウエスタンブロッティングにより、これらを分析した。第２３図は、正常ウサギ血清処置異種移植片２において、免疫反応性バンドが７４および５０ｋＤａに存在したことを示すウエスタンブロットの写真であって、前者のバンドが最も強い免疫反応性を示している。ＧＲＰ１抗血清処置異種移植片では、２本の免疫反応性バンドが中間バンドとともに存在するが、しかし対照異種移植片またはin vitroで増殖させた細胞には認められない。５０ｋＤａバンドは、最も強い免疫反応性を示している。これは、ＧＲＰ１抗血清処置異種移植片では、より大きい割合のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体が内在化形態として存在することを示している。
【００８０】
Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片の組織学的分析
第２４図は、ヌードマウスの肝臓を侵襲しているＣ１７０ＨＭ２異種移植片の顕微鏡写真である。腫瘍は一般に、肝臓を侵襲した場合に肝細胞を押し潰す、生育可能な前縁を有する壊死性中心で構成される。in-situハイブリダイゼーションにより可視化した陽性細胞を用いてタネル（Tunel）法により、Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍の生育可能な前縁で、アポトーシスの程度を測定した。第２５図はアポトーシス細胞がＧＲＰ１抗血清処置異種移植片中の生育可能腫瘍細胞中には存在するが、正常ウサギ血清処置腫瘍中には認められないことを示している。
【００８１】
データは、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端エピトープに対して生じた抗血清が肝臓侵襲性Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍内に選択的に局在することを示している。ＧＲＰ１エピトープの中和は、腫瘍「取り込み率」および樹立腫瘍の腫瘍負荷量全体の両方に及ぼす有意の効果を誘導した。この腫瘍阻害作用は、（ａ）ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体をブロックすることによって誘導される一般的細胞増殖抑制効果および／または（ｂ）アポトーシスを引き起こしうる、抗体が細胞の核を標的とする間接的効果によると思われる。
【００８２】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体およびその７つの膜内外ドメインの概略図を示す図である。
【図２】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド１に対する免疫原により免疫感作されたウサギにおいて生じた抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定からのデータを示す図である。
【図３】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド４に対する免疫原により免疫感作されたウサギにおいて生じた抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定からのデータを示す図である。
【図４】ＧＲＰＩ−ＤＴ免疫原に対して生じたアフィニティー精製した抗体の特異性を評価するために用いられた阻害ＥＬＩＳＡから得られたデータを示すグラフである。
【図５】ペプチド阻害剤による125Ｉ−ヒトＧ１７のＡＲ４２Ｊ細胞との結合の阻害に関するデータを示す棒グラフである。
【図６】免疫金標識化ＡＲ４−２Ｊ腫瘍細胞の細胞分布の棒グラフである。
【図７】ペプチド１に対して生じた抗体を用いた腺癌細胞の核膜からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析の写真である。
【図８】ペプチト１に対して生じた抗体を用いた腺癌細胞の核外および形質膜からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析の写真である。
【図９】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物のＣ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示すプロットグラフである。
【図１０】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物からのＣ１７０ＨＭ２腫瘍の横断面積を示すプロットグラフである。
【図１１】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物の平均Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１２】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物のＣ１７０ＨＭ２腫瘍の平均横断面積を示す棒グラフである。
【図１３】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物におけるＣ１７０ＨＭ２腫瘍の平均数を示す棒グラフである。
【図１４】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物の肝臓転移の中央値Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１５】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物からのＣ１７０ＨＭ２腫瘍の中央値横断面積を示す棒グラフである。
【図１６】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物における中央値Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍数を示す棒グラフである。
【図１７】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物における平均および中央値肝臓Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍数を示す棒グラフである。
【図１８】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物における平均および中央値肝臓Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１９】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物におけるＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍転移の横断面積に関する平均および中央値を示す棒グラフである。
【図２０】対照（正常ウサギ血清）および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍異種移植片における放射能標識化125Ｉ抗体の濃度を示すグラフである。
【図２１】対照および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスの異種移植片の肝臓当たりの平均Ｃ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍数を示す棒グラフである。
【図２２】対照および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスの肝臓異種移植片の平均Ｃ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図２３】対照および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍異種移植片タンパク質のウエスタンブロットを示す図である。
【図２４】対照マウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓異種移植片のヘマトキシリン／エオシン染色切片を示す光学顕微鏡で撮った組織切片の写真である。
【図２５】ウサギ抗ＧＲＰ１抗体で処理したマウスからのＣ１７０ＨＭ２肝臓異種移植片のヘマトキシリン／エオシン染色切片を示す光学顕微鏡で撮った組織切片の写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性組成物およびガストリン依存性腫瘍の治療のための免疫学的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホルモンであるガストリンは、その５カルボキシ末端アミノ酸を介して高い親和性でガストリン／コレシストキニン（ＣＣＫ）−Ｂ受容体と結合する。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体（レセプター）は、また種々の遺伝子の発現を制御する細胞内シグナル導入経路にＧタンパク質を介して連結される細胞質膜タンパク質である。
【０００３】
ガストリンは、テトラトリアコンタガストリン（Ｇ３４）とヘプタデカガストリン（Ｇ１７）の２つの形態で生じるペプチドホルモンであって、胃の幽門洞に位置する特殊化細胞であるＧ細胞により合成され、そして分泌される。ホルモンは循環血液中に分泌され、胃酸の分泌量に間接的または直接的に影響を及ぼす胃の中の特定の細胞、即ちエンテロクロマフィン様（ＥＣＬ）細胞および壁細胞と結合する。歴史的に、ガストリンホルモンは胃酸分泌の刺激と関連づけられてきた（Edkins,J.S．1905）（本明細書中で引用した参考文献の全引用は、発明の開示の末尾に提示される）。
【０００４】
近年、ガストリンが胃腸管内で栄養因子として作用することが可能であり（Johnson,L．1997）、そしてそれは胃腸癌（Watson et al.1989，Dickinson,C.J.1995）、ならびに肺の小細胞癌を含む非胃腸癌（Rehfeld et al.1989）の増殖を促し得るという証拠が蓄積されている。ガストリンの翻訳後プロセッシングでは、それはカルボキシ末端を介してガストリン／ＣＣＫ−Ｂ受容体と結合する「成熟」カルボキシアミド化形態である（Kopin et al.1992）。
【０００５】
いくつかの種類の腫瘍、例えば結腸直腸、胃、膵臓および肝細胞腺癌は、それらの形質膜中にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を保有し、そしてそれらはガストリンに反応して強力な細胞増殖性を有するということが示されている（Rehfeld,J.F．1972，Upp et al.1989およびWatson et al.1993）。さらに、もっと最近になって、これらの癌細胞の多くがガストリンの分泌をも行い、従って自律性増殖経路に影響を与えることが発見された（Van-Solinge et al.1993，Nemeth et al．1993およびSeva et al．1994）。
【０００６】
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は、７つの膜内外トメインを有し、ＣＣＫおよびガストリンの両方に対して等しい親和性を有するＧタンパク質結合受容体の一族に属する（Soll et al．1984）。この受容体は、それが脳中で主として見出されたために、ＣＣＫ Ｂ型受容体と命名された（Wank et al．1992）。その受容体はその後、胃の壁およびＥＣＬ細胞中の周辺ＣＣＫ／ガストリン受容体と同一であることが判明した（Nakata et al．1992）。この受容体は、多数の正常組織（Fourmy et al．1984、Grider et al．1990）および腫瘍組織（Singh et al．1990、Watson et al．1993）において十分特性化され、ラット膵臓腺癌細胞株ＡＲ４２Ｊを用いて大規模に研究された（Scemama et al．1987）。ＡＲ４２Ｊ ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡは、クローン化され、シーケンシングされており、そしてそれはラットおよびヒトの脳におけるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体とは９０％より多くのＤＮＡ配列が相同であり、イヌ壁細胞ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ｃＤＮＡとは８４％より多くの配列が相同であって（Wank,S.A．1995）、これは種間でも高度の配列相同性を実証している。
