ＣＤ２０結合分子
【課題】本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列に関する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に対し高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子に関する。
【解決手段】本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒト型のフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含むことが望ましい。
【解決手段】本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒト型のフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含むことが望ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年５月２０日に出願された米国仮特許出願連続番号６０／４７１，９５８の優先権を主張する。
本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列に関する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に対して高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子に関する。本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒトのフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでいるのが望ましい。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞リンパ腫のような疾病の診断および／または治療薬としてＣＤ２０抗原の抗体を使用する方法は、以前にも報告されている。ＣＤ２０は悪性のＢ細胞、すなわちその無制限な増幅がＢ細胞リンパ腫の原因となるＢ細胞の表面に高密度で発現する抗原であるため、Ｂ細胞リンパ腫のマーカーまたは標的として有用である。
【０００３】
ＣＤ２０（Ｂｐ３５としても知られる）は、Ｂ前駆体細胞成長の初期に発現し、血漿の細胞分化まで残留する、Ｂリンパ球に制限された分化抗原である。ＣＤ２０分子は細胞サイクルの開始および分化に必要なＢ細胞活性化プロセスの一段階を調整していると考えている者もいる。さらに上述のように、通常ＣＤ２０は新生物形成（「腫瘍」）Ｂ細胞上に、極めて高レベルで発現する。ＣＤ２０抗原は［他の物質を］削減、調整、または吸収したりしないため、標的治療に適している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗ＣＤ２０抗体に関する、これまでに報告されている治療法には、治療用抗ＣＤ２０抗体の単独投与、あるいは第二の放射線標識抗ＣＤ２０抗体または化学療法薬との併用投与が含まれている。米国食品医薬品局は、以前に治療され再発した低悪性度の非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における、このような抗ＣＤ２０抗体の一つであるリツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）の使用を承認した。しかしながら、リツキサンはＢ細胞リンパ腫の治療に効果的であると一般に報告されてはいるものの、治療を受けた患者はしばしば再発する傾向がある。
【０００５】
最近、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の１８人の患者（非免疫抑制患者）の治療に対するリツキサンの安全性、許容性、予備臨床の治療効果が試験された。この研究結果の一部は、２００２年１０月、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）第６６回年次学会で発表された。治療を受けた１８人の患者のうち、６人の患者には週１回１００ｍｇ／ｍ２（低用量）のリツキサン注入を、６人の患者には週１回３７５ｍｇ／ｍ２（中用量）のリツキサン注入を、そして６人の患者には週１回３７５ｍｇ／ｍ２（高用量）のリツキサン注入が４週間与えられた。低用量または中用量の投与を受けた１２人中の３人（２５％）には２ヶ月でヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）が高濃度で発現したが、高用量の患者は現在なお評価中である。
【０００６】
従って、治療を受けたＢ細胞リンパ腫の患者が再発しないように、結合親和力が高く解離定数の低いＣＤ２０結合分子、および免疫抑制されていない患者に投与された場合ＨＡＣＡ反応を引き起こさない、あるいは引き起こす可能性を小さくするようなＣＤ２０結合分子が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列を提供する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に対して高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子を提供する。本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒトのフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでいることが望ましい。
【０００８】
ある実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供し、このとき当該ＣＤ２０結合分子はａ）軽鎖可変領域、あるいは軽鎖可変領域の一部を含み、このとき当該軽鎖可変領域（または軽鎖可変領域の一部）はｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、また、ｂ）重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域の一部を含み、このとき当該重鎖可変領域（または重鎖可変領域の一部）はｉ）配列番号２３および配列番号２５から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含んでいる。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は軽鎖可変領域（またはその一部）、あるいは軽鎖可変領域をコード化する核酸配列（またはその一部）を含む組成物を提供し、このとき当該軽鎖可変領域（またはその一部）は、ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｂ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２アミノ酸配列、およびｃ）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は重鎖可変領域（またはその一部）あるいは重鎖可変領域をコード化する核酸配列（またはその一部）を含む組成物を提供し、このとき当該重鎖可変領域（またはその一部）は、ａ）配列番号２３および配列番号２５から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｂ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２アミノ酸配列、およびｃ）配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含む。
【００１１】
別の実施形態では、本発明はａ）軽鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該軽鎖可変領域が配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むもの、およびｂ）重鎖可変領域あるいは重鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該重鎖可変領域が配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むもの、を含んだ組成物を提供する。
【００１２】
ある実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の軽鎖可変領域をコード化する核酸分子を含む組成物を提供し、このときその核酸分子は、ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１核酸配列、ｂ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２核酸配列、およびｃ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の重鎖可変領域をコード化する核酸分子を含む組成物を提供し、このときその核酸分子は、ａ）配列番号２４および配列番号２６から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１核酸分子、ｂ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２核酸分子、およびｃ）配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３核酸分子を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供し、このとき当該ＣＤ２０結合分子は、ａ）配列番号５を含むＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｂ）配列番号１３を含むＣＤＲＬ２１アミノ酸配列、ｃ）配列番号１９を含むＣＤＲＬ３１アミノ酸配列、ｄ）配列番号２５を含むＣＤＲＨ１１アミノ酸配列、ｅ）配列番号３９を含むＣＤＲＨ２１アミノ酸配列、およびｆ）配列番号５７を含むＣＤＲＨ３１アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の軽鎖可変領域をコード化する核酸分子を含み、このときその核酸分子は、ａ）配列番号６を含むＣＤＲＬ１核酸配列、ｂ）配列番号１４を含むＣＤＲＬ２核酸配列、およびｃ）配列番号２０を含むＣＤＲＬ３核酸配列を含む。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の重鎖可変領域をコード化する核酸分子を含み、このときその核酸分子は、ａ）配列番号２６を含むＣＤＲＨ１核酸配列、ｂ）配列番号４０を含むＣＤＲＨ２核酸配列、およびｃ）配列番号５８を含むＣＤＲＨ３核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明は、ａ）軽鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該第１核酸配列が配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３核酸配列を含むもの、およびｂ）重鎖可変領域をコード化する第２核酸配列であり、このとき当該第２核酸配列が配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６および配列番号５８から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３核酸配列を含むもの、を含む組成物を提供する。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、ａ）軽鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該軽鎖可変領域が、ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むもの、およびｂ）重鎖可変領域をコード化する第２核酸配列であり、このとき当該重鎖可変領域が、ｉ）配列番号２３および配列番号２５から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む）、を含む組成物を提供する。
【００１６】
ある実施形態では、本発明は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択された、少なくとも二つ（あるいは少なくとも三つまたは四つ）のＣＤＲを含むペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択された、少なくとも二つ（あるいは少なくとも三つまたは四つ）のＣＤＲを含むペプチドを提供する。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む組成物を提供し、このとき当該軽鎖可変領域は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含み、またこのとき当該重鎖可変領域は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１８】
ある実施形態では、軽鎖可変領域はフレームワークの一部（例えばＦＲ２やＦＲ３などの２つから三つの準領域）を含む。ある実施形態では、軽鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号５９および６３から選択されたアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域はフレームワークの一部（例えばＦＲ２やＦＲ３などの二つから三つの準領域）を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域は６１および６５から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は抗体または抗体の断片（例えばＦｖ、Ｆａｂなど）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ３３ ＦｖまたはＦａｂを含む。別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ５ ＦｖまたはＦａｂを含む。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子は、ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５から成るグループから選択されたＦｖまたはＦａｂを含む。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子（例えば抗体や抗体の断片）を含む融合構成物、および酵素、検出可能な標識、炭水化物分子、脂質などの融合パートナーを提供する。ある実施形態では、融合構成物はヒトのＣＤ２０に結合するＦａｂまたはＦａｂ’２、およびプロドラッグを活性形に変換する酵素を含む。
【００２１】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は宿主細胞（例えば真核生物または原核生物の宿主細胞）内に含まれている。別の実施形態では、軽鎖および／または重鎖をコード化する核酸はプラスミドや他の発現ベクター内に含まれている。
【００２２】
ある実施形態では、本発明はヒトのＣＤ２０に対し結合親和力（Ｋｄ）が５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下（例えば５．０Ｘ１０−１０Ｍ〜５．０Ｘ１０−１１Ｍ）であるＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供し、このとき当該ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和力（Ｋｄ）、および５．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下である解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。
【００２３】
別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．５Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和力（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和力（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し２．５Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下（例えば１．０Ｘ１０−４ｓ−１〜１．０Ｘ１０−５ｓ−１）の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し８．０Ｘ１０−５ｓ−１またはそれ以下の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上（例えば１．０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１〜１．０Ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１）の会合速度（ｋｏｎ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し５．０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上の会合速度（ｋｏｎ）を有する。
【００２４】
ある実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）被験者およびｉｉ）本発明のＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）その組成物の被験者への投与、からなるＢ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）疾病の症状を訴える被験者およびｉｉ）本発明のＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）当該症状を軽減または排除するための、当該被験者への当該組成物の投与からなる、疾病の治療法を提供する。特定の実施形態では、疾病は、再発したホジキンス病、高悪性度の抵抗性ホジキンス病、低悪性度および中悪性度の非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞性悪性リンパ腫（ＬＰＬ）、被膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、瀰漫性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、エイズ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症、小リンパ球型、濾胞性びまん性大型細胞、びまん性小型開裂細胞、大細胞免疫芽球性リンパ腫、小非開裂型、バーキットおよび非バーキット型、濾胞性の主に大型の細胞、主に小型の濾胞性開裂細胞、および濾胞性の小型及び大型混合細胞リンパ腫から成るグループから選択される。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は本発明のＣＤ２０結合分子の有効量をその動物に投与することからなる治療を必要としている動物における疾病（例えば癌）の治療方法を提供している。ある実施形態では、本発明は薬剤として使用するための本発明のＣＤ２０結合分子を提供する。他の実施形態では、本発明は疾病（例えばＮＨＬ）治療用の薬剤の製造において、本発明のＣＤ２０結合分子を提供する。特定の実施形態では、本発明は疾病（例えば癌）の治療のために、本発明のＣＤ２０結合分子を活性成分として含むことを特徴とする薬剤を提供する。
【００２６】
好適な実施形態において、被験者（患者）は免疫抑制されていない。例えば、患者は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような病気にかかっている。非免疫抑制の被験者にＣＤ２０結合分子を投与した場合、ＨＡＣＡ反応（ヒト抗キメラ抗体反応）が生じない（あるいは生じても無視できる程度である）ことが望ましい。ある実施形態では、被験者に投与される用量は週に約３７５ｍｇ／ｍ２ずつ４週間（ＨＡＣＡ反応を生じる事なく）である。ある実施形態では、投与量は（例えば慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）などに対し）、週に約５０〜３００ｍｇ／ｍ２または週に約１００〜２００ｍｇ／ｍ２ずつ４週間である。
【００２７】
ある実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）被験者およびｉｉ）ヒトのＣＤ２０に対する結合親和力（Ｋｄ）が５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下であり、またヒトのＣＤ２０に対する解離速度（ｋｏｆｆ）が５．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下であるＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）その組成物の被験者への投与、からなるＢ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は上述の治療を必要としている被験者において、末梢Ｂ細胞を枯渇させる、ａ）ｉ）被験者およびｉｉ）ヒトのＣＤ２０に対する結合親和力（Ｋｄ）が５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下であり、またヒトのＣＤ２０に対する解離速度（ｋｏｆｆ）が５．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下であるＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）その組成物の被験者への投与、からなる方法を提供する。
【００２９】
ある実施形態では、軽鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５９および６３から選択されたアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。さらに別の実施形態では、重鎖可変領域は６１および６５から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３０】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は抗体または抗体の断片（例えばＦｖ、Ｆａｂなど）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ３３ ＦｖまたはＦａｂを含む。別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ５ ＦｖまたはＦａｂを含む。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子は、ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５から成るグループから選択されたＦｖまたはＦａｂを含む。
【００３１】
他の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣ２Ｂ８抗体とほぼ同じＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトの末梢血管単核細胞を作動体としまたＢリンパ腫を標的として、Ｃ２Ｂ８抗体とほぼ同じＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣ２Ｂ８抗体の約１．５から２倍のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する（当該Ｃ２Ｂ８抗体は番号６９１１９としてＡＴＣＣに蒸着している）。また別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトの末梢血管単核細胞を作動体としまたＢリンパ腫を標的として、Ｃ２Ｂ８抗体の約１．５から２倍のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣ２Ｂ８抗体の１０倍またはそれ以上のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。また別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトの末梢血管単核細胞を作動体としまたＢリンパ腫を標的として、Ｃ２Ｂ８抗体の１０倍またはそれ以上のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。
【００３２】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子にはヒトの生殖細胞系軽鎖フレームワークが含まれる。ある実施形態では、このヒト生殖細胞系軽鎖フレームワークは、Ｖ１−１１、Ｖ１−１３、Ｖ１−１６、Ｖ１−１７、Ｖ１−１８、Ｖ１−１９、Ｖ１−２、Ｖ１−２０、Ｖ１−２２、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ１−５、Ｖ１−７、Ｖ１−９、Ｖ２−１、Ｖ２−１１、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ２−１５、Ｖ２−１７、Ｖ２−１９、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ３−２、Ｖ３−３、Ｖ３−４、Ｖ４−１、Ｖ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４、Ｖ５−６から選択される。
【００３３】
別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子にはヒトの生殖細胞系重鎖フレームワークが含まれる。特定の実施形態では、この重鎖ヒト生殖細胞系フレームワークは、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１およびＶＨ７−８１から選択される。
【００３４】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣＤ２０結合ペプチドまたはポリペプチドである。ある実施形態では、ＣＤ２０結合ペプチドは抗ＣＤ２０抗体または抗ＣＤ２０抗体の断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）を含む。別の実施形態では、ペプチドには軽鎖および／または重鎖可変領域が含まれる。特定の実施形態では、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域にはフレームワーク領域または少なくともフレームワーク領域の一部（例えばＦＲ２やＦＲ３などの二つから三つの準領域）が含まれる。ある実施形態では、少なくともＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３またはＦＲＬ４は完全にヒト型である。別の実施形態では、少なくともＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３またはＦＲＨ４は完全にヒトである。ある実施形態では、少なくともＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３またはＦＲＬ４は生殖細胞系（例えばヒトの生殖細胞）の配列である。別の実施形態では、少なくともＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３またはＦＲＨ４は生殖細胞系（例えばヒトの生殖細胞）の配列である。好ましい実施形態では、フレームワーク領域は完全にヒト型のフレームワーク領域（例えば図４−５および８−９に示されているヒト型のフレームワーク領域）である。ある実施形態では、フレームワーク領域には配列番号７１、７２、７３、７４、７９、８０、８１、８２またはそれらの組み合わせが含まれる。別の実施形態では、フレームワーク領域には配列番号８７、８８、８９、９０、９５、９６、９７、９８またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００３５】
ある実施形態では、本発明は核酸、アミノ酸、配列番号１−７０から選択される配列またはその補体の発現をコード化するコンピュータ可読媒体を提供する。ある実施形態では、コンピュータ処理装置に送られた場合、これらの配列の発現はユーザーに（例えばインターネットを通して）表示される。
【００３６】
ある実施形態では、本発明は、配列番号１−７０に見られる核酸配列、または配列番号１−７０に見られるアミノ酸配列をコード化する核酸配列と、（厳密性の低い、中程度、あるいは高い条件下で）ハイブリダイズする核酸配列を提供する。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は本出願に記載の核酸配列の補体を提供する（例えば表１−２および図２、３、６、７、１０および１１を参照）。ある実施形態では、本発明は厳密性の高い、中程度、あるいは低い条件下で本出願に記載の核酸配列とハイブリダイズを行なう配列を提供する（例えば表１−２および図２、３、６、７、１０および１１を参照）。
【００３８】
ある実施形態では、親和性定数（Ｋｄ）および会合速度（Ｋｏｎ）は、ＫｉｎＥｘａ平衡ソフト（例えばセパダイン・インスツルメンツ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、アイダホ州ボイジー（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ））を使って、ＩｇＧ細胞結合分析（つまり表面にヒトのＣＤ２０を発現する細胞）で決定される。ある実施形態では、親和性定数および会合速度定数は動的排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）で決定される（例えば、チュー（Ｃｈｉｕ）ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３、５４７７−５４８４（２００１）、ブレーク（Ｂｌａｋｅ）ら、生物化学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７１、２７６７７−２７６８５（１９９６）、ホンゴウ（Ｈｏｎｇｏ）ら、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、１９、３０３−３１５（２０００）、コスラビアニ（Ｋｈｏｓｒａｖｉａｎｉ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１、２６７−２７７（２０００）、パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら、免疫方法ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２５１、１２３−１３５（２００１）を参照、これらは全て参照として本出願に組み込まれている）。特定の実施形態では、動的排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）はＫｉｎＥｘＡ装置（例えばセパダイン・インスツルメンツ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）３０００、アイダホ州ボイジー（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ））または類似の機器を使用して行なわれる。
【００３９】
他の実施形態では、ＣＤ２０結合分子にはＦａｂが含まれ、さらに一つまたはそれ以上の定常領域（例えばＣＨ２および／またはＣＨ３、図１０−１１を参照）が含まれる。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子には抗体（例えば合成ＣＤＲ配列を有し、完全にヒト型のフレームワークを含む抗体）が含まれる。ある実施形態では、抗体には変質した（例えば突然変異した）Ｆｃ領域が含まれる。例えばある実施形態では、抗体のエフェクター機能を向上または低下させるためにＦｃ領域が変更されている。ある実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、その他から選択されるアイソタイプである。
【００４０】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域のＣＨ２ドメインにアミノ酸修飾が導入される。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の結合親和力または活性が変化したＩｇＧ Ｆｃ変異領域を作成するための修飾に有用なアミノ酸の位置には、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９のアミノ酸位置の一つあるいはそれ以上が含まれる。好適な実施形態では、そのような変異体を作成するためのテンプレートとして使用される親Ｆｃ領域は、ヒトのＩｇＧ Ｆｃを含む。ある実施形態では、ＦｃγＲとの結合力の低下したＦｃ領域変異体を生成するために、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９、のアミノ酸位置の一つまたはそれ以上にアミノ酸修飾を導入することができる。特定の実施形態では、一つまたはそれ以上のＦｃγＲｓとの結合が向上したＦｃ領域変異体が生成されることもある。そのようなＦｃ領域変異体は、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８または４３０、のアミノ酸位置の一つまたはそれ以上にアミノ酸修飾を含む。ある実施形態では、アミノ酸修飾はＹ３００Ｉである。
【００４１】
別の実施形態では、アミノ酸修飾はＹ３００Ｌである。ある実施形態では、アミノ酸修飾はＱ２９５ＫまたはＱ２９５Ｌである。ある実施形態では、アミノ酸修飾はＥ２９４Ｎである。別の実施形態では、２９６の位置のアミノ酸修飾はＹ２９６Ｐである。ある実施形態では、２９８の位置のアミノ酸修飾はＳ２９８Ｐである。別の実施形態では、アミノ酸修飾はＳ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｐ、Ｓ２９８ＶまたはＳ２９８Ｄである。
【００４２】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は重鎖定常領域の突然変異を含む。別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＤ２８０ＨおよびＫ２９０Ｓから選択された、突然変異を起こした重鎖定常領域を含む。
【００４３】
代替的あるいは追加的に、アミノ酸修飾と、Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の補体依存性細胞毒性機能を変化させる一つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸修飾とを組み合わせることが有用である。特に関連する出発ポリペプチドは、Ｃ１ｑと結合し補体依存性細胞毒性機能（ＣＤＣ）を示すものであり得る。本出願に記載のアミノ酸置換は、Ｃ１ｑと結合するおよび／または補体依存性細胞毒性機能を修正する（例えばこれらの作動体の機能を減少、及び望ましくは取り除く）出発ポリペプチドの機能を変化させる働きをする。しかしながら、上述の一つまたはそれ以上の位置に、より優れたＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性機能（ＣＤＣ）を備えた置換体を含むポリペプチドも本出願では考慮されている。例えば、出発ポリペプチドは、Ｃ１ｑを結合するおよび／またはＣＤＣを媒介することはできないかもしれないし、またこれらのエフェクター機能を取得するべく、本出願の内容に従って修正されるかもしれない。さらに、既存のＣ１ｑ結合活性、さらに任意的にＣＤＣ媒介機能を有するポリペプチドが、これらの活性のうち一つまたは両方の活性を向上させるべく修正されることもある。Ｃ１ｑを変化させるおよび／またはその補体依存性細胞毒性機能を修正するアミノ酸修飾が、例えば参照としてここに組み込まれているＷＯ００４２０７２に記載されている。
【００４４】
上述のように、変更されたエフェクター機能を備えたＣＤ２０結合分子のＦｃ地域を、例えばＣ１ｑ結合および／またはＦｃγＲ結合を修正し、その結果ＣＤＣの活性および／またはＡＤＣＣ活性を変化させることによって設計することが可能である。例えば、改善されたＣ１ｑ結合および改善されたＦｃγＲＩＩＩ結合を備えた（例えば、改善されたＡＤＣＣ活性および改善されたＣＤＣ活性の両方を備えた）ＣＤ２０結合分子の様々なＦｃ地域を生成することが可能である。
【００４５】
あるいはエフェクター機能を減退または除去したい場合は、減退したＣＤＣ活性および／または減退したＡＤＣＣ活性を有するＦｃ変異領域を作成してもよい。別の実施形態では、これらの活性のいずれか一方だけを向上させ、他の活性を任意的に減退させること（例えばＡＤＣＣ活性を向上させＣＤＣ活性を減退させること、あるいはその逆によるＦｃ変異領域の作成）も可能である。
【００４６】
Ｆｃ変異体を本発明のＣＤ２０結合分子に導入し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を変化させ、薬物速度論的特性を改善することもできる。抗体のＦｃ領域とＦｃＲｎとの間の相互作用が血清免疫グロブリンの持続性に何らかの役割を演じている事がいくつかの実験で示されている。例えば、機能性ＦｃＲｎが欠如しているマウスのＩｇＧ分子において、血清の異常に短い半減期が観察されている。ＦｃＲｎとの結合を改善するＦｃの変異により血清の半減期が長くなると思われ、一方、ＩｇＧ結合の強化をもたらすラットのＦｃＲｎにおける変異もまた血清の半減期を向上させる。ＦｃＲｎとの結合が改善されたヒトＦｃ変異体のコレクションも記載されている（シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、ヒトＩｇＧＩのＦＣγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎ結合領域の高解像度マッピング、およびＦｃγＲとの結合が改善されたＩｇＧ１変異体のデザイン、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、６５９１−６６０４（２００１））。低ｐＨで観察される（例えば飲作用あるいは血清からのＩｇＧ分子による液相飲食作用中）ＩｇＧ分子とＦｃＲｎの結合親和性の増大が血清の半減期に影響を及ぼすことが報告されている（ゲティー（Ｇｈｅｔｉｅ）ら、ランダム変異誘発によるＩｇＧ断片の血清持続性の増加、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、６３７−６４０（１９９７）、メデサン（Ｍｅｄｅｓａｎ）ら、Ｆｃ：ＦｃＲｎ相互作用領域を説明するためのラットＩｇＧの比較研究、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、２０９２−２１００（１９９８）、キム（Ｋｉｍ）ら、ＭＨＣクラスＩ関連受容体の結合に関するヒトＩｇＧ領域マッピング、ＦｃＲｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９、２８１９−２８２５（１９９９）、ダーラクア（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ）ら、新生児Ｆｃ受容体に関するヒトＩｇＧＩの親和力増大：生物学的結果、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、５１７１−５１８０（２００２））。しかし、高ｐＨで結合を増強させる突然変異は血清の半減期に悪い影響を及ぼすと思われる（ダーラクアら、新生児Ｆｃ受容体に関するヒトＩｇＧＩの親和力増大：生物学的結果、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、５１７１−５１８０（２００２））。上述の文献は全て参照として本出願に編入されている。従って、低ｐＨでＦｃＲｎの親和性を増大させ、高ｐＨでＦｃＲｎの親和性を維持または減少させるように、Ｆｃ変異体を本発明のＣＤ２０結合分子に導入することができる。
【００４７】
別のタイプのアミノ酸置換は、ＣＤ２０結合分子Ｆｃ領域の糖鎖形成パターンを変更する働きをする。これは例えば、ポリペプチド内の一つまたはそれ以上の糖鎖形成領域を除去することにより、および／またはポリペプチド内に存在しない一つまたはそれ以上の糖鎖形成領域を加える事によって達成できる。Ｆｃ領域の糖鎖形成は通常Ｎ−リンクまたはＯ−リンクである。Ｎ−リンクは炭水化物の一部をアスパラギン残基の側鎖に結合させる事を意味する。ペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外のアミノ酸）は、炭水化物の一部がアスパラギン側鎖に酵素結合する際の認識配列である。従って、ポリペプチド中におけるこのようなペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的な糖鎖形成領域を形成する事になる。Ｏ−リンク糖鎖形成は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち一つの糖が、ヒドロキシアミノ酸（通常はセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使用されることもある）と結合する事を意味する。
【００４８】
ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域への糖鎖形成領域の付加は、上述のトリペプチド配列（Ｎ−リンク糖鎖形成領域）の一つまたはそれ以上を含むようにアミノ酸配列を変化させることにより容易に達成できる。典型的な糖鎖形成変異体は、重鎖の残基Ａｓｎ２９７のアミノ酸置換を有する。最初のポリペプチド（Ｏ−リンク糖鎖形成領域用）の配列に一つまたはそれ以上のセリンまたはトレオニン残基を付加する、あるいはそれらで置換する事によって変更することもできる。
【００４９】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）を発現する細胞において、ＧｎＴ ＩＩＩがＧｌｃＮＡｃをＣＤ２０結合分子に付加する形で発現する。結合分子をこのような形で作成する方法は、これらの全てが完全なものとして参照用に本出願に組み込まれている、ＷＯ９９５４３４２、ＷＯ０３０１１８７８、出願公告２００３０００３０９７Ａ１、およびウマナ（Ｕｍａｎａ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１７、１７６−１８０、１９９９年２月発行に記載されている。
【００５０】
