ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法
【課題】ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供する。
【解決手段】血液・尿生化学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、尿中のデオキシピリノジリン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド若しくはＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ、骨型アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド、ＭＩＰ−１α若しくはＭＩＰ−１β、又は、血漿中のＲＡＮＴＥＳを測定するＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【解決手段】血液・尿生化学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、尿中のデオキシピリノジリン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド若しくはＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ、骨型アルカリフォスファターゼ、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド、ＭＩＰ−１α若しくはＭＩＰ−１β、又は、血漿中のＲＡＮＴＥＳを測定するＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳに対する化学療法は、Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＨＡＡＲＴ療法）の開発により格段の進歩を遂げた（非特許文献１）。しかしながら、近年では、薬剤耐性ＨＩＶの出現が大きな問題となっている。最近、ある家系においてケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）のＮ末端の３２アミノ酸が欠損しているポリモルフィズムを持っており、その欠損を有する人は、ＨＩＶ感染は起きるものの、ＡＩＤＳは発症しないという特徴を有することが判明した。これより、ＣＣＲ５が、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳ発症に至るのに極めて重要であることが示唆される。即ち、ＣＣＲ５は、ＨＩＶのレセプターとして機能しているものと考えられる。従って、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤は、従来の逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等のＡＩＤＳ治療薬とは異なる作用メカニズムによりＡＩＤＳの予防と治療とに役立つことが期待され、薬剤耐性ＨＩＶの治療にも効果を挙げることが期待されている。
【０００３】
ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の１つであるＡＫ６０２／ＧＷ８７３１４０は、米国におけるｐｈａｓｅ ２ａ臨床試験でＨＩＶ感染者への短期間投与により良好なＨＩＶ抑制効果を示した。しかしながら、ＣＣＲ５阻害剤が宿主（生体）側因子であるＣＣＲ５を阻害することによる長期的な生体への影響やその機序については現在のところ未知である。実際、ＣＣＲ５阻害剤のうちの一つであるａｐａｐｌａｖｉｒｏｃは、副作用として肝毒性を示したことから、開発が中止されてしまった。
このようなＣＣＲ５を標的とする阻害剤からなる新薬の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本国際保険医療学会／国際保険用語集、［平成２１年５月２１日検索］、インターネット＜URL:http://wiki.livedoor.jp/jaih/d/HAART＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、血液・尿生化学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、尿中のデオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）若しくはＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α若しくはＭＩＰ−１β、又は、血漿中のＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を測定するＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
【０００７】
本発明は、また、細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色又は酸性フォスファターゼ染色により染色して顕微鏡観察するＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
本発明は、また、細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を象牙板上で培養し、培養後の前記象牙板を顕微鏡観察することを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
【０００８】
本発明は、更に、細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、実験動物に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した後に骨又は軟骨を採取して観察を行うＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
ケモカインレセプター（ＣＣＲ）は、７回貫通型膜タンパク質で極めて特徴的な役割を果たしている。これまでに腹腔内に於ける脂肪をどん食するマクロファージは、その細胞表面にケモカインレセプター８（ＣＣＲ８）を発現しており、この細胞の腸潰瘍の修復を行ない、また手術後の癒着にも関与している（土肥など論文および特許）ことが知られている。
本発明者は、ＣＣＲ５が骨の代謝に重要な働きをしている事実を世界で初めて確認した。本発明者は、更に鋭意検討の結果、骨の代謝に関連する血液・尿生化学検査法、細胞生物学検査法、骨軟骨形態学検査法により、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価することができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの血液を採取し、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）及び酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）量を測定したグラフである。