【０００７】
ペプチドホルモンＧ１７およびＧ３４は、正常細胞の細胞膜上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合する。しかしながら、Ｇ１７はガストリン依存性癌細胞の増殖を刺激するが、Ｇ３４はそうではないということが判明している。血清関連Ｇ１７は、特に、腫瘍細胞中でＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体により媒介される内分泌様式で（Watson et al．1993）結腸直腸腫瘍の増殖を刺激する能力を有する。ガストリン−１７は、その他のガストリンホルモン種を上回る、腫瘍細胞におけるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する親和性増大の可能性のために、結腸直腸腺癌の増殖を刺激する場合に特に関係があると考えられる（Rehfeld 1972および1993）。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体は、ヒト原発性結腸直腸腫瘍の５６．７％で高親和性形態で発現されることが判明した（Upp et al.1989）。このような腫瘍による前駆体ガストリンペプチドの内因性産生のために、オートクラインループの可能性も存在し得る、と仮定される（Van-Solinge et al．1993およびNemeth et al．1993）。その結果生じるＧ１７配位子／受容体抱合体は、細胞機能を調節するための二次メッセンジャーにより細胞増殖を刺激する（Ullrich et al.1990）。Ｇ１７のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体との結合は、ホスファチジルイノシトール分解の活性化、その結果生じる細胞内カルシウムイオン濃度増大を伴うプロテインキナーゼＣ活性化、ならびに細胞増殖の調節に関連があるとされたミトゲン活性化プロテインキナーゼによる、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ遺伝子の誘導を引き起こす（Tadisco et al.1995）。さらに、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合するガストリンは、ミトゲンシグナルの伝達にある役割を有し得るチロシンキナーゼｐｐ１２５ＦＡＤＫ（フォーカルアトヒーションキナーゼ）によるリン酸化におけるその後の増大に関連づけられている（Tanaguchi et al．1994）。
【０００８】
多数の高親和性ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体拮抗薬は、多数の実験的胃腸癌でインビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）の両方で療法的に評価されてきた。例えば、グルタミン酸誘導体であるプログルミド（Seva et al.190；Harrison et al.1990およびWatson et al.1991a）；トリプトファンのＮ−アシル誘導体であるベンゾトリプト；アスペルシリンの誘導体である、Ｌ−３６５，２６０（Bock et al．1989；およびＣＣＫのＣ末端ペンタペプチド配列に似せた分子であるＣＩ−９８８（Hughes et al．1990）は、in vitroとin vivoの両方で胃腸腫瘍の増殖に及ぼす外因性ガストリンの作用を有効に中和することが示されている（Watson et al．およびRomani et al．1994）。しかし、これらの拮抗薬は正常細胞におけるＧ３４およびＣＣＫのような受容体の可能性のあるすべての配位子の作用をブロックするので、深刻な毒性の副作用を有し、そして特異性を欠いている。近年、非常に有効且つ選択的ＣＣＫＢ／ガストリン受容体拮抗薬、例えばＹＭ０２２（Yuki et al.1997）およびＹＦ４７６（Takinami et al.1997）も記載されている。
【０００９】
プログルミドおよびベンゾトリプトは、前臨床試験で広範に評価されている。
これらの化合物に伴う主な問題はそれらの効力不足であり、Ｇ１７に取って代わるには相対的に高濃度を要する（Watson et al.,1992a;Watson et al.,1992b）。これにもかかわらず、プログルミドおよびベンゾトリプトは多数の細胞株の基本的およびガストリン刺激性増殖を阻害した（Seva et al.,1990;Watson et al.,1991a）。さらに、プログルミドは、ガストリン感受性マウス結腸腫瘍ＭＣ２６を有する異種移植マウスの生存を、対照動物の２５日から処置動物では３９日に増大した。
【００１０】
ガストリン／ＣＣＫＢ受容体に対するこの種のガストリン拮抗剤の低特異性のために、腫瘍増殖の阻害はガストリン拮抗薬による有効な制御であり得ない。さらに、ガストリンを認識し結合する細胞受容体は、試験したすべての阻害剤を結合するわけではない（Seva et al.1994）。したがって、受容体に結合するガストリンの完全な阻害がオートクライン増殖カスケードで起きない場合には、ガストリン拮抗薬は腫瘍増殖促進のこのメカニズムをブロックできないこともある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、免疫原性組成物およびガストリン依存性腫瘍の治療のための免疫学的方法を提供する。本方法は、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原または抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体による患者の能動性または受動性免疫感作を包含する。免疫原により産生される抗体は腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対して特異的であり、そして受容体に及ぼすガストリンの増殖促進作用をブロックする。抗体はペプチドホルモンがガストリン依存性腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合するのを阻止し、したがって腫瘍の増殖が抑制される。
【００１２】
さらに、意外にも、受容体と結合する場合に、受容体のＮＨ2末端に特異的な抗体は内在化され、腫瘍細胞の細胞質中に、そして核中に迅速に転位される。この内在化は、細胞を抗体に曝露後１０秒という初期に起こり得る。抗体／受容体抱合体のこの迅速な内在化は、また罹患腫瘍細胞にアポトーシスまたは自殺を起こさせる。
【００１３】
本発明の免疫原は、免疫原の免疫模擬部分として、ヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に由来する天然または合成ペプチドを包含する。免疫原は、免疫模擬ペプチドの末端に結合したスペーサーペプチド配列も包含し得る。免疫原はまた、タンパク質担体、例えばジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミン等と結合され得る。
一実施態様では、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する免疫感作の方法は、患者が本発明の免疫原により免疫感作される、能動性免疫感作を包含する。免疫原は、腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する抗体の産生を刺激する。
【００１４】
抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原により産生される抗体は腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合して、ペプチドホルモンの受容体との結合を有効に阻止し、それにより腫瘍細胞分裂のオートクライン増殖刺激経路を、そして結局は腫瘍の増殖を阻害する。
【００１５】
本発明の別の実施態様では、治療方法は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する抗体が腫瘍細胞のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合するのに十分な濃度で患者に投与され、抗体がペプチドホルモンの受容体との結合をブロックする受動性免疫感作を包含する。ホルモンのそれらの受容体との結合の阻止は、腫瘍細胞の増殖刺激経路を阻害し、それによりホルモン依存性腫瘍の増殖を阻害する。本発明のこの態様の好ましい実施例では、ヒトの療法のための抗体は、当業者に周知の方法により産生され得るキメラ、ヒト化またはヒトモノクローナル抗体であり得る。さらに、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、腫瘍細胞の殺害を増強するために、コレラ毒素のような細胞毒性分子と、または125Ｉおよび131Ｉのような放射性核種で標識化された放射性分子とさらに結合され得る。
【００１６】
本発明は、ガストリン反応性腫瘍を診断するための方法であり、本発明の抗体を用いた組織生検からのガストリン依存性（ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン含有）腫瘍の免疫化学的検出を包含する方法も提供する。本発明の特異的抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、標準免疫化学手法を用いて腫瘍組織中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を検出するためのビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼおよびフルオレセインのような化合物を利用する検出系により標識化され得る。
【００１７】
本発明はガストリン依存性腫瘍の診断方法であって、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を用いたガストリン依存性（ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体含有）腫瘍のin vivo検出を包含する方法も提供する。該方法は、結腸直腸腫瘍を有する患者に有効用量の放射能標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を静脈注射により投与し、標準シンチグラフィー走査法によりそれらの細胞膜と結合した抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を有する腫瘍細胞を画像化しまたは検出する工程を包含する。本発明のこの態様では、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は111インジウム、90イットリウムおよび131Ｉのような放射性核種で標識化される必要がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の方法は、ヒトを含めた動物におけるガストリンホルモン依存性腫瘍の治療に向けられ、そしてホルモンの増殖促進作用を阻害するために、ホルモンの受容体との結合を阻止するよう、腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合する、免疫感作患者において抗体を産生する抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を患者に投与することを包含する。さらに重要なのは、臨床的見地から受容体／抗ＧＲＰＩ抱合体が迅速に内在化され、細胞質を横断して核に入ることである。これは、明らかに罹患腫瘍細胞が自殺（アポトーシス）するのを誘発する。