ある実施形態では、本発明は、ａ）本発明のＣＤ２０結合分子、およびｂ）被験者の疾病を治療するためのＣＤ２０結合分子の使用手引書または科学的研究あるいは診断目的（例えばＥＬＩＳＡ分析など）のためのＣＤ２０結合分子の使用手引書を含む道具一式を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明のＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列が永続的または一時的にトランスフェクトされた細胞株を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は標識された種々の領域およびセクションを有するＩｇＧ分子の概念図である。ＣＤＲおよび二つの可変領域軽鎖のうちの一つ、また二つの可変領域重鎖のうちの一つのフレームワークも標識されている。
【００５２】
【図２】図２ＡはＡＭＥ３３（配列番号５９）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、図２ＢはＡＭＥ３３（配列番号６０）の軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５３】
【図３】図３ＡはＡＭＥ３３（配列番号６１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、図３ＢはＡＭＥ３３（配列番号６２）の重鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５４】
【図４】図４ＡはＣＤＲが散在した完全にヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩＩＩ（Ａ２７）（ＤＰＫ２２）のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される：ＦＲＬ１（配列番号７１）、ＦＲＬ２（配列番号７２）、ＦＲＬ３（配列番号７３）およびＦＲＬ４（配列番号７４）。図４ＢはＣＤＲが散在したヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩＩＩ（Ａ２７）（ＤＰＫ２２）の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される。ＦＲＬ１（配列番号７５）、ＦＲＬ２（配列番号７６）、ＦＲＬ３（配列番号７７）およびＦＲＬ４（配列番号７８）。
【００５５】
【図５】図５ＡはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域ＶＨ５−５１（ＤＰ−７３）のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される。ＦＲＨ１（配列番号７９）、ＦＲＨ２（配列番号８０）、ＦＲＨ３（配列番号８１）およびＦＲＨ４（配列番号８２）。図５ＢはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域Ｖ５−５１（ＤＰ−７３）の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される：ＦＲＨ１（配列番号８３）、ＦＲＨ２（配列番号８４）、ＦＲＨ３（配列番号８５）およびＦＲＨ４（配列番号８６）。
【００５６】
【図６】図６ＡはＡＭＥ５（配列番号６３）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図６ＢはＡＭＥ５（配列番号６４）の軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５７】
【図７】図７ＡはＡＭＥ５（配列番号６５）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図７ＢはＡＭＥ５（配列番号６６）の重鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５８】
【図８】図８ＡはＣＤＲが散在したヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩ（ＤＰＫ４）（Ａ２０）のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＬ１（配列番号８７）、ＦＲＬ２（配列番号８８）、ＦＲＬ３（配列番号８９）およびＦＲＬ４（配列番号９０）のように標識される。図８ＢはＣＤＲが散在したヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩ（ＤＰＫ４）（Ａ２０）の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＬ１（配列番号９１）、ＦＲＬ２（配列番号９２）、ＦＲＬ３（配列番号９３）およびＦＲＬ４（配列番号９４）のように標識される。
【００５９】
【図９】図９ＡはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域ＶＨＩ ＤＰ７／２１−２のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＨ１（配列番号９５）、ＦＲＨ２（配列番号９６）、ＦＲＨ３（配列番号９７）およびＦＲＨ４（配列番号９８）のように標識される。図９ＢはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域ＶＨＩ ＤＰＩ７／２１−２の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＨ１（配列番号９９）、ＦＲＨ２（配列番号１００）、ＦＲＨ３（配列番号１０１）およびＦＲＨ４（配列番号１０２）のように標識される。
【００６０】
【図１０】図１０ＡはＡＭＥ３３（配列番号６７）の軽鎖の完全アミノ酸配列を示し、図１０ＢはＡＭＥ３３（配列番号６８）の軽鎖の完全核酸配列を示す。
【００６１】
【図１１】図１１ＡはＡＭＥ３３（配列番号６９）の重鎖の完全アミノ酸配列を示し、図１１ＢはＡＭＥ３３（配列番号７０）の重鎖の完全核酸配列を示す。
【００６２】
【図１２】図１２は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ結合分析の結果を示す。
【００６３】
【図１３】図１３は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ結合分析の結果を示す。
【００６４】
【図１４】図１４は実施例３に記載の生体Ｂリンパ腫Ｆａｂ結合分析の結果を示す。
【００６５】
【図１５】図１５は実施例５に記載のＡＤＣＣ分析の結果を示す。
【００６６】
【図１６】図１６は実施例６に記載の糖鎖合成ＣＤ２０結合分子のＡＤＣＣ活性を示している。
【００６７】
【図１７】図１７は実施例９に記載の、ＡＭＥ３３抗体およびＣ２Ｂ８抗体に関わる生体内腫瘍阻害分析の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
定義
本発明の理解を助ける目的で、多くの用語が以下のように定義される。
【００６９】
本出願で使用されている「抗体」という用語は、四つのペプチド鎖、つまりジスルフィド結合で連結された二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は重鎖可変領域（本出願ではＨＣＶＲまたはＶＨと略）と重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（図１を参照）で構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本出願ではＬＣＶＲまたはＶＬと略）と軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬ（図１を参照）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる領域が組み込まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域に細分される。各可変領域（ＶＨまたはＶＬ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に指定される三つのＣＤＲを含んでいる（図１、４および５を参照）。各可変領域はＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に指定される四つの準領域であるフレームワークを含んでいる（図１、４および５を参照）。
【００７０】
本出願で使用されている「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部分を意味する。抗体断片の例として、これだけに限定されるものではないが、線形抗体、単鎖抗体分子、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、抗体断片から形成される多特異的抗体などが含まれる。抗体断片は重鎖および／または軽鎖可変領域の少なくとも一部を保持していることが望ましい。
【００７１】
本出願で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合で主な働きをする領域である。軽鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）、重鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）が存在する。これら六つのＣＤＲを構成している残基は、カバット（Ｋａｂａｔ）およびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）により次のように特徴付けられている：軽鎖可変領域の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）、そして重鎖可変領域の３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）；カバット（Ｋａｂａｔ）など、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ） （１９９１）、第５版、国立衛生研究所公衆衛生サービス（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）（参照として本出願に編入）、および軽鎖可変領域の残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）および９１〜９６（ＣＤＲＬ３）、そして重鎖可変領域の２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）および９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）；コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、９０１〜９１７（１９８７）（参照として本出願に組み込まれている）。特別の断りがない限り、本出願で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、カバット（Ｋａｂａｔ）とコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の両方に含まれる残基を含んでいる（すなわち軽鎖可変領域の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）、そして２６〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）である）。本出願では、指定されていない限り、ＣＤＲ残基の番号はカバット（Ｋａｂａｔ）の方法に基づいている。
【００７２】
本出願で使用される「フレームワーク」という用語は、本出願で定義されるＣＤＲ残基以外の可変領域の残基を意味する。フレームワークを構成する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の四つの準領域が存在する（図１、４および５を参照）。フレームワークの準領域が軽鎖可変領域であるか重鎖可変領域であるかを区別するために、準領域の略号に「Ｌ」か「Ｈ」を付けることもできる（例えば「ＦＲＬ１」は軽鎖可変領域のフレームワーク準領域１を示す）。特に指定されていない限り、ＣＤＲ残基の番号はカバット（Ｋａｂａｔ）の方法に基づいている。ある実施形態において、本出願のＣＤ２０結合分子が完全ではないフレームワークを有する場合がある（例えばＣＤ２０結合分子が四つの準領域のうち一つだけあるいは一つ以上を含むフレームワークの一部を有する場合がある）ことが知られている。
【００７３】
本出願で使用される「完全にヒト型のフレームワーク」という用語は、ヒトに自然に見られるアミノ酸配列を有するフレームワークを意味する。完全にヒト型のフレームワークの例には、これだけに限定されるものではないが、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、ＰＯＭなどが含まれる（例えばカバット（Ｋａｂａｔ）ら、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（１９９１）、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ、およびウー（Ｗｕ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２，２１１−２５０（１９７０）を参照、両方とも参照として本出願に組み込まれている））。
【００７４】
本出願で使用される「被験者」および「患者」という用語は、犬、猫、鳥、家畜などの哺乳類を含む動物で、ヒトであるのが望ましい。
【００７５】
本出願で使用される「コドン」または「トリプレット」という用語は、ポリペプチドに含まれる天然アミノ酸の一つを特定する、隣り合った三つのヌクレオチド・モノマーのグループを意味する。この用語には、どのアミノ酸も特定しないコドンも含まれる。遺伝子コドンの縮退のため、同じアミノ酸をコード化するコドンが複数存在する事も知られている。従って、本発明の核酸配列の多くの塩基（例えば表１および２を参照）を、コード化されている実際のアミノ酸配列を変えることなく変更することができる。本発明はそのような核酸配列を全て含むことを意図している。
【００７６】
本出願で使用される「ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」、「ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」および「ペプチドをコード化する核酸配列」という用語は、特定のポリペプチドのコード領域を含む核酸配列を意味する。当該コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの形で存在する。ＤＮＡの形で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）であっても二本鎖であってもよい。転写の適切な開始および／または１次ＲＮＡ転写物の正しいプロセッシングを必要とされている場合、エンハンサー・プロモーター、スプライス部位、ポリアデニレーション・シグナルなどの適切な調節要素を遺伝子のコード領域の直ぐ近くに配置することもできる。あるいは、本発明の発現ベクターに使用されるコード領域は、内因性のエンハンサー・プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニレーション・シグナルなど、または内因性と外因性の調節要素の組み合わせを含んでいることもある。
【００７７】
本出願で使用される「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」という用語の間には大きさの制限や区別はない。どちらの用語も単にヌクレオチドからなる分子を意味する。同様に、「ペプチド」と「ポリペプチド」という用語の間にも大きさの区別は存在しない。両用語とも単にアミノ酸残基で構成される分子を意味する。
【００７８】
本出願で使用される「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連した、ポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）について使用される。例えば配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は塩基対合則に従って核酸塩基の一部だけが一致している「部分的」なものでも、核酸間で「完全に」あるいは「全体に」相補的なものでもよい。核酸鎖間の相補性の度合いは、ハイブリダイゼーションの効果および強度に重要な影響を及ぼす。
【００７９】
本出願で使用される、所定の配列の「補体」という用語は、その全長にわたる配列に完全に相補的である配列に関して使用される。例えば配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」の「補体」である。本発明は、本出願に記載の配列の補体（例えば配列番号１−７０の核酸配列の補体）も提供する。
【００８０】
本出願で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合に関連して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち核酸間の結合の強さ）は、核酸間の相補性の度合い、条件の厳しさの度合い、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因の影響を受ける。
【００８１】
本出願で使用される「厳密性」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行なわれる温度、イオン強度、有機溶媒のような他の化合物の存在などの条件に関連して使用される。上述のパラメーターを単独でまたは組み合わせて変えることにより条件の「厳密性」変化させる事ができることを、当技術分野に精通した技術者は理解している。「厳密性の高い」条件では、核酸塩基の対形成は、相補的な塩基配列の頻度が高い核酸断片の間でのみ生じる（例えば「厳密性の高い」）条件下のハイブリダイゼーションは、約８５〜１００％同一、望ましくは約７０〜１００％同一の相同体間で生じる）。厳密性が中度の条件下では、核酸塩基の対形成は、相補的な塩基配列の頻度が中位の核酸断片の間で生じる（例えば「厳密性が中度の」条件下のハイブリダイゼーションは、約５０〜７０％同一の相同体の間で生じる）。従って、厳密性が「弱い」または「低い」条件下では、相補的な塩基配列の頻度が低いため、通常遺伝的に多様性のある有機体から導かれる核酸が要求される。
【００８２】
「厳密性の高い条件」という用語が核酸ハイブリダイゼーションとの関連で使用される場合、長さ約５００のヌクレオチドのプローブを使用する時は、５ＸＳＳＰＥ（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハーツ溶液（５０Ｘデンハーツ溶液は５００ｍｌ当たり５ｇのＦｉｃｏｌｌ（タイプ４００、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（画分Ｖ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）を含む））、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズし、その後０．１ＸＳＳＰＥおよび１．０％ＳＤＳの溶液中、４２℃で洗浄する条件が含まれる。
【００８３】
「中程度の厳密性の条件」という用語が核酸ハイブリダイゼーションとの関連で使用される場合、長さ約５００のヌクレオチドのプローブを使用する時は、５ＸＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハーツ溶液、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズし、その後１．０ＸＳＳＰＥおよび１．０％ＳＤＳの溶液中、４２℃で洗浄する条件が含まれる。
【００８４】
「厳密性の低い条件」という用語が核酸ハイブリダイゼーションとの関連で使用される場合、長さ約５００のヌクレオチドのプローブを使用する時は、５ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５Ｘのデンハーツ溶液、および１００ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズし、その後５ＸＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ溶液中、４２℃で洗浄する条件が含まれる。
【００８５】
「単離される」という用語が、「単離されたオリゴヌクレオチド」、「単離されたポリヌクレオチド」、「ＣＤ２０結合分子をコード化する単離された核酸配列」（例えば表１−２を参照）など、核酸との関連で使用される場合、識別された、またそれが通常関係している（例えば宿主細胞の蛋白質）少なくとも一つの汚染物である核酸から分離された核酸配列を意味する。
【００８６】
本出願で使用される「一部」という用語は、ヌクレオチド配列との関係で使用される場合（例えば「あるヌクレオチド配列の一部」）、その配列の断片を意味する。断片の大きさは１０ヌクレオチドから全ヌクレオチド配列マイナス一つのヌクレオチドまで様々であってよい（例えば１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００ヌクレオチドなど）。
【００８７】
本出願で使用される「一部」という用語は、アミノ酸配列との関係で使用される場合（例えば「あるアミノ酸配列の一部」）、その配列の断片を意味する。断片の大きさは六つのアミノ酸から全アミノ酸配列マイナス一つのアミノ酸まで様々であってよい（例えば６、１０、２０、３０、４０、７５、２００アミノ酸など）。
【００８８】
本出願で使用される「精製される」または「精製する」という用語は、サンプルから汚染物を除去する事を意味する。例えばＣＤ２０特異的な抗体は、汚染物である非免疫グロブリン蛋白質を除去する事により精製される。これらはまたあるいは同じ抗原と結合しない免疫グロブリンを除去する事によっても精製される。非免疫グロブリン蛋白質および／または特定の抗原と結合しない免疫グロブリンを除去する事により、サンプル中の抗原特異的な免疫グロブリンの比率が高まる結果となる。別の例では、抗原特異的な組み換えポリペプチドが細菌の宿主細胞で発現し、また宿主細胞の蛋白質を除去する事によりそのポリペプチドが精製され、サンプル中の抗原特異的な組み換えポリペプチドの比率が高まる。
【００８９】
本出願で使用される「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を一つの細胞から別の細胞へ移す核酸分子に関連して使用される。「ビヒクル」という用語が、「ベクター」と同じ意味で使用される場合もある。
【００９０】
本出願で使用される「発現ベクター」という用語は、希望のコード配列および特別の宿主生物内の機能的に連結したコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含む、組み換えＤＮＡ分子を意味する。原核生物における発現に必要な核酸配列には、プロモーター、オペレーター（任意）およびリボソーム結合部位が、他の配列とともに含まれる。真核細胞はプロモーター、エンハンサー、終止シグナル、そしてポリアデニレーション・シグナルを使用することが知られている。
【００９１】
本出願で使用される「宿主細胞」という用語は、生体内または生体外のあらゆる原核細胞または真核細胞をさす（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（クルセル社（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、オランダ）やＣＨＯ細胞などの哺乳類の細胞、鳥の細胞、両生類の細胞、植物細胞、魚の細胞および昆虫の細胞）。例えば、宿主細胞は遺伝子導入動物中に存在することもある。
【００９２】
本出願で使用される「コンピュータ・メモリ」および「コンピュータ・メモリ装置」という用語は、コンピュータ・プロセッサで読取り可能なあらゆる記憶媒体を意味する。コンピュータメモリには、これだけに限定されるものではないが、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、コンピュータ・チップ、デジタル・ビデオ・ディスク（ＤＶＤ）、コンパクト・ディスク（ＣＤ）、ハードディスク・ドライブ（ＨＤＤ）、磁気テープなどが含まれる。
【００９３】
本出願で使用される「コンピュータ読取り可能媒体」という用語は、コンピュータ・プロセッサに情報（例えばデータや指示）を保存および提供するあらゆる装置またはシステムを意味する。コンピュータ読取り可能媒体の例には、これだけに限定されるものではないが、例えばＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスク・ドライブ、磁気テープ、ネットワークのストリーム媒体用サーバーなどが含まれる。
【００９４】
本出願で使用される、核酸またはアミノ酸配列の「発現をコード化するコンピュータ読取り可能媒体」という用語は、プロセッサに配信されたときに、核酸またはアミノ酸配列をユーザーに表示（例えばプリントアウトや画面表示）することを可能にする情報を記憶している、コンピュータ読取り可能媒体を意味する。
【００９５】
本出願で使用される「プロセッサ」および「中央処理装置」あるいは「ＣＰＵ」という用語は同じ意味で使用され、コンピュータ・メモリ（例えばＲＯＭまたは他のメモリ）からプログラムを読取り、そのメモリに従って一連のステップを行なう事のできる装置を意味する。
【００９６】
本出願で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する（例えば表１を参照）。「Ｆｃ領域」は天然配列のＦｃ領域であってもよいし、変異体のＦｃ領域（例えば作動体の機能が減少または増大したもの）であってもよい。
【００９７】
本出願で使用されるように、Ｆｃ領域は（例えば被験者の）生物活性の活発化あるいは減退の原因である「作動体の機能」を有していてもよい。作動体の機能には、これだけに限定されるものではないが、例えばＣ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、食細胞活動、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーションなどが含まれる。このような作動体の機能は、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と結合することを必要とし、また種々の分析（例えばＦｃ結合分析、ＡＤＣＣ分析、ＣＤＣ分析など）を使って評価される。
【００９８】
本出願で使用される「単離された」ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質とは、識別され、自然環境の成分から分離および（または）回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、当該ポリペプチドの診断または治療のための使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、他の蛋白様または非蛋白様溶質が含まれる。ある実施形態では、単離されたポリペプチドは、（１）ロウリー（Ｌａｗｒｙ）法で測定してポリペプチドの重量比で９５％以上、好ましくは重量比で９９％以上になるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使ってＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クマシー・ブルーまたは銀染色を使い還元または非還元条件下でＳＤＳ−ｐａｇｅにより均一になるまで、のレベルまで精製される。そのポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組み換え細胞内の本来の位置のポリペプチドが含まれる。しかし、単離されたポリペプチドは通常、少なくとも一つの精製ステップを経て生成される。
【００９９】
本出願で使用される「治療」という用語は、治療を目的とした処置および予防的治療の両方を意味する。治療を必要とする人には、既に疾病に罹っている人およびその疾病の予防を希望する人が含まれる。
【０１００】
「症状が軽減する条件の下に」という用語は、ＣＤ２０結合分子で治療可能なあらゆる疾病の検出可能な症状の、あらゆる程度の質的あるいは量的な軽減を意味し、これには、決してこれだけに限定されるものではないが、疾病の回復速度に対する検出可能な影響（例えば体重の増加率）、あるいは特定の疾病に通常関連する症状の少なくとも一つの軽減が含まれる。
【０１０１】
本出願で使用される「ヒトのＣＤ２０」（本出願ではｈＣＤ２０と略）という用語は、ヒトのＢリンパ球制限分化抗原（Ｂｐ３５とも呼ばれる）を意味する。ＣＤ２０はＢ前駆体細胞成長の初期に発現し、血漿の細胞分化まで残る。ＣＤ２０分子は、細胞サイクルの開始および分化に必要なＢ細胞活性化プロセスの一段階を規制することもあり、新生物形成Ｂ細胞において通常極めて高レベルで発現する。ＣＤ２０は「正常な」Ｂ細胞にも「悪性の」Ｂ細胞（すなわち無制限の増幅がＢ細胞リンパ腫の原因となるＢ細胞）にも存在する。
【０１０２】
「親和性」、「結合親和性」および「Ｋｄ」という用語は、ＣＤ２０結合分子・ＣＤ２０蛋白の複合体に関連した解離平衡定数（濃度の単位で表現される）を意味する。結合親和性は、オフレート定数（一般に時間の逆数、例えば秒−１の単位で報告される）とオンレート（一般に時間単位当たりの濃度の単位、例えばモル／秒で報告される）の比に直接関係している。結合親和性は、例えばＥＬＩＳＡ分析、動的排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）、表面プラズモン共鳴などにより決定される。あるエピトープは細胞表面で繰り返し（多価性）生じる場合があり、抗体と反復エピトープとの結合の解離定数（ｋｏｆｆ）は、一価のリガンドと同抗体の反応の解離定数と比べて大幅に縮小する場合があることが知られている。一つの抗体・リガンド結合が解離すると、他の結合が二価（または多価）の抗体を多価のリガンドに繋ぎ止め、解離した結合が再び形成されるため、解離定数の縮小が起きる。二価（または多価）のＡｂと多価のリガンドとの反応の解離定数は、抗体の代表的な部位の会合定数である内因性の親和性と区別するために、機能的親和性と呼ばれる。
【０１０３】
本出願で使用される「解離」、「解離速度」および「ｋｏｆｆ」という用語は、抗原・抗体複合体からＣＤ２０結合分子が解離するオフレート定数を意味する。
【０１０４】
本出願で使用される「会合」、「会合速度」および「ｋｏｎ」という用語は、ＣＤ２０結合分子が抗原と会合し抗原抗体複合体を作るオンレート定数を意味する。
【０１０５】
本出願で使用される「有効濃度」および「ＥＣ５０」という用語は、十分な量のＣＤ２０分子と相互作して、処理された細胞の約５０％に影響を及ぼす事のできるＣＤ２０結合分子の濃度を意味する。
【０１０６】
発明の説明
本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列を提供する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に関して高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子を提供する。本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒト型のフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでいるのが望ましい。発明の説明は、便宜上、Ｉ．ＣＤ２０結合分子、ＩＩ．ＣＤ２０結合分子の作成、ＩＩＩ．治療用の調剤および使用、およびＩＶ．それ以外のＣＤ２０結合分子の使用、に分類される。
【０１０７】
Ｉ．ＣＤ２０結合分子
本発明は望ましい性質をもったＣＤ２０結合分子を提供する。特にある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し高い結合親和性（Ｋｄ）を有している。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し低い解離速度（ｋｏｆｆ）を有している。好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、高い親和性と低い解離速度を有し、低濃度で有効である。従って、当発明を実践または理解する必要なくして、高親和性と低解離速度を有する本発明のＣＤ２０結合分子が特にヒトの治療用に優れており、リツキサン（Ｃ２Ｂ８）のような他の抗ＣＤ２０分子と比べてＨＡＣＡ反応を引き起こす可能性が小さい事が理解される。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に結合する。別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子はカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）のＢ細胞表面のＣＤ２０と結合する。
【０１０９】
好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでおり、完全にヒト型のフレームワークを有していることが望ましい。特に好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでおり、ヒトの生殖細胞系フレームワークを有していることが望ましい。従って、本発明を実践または詳細に理解する必要なくして、フレームワーク領域が完全にヒトであるならば、ヒトに投与（例えば疾病の治療）した場合、本発明のＣＤ２０結合分子（例えば後述の実施例を参照）は免疫原性反応を殆どあるいは全く引き起こさないと考えられる。
【０１１０】
以下の表１および２に示されているように、本発明はＣＤ２０結合分子を作成するのに有効な数多くのＣＤＲを提供する。例えば、ＣＤ２０結合ペプチドまたはＣＤ２０結合ペプチドをコード化する核酸配列を作成するため、表示されている一つまたはそれ以上のＣＤＲをフレームワークの準領域（例えば完全にヒトのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４）と組み合わせることができる。あるいは、以下の表に示されているＣＤＲを、例えば、三つのＣＤＲが軽鎖可変領域に存在するように、および／または三つのＣＤＲが重鎖可変領域に存在するように組み合わせてもよい。
【０１１１】
ＣＤ２０結合分子またはＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列を作成するため、以下に示されているＣＤＲを（例えば組み換え技術を使って）ヒト型のフレームワーク、つまり図４−５および８−９に示されているような軽鎖および重鎖フレームワークに挿入してもよい。例えば、図４Ａ（または８Ａ）に示されているＣＤＲＬ１を、表１に示されるように配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１で置き換えることができる。同様に、図４Ｂ（または８Ｂ）に示されているＣＤＲＬ１を、表１に示されているように配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２で置き換えることができる。同じ方法が表１−２に示されている全てのＣＤＲに関して使用できる。以下に表１および２を示す。
表１ 軽鎖ＣＤＲ
【表１】
＊ 残基の番号付けにはカバット（Ｋａｂａｔ）の方法を採用した。ＣＤＲはカバット（Ｋａｂａｔ）およびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の残基を含む。
表２ 重鎖ＣＤＲ
【表２】
＊ 残基の番号付けにはカバット（Ｋａｂａｔ）の方法を採用した。ＣＤＲはカバット（Ｋａｂａｔ）およびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の残基を含む。
【０１１２】
本発明は、上の表に示されているＣＤＲ配列（アミノ酸および核酸）と実質的に同じ配列も提供する。例えば、表に示されている配列の中の一つまたは二つのアミノ酸を置き換えてもよい。さらに例えば、表に示されている配列において多数のヌクレオチド塩基を置き換えることもできる。アミノ酸配列の変更は、そのアミノ酸配列をコード化している核酸配列を変えることによって行われてもよい。所定のＣＤＲの変異体をコード化する核酸配列は、特定の配列に関する本明細のガイダンスを使い、当業者に知られている方法でも生成される。これらの方法には、これだけに限定されるものではないが、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、ＣＤＲをコード化する以前に生成した核酸のカセット変異誘発などによる生成が含まれる。置換変異体を生成する方法としては、部位特異的変異誘発が望ましい。この方法は当技術分野ではよく知られている（例えばカーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、４４３１−４４４３（１９８５）、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８−４９２（１９８５）を参照。両方とも参照として本出願に組み込まれている）。
【０１１３】
簡単に説明すると、ＤＮＡの部位特異的変異誘発を行う際、目的の変異をコード化しているオリゴヌクレオチドを出発ＤＮＡの一本鎖とまずハイブリダイズする事により、当該出発ＤＮＡが変質される。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、また出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって二本目の鎖全体が合成される。このようにして、目的の変異をコード化するオリゴヌクレオチドが結果として得られる二本鎖のＤＮＡに取り込まれる。
【０１１４】
出発ＣＤＲのアミノ酸配列変異体を作成するには、ＰＣＲ変異誘発も適している（例えばバレット（Ｖａｌｌｅｔｔｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７、７２３−７３３（１９８９）、参照として本出願に組み込まれている）。簡単に説明すると、ＰＣＲにおいて僅かな量のテンプレートＤＮＡを出発物質として使用する場合、テンプレートＤＮＡ内の対応する領域とわずかに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーとテンプレートが相違している位置だけテンプレート配列と異なるＤＮＡ断片を比較的大量に作成できる。
【０１１５】
変異体を生成する別の方法であるカセット式変異誘発は、ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３４、３１５−３２３（１９８５）（参照として本出願に組み込まれている）に記載の技術に基づいている。出発物質は、変異される出発ＣＤＲ ＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異される出発ＤＮＡのコドンが同定される。同定された変異部位の両側に、独特の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなくてはならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上述のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使って、出発ポリペプチドＤＮＡの適切な場所に制限部位を導入してもよい。プラスミドＤＮＡは、線形化するため当該の部位で切断される。制限部位間のＤＮＡ配列をコード化し、また目的の突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドが標準の方法を使って合成される。この場合、オリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、標準技術を使ってハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドと直接連結できるよう、線形化されたプラスミドの両端と適合する５’および３’末端を持つようにデザインされる。このようにして、突然変異ＤＮＡ配列を含むプラスミドが作成される。
【０１１６】
代替的にまたは追加的に、ポリペプチド変異体をコード化する目的アミノ酸配列を決定し、そのようなアミノ酸配列の変異体をコード化する核酸配列を合成してもよい。ＣＤＲのアミノ酸配列に保存的な修飾を施してもよい。天然の残基は側鎖の特性を基にいくつかのクラスに分類される。
（１） 疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２） 中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３） 酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４） 塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５） 鎖の方向付けに影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
（６） 芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
同類置換は、あるクラスのメンバーを同じクラスの別のメンバーで置き換える。本発明は、表１および２に示されている核酸配列の補体、および減密度が低い、中程度、また高い条件下でこのような核酸配列とハイブリダイズする核酸配列も提供する。
【０１１７】