【図２】野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色及び酸性フォスファターゼ染色した場合の顕微鏡写真である。
【図３】野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を象牙板上で培養した後の、該象牙板の状態を示す顕微鏡写真である。
【図４】野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスから採取した骨（上段）及び軟骨（中段（２００倍）、下段（１００倍））の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）ＣＣＲ５が骨の代謝との関係について
本発明者は、通常のマウス（以下、「野生型」ともいう）、ケモカインレセプター１（ＣＣＲ１）が欠損したノックアウトマウス（以下、「ＣＣＲ１抑制型」ともいう）、ケモカインの一種であるフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＲ１）が欠損したノックアウトマウス（以下、「ＣＸ３ＣＲ１抑制型」ともいう）、及び、ケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）が欠損したノックアウトマウス（以下、「ＣＣＲ５抑制型」ともいう）を用いて種々の実験を行い、ＣＣＲ５が骨の代謝に重要な働きをしている事実を世界で初めて確認した。
【００１３】
骨の形成には、造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）と破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｒａｓｔ）とが大きく関与している。子供から大人に成長するときには、古い骨を破骨細胞が破壊する一方、造骨細胞が新しい大きな骨を形成していく。また、成人になった後にも、造骨細胞と破骨細胞は活発に活動を続け、骨のメンテナンスが行われている。
破骨細胞は、酸性フォスファターゼとペプチターゼとを分泌する。酸性ホスファターゼは、骨表面のリン酸カルシウムを融解する役割を有する。ぺプチターゼは、骨表面下に存在するコラーゲン繊維を分解する役割を有する。例えば、近年、患者が増加している骨粗しょう症は、老化によって破骨細胞が制御できなくなり、骨の破壊が一方的に進むことが原因の一つであると考えられている。
【００１４】
図１に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの血液を採取し、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）及び酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）量を測定したグラフを示した。
骨形成マーカーである骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）については、野生型、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型の間で有意な差異は認められない。これに対して、骨吸収のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）については、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型ともに、有意に野生型よりも低値であることが判った。
【００１５】
図２に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色及び酸性フォスファターゼ染色した場合の顕微鏡写真である。
Ｆアクチン（フィラメント）染色された破骨細胞について、野生型では、Ｆアクチン（フィラメント）がリング状に細胞の周囲に存在する。一方、ＣＣＲ１抑制型では、前骨細胞の融合は見られない（正常であれば、前骨細胞が融合し、多核の正常な破骨細胞が観察される。ＣＣＲ５抑制型では、Ｆアクチン（フィラメント）の異常凝集が認められた。
酸性フォスファターゼ染色された破骨細胞について、野生型では、濃く染色されている。一方、ＣＣＲ５抑制型では、酸性フォスファターゼの発現量が少なく、染色が薄い。また、ＣＣＲ１抑制型では、正常な破骨細胞が認められず、染色もごく薄いものであった。
【００１６】
図３に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を象牙板上で培養した後の、該象牙板の状態を示す顕微鏡写真を示した。
野生型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質も、その下のコラーゲン繊維も溶解していた。一方、ＣＣＲ１抑制型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質も、その下のコラーゲン繊維も溶解しておらず、ＣＣＲ５抑制型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質は溶解していたが、その下のコラーゲン繊維は溶解していなかったことが判った。
【００１７】
図４に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスから採取した骨（上段）及び軟骨（中段（２００倍）、下段（１００倍））の顕微鏡写真を示した。ＣＣＲ５抑制型の骨は、野生型に比べて骨厚が大きい一方、海綿骨が少なく疎である。また、軟骨については、野生型では軟骨細胞が整列し並んでいるのに対して、ＣＣＲ５抑制型では軟骨細胞の並びが崩れていることが判った。
【００１８】
（２）本発明のＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法
本発明のＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法について詳しく説明する。本発明のＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法は、血液・尿生化学検査法、細胞生物学検査法、骨軟骨形態学検査法の３つに大別される。
【００１９】
（２−１）血液・尿生化学検査法
血液・尿生化学検査法においては、尿中のデオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）を測定する。また、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α、ＭＩＰ−１βや、血漿中のＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を測定する。
【００２０】
上記デオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）は、骨吸収のマーカーとして知られるものである。
上記骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシンは、骨形成マーカーとして知られるものである。
上記ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）は、ケモカインレセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ５に結合するケモカインである。