【００１９】
免疫原は、免疫模擬物質として作用するヒトＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の天然または合成ペプチドを包含する。特に２つの合成ペプチドが免疫模擬物質として開発されている。ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ酸配列から発現されるこれらのペプチドは免疫原性であり、in vivoとin vitroの両方で腫瘍細胞の内因性ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と交差反応性である。ペプチド１はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体配列のアミノ酸５〜２１で構成される：ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（ペプチド１、配列表の配列番号：１）。ペプチド１は、受容体のアミノ末端を構成し、細胞膜の細胞外表面に位置する（第１図参照）。
【００２０】
別の実施態様では、免疫原は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の以下のアミノ酸配列から成るペプチド４を包含する：ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（ペプチト４、配列表の配列番号：２）。ペプチド４は受容体の四番目の細胞外ドメインの一部であり、それも形質膜の外側にある（第１図参照）。
【００２１】
免疫原は、タンパク質担体から離れて免疫模擬ペプチドを突き出し、リンパ球受容体を結合するその能力を増強するのに適した延長またはスペーサーペプチドも包含し得る。適切なスペーサーペプチドは、アミノ酸配列ＳＳＰＰＰＣ（セリン（Ｓｅｒ）スペーサー、配列表の配列番号：３）の配列を有する。しかしなからその他のスペーサーペプチドも適している。スペーサーの有無に関わらず、免疫模擬ペプチドを次に、カルボキシ末端のシステイン残基を介してタンパク質担体、例えばジフテリアトキソイドと結合させる。スペーサーペプチドはＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体由来ペプチドとは免疫学的に関連せず、したがって受容体由来ペプチドの特異的免疫原性を増強すべきであるが、しかし確定はしない。
【００２２】
患者における腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の存在および密度は、標識化抗受容体抗体を腫瘍生検標本から得られた標本と反応させることにより確定され得る。抗受容体抗体は、放射能トレーサー、染料または蛍光標識により標識化され得る。さらに、ガストリンに対する腫瘍細胞の反応性は標準技法を用いて患者の腫瘍生検標本からin vitroで評価され得る。腫瘍を有し、生検標本がＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体検定に陽性である患者は、本発明の方法による治療のための典型的候補者である。
【００２３】
０．００１〜２ｍｇの範囲の有効投与量の免疫原性組成物が、胃腸癌の治療のために患者に投与される。免疫原性組成物の有効投与量は、免疫感作後１〜３ヶ月目にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対して有効レベルの抗体力価から成る、患者における免疫反応を引き出し得るべきである。患者の免疫感作後、免疫原の有効性は、腫瘍の存在およびサイズを検出するために、標準臨床手法、例えば超音波および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）によりモニタリングされる。受容体に対する抗体力価レベルも、患者から採取した血液の標本からモニタリングし得る。ブースター免疫感作は、有効な抗体力価を保持する必要がある場合に投与されるべきである。ガストリン依存性癌、例えば胃、肝臓、膵臓および結腸直腸腺癌の本方法による有効な治療は、腫瘍増殖の阻害および腫瘍のサイズ低減を生じる。
【００２４】
本発明の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原により生じた抗体は、３つの可能なメカニズムによりガストリン依存性腫瘍に対する抗栄養作用を有し得る：（ｉ）その受容体と結合するガストリンの阻害、（ｉｉ）腫瘍細胞増殖のシグナル導入経路の分解または崩壊、および（ｉｉｉ）受容体／抗体抱合体が内在化され、核中に移動する細胞におけるアポトーシス（または細胞自殺）の誘発。
【００２５】
本発明の別の実施態様では、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体反応性腫瘍を有する患者に投与される。抗体は、腫瘍細胞上のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と特異的に結合する。抗体の受容体との結合は、細胞の膜中でのその配位子とのガストリンの結合を阻止し、したがって、ガストリン依存性腫瘍細胞に対する増殖シグナルが阻害され、腫瘍の増殖が抑制される。抗体は、好ましくはキメラまたはヒト化抗体、またはその断片であり、それらは標的受容体と有効に結合し、例えば米国特許第5,023,077号、第5,468,494号、第5,607,676号、第5,609,870号、第5,688,506号および第5,662,702号に開示されているような標準技法によって製造され得る。これらの外因的に製造された抗体も、腫瘍細胞の増殖のそれらによる阻害または腫瘍細胞への毒性物質の送達の観点から、それらの形質膜上にＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を保有する腫瘍細胞を殺害するのに有用であり得る。治療のための好ましい抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体は、それぞれＧＲＰ−１およびＧＲＰ−４として図１に示した受容体タンパク質の細胞外ドメイン１および４と反応性のものである。特に好ましいのは、ペプチド１および４に対応する受容体タンパク質のアミノ酸配列を特異的に認識し、結合する抗体である。免疫感作のこの方法での腫瘍増殖の阻害も超音波画像およびＭＲＩによりモニタリングされ、患者により必要な場合には、繰り返し免疫感作が投与される。
【００２６】
腫瘍細胞増殖を抑制し腫瘍細胞を殺害する場合の抗体の有効性は細胞毒性分子を抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体と抱合させることにより増強され得る。細胞毒性分子は、毒素、例えばコレラ毒素、リシン、α−アマニチン、あるいは125Ｉまたは131Ｉで標識化された放射性分子、あるいは化学療法薬、例えばシトシンアラビノシドまたは５−フルオロウリジンであり得る。
【００２７】
125Ｉまたは131Ｉで放射能標識化された抗体の他に、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体も111インジウムまたは90イットリウムのような放射性核種で標識化され得る。本発明のこの局面では、抗体は、これらの抗体を患者に投与することによるin vivoでのＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体保有腫瘍の検出および診断に、そしてＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体含有腫瘍細胞上の結合した抗体の検出に有用である。放射能標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体を腫瘍に到達させた後、注射の約１〜２時間後に、以前に開示されたような標準シンチグラフィー法を用いて、放射性「ホットスポット」を画像化する（Harrison's Principles of Internal Medicine,Isselbacher et al．eds．13thEd.1994）。
【００２８】
免疫原が患者におけるガストリン依存性腫瘍の治療のために投与される組成物は、種々の形態であり得る。これらの例としては、例えば固体、半固体および液体投与形態、例えば粉末、液体溶液、懸濁液、座薬、ならびに注射用および注入用溶液が挙げられる。好ましい形態は意図される投与方式および治療用途によっている。組成物は本発明の免疫原および適切な製薬上許容可能な成分を包含し、その他の医薬剤、担体、アジュバント、賦形剤等を含み得る。適切なアジュバントとして、ノルムラミルジペプチド（ノル−ＭＤＰ、Peninsula Labs.,CA）および油、例えば、モンタニドＩＳＡ７０３（Seppic，Inc.，Paris,France）が挙げられるが、これらは標準手法を用いて混合され得る。好ましくは、組成物は単位用量の形態である。免疫感作のために、あるいは一度にまたは一定期間中に薬物として投与される活性化合物の量は、治療される被験者、投与の方式および形態、ならびに治療担当医の判断による。
【００２９】
受動性免疫感作のための本発明の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、好ましくは製薬上許容可能な担体、例えば生理食塩水、例えばリン酸緩衝化生理食塩水を用いて、静脈注射により患者に投与される。
【００３０】
実施例１
ＧＲＰ１−ＤＴおよびＧＲＰ４−ＤＴ抱合体の調製
標準固体状態ペプチド合成により、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体ペプチドを調製した。特異的免疫反応を誘発し得る免疫原を作製するために、そのカルボキシ末端にスペーサー配列ＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列番号：３）を含有するペプチト１および４の各々を合成した。これらのペプチドをその後、下記の方法Ａまたは方法Ｂのいずれかにより、カップリング剤の一端にスクシンイミジルエステルを、そして他端にマレイミドを含有するヘテロ二官能性カップリング剤を用いて、スペーサーの末端ペプチドアミノ酸残基システインを介して、担体であるジフテリアトキソイド（「ＤＴ」）上に存在するアミノ基と結合させた。
【００３１】
方法Ａ：米国特許第5,023,077号で以前に記載されているように、前記のペプチド１または４と担体との抱合は、以下のように成し遂げられる。乾燥ペプチドを、３０倍のモル過剰量のジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）とともに、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０中に溶解した。溶液を水飽和窒素ガス雰囲気下で４時間攪拌した。０．２Ｍ酢酸で平衡させたＧ１０セファデックスカラム上でのクロマトグラフィーにより、還元システインを含有するペプチドを他の成分から分離した。ペプチドを凍結乾燥し、使用されるまで真空中で保存した。
【００３２】
分子量１０5の担体当たり約２５個の遊離アミノ基の活性化を成し遂げるのに十分な割合のヘテロ二官能性カップリング剤、例えばイプシロン−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（「ＥＭＣＳ」）で処理することにより、担体を活性化した。ジフテリアトキソイドの特定の例では、これは２０ｍｇのジフテリアトキソイドの各々に６．１８ｍｇのＥＭＣＳ（純度７５％）を付加するという量であった。
【００３３】
１ｍｌの０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．４５中にジフテリアトキソイドのアリコート各々２０ｍｇを溶解することにより、ジフテリアトキソイドの活性化を成し遂げた。６．１８ｍｇのＥＭＣＳのアリコートを０．２ｍｌのシメチルホルムアミド（「ＤＭＦ」）中に溶解した。暗化条件下で、ＥＭＣＳを攪拌しながら５０マイクロリットル（「μｌ」）量でＤＴに滴下した。暗所で２時間インキュベーション後、混合物を、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０で平衡させたＧ５０セファデックスカラム上でクロマトグラフィー処理した。