本発明のＣＤＲは、どのタイプのフレームワークと共に使用してもよい。ＣＤＲは完全にヒト型のフレームワーク、またはフレームワークの準領域と一緒に使用するのが望ましい。特に好適な実施形態では、フレームワークはヒトの生殖細胞系配列である。完全にヒト型のフレームワークの例は、図４−５および８−９に示してある。その他の完全にヒト型のフレームワークまたはフレームワークの準領域を使用してもよい。例えばＮＣＢＩウェブサイトには、現在知られているフレームワーク領域の配列が含まれている。ヒトのＶＨ配列は、これだけに限定されるものではないが、例えばＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−８１などであり、これらは参照として本出願に編入されているマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、１９７３−１９７５（１９９８）に記載されており、ヒトの免疫グロブリン鎖可変領域座の完全なヌクレオチド配列を含んでいる。ヒトのＶＫ配列は、これだけに限定されるものではないが、例えばＡｌ、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０、Ａ２３、Ａ２６、Ａ２７、Ａ３、Ａ３０、Ａ５、Ａ７、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ１、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ９、Ｏ１、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１４、Ｏ１８、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ８などであり、これらは参照として本出願に組み込まれているカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１、１０１７−１０２８（２００１）、シェーブル（Ｓｃｈａｂｌｅ）およびツァッハウ（Ｚａｃｈａｕ）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ３７４、１００１−１０２２（１９９３）、およびブレンシン−クッパース（Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９１、１７３−１８１（１９９７）に記載されている。ヒトのＶＬ配列は、これだけに限定されるものではないが、例えばＶ１−１１、Ｖ１−１３、Ｖ１−１６、Ｖ１−１７、Ｖ１−１８、Ｖ１−１９、Ｖ１−２、Ｖ１−２０、Ｖ１−２２、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ１−５、Ｖ１−７、Ｖ１−９、Ｖ２−１、Ｖ２−１１、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ２−１５、Ｖ２−１7、Ｖ２−１９、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ３−２、Ｖ３−３、Ｖ３−４、Ｖ４−１、Ｖ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４、Ｖ５−６などであり、これらは参照として本出願に編入されているカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７、２５０−２６１（１９９７）に記載されている。完全にヒト型のフレームワークは、これらの機能的生殖細胞系遺伝子から選択される。通常これらのフレームワークは制限された数のアミノ酸の変更により互いに異なっている。これらのフレームワークを本出願に記載のＣＤＲと共に使用してもよい。本発明のＣＤＲと共に使用されるヒト型のフレームワークの追加的な例には、これだけに限定されるわけではないが、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、ＰＯＭなどがある（例えば、両方とも参照として本出願に編入されている、カバット（Ｋａｂａｔ）ら、（１９９１）免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ、およびウー（Ｗｕ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３２、２１１−２５０（１９７０）参照）。
【０１１８】
再び本発明を実践または理解する必要なくして、生殖細胞系の配列の使用がほとんどの個人において有害な免疫反応を排除すると期待されている理由は、以下の通りであると考えられている。通常の免疫反応中に生じる親和性成熟ステップの結果、免疫グロブリンの可変領域に体細胞の突然変異が頻繁に生じる。これらの突然変異は主に超可変的なＣＤＲの周りに生じるが、フレームワーク領域の残基にも影響を及ぼす。これらのフレームワークの突然変異は生殖細胞系の遺伝子には存在せず、また患者の免疫原性になる可能性は少ない。一方、一般集団は生殖細胞系の遺伝子によって発現されるフレームワーク配列の大多数に晒されており、免疫寛容の結果、これらの生殖細胞系のフレームワークは患者において免疫原性が低いあるいは被免疫原性であると予想される。免疫寛容の可能性を最大にするため、可変領域をコード化する遺伝子を普通に存在する機能的生殖細胞系遺伝子の集合から選択することができ、またさらにＶＨおよびＶＬ領域をコード化する遺伝子を免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖間の既知の関連性と一致させるために選択することもできる。
【０１１９】
ＩＩ．ＣＤ２０結合分子の作成
好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は抗体または抗体断片（例えば本出願に記載の一つまたはそれ以上のＣＤＲ）を含む。本発明の抗体または抗体断片は、例えば、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖遺伝子を宿主細胞内で組み換え・発現させる事により生成できる。抗体を組み換え・発現させるため、例えば、軽鎖および重鎖が宿主細胞の中で表現され、また望ましくは宿主細胞が培養され、そこから抗体が回収されるような培地中に分泌されるように抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコード化するＤＮＡ断片を含んだ、一つ以上の組み換え発現ベクターが宿主細胞に導入されることがある。標準の組み換えＤＮＡ技術を使用して、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子が得られ、これらの遺伝子を組み換え・発現ベクターに挿入し、そのベクターを宿主細胞に導入することもできる。このような方法は、いずれも参照として本出願に編入されている、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室手引書（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、（１９８９）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら編、分子生物学の現在の実験記録（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（１９８９）、およびボス（Ｂｏｓｓ）らによる米国特許番号４，８１６，３９７などに記載されている。
【０１２０】
本発明の一つまたはそれ以上のＣＤＲを有する抗体を発現させるには、軽鎖および重鎖可変領域をコード化するＤＮＡ断片をまず入手する。このようなＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、生殖細胞系の軽鎖および重鎖可変配列を増幅および修飾する事により入手できる。ヒト型の重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子に関する生殖細胞系ＤＮＡ配列は、当技術分野で良く知られている（上述参照）。
【０１２１】
生殖細胞系のＶＨおよびＶＬ断片を入手したら、本出願開示のＣＤＲアミノ酸配列の一つまたはそれ以上をコード化するように配列を変異させることができる（例えば表１−２を参照）。生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ ＤＮＡ配列でコード化されたアミノ酸配列が、生殖細胞系の配列とは異なるアミノ酸残基を識別するためのＣＤＲ配列と比較される。次に、どのヌクレオチドを変異させるかを決定する遺伝子コードを使用し、変異した生殖細胞系配列が選択されたＣＤＲ（例えば表１−２から選択された六つのＣＤＲ）をコード化するように、生殖細胞系ＤＮＡ配列の適切なヌクレオチドが変異される。生殖細胞系配列の変異誘発は、（ＰＣＲ産物が突然変異体を含むように、変異したヌクレオチドがＰＣＲプライマーに導入されるような）ＰＣＲ−媒介変異誘発や、部位特異的変異誘発などの標準の方法を使って行なわれてもよい。別の実施形態では、可変領域は新たに合成される（例えば核酸合成機を使用）。
【０１２２】
目的のＶＨおよびＶＬ部分をコード化するＤＮＡ断片が（例えば上述したように生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅および変異誘発または合成などを使用）入手できたら、例えば、可変領域の遺伝子を抗体の全長鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、あるいはｓｃＦｖ遺伝子などに変換するなど、このようなＤＮＡ断片を標準の組み換えＤＮＡ技術を使ってさらに操作することができる。のような操作では、ＶＬまたはＶＨをコード化しているＤＮＡ断片は、抗体の定常領域やフレキシブルリンカーなどの他のポリペプチドをコード化するＤＮＡ断片と操作可能な状態で連結される。ＶＨ領域をコード化している単離されたＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、図１０−１１を参照）をコード化している別のＤＮＡ分子に操作可能な状態で連結させる事により、全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト型の重鎖定常領域の遺伝子の配列は当技術分野で良く知られており（例えばカバット（Ｋａｂａｔ）、Ｅ．Ａ．ら、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ出版物Ｎｏ．９１−３２４２）（１９９１）、またこのような領域を含むＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により入手できる。重鎖定常領域は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であるが、最も好ましいのはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関しては、ＶＨをコード化するＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコード化する別のＤＮＡ分子と操作可能な状態で連結される。好適な実施形態では、重鎖定常領域は図１１に示される定常領域に類似しているかまたはそれと同一である。
【０１２３】
ＶＬ領域をコード化している単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコード化している別のＤＮＡ分子と操作可能な状態で連結する事により、全長の軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変更することができる。ヒト型の軽鎖定常領域の遺伝子の配列は当技術分野で良く知られており（例えばカバット（Ｋａｂａｔ）、Ｅ．Ａ．ら、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ出版物Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、またこのような領域を含むＤＮＡ断片は、標準のＰＣＲ増幅により入手できる。軽鎖定常領域は、例えばκまたはλ定常領域であるが、より好ましいのはκ定常領域である。好適な実施形態では、軽鎖定常領域は図１０に示される定常領域に類似しているかまたはそれと同一である。
【０１２４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作成するには、ＶＨおよびＶＬ配列が隣接する一本鎖蛋白質として発現し、ＶＬおよびＶＨがそのフレキシブルリンカーで連結される様な状態で（例えば、全て参照として本出願に編入されている、ハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９−５８８３（１９８８）、およびマッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４８、５５２−５５４（１９９０）参照）、ＶＨおよびＶＬをコード化するＤＮＡ断片が、フレキシブルリンカーをコード化（例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコード化）する別の断片に操作可能な状態で連結される。
【０１２５】
抗体または抗体の断片を発現させるには、その遺伝子が転写および翻訳調節配列に操作可能な状態で連結されるように、部分的または全長の軽鎖および重鎖をコード化する（例えば上述の方法で得られる）ＤＮＡが発現ベクターに挿入される。ここで「操作可能な状態で連結」という用語は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節できるように、つまりその本来の機能を発揮できるようなやり方で、抗体遺伝子をベクターに連結する事を意味する。発現ベクターおよび発現調節配列は、通常使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができるが、より一般的には両方とも同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準的な方法を使って発現ベクターに挿入してもよい（例えば抗体遺伝子断片への相補的制限部位の連結、あるいは制限部位がない場合は平滑末端連結）。軽鎖または重鎖配列を挿入する以前に、発現ベクターは既に抗体定常領域を含んでいる場合がある。例えば、ＶＨおよびＶＬ配列を全長の抗体遺伝子に変える一つの方法は、Ｈ部分がベクター内でＣＨ部分と操作可能な状態で連結し、ＶＬ部分がベクター内でＣＬ部分と操作可能な状態で連結するように、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコード化している発現ベクターにそれぞれを挿入する事である。代替的または追加的に、組み換え発現ベクターが、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナル・ペプチドをコード化することもできる。シグナル・ペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム単位で連結するように、抗体鎖の遺伝子をベクターにクローン化することができる。当該シグナル・ペプチドは免疫グロブリン・シグナル・ペプチドであってもよいし、異種のシグナル・ペプチド（すなわち非免疫グロブリン蛋白由来のシグナル・ペプチド）であってもよい。
【０１２６】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組み換え・発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含んでいてもよい。この「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するその他の発現調節要素（例えばポリアデニレーション・シグナル）を含むことを意図している。このような調節配列は、例えば、参照として本出願に編入されているゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８５（１９９０）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に記載されている。調節配列の選択を含んだ発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞、目的の蛋白質の発現レベルなどの要因に依存している事が、当技術分野に精通した技術者により評価される。哺乳類の宿主細胞発現にとって好ましい調節配列には、哺乳類の細胞で蛋白質の発現を高レベルで方向付けするウィルス要素、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオマウィルスなどのプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウィルスの調節要素およびその配列に関する詳細は、全て参照として本出願に編入されているスティンスキ（Ｓｔｉｎｓｋｉ）による米国特許番号５，１６８，０６２、クーセンス（Ｃｏｕｓｅｎｓ）などによる米国特許番号４，５１０，２４５およびコジンスキー（Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ）による米国特許番号４，９６８，６１５を参照のこと。
【０１２７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本発明の組み換え・発現ベクターは、宿主細胞（例えば複製源）でベクターの複製を調節する配列や選択可能マーカー遺伝子などの配列を含んでいてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターを導入する宿主細胞の選択を容易にする（例えばアクセル（Ａｘｅｌ）らによる米国特許番号４，３９９，２１６、４，６３４．６６５および５，１７９，０１７を参照）。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、典型的に、ベクターが導入された宿主細胞上で、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの医薬品への抵抗力を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択・増幅と共にｄｈｆｒ宿主細胞で使用）およびネオマイシン遺伝子（Ｇ４１８選択）を含んでいる。
【０１２８】
軽鎖および重鎖の発現に関しては、重鎖および軽鎖をコード化する発現ベクターを標準技術を使って宿主細胞に形質移入してもよい。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核生物や真核生物の宿主細胞に外因性のＤＮＡを導入するのに一般に使用される多種多様な技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを含むことを意図している。
【０１２９】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子を発現させるのに使用される発現ベクターは、レトロウィルス・ベクターなどのウィルス・ベクターである。このようなウィルス・ベクターを、安定して形質導入された細胞株の生成に利用してもよい（例えばＣＤ２０結合分子の継続提供源）。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子（およびＣＤ２０結合分子を発現する安定した細胞株）を生成するために、ＧＰＥＸ遺伝子生成物発現技術（ガラ・デザイン・インク（Ｇａｌａ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ））を利用する。特定の実施形態では、ブレック（Ｂｌｅｃｋ）による、ＷＯ０２０２７８３およびＷＯ０２０２７３８（いずれも参照として全て本出願に編入されている）に記載の発現技術が利用される。
【０１３０】
本発明の組み換え抗体を発現させる哺乳類の好ましい宿主細胞には、例えばＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（クルセル社（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、オランダ）、チャイニーズハムスターの子宮（ＣＨＯ細胞）（ウアラウプ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６−４２２０（１９８０）に記載され、例えばＲ．Ｊ．カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびＰ．Ａ．シャープ（Ｓｈａｒｐ）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９、６０１−６２１（１９８２）に記載のごとくＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞などが含まれる。他の好適な実施形態では、両方とも参照として本出願に編入されているＷＯ９９５４３４２および米国特許出願公告２００３０００３０９７に記載されているように、発現したＣＤ２０結合分子がＡＤＣＣ活性を向上させるような形で、宿主細胞がＧｎＴ ＩＩＩを発現する。抗体の遺伝子をコード化している組み換え・発現ベクターを哺乳類の宿主細胞に導入する場合、抗体は通常、宿主細胞内で抗体の発現に必要な期間宿主細胞を培養することにより、あるいはさらに好ましくは、宿主細胞を培養する培地に抗体を分泌させるにより生成される。抗体は、標準的な蛋白質精製方法を使って培地から回収される。
【０１３１】
また、Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ分子など無傷の抗体の一部を生産するために宿主細胞を利用することもできる。上述の方法の変形体も本発明の範囲内にあることが理解されている。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコード化するＤＮＡを宿主細胞に形質移入することが望ましい。また、ｈＣＤ２０との結合に必要でない軽鎖および／または重鎖をコード化するＤＮＡの一部または全部を除去するために、組み換えＤＮＡ技術を使ってもよい。このような切断ＤＮＡ分子から発現した分子もまた本発明の抗体に含まれる。さらに、一つの重鎖と一つの軽鎖が本発明の抗体であり、もう一つの重鎖および軽鎖がｈＣＤ２０以外の抗原に特異的であるような二機能抗体を生産してもよい（例えば標準的な化学架橋結合技術を使って、本発明の抗体を第２の抗体に架橋結合させる）。
【０１３２】
抗体またはその断片の組み換え・発現にとって好ましいシステムの一つにおいて、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコード化する組み換え・発現べクターが、リン酸カルシウム媒介の形質移入により、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組み換え・発現べクター内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子はそれぞれエンハンサー・プロモーター調節要素（例えばＣＭＶエンハンサー・ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素やＳＶ４０エンハンサー・ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素などの、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウィルスから派生し多要素）と操作可能な状態で連結し、遺伝子の転写レベルを高めている。組み換え・発現べクターはまたＨＦＲ遺伝子を含むこともあり、この遺伝子は、メトトレキセートの選択・増幅を利用して、ベクターが形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現のために培養され、当該培地から無傷の抗体が回収される。組み換え・発現べクターの生成、宿主細胞への形質移入、形質転換体の選択、宿主細胞の培養および培地からの抗体の回収のため、分子生物学の標準技術が使用される。
【０１３３】
ある実施形態では、本発明の抗体および抗体の断片が遺伝子導入動物中で生成される。例えば、遺伝子導入羊や雌牛を使って、そのミルクの中に抗体または抗体の断片を生成することもできる（例えば、参照として本出願に編入されているポラック（Ｐｏｌｌｏｃｋ）ＤＰら、組み換え抗体生産の一方法である遺伝子導入ミルク、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１、１４７−１５７（１９９９）参照）。本発明の抗体または抗体の断片を植物中で生成してもよい（例えば参照として本出願に編入されているラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら、植物を使ったＩｇＡ分泌抗体の生産、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１８、８７−９４（２００１）参照）。これ以外の方法や精製プロトコルは、参照として本出願に編入されているハンフリーズ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ）ら、治療用抗体生産技術：分子応用、発現および精製、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．、４、１７２−１８５（２００１）に記載されている。ある実施形態では、本発明の抗体または抗体の断片は遺伝子導入されたニワトリにより生成される（例えば、両方とも本出願に組み込まれている米国特許出願公告２００２０１０８１３２および２００２００２８４８８を参照）。
【０１３４】
ＩＩＩ．治療用調剤および使用
本発明のＣＤ２０結合分子（例えば抗体および抗体の断片）は疾病に罹った被験者を治療するのに有効である。ＣＤ２０結合分子はまた診断にも使用される（例えば標識付きＣＤ２０結合分子を組織の画像化に使用）。好適な実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＢ細胞の増殖が無限に継続することを特徴とするＢ細胞リンパ腫の患者に投与される。
【０１３５】
ある実施形態では、診断および治療目的で、ＣＤ２０結合分子が種々の放射標識物質と結合される。放射標識物質は腫瘍および他の組織の「画像化」を可能にし、腫瘍の放射線治療に役立つ。典型的放射標識物質には、これだけに限定されるものではないが、例えば１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅなどがあり、好ましくは９０Ｙである。
【０１３６】
ある実施形態で治療された疾病は非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）である。ある実施形態では疾病は、再発ホジキンス病、悪性度の高い抵抗性ホジキンス病、低悪性度および中悪性度の非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞性悪性リンパ腫（ＬＰＬ）、被膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、瀰漫性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、エイズ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症、小リンパ球型、濾胞性瀰漫性大細胞型、彌慢性小開裂細胞型、大細胞免疫芽球性リンパ腫、小非開裂型、バーキットおよび非バーキット型、濾胞性大細胞型、濾胞性小開裂細胞型、濾胞性小開裂・大細胞混合型リンパ腫、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から選択される。特定の実施形態では、治療される疾病はヴァルデンストローム・マクログロブリン血症（ＷＭ）または慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）である。
【０１３７】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子はＣＤ２０＋細胞の枯渇が治療面で有益である場合に、例えば、ヴァルデンストローム・マクログロブリン血症、多発性骨髄腫、プラズマ細胞悪液質、慢性リンパ球白血病、移植組織の処置、ヘアリー・セル白血病、ＩＴＰ、幹細胞移植後のエプスタイン・バー・ウィルス・リンパ腫、腎臓移植などの疾病の治療に使用される。本出願に編入されている米国特許出願公告２００２０１２８４４８を参照のこと。別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、骨髄腫、自己免疫疾患、移植、移植片対宿主病、Ｂ細胞に関係する感染症およびリンパ球増殖病から成るグループから選択された疾病の治療、およびＢ細胞活性および／または体液性免疫の抑制が望まれる疾病や症状の治療に使用される。ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、骨髄腫、移植、移植片対宿主病、自己免疫疾患、リンパ球増殖症状から成るグループから選択された疾病の治療、あるいは体液性免疫、Ｂ細胞機能および／または増殖の阻害が治療面で有益である疾病や症状の治療に使用される。さらに別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、Ｂ−ＡＬＬ、ヘアリー・セル白血病、多発性骨髄腫、リクター症候群、獲得第ＶＩＩＩ因子阻害遺伝子、抗リン脂質症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、水疱性類天疱瘡、寒冷赤血球凝集素病、エバンス症候群、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、特発性血小板減少紫斑病、ＩｇＭ関連多発性神経障害、カポージ肉腫関連ヘルペスウィルス（ＫＳＨＶ）関連多中心型キャッスルマン病（ＭＣＤ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、赤芽球癆、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性免疫複合体脈管炎、全身性エリテマトーデス、ＩＩ型混合寒冷グロブリン症、ウェジナー肉芽腫、同種異系移植片拒絶および移植後リンパ球増殖病の治療、または骨髄移植のための幹細胞の浄化のために使用される。
【０１３８】
好適な実施形態では、治療される被験者は免疫不全ではない（例えばＳＬＥ患者）。いかなるメカニズムにも制限されることなく、本発明のＣＤ２０結合分子は、これまで知られている抗ＣＤ２０抗体と比べ、特に非免疫抑制患者において、ＨＡＣＡ反応を引き出す可能性が少ないと考えられている。従って、有害なＨＡＣＡ反応の心配をしないで非免疫抑制患者を治療することができる。また、本発明のＣＤ２０結合分子の結合能力は改善されているため、患者に低用量を投与してもよいし（ＨＡＣＡ反応の危険性をさらに回避）、あるいは生死に関わるＨＡＣＡ反応の危険性なしに高用量を投与することもできる。別の好適な実施形態では、被験者は慢性関節リウマチまたはその他の自己免疫疾患に罹っている（例えば、本出願に編入されたエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、リウマチ病学（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（オックスフォード）２００１年２月；４０（２）：２０５−１１を参照）。
【０１３９】
本発明のＣＤ２０結合分子を、他の治療用の物質と共に投与してもよい。例えば、ＣＤ２０結合分子を化学療法プログラムの一環として投与してもよい（例えばＣＨＯＰ）。またＣＤ２０結合分子を、サイトカイン、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−２と共に投与してもよい（本出願に編入されている米国特許６，４５５，０４３を参照）。
【０１４０】
本発明のＣＤ２０結合分子は、例えば非経口、経口、皮下、局所、腹腔内、肺内、鼻腔内、病変内投与（例えば局部免疫抑制治療）などを含む、いかなる方法で投与してもよい。非経口注入には、これだけに限定されるものではないが、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下投与などが含まれる。さらに、ＣＤ２０結合分子は、特に低用量で、パルス注入によって投与してもよい。投与が短期的なものであるか長期的なものであるかにある程度基づき、投与は注射により、あるいは最も好ましくは静脈内または皮下注射によって行なわれる。
【０１４１】
投与計画は、最も望ましい反応（例えば治療面または予防面の反応）が得られるように調整される。例えば、ボーラスを単回投与しても、時間をかけ数回に分けて投与してもよいし、あるいは治療状態の必要にあわせて投与量を増やしたり減らしたりしてもよい。非経口組成物を用量単位形式で調剤すると、投与も容易となり、用量の均一性も保たれて有利である。本発明のＣＤ２０結合分子の用量は通常、（ａ）活性成分の独自の性質および目的としている治療的または予防的効果、および（ｂ）個人の感受性の治療のためにこのような活性成分を合成する技術に固有の限界によって決定される。
【０１４２】
抗体または抗体の断片（または本発明の他のＣＤ２０結合分子）の治療的または予防的有効量の、典型的で被限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態では、当該用量は５０〜６００ｍｇ／ｍ２（例えば３７５ｍｇ／ｍ２）である。緩和される症状のタイプおよび重篤度により投与量が変化することに注意しなくてはならない。またさらに、どのような被験者についてもその人のニーズ、そして組成物を投与したり投与を監督する人の専門家としての判断に従って、時が経つと共に用量を調整すべきであること、また本出願に説明されている用量の範囲は単に例示であり、本発明を制限するものではない点にも注意しなくてはならない。
【０１４３】
投与量は勿論、特定の薬の薬物動態学的な特徴、投与方法および経路、被投与者の年齢、健康状態、そして体重、症状の性質および重篤度、併用療法の種類、治療の頻度、目的とする効果などの既知の要因により変化する。例えば、活性成分の１日の投与量は体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから１００ｍｇである。通常、１日に体重１ｋｇ当たり１．０ｍｇから５ｍｇ、好ましくは１ｍｇから１０ｍｇを１から６回に分けるか、持続放出形式で投与する方が、希望する結果を得るのに有効な場合がある。
【０１４４】
本発明のＣＤ２０結合分子、被験者への投与に適した薬剤組成物に組み込むこともできる。例えば薬剤組成物は、ＣＤ２０結合分子（例えば抗体または抗体の断片）および製薬的に容認できる担体を含んでいてもよい。本出願で使用される「製薬的に容認できる担体」という用語には、生理学的適合性のある、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌薬、等張性薬剤、吸収遅延薬などが含まれる。製薬的に容認できる担体には、次の物質の一つまたはそれ以上が含まれる。水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせ。多くの場合、組成物の中に砂糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどのなどの等張性薬剤が含まれることが望ましい。製薬的に容認できる担体にはさらに、ＣＤ２０結合分子の貯蔵寿命または効果を向上させる、加湿薬、乳化剤、保存剤、緩衝液などの補助物質が少量含まれることもある。
【０１４５】
本発明の組成物は様々な形態で存在する。これらには、例えば溶液（例えば注射および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、小丸剤、粉末、リポソームおよび座薬などの、液体、半固体および固体の投薬形態が含まれる。好ましい形態は、投与方法および治療アプリケーションの内容に基づいて決められる。通常好まれる組成物は、例えば他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物のような、注射および注入可能な溶液である。
【０１４６】
治療用の組成物は通常、製造および貯蔵条件下で無菌でありしかも安定している。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、あるいはその他の高濃度の薬剤に適した秩序形態に調剤することができる。注射可能な無菌溶液は、要求量の活性化合物（つまり抗体または抗体の断片）を上述の成分またはその組み合わせと一緒に適切な溶媒に組み入れ、要求に応じて、その後無菌濾過する事により生成できる。一般に分散液は、分散媒体や上述の必要成分を含む無菌溶剤に活性化合物を組み入れる事により生成される。注射可能な無菌溶液の生成に使用される無菌粉末の好ましい生成方法は、活性成分に加え以前に無菌濾過された溶液から得られる追加的な望ましい成分の粉末を生成する、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は粒子の規定のサイズの保持、また表面活性剤の使用により維持される。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物の中にモノステアリン酸塩やゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を含める事により達成できる。
【０１４７】
ある実施形態では、当該活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル化された送達システムを含む放出制御製剤のような、化合物の急速な放出を防ぐ担体を使用して生成される。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生物分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。このような調剤の調製方法の多くは特許を受けており、当業者には一般的に知られている（例えば、持続的および放出調節医薬品送達システム、Ｊ．Ｒ．ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）版、マルセル・デッカー・インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９７８を参照）。
【０１４８】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、例えば不活性の希釈剤や同化可能な食用の担体などと共に経口投与される。当該化合物（および必要ならば他の成分）はまた、硬質または軟質のゼラチン・カプセルに被包化されたり、錠剤に圧縮されたり、あるいは直接被験者の食事に混入されることもある。治療用経口投与の場合、当該化合物は賦形剤と共に組み入れられ、服用可能な錠剤、頬錠剤、トローチ剤、カプセル、エリクシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用される。非経口投与以外の方法で本発明の化合物を投与するため、不活性化を防止する物質と共に投与する、あるいはそのような物質でコーティングする必要があるかもしれない。
【０１４９】
本発明の薬剤組成物には、本発明の抗体または抗体断片の「治療面での有効量」または「予防面での有効量」が含まれる。「治療面での有効量」とは、用量および期間の点で、好ましい治療結果を得るための有効量を意味する。抗体または抗体断片の治療面での有効量は、個人の疾病の状態、年齢、性別および体重、好ましい反応を引き出す抗体または抗体断片の効果などの要因により異なる。さらに治療面での有効量とは、治療効果が抗体または抗体断片の毒性または有害作用を凌駕する量でもある。「予防面での有効量」とは、用量および期間の点で、好ましい予防結果を得るための有効量を意味する。一般に、予防用の用量は疾病に罹る前または疾病の初期に被験者に使用されるため、予防面での有効量は通常治療面での有効量より少ない。
【０１５０】
ＩＶ．ＣＤ２０結合分子の他の使用方法
本発明のＣＤ２０結合分子、例えば抗ＣＤ２０ペプチドおよび／または抗体は、サンプル中またはＣＤ２０を含むＢ細胞中のＣＤ２０を検出または定量する免疫測定に有効である。ＣＤ２０の免疫測定には通常、検出可能な標識付けのされた高親和性の抗ＣＤ２０ペプチドおよび／または選択的にＣＤ２０に結合することのできる本発明の抗体の存在下における成体サンプルの培養、およびサンプル中で結合した標識のついたペプチドあるいは抗体の検出が含まれる。種々の臨床分析方法は当技術分野で知られている。
【０１５１】
従って、抗ＣＤ２０ペプチドまたは抗体を、ニトロセルロースまたは溶解性の蛋白質を固定できる他の固体支持体上で捕獲することが可能である。次にＣＤ２０を含むサンプルを支持体に加え、その後適切な緩衝液を使って洗浄して結合しなかった蛋白質を除去する。二番目の検出可能な標識付けをされたＣＤ２０特異的なペプチドまたは抗体をその固体相支持体に加え、さらに緩衝液で再び洗浄して検出可能な標識付けをされた結合しなかったペプチドまたは抗体を除去する。固体支持体に結合した標識化合物の量は既知の方法を使って検出できる。
【０１５２】
「固体相支持体」または「担体」とは、ペプチド、抗原または抗体に結合できるあらゆる支持体を意味する。よく知られている支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱などが含まれる。本発明の目的では、担体はある程度溶解性であってもよいし、不溶性であってもよい。支持体の物質は、結合した分子がＣＤ２０との結合能力を維持できる限り、実質的にどのような構造体であってもよい。従って、支持体の構造は、ビーズのように球体であってもよいし、試験管の内面または棒の外面のような円筒状であってもよい。あるいは表面は、プレート、培養皿、試験用細片、マイクロタイター用プレートなどのように平たいものであってもよい。好ましい支持体にはポリスチレン・ビーズが含まれる。当業者は、抗体、ペプチド、または抗原と結合する適切な担体をその他にも数多く知っており、通常の実験を通してそれを確認することができる。抗ＣＤ２０ペプチドおよび／または抗体の結合活性を測定するのに、既知の方法を使用することができる。当業者は、通常の実験を通して、実施可能で最適な分析条件を決定することができる。
【０１５３】
ＣＤ２０特異的なペプチドおよび／または抗体のＣＤ２０結合分子の検出可能な標識化は、酵素免疫測定（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で使用される酵素との結合により達成できる。結合した酵素は露呈した基質と反応して、例えば分光光度計、蛍光光度計、あるいは可視的に検出することのできる化学物質を生産する。本発明のＣＤ２０結合分子の検出可能な標識化に使用される酵素には、これだけに限定されるものではないが、例えばリンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌核酸分解酵素、δ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＲＮＡ分解酵素、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが含まれる。
【０１５４】
ＣＤ２０結合分子を放射活性物質で標識化する事により、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）を使用してＣＤ２０を検出することが可能となる（例えばワーク（Ｗｏｒｋ）ら、分子生物学に於ける実験技術および生化学（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９７８）、ノース・ホランド出版社（Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨークを参照）。放射性同位元素は、ガンマ計数器、シンチレーション計数器、オートラジオグラフィなどを使用した方法で検出される。
【０１５５】
ＣＤ２０結合分子を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識分子が適切な波長の光に晒されると、蛍光性の故にその存在が検出できる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミンなどである。
【０１５６】
１２５Ｅｕや他のランタニド系列の蛍光放射金属を使ってＣＤ２０結合分子に検出可能な標識付けをすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化グループを使ってＣＤ２０結合分子に結合される。
【０１５７】
また、ケミルミネセンス化合物と結合させる事によりＣＤ２０結合分子に検出可能な標識付けをすることもできる。ケミルミネセンス標識分子の存在は次に、化学反応中に生じる発光の存在を検出する事により決定される。特に有効なケミルミネセンス標識化合物の例には、例えばルミノール、イソルミノール、テロマチック・アクリジニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどがある。
【０１５８】
