ＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを用いるＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原殺菌活性の増強
【課題】殺菌性抗体を誘導しかつ研究のための動物における予防処置および治療処置に使用され得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせてアジュバントを含む有効な免疫原性組成物を提供すること。殺菌性抗体を誘導しかつヒトにおける予防処置および治療処置に使用され得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせてアジュバントを含む有効な免疫原性組成物を提供すること。
【解決手段】 （ａ）免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原；および
（ｂ）少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、免疫を刺激する量のアジュバント組成物、
を含む、免疫原性組成物。
【解決手段】 （ａ）免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原；および
（ｂ）少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、免疫を刺激する量のアジュバント組成物、
を含む、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として本明細書により援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般には免疫応答の分野に関し、そして詳細には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原およびＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、治療投与および予防投与のための免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａは、グラム陰性球菌であり、直径０．６〜１．０μｍである。以下の２種のＮｅｉｓｓｅｒｉａ：Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋病の原因因子）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（細菌性髄膜炎の原因因子）が、主に医学的に重要である。ヒトは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のメンバーの唯一公知の貯蔵庫（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対するワクチンが有効であるために、補体の存在下でその細菌を殺傷し得る殺菌性抗体が惹起されなければならないことが、十分認識される。例えば、髄膜炎菌Ｂ株に対する現在のワクチン処方物は、多糖類および外膜タンパク質に焦点を合わせている。この外膜タンパク質は、株間で交差反応性がほとんどないかまたは全くない、非常に変わりやすいタンパク質である。さらに、淋菌株についてのワクチンは現在存在しない。従って、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの両方についての改良された免疫原性組成物（これらは、ワクチン組成物において使用され得る）が、非常に所望される。さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する抗殺菌性応答を惹起し得るアジュバントを含む、免疫原性組成物もまた、非常に所望される。
【０００４】
アジュバントとは、抗原に対する免疫応答を増強し得る化合物である。アジュバントは、体液性免疫および細胞性免疫の両方を増強し得る。しかし、特定の病原体について、細胞性免疫、実際にはＴ細胞を刺激することが、好ましい。現在使用されるアジュバントは、Ｔ細胞応答を十分には誘導せず、そして／または有害な副作用を有する。
【０００５】
現在、米国においてヒトでの使用を認可されている唯一のアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）である。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、およびインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用であるが、その他のワクチンには、特に、細胞媒介性免疫の刺激が防御に必要な場合に、有用ではないかもしれない。例えば、報告によると、ミョウバンが百日咳ワクチンおよび腸チフスワクチンの有効性を改良しなかったこと、およびアデノウイルスワクチンとともにはわずかな効果しか提供しなかったことが、示される。さらに、注射部位での肉芽腫の誘導およびミョウバン調製物のロット間での変動のような問題が、経験されている。
【０００６】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、実験的根拠に基づいて、特に動物研究のために、多くの抗原とともに首尾良く用いられている、強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは、以下の３つの成分：鉱物油、乳化剤（例えば、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ）および殺傷されたミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、から構成される。水性抗原溶液が、これらの成分と混合されて、油中水エマルジョンが生成される。しかし、ＣＦＡは、重篤な副作用（痛み、膿瘍、および熱を含む）を引き起こし、これら副作用により、ヒトワクチンまたは脊椎動物ワクチンのいずれかにおけるＣＦＡの使用が、妨げられる。これらの副作用は、主に、ＣＦＡのミコバクテリア成分に対する宿主の反応に起因する。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、この細菌成分を含まないＣＦＡと類似する。米国における使用は未だに認可されていないが、ＩＦＡは、他の国において、いくつかの型のワクチンに有用である。ＩＦＡは、インフルエンザワクチンおよびポリオワクチンとともにヒトにおいて、そしていくつかの動物ワクチン（狂犬病、イヌジステンバー、および口蹄疫を含む）とともに、首尾良く使用されている。しかし、ＩＦＡにおいて使用される油および乳化剤の両方が、マウスにおいて腫瘍を引き起こし得るという実験が示された。このことは、代替のアジュバントが、ヒトでの使用のためにより良い選択であることを示す。
【０００７】
ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡとともに観察されたアジュバント活性を生じる、ミコバクテリア細胞壁複合体の最小単位を示す。Ｅｌｌｏｕｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７４、５９、１３１７。広範なアジュバント能力および副作用を示す、ＭＤＰの多くの合成アナログが生成されている。Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１９７８、２５、６３。ＭＤＰの３つのアナログ−−ＭＤＰのスレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８７、５，２２３）；ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８２、３５、４１７）；およびムラミルトリペプチドの脂肪親和性誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｙ．ＹａｍａｍｕｒａおよびＳ．Ｋｏｔａｎｉ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１６７頁）−−が、体液媒介性免疫および細胞媒介性免疫を刺激し、そして低レベルの毒性を示すことが示されている。ＭＤＰの別の誘導体（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−３（ヒドロキシホスホリル−オキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ））は、脂肪親和性である。ＭＴＰ−ＰＥは、リン脂質テールを有し、このテールが、脂質環境とその分子の疎水性部分の会合を可能にしつつ、そのムラミルペプチド部分が、水性環境と会合する。従って、ＭＴＰ−ＰＥ自体は、安定な水中油エマルジョンを生じるための乳化剤として作用し得る。
【０００８】
レバミゾールおよびイソプリノシンは、宿主免疫を増加する他の合成アジュバントである。レバミゾールは、テトラミゾールの左旋性異性体であり、そしてＴ細胞依存性機構を介して、体液性免疫および細胞性免疫を増強する。イソプリノシンは、イノシン、アデノシンのプリン前駆体およびグアノシンを含む複合体であり、Ｔ細胞有糸分裂誘発を促進する。ツフシンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖中の配列と相同な４アミノ酸ペプチド（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）であり、主に、マクロファージを刺激する。
【０００９】
生分解性および生体適合性ポリマーから調製された微粒子は、ポリ（ラクチド−グリコシド共重合体）（ＰＬＧ）として公知であり、多数の抗原についての有効なアジュバントであることが示されている。さらに、ＰＬＧ微粒子は、捕捉された抗原の放出速度を制御し得、従って、単一用量ワクチンの可能性を与える。さらに、捕捉された抗原との生分解性ポリマーの投与は、強力な免疫応答を誘導することが、一定範囲の動物モデルにて示されている。Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１９９８、３２、２２５〜２４６およびＳｉｎｇｈら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１９９８、３４、２８５〜３０４。
【００１０】
均一なサイズの微小液滴を提供するようにミクロな流体にされた、スクアレン、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５TM）、およびポリソルビタン８０（Ｔｗｅｅｎ ８０TM）を含むエマルジョン（すなわち、ＭＦ５９）もまた、強力な免疫応答を誘導することが示されている。ＭＦ５９処方物は、アルミニウム塩アジュバントとともに得られる抗体力価よりも５〜１００倍大きい抗体力価を誘導することが示されている。ＭＦ５９は、多数の供給源（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびマラリアを含む）由来の抗原に対する免疫応答を増強することが示されている。Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２７７〜２９６頁：Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９８、１６、１８２２〜１８２７；Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９５、１３、１５５７〜１５６２；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、１９９７、Ｆｅｂｕｒｕａｒｙ、６９〜７５；およびＴｒａｑｕｉｎａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９６、１７４、１１６８〜７５（これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。ＭＦ５９アジュバントは、サブユニット抗原の免疫原性を改善しつつ、ミョウバンアジュバントの安全性および耐性のプロフィールを維持する。Ｖａｎ Ｎｅｓｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２、１９９２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、５７〜６２およびＶａｌｅｎｓｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、１５３、４０２９〜３９（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。ＭＦ５９は、１９９５年５月４日出願の、米国特許出願０８／４３４，５１２に記載され、この出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。動物研究において、ＭＦ５９は、遺伝子毒性、催奇性であることも、感作を引き起こすことも、見出されなかった。ＭＦ５９の作用機構は、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞の生成（すなわち、Ｔｈ２細胞応答）に依存するようである。しかし、ＭＦ５９アジュバントは、Ｔｈ１応答または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を、ほとんど（あったとしても）惹起しない。
【００１１】