【００３４】
ＥＭＣＳ活性化ジフテリアトキソイドを含有する分画を、暗化条件下でＰＭ１０限外濾過膜上で濃縮した。ロウリー法またはブラッドフォード法のいずれかにより、濃縮物のタンパク質含量を確定した。システイン−ＨＣｌとともに活性化担体をインキュベートし、その後１０ｍＭのエルマン試薬５，５’シチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）と反応させることにより、担体のＥＭＣＳ含量を確定した。システイン−ＨＣｌを含有するブランク管とシステイン−ＨＣｌおよび担体を含有する標本管との間の光学密度差を、４１２ｎｍでの５−チオ−２−ニトロ安息香酸に関する１３．６×１０3というモル吸光係数を用いることによりＥＭＣＳ基含量に翻訳した。
【００３５】
エルマン試薬を用いてペプチドの還元システイン含量（−ＳＨ）も確定した。約１ｍｇのペプチドを１ｍｌの窒素ガス飽和水中に溶解し、この溶液の０．１ｍｌアリコートをエルマン試薬と反応させた。５−チオ−２−ニトロ安息香酸のモル吸光係数（１３．６×１０3）を用いて、遊離システイン−ＳＨを算出した。
【００３６】
担体上の２５個のＥＭＣＳ活性化アミノ基の各々と反応するのに十分な遊離−ＳＨを含有する量のペプチトを、０．１ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０中に溶解し、暗化条件下でＥＭＣＳ活性化担体に滴下した。ペプチド溶液すべてを担体に付加した後、混合物を水−飽和窒素ガス雰囲気下で暗所で一夜インキュベートした。
０．２Ｍの重炭酸アンモニウムで平衡させたＧ５０セファデックスカラム上でのクロマトグラフィーにより、ＥＭＣＳを介して担体に結合したペプチドの抱合体を混合物の他の成分から分離した。カラム放出容積中に溶離した抱合体を凍結乾燥し、使用するまで２０℃でデシケーター保存した。
得られた抱合体は、重量増加、アミノ酸分析等を含めた当業者に既知の多数の方法により、ペプチド含量に関して特性化され得る。この方法により製造されたスペーサーを有するペプチド１および４ならびにジフテリアトキソイドの抱合体は、１００ＫＤ ＭＷの担体当たり５〜３５モルのペプチドという有効ペプチド／担体比を有することが確定され、すべてが被験動物の免疫感作のための免疫原として適切であると考えられた。好ましくは、１００ＫＤ ＭＷのＤＴ当たり１０〜３０モルの範囲のペプチドが有効な免疫応答を生じた。
【００３７】
方法Ｂ：好ましい方法では、ＤＴとカップリングしたＧＲＰ１およびＤＴとカップリングしたＧＲＰ４ペプチドを包含する抱合体を室温で以下のように調製した。精製したＤＴ（４００ｍｇ）を窒素ガスで飽和した２０ｍｌの０．５Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ＝６．６中に溶解して、２０ｍｇ／ｍｌのＤＴ溶液を得た。ＤＴ溶液を６０ｍｌ暗琥珀色ガラス瓶（反応容器および濾過溜めとして役立つ）に入れた。ＥＭＣＳカップリング試薬（１２３．６ｍｇ）を２．０ｍｌのジメチルホルムアミド中に溶解した。ＥＭＣＳ溶液を連続的に攪拌しなから１５分間掛けてＤＴ溶液に滴下した。瓶に蓋をして、混合物を室温でさらに１時間４５分攪拌して、活性化ＤＴ（Ｍ−ＤＴ）を生成した。次に、ＸＭ５０ダイアフロー限外濾過膜を用いた操作マニュアルＩ−１１３Ｇ通りに、アミコンＴＦＣ１０型薄チャンネル限外濾過システムを用いたダイアフィルトレーションにより、Ｍ−ＤＴを精製した。Ｍ−ＤＴを４２０ｍｌのリン酸緩衝液の容積に対して２回洗浄し、毎回２０ｍｌに濃縮して、次に０．１ＭのＥＤＴＡを含有する４２０ｍｌの０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝６．０に対して１回洗浄して、溶液を２０ｍｌに濃縮した。
【００３８】
ＧＲＰ１−ＤＴ抱合体を作製するために、２．０２ｍｌのＭ−ＤＴ溶液（２２．３ｍｇのＭ−ＤＴを含有）を１０ｍｌ暗琥珀色ガラスバイアルに入れた後、１３ｍｇのＧＲＰ１ペプチドをクエン酸緩衝液中に溶解して、４０ｍｇ／ｍｌのペプチドを生成し、攪拌しなからＭ−ＤＴ溶液に滴下した。ＧＲＰ４−ＤＴ抱合体を作製するために、２．２１ｍｌのＭ−ＤＴ溶液（２４．４ｍｇのＭ−ＤＴを含有）を１０ｍｌ暗琥珀色ガラスバイアルに入れた後、１３ｍｇのＧＲＰ４ペプチドをクエン酸緩衝液中に溶解して、４０ｍｇ／ｍｌペプチドを生成し、攪拌しながらＭ−ＤＴ溶液に滴下した。
【００３９】
反応を暗所で一夜進行させた。各々の抱合体を反応容器から取り出して、１２，０００〜１４，０００ＭＷ分離透析管中で、５回交換する５００ｍｌの０．１Ｍ重炭酸アンモニウム溶液に対して別々に透析した。各抱合体を凍結乾燥した。
【００４０】
次に、アミノ酸分析により抱合体を分析した結果、それらのペプチド対ＤＴの置換比はＧＲＰ１−ＤＴに関しては１０5ＭＷのＤＴ当たり２１．８ペプチド、ＧＲＰ４−ＤＴに関しては１０5ＭＷのＤＴ当たり２１．１ペプチドと確定された。
【００４１】
この方法により製造されたスペーサーを有するペプチド１および４ならびにＤＴの抱合体は、１００ＫＤ ＭＷの担体当たり５〜３５モルのペプチドという有効ペプチド／担体比を有し、すべてが免疫原として適切であると考えられる。有効免疫応答を生じるための好ましい比の範囲は、１００ＫＤ ＭＷのＤＴ当たり１０〜２５モルのペプチドである。
【００４２】
免疫原の調製
前記のようにＤＴと結合されたスペーサーを有するペプチド１またはペプチド４を含有する本発明の免疫原を用いて、ウサギを免疫感作した。以下のようにして、免疫原を調製した。抱合体を０．１５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝化生理食塩水、ｐＨ７．３中に溶解して３．７９ｍｇ／ｍｌの濃度とした。抱合体溶液をモンタニドＩＳＡ（７０３）アジュバント（Seppic，Inc.）に抱合体溶液：モンタニドＩＳＡ７０３＝３０：７０（ｗｔ：ｗｔ）比で付加した後、シルバーソンホモシナイサーを８，０００ＲＰＭで３分間用いて混合物を均質化し、１ｍｇ／ｍｌの抱合体を含有するエマルジョンを生成した。
【００４３】
免疫感作および標本収集
０．１ｍｇのＧＲＰ１−ＤＴまたはＧＲＰ４−ＤＴ抱合体から成る０．１ｍｌの免疫原をウサギに筋肉注射した。０および４週目に各ウサギに免疫原注射を施した。実験の６および８週目に、各ウサギから血液を採取した。各血液標本から血清を調製し、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体の存在を確定するための検定に使用するまで、−２０℃で保存した。
【００４４】
エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）
固相ＥＬＩＳＡを用いて各免疫感作ウサギのペプチト１およびペプチド４に対して生じた抗血清の反応または交差反応に関してスクリーニングした。ポリスチレン９６ウエルプレート（IMMULON II，Dynatech）を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ９．５緩衝液中の１０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合されたペプチド１（「ＧＲＰ１−ＢＳＡ」）、またはＢＳＡに結合されたペプチド４（「ＧＲＰ４−ＢＳＡ」）抗原を２５μｌ／ウエルで被覆してＥＬＩＳＡを実施した。プレートを４℃で一夜インキュベートして、その後緩衝液中で洗浄した。
【００４５】
免疫感作したウザギから得られた抗血清を、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ血球凝集緩衝液、ｐＨ７．２中に１０-1〜１０-8の範囲に連続希釈した。ウエル当たり２５μｌの被験抗血清を各被験ペプチドとともに室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを緩衝液で十分洗浄して、結合しない抗体をすべて除去した。１％ＢＳＡ−ＦＴＡ希釈緩衝液中で１：１０００に希釈したビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）２５μｌを用いて、室温で１時間各ウエルを処理した。非結合抗ウサギ試薬を除去するためにプレートを洗浄後、１％ＢＳＡ−ＦＴＡ緩衝液中で１：１０００に希釈したアビジン−アルカリホスファターゼ抱合体２５μｌを用いて室温で１時間、各ウエルをインキュベートした。非結合アビジン−アルカリホスファターゼ試薬を除去するためにプレートを十分洗浄し、０．０１％ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ９．８を含有する１０％ジエタノールアミン緩衝液中の１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート（「ＰＮＰＰ」）２５μｌを用いてインキュベートした。４９０ｎｍ波長での反応の吸光度が０．８〜１．５の光学密度に達するまで、プレートを発現させた。ウサギにより産生される抗血清の特異性を試験するために、ウサギもＤＴを用いて、ＥＬＩＳＡ検定のために免疫感作し、担体に対して産生される抗血清の反応性を確定するための抗原としてＤＴでプレートを被覆した。
【００４６】
第２図は抗原としてペプチド１／ＧＲＰ１を用いたＥＬＩＳＡの結果を示し、第３図はペプチド４／ＧＲＰ４を用いたＥＬＩＳＡの結果を示している。第２図で観察されるように、ＥＬＩＳＡの結果は、ペプチド１−スペーサー−ＤＴ抱合体で免疫感作されたウサギが、抗血清の高（１：１００，０００）希釈でもペプチド１を結合する抗体により示されるように、ペプチド１と特異的に結合する高抗体力価を生じたことを示す。同様に、第３図は、ペプチド４−スペーサー−ＤＴ抱合体で免疫感作したウサギが高力価の抗ペプチド４抗体を産生したことを示している。第２図および第３図に認められるように、各ペプチドに対して免疫感作されたウサギは、低抗血清濃度で各ペプチドと特異的に結合した抗体を産生した。データは、抗ペプチド１および抗ペプチド４抗体が、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド１および４を結合する大きな能力を有することを示している。データは、本発明の抱合体によるウサギの免疫感作がそれぞれペプチド１およびペプチド４に対して強力な免疫応答を発揮することも示している。さらに、ペプチド−１またはペプチド−４抱合体のいずれかで免疫感作されたウサギは正常であると思われるし、そのように行動し、実験中は疾患または病理のいかなる症状も示さなかった。
【００４７】
実施例２
以下の実験を実施して、方法Ｂを用いて実施例１に記載したＳｅｒスペーサーを含有するＧＲＰ１−ＤＴペプチドに対してウサギ中に生じた抗体の特異性を確定した。一連の試験を実施して、ＧＲＰ１−ＤＴを用いた免疫感作により誘導され、ＧＲＰ１−Ｓｅｒセファロー−スカラム上での免疫吸着によりアフィニティー精製したされるウサギ抗体の特異性を評価した。
【００４８】