同様に、生物発光性の化合物を本発明のＣＤ２０結合分子の標識に使用することができる。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光の反応効率を増加させる生物システム内に見られる一種の化学発光である。生物発光性のタンパク質の存在は、発光の存在を検出する事により決定される。標識に使用される重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１５９】
ＣＤ２０結合分子の検出は、例えば検出可能な標識が放射性ガンマエミッターの場合はシンチレーション計数器、例えば標識が蛍光物質の場合は蛍光光度計により達成できる。酵素標識の場合、検出は酵素基質を利用した比色法によって行なわれる。基質の酵素反応の程度を同様に生成した標準物質と目視で比較する事によっても検出を行なうことも可能である。
【０１６０】
本発明のある実施形態では、上述の分析で検出されるＣＤ２０は生物サンプルの中に存在することができる。ＣＤ２０を含むあらゆるサンプルが使用可能である。サンプルは例えば、血液、血清、リンパ、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、組織エキス、ホモジェネートなどの生物液体であることが望ましい。しかし、当技術分野における通常の技術を有した技術者であれば、他のサンプルの使用を可能とする適切な条件を決定することができるため、当発明はこれらのサンプルのみを使用する分析に限定されるものではない。
【０１６１】
患者から組織学的標本を採取し、本発明の標識ＣＤ２０結合分子をその標本と組み合わせる事により現場（ｉｎ ｓｉｔｕ）検出を達成することができる。生物サンプルに適合またはその上に重ね合わせることにより標識ＣＤ２０結合分子を提供することが望ましい。そのような方法を使うことにより、ＣＤ２０の存在だけでなく、試験される組織の中のＣＤ２０の分布をも決定することができる。本発明を利用し、当業者は、現場検出を達成するために、多様な（染色方法などの）組織学的方法のいずれもが修正可能であることを理解する。
【０１６２】
「ｔｗｏ−ｓｉｔｅ」または「サンドイッチ」分析としても知られる免疫測定法において利用できるように本発明のＣＤ２０結合分子を調整することができる。通常の免疫測定法では、無標識のＣＤ２０結合分子（抗ＣＤ２０抗体など）の適量を試験液体に不溶性の固体支持体に結合させ、それに検出可能な方法で標識した可溶性の抗体を適量加え、固体相の抗体、抗原と標識抗体の間に形成される三成分複合体を検出および／または定量する。
【０１６３】
通常のそして好ましい免疫測定法には、固体相に結合したＣＤ２０結合分子（例えば抗体）をまず試験サンプルと接触させ、二成分の固体相抗体ＣＤ２０複合体を形成してサンプルからＣＤ２０を抽出する、「順向」分析が含まれる。適切な培養期間の後、固体支持体を洗浄して、存在していれば未反応のＣＤ２０も含み、液体サンプルの残渣を除去する。次に既知の量の標識抗体（「レポーター分子」として機能）を含む溶液と接触させる。二度目の培養期間により無標識の抗体を通して固体支持体に結合したＣＤ２０と標識抗体との間で複合体を形成させた後、個体支持体をもう一度洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。このタイプの順向サンドイッチ分析は、ＣＤ２０の存在を決定する単純な「イエス・ノー」型の分析であってもよいが、既知の量のＣＤ２０を含む標準サンプルと標識抗体の測定値を比較する事による定量とすることも可能である。
【０１６４】
ＣＤ２０にとって有効な別のタイプの「サンドイッチ」分析は、いわゆる「同時」または「逆行」分析である。同時分析には、固体支持体に結合した抗体と標識抗体を同時に試験サンプルに加える、一度の培養が含まれる。培養が終了した後、固体支持体を洗浄し、液体サンプルの残渣および複合体を形成しなかった標識抗体を除去する。固体支持体と結合した標識抗体の存在が、通常の「順向」サンドイッチ分析で行なわれるように決定される。「逆行」分析では、まず流動性サンプルに標識抗体溶液を加え、次に適切な培養期間の後固体サンプルに標識されていない抗体を加えるという、段階的な追加法が使用される。二回目の培養期間の後、固体相を従来の方法で洗浄し、試験サンプルの残渣と未反応標識抗体の溶液を除去する。次に、固体支持体に結合した標識抗体を「同時」および「順向」分析と同様の方法で決定する。
【０１６５】
ある実施形態では、固体支持体と結合した本発明のＣＤ２０結合分子を、流体、組織または細胞エキスからＣＤ２０（またはＣＤ２０を含むＢ細胞）を除去するために利用することができる。好適な実施形態では、これらは血液または血漿生成物からＣＤ２０を除去するために使用される。別の好適な実施形態では、当技術分野で知られている体外免疫吸着装置においてＣＤ２０結合分子が有効に使用される（例えば血液学セミナー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、２６（２ Ｓｕｐｐｌ．１）（１９８９）を参照）。患者の血液や他の体液を付着したＣＤ２０結合分子に接触させることで、循環しているＣＤ２０（遊離体または免疫複合体）を部分的あるいは完全に除去する結果となり、その後で流体が体に戻される。この免疫吸着法を、途中の細胞遠心分離段階の有無に関わらず、連続フロー処理において行なうことができる。例えばターマン（Ｔｅｒｍａｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７、１９７１−１９７５（１９７６）を参照。
【実施例】
【０１６６】
以下の実施例は、いくつかの好適な実施形態と本発明のいろいろな側面を証明し、さらに詳しく説明する目的で提供されるものであり、決して本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【０１６７】
以下に開示される実験では、次のような略語が使用される：Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、ｎＭ（ナノモル）、ｐＭ（ピコモル）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、℃（摂氏）、ＯＤ（光学密度）、ｎｍ（ナノメーター）、ＢＳＡ（ウシの血清アルブミン）およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。
【０１６８】
＜実施例１＞ ＣＤ２０結合分子
この実施例はいくつかのＣＤ２０結合分子の作成方法を説明する。特にこの実施例は、１１の異なるＣＤ２０結合分子（ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５およびＡＭＥ ５）の作成方法、および例えばＦａｂや完全なＩｇＧとして発現させる方法を説明する。
【０１６９】
１１の異なるＣＤ２０結合分子の軽鎖および重鎖可変領域は以下のようにして構成される。各ＣＤ２０結合分子の六つのＣＤＲのコレクションが表３に示してある。アミノ酸配列の配列番号が最初に、核酸配列の配列番号が次に示してある。
表３ 典型的なＣＤ２０結合分子における軽鎖および重鎖ＣＤＲ
【表３】
【０１７０】
可変領域（例えばＦｖｓとして発現する場合もある）を作成するため、表３のＣＤＲが、ヒトの生殖細胞系フレームワークなどのあらゆるフレームワークと組み合わせられる。例えば、本実施例で名前のつけられている１１の抗ＣＤ２０分子の可変領域を作成するため、表４に示される方法で、表３のＣＤＲがヒトの生殖細胞系フレームワークと組み合わせられた。
表４ 名前のついたＣＤ２０結合分子の生産に使用されるヒトの生殖細胞系フレームライン
【表４】
【０１７１】
１１のＣＤ２０結合分子のうちの二つに関して、完全な軽鎖および重鎖可変領域の配列が図２−３および６−7に示してある。特に図２および３は、ＡＭＥ３３の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を示している（両方でＡＭＥ３３の完全Ｆｖ配列を提供）。図６および７は、ＡＭＥ５の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を示している。
【０１７２】
本実施例で説明している１１のＣＤ２０結合分子の軽鎖および重鎖可変領域を、軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせ、Ｆａｂまたは完全な抗体（例えばＩｇＧ）として発現させてもよい。これらの配列は望ましくはリーダー配列と結合する（例えば軽鎖配列の最初のリーダー配列）。リーダー配列の一つの例はＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１０５）である。他のリーダー配列を使用してもよい。又、ヒトの定常領域アロタイプであればどれでも使用して構わない。例えば、図１０および１１はＡＭＥ３３の完全な軽鎖および重鎖を示しており、これには軽鎖および重鎖の定常領域も含まれる。これらの図はまた、本実施例で指定された他のＣＤ２０結合分子のＦａｂおよびＩｇＧを作成するために使用された定常領域の出典ともなる。図１０Ａおよび１１Ａでは、定常領域には下線が引いてある。さらに本実施例の抗ＣＤ２０分子は、Ｆｃ領域のアミノ酸置換を例外として、図１０および１１に示している重鎖定常領域を選択的に使用してもよい。特に、図１１に示されている重鎖定常領域には、Ｄ２８０Ｈ突然変異またはＫ２９０Ｓ突然変異が含まれていてもよい（図１１Ａは突然変異のない２８０および２９０を太字で示してある）。図１１Ｂは太字で下線の付いた「ＧＡＣ」を示している。この「ＧＡＣ」を、Ｄ２８０Ｈ突然変異をコード化するため「ＣＡＴ」に代えてもよい。
【０１７３】
本実施例で抗ＣＤ２０結合分子を（ＦａｂまたはＩｇＧとして）発現させるため、当技術分野で周知の方法を使用してもよい。例えば、シングルベクターかダブルベクター・システムを使い、哺乳類発現システム（あるいは細菌、真菌、植物発現システム）の中で、本実施例の１１のＣＤ２０結合分子をＦａｂまたはＩｇＧとして発現させてもよい。シングルベクター・システムでは、発現に必要な全ての調節要素を含んでいる発現カセットの中で、重鎖と軽鎖の両方が製造またはクローン化される。ダブルベクター・システムは単に別々のプラスミドの中にこの二つの発現カセットを有している。当技術分野で周知のように、単一プラスミドまたはダブルベクター・システムの併用プラスミドをチャイニーズハムスターの子宮（ＣＨＯ）細胞、あるいは網膜細胞株ＰｅｒＣ６などの宿主細胞に形質移入し、選択、拡張および培養して、ＦａｂまたはＩｇＧ蛋白質を発現させてもよい（抗体発現および処理：米国化学会第２０７回全国大会、生化学技術部門主催シンポジウムより、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）［ＡＣＳシンポジウム・シリーズ、６０４］を参照）。
【０１７４】
Ｆａｂは哺乳類システムよりも時間も費用も少なくて済むことから、細菌の発現システムで発現させてもよい。ここで、ＦａｂをＭ１３ウイルス発現システムに挿入し発現させることができる。細菌が発現するＦａｂは、細菌の細胞壁と細胞膜の間の周辺細胞質空間に分泌・蓄積される。低張液ショックや凍結融解法など当技術分野において一般的である多くの技術を使って、Ｆａｂを周辺細胞質空間から放出させることができる。Ｆａｂは、パパインなどのプロテアーゼを使って蛋白質を分解し、無傷のＩｇＧからも生成される。分解産物のＦａｂ部分は、次に分解産物のＦｃ部分から精製される。ＦａｂおよびＩｇＧは、これもまた当技術分野では周知の種々のクロマトグラフィ技術や特異吸着技術を使って精製される（抗体：実験室手引書、エド・ハーロウ（Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ）（編集員）、デイビッド・レーン（Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ）（編集員）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）参照）。例えばＩｇＧは、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィ、そしてそれに続いてＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィを使用した特異結合により、細胞の上清から容易に精製される。
【０１７５】
＜実施例２＞ 固定ラモス細胞ＥＬＩＳＡ
本実施例では、ＣＤ２０結合分子を使った固定ラモス細胞ＥＬＩＳＡ結合分析を説明する。本実施例では、ＦａｂおよびＩｇＧとして発現するＡＭＥ ４Ｈ５、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ３３およびＡＭＥ １Ｄ１０を検定し、全体的な結合、オフレートおよびオンレートを特に測定した。本実施例は、当社のＣ２Ｂ８ ｆａｂおよび全抗体、および比較のために市販のリツキサン（オンコロジー・サプライ社（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏ．））を同じ分析条件下で試験した。Ｃ２Ｂ８抗体は保管番号６９１１９でＡＴＣＣに保管されている。
【０１７６】
ラモス細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％加熱不活性の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０の中で成長させた。ラモス細胞５０μｌ（２〜４Ｘ１０６／ｍｌ）をＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅコートした９６ウェルのプレート（ＢＩＯＣＡＴべクトン・ディキンソン・ラブウェア（ＢＩＯＣＡＴ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ））の各ウェルにピペットを使って注入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。培地は穏やかに吸引し、１００ｍｌの緩衝亜鉛ホルマリン水溶液（アナテク社（Ａｎａｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．））を室温で１５分間各ウェルに添加した。Ｚ−ｆｉｘを除き、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。プレートをＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。ＦａｂまたはＩｇＧの希釈液を室温で１時間、固定およびブロック・ラモス細胞と一緒に培養した。プレートをＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、抗Ｈｉｓ６ペルオキシダーゼ・マウス・モノクローナル抗体（ロッシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））（１：５００希釈）５０ｍｌをウェルに加え、室温で１時間培養した。プレートを上述の方法で洗浄し、テトラメチルベンジジンで発色させ、反応は５ＮのＨ２ＳＯ４を使って停止した。プレート吸光度はＯＤ４５０ｎｍで読み取った。Ｆａｂおよび複合体の希釈には１％ＢＳＡ／ＰＢＳを使った。
【０１７７】
ＩｇＧ分析も同様にして行なったが、ＩｇＧ結合はヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを使って検出した。抗体オフレートの比較では、ＦａｂまたはＩｇＧと共に培養した後、プレートをＰＢＳ／ＢＳＡ中で一夜培養してから、第二の抗体ステップに進んだ。抗体オンレートの比較では、Ｆａｂ／ＩｇＧ結合の培養期間も第二抗体ステップも５分であった。
【０１７８】
本実施例の結果は図１２および１３に示してある。図の通りＦａｂ ＡＭＥ ４Ｈ５、１５、１８、３３および１Ｄ１０の全体的な結合はＣ２Ｂ８ Ｆａｂよりも効果的である。ＡＭＥ抗体の用量応答曲線はＣ２Ｂ８抗体および市販のリツキサンと比べて左に移動しており、最大ＯＤもＣ２Ｂ８抗体の約１．５倍である。オフレートに関しては、ＡＭＥ ４Ｈ５、１５、１８、３３および１Ｄ１０のＦａｂはＣ２Ｂ８ Ｆａｂと比べて大幅に減少している（図１２Ｂ）。全ＩｇＧとして発現したＡＭＥ抗体のオフレートは、Ｃ２Ｂ８抗体および市販のリツキサンのそれと似ている（図１３Ａ）。オンレートに関しては、ＡＭＥ ４Ｈ５、１５、１８、３３および１Ｄ１０のＦａｂはＣ２Ｂ８ Ｆａｂのそれと似ており、結合が全体的に増大している（最大ＯＤが達成）（図１２Ｃ）。全ＩｇＧとして発現したＡＭＥ抗体の用量応答曲線は、全Ｃ２Ｂ８抗体の左へ移動している（図１３Ｂ）。
【０１７９】
＜実施例３＞ 免疫蛍光生体Ｂリンパ腫結合分析
本実施例は免疫蛍光生体Ｂリンパ腫結合分析を記述する。特に、以下に示すように、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５およびＣ２Ｂ８のＦａｂを分析した。
【０１８０】
ＣＤ２０ ＦＡＣＳ分析のためのＰＢＭＣのＦａｂ染色
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−１０７７）上で浮遊法により正常なヒトの血液から単離した。細胞を計数し、再びＰＢＳ＋１％ＢＳＡに懸濁して、２〜５Ｘ１０６細胞／ｍｌが得られた。１００μｌの希釈細胞をポリスチレン・チューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃２０５８）に入れ、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した抗ＣＤ２０ Ｆａｂ抗体を加えた。チューブを室温で１時間培養した。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ４ｍｌを各チューブに加え、３００ＸＧで１０分遠心分離した。上清を除き、細胞を再びＰＢＳ１００μｌ＋１％ＢＳＡに懸濁した。Ａｎｔｉ−Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８複合体（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）＃３５３１０）をチューブ当たり２μｌずつ加え、混合し、室温、暗室で、１時間培養した。サンプルを前出の方法で洗浄した。上清を除き、細胞を再びＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムに懸濁した。蛍光性をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーターで分析し、データをＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））またはＷｉｎＭＤＩソフトを使って解析した。
【０１８１】
結果は図１４に示してある。Ｄａｕｄｉ細胞の結果は図１４Ａ、Ｗｉ１２−Ｓ細胞の結果は図１４Ｂ、そしてラモス細胞の結果は図１４Ｃに示してある。図に示されているように、ＡＭＥ５および３３のＦａｂは、生体Ｂリンパ腫細胞腫との結合の面でＣ２Ｂ８よりも有効である。ＡＭＥ５およびＡＭＥ３３の用量応答曲線はＣ２Ｂ８と比べて左に移動している。
【０１８２】
＜実施例４＞ ＫｉｎＥｘＡ測定によるＩｇＧ結合
本実施例は、種々のＣＤ２０ ＩｇＧのＫｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆを測定するための分析を記述する。特に本分析は、ＳＫＷ６．４ Ｂリンパ腫細胞との結合の面で、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５、ＡＭＥ ６Ｆ１およびＣ２Ｂ８抗体を試験し、ＫｉｎＥｘａ平衡ソフトを使ってこのような分子のＫｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆを測定した。さらに、ＡＭＥ ３３およびＣ２Ｂ８については、原発性ヒト末梢血Ｂ細胞との結合を試験した。
【０１８３】
Ｋｄ測定：
ＳＫＷ６．４細胞を１０％ＦＣＳ添加のＤＭＥＭ培地で成長させ、５〜１０Ｘ１０５細胞／ｍｌで収穫した。細胞を５容積のＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再び懸濁した（１Ｘ１０８細胞／ｍｌ）。ヒト末梢血Ｂ細胞は、新鮮なＣＤ１９選別Ｂ細胞をオールセルズ社（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）から入手した。細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２度洗浄し、濃度８Ｘ１０７／ｍｌで再び懸濁した。
【０１８４】
３倍連続希釈を１２回行い、各希釈液１００μｌを９６ウェルのプレートに加えた。各希釈液に抗体１００ｍｌを加え（１００ｎｇ／ｍｌ）、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。サンプルは９６ウェル１μフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で濾過し、細胞および結合抗体を除いた。溶液の中の遊離抗体をＥＬＩＳＡを使って定量した。簡単にいうと、遊離ＩｇＧを１ｍｇ／ｍｌの抗ヒトκ抗体（サザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））でコートした９６ウェルのプレートで捕獲し、ＨＲＰと結合した抗ヒトＦｃ抗体（サザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を使ってそれを検出した。プレートはＦａｓｔ ＴＭＢ基質（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を使って発色させ、４５０ｎｍで読み取った。
【０１８５】
つぎに、未知の抗原濃度を被験者にＫｉｎＥｘＡ平衡ソフトを使って抗体のＫｄを測定した。各連続希釈液のＯＤ４５０値は、推定抗原濃度および実際の抗体濃度と一致した。Ｋｄおよび実際の抗原濃度を計算した。ＳＫＷ６．４細胞分析の結果は表５に示してある。結果は、ＡＭＥ ３３およびＡＭＥ ５のＫｄがＣ２Ｂ８抗体と比べて１０倍向上している事を示している。原発性ヒト末梢血Ｂ細胞の結果は、ＡＭＥ ３３のＫｄが１１３ｐＭ、そしてＣ２Ｂ８のＫｄが１５００ｐＭである事を示している。ここでもＡＭＥ ３３のＫｄがＣ２Ｂ８抗体のＫｄの１０倍以上（ほぼ１５倍）である事が示されている。
表５
【表５】
【０１８６】
反応速度測定：
ＳＫＷ６．４細胞を１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地で成長させ、５〜１０Ｘ１０５細胞／ｍｌで収穫した。細胞を５容量のＰＢＳで洗浄し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳに再び懸濁（約ｌＸ１０７細胞／ｍｌ）し、３７℃の水浴に維持した。同容積の抗体（１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１００ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で加え、実験の計時が開始された。６０秒から１０８００秒の間隔で抗体細胞溶液のサンプルを採取し、濾過し、細胞と結合抗体を除去した。残っている遊離抗体を各時間単位に上述のＥＬＩＳＡを使って定量した。
【０１８７】
抗体細胞の反応速度は、直接反応速度ＫｉｎＥｘＡソフトを使って計算した。各時間でのＯＤ４５０値は、以前計算したＫｄ、抗原濃度、反応の計算値ＫｏｎおよびＫｏｆｆを使って調整した。結果は表５に示してある。
【０１８８】
＜実施例５＞ ＣＤ２０結合細胞を使ったＡＤＣＣ分析
本実施例では、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力に関して、作動体としてヒト末梢血単核細胞、標的としてＢリンパ腫細胞株を使って、ＡＭＥ５、ＡＭＥ３３、ＡＭＥ６Ｆ１ ＩｇＧおよびＣ２Ｂ８抗体を試験した。この分析は以下に記述する方法で行った。
【０１８９】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の単離：
健康なドナーから得た末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０）を使って１：２に希釈した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号１０７７−１）１２ｍｌを希釈サンプルの下の相に注意して置き、水平ローター付きＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂ遠心分離機を使い（ブレーキ・オフ）、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含む中間相を集め、ハンクス液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で３度洗浄した。洗浄した細胞ペレットを、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（オメガ・サイエンティフィック（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含むＲＰＭＩ １６４０培地（ATCC）２０ｍＬに懸濁した。再懸濁したＰＢＭＣを二つのＴ−１７５培養フラスコに分け、それぞれにＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ３０ｍＬを加えた。フラスコを３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、付着していないＰＢＭＣを集め、上述のように遠心分離し、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに再懸濁し、血球計数器を使って計数した。
【０１９０】
標的細胞株：
Ｂリンパ腫細胞株をＡＴＣＣから入手し、手引書に従って成長させた。実験の前日細胞を１：２に分けた。翌日濃度を０．５から１Ｘ１０６細胞／ｍＬに調整し、５０μＬ（２５，０００から５０，０００細胞／ウェル）をベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）９６ウェルＵ底組織培養プレートに加えた。
【０１９１】
ＩｇＧ滴定：
１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩでサンプルを希釈する事により、ＩｇＧ希釈液を生成した。ＩｇＧ５０μｌを９６ウェル・マイクロタイター・プレートの標的細胞に加え、ピペットを使って穏やかに混合した。作動体細胞を加える前に、３７℃／５％ＣＯ２の条件下で、ＩｇＧを標的細胞と一緒に１５分培養した。
【０１９２】
作動体細胞：
再懸濁したＰＢＭＣ１００μｌを標的細胞／ＩｇＧプレートの各ウェルに加えた。作動体と標的の比が１０〜２０：１になるようにＰＢＭＣの濃度を調整した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２の条件下で３〜４時間培養した。
【０１９３】
ＬＤＨ放出検出：
培養の後、プレートを１０００〜２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離した。ペレット状の細胞を避けながら、上清５０μｌを注意して除去した。ウェル当たりＰＢＳ５０ｐｌを含むＤｙｎｅｘ Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ平底プレートにこの上清を直接加えた。このプレートにＬＤＨ検出試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））１００μｌを加えた。プレートを約１５〜３０分間培養し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使って、４９０ｎｍでＯＤを読み取った。
【０１９４】
データの解析：
データは対数ＩｇＧ濃度対Ａ４９０として記された（図１５参照）。Ａ４９０は次の式を使って細胞障害作用％に転換された。
細胞障害作用％＝（実験Ａ４９０−基底Ａ４９０）／（最大Ａ４９０−基底Ａ４９０）Ｘ１００
ここで最大Ａ４９０は標的細胞に２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える事により決定された。基底−放出は、感作ＩｇＧの不在下に作動体および標的細胞の混合物に関して測定された。図１５に示されるデータによると、Ｆｃ変異体Ｄ２８０ＨおよびＫ２９０Ｓを含むＡＭＥ３３のＥＣ５０は、Ｃ２Ｂ８よりも一貫して１．５〜２．０倍低かったことが示されている。このデータは以下の表６にも示されている。
表６ 推定ＥＣ５０ｓ, μｇ／ｍｌ（標的：Ｗｉｌ−２細胞）
【表６】
【０１９５】
＜実施例６＞ ＣＤ２０結合分子の糖鎖工学
本実施例は、ある種のＣＤ２０結合分子に適用した糖鎖工学法を説明する。特に、野生型または突然変異（Ｄ２８０ＨまたはＫ２９０Ｓ）Ｆｃ領域を含むＡＭＥ １Ｃ２ ＩｇＧをβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ酵素と一緒にＣＨＯ細胞の中で発現させる事により、Ｆｃ領域で切断されたオリゴ糖の発現を増加させた。糖鎖工学とＦｃ変異領域の組み合わせは、修飾していない１Ｃ２または市販のリツキサン抗体と比べ、ＡＤＣＣ分析において１Ｃ２のＥＣ５０を減少させた。方法は以下に記載する。
【０１９６】
ラットの腎臓ｃＤＮＡ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））から得たβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ遺伝子をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーはその遺伝子の５’末端にＮｈｅＩ部位を導入し、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入した（正プライマーは５’−ＧＧＣＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧ−３’、配列番号１０３、逆プライマーは５’−ＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＧＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＣ−３’、配列番号１０４）。ＰＣＲ生成物の制限消化および精製の後、同じように開裂したｐｃＤＮＡ３．１ ＮＥＯ（生体外ゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））とそれとを連結させた。連結したプラスミドＤＮＡはエレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換に使用された。コロニーＰＣＲを使い、ラットのβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ遺伝子の存在を検出するため、アンピシリン抵抗性の大腸菌コロニーをスクリーニングした。プラスミドＤＮＡはポジティブクローンから単離され、配列が決定された。配列決定により、プラスミドＤＮＡがＢｓｐＨＩと線形になっている事が確認された。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（生体外ゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使い、製造元の実験記録に従って、約１０ｍｇの線形ＤＮＡがＣＨＯ Ｋ１細胞への形質移入に使用された。Ｇ４１８選択の後、単離した抵抗性のコロニーを組織培養で増殖した。ｍＲＮＡが単離され、ラットβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩｍＲＮＡ生産の定性的なスクリーニングが行なわれた。形質移入された細胞株は予期されたサイズのＰＣＲ生成物を産出したが、形質移入されていないＣＨＯＫ１細胞は産出しなかった。抗ＣＤ２０ ＩｇＧをコード化するＤＮＡが安定な細胞株の形質移入に使用された。形質移入の約３日後、細胞培養の上清が集められ、蛋白質Ａクロマトグラフィを使ってＩｇＧ類縁物質を精製した。蛋白質ＡカラムからＩｇＧを溶出した後、サンプルを透析し、２８０ｎｍで吸収度を測定する事により蛋白質の濃度を定量した。
【０１９７】
実施例５に記載の方法を使い、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）の効果に関して、種々のＣＨＯＫ１細胞株で発現したＩｇＧサンプルを試験した。この実験では、新鮮なヒトの血液から単離された抹消血リンパ球が作動体細胞として使用され、ＷＩＬ．２ｓ Ｂ細胞が標的細胞として使用された。標的細胞の溶解量は、標準の乳酸脱水素酵素放出分析を使って測定した。ＡＤＣＣを引き出す効果に関して、加工されたＣＨＯＫ１細胞株で発現したＩｇＧと加工していないＣＨＯＫ１細胞株で発現したＩｇＧおよび市販のリツキサン抗体が直接比較された。さらに、切断されたＮ−アセチルグルコサミン糖の存在が、直接糖鎖形成分析により確認された。ＡＭＥ １Ｃ２に関するＡＤＣＣ分析の結果は図１６に示されている。
【０１９８】
＜実施例７＞ 生体外アポプトシス分析
本実施例は、種々のＣＤ２０結合分子を使って行なった生体外アポプトシス分析について記述する。特にＡＭＥ ５、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ６Ｆ１（全て抗体全体）およびＣ２Ｂ８抗体を使い、抗ヒトＩｇＧとの架橋結合によりラモスＢリンパ腫細胞株のアポプトシスを誘発する能力を試験した。分析の方法は以下の通りである。
【０１９９】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色：
ラモスＢリンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ）を、使用の２４時間前に１：２に分けた。分析の当日、ラモス細胞を遠心分離し（１，０００ｒｐｍで５分）、ＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩおよび１０％の加熱不活性ＦＢＳ（培地）に再び懸濁した（細胞濃度：５Ｘ１０５細胞／ｍｌ）。６ウェル組織培養プレートにウェル当たり１００万の細胞を加えた。一次抗体を指定濃度で細胞に加え、プレートを１５分間穏やかに振盪し、さらに４５分間３７℃に戻した。予め温めておいたヤギの抗ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）または培地を特定のウェルに加え、プレートを３７℃で６時間培養した。
【０２００】
細胞は遠心分離で採取し（１，０００ｒｐｍで５分）、冷却１Ｘ結合緩衝液（１０Ｘ株から水で希釈）１００μｌおよびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（サザン・バイオテク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ））１０μｌに再懸濁した。サンプルをポリスチレン製の丸底チューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５８）に移し、室温、暗所で、１５分培養した。ヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ）を含む結合緩衝液を加え、サンプルをベクトン・ディッキンソン・ファクスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｃｓｃａｎ）フローサイトメーターで分析し、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）またはＷｉｎＭＤＩソフトを使ってデータを解析した。細胞の死（アポプトシスおよび壊死の細胞の％）は、アネキシンＶで染色する細胞の％を測定する事により決定された。この分析の結果、ＡＭＥ ５、３３および６Ｆ１はＣ２Ｂ８抗体処理の場合と同じようなレベルで細胞の死を誘発する事が証明された。
【０２０１】
＜実施例８＞ 補体媒介の細胞障害活性分析
本実施例は、ヒトの補体およびＷｉｌ−２Ｂリンパ腫細胞株（標的）を使い、補体依存性細胞障害作用を媒介する効果に関して、Ｃ２Ｂ８抗体、シナジス（対照）およびＡＭＥ抗体である６Ｆ１、２Ｃ２、１Ｄ１０、１５、１８および３３を試験した結果を記載する。
【０２０２】
Ｗｉｌ２−ＳＢリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ）をＲＰＭＩ＋１０％加熱不活性ＦＢＳに再懸濁した（５Ｘ１０５／ｍｌ）。Ｗｉｌ２−Ｓ細胞懸濁液５０μｌ、ＩｇＧ（濃度範囲：１ｎｇ／ｍｌから７５μｇ／ｍｌ）５０μｌ、およびヒトの希釈［１：５］補体５０μｌを９６ウェルのプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）３９１７）で混合した。抗体も補体もＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで希釈した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で９０分培養した。アラマーブルーをウェル当たり１５μｌ加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。蛍光（生きた細胞の数を反映）を５６０ｎｍで励起し５９０ｎｍで検出する事により記録した。分析の結果は、全ＡＭＥ抗体のＥＣ５０がＣ２Ｂ８抗体のそれに似ている事を示していた。
【０２０３】
＜実施例９＞ ＣＤ２０結合分子の生体内投与
本実施例では、多くのＣＤ２０結合分子を生体内で試験するために使用された分析について説明する。
【０２０４】
抗体ＡＭＥ４５Ｈ、１Ｃ２、５−３およびＣ２Ｂ８抗体をマウスにより以下のように分析した。５Ｘ１０６ラジ細胞（ＡＴＣＣ）を６〜８週齢のＣ．Ｂ．１７−ＳＣＩＤマウスの雄（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ））の左右の脇腹に注射した（ｓ．ｃ．）。約２〜３時間後（０日）、抗体を腹腔内に注射した（０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍の長さ、幅、そして高さを毎週月、水、金にカルパスで測定し、腫瘍の体積を計算した。用量応答曲線からＥＣ５０値を決定した。ＡＭＥ４Ｈ５、１Ｃ２および５−３のＥＣ５０は、Ｃ２Ｂ８のＥＣ５０と一貫して異なっているわけではなかった。
【０２０５】
抗体ＡＭＥ３３およびＣ２Ｂ８抗体もまた、５Ｘ１０６ラジ細胞が注射されたマウスを使って分析された。マウスは３日目に０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭＥ ３３またはＣ２Ｂ８で処置された。対照群のマウスには生理食塩水が与えられた。結果（図１７に示す）は、ＡＭＥ ３３およびＣ２Ｂ８が同じようにラジ腫瘍を阻害し、Ｃ２Ｂ８に比べるとＡＭＥ ３３の方が長期的に見て腫瘍の成長が少ない事を示している。
【０２０６】
＜実施例10＞ ヒトの疾病の治療にＣＤ２０結合分子を使用
本実施例は、これだけに限定されるものではないが、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から選択され、これらに限定されない疾病を含む、ヒトの患者の疾病の治療および予防的治療のためのＣＤ２０結合分子の用法にについて記述する。
【０２０７】
例えば上述の疾病のいずれかに罹っている患者に、ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５またはＡＭＥ ５などのＣＤ２０結合分子を０．４から体重１ｋｇあたり２０．０ｍｇ静脈内注射する。典型的な投与計画は、例えば緩徐静脈内注入として投与される抗体３７５ｍｇ／ｍ２を週１回、４または８用量である。別の投与計画は、完全なものとして参照用に本出願に編入されているアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）による米国特許６，３９９，０６１に記載されている。治療および／または生体内撮像法のため、抗体またはＦａｂ断片を放射性同位元素（例えばイットリウム［９０］）で標識してもよい（米国特許６，３９９，０６１参照）。治療に対する反応はモニターされ、投与量を増やすべきか減らすべきか、あるいは反復治療の必要があるかどうかが決定される。治療に対する反応および投与計画に関する追加的な指示は、米国特許６，３９９，０６１に記載されている。
【０２０８】
上述の明細に記載されている出版物および特許は、全て参照として本出願に編入されている。本発明の範囲および精神から逸脱する事なく、本発明の方法およびシステムを様々に調整および変更できることは、当業者には明白である。本発明は特定の望ましい実施例との関連で記載されてはいるが、請求されている発明はそれらの具体的な実施例により不当に制限されるべきではない。本発明の実施のために記載された方法のうち、化学、医学、分子生物学、あるいは当業者にとって明白な種々の変更は、以下の請求項の範囲内に含まれている。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年５月２０日に出願された米国仮特許出願連続番号６０／４７１，９５８の優先権を主張する。
本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列に関する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に対して高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子に関する。本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒトのフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでいるのが望ましい。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ細胞リンパ腫のような疾病の診断および／または治療薬としてＣＤ２０抗原の抗体を使用する方法は、以前にも報告されている。ＣＤ２０は悪性のＢ細胞、すなわちその無制限な増幅がＢ細胞リンパ腫の原因となるＢ細胞の表面に高密度で発現する抗原であるため、Ｂ細胞リンパ腫のマーカーまたは標的として有用である。
【０００３】
ＣＤ２０（Ｂｐ３５としても知られる）は、Ｂ前駆体細胞成長の初期に発現し、血漿の細胞分化まで残留する、Ｂリンパ球に制限された分化抗原である。ＣＤ２０分子は細胞サイクルの開始および分化に必要なＢ細胞活性化プロセスの一段階を調整していると考えている者もいる。さらに上述のように、通常ＣＤ２０は新生物形成（「腫瘍」）Ｂ細胞上に、極めて高レベルで発現する。ＣＤ２０抗原は［他の物質を］削減、調整、または吸収したりしないため、標的治療に適している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
抗ＣＤ２０抗体に関する、これまでに報告されている治療法には、治療用抗ＣＤ２０抗体の単独投与、あるいは第二の放射線標識抗ＣＤ２０抗体または化学療法薬との併用投与が含まれている。米国食品医薬品局は、以前に治療され再発した低悪性度の非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）の治療における、このような抗ＣＤ２０抗体の一つであるリツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）の使用を承認した。しかしながら、リツキサンはＢ細胞リンパ腫の治療に効果的であると一般に報告されてはいるものの、治療を受けた患者はしばしば再発する傾向がある。