抗原と混合されたＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、強力なＴｈ１免疫応答を誘導することが示された。Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０、８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、２７、２３４０〜２３４４；ならびにＭｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８、１６、１２１６〜１２２４（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、細菌ＤＮＡにおいて比較的一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいては、少ない比率で示され、そしてメチル化されている。Ｂｉｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９８７、３、３４２〜３４７。非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡまたは合成ＤＮＡもまた、例えば以下を含む、免疫応答を誘導することが公知である：Ｂ細胞増殖、インターロイキン−６および免疫グロブリンの分泌、およびアポトーシス耐性。Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、５３４９〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；ならびにＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；ＰＣＴ公報ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。しかし、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、殺菌性抗体応答を誘導すると示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
殺菌性抗体を誘導しかつ研究のための動物における予防処置および治療処置に使用され得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせてアジュバントを含む有効な免疫原性組成物が、非常に所望される。さらに、殺菌性抗体を誘導しかつヒトにおける予防処置および治療処置に使用され得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせてアジュバントを含む有効な免疫原性組成物もまた、なお所望される。このような応答は、例えば、髄膜炎菌感染または淋菌感染の処置において、ならびに髄膜炎菌感染または淋菌感染に対して感受性である個体を免疫するために、有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の開示）
・本発明は、以下を提供し得る：
・（項目１） 免疫原性組成物であって、以下：
（ａ）免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原；および
（ｂ）免疫を刺激する量のアジュバント組成物であって、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、組成物、
を含む、組成物。
・（項目２） 項目１に記載の組成物であって、上記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、タンパク質、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、多糖類、およびリポ多糖類からなる群より選択される、組成物。
・（項目３） 項目１〜２のいずれか１項に記載の組成物であって、上記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにかまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する、組成物。
・（項目４） 項目３に記載の組成物であって、上記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清型Ｂペプチドである、組成物。
・（項目５） 項目４に記載の組成物であって、上記ペプチドが配列番号３１を含む、組成物。
・（項目６） 項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物であって、成分（ｂ）がさらに第２のアジュバントを含む、組成物。
・（項目７） 項目６に記載の組成物であって、上記第２のアジュバントが油性液滴エマルジョンを含む、組成物。
・（項目８） 項目７に記載の組成物であって、上記油性液滴エマルジョンが、代謝可能な油および乳化剤を含む、組成物。
・（項目９） 項目８に記載の組成物であって、全くポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で存在し、上記油および上記乳化剤が、油性液滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、その油性液滴の実質的にすべてが直径１ミクロン未満である、組成物。
・（項目１０） 項目９に記載の組成物であって、上記油が、動物油、不飽和炭化水素、植物油、またはテルペノイドである、組成物。
・（項目１１） 項目１０に記載の組成物であって、上記テルペノイドがスクアレンである、組成物。
・（項目１２） 項目８〜１１のいずれか１項に記載の組成物であって、水性媒体中に０．５〜２０体積％の上記油を含む、組成物。
・（項目１３） 項目８〜１２のいずれか１項に記載の組成物であって、上記乳化剤が、非イオン性洗剤、あるいはポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、もしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、またはソルビタンモノエーテル、ソルビタンジエーテル、もしくはソルビタントリエーテルを含む、組成物。
・（項目１４） 項目８〜１３のいずれか１項に記載の組成物であって、０．０１〜０．５重量％の上記乳化剤を含む、組成物。
・（項目１５） 項目１〜１４のいずれか１項に記載の組成物であって、別個の免疫刺激剤をさらに含む、組成物。
・（項目１６） 項目１５に記載の組成物であって、上記免疫刺激剤が、細菌細胞壁成分およびムラミルペプチドからなる群より選択される、組成物。
・（項目１７） 項目６〜１６のいずれか１項に記載の組成物であって、上記第２のアジュバントが、ミョウバン、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、または完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含む、組成物。
・（項目１８） 項目１〜１７のいずれか１項に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、組成物。