阻害ＥＬＩＳＡを用いて、ＧＲＰＩ−Ｓｅｒペプチドに関してアフィニティー精製した化抗体の特異性を評価した。検定は以下のように実施した：グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝９．５）中の抱合体の２μｇ／ｍｌ溶液５０μｌを４℃で一夜インキュベートすることにより、ＧＲＰ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡ抱合体を９６ウエルプレート（Immulon U bottom）上に被覆した。アフィニティー精製した抗ＧＲＰ１Ａｂ（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を種々の阻害剤（１：１０希釈シリーズ）と組合せて室温で１時間インキュベートした。阻害剤はＧＲＰ１−Ｓｅｒ、ＧＲＰ１ＥＰＴ、Ｓｅｒ、ヒトガストリン１７（１−９）−Ｓｅｒスペーサー（ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ）、ＧＲＰＩＥＰＴ＋Ｓｅｒおよび緩衝液（非阻害剤）を含んだ。インキュベーション緩衝液は、ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％トゥイーン２０＋０．０２％ＮａＮ3で構成された。その後の工程は、ＢＳＡを含有しない同一緩衝液を使用した。９６ウエルプレートを洗浄して非結合ＧＲＰ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡを除去し、Ａｂ＋阻害剤混合物を付加した（５０μｌ／ウエル）。１時間後、プレートを洗浄し、ヤギ抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ抱合体（Zymed）を付加した（１：２０００希釈）。１時間インキュベーション後、プレートを洗浄して非結合試薬を除去し、５０μｌ／ウエルのｐＮＰＰ基質（Sigma）溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を基質緩衝液（ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌＭｇＣｌ2＋１０％シエタノールアミン＋０．０２％ＮａＮ3）中に付加した。６０分間インキュベーション後、ＭＲＸ読取り機（Dynatech Laboratories）で吸光度を測定した。標本は２回試験して、各濃度に関して平均を算出した。バックグラウンド結合（アフィニティー精製したウサギ抗ＧｎＲＨ抗体から確定）を全値から差し引いて、阻害剤を付加しないもの（抗ＧＲＰ１Ａｂ＋緩衝液）に対する阻害％を試験した各阻害剤に関して算出した：阻害％＝（１００）（１−（（Ａ非阻害−Ａ阻害）／Ａ非阻害））。式中、Ａ＝吸光度。結果を図４に示す。
【００４９】
第４図は、阻害剤濃度の一関数としての抗体結合の阻害％を示している。図から分かるように、ＧＲＰ１−ＳｅｒペプチドはＧＲＰ１−Ｓｅｒ−ＢＳＡに対する抗体結合を十分に阻害した。Ｓｅｒスペーサー配列を含有しないＧＲＰ１ＥＰＴペプチドを用いて、ＧＲＰ１ＥＰＴ＋Ｓｅｒスペーサーの等モル混合物により、約６０％阻害が得られた。これらのペプチドが完全な阻害を生じることができなかったことは、抗体の割合が、ＧＲＰ１およびＳｅｒスペーサー配列の両方を包含するエピトープに対して特異的であったことを示唆する。Ｓｅｒスペーサー配列それ自体により、またはＳｅｒスペーサーを保有する非関連ペプチドであり、（ｈＧ１７のアミノ末端の９残基とそれに続くＳｅｒスペーサーで構成される、「ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒ」）によっては、阻害は全く得られなかった。これらのＥＬＩＳＡ結果は、アフィニティー精製した抗体調製物がＧＲＰ１−Ｓｅｒペプチドに特異的であり、そして結合活性の６０％がペプチドのガストリン−受容体エピトープ成分に向けられる、ということを実証する。
【００５０】
実施例３
ＡＲ４２Ｊ腫瘍細胞（European Collection of Animal Cellcultures，Porton Down,UK）は、ラット膵臓腺癌に由来し、十分特性化されたＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体であることが知られている。従って、ＡＲ４２Ｊを試験して放射性配位子阻害によるＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の発現およびｈＧ１７に関する受容体の特異性を確認した。１０％ＦＣＳ（Gemini Bioproducts）、２ｍＭグルタミン（JRH Biosciences）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（JRHB）および５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Gemini Bioproducts）を加えた完全なＲＰＭ１ １６４０（Sigma）中７％ＣＯ2で、ＡＲ４２Ｊ細胞を３７℃で培養した。０．２５％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳを用いて１７５ｃｍ2Ｔフラスコ（Falcon Plastics）から細胞を回収した後、遠心分離（４００×ｇで１０分間）によってＰＢＳ（ＥＤＴＡなし）で２回洗浄した。細胞は全操作中０〜４℃に保った。単一細胞懸濁液を緩衝液中に調製し、細胞濃度を１０6細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液の１ｍｌアリコートを１２×７５ｍｍ培養管に付加し、次に細胞を遠心分離して、上清を捨てた。ヒトＧ１７（ｈＧ１７）、ゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）を含有するか、またはペプチドを含有しないＰＢＳ（０．１ｍｌ／管）中に細胞を再懸濁した。ペプチド濃度は１．０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった。約２６，３００ＣＰＭ（比活性、２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する125Ｉ−ｈＧ１７（ＮＥＮ）の０．１ｍｌアリコートを各管に付加した。試験管をボルテックスした後、１５分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、γ計数器（Wallac）で計数した。標本は２回試験した。バックグラウンド数を差し引いた後、各阻害剤による125Ｉ−ｈＧ１７結合の阻害％を以下の等式を用いて算出した。阻害％＝（１００）（１−（（ＣＰＭ非阻害−ＣＰＭ阻害）／ＣＰＭ非阻害））。
【００５１】
放射性配位子結合阻害試験の結果を第５図に示すが、この場合、個々の値の平均（±ＳＥ）で表した。図から分かるように、125Ｉ−ｈＧ１７のＡＲ４２Ｊ細胞との結合はｈＧ１７によって阻害された。阻害程度は、付加される阻害剤の量に伴って、試験したペプチドの最高濃度である１μｇのｈＧ１７／管で３２％阻害まで増大した。逆に、ＧｎＲＨは試験した２つの最高濃度で全く阻害を生じなかった（１００ｐｇＧｎＲＨで得られた６％阻害は非特異的であると考えられた）が、このことは、ｈＧ１７による阻害がガストリンに特異的であったことを示す。これらの結果から、ＡＲ４２Ｊ腫瘍細胞によるガストリン−受容体の細胞表面発現が確認された。
【００５２】
実施例４
ＧＲＰ１−Ｓｅｒ特異的抗体のＡＲ４２Ｊ細胞との結合を、免疫蛍光により評価した。ＡＲ４２Ｊ細胞を前記の実施例と同様に増殖させて、１７５ｃｍ2Ｔフラスコから細胞スクレーパーで回収し、遠心分離（４００×ｇで７分間）によって緩衝液（０．０２％ＮａＮ3を含有するＰＢＳ）で２回洗浄した。全操作に関して、細胞を０〜４℃に保持した。単一細胞懸濁液を緩衝液中に調製し、細胞濃度を１０6細胞／ｍｌに調整した。細胞懸濁液を１．５ｍｌ微小遠心管に付加した（１ｍｌ／管）。遠心分離により細胞をペレット化し、上清を吸引した。ペプチド阻害剤を含有する（１．０ｍｇ／ｍｌ）緩衝液（０．１ｍｌ／試験管）中に細胞を再懸濁した。阻害剤はＧＲＰ１−Ｓｅｒ、ＧｎＲＨ、ｈＧ１７（９）−Ｓｅｒおよび緩衝液（阻害剤なし）を含んだ。ウサギ抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ（１００μｇ／ｍｌ）、アフィニティー精製したウサギ抗ＤＴ（陰性対照、１００μｇ／ｍｌ）、マウス抗ＡＲ４２Ｊ抗血清（陽性対照、１：１００希釈、熱不活性化）または正常マウス血清を含む抗体を適切な管に付加し、内容物を混合した。細胞を時々攪拌しながら１時間インキュベートした。次に細胞を緩衝液で３回洗浄し、管当たり０．１ｍｌのフルオレセイン標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Antibodies Incorporated）（１：５０に希釈）を付加した。マウス血清で処理した細胞をフルオレセイン抗マウスＩｇＧ試薬（Zymed）を用いて発現させた。ポルテックスにより細胞を再懸濁した後、１時間インキュベートした。細胞を再び３回洗浄し、グリセロール：ＰＢＳ（１：１、ｖ：ｖ）中に再懸濁した（５０μｌ／管）。各試験管の内容物を用いて湿潤標本を調製し、レーバーラックス（Laborlux）１２蛍光顕微鏡（Leitz）を用いて細胞を調べた。蛍光を０〜４のスケールで評価し、０はバックグラウンド蛍光（正常マウス血清を用いて得られる）を示し、４は最大蛍光（マウス抗ＡＲ４２Ｊ陽性対照抗血清を用いて得られる）を示した。
【００５３】
免疫蛍光試験の結果を、表１に示す。表から分かるように、ペプチド阻害剤の非存在下で抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ抗体で処理したＡＲ４２Ｊ細胞は強力に蛍光を放ったか、これは、抗体が細胞と結合したことを示す。ウサギ抗ＤＴ抗体は蛍光染色を生じなかったが、これは、抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ抗体で観察された染色がウサギイムノグロブリンによる非特異的細胞表面結合の結果でなかったことを実証する。さらに、結合は、ＧＲＰ１−Ｓｅｒペプチドに特異的であることが示された。ＧＲＰ１−Ｓｅｒの付加は結合を十分に阻害したが、一方、ｈＧ１７（９）−ＳｅｒおよびＧｎＲＨを含む非関連ペプチドは阻害できなかった。ＧＲＰ１エピトープは、ガストリン−受容体の５〜２１の残基を包含するので、抗ＧＲＰ１−Ｓｅｒ抗体は、ＡＲ４２Ｊ細胞により発現されたガストリン−受容体に特異的であると結論づけられた。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例５
ＡＲ４２Ｊ細胞、継代数１６〜１８を、1０％ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2、空気中、湿度１００％で保持し、Ｔ７５フラスコ（Falcon，London，UK）中で集密度８０％に増殖させて、０．０２％ＥＤＴＡ処理後に継代して、付着細胞を懸濁液とした。細胞を１０、３０秒、３０分および１時間、ペプチド１を用いて調製したカラム中のアフィニティークロマトグラフィーにより精製されていた、実施例１に記載したような本発明のＣＣＫ−Ｂ／ガストリンペプチド１受容体免疫原を用いてウサギ中に生成した、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ａＧＲ）とともにインキュベートした。
【００５６】
標準技法を用いて、細胞を１％グルタルアルデヒドに１時間固定して、免疫電子顕微鏡（ImmunoEM）研究用に調製した。細胞懸濁液を２０００ｒｐｍで２分間を２回、遠心分離して、次に細胞ペレットをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞ペレットにＬＲ白色プラスチック樹脂を浸潤させた。７０〜９０ｎｍの厚みの超薄切片を切り出し、ピオロフオーム（Pioloform）被覆ニッケルグリッドに載せた。グリッドを０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma，Poole，Dorset）中の正常ヤギ血清（Dako，High Wycombe，UK）に入れて、室温で３０分間インキュベートした。グリッドをＰＢＳで濯いだ後、１％ＢＳＡ中に１：５０希釈した第二の抗体であるビオチン抱合ヤギ抗ウサギ抗体（金標識化）とともに室温で１時間インキュベートした。第二の抗体を用いずに、対照実験を実施した。最後にＰＢＳ洗浄した後、グリッドを飽和水性酢酸ウラニル中で３分間、そしてレイノルドクエン酸鉛中で３分間、対比染色した。細胞膜上、細胞質中、核膜上および核内の金粒子を計数した。２５個の細胞／グリッドを、別々の観察者で観察した。対照に関しては、ＡＲ４２Ｊ細胞を１秒間未満、抗体に曝露し、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を欠く肝細胞を用いた。正常ＩｇＧに曝露したＡＲ４２Ｊ細胞も、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体の非特異的結合を確定するための対照として用いた。これらの実験の結果を表２および第６図に示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