【００２１】
具体的には、対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した患者からなる群と、投与しない健常者からなる群とを設定し、採血、採尿を行ったうえで各々の群の骨吸収のマーカー、骨形成マーカー及びケモカインの数値を測定して比較することにより、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価することができる。
【００２２】
（２−２）細胞生物学検査法
細胞生物学検査法においては、骨髄細胞又は単球をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して誘導した、破骨細胞を用いる。
【００２３】
骨髄細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、破骨細胞を誘導する方法について説明する。
マウスやヒトの骨髄から採取した骨髄細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）を含むＭＥＭ培地にて２４時間培養した後、破骨細胞に分化させる骨髄マクロファージとして浮遊細胞を分離する。更に１０日間、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含むＭＥＭ培地にて培養した後、セファデックスカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通過させることにより、破骨細胞に分化させる骨髄マクロファージとして浮遊細胞を分離する。得られた浮遊細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）を含むＭＥＭ培地で４日間培養することにより、前破骨細胞が得られる。その後、細胞数を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに整えた条件下で、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含むＭＥＭ培地中で１４〜２１日程度培養することにより、破骨細胞が得られる。なお、培養液の交換は、４日に１回程度行う。
【００２４】
単球をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、破骨細胞を誘導する方法について説明する。
マウスやヒトの抹消血から分離した単球を、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含むＭＥＭ培地にて、１０日間程度培養する。培養液を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含むＭＥＭ培地に変え、更に４日間程度培養することにより前破骨細胞が得られる。その後、細胞数を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに整えた条件下で、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含むＭＥＭ培地中で１４日程度培養することにより、破骨細胞が得られる。なお、培養液の交換は、４日に１回程度行う。
【００２５】
本発明の細胞生物学検査法においては、上記培養に用いる培養液中に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した群と、添加しない群とを設定し、得られた破骨細胞を顕微鏡検査及び細胞機能評価を行う。
【００２６】
上記破骨細胞の顕微鏡検査では、例えば、破骨細胞のＦアクチン（フィラメント）を染色したり、酸性フォスファターゼを染色したりして顕微鏡が観察する。対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、多核の正常な破骨細胞が形成されなかったり、Ｆアクチン（フィラメント）の異常凝集が認められたり、酸性フォスファターゼ染色が薄かったりする。
【００２７】
上記破骨細胞の細胞機能評価では、得られた破骨細胞の象牙溶解能を調べる。具体的には、骨髄細胞等から誘導した破骨細胞を象牙板上で培養した後、該象牙板の状態を顕微鏡等を用いて観察する。対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、象牙板のセメント質やコラーゲン繊維が溶解されない。
【００２８】
（２−３）骨軟骨形態学検査法
骨軟骨形態学検査法においては、マウス等の実験動物に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した群と、投与しない群とを設定し、投与後の骨又は軟骨を採取して比較を行う。対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、骨の骨厚が大きくなったり、海綿骨が少なく疎になったり、また、軟骨中の軟骨細胞の並びが崩れたりする。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＩＤＳに対する化学療法は、Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉ−Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ（ＨＡＡＲＴ療法）の開発により格段の進歩を遂げた（非特許文献１）。しかしながら、近年では、薬剤耐性ＨＩＶの出現が大きな問題となっている。最近、ある家系においてケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）のＮ末端の３２アミノ酸が欠損しているポリモルフィズムを持っており、その欠損を有する人は、ＨＩＶ感染は起きるものの、ＡＩＤＳは発症しないという特徴を有することが判明した。これより、ＣＣＲ５が、ＨＩＶ感染からＡＩＤＳ発症に至るのに極めて重要であることが示唆される。即ち、ＣＣＲ５は、ＨＩＶのレセプターとして機能しているものと考えられる。従って、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤は、従来の逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤等のＡＩＤＳ治療薬とは異なる作用メカニズムによりＡＩＤＳの予防と治療とに役立つことが期待され、薬剤耐性ＨＩＶの治療にも効果を挙げることが期待されている。
【０００３】
ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の１つであるＡＫ６０２／ＧＷ８７３１４０は、米国におけるｐｈａｓｅ ２ａ臨床試験でＨＩＶ感染者への短期間投与により良好なＨＩＶ抑制効果を示した。しかしながら、ＣＣＲ５阻害剤が宿主（生体）側因子であるＣＣＲ５を阻害することによる長期的な生体への影響やその機序については現在のところ未知である。実際、ＣＣＲ５阻害剤のうちの一つであるａｐａｐｌａｖｉｒｏｃは、副作用として肝毒性を示したことから、開発が中止されてしまった。