【０００５】
最近、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の１８人の患者（非免疫抑制患者）の治療に対するリツキサンの安全性、許容性、予備臨床の治療効果が試験された。この研究結果の一部は、２００２年１０月、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）第６６回年次学会で発表された。治療を受けた１８人の患者のうち、６人の患者には週１回１００ｍｇ／ｍ２（低用量）のリツキサン注入を、６人の患者には週１回３７５ｍｇ／ｍ２（中用量）のリツキサン注入を、そして６人の患者には週１回３７５ｍｇ／ｍ２（高用量）のリツキサン注入が４週間与えられた。低用量または中用量の投与を受けた１２人中の３人（２５％）には２ヶ月でヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）が高濃度で発現したが、高用量の患者は現在なお評価中である。
【０００６】
従って、治療を受けたＢ細胞リンパ腫の患者が再発しないように、結合親和力が高く解離定数の低いＣＤ２０結合分子、および免疫抑制されていない患者に投与された場合ＨＡＣＡ反応を引き起こさない、あるいは引き起こす可能性を小さくするようなＣＤ２０結合分子が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列を提供する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に対して高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子を提供する。本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒトのフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでいることが望ましい。
【０００８】
ある実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供し、このとき当該ＣＤ２０結合分子はａ）軽鎖可変領域、あるいは軽鎖可変領域の一部を含み、このとき当該軽鎖可変領域（または軽鎖可変領域の一部）はｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含み、また、ｂ）重鎖可変領域、あるいは重鎖可変領域の一部を含み、このとき当該重鎖可変領域（または重鎖可変領域の一部）はｉ）配列番号２３および配列番号２５から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含んでいる。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は軽鎖可変領域（またはその一部）、あるいは軽鎖可変領域をコード化する核酸配列（またはその一部）を含む組成物を提供し、このとき当該軽鎖可変領域（またはその一部）は、ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｂ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２アミノ酸配列、およびｃ）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
【００１０】
ある実施形態では、本発明は重鎖可変領域（またはその一部）あるいは重鎖可変領域をコード化する核酸配列（またはその一部）を含む組成物を提供し、このとき当該重鎖可変領域（またはその一部）は、ａ）配列番号２３および配列番号２５から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｂ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２アミノ酸配列、およびｃ）配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含む。
【００１１】
別の実施形態では、本発明はａ）軽鎖可変領域あるいは軽鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該軽鎖可変領域が配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むもの、およびｂ）重鎖可変領域あるいは重鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該重鎖可変領域が配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むもの、を含んだ組成物を提供する。
【００１２】
ある実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の軽鎖可変領域をコード化する核酸分子を含む組成物を提供し、このときその核酸分子は、ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１核酸配列、ｂ）配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２核酸配列、およびｃ）配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の重鎖可変領域をコード化する核酸分子を含む組成物を提供し、このときその核酸分子は、ａ）配列番号２４および配列番号２６から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１核酸分子、ｂ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２核酸分子、およびｃ）配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３核酸分子を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供し、このとき当該ＣＤ２０結合分子は、ａ）配列番号５を含むＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｂ）配列番号１３を含むＣＤＲＬ２１アミノ酸配列、ｃ）配列番号１９を含むＣＤＲＬ３１アミノ酸配列、ｄ）配列番号２５を含むＣＤＲＨ１１アミノ酸配列、ｅ）配列番号３９を含むＣＤＲＨ２１アミノ酸配列、およびｆ）配列番号５７を含むＣＤＲＨ３１アミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の軽鎖可変領域をコード化する核酸分子を含み、このときその核酸分子は、ａ）配列番号６を含むＣＤＲＬ１核酸配列、ｂ）配列番号１４を含むＣＤＲＬ２核酸配列、およびｃ）配列番号２０を含むＣＤＲＬ３核酸配列を含む。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子の重鎖可変領域をコード化する核酸分子を含み、このときその核酸分子は、ａ）配列番号２６を含むＣＤＲＨ１核酸配列、ｂ）配列番号４０を含むＣＤＲＨ２核酸配列、およびｃ）配列番号５８を含むＣＤＲＨ３核酸配列を含む。別の実施形態では、本発明は、ａ）軽鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該第１核酸配列が配列番号１８、配列番号２０および配列番号２２から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３核酸配列を含むもの、およびｂ）重鎖可変領域をコード化する第２核酸配列であり、このとき当該第２核酸配列が配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６および配列番号５８から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３核酸配列を含むもの、を含む組成物を提供する。
【００１５】
ある実施形態では、本発明は、ａ）軽鎖可変領域をコード化する第１核酸配列であり、このとき当該軽鎖可変領域が、ｉ）配列番号１、配列番号３、配列番号５から成るグループから選択されたＣＤＲＬ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３から成るグループから選択されたＣＤＲＬ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むもの、およびｂ）重鎖可変領域をコード化する第２核酸配列であり、このとき当該重鎖可変領域が、ｉ）配列番号２３および配列番号２５から成るグループから選択されたＣＤＲＨ１アミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９から成るグループから選択されたＣＤＲＨ２アミノ酸配列、およびｉｉｉ）配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む）、を含む組成物を提供する。
【００１６】
ある実施形態では、本発明は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択された、少なくとも二つ（あるいは少なくとも三つまたは四つ）のＣＤＲを含むペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択された、少なくとも二つ（あるいは少なくとも三つまたは四つ）のＣＤＲを含むペプチドを提供する。
【００１７】
ある実施形態では、本発明は軽鎖可変領域と重鎖可変領域を含む組成物を提供し、このとき当該軽鎖可変領域は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含み、またこのとき当該重鎖可変領域は、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７から成るグループから選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１８】
ある実施形態では、軽鎖可変領域はフレームワークの一部（例えばＦＲ２やＦＲ３などの２つから三つの準領域）を含む。ある実施形態では、軽鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は配列番号５９および６３から選択されたアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域はフレームワークの一部（例えばＦＲ２やＦＲ３などの二つから三つの準領域）を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域は６１および６５から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１９】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は抗体または抗体の断片（例えばＦｖ、Ｆａｂなど）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ３３ ＦｖまたはＦａｂを含む。別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ５ ＦｖまたはＦａｂを含む。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子は、ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５から成るグループから選択されたＦｖまたはＦａｂを含む。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子（例えば抗体や抗体の断片）を含む融合構成物、および酵素、検出可能な標識、炭水化物分子、脂質などの融合パートナーを提供する。ある実施形態では、融合構成物はヒトのＣＤ２０に結合するＦａｂまたはＦａｂ’２、およびプロドラッグを活性形に変換する酵素を含む。
【００２１】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は宿主細胞（例えば真核生物または原核生物の宿主細胞）内に含まれている。別の実施形態では、軽鎖および／または重鎖をコード化する核酸はプラスミドや他の発現ベクター内に含まれている。
【００２２】
ある実施形態では、本発明はヒトのＣＤ２０に対し結合親和力（Ｋｄ）が５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下（例えば５．０Ｘ１０−１０Ｍ〜５．０Ｘ１０−１１Ｍ）であるＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明はＣＤ２０結合分子を含む組成物を提供し、このとき当該ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和力（Ｋｄ）、および５．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下である解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。
【００２３】
別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．５Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和力（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下の結合親和力（Ｋｄ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し２．５Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下（例えば１．０Ｘ１０−４ｓ−１〜１．０Ｘ１０−５ｓ−１）の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し８．０Ｘ１０−５ｓ−１またはそれ以下の解離速度（ｋｏｆｆ）を有する。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し１．０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上（例えば１．０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１〜１．０Ｘ１０６Ｍ−１ｓ−１）の会合速度（ｋｏｎ）を有する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し５．０Ｘ１０５Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上の会合速度（ｋｏｎ）を有する。
【００２４】
ある実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）被験者およびｉｉ）本発明のＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）その組成物の被験者への投与、からなるＢ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）疾病の症状を訴える被験者およびｉｉ）本発明のＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）当該症状を軽減または排除するための、当該被験者への当該組成物の投与からなる、疾病の治療法を提供する。特定の実施形態では、疾病は、再発したホジキンス病、高悪性度の抵抗性ホジキンス病、低悪性度および中悪性度の非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞性悪性リンパ腫（ＬＰＬ）、被膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、瀰漫性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、エイズ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症、小リンパ球型、濾胞性びまん性大型細胞、びまん性小型開裂細胞、大細胞免疫芽球性リンパ腫、小非開裂型、バーキットおよび非バーキット型、濾胞性の主に大型の細胞、主に小型の濾胞性開裂細胞、および濾胞性の小型及び大型混合細胞リンパ腫から成るグループから選択される。
【００２５】
ある実施形態では、本発明は本発明のＣＤ２０結合分子の有効量をその動物に投与することからなる治療を必要としている動物における疾病（例えば癌）の治療方法を提供している。ある実施形態では、本発明は薬剤として使用するための本発明のＣＤ２０結合分子を提供する。他の実施形態では、本発明は疾病（例えばＮＨＬ）治療用の薬剤の製造において、本発明のＣＤ２０結合分子を提供する。特定の実施形態では、本発明は疾病（例えば癌）の治療のために、本発明のＣＤ２０結合分子を活性成分として含むことを特徴とする薬剤を提供する。
【００２６】
好適な実施形態において、被験者（患者）は免疫抑制されていない。例えば、患者は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のような病気にかかっている。非免疫抑制の被験者にＣＤ２０結合分子を投与した場合、ＨＡＣＡ反応（ヒト抗キメラ抗体反応）が生じない（あるいは生じても無視できる程度である）ことが望ましい。ある実施形態では、被験者に投与される用量は週に約３７５ｍｇ／ｍ２ずつ４週間（ＨＡＣＡ反応を生じる事なく）である。ある実施形態では、投与量は（例えば慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）などに対し）、週に約５０〜３００ｍｇ／ｍ２または週に約１００〜２００ｍｇ／ｍ２ずつ４週間である。
【００２７】
ある実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）被験者およびｉｉ）ヒトのＣＤ２０に対する結合親和力（Ｋｄ）が５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下であり、またヒトのＣＤ２０に対する解離速度（ｋｏｆｆ）が５．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下であるＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）その組成物の被験者への投与、からなるＢ細胞リンパ腫の治療方法を提供する。
【００２８】
ある実施形態では、本発明は上述の治療を必要としている被験者において、末梢Ｂ細胞を枯渇させる、ａ）ｉ）被験者およびｉｉ）ヒトのＣＤ２０に対する結合親和力（Ｋｄ）が５．０Ｘ１０−１０Ｍまたはそれ以下であり、またヒトのＣＤ２０に対する解離速度（ｋｏｆｆ）が５．０Ｘ１０−４ｓ−１またはそれ以下であるＣＤ２０結合分子を含むことを特徴とする組成物の提供、およびｂ）その組成物の被験者への投与、からなる方法を提供する。
【００２９】
ある実施形態では、軽鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、軽鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号５９および６３から選択されたアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、重鎖可変領域は完全にヒト型のフレームワークを含む。別の実施形態では、重鎖可変領域はヒトの生殖細胞系フレームワークを含む。さらに別の実施形態では、重鎖可変領域は６１および６５から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３０】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は抗体または抗体の断片（例えばＦｖ、Ｆａｂなど）を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ３３ ＦｖまたはＦａｂを含む。別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＡＭＥ ５ ＦｖまたはＦａｂを含む。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子は、ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５から成るグループから選択されたＦｖまたはＦａｂを含む。
【００３１】
他の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣ２Ｂ８抗体とほぼ同じＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトの末梢血管単核細胞を作動体としまたＢリンパ腫を標的として、Ｃ２Ｂ８抗体とほぼ同じＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣ２Ｂ８抗体の約１．５から２倍のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する（当該Ｃ２Ｂ８抗体は番号６９１１９としてＡＴＣＣに蒸着している）。また別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトの末梢血管単核細胞を作動体としまたＢリンパ腫を標的として、Ｃ２Ｂ８抗体の約１．５から２倍のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。さらに別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣ２Ｂ８抗体の１０倍またはそれ以上のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。また別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトの末梢血管単核細胞を作動体としまたＢリンパ腫を標的として、Ｃ２Ｂ８抗体の１０倍またはそれ以上のＥＣ５０レベルで抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する。
【００３２】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子にはヒトの生殖細胞系軽鎖フレームワークが含まれる。ある実施形態では、このヒト生殖細胞系軽鎖フレームワークは、Ｖ１−１１、Ｖ１−１３、Ｖ１−１６、Ｖ１−１７、Ｖ１−１８、Ｖ１−１９、Ｖ１−２、Ｖ１−２０、Ｖ１−２２、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ１−５、Ｖ１−７、Ｖ１−９、Ｖ２−１、Ｖ２−１１、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ２−１５、Ｖ２−１７、Ｖ２−１９、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ３−２、Ｖ３−３、Ｖ３−４、Ｖ４−１、Ｖ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４、Ｖ５−６から選択される。
【００３３】
別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子にはヒトの生殖細胞系重鎖フレームワークが含まれる。特定の実施形態では、この重鎖ヒト生殖細胞系フレームワークは、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１およびＶＨ７−８１から選択される。
【００３４】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＣＤ２０結合ペプチドまたはポリペプチドである。ある実施形態では、ＣＤ２０結合ペプチドは抗ＣＤ２０抗体または抗ＣＤ２０抗体の断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２など）を含む。別の実施形態では、ペプチドには軽鎖および／または重鎖可変領域が含まれる。特定の実施形態では、軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域にはフレームワーク領域または少なくともフレームワーク領域の一部（例えばＦＲ２やＦＲ３などの二つから三つの準領域）が含まれる。ある実施形態では、少なくともＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３またはＦＲＬ４は完全にヒト型である。別の実施形態では、少なくともＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３またはＦＲＨ４は完全にヒトである。ある実施形態では、少なくともＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３またはＦＲＬ４は生殖細胞系（例えばヒトの生殖細胞）の配列である。別の実施形態では、少なくともＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３またはＦＲＨ４は生殖細胞系（例えばヒトの生殖細胞）の配列である。好ましい実施形態では、フレームワーク領域は完全にヒト型のフレームワーク領域（例えば図４−５および８−９に示されているヒト型のフレームワーク領域）である。ある実施形態では、フレームワーク領域には配列番号７１、７２、７３、７４、７９、８０、８１、８２またはそれらの組み合わせが含まれる。別の実施形態では、フレームワーク領域には配列番号８７、８８、８９、９０、９５、９６、９７、９８またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００３５】
ある実施形態では、本発明は核酸、アミノ酸、配列番号１−７０から選択される配列またはその補体の発現をコード化するコンピュータ可読媒体を提供する。ある実施形態では、コンピュータ処理装置に送られた場合、これらの配列の発現はユーザーに（例えばインターネットを通して）表示される。
【００３６】
ある実施形態では、本発明は、配列番号１−７０に見られる核酸配列、または配列番号１−７０に見られるアミノ酸配列をコード化する核酸配列と、（厳密性の低い、中程度、あるいは高い条件下で）ハイブリダイズする核酸配列を提供する。
【００３７】
ある実施形態では、本発明は本出願に記載の核酸配列の補体を提供する（例えば表１−２および図２、３、６、７、１０および１１を参照）。ある実施形態では、本発明は厳密性の高い、中程度、あるいは低い条件下で本出願に記載の核酸配列とハイブリダイズを行なう配列を提供する（例えば表１−２および図２、３、６、７、１０および１１を参照）。
【００３８】
ある実施形態では、親和性定数（Ｋｄ）および会合速度（Ｋｏｎ）は、ＫｉｎＥｘａ平衡ソフト（例えばセパダイン・インスツルメンツ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、アイダホ州ボイジー（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ））を使って、ＩｇＧ細胞結合分析（つまり表面にヒトのＣＤ２０を発現する細胞）で決定される。ある実施形態では、親和性定数および会合速度定数は動的排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）で決定される（例えば、チュー（Ｃｈｉｕ）ら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、７３、５４７７−５４８４（２００１）、ブレーク（Ｂｌａｋｅ）ら、生物化学ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２７１、２７６７７−２７６８５（１９９６）、ホンゴウ（Ｈｏｎｇｏ）ら、ハイブリドーマ（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）、１９、３０３−３１５（２０００）、コスラビアニ（Ｋｈｏｓｒａｖｉａｎｉ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１、２６７−２７７（２０００）、パワーズ（Ｐｏｗｅｒｓ）ら、免疫方法ジャーナル（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２５１、１２３−１３５（２００１）を参照、これらは全て参照として本出願に組み込まれている）。特定の実施形態では、動的排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）はＫｉｎＥｘＡ装置（例えばセパダイン・インスツルメンツ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製ＫｉｎＥｘＡ（登録商標）３０００、アイダホ州ボイジー（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄａｈｏ））または類似の機器を使用して行なわれる。
【００３９】
他の実施形態では、ＣＤ２０結合分子にはＦａｂが含まれ、さらに一つまたはそれ以上の定常領域（例えばＣＨ２および／またはＣＨ３、図１０−１１を参照）が含まれる。特定の実施形態では、ＣＤ２０結合分子には抗体（例えば合成ＣＤＲ配列を有し、完全にヒト型のフレームワークを含む抗体）が含まれる。ある実施形態では、抗体には変質した（例えば突然変異した）Ｆｃ領域が含まれる。例えばある実施形態では、抗体のエフェクター機能を向上または低下させるためにＦｃ領域が変更されている。ある実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、その他から選択されるアイソタイプである。
【００４０】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域のＣＨ２ドメインにアミノ酸修飾が導入される。Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）の結合親和力または活性が変化したＩｇＧ Ｆｃ変異領域を作成するための修飾に有用なアミノ酸の位置には、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９のアミノ酸位置の一つあるいはそれ以上が含まれる。好適な実施形態では、そのような変異体を作成するためのテンプレートとして使用される親Ｆｃ領域は、ヒトのＩｇＧ Ｆｃを含む。ある実施形態では、ＦｃγＲとの結合力の低下したＦｃ領域変異体を生成するために、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３００、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９、のアミノ酸位置の一つまたはそれ以上にアミノ酸修飾を導入することができる。特定の実施形態では、一つまたはそれ以上のＦｃγＲｓとの結合が向上したＦｃ領域変異体が生成されることもある。そのようなＦｃ領域変異体は、ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の２８０、２８３、２８５、２８６、２９０、２９４、２９５、２９８、３００、３０１、３０５、３０７、３０９、３１２、３１５、３３１、３３３、３３４、３３７、３４０、３６０、３７８、３９８または４３０、のアミノ酸位置の一つまたはそれ以上にアミノ酸修飾を含む。ある実施形態では、アミノ酸修飾はＹ３００Ｉである。
【００４１】
別の実施形態では、アミノ酸修飾はＹ３００Ｌである。ある実施形態では、アミノ酸修飾はＱ２９５ＫまたはＱ２９５Ｌである。ある実施形態では、アミノ酸修飾はＥ２９４Ｎである。別の実施形態では、２９６の位置のアミノ酸修飾はＹ２９６Ｐである。ある実施形態では、２９８の位置のアミノ酸修飾はＳ２９８Ｐである。別の実施形態では、アミノ酸修飾はＳ２９８Ｎ、Ｓ２９８Ｐ、Ｓ２９８ＶまたはＳ２９８Ｄである。
【００４２】
ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子は重鎖定常領域の突然変異を含む。別の実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＤ２８０ＨおよびＫ２９０Ｓから選択された、突然変異を起こした重鎖定常領域を含む。
【００４３】
代替的あるいは追加的に、アミノ酸修飾と、Ｃ１ｑ結合および／またはＣＤ２０結合分子のＦｃ領域の補体依存性細胞毒性機能を変化させる一つまたはそれ以上のさらなるアミノ酸修飾とを組み合わせることが有用である。特に関連する出発ポリペプチドは、Ｃ１ｑと結合し補体依存性細胞毒性機能（ＣＤＣ）を示すものであり得る。本出願に記載のアミノ酸置換は、Ｃ１ｑと結合するおよび／または補体依存性細胞毒性機能を修正する（例えばこれらの作動体の機能を減少、及び望ましくは取り除く）出発ポリペプチドの機能を変化させる働きをする。しかしながら、上述の一つまたはそれ以上の位置に、より優れたＣ１ｑ結合および／または補体依存性細胞毒性機能（ＣＤＣ）を備えた置換体を含むポリペプチドも本出願では考慮されている。例えば、出発ポリペプチドは、Ｃ１ｑを結合するおよび／またはＣＤＣを媒介することはできないかもしれないし、またこれらのエフェクター機能を取得するべく、本出願の内容に従って修正されるかもしれない。さらに、既存のＣ１ｑ結合活性、さらに任意的にＣＤＣ媒介機能を有するポリペプチドが、これらの活性のうち一つまたは両方の活性を向上させるべく修正されることもある。Ｃ１ｑを変化させるおよび／またはその補体依存性細胞毒性機能を修正するアミノ酸修飾が、例えば参照としてここに組み込まれているＷＯ００４２０７２に記載されている。
【００４４】
上述のように、変更されたエフェクター機能を備えたＣＤ２０結合分子のＦｃ地域を、例えばＣ１ｑ結合および／またはＦｃγＲ結合を修正し、その結果ＣＤＣの活性および／またはＡＤＣＣ活性を変化させることによって設計することが可能である。例えば、改善されたＣ１ｑ結合および改善されたＦｃγＲＩＩＩ結合を備えた（例えば、改善されたＡＤＣＣ活性および改善されたＣＤＣ活性の両方を備えた）ＣＤ２０結合分子の様々なＦｃ地域を生成することが可能である。
【００４５】
あるいはエフェクター機能を減退または除去したい場合は、減退したＣＤＣ活性および／または減退したＡＤＣＣ活性を有するＦｃ変異領域を作成してもよい。別の実施形態では、これらの活性のいずれか一方だけを向上させ、他の活性を任意的に減退させること（例えばＡＤＣＣ活性を向上させＣＤＣ活性を減退させること、あるいはその逆によるＦｃ変異領域の作成）も可能である。
【００４６】
Ｆｃ変異体を本発明のＣＤ２０結合分子に導入し、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用を変化させ、薬物速度論的特性を改善することもできる。抗体のＦｃ領域とＦｃＲｎとの間の相互作用が血清免疫グロブリンの持続性に何らかの役割を演じている事がいくつかの実験で示されている。例えば、機能性ＦｃＲｎが欠如しているマウスのＩｇＧ分子において、血清の異常に短い半減期が観察されている。ＦｃＲｎとの結合を改善するＦｃの変異により血清の半減期が長くなると思われ、一方、ＩｇＧ結合の強化をもたらすラットのＦｃＲｎにおける変異もまた血清の半減期を向上させる。ＦｃＲｎとの結合が改善されたヒトＦｃ変異体のコレクションも記載されている（シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、ヒトＩｇＧＩのＦＣγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃＲｎ結合領域の高解像度マッピング、およびＦｃγＲとの結合が改善されたＩｇＧ１変異体のデザイン、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６、６５９１−６６０４（２００１））。低ｐＨで観察される（例えば飲作用あるいは血清からのＩｇＧ分子による液相飲食作用中）ＩｇＧ分子とＦｃＲｎの結合親和性の増大が血清の半減期に影響を及ぼすことが報告されている（ゲティー（Ｇｈｅｔｉｅ）ら、ランダム変異誘発によるＩｇＧ断片の血清持続性の増加、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５、６３７−６４０（１９９７）、メデサン（Ｍｅｄｅｓａｎ）ら、Ｆｃ：ＦｃＲｎ相互作用領域を説明するためのラットＩｇＧの比較研究、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８、２０９２−２１００（１９９８）、キム（Ｋｉｍ）ら、ＭＨＣクラスＩ関連受容体の結合に関するヒトＩｇＧ領域マッピング、ＦｃＲｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９、２８１９−２８２５（１９９９）、ダーラクア（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ）ら、新生児Ｆｃ受容体に関するヒトＩｇＧＩの親和力増大：生物学的結果、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、５１７１−５１８０（２００２））。しかし、高ｐＨで結合を増強させる突然変異は血清の半減期に悪い影響を及ぼすと思われる（ダーラクアら、新生児Ｆｃ受容体に関するヒトＩｇＧＩの親和力増大：生物学的結果、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９、５１７１−５１８０（２００２））。上述の文献は全て参照として本出願に編入されている。従って、低ｐＨでＦｃＲｎの親和性を増大させ、高ｐＨでＦｃＲｎの親和性を維持または減少させるように、Ｆｃ変異体を本発明のＣＤ２０結合分子に導入することができる。
【００４７】
別のタイプのアミノ酸置換は、ＣＤ２０結合分子Ｆｃ領域の糖鎖形成パターンを変更する働きをする。これは例えば、ポリペプチド内の一つまたはそれ以上の糖鎖形成領域を除去することにより、および／またはポリペプチド内に存在しない一つまたはそれ以上の糖鎖形成領域を加える事によって達成できる。Ｆｃ領域の糖鎖形成は通常Ｎ−リンクまたはＯ−リンクである。Ｎ−リンクは炭水化物の一部をアスパラギン残基の側鎖に結合させる事を意味する。ペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外のアミノ酸）は、炭水化物の一部がアスパラギン側鎖に酵素結合する際の認識配列である。従って、ポリペプチド中におけるこのようなペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的な糖鎖形成領域を形成する事になる。Ｏ−リンク糖鎖形成は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうち一つの糖が、ヒドロキシアミノ酸（通常はセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンが使用されることもある）と結合する事を意味する。
【００４８】
ＣＤ２０結合分子のＦｃ領域への糖鎖形成領域の付加は、上述のトリペプチド配列（Ｎ−リンク糖鎖形成領域）の一つまたはそれ以上を含むようにアミノ酸配列を変化させることにより容易に達成できる。典型的な糖鎖形成変異体は、重鎖の残基Ａｓｎ２９７のアミノ酸置換を有する。最初のポリペプチド（Ｏ−リンク糖鎖形成領域用）の配列に一つまたはそれ以上のセリンまたはトレオニン残基を付加する、あるいはそれらで置換する事によって変更することもできる。
【００４９】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ ＩＩＩ）を発現する細胞において、ＧｎＴ ＩＩＩがＧｌｃＮＡｃをＣＤ２０結合分子に付加する形で発現する。結合分子をこのような形で作成する方法は、これらの全てが完全なものとして参照用に本出願に組み込まれている、ＷＯ９９５４３４２、ＷＯ０３０１１８７８、出願公告２００３０００３０９７Ａ１、およびウマナ（Ｕｍａｎａ）ら、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１７、１７６−１８０、１９９９年２月発行に記載されている。
【００５０】
ある実施形態では、本発明は、ａ）本発明のＣＤ２０結合分子、およびｂ）被験者の疾病を治療するためのＣＤ２０結合分子の使用手引書または科学的研究あるいは診断目的（例えばＥＬＩＳＡ分析など）のためのＣＤ２０結合分子の使用手引書を含む道具一式を提供する。ある実施形態では、本発明は、本発明のＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列が永続的または一時的にトランスフェクトされた細胞株を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は標識された種々の領域およびセクションを有するＩｇＧ分子の概念図である。ＣＤＲおよび二つの可変領域軽鎖のうちの一つ、また二つの可変領域重鎖のうちの一つのフレームワークも標識されている。
【００５２】
【図２】図２ＡはＡＭＥ３３（配列番号５９）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、図２ＢはＡＭＥ３３（配列番号６０）の軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５３】
【図３】図３ＡはＡＭＥ３３（配列番号６１）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示し、図３ＢはＡＭＥ３３（配列番号６２）の重鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５４】
【図４】図４ＡはＣＤＲが散在した完全にヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩＩＩ（Ａ２７）（ＤＰＫ２２）のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される：ＦＲＬ１（配列番号７１）、ＦＲＬ２（配列番号７２）、ＦＲＬ３（配列番号７３）およびＦＲＬ４（配列番号７４）。図４ＢはＣＤＲが散在したヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩＩＩ（Ａ２７）（ＤＰＫ２２）の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される。ＦＲＬ１（配列番号７５）、ＦＲＬ２（配列番号７６）、ＦＲＬ３（配列番号７７）およびＦＲＬ４（配列番号７８）。
【００５５】
【図５】図５ＡはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域ＶＨ５−５１（ＤＰ−７３）のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される。ＦＲＨ１（配列番号７９）、ＦＲＨ２（配列番号８０）、ＦＲＨ３（配列番号８１）およびＦＲＨ４（配列番号８２）。図５ＢはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域Ｖ５−５１（ＤＰ−７３）の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は次のように標識される：ＦＲＨ１（配列番号８３）、ＦＲＨ２（配列番号８４）、ＦＲＨ３（配列番号８５）およびＦＲＨ４（配列番号８６）。