表２および第６図に示したように、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体と結合した免疫金抗体粒子は、腺癌細胞の形質膜、細胞質、核膜および核基質に局在し、このことはさらに、抗体／受容体抱合体が細胞に内在化されることを実証する。
【００５９】
表２でわかるように、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端に対する抗血清を用いた免疫ＥＭ研究は、１時間インキュベーション後、抗体受容体抱合体の１２％が細胞膜に関連し、３６．６％が細胞質内、７．９％が核膜、そして非常に意外なことに４３．５％が細胞核内であるので、免疫金標識化ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体の分布は迅速に内在化されることを示している。核内の強いＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫反応性の領域はクロマチン上に認められ、これはＤＮＡの調節に関する特異的な結合部位を示唆し得る。
【００６０】
金ビーズ（免疫金）と抱合した抗イムノグロブリンを用いたこれらの電子顕微鏡研究は、抗受容体／受容体抱合体の非常に迅速な回転が瘍細胞中で起こり、図６で分かるように、錯体が胞核内で検出可能であるのは抗体曝露後１０秒という早い時期である。
【００６１】
実施例６
腺癌細胞株、即ちＡＲ４２Ｊ、ＨＣＴ１１６、Ｃ１７０ＨＭ２、ＬｏＶｏ、ＳＴ１６およびＭＧＬＶＡ１を、実施例３に記載したようにin vitroで増殖させて回収した。３０×Ｔ−７５フラスコからの細胞を５ｍｌの均質化緩衝液（１ｍＭの炭酸水素ナトリウム、２ｍＭの塩化マグネシウム、１ｎＭのフッ化フェニルメチルスルホニル、４０ｍＭの塩化ナトリウム、１０μｌのロイペプチン、１μＭのペプスタチン、５ｎＭのＥＤＴＡ［Sigma］）中に懸濁した。ホモジナイザー中で５秒間の継続時間の５回のバーストにより、均質化を実施した。核外膜に関しては、４℃で７分間、５００ｇで遠心分離することにより組織破砕屑をペレット化した。ペレットを捨て上清を４℃で５００ｇで遠心分離し、さらに破砕屑を除去した。上清を４℃で１時間、４８，０００９で再遠心分離した。核外膜調製物を含有するペレットをトリス／ＮＰ−４０溶液（０．１Ｍ ＴＲＩＺＭＡ、０．５％ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ４０［Sigma Chemical］）中に懸濁した。
【００６２】
核膜調製物に関しては、第二の均質化緩衝液（２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ＴＲＩＴＯＮ１００、０．３２Ｍのスクロース、３ｍＭのＭｇＣｌ2、２ｍＭのＥＧＴＡ、０．１ｍＭのスペルミンテトラヒドロクロリド、２ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍＭの塩酸ベゾミジン、３ｍＭのＥＧＴＡ塩酸アミノアセトニトリル［Sigma］）中で均質化後、組織破砕屑を４℃で１０分間、４００ｇで遠心分離してペレット化した。ペレットを、ＨＰＬＣ水中の５５％（０．２Ｍ）スクロース中に再懸濁した。この混合物を４℃で１時間、６０，０００ｇで回転させた。ペレットをＴＲＩＴＯＮ１００を含有しない均質化緩衝液中の０．４％ＮＯＮＩＤＥＴＰ４０で洗浄した。ペレットを４℃で１５分間、７００ｇで回転させて、ＴＲＩＴＯ、１００を含有しない均質化緩衝液中に再懸濁した。
【００６３】
ロウリー法（Pierceからのキットを使用）により、タンパク質含量を確定する。１０〜１５μｇのタンパク質を含有する標本を、トリス／グリシン緩衝液中の８〜１６％トリス／グリシン勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＡＧＥ（ノベックス（Novex）ＲおよびＤ系）に載せて、１２５定電圧、３６ｍＡで９０分間行った。ゲルを１０％氷酢酸中で１時間固定し、標本をニトロセルロース膜上でブロッティングした。膜を１％ＢＳＡ中で１時間インキュベートし、その後ＧＲＰ１抗血清（前吸収を用いて、または用いずに）を用いて１時間インキュベートした。基質としてジアミノ−ベジデンを用いて、アビジン：ビオチン−ペルオキシダーゼ錯体法により、抗体結合を検出した。ペプチド１に対して生じたウサギ抗血清（ウサギ抗ＧＲＰ１抗血清）を用いたウエスタンブロット分析結果を第７図および第８図に示す。
【００６４】
第７図に示すように、タンパク質分子量マーカーは、１１６、６６、４５および２９ｋＤａの範囲である。ブロットは、１つ（ＡＰ５ＬＶ）を除いて、試験したすべての腺癌細胞、即ちＨＣＴ１１６、Ｃ１７０ＨＭ２、ＬｏＶｏ、ＳＴ１６およびＭＧＬＶＡ１において、約４３ｋＤａに局在する顕著な抗ペプチド１免疫反応性バンドを示す。このタンパク質は、切頭形態のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対応する。いくつかの細胞株（ＨＣＴ１１６およびＣ１７０ＨＭ２）は、６０〜１００ｋＤａの分子量範囲の少なくとも３本のその他のバンドを示す。データは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体が、腫瘍細胞中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体の種々のアイソフォームを認識し、結合し得ることを示す。
【００６５】
第８図はＣ１７０ＨＭ２およびＨＣＴ１１６腺癌細胞の核外膜（ＥＮＭ）および形質膜からのウエスタンブロットを示している。第８図に示したように、ＥＮＭ ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に関して試験した腺癌細胞株は２本の強く染色されたバンド、即ち約４３ｋＤａともう一つの約６６ｋＤａの存在を実証する。形質膜分画だけが染色された場合は、約６６ｋＤａの単一バンドが存在した。
【００６６】
従って、ウエスタンブロット試験により、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体が腺癌腫瘍細胞中に存在するという免疫ＥＭ結果が確認されるが、しかし免疫ＥＭ研究はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアイソフォーム間の識別をしない。データは、本発明の免疫原が、受容体の種々のアイソフォームを認識し、結合し得る抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を誘導することを示している。これは、これらの腫瘍の治療に有益であると思われる。
【００６７】
実施例７
Ｃ１７０ＨＭ２腺癌細胞をヌードマウスに腹腔内注入し、腫瘍を肝臓で増殖させた。対照マウスにはリン酸緩衝生理食塩水溶液（ＰＢＳ）を注入し、実験マウスには抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を注入した。グループ１では、ペプチド１に対して生じたウサギ抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ウサギ抗ペプチド１、Ｒｂｔ＠ＧＲＰ１）０．５ｍｇを各マウスに毎日注入した。グループ２では、ペプチト４に対して生じたウサギ抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（ウサギ抗ペプチド４、Ｒｂｔ＠ＧＲＰ４）０．５ｍｇを各マウスに毎日注入した。抗体注入後４０日間、マウスを調べ、屠殺して研究のために腫瘍を取り出した。腫瘍の重量、サイズおよび横断面積を標準技法により評価した。結果を第９図および第１０図に示す。
【００６８】
第９図および第１０図に示したように、処置しないマウスに結腸直腸腺癌細胞株Ｃ１７０ＨＭ２を移植すると、腫瘍の重量またはサイズおよび腫瘍の横断面積で確定した場合、大きい腫瘍塊が急速に増殖する。しかしなから、ウサギ抗ペプチド１またはウサギ抗ペプチド４抗体を動物に注入すると、何らかの検出可能な腫瘍を有する動物の数、ならびにそれらを有する動物における腫瘍の重量およびサイズに、対照と比較した場合に顕著な低減が生じる。平均腫瘍重量、平均腫瘍サイズまたは平均腫瘍数を算出する場合も、同じ効果が観察され得る。これらのデータを第１１図、第１２図、第１３図に示す。
【００６９】
腫瘍の数、重量およびサイズの中央値を算出することにより、集団内の分布のさらなる見識が得られる。結果を第１４図、第１５図および第１６図に示す。これらの図でわかるように、ウサギ抗ペプチド１免疫原は一貫して腫瘍増殖を抑制するのに、ウサギ抗ペプチド４より有効である。しかしなからウサギ抗ペプチド１およびウサギ抗ペプチド４抗体はともに、対照治療と比較した場合、強力な腫瘍抑制活性を示した。
【００７０】
実施例８
実施例７に記載したような方法により、しかしより多くの初期細胞接種物を用いて、結腸癌細胞株Ｃ１７０ＨＭ２を用いて、ヌードマウスにより大きい腫瘍負荷量を生じさせた。Ｃ１７０ＨＭ２は肝臓侵襲性異種移植片モデルである。対照および実験マウスは、実施例７に記載したように処置した。
抗体注入後４０日目に、マウスを屠殺して、肝臓腫瘍を取り出し、調べた。第１７図、第１８図および第１９図は、これらの実験結果を示す。第１７図は、対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体処置動物の平均および中央値肝腫瘍数を示している。データは、ウサギ抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体（「ウサギ＠ＧＲＰ」）が肝臓中の転移腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることを示す。対照と比較して、ウサギ抗ペプチド１を用いたマウス肝臓における平均肝腫瘍数（スチューデントＴ検定）、ｐ＝０．００８４に、そして中央値肝腫瘍数、ｐ＝０．００１６（マン ホイットニー、Mann Whitney）に統計学的に有意な低減が認められる。抗ペプチド４抗体で処置したマウスも平均肝臓腫瘍数の低減を示すが、しかし、対照と比較した場合にこの動物の平均肝臓腫瘍数に差は認められなかった。
【００７１】
第１８図は、抗ペプチド１および抗ペプチド４抗体が、対照動物と比較して、肝臓転移の平均および中央値腫瘍重量も低減し得たことを示す。第１９図のデータは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処置マウスも、対照動物と比較した場合に、肝臓腫瘍の平均および中央値横断面積の有意の低減を有したことを示している。
データは、抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は、この癌の転移蔓延の主要部位を構成する、肝臓におけるガストリン依存性結腸癌の蔓延および増殖を制御するのに有効であることを示している。
【００７２】
実施例９
Ｃ１７０ＨＭ２細胞におけるＧＲＰ１免疫反応性を確認するために、これらの研究を実施した。研究の目的は、ＧＲＰ１に対して生じた抗血清の腫瘍局在化を評価し、そしてヌードマウスの肝臓内のＣ１７０ＨＭ２細胞の増殖に及ぼすその治療的効果を確定することであった。前記の実施例７と同様に、Ｃ１７０ＨＭ２細胞をヌードマウスに腹腔内注入した。ＧＲＰ１抗血清をウサギに生じさせた。
【００７３】
抗血清を125Ｉで放射能標識化して、尾部静脈注射により、樹立Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片とともにヌードマウスに投与した。対照マウスには、125Ｉ放射能標識化正常ウサギ血清を投与した。125Ｉ抗体の１回用量を注入後の種々の漸増時点でマウスを屠殺した。計数／分／組織１ｇ（ＣＰＭ／ｇ）として放射能を測定し、肝臓／肝臓腫瘍比を算出した。
【００７４】
第２０図は対照と比較した場合の肝臓腫瘍と結合した放射能標識化ウサギ抗ＧＲＰ１抗体を示すグラフである。図で分かるように、対照と比較して、より多くのウサギ抗ＧＲＰ１抗体が肝臓腫瘍組織と結合した。第２０図は、放射能標識化正常ウサギ血清およびＧＲＰ１抗血清の両方に関して、ｘ軸上の漸増時間に伴うｙ軸上での肝臓腫瘍／肝臓比をも示している。正常ウサギ血清は１日目からこの比が１に達し、これは５日目までずっと一定であった。これは、肝臓腫瘍および正常肝臓における放射能標識のレベルが等しいことを示す。ＧＲＰ１抗血清に関する比は累積して、５日目までに指数的に２に近づいた。これは、放射能標識化ＧＲＰ１抗血清が１７０ＨＭ２肝臓腫瘍内に特異的に局在することを示している。