このようなＣＣＲ５を標的とする阻害剤からなる新薬の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法が求められていた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】日本国際保険医療学会／国際保険用語集、［平成２１年５月２１日検索］、インターネット＜URL:http://wiki.livedoor.jp/jaih/d/HAART＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、血液・尿生化学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、尿中のデオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）若しくはＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α若しくはＭＩＰ−１β、又は、血漿中のＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を測定するＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
【０００７】
本発明は、また、細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色又は酸性フォスファターゼ染色により染色して顕微鏡観察するＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
本発明は、また、細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を象牙板上で培養し、培養後の前記象牙板を顕微鏡観察することを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
【０００８】
本発明は、更に、細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、実験動物に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した後に骨又は軟骨を採取して観察を行うＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法である。
以下に本発明を詳述する。
【０００９】
ケモカインレセプター（ＣＣＲ）は、７回貫通型膜タンパク質で極めて特徴的な役割を果たしている。これまでに腹腔内に於ける脂肪をどん食するマクロファージは、その細胞表面にケモカインレセプター８（ＣＣＲ８）を発現しており、この細胞の腸潰瘍の修復を行ない、また手術後の癒着にも関与している（土肥など論文および特許）ことが知られている。
本発明者は、ＣＣＲ５が骨の代謝に重要な働きをしている事実を世界で初めて確認した。本発明者は、更に鋭意検討の結果、骨の代謝に関連する血液・尿生化学検査法、細胞生物学検査法、骨軟骨形態学検査法により、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価することができることを見出し、本発明を完成した。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの血液を採取し、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）及び酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）量を測定したグラフである。
【図２】野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色及び酸性フォスファターゼ染色した場合の顕微鏡写真である。
【図３】野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を象牙板上で培養した後の、該象牙板の状態を示す顕微鏡写真である。
【図４】野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスから採取した骨（上段）及び軟骨（中段（２００倍）、下段（１００倍））の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
（１）ＣＣＲ５が骨の代謝との関係について
本発明者は、通常のマウス（以下、「野生型」ともいう）、ケモカインレセプター１（ＣＣＲ１）が欠損したノックアウトマウス（以下、「ＣＣＲ１抑制型」ともいう）、ケモカインの一種であるフラクタルカイン（ＣＸ３ＣＲ１）が欠損したノックアウトマウス（以下、「ＣＸ３ＣＲ１抑制型」ともいう）、及び、ケモカインレセプター５（ＣＣＲ５）が欠損したノックアウトマウス（以下、「ＣＣＲ５抑制型」ともいう）を用いて種々の実験を行い、ＣＣＲ５が骨の代謝に重要な働きをしている事実を世界で初めて確認した。
【００１３】
骨の形成には、造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）と破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｒａｓｔ）とが大きく関与している。子供から大人に成長するときには、古い骨を破骨細胞が破壊する一方、造骨細胞が新しい大きな骨を形成していく。また、成人になった後にも、造骨細胞と破骨細胞は活発に活動を続け、骨のメンテナンスが行われている。
破骨細胞は、酸性フォスファターゼとペプチターゼとを分泌する。酸性ホスファターゼは、骨表面のリン酸カルシウムを融解する役割を有する。ぺプチターゼは、骨表面下に存在するコラーゲン繊維を分解する役割を有する。例えば、近年、患者が増加している骨粗しょう症は、老化によって破骨細胞が制御できなくなり、骨の破壊が一方的に進むことが原因の一つであると考えられている。
【００１４】
図１に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの血液を採取し、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）及び酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）量を測定したグラフを示した。
骨形成マーカーである骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）については、野生型、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型の間で有意な差異は認められない。これに対して、骨吸収のマーカーである酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）については、ＣＣＲ１抑制型、ＣＸ３ＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型ともに、有意に野生型よりも低値であることが判った。
【００１５】
図２に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色及び酸性フォスファターゼ染色した場合の顕微鏡写真である。