【００５６】
【図６】図６ＡはＡＭＥ５（配列番号６３）の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図６ＢはＡＭＥ５（配列番号６４）の軽鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５７】
【図７】図７ＡはＡＭＥ５（配列番号６５）の重鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図７ＢはＡＭＥ５（配列番号６６）の重鎖可変領域の核酸配列を示す。
【００５８】
【図８】図８ＡはＣＤＲが散在したヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩ（ＤＰＫ４）（Ａ２０）のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＬ１（配列番号８７）、ＦＲＬ２（配列番号８８）、ＦＲＬ３（配列番号８９）およびＦＲＬ４（配列番号９０）のように標識される。図８ＢはＣＤＲが散在したヒト型の軽鎖フレームワーク領域ＶｋＩ（ＤＰＫ４）（Ａ２０）の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＬ１（配列番号９１）、ＦＲＬ２（配列番号９２）、ＦＲＬ３（配列番号９３）およびＦＲＬ４（配列番号９４）のように標識される。
【００５９】
【図９】図９ＡはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域ＶＨＩ ＤＰ７／２１−２のアミノ酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＨ１（配列番号９５）、ＦＲＨ２（配列番号９６）、ＦＲＨ３（配列番号９７）およびＦＲＨ４（配列番号９８）のように標識される。図９ＢはＣＤＲが散在したヒト型の重鎖フレームワーク領域ＶＨＩ ＤＰＩ７／２１−２の核酸配列を示す。フレームワークの四つの準領域は、ＦＲＨ１（配列番号９９）、ＦＲＨ２（配列番号１００）、ＦＲＨ３（配列番号１０１）およびＦＲＨ４（配列番号１０２）のように標識される。
【００６０】
【図１０】図１０ＡはＡＭＥ３３（配列番号６７）の軽鎖の完全アミノ酸配列を示し、図１０ＢはＡＭＥ３３（配列番号６８）の軽鎖の完全核酸配列を示す。
【００６１】
【図１１】図１１ＡはＡＭＥ３３（配列番号６９）の重鎖の完全アミノ酸配列を示し、図１１ＢはＡＭＥ３３（配列番号７０）の重鎖の完全核酸配列を示す。
【００６２】
【図１２】図１２は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ結合分析の結果を示す。
【００６３】
【図１３】図１３は実施例２に記載のＥＬＩＳＡ結合分析の結果を示す。
【００６４】
【図１４】図１４は実施例３に記載の生体Ｂリンパ腫Ｆａｂ結合分析の結果を示す。
【００６５】
【図１５】図１５は実施例５に記載のＡＤＣＣ分析の結果を示す。
【００６６】
【図１６】図１６は実施例６に記載の糖鎖合成ＣＤ２０結合分子のＡＤＣＣ活性を示している。
【００６７】
【図１７】図１７は実施例９に記載の、ＡＭＥ３３抗体およびＣ２Ｂ８抗体に関わる生体内腫瘍阻害分析の結果を示している。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
定義
本発明の理解を助ける目的で、多くの用語が以下のように定義される。
【００６９】
本出願で使用されている「抗体」という用語は、四つのペプチド鎖、つまりジスルフィド結合で連結された二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖で構成される免疫グロブリン分子を意味する。各重鎖は重鎖可変領域（本出願ではＨＣＶＲまたはＶＨと略）と重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は三つのドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（図１を参照）で構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域（本出願ではＬＣＶＲまたはＶＬと略）と軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は一つのドメインＣＬ（図１を参照）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、より保存された、フレームワーク領域（ＦＲ）とよばれる領域が組み込まれた、相補性決定領域（ＣＤＲ）とよばれる超可変性の領域に細分される。各可変領域（ＶＨまたはＶＬ）はＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に指定される三つのＣＤＲを含んでいる（図１、４および５を参照）。各可変領域はＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４に指定される四つの準領域であるフレームワークを含んでいる（図１、４および５を参照）。
【００７０】
本出願で使用されている「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部分を意味する。抗体断片の例として、これだけに限定されるものではないが、線形抗体、単鎖抗体分子、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片、抗体断片から形成される多特異的抗体などが含まれる。抗体断片は重鎖および／または軽鎖可変領域の少なくとも一部を保持していることが望ましい。
【００７１】
本出願で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、抗原結合で主な働きをする領域である。軽鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）、重鎖可変領域に三つのＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）が存在する。これら六つのＣＤＲを構成している残基は、カバット（Ｋａｂａｔ）およびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）により次のように特徴付けられている：軽鎖可変領域の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）、そして重鎖可変領域の３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）；カバット（Ｋａｂａｔ）など、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ） （１９９１）、第５版、国立衛生研究所公衆衛生サービス（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）、メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）（参照として本出願に編入）、および軽鎖可変領域の残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）および９１〜９６（ＣＤＲＬ３）、そして重鎖可変領域の２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）および９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）；コチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、９０１〜９１７（１９８７）（参照として本出願に組み込まれている）。特別の断りがない限り、本出願で使用される「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、カバット（Ｋａｂａｔ）とコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の両方に含まれる残基を含んでいる（すなわち軽鎖可変領域の残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）および８９〜９７（ＣＤＲＬ３）、そして２６〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）および９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）である）。本出願では、指定されていない限り、ＣＤＲ残基の番号はカバット（Ｋａｂａｔ）の方法に基づいている。
【００７２】
本出願で使用される「フレームワーク」という用語は、本出願で定義されるＣＤＲ残基以外の可変領域の残基を意味する。フレームワークを構成する、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の四つの準領域が存在する（図１、４および５を参照）。フレームワークの準領域が軽鎖可変領域であるか重鎖可変領域であるかを区別するために、準領域の略号に「Ｌ」か「Ｈ」を付けることもできる（例えば「ＦＲＬ１」は軽鎖可変領域のフレームワーク準領域１を示す）。特に指定されていない限り、ＣＤＲ残基の番号はカバット（Ｋａｂａｔ）の方法に基づいている。ある実施形態において、本出願のＣＤ２０結合分子が完全ではないフレームワークを有する場合がある（例えばＣＤ２０結合分子が四つの準領域のうち一つだけあるいは一つ以上を含むフレームワークの一部を有する場合がある）ことが知られている。
【００７３】
本出願で使用される「完全にヒト型のフレームワーク」という用語は、ヒトに自然に見られるアミノ酸配列を有するフレームワークを意味する。完全にヒト型のフレームワークの例には、これだけに限定されるものではないが、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、ＰＯＭなどが含まれる（例えばカバット（Ｋａｂａｔ）ら、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）（１９９１）、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ、およびウー（Ｗｕ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２，２１１−２５０（１９７０）を参照、両方とも参照として本出願に組み込まれている））。
【００７４】
本出願で使用される「被験者」および「患者」という用語は、犬、猫、鳥、家畜などの哺乳類を含む動物で、ヒトであるのが望ましい。
【００７５】
本出願で使用される「コドン」または「トリプレット」という用語は、ポリペプチドに含まれる天然アミノ酸の一つを特定する、隣り合った三つのヌクレオチド・モノマーのグループを意味する。この用語には、どのアミノ酸も特定しないコドンも含まれる。遺伝子コドンの縮退のため、同じアミノ酸をコード化するコドンが複数存在する事も知られている。従って、本発明の核酸配列の多くの塩基（例えば表１および２を参照）を、コード化されている実際のアミノ酸配列を変えることなく変更することができる。本発明はそのような核酸配列を全て含むことを意図している。
【００７６】
本出願で使用される「ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」、「ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」および「ペプチドをコード化する核酸配列」という用語は、特定のポリペプチドのコード領域を含む核酸配列を意味する。当該コード領域はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの形で存在する。ＤＮＡの形で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖（すなわちセンス鎖）であっても二本鎖であってもよい。転写の適切な開始および／または１次ＲＮＡ転写物の正しいプロセッシングを必要とされている場合、エンハンサー・プロモーター、スプライス部位、ポリアデニレーション・シグナルなどの適切な調節要素を遺伝子のコード領域の直ぐ近くに配置することもできる。あるいは、本発明の発現ベクターに使用されるコード領域は、内因性のエンハンサー・プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニレーション・シグナルなど、または内因性と外因性の調節要素の組み合わせを含んでいることもある。
【００７７】
本出願で使用される「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」という用語の間には大きさの制限や区別はない。どちらの用語も単にヌクレオチドからなる分子を意味する。同様に、「ペプチド」と「ポリペプチド」という用語の間にも大きさの区別は存在しない。両用語とも単にアミノ酸残基で構成される分子を意味する。
【００７８】
本出願で使用される「相補的な」または「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連した、ポリヌクレオチド（すなわちヌクレオチドの配列）について使用される。例えば配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。相補性は塩基対合則に従って核酸塩基の一部だけが一致している「部分的」なものでも、核酸間で「完全に」あるいは「全体に」相補的なものでもよい。核酸鎖間の相補性の度合いは、ハイブリダイゼーションの効果および強度に重要な影響を及ぼす。
【００７９】
本出願で使用される、所定の配列の「補体」という用語は、その全長にわたる配列に完全に相補的である配列に関して使用される。例えば配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」の「補体」である。本発明は、本出願に記載の配列の補体（例えば配列番号１−７０の核酸配列の補体）も提供する。
【００８０】
本出願で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸の対合に関連して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち核酸間の結合の強さ）は、核酸間の相補性の度合い、条件の厳しさの度合い、形成されたハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの要因の影響を受ける。
【００８１】
本出願で使用される「厳密性」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行なわれる温度、イオン強度、有機溶媒のような他の化合物の存在などの条件に関連して使用される。上述のパラメーターを単独でまたは組み合わせて変えることにより条件の「厳密性」変化させる事ができることを、当技術分野に精通した技術者は理解している。「厳密性の高い」条件では、核酸塩基の対形成は、相補的な塩基配列の頻度が高い核酸断片の間でのみ生じる（例えば「厳密性の高い」）条件下のハイブリダイゼーションは、約８５〜１００％同一、望ましくは約７０〜１００％同一の相同体間で生じる）。厳密性が中度の条件下では、核酸塩基の対形成は、相補的な塩基配列の頻度が中位の核酸断片の間で生じる（例えば「厳密性が中度の」条件下のハイブリダイゼーションは、約５０〜７０％同一の相同体の間で生じる）。従って、厳密性が「弱い」または「低い」条件下では、相補的な塩基配列の頻度が低いため、通常遺伝的に多様性のある有機体から導かれる核酸が要求される。
【００８２】
「厳密性の高い条件」という用語が核酸ハイブリダイゼーションとの関連で使用される場合、長さ約５００のヌクレオチドのプローブを使用する時は、５ＸＳＳＰＥ（ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整した４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ）、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハーツ溶液（５０Ｘデンハーツ溶液は５００ｍｌ当たり５ｇのＦｉｃｏｌｌ（タイプ４００、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇのＢＳＡ（画分Ｖ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）を含む））、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズし、その後０．１ＸＳＳＰＥおよび１．０％ＳＤＳの溶液中、４２℃で洗浄する条件が含まれる。
【００８３】
「中程度の厳密性の条件」という用語が核酸ハイブリダイゼーションとの関連で使用される場合、長さ約５００のヌクレオチドのプローブを使用する時は、５ＸＳＳＰＥ、０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハーツ溶液、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズし、その後１．０ＸＳＳＰＥおよび１．０％ＳＤＳの溶液中、４２℃で洗浄する条件が含まれる。
【００８４】
「厳密性の低い条件」という用語が核酸ハイブリダイゼーションとの関連で使用される場合、長さ約５００のヌクレオチドのプローブを使用する時は、５ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５Ｘのデンハーツ溶液、および１００ｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡの溶液中、４２℃で結合またはハイブリダイズし、その後５ＸＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ溶液中、４２℃で洗浄する条件が含まれる。
【００８５】
「単離される」という用語が、「単離されたオリゴヌクレオチド」、「単離されたポリヌクレオチド」、「ＣＤ２０結合分子をコード化する単離された核酸配列」（例えば表１−２を参照）など、核酸との関連で使用される場合、識別された、またそれが通常関係している（例えば宿主細胞の蛋白質）少なくとも一つの汚染物である核酸から分離された核酸配列を意味する。
【００８６】
本出願で使用される「一部」という用語は、ヌクレオチド配列との関係で使用される場合（例えば「あるヌクレオチド配列の一部」）、その配列の断片を意味する。断片の大きさは１０ヌクレオチドから全ヌクレオチド配列マイナス一つのヌクレオチドまで様々であってよい（例えば１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００ヌクレオチドなど）。
【００８７】
本出願で使用される「一部」という用語は、アミノ酸配列との関係で使用される場合（例えば「あるアミノ酸配列の一部」）、その配列の断片を意味する。断片の大きさは六つのアミノ酸から全アミノ酸配列マイナス一つのアミノ酸まで様々であってよい（例えば６、１０、２０、３０、４０、７５、２００アミノ酸など）。
【００８８】
本出願で使用される「精製される」または「精製する」という用語は、サンプルから汚染物を除去する事を意味する。例えばＣＤ２０特異的な抗体は、汚染物である非免疫グロブリン蛋白質を除去する事により精製される。これらはまたあるいは同じ抗原と結合しない免疫グロブリンを除去する事によっても精製される。非免疫グロブリン蛋白質および／または特定の抗原と結合しない免疫グロブリンを除去する事により、サンプル中の抗原特異的な免疫グロブリンの比率が高まる結果となる。別の例では、抗原特異的な組み換えポリペプチドが細菌の宿主細胞で発現し、また宿主細胞の蛋白質を除去する事によりそのポリペプチドが精製され、サンプル中の抗原特異的な組み換えポリペプチドの比率が高まる。
【００８９】
本出願で使用される「ベクター」という用語は、ＤＮＡ断片を一つの細胞から別の細胞へ移す核酸分子に関連して使用される。「ビヒクル」という用語が、「ベクター」と同じ意味で使用される場合もある。
【００９０】
本出願で使用される「発現ベクター」という用語は、希望のコード配列および特別の宿主生物内の機能的に連結したコード配列の発現に必要な適切な核酸配列を含む、組み換えＤＮＡ分子を意味する。原核生物における発現に必要な核酸配列には、プロモーター、オペレーター（任意）およびリボソーム結合部位が、他の配列とともに含まれる。真核細胞はプロモーター、エンハンサー、終止シグナル、そしてポリアデニレーション・シグナルを使用することが知られている。
【００９１】
本出願で使用される「宿主細胞」という用語は、生体内または生体外のあらゆる原核細胞または真核細胞をさす（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（クルセル社（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、オランダ）やＣＨＯ細胞などの哺乳類の細胞、鳥の細胞、両生類の細胞、植物細胞、魚の細胞および昆虫の細胞）。例えば、宿主細胞は遺伝子導入動物中に存在することもある。
【００９２】
本出願で使用される「コンピュータ・メモリ」および「コンピュータ・メモリ装置」という用語は、コンピュータ・プロセッサで読取り可能なあらゆる記憶媒体を意味する。コンピュータメモリには、これだけに限定されるものではないが、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、コンピュータ・チップ、デジタル・ビデオ・ディスク（ＤＶＤ）、コンパクト・ディスク（ＣＤ）、ハードディスク・ドライブ（ＨＤＤ）、磁気テープなどが含まれる。
【００９３】
本出願で使用される「コンピュータ読取り可能媒体」という用語は、コンピュータ・プロセッサに情報（例えばデータや指示）を保存および提供するあらゆる装置またはシステムを意味する。コンピュータ読取り可能媒体の例には、これだけに限定されるものではないが、例えばＤＶＤ、ＣＤ、ハードディスク・ドライブ、磁気テープ、ネットワークのストリーム媒体用サーバーなどが含まれる。
【００９４】
本出願で使用される、核酸またはアミノ酸配列の「発現をコード化するコンピュータ読取り可能媒体」という用語は、プロセッサに配信されたときに、核酸またはアミノ酸配列をユーザーに表示（例えばプリントアウトや画面表示）することを可能にする情報を記憶している、コンピュータ読取り可能媒体を意味する。
【００９５】
本出願で使用される「プロセッサ」および「中央処理装置」あるいは「ＣＰＵ」という用語は同じ意味で使用され、コンピュータ・メモリ（例えばＲＯＭまたは他のメモリ）からプログラムを読取り、そのメモリに従って一連のステップを行なう事のできる装置を意味する。
【００９６】
本出願で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を意味する（例えば表１を参照）。「Ｆｃ領域」は天然配列のＦｃ領域であってもよいし、変異体のＦｃ領域（例えば作動体の機能が減少または増大したもの）であってもよい。
【００９７】
本出願で使用されるように、Ｆｃ領域は（例えば被験者の）生物活性の活発化あるいは減退の原因である「作動体の機能」を有していてもよい。作動体の機能には、これだけに限定されるものではないが、例えばＣ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）、食細胞活動、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体（ＢＣＲ））のダウンレギュレーションなどが含まれる。このような作動体の機能は、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば抗体可変ドメイン）と結合することを必要とし、また種々の分析（例えばＦｃ結合分析、ＡＤＣＣ分析、ＣＤＣ分析など）を使って評価される。
【００９８】
本出願で使用される「単離された」ペプチド、ポリペプチド、または蛋白質とは、識別され、自然環境の成分から分離および（または）回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、当該ポリペプチドの診断または治療のための使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、他の蛋白様または非蛋白様溶質が含まれる。ある実施形態では、単離されたポリペプチドは、（１）ロウリー（Ｌａｗｒｙ）法で測定してポリペプチドの重量比で９５％以上、好ましくは重量比で９９％以上になるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使ってＮ−末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、あるいは（３）クマシー・ブルーまたは銀染色を使い還元または非還元条件下でＳＤＳ−ｐａｇｅにより均一になるまで、のレベルまで精製される。そのポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組み換え細胞内の本来の位置のポリペプチドが含まれる。しかし、単離されたポリペプチドは通常、少なくとも一つの精製ステップを経て生成される。
【００９９】
本出願で使用される「治療」という用語は、治療を目的とした処置および予防的治療の両方を意味する。治療を必要とする人には、既に疾病に罹っている人およびその疾病の予防を希望する人が含まれる。
【０１００】
「症状が軽減する条件の下に」という用語は、ＣＤ２０結合分子で治療可能なあらゆる疾病の検出可能な症状の、あらゆる程度の質的あるいは量的な軽減を意味し、これには、決してこれだけに限定されるものではないが、疾病の回復速度に対する検出可能な影響（例えば体重の増加率）、あるいは特定の疾病に通常関連する症状の少なくとも一つの軽減が含まれる。
【０１０１】
本出願で使用される「ヒトのＣＤ２０」（本出願ではｈＣＤ２０と略）という用語は、ヒトのＢリンパ球制限分化抗原（Ｂｐ３５とも呼ばれる）を意味する。ＣＤ２０はＢ前駆体細胞成長の初期に発現し、血漿の細胞分化まで残る。ＣＤ２０分子は、細胞サイクルの開始および分化に必要なＢ細胞活性化プロセスの一段階を規制することもあり、新生物形成Ｂ細胞において通常極めて高レベルで発現する。ＣＤ２０は「正常な」Ｂ細胞にも「悪性の」Ｂ細胞（すなわち無制限の増幅がＢ細胞リンパ腫の原因となるＢ細胞）にも存在する。
【０１０２】
「親和性」、「結合親和性」および「Ｋｄ」という用語は、ＣＤ２０結合分子・ＣＤ２０蛋白の複合体に関連した解離平衡定数（濃度の単位で表現される）を意味する。結合親和性は、オフレート定数（一般に時間の逆数、例えば秒−１の単位で報告される）とオンレート（一般に時間単位当たりの濃度の単位、例えばモル／秒で報告される）の比に直接関係している。結合親和性は、例えばＥＬＩＳＡ分析、動的排除分析（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ａｓｓａｙ）、表面プラズモン共鳴などにより決定される。あるエピトープは細胞表面で繰り返し（多価性）生じる場合があり、抗体と反復エピトープとの結合の解離定数（ｋｏｆｆ）は、一価のリガンドと同抗体の反応の解離定数と比べて大幅に縮小する場合があることが知られている。一つの抗体・リガンド結合が解離すると、他の結合が二価（または多価）の抗体を多価のリガンドに繋ぎ止め、解離した結合が再び形成されるため、解離定数の縮小が起きる。二価（または多価）のＡｂと多価のリガンドとの反応の解離定数は、抗体の代表的な部位の会合定数である内因性の親和性と区別するために、機能的親和性と呼ばれる。
【０１０３】
本出願で使用される「解離」、「解離速度」および「ｋｏｆｆ」という用語は、抗原・抗体複合体からＣＤ２０結合分子が解離するオフレート定数を意味する。
【０１０４】
本出願で使用される「会合」、「会合速度」および「ｋｏｎ」という用語は、ＣＤ２０結合分子が抗原と会合し抗原抗体複合体を作るオンレート定数を意味する。
【０１０５】
本出願で使用される「有効濃度」および「ＥＣ５０」という用語は、十分な量のＣＤ２０分子と相互作して、処理された細胞の約５０％に影響を及ぼす事のできるＣＤ２０結合分子の濃度を意味する。
【０１０６】
発明の説明
本発明は、ＣＤ２０結合分子およびＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列を提供する。特に本発明は、ヒトのＣＤ２０に関して高い結合親和力と低い解離速度を有するＣＤ２０結合分子を提供する。本発明のＣＤ２０結合分子は、完全にヒト型のフレームワーク（例えばヒトの生殖細胞系フレームワーク）を有する軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでいるのが望ましい。発明の説明は、便宜上、Ｉ．ＣＤ２０結合分子、ＩＩ．ＣＤ２０結合分子の作成、ＩＩＩ．治療用の調剤および使用、およびＩＶ．それ以外のＣＤ２０結合分子の使用、に分類される。
【０１０７】
Ｉ．ＣＤ２０結合分子
本発明は望ましい性質をもったＣＤ２０結合分子を提供する。特にある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し高い結合親和性（Ｋｄ）を有している。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に対し低い解離速度（ｋｏｆｆ）を有している。好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、高い親和性と低い解離速度を有し、低濃度で有効である。従って、当発明を実践または理解する必要なくして、高親和性と低解離速度を有する本発明のＣＤ２０結合分子が特にヒトの治療用に優れており、リツキサン（Ｃ２Ｂ８）のような他の抗ＣＤ２０分子と比べてＨＡＣＡ反応を引き起こす可能性が小さい事が理解される。
【０１０８】
さらに別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子はヒトのＣＤ２０に結合する。別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子はカニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）のＢ細胞表面のＣＤ２０と結合する。
【０１０９】
好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでおり、完全にヒト型のフレームワークを有していることが望ましい。特に好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は軽鎖および／または重鎖可変領域を含んでおり、ヒトの生殖細胞系フレームワークを有していることが望ましい。従って、本発明を実践または詳細に理解する必要なくして、フレームワーク領域が完全にヒトであるならば、ヒトに投与（例えば疾病の治療）した場合、本発明のＣＤ２０結合分子（例えば後述の実施例を参照）は免疫原性反応を殆どあるいは全く引き起こさないと考えられる。
【０１１０】
以下の表１および２に示されているように、本発明はＣＤ２０結合分子を作成するのに有効な数多くのＣＤＲを提供する。例えば、ＣＤ２０結合ペプチドまたはＣＤ２０結合ペプチドをコード化する核酸配列を作成するため、表示されている一つまたはそれ以上のＣＤＲをフレームワークの準領域（例えば完全にヒトのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４）と組み合わせることができる。あるいは、以下の表に示されているＣＤＲを、例えば、三つのＣＤＲが軽鎖可変領域に存在するように、および／または三つのＣＤＲが重鎖可変領域に存在するように組み合わせてもよい。
【０１１１】
ＣＤ２０結合分子またはＣＤ２０結合分子をコード化する核酸配列を作成するため、以下に示されているＣＤＲを（例えば組み換え技術を使って）ヒト型のフレームワーク、つまり図４−５および８−９に示されているような軽鎖および重鎖フレームワークに挿入してもよい。例えば、図４Ａ（または８Ａ）に示されているＣＤＲＬ１を、表１に示されるように配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９または２１で置き換えることができる。同様に、図４Ｂ（または８Ｂ）に示されているＣＤＲＬ１を、表１に示されているように配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０または２２で置き換えることができる。同じ方法が表１−２に示されている全てのＣＤＲに関して使用できる。以下に表１および２を示す。
表１ 軽鎖ＣＤＲ
【表１】
＊ 残基の番号付けにはカバット（Ｋａｂａｔ）の方法を採用した。ＣＤＲはカバット（Ｋａｂａｔ）およびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の残基を含む。
表２ 重鎖ＣＤＲ
【表２】
＊ 残基の番号付けにはカバット（Ｋａｂａｔ）の方法を採用した。ＣＤＲはカバット（Ｋａｂａｔ）およびコチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）の残基を含む。
【０１１２】
本発明は、上の表に示されているＣＤＲ配列（アミノ酸および核酸）と実質的に同じ配列も提供する。例えば、表に示されている配列の中の一つまたは二つのアミノ酸を置き換えてもよい。さらに例えば、表に示されている配列において多数のヌクレオチド塩基を置き換えることもできる。アミノ酸配列の変更は、そのアミノ酸配列をコード化している核酸配列を変えることによって行われてもよい。所定のＣＤＲの変異体をコード化する核酸配列は、特定の配列に関する本明細のガイダンスを使い、当業者に知られている方法でも生成される。これらの方法には、これだけに限定されるものではないが、部位特異的（またはオリゴヌクレオチド媒介）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、ＣＤＲをコード化する以前に生成した核酸のカセット変異誘発などによる生成が含まれる。置換変異体を生成する方法としては、部位特異的変異誘発が望ましい。この方法は当技術分野ではよく知られている（例えばカーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、４４３１−４４４３（１９８５）、クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２、４８８−４９２（１９８５）を参照。両方とも参照として本出願に組み込まれている）。
【０１１３】
簡単に説明すると、ＤＮＡの部位特異的変異誘発を行う際、目的の変異をコード化しているオリゴヌクレオチドを出発ＤＮＡの一本鎖とまずハイブリダイズする事により、当該出発ＤＮＡが変質される。ハイブリダイゼーションの後、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、また出発ＤＮＡの一本鎖をテンプレートとして用いて、ＤＮＡポリメラーゼによって二本目の鎖全体が合成される。このようにして、目的の変異をコード化するオリゴヌクレオチドが結果として得られる二本鎖のＤＮＡに取り込まれる。
【０１１４】
出発ＣＤＲのアミノ酸配列変異体を作成するには、ＰＣＲ変異誘発も適している（例えばバレット（Ｖａｌｌｅｔｔｅ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７、７２３−７３３（１９８９）、参照として本出願に組み込まれている）。簡単に説明すると、ＰＣＲにおいて僅かな量のテンプレートＤＮＡを出発物質として使用する場合、テンプレートＤＮＡ内の対応する領域とわずかに配列が異なるプライマーを使用して、プライマーとテンプレートが相違している位置だけテンプレート配列と異なるＤＮＡ断片を比較的大量に作成できる。
【０１１５】
変異体を生成する別の方法であるカセット式変異誘発は、ウェルス（Ｗｅｌｌｓ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３４、３１５−３２３（１９８５）（参照として本出願に組み込まれている）に記載の技術に基づいている。出発物質は、変異される出発ＣＤＲ ＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。変異される出発ＤＮＡのコドンが同定される。同定された変異部位の両側に、独特の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなくてはならない。そのような制限部位が存在しない場合には、上述のオリゴヌクレオチド媒介変異誘発方法を使って、出発ポリペプチドＤＮＡの適切な場所に制限部位を導入してもよい。プラスミドＤＮＡは、線形化するため当該の部位で切断される。制限部位間のＤＮＡ配列をコード化し、また目的の突然変異を含んでいる二本鎖オリゴヌクレオチドが標準の方法を使って合成される。この場合、オリゴヌクレオチドの二本鎖は別々に合成され、標準技術を使ってハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドはカセットと呼ばれる。このカセットは、プラスミドと直接連結できるよう、線形化されたプラスミドの両端と適合する５’および３’末端を持つようにデザインされる。このようにして、突然変異ＤＮＡ配列を含むプラスミドが作成される。
【０１１６】
代替的にまたは追加的に、ポリペプチド変異体をコード化する目的アミノ酸配列を決定し、そのようなアミノ酸配列の変異体をコード化する核酸配列を合成してもよい。ＣＤＲのアミノ酸配列に保存的な修飾を施してもよい。天然の残基は側鎖の特性を基にいくつかのクラスに分類される。
（１） 疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２） 中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３） 酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４） 塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５） 鎖の方向付けに影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
（６） 芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
同類置換は、あるクラスのメンバーを同じクラスの別のメンバーで置き換える。本発明は、表１および２に示されている核酸配列の補体、および減密度が低い、中程度、また高い条件下でこのような核酸配列とハイブリダイズする核酸配列も提供する。
【０１１７】
本発明のＣＤＲは、どのタイプのフレームワークと共に使用してもよい。ＣＤＲは完全にヒト型のフレームワーク、またはフレームワークの準領域と一緒に使用するのが望ましい。特に好適な実施形態では、フレームワークはヒトの生殖細胞系配列である。完全にヒト型のフレームワークの例は、図４−５および８−９に示してある。その他の完全にヒト型のフレームワークまたはフレームワークの準領域を使用してもよい。例えばＮＣＢＩウェブサイトには、現在知られているフレームワーク領域の配列が含まれている。ヒトのＶＨ配列は、これだけに限定されるものではないが、例えばＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、ＶＨ７−８１などであり、これらは参照として本出願に編入されているマツダ（Ｍａｔｓｕｄａ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８、１９７３−１９７５（１９９８）に記載されており、ヒトの免疫グロブリン鎖可変領域座の完全なヌクレオチド配列を含んでいる。ヒトのＶＫ配列は、これだけに限定されるものではないが、例えばＡｌ、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２、Ａ２０、Ａ２３、Ａ２６、Ａ２７、Ａ３、Ａ３０、Ａ５、Ａ７、Ｂ２、Ｂ３、Ｌ１、Ｌ１０、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｌ１４、Ｌ１５、Ｌ１６、Ｌ１８、Ｌ１９、Ｌ２、Ｌ２０、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ８、Ｌ９、Ｏ１、Ｏ１１、Ｏ１２、Ｏ１４、Ｏ１８、Ｏ２、Ｏ４、Ｏ８などであり、これらは参照として本出願に組み込まれているカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１、１０１７−１０２８（２００１）、シェーブル（Ｓｃｈａｂｌｅ）およびツァッハウ（Ｚａｃｈａｕ）、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ Ｓｅｙｌｅｒ３７４、１００１−１０２２（１９９３）、およびブレンシン−クッパース（Ｂｒｅｎｓｉｎｇ−Ｋｕｐｐｅｒｓ）ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）１９１、１７３−１８１（１９９７）に記載されている。ヒトのＶＬ配列は、これだけに限定されるものではないが、例えばＶ１−１１、Ｖ１−１３、Ｖ１−１６、Ｖ１−１７、Ｖ１−１８、Ｖ１−１９、Ｖ１−２、Ｖ１−２０、Ｖ１−２２、Ｖ１−３、Ｖ１−４、Ｖ１−５、Ｖ１−７、Ｖ１−９、Ｖ２−１、Ｖ２−１１、Ｖ２−１３、Ｖ２−１４、Ｖ２−１５、Ｖ２−１7、Ｖ２−１９、Ｖ２−６、Ｖ２−７、Ｖ２−８、Ｖ３−２、Ｖ３−３、Ｖ３−４、Ｖ４−１、Ｖ４−２、Ｖ４−３、Ｖ４−４、Ｖ４−６、Ｖ５−１、Ｖ５−２、Ｖ５−４、Ｖ５−６などであり、これらは参照として本出願に編入されているカワサキ（Ｋａｗａｓａｋｉ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７、２５０−２６１（１９９７）に記載されている。完全にヒト型のフレームワークは、これらの機能的生殖細胞系遺伝子から選択される。通常これらのフレームワークは制限された数のアミノ酸の変更により互いに異なっている。これらのフレームワークを本出願に記載のＣＤＲと共に使用してもよい。本発明のＣＤＲと共に使用されるヒト型のフレームワークの追加的な例には、これだけに限定されるわけではないが、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、ＰＯＭなどがある（例えば、両方とも参照として本出願に編入されている、カバット（Ｋａｂａｔ）ら、（１９９１）免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ、ＵＳＡ、およびウー（Ｗｕ）ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１３２、２１１−２５０（１９７０）参照）。
【０１１８】
再び本発明を実践または理解する必要なくして、生殖細胞系の配列の使用がほとんどの個人において有害な免疫反応を排除すると期待されている理由は、以下の通りであると考えられている。通常の免疫反応中に生じる親和性成熟ステップの結果、免疫グロブリンの可変領域に体細胞の突然変異が頻繁に生じる。これらの突然変異は主に超可変的なＣＤＲの周りに生じるが、フレームワーク領域の残基にも影響を及ぼす。これらのフレームワークの突然変異は生殖細胞系の遺伝子には存在せず、また患者の免疫原性になる可能性は少ない。一方、一般集団は生殖細胞系の遺伝子によって発現されるフレームワーク配列の大多数に晒されており、免疫寛容の結果、これらの生殖細胞系のフレームワークは患者において免疫原性が低いあるいは被免疫原性であると予想される。免疫寛容の可能性を最大にするため、可変領域をコード化する遺伝子を普通に存在する機能的生殖細胞系遺伝子の集合から選択することができ、またさらにＶＨおよびＶＬ領域をコード化する遺伝子を免疫グロブリン分子の重鎖および軽鎖間の既知の関連性と一致させるために選択することもできる。