【００７５】
実施例１０
Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片に及ぼすＧＲＰ１抗血清の治療的効果
細胞の腹腔内注入によりＣ１７０ＨＭ２腫瘍異種移植片は開始された。３つの異なる細胞接種物を用いて、３つのレベルの腫瘍負荷量を生じさせた。０日目から毎日、尾部静脈注射により受動的にＧＲＰ１抗血清を投与した。治療は４０日目に終了した。
【００７６】
腫瘍「取り込み率」に及ぼすＧＲＰ１抗血清の作用
評価した最初のパラメーターは、第２１図に示した肝臓内の平均腫瘍数であった。正常ウサギ抗血清処置対照を、細胞接種物を増大させてグループ分けした。
【００７７】
第２１図に示したように、対照群では、平均腫瘍数／肝臓は、１〜３の間であった。ＧＲＰ１抗血清処置群では、平均腫瘍数／肝臓は、３つの細胞接種物のすべてに関して１未満であり、これは３つの実験すべてに関して有意であった（接種物１、ｎ＝１８、ｐ＝０．００３；接種物２、ｎ＝１２、ｐ＝０．０００１；接種物３、ｎ＝２０、ｐ＝０．００６８、マンホイットニー分析）。
【００７８】
樹立腫瘍の腫瘍重量に及ぼすＧＲＰ１抗血清の作用
第２２図は３つの漸増細胞接種物に関する左パネルにおける正常ウサギ血清処置対照に関する平均腫瘍重量を示している。図はＧＲＰ１抗血清で処置後のヌードマウスの平均腫瘍重量も示している。平均肝臓重量は３つの細胞接種物のすべてに関して６０％低減したが、これは３つの実験すべてに関して有意であった（接種物１、ｐ＝０．００１６；接種物２、ｐ＝０．００８４；接種物３、ｐ＝０．０００１、マンホイットニー分析）。
【００７９】
ウエスタンブロッティングにより確定した場合のＣ１７０ＨＭ２異種移植片におけるＧＲＰ１免疫反応性
３つの実験の２つからのＣ１７０ＨＭ２異種移植片から、核外膜タンパク質を調製した。ＧＲＰ１抗血清を用いてウエスタンブロッティングにより、これらを分析した。第２３図は、正常ウサギ血清処置異種移植片２において、免疫反応性バンドが７４および５０ｋＤａに存在したことを示すウエスタンブロットの写真であって、前者のバンドが最も強い免疫反応性を示している。ＧＲＰ１抗血清処置異種移植片では、２本の免疫反応性バンドが中間バンドとともに存在するが、しかし対照異種移植片またはin vitroで増殖させた細胞には認められない。５０ｋＤａバンドは、最も強い免疫反応性を示している。これは、ＧＲＰ１抗血清処置異種移植片では、より大きい割合のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体が内在化形態として存在することを示している。
【００８０】
Ｃ１７０ＨＭ２異種移植片の組織学的分析
第２４図は、ヌードマウスの肝臓を侵襲しているＣ１７０ＨＭ２異種移植片の顕微鏡写真である。腫瘍は一般に、肝臓を侵襲した場合に肝細胞を押し潰す、生育可能な前縁を有する壊死性中心で構成される。in-situハイブリダイゼーションにより可視化した陽性細胞を用いてタネル（Tunel）法により、Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍の生育可能な前縁で、アポトーシスの程度を測定した。第２５図はアポトーシス細胞がＧＲＰ１抗血清処置異種移植片中の生育可能腫瘍細胞中には存在するが、正常ウサギ血清処置腫瘍中には認められないことを示している。
【００８１】
データは、ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端エピトープに対して生じた抗血清が肝臓侵襲性Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍内に選択的に局在することを示している。ＧＲＰ１エピトープの中和は、腫瘍「取り込み率」および樹立腫瘍の腫瘍負荷量全体の両方に及ぼす有意の効果を誘導した。この腫瘍阻害作用は、（ａ）ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体をブロックすることによって誘導される一般的細胞増殖抑制効果および／または（ｂ）アポトーシスを引き起こしうる、抗体が細胞の核を標的とする間接的効果によると思われる。
【００８２】
参考文献
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体およびその７つの膜内外ドメインの概略図を示す図である。
【図２】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド１に対する免疫原により免疫感作されたウサギにおいて生じた抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定からのデータを示す図である。
【図３】ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のペプチド４に対する免疫原により免疫感作されたウサギにおいて生じた抗体を用いたＥＬＩＳＡ検定からのデータを示す図である。
【図４】ＧＲＰＩ−ＤＴ免疫原に対して生じたアフィニティー精製した抗体の特異性を評価するために用いられた阻害ＥＬＩＳＡから得られたデータを示すグラフである。
【図５】ペプチド阻害剤による125Ｉ−ヒトＧ１７のＡＲ４２Ｊ細胞との結合の阻害に関するデータを示す棒グラフである。
【図６】免疫金標識化ＡＲ４−２Ｊ腫瘍細胞の細胞分布の棒グラフである。
【図７】ペプチド１に対して生じた抗体を用いた腺癌細胞の核膜からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析の写真である。
【図８】ペプチト１に対して生じた抗体を用いた腺癌細胞の核外および形質膜からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析の写真である。
【図９】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物のＣ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示すプロットグラフである。
【図１０】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物からのＣ１７０ＨＭ２腫瘍の横断面積を示すプロットグラフである。
【図１１】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物の平均Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１２】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物のＣ１７０ＨＭ２腫瘍の平均横断面積を示す棒グラフである。
【図１３】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物におけるＣ１７０ＨＭ２腫瘍の平均数を示す棒グラフである。
【図１４】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物の肝臓転移の中央値Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１５】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物からのＣ１７０ＨＭ２腫瘍の中央値横断面積を示す棒グラフである。
【図１６】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物における中央値Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍数を示す棒グラフである。
【図１７】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物における平均および中央値肝臓Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍数を示す棒グラフである。
【図１８】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物における平均および中央値肝臓Ｃ１７０ＨＭ２腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図１９】対照および抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体処理動物におけるＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍転移の横断面積に関する平均および中央値を示す棒グラフである。
【図２０】対照（正常ウサギ血清）および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍異種移植片における放射能標識化125Ｉ抗体の濃度を示すグラフである。
【図２１】対照および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスの異種移植片の肝臓当たりの平均Ｃ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍数を示す棒グラフである。
【図２２】対照および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスの肝臓異種移植片の平均Ｃ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍重量を示す棒グラフである。
【図２３】対照および抗ＧＲＰ１処理ヌードマウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓腫瘍異種移植片タンパク質のウエスタンブロットを示す図である。
【図２４】対照マウスのＣ１７０ＨＭ２肝臓異種移植片のヘマトキシリン／エオシン染色切片を示す光学顕微鏡で撮った組織切片の写真である。
【図２５】ウサギ抗ＧＲＰ１抗体で処理したマウスからのＣ１７０ＨＭ２肝臓異種移植片のヘマトキシリン／エオシン染色切片を示す光学顕微鏡で撮った組織切片の写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性担体と抱合したＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体からのペプチドを包含する免疫原。
【請求項２】
前記ペプチドはアミノ酸配列
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列ＩＤ番号：１）または
ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列ＩＤ番号：２）を有する請求の範囲第１項記載の免疫原。
【請求項３】
スペーサーペプチド配列をさらに包含する請求の範囲第１項または第２項に記載の免疫原。
【請求項４】
前記スペーサーペプチト配列はＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列ＩＤ番号：３）である請求の範囲第３項に記載の免疫原。
【請求項５】
前記免疫原性担体はジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の免疫原。
【請求項６】
ガストリン依存性悪性細胞増殖によって引き起こされる悪性症状の治療方法であって、このような治療が必要な動物に有効量の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を投与することを包含する方法。
【請求項７】
前記免疫原はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体からのペプチドを包含する請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドはアミノ酸配列