・（項目１９） 項目１〜１８のいずれか１項に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目２０） 項目１〜１９のいずれか１項に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、ＣＧモチーフを含み、当該モチーフが、５’側ですぐに２つのプリンと隣接し、そして３’側ですぐに２つのピリミジンと隣接する、組成物。
・（項目２１） 項目２０に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目２２） 項目１〜２１のいずれか１項に記載の組成物であって、以下のタンパク質：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；ならびに／あるいは
・ＧＢ−９９２８１９７．４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント、
のうちの１つ以上をさらに含む、組成物。
・（項目２３） ワクチン組成物であって、以下：
ａ）免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原；および
ｂ）免疫を刺激する量のアジュバント組成物であって、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、組成物、
を含む、ワクチン組成物。
・（項目２４） 項目２３に記載のワクチン組成物であって、成分（ｂ）が、第２のアジュバントをさらに含む、ワクチン組成物。
・（項目２５） 項目２３または項目２４に記載のワクチン組成物であって、上記ペプチドが配列番号３１を含む、ワクチン組成物。
・（項目２６） 項目２３〜２５のいずれか１項に記載のワクチン組成物であって、項目２〜２１のいずれか１項においてさらに規定されるような、ワクチン組成物。
・（項目２７） アジュバント組成物であって、以下：
ａ）オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧモチーフを含む、オリゴヌクレオチド；および
ｂ）完全フロイントアジュバント、
を含む、組成物。
・（項目２８） 項目２７に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、組成物。
・（項目２９） 項目２７に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目３０） 項目２７に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドがＣＧモチーフを含み、当該モチーフが、５’側ですぐ２つのプリンと隣接し、そして３’側ですぐ２つのピリミジンと隣接する、組成物。
・（項目３１） 項目３０に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目３２） 宿主動物において免疫応答を刺激する方法であって、当該動物に、免疫応答を誘導するに有効な量の項目１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、上記宿主動物が哺乳動物である、方法。
・（項目３４） Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して宿主動物を免疫する方法であって、当該動物に、防御応答を誘導するに有効な量の項目２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目３５） 項目３４に記載の方法であって、上記宿主動物が哺乳動物である、方法。
・（項目３６） 項目３５に記載の方法であって、上記哺乳動物がヒトである、方法。
・（項目３７） Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して宿主動物を免疫する方法であって、当該動物に、防御応答を誘導するに有効な量の項目２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含し、上記抗原がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドである、方法。
・（項目３８） 項目３７に記載の方法であって、上記ペプチドが配列番号３１を含む、方法。
・（項目３９） 項目３８に記載の方法であって、上記宿主動物がヒトである、方法。
・（項目４０） 薬剤における使用のための、項目１〜２９のいずれか１項に規定されるような組成物。
・（項目４１） 動物において免疫応答を誘導するための医薬の製造における、項目１〜３１のいずれか１項に規定されるような組成物の使用。
・（項目４２） 項目４１に記載の使用であって、上記組成物が項目１に規定されるような組成物であり、そして上記医薬が動物における防御免疫応答を誘導するためのものである、使用。
・本発明は、少なくとも１つのＣＧモチーフ、および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含む、アジュバント組成物に関する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７。本発明のいくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ＣＧモチーフを含み、そのＣＧモチーフは、その５’側ですぐに２つのプリンに隣接し、そしてその３’側ですぐに２つのピリミジンに隣接する。本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５。
【００１４】
本発明はまた、免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、および少なくとも１つのＣＧモチーフを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、免疫を刺激する量のアジュバント組成物を含む、免疫原性組成物に関する。好ましくは、このアジュバント組成物は、少なくとも１つのＣＧモチーフを第２のアジュバントとともに含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、以下からなる群より選択される：タンパク質、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、多糖類、およびリポ多糖類。好ましくは、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する。本発明の好ましい実施形態において、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドであり、好ましくは、これは、配列番号３１を含む。本発明のいくつかの実施形態において、このアジュバント組成物は、第２のアジュバント（例えば、ミョウバン、完全フロイントアジュバント、または完全フロイントアジュバントなど）を含む。