Ｆアクチン（フィラメント）染色された破骨細胞について、野生型では、Ｆアクチン（フィラメント）がリング状に細胞の周囲に存在する。一方、ＣＣＲ１抑制型では、前骨細胞の融合は見られない（正常であれば、前骨細胞が融合し、多核の正常な破骨細胞が観察される。ＣＣＲ５抑制型では、Ｆアクチン（フィラメント）の異常凝集が認められた。
酸性フォスファターゼ染色された破骨細胞について、野生型では、濃く染色されている。一方、ＣＣＲ５抑制型では、酸性フォスファターゼの発現量が少なく、染色が薄い。また、ＣＣＲ１抑制型では、正常な破骨細胞が認められず、染色もごく薄いものであった。
【００１６】
図３に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスの骨髄細胞から誘導した破骨細胞を象牙板上で培養した後の、該象牙板の状態を示す顕微鏡写真を示した。
野生型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質も、その下のコラーゲン繊維も溶解していた。一方、ＣＣＲ１抑制型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質も、その下のコラーゲン繊維も溶解しておらず、ＣＣＲ５抑制型の破骨細胞を培養した象牙板は、セメント質は溶解していたが、その下のコラーゲン繊維は溶解していなかったことが判った。
【００１７】
図４に、野生型、ＣＣＲ１抑制型、及び、ＣＣＲ５抑制型のマウスから採取した骨（上段）及び軟骨（中段（２００倍）、下段（１００倍））の顕微鏡写真を示した。ＣＣＲ５抑制型の骨は、野生型に比べて骨厚が大きい一方、海綿骨が少なく疎である。また、軟骨については、野生型では軟骨細胞が整列し並んでいるのに対して、ＣＣＲ５抑制型では軟骨細胞の並びが崩れていることが判った。
【００１８】
（２）本発明のＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法
本発明のＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法について詳しく説明する。本発明のＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法は、血液・尿生化学検査法、細胞生物学検査法、骨軟骨形態学検査法の３つに大別される。
【００１９】
（２−１）血液・尿生化学検査法
血液・尿生化学検査法においては、尿中のデオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）を測定する。また、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α、ＭＩＰ−１βや、血漿中のＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を測定する。
【００２０】
上記デオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）は、骨吸収のマーカーとして知られるものである。
上記骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシンは、骨形成マーカーとして知られるものである。
上記ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）は、ケモカインレセプターＣＣＲ１、ＣＣＲ５に結合するケモカインである。
【００２１】
具体的には、対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した患者からなる群と、投与しない健常者からなる群とを設定し、採血、採尿を行ったうえで各々の群の骨吸収のマーカー、骨形成マーカー及びケモカインの数値を測定して比較することにより、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価することができる。
【００２２】
（２−２）細胞生物学検査法
細胞生物学検査法においては、骨髄細胞又は単球をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して誘導した、破骨細胞を用いる。
【００２３】
骨髄細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、破骨細胞を誘導する方法について説明する。
マウスやヒトの骨髄から採取した骨髄細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのマクロファージコロニー刺激因子（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ｃｏｌｏｎｙ Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ：Ｍ−ＣＳＦ）を含むＭＥＭ培地にて２４時間培養した後、破骨細胞に分化させる骨髄マクロファージとして浮遊細胞を分離する。更に１０日間、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含むＭＥＭ培地にて培養した後、セファデックスカラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を通過させることにより、破骨細胞に分化させる骨髄マクロファージとして浮遊細胞を分離する。得られた浮遊細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫＬ）を含むＭＥＭ培地で４日間培養することにより、前破骨細胞が得られる。その後、細胞数を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに整えた条件下で、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含むＭＥＭ培地中で１４〜２１日程度培養することにより、破骨細胞が得られる。なお、培養液の交換は、４日に１回程度行う。
【００２４】
単球をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、破骨細胞を誘導する方法について説明する。
マウスやヒトの抹消血から分離した単球を、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを含むＭＥＭ培地にて、１０日間程度培養する。培養液を１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含むＭＥＭ培地に変え、更に４日間程度培養することにより前破骨細胞が得られる。その後、細胞数を５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌに整えた条件下で、１０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦと２０ｎｇ／ｍｌのＲＡＮＫＬを含むＭＥＭ培地中で１４日程度培養することにより、破骨細胞が得られる。なお、培養液の交換は、４日に１回程度行う。
【００２５】
本発明の細胞生物学検査法においては、上記培養に用いる培養液中に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した群と、添加しない群とを設定し、得られた破骨細胞を顕微鏡検査及び細胞機能評価を行う。