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列ＩＤ番号：１）または
ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列ＩＤ番号：２）を有する請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫原はスペーサーペプチド配列をさらに包含する請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スペーサーペプチド配列はＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列ＩＤ番号：３）である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される免疫原性担体をさらに包含する請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
ガストリン依存性腫瘍の治療方法であって、このような治療が必要な動物に腫瘍細胞中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を認識し、結合する有効量の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体を投与することを包含する方法。
【請求項１３】
前記抗体はキメラ、モノクローナルおよびヒト化抗体から成る群から選択される請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は受容体のアミノ酸配列
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列ＩＤ番号：１）または
ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列ＩＤ番号：２）を認識し結合する請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体は細胞毒性分子にさらに抱合される請求の範囲第１２項または第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞毒性分子は毒素または放射性分子である請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
前記毒素はコレラ毒素である請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
前記放射性分子は125Ｉまたは131Ｉで標識される請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を含有するガストリン応答性腫瘍の検出方法であって、抗ガストリン受容体抗体を腫瘍生検標本から単離した細胞に曝露して、標本中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を検出することを包含する方法。
【請求項２０】
前記抗ガストリン受容体抗体はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端ペプチドに特異的である請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端領域に存在するペプチドはアミノ酸残基５〜２１を包含する請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を包含する免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体からのペプチドを包含する請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫原はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する抗体を包含する請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２５】
ガストリン依存性腫瘍の診断方法であって、放射能標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を結腸直腸腫瘍を有する患者に投与して、シンチグラフ走査により腫瘍を画像化することを包含する方法。
【請求項２６】
前記抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は111インジウムまたは90イットリウムで放射能標識化される請求の範囲第２５項に記載の方法。
【請求項１】
免疫原性担体と抱合したＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体からのペプチドを包含する免疫原。
【請求項２】
前記ペプチドはアミノ酸配列
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列ＩＤ番号：１）または
ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列ＩＤ番号：２）を有する請求の範囲第１項記載の免疫原。
【請求項３】
スペーサーペプチド配列をさらに包含する請求の範囲第１項または第２項に記載の免疫原。
【請求項４】
前記スペーサーペプチト配列はＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列ＩＤ番号：３）である請求の範囲第３項に記載の免疫原。
【請求項５】
前記免疫原性担体はジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の免疫原。
【請求項６】
ガストリン依存性悪性細胞増殖によって引き起こされる悪性症状の治療方法であって、このような治療が必要な動物に有効量の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を投与することを包含する方法。
【請求項７】
前記免疫原はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体からのペプチドを包含する請求の範囲第６項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドはアミノ酸配列
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列ＩＤ番号：１）または
ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列ＩＤ番号：２）を有する請求の範囲第７項に記載の方法。
【請求項９】
前記免疫原はスペーサーペプチド配列をさらに包含する請求の範囲第８項に記載の方法。
【請求項１０】
前記スペーサーペプチド配列はＳＳＰＰＰＰＣ（配列表の配列ＩＤ番号：３）である請求の範囲第９項に記載の方法。
【請求項１１】
ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイドおよびウシ血清アルブミンからなる群から選択される免疫原性担体をさらに包含する請求の範囲第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
ガストリン依存性腫瘍の治療方法であって、このような治療が必要な動物に腫瘍細胞中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を認識し、結合する有効量の抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン抗体を投与することを包含する方法。
【請求項１３】
前記抗体はキメラ、モノクローナルおよびヒト化抗体から成る群から選択される請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は受容体のアミノ酸配列
ＫＬＮＲＳＶＱＧＴＧＰＧＰＧＡＳＬ（配列表の配列ＩＤ番号：１）または
ＧＰＧＡＨＲＡＬＳＧＡＰＩＳＦ（配列表の配列ＩＤ番号：２）を認識し結合する請求の範囲第１２項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体は細胞毒性分子にさらに抱合される請求の範囲第１２項または第１４項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞毒性分子は毒素または放射性分子である請求の範囲第１５項に記載の方法。
【請求項１７】
前記毒素はコレラ毒素である請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１８】
前記放射性分子は125Ｉまたは131Ｉで標識される請求の範囲第１６項に記載の方法。
【請求項１９】
ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を含有するガストリン応答性腫瘍の検出方法であって、抗ガストリン受容体抗体を腫瘍生検標本から単離した細胞に曝露して、標本中のＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体を検出することを包含する方法。
【請求項２０】
前記抗ガストリン受容体抗体はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端ペプチドに特異的である請求の範囲第１９項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体のアミノ末端領域に存在するペプチドはアミノ酸残基５〜２１を包含する請求の範囲第２０項に記載の方法。
【請求項２２】
抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体免疫原を包含する免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記免疫原性組成物はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体からのペプチドを包含する請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記免疫原はＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体に対する抗体を包含する請求の範囲第２２項に記載の組成物。
【請求項２５】
ガストリン依存性腫瘍の診断方法であって、放射能標識化抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体を結腸直腸腫瘍を有する患者に投与して、シンチグラフ走査により腫瘍を画像化することを包含する方法。
【請求項２６】
前記抗ＣＣＫ−Ｂ／ガストリン受容体抗体は111インジウムまたは90イットリウムで放射能標識化される請求の範囲第２５項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【公開番号】特開２００７−６３２８９（Ｐ２００７−６３２８９Ａ）
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３０３６９７（Ｐ２００６−３０３６９７）
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【分割の表示】特願平１０−５４９５７８の分割
【原出願日】平成１０年５月１２日（１９９８．５．１２）
【出願人】（５００５２２９０９）アフトン コーポレーション (5)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年３月１５日（２００７．３．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１１月９日（２００６．１１．９）
【分割の表示】特願平１０−５４９５７８の分割
【原出願日】平成１０年５月１２日（１９９８．５．１２）
【出願人】（５００５２２９０９）アフトン コーポレーション (5)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]