本発明の他の実施形態において、このアジュバント組成物は、油性液滴エマルジョンを第２のアジュバントとして含み、これは好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含む。好ましくは、この油および乳化剤は、油性液滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、その油性液滴の実質的にすべてが、１ミクロン未満の直径であり、そしてそのエマルジョンは、全くポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーの非存在下で存在する。好ましくは、この油は、動物油または植物油であり、より好ましくは、不飽和炭化水素、より好ましくは、テルペノイド(例えば、スクアレン）である。好ましい実施形態において、この組成物は、０．５〜２０体積％の油を水性媒体中に含む。好ましくは、この乳化剤は、非イオン性洗剤を含む。好ましくは、この乳化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、もしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステルまたはソルビタンモノエーテル、ソルビタンジエーテル、もしくはソルビタントリエーテルを含む。本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、０．０１〜０．５重量％のこの乳化剤を含む。
【００１５】
本発明の組成物はまた、別個の免疫刺激剤（例えば、細菌細胞壁成分およびムラミルペプチド）も含み得る。本発明の好ましい実施形態において、この組成物は、本明細書中に記載される少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。
【００１６】
本発明はまた、本明細書中に記載されるような、免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、および本明細書中に記載されるような、免疫を刺激する量のアジュバント組成物を含む、ワクチンに関し、このアジュバント組成物は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００１７】
本発明はまた、宿主動物において免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書中に記載されるような免疫原性組成物を、免疫応答を誘導するに有効な量で投与する工程を包含する。好ましくは、その宿主動物は、哺乳動物である。
【００１８】
本発明はまた、宿主動物をＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して免疫する方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書中に記載されるようなワクチン組成物を、防御応答を誘導するに有効な量で投与する工程を包含する。好ましくは、その宿主動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。
【００１９】
本発明はまた、宿主動物をＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して免疫する方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書中に記載されるようなワクチン組成物を、防御応答を誘導するに有効な量で投与する工程を包含し、そのワクチン組成物において、抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドであり、好ましくは、配列番号３１を含む。好ましくは、その宿主動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。
【００２０】
本発明の実施は、他のように示さない限り、当業者の範囲内にある、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００２１】
本発明は、部分的に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、アジュバント、および少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物に関する。本発明の免疫原性組成物は、抗体力価で判断した場合に、ほぼ１０倍その抗原の免疫原性を増加した。驚くべきことに、免疫された動物由来の血清が、ＭｅｎＢ殺菌アッセイにおいて試験された場合に、ＭｅｎＢ細胞を殺傷する能力の２倍の増加が観察された。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、句「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらから形成されるキメラをいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、句「少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、当該分野における「ＣｐＧ」オリゴヌクレオチドとしても当該分野において公知である。本明細書中で使用される場合、句「ＣＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドに続いてグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、句「油性液滴エマルジョン」とは、代謝可能な油および乳化剤を含むエマルジョンをいう。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「約」とは、その用語が修飾する値の±１０％を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、句「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原」とは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に由来する、任意のタンパク質、ペプチド、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、ペプチド−多糖類、ペプチド−リポ多糖類、多糖類、またはリポ多糖類を意味する。好ましくは、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、特異的抗体の形成を刺激し、そして相同抗体とインビボまたはインビトロで特異的に反応し、そして／または細胞性Ｔ細胞応答を刺激する。このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、任意のＮｅｉｓｓｅｒｉａ種に由来し得るが、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのいずれかに由来する。当業者は、多数のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原を容易に同定し得かつ調製し得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」とは、殺菌性免疫応答を誘導し得る、免疫原性組成物を意味する。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、殺菌性抗体応答を惹起する。