【０１１９】
ＩＩ．ＣＤ２０結合分子の作成
好適な実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は抗体または抗体断片（例えば本出願に記載の一つまたはそれ以上のＣＤＲ）を含む。本発明の抗体または抗体断片は、例えば、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖遺伝子を宿主細胞内で組み換え・発現させる事により生成できる。抗体を組み換え・発現させるため、例えば、軽鎖および重鎖が宿主細胞の中で表現され、また望ましくは宿主細胞が培養され、そこから抗体が回収されるような培地中に分泌されるように抗体の免疫グロブリン軽鎖および重鎖をコード化するＤＮＡ断片を含んだ、一つ以上の組み換え発現ベクターが宿主細胞に導入されることがある。標準の組み換えＤＮＡ技術を使用して、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子が得られ、これらの遺伝子を組み換え・発現ベクターに挿入し、そのベクターを宿主細胞に導入することもできる。このような方法は、いずれも参照として本出願に編入されている、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編、分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）、実験室手引書（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、第２版、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、（１９８９）、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．）ら編、分子生物学の現在の実験記録（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、グリーン・パブリッシング・アソシエーツ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）（１９８９）、およびボス（Ｂｏｓｓ）らによる米国特許番号４，８１６，３９７などに記載されている。
【０１２０】
本発明の一つまたはそれ以上のＣＤＲを有する抗体を発現させるには、軽鎖および重鎖可変領域をコード化するＤＮＡ断片をまず入手する。このようなＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って、生殖細胞系の軽鎖および重鎖可変配列を増幅および修飾する事により入手できる。ヒト型の重鎖および軽鎖可変領域の遺伝子に関する生殖細胞系ＤＮＡ配列は、当技術分野で良く知られている（上述参照）。
【０１２１】
生殖細胞系のＶＨおよびＶＬ断片を入手したら、本出願開示のＣＤＲアミノ酸配列の一つまたはそれ以上をコード化するように配列を変異させることができる（例えば表１−２を参照）。生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ ＤＮＡ配列でコード化されたアミノ酸配列が、生殖細胞系の配列とは異なるアミノ酸残基を識別するためのＣＤＲ配列と比較される。次に、どのヌクレオチドを変異させるかを決定する遺伝子コードを使用し、変異した生殖細胞系配列が選択されたＣＤＲ（例えば表１−２から選択された六つのＣＤＲ）をコード化するように、生殖細胞系ＤＮＡ配列の適切なヌクレオチドが変異される。生殖細胞系配列の変異誘発は、（ＰＣＲ産物が突然変異体を含むように、変異したヌクレオチドがＰＣＲプライマーに導入されるような）ＰＣＲ−媒介変異誘発や、部位特異的変異誘発などの標準の方法を使って行なわれてもよい。別の実施形態では、可変領域は新たに合成される（例えば核酸合成機を使用）。
【０１２２】
目的のＶＨおよびＶＬ部分をコード化するＤＮＡ断片が（例えば上述したように生殖細胞系ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅および変異誘発または合成などを使用）入手できたら、例えば、可変領域の遺伝子を抗体の全長鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、あるいはｓｃＦｖ遺伝子などに変換するなど、このようなＤＮＡ断片を標準の組み換えＤＮＡ技術を使ってさらに操作することができる。のような操作では、ＶＬまたはＶＨをコード化しているＤＮＡ断片は、抗体の定常領域やフレキシブルリンカーなどの他のポリペプチドをコード化するＤＮＡ断片と操作可能な状態で連結される。ＶＨ領域をコード化している単離されたＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、図１０−１１を参照）をコード化している別のＤＮＡ分子に操作可能な状態で連結させる事により、全長の重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト型の重鎖定常領域の遺伝子の配列は当技術分野で良く知られており（例えばカバット（Ｋａｂａｔ）、Ｅ．Ａ．ら、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ出版物Ｎｏ．９１−３２４２）（１９９１）、またこのような領域を含むＤＮＡ断片は標準のＰＣＲ増幅により入手できる。重鎖定常領域は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であるが、最も好ましいのはＩｇＧ１またはＩｇＧ４定常領域である。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関しては、ＶＨをコード化するＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコード化する別のＤＮＡ分子と操作可能な状態で連結される。好適な実施形態では、重鎖定常領域は図１１に示される定常領域に類似しているかまたはそれと同一である。
【０１２３】
ＶＬ領域をコード化している単離されたＤＮＡは、軽鎖定常領域ＣＬをコード化している別のＤＮＡ分子と操作可能な状態で連結する事により、全長の軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変更することができる。ヒト型の軽鎖定常領域の遺伝子の配列は当技術分野で良く知られており（例えばカバット（Ｋａｂａｔ）、Ｅ．Ａ．ら、免疫学的関心の蛋白質配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、米国保健福祉省（ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、ＮＩＨ出版物Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１））、またこのような領域を含むＤＮＡ断片は、標準のＰＣＲ増幅により入手できる。軽鎖定常領域は、例えばκまたはλ定常領域であるが、より好ましいのはκ定常領域である。好適な実施形態では、軽鎖定常領域は図１０に示される定常領域に類似しているかまたはそれと同一である。
【０１２４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作成するには、ＶＨおよびＶＬ配列が隣接する一本鎖蛋白質として発現し、ＶＬおよびＶＨがそのフレキシブルリンカーで連結される様な状態で（例えば、全て参照として本出願に編入されている、ハストン（Ｈｕｓｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９−５８８３（１９８８）、およびマッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、３４８、５５２−５５４（１９９０）参照）、ＶＨおよびＶＬをコード化するＤＮＡ断片が、フレキシブルリンカーをコード化（例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコード化）する別の断片に操作可能な状態で連結される。
【０１２５】
抗体または抗体の断片を発現させるには、その遺伝子が転写および翻訳調節配列に操作可能な状態で連結されるように、部分的または全長の軽鎖および重鎖をコード化する（例えば上述の方法で得られる）ＤＮＡが発現ベクターに挿入される。ここで「操作可能な状態で連結」という用語は、ベクター内の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節できるように、つまりその本来の機能を発揮できるようなやり方で、抗体遺伝子をベクターに連結する事を意味する。発現ベクターおよび発現調節配列は、通常使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子と抗体重鎖遺伝子を別々のベクターに挿入することができるが、より一般的には両方とも同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は標準的な方法を使って発現ベクターに挿入してもよい（例えば抗体遺伝子断片への相補的制限部位の連結、あるいは制限部位がない場合は平滑末端連結）。軽鎖または重鎖配列を挿入する以前に、発現ベクターは既に抗体定常領域を含んでいる場合がある。例えば、ＶＨおよびＶＬ配列を全長の抗体遺伝子に変える一つの方法は、Ｈ部分がベクター内でＣＨ部分と操作可能な状態で連結し、ＶＬ部分がベクター内でＣＬ部分と操作可能な状態で連結するように、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコード化している発現ベクターにそれぞれを挿入する事である。代替的または追加的に、組み換え発現ベクターが、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナル・ペプチドをコード化することもできる。シグナル・ペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレーム単位で連結するように、抗体鎖の遺伝子をベクターにクローン化することができる。当該シグナル・ペプチドは免疫グロブリン・シグナル・ペプチドであってもよいし、異種のシグナル・ペプチド（すなわち非免疫グロブリン蛋白由来のシグナル・ペプチド）であってもよい。
【０１２６】
抗体鎖遺伝子に加え、本発明の組み換え・発現ベクターは、宿主細胞内で抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を含んでいてもよい。この「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサーおよび抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するその他の発現調節要素（例えばポリアデニレーション・シグナル）を含むことを意図している。このような調節配列は、例えば、参照として本出願に編入されているゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）、遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８５（１９９０）、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）に記載されている。調節配列の選択を含んだ発現ベクターのデザインが、形質転換される宿主細胞、目的の蛋白質の発現レベルなどの要因に依存している事が、当技術分野に精通した技術者により評価される。哺乳類の宿主細胞発現にとって好ましい調節配列には、哺乳類の細胞で蛋白質の発現を高レベルで方向付けするウィルス要素、例えばサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶプロモーター／エンハンサーなど）、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）（ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーなど）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオマウィルスなどのプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。ウィルスの調節要素およびその配列に関する詳細は、全て参照として本出願に編入されているスティンスキ（Ｓｔｉｎｓｋｉ）による米国特許番号５，１６８，０６２、クーセンス（Ｃｏｕｓｅｎｓ）などによる米国特許番号４，５１０，２４５およびコジンスキー（Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉ）による米国特許番号４，９６８，６１５を参照のこと。
【０１２７】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加え、本発明の組み換え・発現ベクターは、宿主細胞（例えば複製源）でベクターの複製を調節する配列や選択可能マーカー遺伝子などの配列を含んでいてもよい。選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターを導入する宿主細胞の選択を容易にする（例えばアクセル（Ａｘｅｌ）らによる米国特許番号４，３９９，２１６、４，６３４．６６５および５，１７９，０１７を参照）。例えば、選択可能なマーカー遺伝子は、典型的に、ベクターが導入された宿主細胞上で、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキセートなどの医薬品への抵抗力を付与する。好ましい選択可能マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択・増幅と共にｄｈｆｒ宿主細胞で使用）およびネオマイシン遺伝子（Ｇ４１８選択）を含んでいる。
【０１２８】
軽鎖および重鎖の発現に関しては、重鎖および軽鎖をコード化する発現ベクターを標準技術を使って宿主細胞に形質移入してもよい。「形質移入」という用語の様々な形態は、原核生物や真核生物の宿主細胞に外因性のＤＮＡを導入するのに一般に使用される多種多様な技術、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン形質移入などを含むことを意図している。
【０１２９】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子を発現させるのに使用される発現ベクターは、レトロウィルス・ベクターなどのウィルス・ベクターである。このようなウィルス・ベクターを、安定して形質導入された細胞株の生成に利用してもよい（例えばＣＤ２０結合分子の継続提供源）。ある実施形態では、ＣＤ２０結合分子（およびＣＤ２０結合分子を発現する安定した細胞株）を生成するために、ＧＰＥＸ遺伝子生成物発現技術（ガラ・デザイン・インク（Ｇａｌａ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州ミドルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ、ＷＩ））を利用する。特定の実施形態では、ブレック（Ｂｌｅｃｋ）による、ＷＯ０２０２７８３およびＷＯ０２０２７３８（いずれも参照として全て本出願に編入されている）に記載の発現技術が利用される。
【０１３０】
本発明の組み換え抗体を発現させる哺乳類の好ましい宿主細胞には、例えばＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（クルセル社（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、オランダ）、チャイニーズハムスターの子宮（ＣＨＯ細胞）（ウアラウプ（Ｕｒｌａｕｂ）およびチェイシン（Ｃｈａｓｉｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７、４２１６−４２２０（１９８０）に記載され、例えばＲ．Ｊ．カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）およびＰ．Ａ．シャープ（Ｓｈａｒｐ）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９、６０１−６２１（１９８２）に記載のごとくＤＨＦＲ選択可能マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＳＰ２細胞などが含まれる。他の好適な実施形態では、両方とも参照として本出願に編入されているＷＯ９９５４３４２および米国特許出願公告２００３０００３０９７に記載されているように、発現したＣＤ２０結合分子がＡＤＣＣ活性を向上させるような形で、宿主細胞がＧｎＴ ＩＩＩを発現する。抗体の遺伝子をコード化している組み換え・発現ベクターを哺乳類の宿主細胞に導入する場合、抗体は通常、宿主細胞内で抗体の発現に必要な期間宿主細胞を培養することにより、あるいはさらに好ましくは、宿主細胞を培養する培地に抗体を分泌させるにより生成される。抗体は、標準的な蛋白質精製方法を使って培地から回収される。
【０１３１】
また、Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ分子など無傷の抗体の一部を生産するために宿主細胞を利用することもできる。上述の方法の変形体も本発明の範囲内にあることが理解されている。例えば、本発明の抗体の軽鎖または重鎖のいずれかをコード化するＤＮＡを宿主細胞に形質移入することが望ましい。また、ｈＣＤ２０との結合に必要でない軽鎖および／または重鎖をコード化するＤＮＡの一部または全部を除去するために、組み換えＤＮＡ技術を使ってもよい。このような切断ＤＮＡ分子から発現した分子もまた本発明の抗体に含まれる。さらに、一つの重鎖と一つの軽鎖が本発明の抗体であり、もう一つの重鎖および軽鎖がｈＣＤ２０以外の抗原に特異的であるような二機能抗体を生産してもよい（例えば標準的な化学架橋結合技術を使って、本発明の抗体を第２の抗体に架橋結合させる）。
【０１３２】
抗体またはその断片の組み換え・発現にとって好ましいシステムの一つにおいて、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコード化する組み換え・発現べクターが、リン酸カルシウム媒介の形質移入により、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入される。組み換え・発現べクター内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子はそれぞれエンハンサー・プロモーター調節要素（例えばＣＭＶエンハンサー・ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素やＳＶ４０エンハンサー・ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素などの、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウィルスから派生し多要素）と操作可能な状態で連結し、遺伝子の転写レベルを高めている。組み換え・発現べクターはまたＨＦＲ遺伝子を含むこともあり、この遺伝子は、メトトレキセートの選択・増幅を利用して、ベクターが形質移入されたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換宿主細胞は、抗体重鎖および軽鎖の発現のために培養され、当該培地から無傷の抗体が回収される。組み換え・発現べクターの生成、宿主細胞への形質移入、形質転換体の選択、宿主細胞の培養および培地からの抗体の回収のため、分子生物学の標準技術が使用される。
【０１３３】
ある実施形態では、本発明の抗体および抗体の断片が遺伝子導入動物中で生成される。例えば、遺伝子導入羊や雌牛を使って、そのミルクの中に抗体または抗体の断片を生成することもできる（例えば、参照として本出願に編入されているポラック（Ｐｏｌｌｏｃｋ）ＤＰら、組み換え抗体生産の一方法である遺伝子導入ミルク、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１、１４７−１５７（１９９９）参照）。本発明の抗体または抗体の断片を植物中で生成してもよい（例えば参照として本出願に編入されているラリック（Ｌａｒｒｉｃｋ）ら、植物を使ったＩｇＡ分泌抗体の生産、Ｂｉｏｍｏｌ．Ｅｎｇ．、１８、８７−９４（２００１）参照）。これ以外の方法や精製プロトコルは、参照として本出願に編入されているハンフリーズ（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ）ら、治療用抗体生産技術：分子応用、発現および精製、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．、４、１７２−１８５（２００１）に記載されている。ある実施形態では、本発明の抗体または抗体の断片は遺伝子導入されたニワトリにより生成される（例えば、両方とも本出願に組み込まれている米国特許出願公告２００２０１０８１３２および２００２００２８４８８を参照）。
【０１３４】
ＩＩＩ．治療用調剤および使用
本発明のＣＤ２０結合分子（例えば抗体および抗体の断片）は疾病に罹った被験者を治療するのに有効である。ＣＤ２０結合分子はまた診断にも使用される（例えば標識付きＣＤ２０結合分子を組織の画像化に使用）。好適な実施形態では、ＣＤ２０結合分子はＢ細胞の増殖が無限に継続することを特徴とするＢ細胞リンパ腫の患者に投与される。
【０１３５】
ある実施形態では、診断および治療目的で、ＣＤ２０結合分子が種々の放射標識物質と結合される。放射標識物質は腫瘍および他の組織の「画像化」を可能にし、腫瘍の放射線治療に役立つ。典型的放射標識物質には、これだけに限定されるものではないが、例えば１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、９９Ｔｃ、６７Ｇａ、１１１Ｉｎ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅなどがあり、好ましくは９０Ｙである。
【０１３６】
ある実施形態で治療された疾病は非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）である。ある実施形態では疾病は、再発ホジキンス病、悪性度の高い抵抗性ホジキンス病、低悪性度および中悪性度の非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞慢性リンパ球白血病（Ｂ−ＣＬＬ）、リンパ形質細胞性悪性リンパ腫（ＬＰＬ）、被膜細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、瀰漫性大細胞リンパ腫（ＤＬＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、エイズ関連リンパ腫、単球性Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性リンパ節症、小リンパ球型、濾胞性瀰漫性大細胞型、彌慢性小開裂細胞型、大細胞免疫芽球性リンパ腫、小非開裂型、バーキットおよび非バーキット型、濾胞性大細胞型、濾胞性小開裂細胞型、濾胞性小開裂・大細胞混合型リンパ腫、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から選択される。特定の実施形態では、治療される疾病はヴァルデンストローム・マクログロブリン血症（ＷＭ）または慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）である。
【０１３７】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子はＣＤ２０＋細胞の枯渇が治療面で有益である場合に、例えば、ヴァルデンストローム・マクログロブリン血症、多発性骨髄腫、プラズマ細胞悪液質、慢性リンパ球白血病、移植組織の処置、ヘアリー・セル白血病、ＩＴＰ、幹細胞移植後のエプスタイン・バー・ウィルス・リンパ腫、腎臓移植などの疾病の治療に使用される。本出願に編入されている米国特許出願公告２００２０１２８４４８を参照のこと。別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、骨髄腫、自己免疫疾患、移植、移植片対宿主病、Ｂ細胞に関係する感染症およびリンパ球増殖病から成るグループから選択された疾病の治療、およびＢ細胞活性および／または体液性免疫の抑制が望まれる疾病や症状の治療に使用される。ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、Ｂ細胞リンパ腫、白血病、骨髄腫、移植、移植片対宿主病、自己免疫疾患、リンパ球増殖症状から成るグループから選択された疾病の治療、あるいは体液性免疫、Ｂ細胞機能および／または増殖の阻害が治療面で有益である疾病や症状の治療に使用される。さらに別の実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、Ｂ−ＡＬＬ、ヘアリー・セル白血病、多発性骨髄腫、リクター症候群、獲得第ＶＩＩＩ因子阻害遺伝子、抗リン脂質症候群、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少症、水疱性類天疱瘡、寒冷赤血球凝集素病、エバンス症候群、グッドパスチャー症候群、特発性膜性腎症、特発性血小板減少紫斑病、ＩｇＭ関連多発性神経障害、カポージ肉腫関連ヘルペスウィルス（ＫＳＨＶ）関連多中心型キャッスルマン病（ＭＣＤ）、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、赤芽球癆、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、全身性免疫複合体脈管炎、全身性エリテマトーデス、ＩＩ型混合寒冷グロブリン症、ウェジナー肉芽腫、同種異系移植片拒絶および移植後リンパ球増殖病の治療、または骨髄移植のための幹細胞の浄化のために使用される。
【０１３８】
好適な実施形態では、治療される被験者は免疫不全ではない（例えばＳＬＥ患者）。いかなるメカニズムにも制限されることなく、本発明のＣＤ２０結合分子は、これまで知られている抗ＣＤ２０抗体と比べ、特に非免疫抑制患者において、ＨＡＣＡ反応を引き出す可能性が少ないと考えられている。従って、有害なＨＡＣＡ反応の心配をしないで非免疫抑制患者を治療することができる。また、本発明のＣＤ２０結合分子の結合能力は改善されているため、患者に低用量を投与してもよいし（ＨＡＣＡ反応の危険性をさらに回避）、あるいは生死に関わるＨＡＣＡ反応の危険性なしに高用量を投与することもできる。別の好適な実施形態では、被験者は慢性関節リウマチまたはその他の自己免疫疾患に罹っている（例えば、本出願に編入されたエドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、リウマチ病学（Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ）（オックスフォード）２００１年２月；４０（２）：２０５−１１を参照）。
【０１３９】
本発明のＣＤ２０結合分子を、他の治療用の物質と共に投与してもよい。例えば、ＣＤ２０結合分子を化学療法プログラムの一環として投与してもよい（例えばＣＨＯＰ）。またＣＤ２０結合分子を、サイトカイン、Ｇ−ＣＳＦまたはＩＬ−２と共に投与してもよい（本出願に編入されている米国特許６，４５５，０４３を参照）。
【０１４０】
本発明のＣＤ２０結合分子は、例えば非経口、経口、皮下、局所、腹腔内、肺内、鼻腔内、病変内投与（例えば局部免疫抑制治療）などを含む、いかなる方法で投与してもよい。非経口注入には、これだけに限定されるものではないが、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下投与などが含まれる。さらに、ＣＤ２０結合分子は、特に低用量で、パルス注入によって投与してもよい。投与が短期的なものであるか長期的なものであるかにある程度基づき、投与は注射により、あるいは最も好ましくは静脈内または皮下注射によって行なわれる。
【０１４１】
投与計画は、最も望ましい反応（例えば治療面または予防面の反応）が得られるように調整される。例えば、ボーラスを単回投与しても、時間をかけ数回に分けて投与してもよいし、あるいは治療状態の必要にあわせて投与量を増やしたり減らしたりしてもよい。非経口組成物を用量単位形式で調剤すると、投与も容易となり、用量の均一性も保たれて有利である。本発明のＣＤ２０結合分子の用量は通常、（ａ）活性成分の独自の性質および目的としている治療的または予防的効果、および（ｂ）個人の感受性の治療のためにこのような活性成分を合成する技術に固有の限界によって決定される。
【０１４２】
抗体または抗体の断片（または本発明の他のＣＤ２０結合分子）の治療的または予防的有効量の、典型的で被限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。ある実施形態では、当該用量は５０〜６００ｍｇ／ｍ２（例えば３７５ｍｇ／ｍ２）である。緩和される症状のタイプおよび重篤度により投与量が変化することに注意しなくてはならない。またさらに、どのような被験者についてもその人のニーズ、そして組成物を投与したり投与を監督する人の専門家としての判断に従って、時が経つと共に用量を調整すべきであること、また本出願に説明されている用量の範囲は単に例示であり、本発明を制限するものではない点にも注意しなくてはならない。
【０１４３】
投与量は勿論、特定の薬の薬物動態学的な特徴、投与方法および経路、被投与者の年齢、健康状態、そして体重、症状の性質および重篤度、併用療法の種類、治療の頻度、目的とする効果などの既知の要因により変化する。例えば、活性成分の１日の投与量は体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇから１００ｍｇである。通常、１日に体重１ｋｇ当たり１．０ｍｇから５ｍｇ、好ましくは１ｍｇから１０ｍｇを１から６回に分けるか、持続放出形式で投与する方が、希望する結果を得るのに有効な場合がある。
【０１４４】
本発明のＣＤ２０結合分子、被験者への投与に適した薬剤組成物に組み込むこともできる。例えば薬剤組成物は、ＣＤ２０結合分子（例えば抗体または抗体の断片）および製薬的に容認できる担体を含んでいてもよい。本出願で使用される「製薬的に容認できる担体」という用語には、生理学的適合性のある、溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌薬、等張性薬剤、吸収遅延薬などが含まれる。製薬的に容認できる担体には、次の物質の一つまたはそれ以上が含まれる。水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組み合わせ。多くの場合、組成物の中に砂糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどのなどの等張性薬剤が含まれることが望ましい。製薬的に容認できる担体にはさらに、ＣＤ２０結合分子の貯蔵寿命または効果を向上させる、加湿薬、乳化剤、保存剤、緩衝液などの補助物質が少量含まれることもある。
【０１４５】
本発明の組成物は様々な形態で存在する。これらには、例えば溶液（例えば注射および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、小丸剤、粉末、リポソームおよび座薬などの、液体、半固体および固体の投薬形態が含まれる。好ましい形態は、投与方法および治療アプリケーションの内容に基づいて決められる。通常好まれる組成物は、例えば他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物のような、注射および注入可能な溶液である。
【０１４６】
治療用の組成物は通常、製造および貯蔵条件下で無菌でありしかも安定している。組成物は溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、あるいはその他の高濃度の薬剤に適した秩序形態に調剤することができる。注射可能な無菌溶液は、要求量の活性化合物（つまり抗体または抗体の断片）を上述の成分またはその組み合わせと一緒に適切な溶媒に組み入れ、要求に応じて、その後無菌濾過する事により生成できる。一般に分散液は、分散媒体や上述の必要成分を含む無菌溶剤に活性化合物を組み入れる事により生成される。注射可能な無菌溶液の生成に使用される無菌粉末の好ましい生成方法は、活性成分に加え以前に無菌濾過された溶液から得られる追加的な望ましい成分の粉末を生成する、真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合は粒子の規定のサイズの保持、また表面活性剤の使用により維持される。注射可能な組成物の持続的吸収は、組成物の中にモノステアリン酸塩やゼラチンなどの吸収を遅らせる物質を含める事により達成できる。
【０１４７】
ある実施形態では、当該活性化合物は、インプラント、経皮パッチ、マイクロカプセル化された送達システムを含む放出制御製剤のような、化合物の急速な放出を防ぐ担体を使用して生成される。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などの生物分解性、生体適合性のポリマーを使用することができる。このような調剤の調製方法の多くは特許を受けており、当業者には一般的に知られている（例えば、持続的および放出調節医薬品送達システム、Ｊ．Ｒ．ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）版、マルセル・デッカー・インク（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク、１９７８を参照）。
【０１４８】
ある実施形態では、本発明のＣＤ２０結合分子は、例えば不活性の希釈剤や同化可能な食用の担体などと共に経口投与される。当該化合物（および必要ならば他の成分）はまた、硬質または軟質のゼラチン・カプセルに被包化されたり、錠剤に圧縮されたり、あるいは直接被験者の食事に混入されることもある。治療用経口投与の場合、当該化合物は賦形剤と共に組み入れられ、服用可能な錠剤、頬錠剤、トローチ剤、カプセル、エリクシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用される。非経口投与以外の方法で本発明の化合物を投与するため、不活性化を防止する物質と共に投与する、あるいはそのような物質でコーティングする必要があるかもしれない。
【０１４９】
本発明の薬剤組成物には、本発明の抗体または抗体断片の「治療面での有効量」または「予防面での有効量」が含まれる。「治療面での有効量」とは、用量および期間の点で、好ましい治療結果を得るための有効量を意味する。抗体または抗体断片の治療面での有効量は、個人の疾病の状態、年齢、性別および体重、好ましい反応を引き出す抗体または抗体断片の効果などの要因により異なる。さらに治療面での有効量とは、治療効果が抗体または抗体断片の毒性または有害作用を凌駕する量でもある。「予防面での有効量」とは、用量および期間の点で、好ましい予防結果を得るための有効量を意味する。一般に、予防用の用量は疾病に罹る前または疾病の初期に被験者に使用されるため、予防面での有効量は通常治療面での有効量より少ない。
【０１５０】
ＩＶ．ＣＤ２０結合分子の他の使用方法
本発明のＣＤ２０結合分子、例えば抗ＣＤ２０ペプチドおよび／または抗体は、サンプル中またはＣＤ２０を含むＢ細胞中のＣＤ２０を検出または定量する免疫測定に有効である。ＣＤ２０の免疫測定には通常、検出可能な標識付けのされた高親和性の抗ＣＤ２０ペプチドおよび／または選択的にＣＤ２０に結合することのできる本発明の抗体の存在下における成体サンプルの培養、およびサンプル中で結合した標識のついたペプチドあるいは抗体の検出が含まれる。種々の臨床分析方法は当技術分野で知られている。
【０１５１】
従って、抗ＣＤ２０ペプチドまたは抗体を、ニトロセルロースまたは溶解性の蛋白質を固定できる他の固体支持体上で捕獲することが可能である。次にＣＤ２０を含むサンプルを支持体に加え、その後適切な緩衝液を使って洗浄して結合しなかった蛋白質を除去する。二番目の検出可能な標識付けをされたＣＤ２０特異的なペプチドまたは抗体をその固体相支持体に加え、さらに緩衝液で再び洗浄して検出可能な標識付けをされた結合しなかったペプチドまたは抗体を除去する。固体支持体に結合した標識化合物の量は既知の方法を使って検出できる。
【０１５２】
「固体相支持体」または「担体」とは、ペプチド、抗原または抗体に結合できるあらゆる支持体を意味する。よく知られている支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および修飾したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱などが含まれる。本発明の目的では、担体はある程度溶解性であってもよいし、不溶性であってもよい。支持体の物質は、結合した分子がＣＤ２０との結合能力を維持できる限り、実質的にどのような構造体であってもよい。従って、支持体の構造は、ビーズのように球体であってもよいし、試験管の内面または棒の外面のような円筒状であってもよい。あるいは表面は、プレート、培養皿、試験用細片、マイクロタイター用プレートなどのように平たいものであってもよい。好ましい支持体にはポリスチレン・ビーズが含まれる。当業者は、抗体、ペプチド、または抗原と結合する適切な担体をその他にも数多く知っており、通常の実験を通してそれを確認することができる。抗ＣＤ２０ペプチドおよび／または抗体の結合活性を測定するのに、既知の方法を使用することができる。当業者は、通常の実験を通して、実施可能で最適な分析条件を決定することができる。
【０１５３】
ＣＤ２０特異的なペプチドおよび／または抗体のＣＤ２０結合分子の検出可能な標識化は、酵素免疫測定（ＥＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で使用される酵素との結合により達成できる。結合した酵素は露呈した基質と反応して、例えば分光光度計、蛍光光度計、あるいは可視的に検出することのできる化学物質を生産する。本発明のＣＤ２０結合分子の検出可能な標識化に使用される酵素には、これだけに限定されるものではないが、例えばリンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌核酸分解酵素、δ−５−ステロイド異性化酵素、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸異性化酵素、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＲＮＡ分解酵素、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが含まれる。
【０１５４】
ＣＤ２０結合分子を放射活性物質で標識化する事により、放射性免疫検定法（ＲＩＡ）を使用してＣＤ２０を検出することが可能となる（例えばワーク（Ｗｏｒｋ）ら、分子生物学に於ける実験技術および生化学（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（１９７８）、ノース・ホランド出版社（Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）、ニューヨークを参照）。放射性同位元素は、ガンマ計数器、シンチレーション計数器、オートラジオグラフィなどを使用した方法で検出される。
【０１５５】
ＣＤ２０結合分子を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識分子が適切な波長の光に晒されると、蛍光性の故にその存在が検出できる。最も一般的に使用される蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、フルオレスカミンなどである。
【０１５６】
１２５Ｅｕや他のランタニド系列の蛍光放射金属を使ってＣＤ２０結合分子に検出可能な標識付けをすることもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）やエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート化グループを使ってＣＤ２０結合分子に結合される。
【０１５７】
また、ケミルミネセンス化合物と結合させる事によりＣＤ２０結合分子に検出可能な標識付けをすることもできる。ケミルミネセンス標識分子の存在は次に、化学反応中に生じる発光の存在を検出する事により決定される。特に有効なケミルミネセンス標識化合物の例には、例えばルミノール、イソルミノール、テロマチック・アクリジニウム・エステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステルなどがある。
【０１５８】
同様に、生物発光性の化合物を本発明のＣＤ２０結合分子の標識に使用することができる。生物発光とは、触媒タンパク質が化学発光の反応効率を増加させる生物システム内に見られる一種の化学発光である。生物発光性のタンパク質の存在は、発光の存在を検出する事により決定される。標識に使用される重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０１５９】
ＣＤ２０結合分子の検出は、例えば検出可能な標識が放射性ガンマエミッターの場合はシンチレーション計数器、例えば標識が蛍光物質の場合は蛍光光度計により達成できる。酵素標識の場合、検出は酵素基質を利用した比色法によって行なわれる。基質の酵素反応の程度を同様に生成した標準物質と目視で比較する事によっても検出を行なうことも可能である。
【０１６０】
本発明のある実施形態では、上述の分析で検出されるＣＤ２０は生物サンプルの中に存在することができる。ＣＤ２０を含むあらゆるサンプルが使用可能である。サンプルは例えば、血液、血清、リンパ、尿、脳脊髄液、羊水、滑液、組織エキス、ホモジェネートなどの生物液体であることが望ましい。しかし、当技術分野における通常の技術を有した技術者であれば、他のサンプルの使用を可能とする適切な条件を決定することができるため、当発明はこれらのサンプルのみを使用する分析に限定されるものではない。
【０１６１】
患者から組織学的標本を採取し、本発明の標識ＣＤ２０結合分子をその標本と組み合わせる事により現場（ｉｎ ｓｉｔｕ）検出を達成することができる。生物サンプルに適合またはその上に重ね合わせることにより標識ＣＤ２０結合分子を提供することが望ましい。そのような方法を使うことにより、ＣＤ２０の存在だけでなく、試験される組織の中のＣＤ２０の分布をも決定することができる。本発明を利用し、当業者は、現場検出を達成するために、多様な（染色方法などの）組織学的方法のいずれもが修正可能であることを理解する。
【０１６２】
「ｔｗｏ−ｓｉｔｅ」または「サンドイッチ」分析としても知られる免疫測定法において利用できるように本発明のＣＤ２０結合分子を調整することができる。通常の免疫測定法では、無標識のＣＤ２０結合分子（抗ＣＤ２０抗体など）の適量を試験液体に不溶性の固体支持体に結合させ、それに検出可能な方法で標識した可溶性の抗体を適量加え、固体相の抗体、抗原と標識抗体の間に形成される三成分複合体を検出および／または定量する。
【０１６３】