【００２６】
上記破骨細胞の顕微鏡検査では、例えば、破骨細胞のＦアクチン（フィラメント）を染色したり、酸性フォスファターゼを染色したりして顕微鏡が観察する。対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、多核の正常な破骨細胞が形成されなかったり、Ｆアクチン（フィラメント）の異常凝集が認められたり、酸性フォスファターゼ染色が薄かったりする。
【００２７】
上記破骨細胞の細胞機能評価では、得られた破骨細胞の象牙溶解能を調べる。具体的には、骨髄細胞等から誘導した破骨細胞を象牙板上で培養した後、該象牙板の状態を顕微鏡等を用いて観察する。対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、象牙板のセメント質やコラーゲン繊維が溶解されない。
【００２８】
（２−３）骨軟骨形態学検査法
骨軟骨形態学検査法においては、マウス等の実験動物に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した群と、投与しない群とを設定し、投与後の骨又は軟骨を採取して比較を行う。対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤が高い疾病治療効果、予防効果を有したり、又は、強い副作用を有する場合には、骨の骨厚が大きくなったり、海綿骨が少なく疎になったり、また、軟骨中の軟骨細胞の並びが崩れたりする。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明によれば、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を、簡便かつ正確に予測する方法を提供することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液・尿生化学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
尿中のデオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）若しくはＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α若しくはＭＩＰ−１β、又は、血漿中のＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を測定する
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項２】
細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色又は酸性フォスファターゼ染色により染色して顕微鏡観察する
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項３】
細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を象牙板上で培養し、培養後の前記象牙板を顕微鏡観察する
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項４】
細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
実験動物に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した後に骨又は軟骨を採取して観察を行う
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項１】
血液・尿生化学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
尿中のデオキシピリノジリン（ＤＰＤ）、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）若しくはＩ型コラーゲン架橋Ｃ−テロペプチド（ＣＴＸ）、又は、血清中の酒石酸抵抗性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＣＰ）、骨型アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）、オステオカルシン、Ｉ型コラーゲン架橋Ｎ−テロペプチド（ＮＴＸ）、ＭＩＰ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）−１α若しくはＭＩＰ−１β、又は、血漿中のＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｕｐｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ、 ｎｏｒｍａｌ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）を測定する
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項２】
細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を、Ｆアクチン（フィラメント）染色又は酸性フォスファターゼ染色により染色して顕微鏡観察する
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項３】
細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
骨髄細胞又は単球を、ＣＣＲ５を標的とする阻害剤を添加した培養液を用いて培養することにより誘導した破骨細胞を象牙板上で培養し、培養後の前記象牙板を顕微鏡観察する
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【請求項４】
細胞生物学検査法によりＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法であって、
実験動物に対象となるＣＣＲ５を標的とする阻害剤を投与した後に骨又は軟骨を採取して観察を行う
ことを特徴とするＣＣＲ５を標的とする阻害剤の疾病治療効果、予防効果及び副作用を評価する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２７１１８１（Ｐ２０１０−２７１１８１Ａ）
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２３１９３（Ｐ２００９−１２３１９３）
【出願日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【出願人】（５０２１６５９４２）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月２日（２０１０．１２．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２１日（２００９．５．２１）
【出願人】（５０２１６５９４２）
【出願人】（０００００２１７４）積水化学工業株式会社 (5,781)
【Ｆターム（参考）】
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