【００２８】
本発明によると、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して宿主動物を予防的および／または治療的に、免疫または処置する、組成物および方法が提供される。本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトに対して、予防的免疫および治療的免疫を付与するために有用である。本発明の方法はまた、ヒト以外の哺乳動物に対して、生物医学的研究のために、実施され得る。
【００２９】
本発明の１つの実施形態において、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが、ＣＦＡと混合されて、アジュバント組成物が形成され、このアジュバント組成物は、任意の抗原と使用され得る。少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の従来のオリゴヌクレオチド合成を使用して調製され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸）を含み、このオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。本発明において使用され得るさらなる骨格は、当業者に周知である。さらに、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約６個と約１００個との間のヌクレオチド、より好ましくは、約８個と約５０個との間のヌクレオチド、最も好ましくは、約１０個と約４０個との間のヌクレオチドを含む。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者に周知である、糖部分および窒素性塩基部分の置換を含み得る。少なくとも１つのＣＧモチーフを含む好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下に開示される：Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８，９５，１２６３１−１２６３６、Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９−２８８３、Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７、Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３−１６３１、Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５５３〜１５５５８、Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５、Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５、Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７、７２〜７８、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６〜８７３、Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９−１７６４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７．４９１８〜４９２５、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，５３９４−５４０２、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１、Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，８４９−８５４、Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、８７０〜８７６、Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，２３４０−２３４４、Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，５８９８−５９０６、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／５２５８１（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むが、複数のＣＧモチーフを含み得ることが、理解されるべきである。
【００３０】
好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のヌクレオチド配列を含む：ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ（配列番号１）、ａｔａａｔｃｇａｃｇｔｔｃａａｇｃａａｇ（配列番号２）、ｇｇｇｇｔｃａａｃｇｔｔｇａｇｇｇｇｇｇ（配列番号３）、ｔｃｔｃｃｃａｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｔ（配列番号４）、ｇａｇａａｃｇｃｔｃｇａｃｃｔｔｃｇａｔ（配列番号５）、ｔｃｃａｔｇｔｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ（配列番号６）、ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ（配列番号７）、ｇｃｔａｇａｃｇｔｔａｇｃｇｔ（配列番号８）、ａｔｃｇａｃｔｃｔｃｇａｇｃｇｔｔｃｔｃ（配列番号９）、ｇａａｃｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｇｔｔｃｃｇ（配列番号１０）、ｇｃｔａｇａｔｇｔｔａｇｃｇｔ（配列番号１１）、ｔｃａａｃｇｔｔ（配列番号１２）、ｇｃａａｃｇｔｔ（配列番号１３）、ｔｃｇａｃｇｔｃ（配列番号１４）、ｔｃａｇｃｇｃｔ（配列番号１５）、ｔｃａａｃｇｃｔ（配列番号１６）、ｔｃａｔｃｇａｔ（配列番号１７）、ｔｃｔｔｃｇａａ（配列番号１８）、ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔｃｇａｇａｔｇａ（配列番号１９）、ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔａｇｃｇａｔｇａ（配列番号２０）、ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔａｇａｇｃｇｇａ（配列番号２１）、ｇｔｔｔｇｃｇｃａａｃｇｔｔｇｔｔｇｃｃａｔ（配列番号２２）、ａｔｇｇｃａａｃａａｃｇｔｔｇｃｇｃａａａｃ（配列番号２３）、ｃａｔｔｇｇａａａａｃｇｔｔｃｔｔｃｇｇｇｇ（配列番号２４）、ｃｃｃｃｇａａｇａａｃｇｔｔｔｔｃｃａａｔｇ（配列番号２５）、ａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔ（配列番号２６）、およびｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔ（配列番号２７）。