通常のそして好ましい免疫測定法には、固体相に結合したＣＤ２０結合分子（例えば抗体）をまず試験サンプルと接触させ、二成分の固体相抗体ＣＤ２０複合体を形成してサンプルからＣＤ２０を抽出する、「順向」分析が含まれる。適切な培養期間の後、固体支持体を洗浄して、存在していれば未反応のＣＤ２０も含み、液体サンプルの残渣を除去する。次に既知の量の標識抗体（「レポーター分子」として機能）を含む溶液と接触させる。二度目の培養期間により無標識の抗体を通して固体支持体に結合したＣＤ２０と標識抗体との間で複合体を形成させた後、個体支持体をもう一度洗浄し、未反応の標識抗体を除去する。このタイプの順向サンドイッチ分析は、ＣＤ２０の存在を決定する単純な「イエス・ノー」型の分析であってもよいが、既知の量のＣＤ２０を含む標準サンプルと標識抗体の測定値を比較する事による定量とすることも可能である。
【０１６４】
ＣＤ２０にとって有効な別のタイプの「サンドイッチ」分析は、いわゆる「同時」または「逆行」分析である。同時分析には、固体支持体に結合した抗体と標識抗体を同時に試験サンプルに加える、一度の培養が含まれる。培養が終了した後、固体支持体を洗浄し、液体サンプルの残渣および複合体を形成しなかった標識抗体を除去する。固体支持体と結合した標識抗体の存在が、通常の「順向」サンドイッチ分析で行なわれるように決定される。「逆行」分析では、まず流動性サンプルに標識抗体溶液を加え、次に適切な培養期間の後固体サンプルに標識されていない抗体を加えるという、段階的な追加法が使用される。二回目の培養期間の後、固体相を従来の方法で洗浄し、試験サンプルの残渣と未反応標識抗体の溶液を除去する。次に、固体支持体に結合した標識抗体を「同時」および「順向」分析と同様の方法で決定する。
【０１６５】
ある実施形態では、固体支持体と結合した本発明のＣＤ２０結合分子を、流体、組織または細胞エキスからＣＤ２０（またはＣＤ２０を含むＢ細胞）を除去するために利用することができる。好適な実施形態では、これらは血液または血漿生成物からＣＤ２０を除去するために使用される。別の好適な実施形態では、当技術分野で知られている体外免疫吸着装置においてＣＤ２０結合分子が有効に使用される（例えば血液学セミナー（Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、２６（２ Ｓｕｐｐｌ．１）（１９８９）を参照）。患者の血液や他の体液を付着したＣＤ２０結合分子に接触させることで、循環しているＣＤ２０（遊離体または免疫複合体）を部分的あるいは完全に除去する結果となり、その後で流体が体に戻される。この免疫吸着法を、途中の細胞遠心分離段階の有無に関わらず、連続フロー処理において行なうことができる。例えばターマン（Ｔｅｒｍａｎ）ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７、１９７１−１９７５（１９７６）を参照。
【実施例】
【０１６６】
以下の実施例は、いくつかの好適な実施形態と本発明のいろいろな側面を証明し、さらに詳しく説明する目的で提供されるものであり、決して本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【０１６７】
以下に開示される実験では、次のような略語が使用される：Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、ｎＭ（ナノモル）、ｐＭ（ピコモル）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、ｍｌ（ミリリットル）、μｌ（マイクロリットル）、℃（摂氏）、ＯＤ（光学密度）、ｎｍ（ナノメーター）、ＢＳＡ（ウシの血清アルブミン）およびＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）。
【０１６８】
＜実施例１＞ ＣＤ２０結合分子
この実施例はいくつかのＣＤ２０結合分子の作成方法を説明する。特にこの実施例は、１１の異なるＣＤ２０結合分子（ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５およびＡＭＥ ５）の作成方法、および例えばＦａｂや完全なＩｇＧとして発現させる方法を説明する。
【０１６９】
１１の異なるＣＤ２０結合分子の軽鎖および重鎖可変領域は以下のようにして構成される。各ＣＤ２０結合分子の六つのＣＤＲのコレクションが表３に示してある。アミノ酸配列の配列番号が最初に、核酸配列の配列番号が次に示してある。
表３ 典型的なＣＤ２０結合分子における軽鎖および重鎖ＣＤＲ
【表３】
【０１７０】
可変領域（例えばＦｖｓとして発現する場合もある）を作成するため、表３のＣＤＲが、ヒトの生殖細胞系フレームワークなどのあらゆるフレームワークと組み合わせられる。例えば、本実施例で名前のつけられている１１の抗ＣＤ２０分子の可変領域を作成するため、表４に示される方法で、表３のＣＤＲがヒトの生殖細胞系フレームワークと組み合わせられた。
表４ 名前のついたＣＤ２０結合分子の生産に使用されるヒトの生殖細胞系フレームライン
【表４】
【０１７１】
１１のＣＤ２０結合分子のうちの二つに関して、完全な軽鎖および重鎖可変領域の配列が図２−３および６−7に示してある。特に図２および３は、ＡＭＥ３３の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を示している（両方でＡＭＥ３３の完全Ｆｖ配列を提供）。図６および７は、ＡＭＥ５の軽鎖および重鎖可変領域のアミノ酸および核酸配列を示している。
【０１７２】
本実施例で説明している１１のＣＤ２０結合分子の軽鎖および重鎖可変領域を、軽鎖および重鎖定常領域と組み合わせ、Ｆａｂまたは完全な抗体（例えばＩｇＧ）として発現させてもよい。これらの配列は望ましくはリーダー配列と結合する（例えば軽鎖配列の最初のリーダー配列）。リーダー配列の一つの例はＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号１０５）である。他のリーダー配列を使用してもよい。又、ヒトの定常領域アロタイプであればどれでも使用して構わない。例えば、図１０および１１はＡＭＥ３３の完全な軽鎖および重鎖を示しており、これには軽鎖および重鎖の定常領域も含まれる。これらの図はまた、本実施例で指定された他のＣＤ２０結合分子のＦａｂおよびＩｇＧを作成するために使用された定常領域の出典ともなる。図１０Ａおよび１１Ａでは、定常領域には下線が引いてある。さらに本実施例の抗ＣＤ２０分子は、Ｆｃ領域のアミノ酸置換を例外として、図１０および１１に示している重鎖定常領域を選択的に使用してもよい。特に、図１１に示されている重鎖定常領域には、Ｄ２８０Ｈ突然変異またはＫ２９０Ｓ突然変異が含まれていてもよい（図１１Ａは突然変異のない２８０および２９０を太字で示してある）。図１１Ｂは太字で下線の付いた「ＧＡＣ」を示している。この「ＧＡＣ」を、Ｄ２８０Ｈ突然変異をコード化するため「ＣＡＴ」に代えてもよい。
【０１７３】
本実施例で抗ＣＤ２０結合分子を（ＦａｂまたはＩｇＧとして）発現させるため、当技術分野で周知の方法を使用してもよい。例えば、シングルベクターかダブルベクター・システムを使い、哺乳類発現システム（あるいは細菌、真菌、植物発現システム）の中で、本実施例の１１のＣＤ２０結合分子をＦａｂまたはＩｇＧとして発現させてもよい。シングルベクター・システムでは、発現に必要な全ての調節要素を含んでいる発現カセットの中で、重鎖と軽鎖の両方が製造またはクローン化される。ダブルベクター・システムは単に別々のプラスミドの中にこの二つの発現カセットを有している。当技術分野で周知のように、単一プラスミドまたはダブルベクター・システムの併用プラスミドをチャイニーズハムスターの子宮（ＣＨＯ）細胞、あるいは網膜細胞株ＰｅｒＣ６などの宿主細胞に形質移入し、選択、拡張および培養して、ＦａｂまたはＩｇＧ蛋白質を発現させてもよい（抗体発現および処理：米国化学会第２０７回全国大会、生化学技術部門主催シンポジウムより、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）［ＡＣＳシンポジウム・シリーズ、６０４］を参照）。
【０１７４】
Ｆａｂは哺乳類システムよりも時間も費用も少なくて済むことから、細菌の発現システムで発現させてもよい。ここで、ＦａｂをＭ１３ウイルス発現システムに挿入し発現させることができる。細菌が発現するＦａｂは、細菌の細胞壁と細胞膜の間の周辺細胞質空間に分泌・蓄積される。低張液ショックや凍結融解法など当技術分野において一般的である多くの技術を使って、Ｆａｂを周辺細胞質空間から放出させることができる。Ｆａｂは、パパインなどのプロテアーゼを使って蛋白質を分解し、無傷のＩｇＧからも生成される。分解産物のＦａｂ部分は、次に分解産物のＦｃ部分から精製される。ＦａｂおよびＩｇＧは、これもまた当技術分野では周知の種々のクロマトグラフィ技術や特異吸着技術を使って精製される（抗体：実験室手引書、エド・ハーロウ（Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ）（編集員）、デイビッド・レーン（Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ）（編集員）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）参照）。例えばＩｇＧは、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィ、そしてそれに続いてＭｏｎｏ Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィを使用した特異結合により、細胞の上清から容易に精製される。
【０１７５】
＜実施例２＞ 固定ラモス細胞ＥＬＩＳＡ
本実施例では、ＣＤ２０結合分子を使った固定ラモス細胞ＥＬＩＳＡ結合分析を説明する。本実施例では、ＦａｂおよびＩｇＧとして発現するＡＭＥ ４Ｈ５、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ３３およびＡＭＥ １Ｄ１０を検定し、全体的な結合、オフレートおよびオンレートを特に測定した。本実施例は、当社のＣ２Ｂ８ ｆａｂおよび全抗体、および比較のために市販のリツキサン（オンコロジー・サプライ社（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｓｕｐｐｌｙ Ｃｏ．））を同じ分析条件下で試験した。Ｃ２Ｂ８抗体は保管番号６９１１９でＡＴＣＣに保管されている。
【０１７６】
ラモス細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％加熱不活性の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ １６４０の中で成長させた。ラモス細胞５０μｌ（２〜４Ｘ１０６／ｍｌ）をＰｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎｅコートした９６ウェルのプレート（ＢＩＯＣＡＴべクトン・ディキンソン・ラブウェア（ＢＩＯＣＡＴ Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ））の各ウェルにピペットを使って注入し、３７℃、５％ ＣＯ２の条件下で１８時間培養した。培地は穏やかに吸引し、１００ｍｌの緩衝亜鉛ホルマリン水溶液（アナテク社（Ａｎａｔｅｃｈ，Ｌｔｄ．））を室温で１５分間各ウェルに添加した。Ｚ−ｆｉｘを除き、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。プレートをＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）で１時間ブロックした。ＦａｂまたはＩｇＧの希釈液を室温で１時間、固定およびブロック・ラモス細胞と一緒に培養した。プレートをＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、抗Ｈｉｓ６ペルオキシダーゼ・マウス・モノクローナル抗体（ロッシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））（１：５００希釈）５０ｍｌをウェルに加え、室温で１時間培養した。プレートを上述の方法で洗浄し、テトラメチルベンジジンで発色させ、反応は５ＮのＨ２ＳＯ４を使って停止した。プレート吸光度はＯＤ４５０ｎｍで読み取った。Ｆａｂおよび複合体の希釈には１％ＢＳＡ／ＰＢＳを使った。
【０１７７】
ＩｇＧ分析も同様にして行なったが、ＩｇＧ結合はヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰを使って検出した。抗体オフレートの比較では、ＦａｂまたはＩｇＧと共に培養した後、プレートをＰＢＳ／ＢＳＡ中で一夜培養してから、第二の抗体ステップに進んだ。抗体オンレートの比較では、Ｆａｂ／ＩｇＧ結合の培養期間も第二抗体ステップも５分であった。
【０１７８】
本実施例の結果は図１２および１３に示してある。図の通りＦａｂ ＡＭＥ ４Ｈ５、１５、１８、３３および１Ｄ１０の全体的な結合はＣ２Ｂ８ Ｆａｂよりも効果的である。ＡＭＥ抗体の用量応答曲線はＣ２Ｂ８抗体および市販のリツキサンと比べて左に移動しており、最大ＯＤもＣ２Ｂ８抗体の約１．５倍である。オフレートに関しては、ＡＭＥ ４Ｈ５、１５、１８、３３および１Ｄ１０のＦａｂはＣ２Ｂ８ Ｆａｂと比べて大幅に減少している（図１２Ｂ）。全ＩｇＧとして発現したＡＭＥ抗体のオフレートは、Ｃ２Ｂ８抗体および市販のリツキサンのそれと似ている（図１３Ａ）。オンレートに関しては、ＡＭＥ ４Ｈ５、１５、１８、３３および１Ｄ１０のＦａｂはＣ２Ｂ８ Ｆａｂのそれと似ており、結合が全体的に増大している（最大ＯＤが達成）（図１２Ｃ）。全ＩｇＧとして発現したＡＭＥ抗体の用量応答曲線は、全Ｃ２Ｂ８抗体の左へ移動している（図１３Ｂ）。
【０１７９】
＜実施例３＞ 免疫蛍光生体Ｂリンパ腫結合分析
本実施例は免疫蛍光生体Ｂリンパ腫結合分析を記述する。特に、以下に示すように、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５およびＣ２Ｂ８のＦａｂを分析した。
【０１８０】
ＣＤ２０ ＦＡＣＳ分析のためのＰＢＭＣのＦａｂ染色
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｓｉｇｍａ−１０７７）上で浮遊法により正常なヒトの血液から単離した。細胞を計数し、再びＰＢＳ＋１％ＢＳＡに懸濁して、２〜５Ｘ１０６細胞／ｍｌが得られた。１００μｌの希釈細胞をポリスチレン・チューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）＃２０５８）に入れ、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで希釈した抗ＣＤ２０ Ｆａｂ抗体を加えた。チューブを室温で１時間培養した。ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ４ｍｌを各チューブに加え、３００ＸＧで１０分遠心分離した。上清を除き、細胞を再びＰＢＳ１００μｌ＋１％ＢＳＡに懸濁した。Ａｎｔｉ−Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８複合体（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）＃３５３１０）をチューブ当たり２μｌずつ加え、混合し、室温、暗室で、１時間培養した。サンプルを前出の方法で洗浄した。上清を除き、細胞を再びＰＢＳ＋１％ＢＳＡ＋２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウムに懸濁した。蛍光性をＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳｃａｎまたはＦＡＣＳｏｒｔフローサイトメーターで分析し、データをＣｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ））またはＷｉｎＭＤＩソフトを使って解析した。
【０１８１】
結果は図１４に示してある。Ｄａｕｄｉ細胞の結果は図１４Ａ、Ｗｉ１２−Ｓ細胞の結果は図１４Ｂ、そしてラモス細胞の結果は図１４Ｃに示してある。図に示されているように、ＡＭＥ５および３３のＦａｂは、生体Ｂリンパ腫細胞腫との結合の面でＣ２Ｂ８よりも有効である。ＡＭＥ５およびＡＭＥ３３の用量応答曲線はＣ２Ｂ８と比べて左に移動している。
【０１８２】
＜実施例４＞ ＫｉｎＥｘＡ測定によるＩｇＧ結合
本実施例は、種々のＣＤ２０ ＩｇＧのＫｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆを測定するための分析を記述する。特に本分析は、ＳＫＷ６．４ Ｂリンパ腫細胞との結合の面で、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５、ＡＭＥ ６Ｆ１およびＣ２Ｂ８抗体を試験し、ＫｉｎＥｘａ平衡ソフトを使ってこのような分子のＫｄ、ＫｏｎおよびＫｏｆｆを測定した。さらに、ＡＭＥ ３３およびＣ２Ｂ８については、原発性ヒト末梢血Ｂ細胞との結合を試験した。
【０１８３】
Ｋｄ測定：
ＳＫＷ６．４細胞を１０％ＦＣＳ添加のＤＭＥＭ培地で成長させ、５〜１０Ｘ１０５細胞／ｍｌで収穫した。細胞を５容積のＰＢＳで洗浄し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再び懸濁した（１Ｘ１０８細胞／ｍｌ）。ヒト末梢血Ｂ細胞は、新鮮なＣＤ１９選別Ｂ細胞をオールセルズ社（Ａｌｌｃｅｌｌｓ）から入手した。細胞を１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２度洗浄し、濃度８Ｘ１０７／ｍｌで再び懸濁した。
【０１８４】
３倍連続希釈を１２回行い、各希釈液１００μｌを９６ウェルのプレートに加えた。各希釈液に抗体１００ｍｌを加え（１００ｎｇ／ｍｌ）、プレートを３７℃、５％ＣＯ２の条件下で４時間培養した。サンプルは９６ウェル１μフィルター（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で濾過し、細胞および結合抗体を除いた。溶液の中の遊離抗体をＥＬＩＳＡを使って定量した。簡単にいうと、遊離ＩｇＧを１ｍｇ／ｍｌの抗ヒトκ抗体（サザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））でコートした９６ウェルのプレートで捕獲し、ＨＲＰと結合した抗ヒトＦｃ抗体（サザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））を使ってそれを検出した。プレートはＦａｓｔ ＴＭＢ基質（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））を使って発色させ、４５０ｎｍで読み取った。
【０１８５】
つぎに、未知の抗原濃度を被験者にＫｉｎＥｘＡ平衡ソフトを使って抗体のＫｄを測定した。各連続希釈液のＯＤ４５０値は、推定抗原濃度および実際の抗体濃度と一致した。Ｋｄおよび実際の抗原濃度を計算した。ＳＫＷ６．４細胞分析の結果は表５に示してある。結果は、ＡＭＥ ３３およびＡＭＥ ５のＫｄがＣ２Ｂ８抗体と比べて１０倍向上している事を示している。原発性ヒト末梢血Ｂ細胞の結果は、ＡＭＥ ３３のＫｄが１１３ｐＭ、そしてＣ２Ｂ８のＫｄが１５００ｐＭである事を示している。ここでもＡＭＥ ３３のＫｄがＣ２Ｂ８抗体のＫｄの１０倍以上（ほぼ１５倍）である事が示されている。
表５
【表５】
【０１８６】
反応速度測定：
ＳＫＷ６．４細胞を１０％のＦＣＳを添加したＤＭＥＭ培地で成長させ、５〜１０Ｘ１０５細胞／ｍｌで収穫した。細胞を５容量のＰＢＳで洗浄し、１％のＢＳＡを含むＰＢＳに再び懸濁（約ｌＸ１０７細胞／ｍｌ）し、３７℃の水浴に維持した。同容積の抗体（１％ＢＳＡを含むＰＢＳに１００ｎｇ／ｍｌ）を３７℃で加え、実験の計時が開始された。６０秒から１０８００秒の間隔で抗体細胞溶液のサンプルを採取し、濾過し、細胞と結合抗体を除去した。残っている遊離抗体を各時間単位に上述のＥＬＩＳＡを使って定量した。
【０１８７】
抗体細胞の反応速度は、直接反応速度ＫｉｎＥｘＡソフトを使って計算した。各時間でのＯＤ４５０値は、以前計算したＫｄ、抗原濃度、反応の計算値ＫｏｎおよびＫｏｆｆを使って調整した。結果は表５に示してある。
【０１８８】
＜実施例５＞ ＣＤ２０結合細胞を使ったＡＤＣＣ分析
本実施例では、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を媒介する能力に関して、作動体としてヒト末梢血単核細胞、標的としてＢリンパ腫細胞株を使って、ＡＭＥ５、ＡＭＥ３３、ＡＭＥ６Ｆ１ ＩｇＧおよびＣ２Ｂ８抗体を試験した。この分析は以下に記述する方法で行った。
【０１８９】
ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）の単離：
健康なドナーから得た末梢血をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．０）を使って１：２に希釈した。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、カタログ番号１０７７−１）１２ｍｌを希釈サンプルの下の相に注意して置き、水平ローター付きＳｏｒｖａｌｌ ＲＴ６０００Ｂ遠心分離機を使い（ブレーキ・オフ）、１０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣを含む中間相を集め、ハンクス液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））で３度洗浄した。洗浄した細胞ペレットを、１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ）（オメガ・サイエンティフィック（Ｏｍｅｇａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を含むＲＰＭＩ １６４０培地（ATCC）２０ｍＬに懸濁した。再懸濁したＰＢＭＣを二つのＴ−１７５培養フラスコに分け、それぞれにＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳ３０ｍＬを加えた。フラスコを３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで培養した。翌日、付着していないＰＢＭＣを集め、上述のように遠心分離し、１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩに再懸濁し、血球計数器を使って計数した。
【０１９０】
標的細胞株：
Ｂリンパ腫細胞株をＡＴＣＣから入手し、手引書に従って成長させた。実験の前日細胞を１：２に分けた。翌日濃度を０．５から１Ｘ１０６細胞／ｍＬに調整し、５０μＬ（２５，０００から５０，０００細胞／ウェル）をベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）９６ウェルＵ底組織培養プレートに加えた。
【０１９１】
ＩｇＧ滴定：
１％ＦＢＳを含むＲＰＭＩでサンプルを希釈する事により、ＩｇＧ希釈液を生成した。ＩｇＧ５０μｌを９６ウェル・マイクロタイター・プレートの標的細胞に加え、ピペットを使って穏やかに混合した。作動体細胞を加える前に、３７℃／５％ＣＯ２の条件下で、ＩｇＧを標的細胞と一緒に１５分培養した。
【０１９２】
作動体細胞：
再懸濁したＰＢＭＣ１００μｌを標的細胞／ＩｇＧプレートの各ウェルに加えた。作動体と標的の比が１０〜２０：１になるようにＰＢＭＣの濃度を調整した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２の条件下で３〜４時間培養した。
【０１９３】
ＬＤＨ放出検出：
培養の後、プレートを１０００〜２０００ｒｐｍで５〜１０分間遠心分離した。ペレット状の細胞を避けながら、上清５０μｌを注意して除去した。ウェル当たりＰＢＳ５０ｐｌを含むＤｙｎｅｘ Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ＨＢ平底プレートにこの上清を直接加えた。このプレートにＬＤＨ検出試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））１００μｌを加えた。プレートを約１５〜３０分間培養し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｖｍａｘ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒを使って、４９０ｎｍでＯＤを読み取った。
【０１９４】
データの解析：
データは対数ＩｇＧ濃度対Ａ４９０として記された（図１５参照）。Ａ４９０は次の式を使って細胞障害作用％に転換された。
細胞障害作用％＝（実験Ａ４９０−基底Ａ４９０）／（最大Ａ４９０−基底Ａ４９０）Ｘ１００
ここで最大Ａ４９０は標的細胞に２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加える事により決定された。基底−放出は、感作ＩｇＧの不在下に作動体および標的細胞の混合物に関して測定された。図１５に示されるデータによると、Ｆｃ変異体Ｄ２８０ＨおよびＫ２９０Ｓを含むＡＭＥ３３のＥＣ５０は、Ｃ２Ｂ８よりも一貫して１．５〜２．０倍低かったことが示されている。このデータは以下の表６にも示されている。
表６ 推定ＥＣ５０ｓ, μｇ／ｍｌ（標的：Ｗｉｌ−２細胞）
【表６】
【０１９５】
＜実施例６＞ ＣＤ２０結合分子の糖鎖工学
本実施例は、ある種のＣＤ２０結合分子に適用した糖鎖工学法を説明する。特に、野生型または突然変異（Ｄ２８０ＨまたはＫ２９０Ｓ）Ｆｃ領域を含むＡＭＥ １Ｃ２ ＩｇＧをβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ酵素と一緒にＣＨＯ細胞の中で発現させる事により、Ｆｃ領域で切断されたオリゴ糖の発現を増加させた。糖鎖工学とＦｃ変異領域の組み合わせは、修飾していない１Ｃ２または市販のリツキサン抗体と比べ、ＡＤＣＣ分析において１Ｃ２のＥＣ５０を減少させた。方法は以下に記載する。
【０１９６】
ラットの腎臓ｃＤＮＡ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ））から得たβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ遺伝子をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーはその遺伝子の５’末端にＮｈｅＩ部位を導入し、３’末端にＥｃｏＲＩ部位を導入した（正プライマーは５’−ＧＧＣＧＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＧＡＣＧＣＴＡＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＧ−３’、配列番号１０３、逆プライマーは５’−ＧＧＣＧＧＡＡＴＴＣＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＧＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＣＴＴＧＣ−３’、配列番号１０４）。ＰＣＲ生成物の制限消化および精製の後、同じように開裂したｐｃＤＮＡ３．１ ＮＥＯ（生体外ゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））とそれとを連結させた。連結したプラスミドＤＮＡはエレクトロポレーションによる大腸菌の形質転換に使用された。コロニーＰＣＲを使い、ラットのβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ遺伝子の存在を検出するため、アンピシリン抵抗性の大腸菌コロニーをスクリーニングした。プラスミドＤＮＡはポジティブクローンから単離され、配列が決定された。配列決定により、プラスミドＤＮＡがＢｓｐＨＩと線形になっている事が確認された。リポフェクタミン２０００（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００）（生体外ゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使い、製造元の実験記録に従って、約１０ｍｇの線形ＤＮＡがＣＨＯ Ｋ１細胞への形質移入に使用された。Ｇ４１８選択の後、単離した抵抗性のコロニーを組織培養で増殖した。ｍＲＮＡが単離され、ラットβ（１−４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩｍＲＮＡ生産の定性的なスクリーニングが行なわれた。形質移入された細胞株は予期されたサイズのＰＣＲ生成物を産出したが、形質移入されていないＣＨＯＫ１細胞は産出しなかった。抗ＣＤ２０ ＩｇＧをコード化するＤＮＡが安定な細胞株の形質移入に使用された。形質移入の約３日後、細胞培養の上清が集められ、蛋白質Ａクロマトグラフィを使ってＩｇＧ類縁物質を精製した。蛋白質ＡカラムからＩｇＧを溶出した後、サンプルを透析し、２８０ｎｍで吸収度を測定する事により蛋白質の濃度を定量した。
【０１９７】
実施例５に記載の方法を使い、抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）の効果に関して、種々のＣＨＯＫ１細胞株で発現したＩｇＧサンプルを試験した。この実験では、新鮮なヒトの血液から単離された抹消血リンパ球が作動体細胞として使用され、ＷＩＬ．２ｓ Ｂ細胞が標的細胞として使用された。標的細胞の溶解量は、標準の乳酸脱水素酵素放出分析を使って測定した。ＡＤＣＣを引き出す効果に関して、加工されたＣＨＯＫ１細胞株で発現したＩｇＧと加工していないＣＨＯＫ１細胞株で発現したＩｇＧおよび市販のリツキサン抗体が直接比較された。さらに、切断されたＮ−アセチルグルコサミン糖の存在が、直接糖鎖形成分析により確認された。ＡＭＥ １Ｃ２に関するＡＤＣＣ分析の結果は図１６に示されている。
【０１９８】
＜実施例７＞ 生体外アポプトシス分析
本実施例は、種々のＣＤ２０結合分子を使って行なった生体外アポプトシス分析について記述する。特にＡＭＥ ５、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ６Ｆ１（全て抗体全体）およびＣ２Ｂ８抗体を使い、抗ヒトＩｇＧとの架橋結合によりラモスＢリンパ腫細胞株のアポプトシスを誘発する能力を試験した。分析の方法は以下の通りである。
【０１９９】
アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色：
ラモスＢリンパ腫細胞株（ＡＴＣＣ）を、使用の２４時間前に１：２に分けた。分析の当日、ラモス細胞を遠心分離し（１，０００ｒｐｍで５分）、ＰＢＳで洗浄し、ＲＰＭＩおよび１０％の加熱不活性ＦＢＳ（培地）に再び懸濁した（細胞濃度：５Ｘ１０５細胞／ｍｌ）。６ウェル組織培養プレートにウェル当たり１００万の細胞を加えた。一次抗体を指定濃度で細胞に加え、プレートを１５分間穏やかに振盪し、さらに４５分間３７℃に戻した。予め温めておいたヤギの抗ヒトＩｇＧ（１０μｇ／ｍｌ）または培地を特定のウェルに加え、プレートを３７℃で６時間培養した。
【０２００】
細胞は遠心分離で採取し（１，０００ｒｐｍで５分）、冷却１Ｘ結合緩衝液（１０Ｘ株から水で希釈）１００μｌおよびアネキシンＶ−ＦＩＴＣ（サザン・バイオテク（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ））１０μｌに再懸濁した。サンプルをポリスチレン製の丸底チューブ（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）２０５８）に移し、室温、暗所で、１５分培養した。ヨウ化プロピジウム（２μｇ／ｍｌ）を含む結合緩衝液を加え、サンプルをベクトン・ディッキンソン・ファクスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｆａｃｓｃａｎ）フローサイトメーターで分析し、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）またはＷｉｎＭＤＩソフトを使ってデータを解析した。細胞の死（アポプトシスおよび壊死の細胞の％）は、アネキシンＶで染色する細胞の％を測定する事により決定された。この分析の結果、ＡＭＥ ５、３３および６Ｆ１はＣ２Ｂ８抗体処理の場合と同じようなレベルで細胞の死を誘発する事が証明された。
【０２０１】
＜実施例８＞ 補体媒介の細胞障害活性分析
本実施例は、ヒトの補体およびＷｉｌ−２Ｂリンパ腫細胞株（標的）を使い、補体依存性細胞障害作用を媒介する効果に関して、Ｃ２Ｂ８抗体、シナジス（対照）およびＡＭＥ抗体である６Ｆ１、２Ｃ２、１Ｄ１０、１５、１８および３３を試験した結果を記載する。
【０２０２】
Ｗｉｌ２−ＳＢリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ）をＲＰＭＩ＋１０％加熱不活性ＦＢＳに再懸濁した（５Ｘ１０５／ｍｌ）。Ｗｉｌ２−Ｓ細胞懸濁液５０μｌ、ＩｇＧ（濃度範囲：１ｎｇ／ｍｌから７５μｇ／ｍｌ）５０μｌ、およびヒトの希釈［１：５］補体５０μｌを９６ウェルのプレート（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）３９１７）で混合した。抗体も補体もＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで希釈した。細胞は３７℃、５％ＣＯ２で９０分培養した。アラマーブルーをウェル当たり１５μｌ加え、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養した。蛍光（生きた細胞の数を反映）を５６０ｎｍで励起し５９０ｎｍで検出する事により記録した。分析の結果は、全ＡＭＥ抗体のＥＣ５０がＣ２Ｂ８抗体のそれに似ている事を示していた。
【０２０３】
＜実施例９＞ ＣＤ２０結合分子の生体内投与
本実施例では、多くのＣＤ２０結合分子を生体内で試験するために使用された分析について説明する。
【０２０４】
抗体ＡＭＥ４５Ｈ、１Ｃ２、５−３およびＣ２Ｂ８抗体をマウスにより以下のように分析した。５Ｘ１０６ラジ細胞（ＡＴＣＣ）を６〜８週齢のＣ．Ｂ．１７−ＳＣＩＤマウスの雄（タコニック（Ｔａｃｏｎｉｃ））の左右の脇腹に注射した（ｓ．ｃ．）。約２〜３時間後（０日）、抗体を腹腔内に注射した（０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇおよび０．５ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍の長さ、幅、そして高さを毎週月、水、金にカルパスで測定し、腫瘍の体積を計算した。用量応答曲線からＥＣ５０値を決定した。ＡＭＥ４Ｈ５、１Ｃ２および５−３のＥＣ５０は、Ｃ２Ｂ８のＥＣ５０と一貫して異なっているわけではなかった。
【０２０５】
抗体ＡＭＥ３３およびＣ２Ｂ８抗体もまた、５Ｘ１０６ラジ細胞が注射されたマウスを使って分析された。マウスは３日目に０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭＥ ３３またはＣ２Ｂ８で処置された。対照群のマウスには生理食塩水が与えられた。結果（図１７に示す）は、ＡＭＥ ３３およびＣ２Ｂ８が同じようにラジ腫瘍を阻害し、Ｃ２Ｂ８に比べるとＡＭＥ ３３の方が長期的に見て腫瘍の成長が少ない事を示している。
【０２０６】
＜実施例10＞ ヒトの疾病の治療にＣＤ２０結合分子を使用
本実施例は、これだけに限定されるものではないが、非ホジキンスリンパ腫（ＮＨＬ）および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から選択され、これらに限定されない疾病を含む、ヒトの患者の疾病の治療および予防的治療のためのＣＤ２０結合分子の用法にについて記述する。
【０２０７】
例えば上述の疾病のいずれかに罹っている患者に、ＡＭＥ ２１Ｅ１ Ｈｕｍ、ＡＭＥ６Ｆ１、ＡＭＥ ２Ｃ２、ＡＭＥ １Ｄ１０、ＡＭＥ １５、ＡＭＥ １８、ＡＭＥ ３３、ＡＭＥ ５−３、ＡＭＥ １Ｃ２、ＡＭＥ ４Ｈ５またはＡＭＥ ５などのＣＤ２０結合分子を０．４から体重１ｋｇあたり２０．０ｍｇ静脈内注射する。典型的な投与計画は、例えば緩徐静脈内注入として投与される抗体３７５ｍｇ／ｍ２を週１回、４または８用量である。別の投与計画は、完全なものとして参照用に本出願に編入されているアンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）による米国特許６，３９９，０６１に記載されている。治療および／または生体内撮像法のため、抗体またはＦａｂ断片を放射性同位元素（例えばイットリウム［９０］）で標識してもよい（米国特許６，３９９，０６１参照）。治療に対する反応はモニターされ、投与量を増やすべきか減らすべきか、あるいは反復治療の必要があるかどうかが決定される。治療に対する反応および投与計画に関する追加的な指示は、米国特許６，３９９，０６１に記載されている。
【０２０８】
上述の明細に記載されている出版物および特許は、全て参照として本出願に編入されている。本発明の範囲および精神から逸脱する事なく、本発明の方法およびシステムを様々に調整および変更できることは、当業者には明白である。本発明は特定の望ましい実施例との関連で記載されてはいるが、請求されている発明はそれらの具体的な実施例により不当に制限されるべきではない。本発明の実施のために記載された方法のうち、化学、医学、分子生物学、あるいは当業者にとって明白な種々の変更は、以下の請求項の範囲内に含まれている。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０結合分子がヒトＣＤ２０に対して５．０×１０−１０Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）を有し、ヒトＣＤ２０に対して５．０×１０−４ｓ−１以下の解離速度（ｋｏｆｆ）を有し、ＣＤ２０結合分子が：
ａ）ｉ）配列番号５のＣＤＲＬ１アミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号１３のＣＤＲＬ２アミノ酸配列；および
ｉｉｉ）配列番号１９のＣＤＲＬ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と；
ｂ）ｉ）配列番号２５のＣＤＲＨ１アミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号３９のＣＤＲＨ２アミノ酸配列；および
ｉｉｉ）配列番号５７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域
とを含む、ＣＤ２０結合分子を含む組成物。
【請求項２】
軽鎖可変領域が完全にヒト型のフレームワークまたはヒトの生殖細胞系フレームワークを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
重鎖可変領域が完全にヒト型のフレームワークまたはヒトの生殖細胞系フレームワークを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
軽鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか記載の組成物。
【請求項５】
軽鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列からなり、重鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか記載の組成物。
【請求項６】
Ｂ細胞リンパ腫治療用組成物の調製のための請求項１〜５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項７】
非ホジキンリンパ腫の治療用組成物の調製のための請求項１〜５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載の組成物および医薬的に許容される担体を含む、医薬製剤。
【請求項１】
ＣＤ２０結合分子がヒトＣＤ２０に対して５．０×１０−１０Ｍ以下の結合親和性（Ｋｄ）を有し、ヒトＣＤ２０に対して５．０×１０−４ｓ−１以下の解離速度（ｋｏｆｆ）を有し、ＣＤ２０結合分子が：
ａ）ｉ）配列番号５のＣＤＲＬ１アミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号１３のＣＤＲＬ２アミノ酸配列；および
ｉｉｉ）配列番号１９のＣＤＲＬ３アミノ酸配列
を含む軽鎖可変領域と；
ｂ）ｉ）配列番号２５のＣＤＲＨ１アミノ酸配列；
ｉｉ）配列番号３９のＣＤＲＨ２アミノ酸配列；および
ｉｉｉ）配列番号５７のＣＤＲＨ３アミノ酸配列
を含む重鎖可変領域
とを含む、ＣＤ２０結合分子を含む組成物。
【請求項２】
軽鎖可変領域が完全にヒト型のフレームワークまたはヒトの生殖細胞系フレームワークを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
重鎖可変領域が完全にヒト型のフレームワークまたはヒトの生殖細胞系フレームワークを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
軽鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか記載の組成物。
【請求項５】
軽鎖可変領域が配列番号５９のアミノ酸配列からなり、重鎖可変領域が配列番号６１のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか記載の組成物。
【請求項６】
Ｂ細胞リンパ腫治療用組成物の調製のための請求項１〜５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項７】
非ホジキンリンパ腫の治療用組成物の調製のための請求項１〜５のいずれか記載の組成物の使用。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか記載の組成物および医薬的に許容される担体を含む、医薬製剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２０１１−５７７０４（Ｐ２０１１−５７７０４Ａ）
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７６１３１（Ｐ２０１０−２７６１３１）
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【分割の表示】特願２００６−５３３２３４（Ｐ２００６−５３３２３４）の分割
【原出願日】平成１６年５月２０日（２００４．５．２０）
【出願人】（５０１０６１８５８）アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド (11)
【氏名又は名称原語表記】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月２４日（２０１１．３．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１０日（２０１０．１２．１０）
【分割の表示】特願２００６−５３３２３４（Ｐ２００６−５３３２３４）の分割
【原出願日】平成１６年５月２０日（２００４．５．２０）
【出願人】（５０１０６１８５８）アプライド モレキュラー エボリューション，インコーポレイテッド (11)
【氏名又は名称原語表記】Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．
【Ｆターム（参考）】
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