本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ＣＧモチーフを含み、このモチーフは、その５’側で２つのプリンに隣接し、そしてその３’側で２つのピリミジンに隣接する。しかし、ＣＧモチーフを含む任意のオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチドが免疫応答の増加を誘導する限り、本発明において使用され得ることが理解されるべきである。
【００３１】
本発明はまた、上記のような少なくとも１つのＣＧオリゴヌクレオチド、およびアジュバントを少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせて含む、免疫原性組成物に関する。本発明のいくつかの実施形態において、このアジュバントは、ミョウバン、完全フロイントアジュバント、または不完全フロイントアジュバントである。本発明の他の実施形態において、このアジュバントは、免疫原性の量の油性液滴エマルジョンを含む。このアジュバント組成物は、免疫原性組成物において使用される抗原とアジュバントを混合する前に、下記の成分から一般的に調製される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態において、その抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する。本発明の他の実施形態において、その抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する。好ましくは、その抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドである。好ましくは、そのペプチドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、（配列番号３０）および（配列番号３１）を含む。しかし、任意のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、本発明において使用され得る。さらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、下記に、実施例において記載される。さらに、本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原として役立ち得るペプチドは、以下の同時係属中の出願に開示される：米国特許出願番号６０／０８３７５８、６０／０９４６８９、６０／０９８、９９４、６０／１０３、７４９、６０／１０３、７９４、６０／０９９、０６２、６０／１２１、５２８および６０／１０３、７９６、そしてＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４およびＷＯ９９／５７２８０（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。単一または複数の、保存的アミノ酸置換が、本発明の抗原の免疫原性を変化することを伴ってなされ得ることが、理解されるべきである。さらに、細菌株におけるバリエーションもまた、本明細書中に開示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸排列内に包含される。例えば、いくつかの株は、アミノ酸１１位においてＣではなくＹを、４８位にてＤではなくＡを、５５位にてＧではなくＡを、２０７位にてＲではなくＱを、３１２位にてＳではなくＡを、３３８位にてＡではなくＴを、そして３４１位にてＳではなくＧを含み得る。
【００３３】
抗原は、調製後にアジュバント組成物に添加され得る。この抗原およびエマルジョンは、振盪により混合され得る。ＣＦＡおよびＩＦＡを使用する場合、ＰＢＳ中の抗原が、等量のＣＦＡまたはＩＦＡのいずれかと混合され得る。その混合物は、濃いエマルジョンが達成されるまで、皮下注射針を通すことによって、乳化され得る。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、免疫を刺激する量の、少なくとも１つのＣＧモチーフを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、油性液滴エマルジョンを含むアジュバントと混合される。この油性液滴エマルジョンは、好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含み、この油および乳化剤は、油性液滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、この液滴の実質的にすべては、直径が１ミクロン未満である。このような液滴は、油性液滴が本発明により提供されるものより有意に大きい油および乳化剤を含むアジュバント組成物に対して、驚くべき優位性を示す。
【００３５】
本発明の個々の成分は、両方とも一般的にそして好ましい実施形態においていくらか詳細に、下記に示されるが、当該分野で周知であり、そして本明細書中で使用される用語、例えば、代謝可能な油、乳化剤、免疫刺激剤、ムラミルペプチド、および脂肪親和性ムラミルペプチドは、これらの化合物を記載することが、さらなる説明なしに、当業者に十分に周知である。
【００３６】
これらの組成物の１つの成分は、代謝可能な、非毒性の油であり、好ましくは、６〜３０個の炭素原子であり、アルカン、アルケン、アルキン、およびそれらの対応する酸およびアルコール、それらのエーテルおよびエステル、ならびにそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。この油は、任意の植物油、魚油、動物油、または合成して調製された油であり得、それらは、免疫原性組成物が投与される宿主動物の身体により代謝され得、そしてその被検体に対して非毒性である。その宿主動物は、代表的には、哺乳動物であり、そして好ましくはヒトである。鉱物油および類似の毒性石油留出油は、本発明から明らかに除外される。
【００３７】
本発明の油成分はまた、任意の長鎖のアルカン、アルケン、またはアルキン、あるいはそれらの酸またはアルコール誘導体であり得、遊離酸としてか、その塩としてか、またはエステル（例えば、モノエステル、またはジエステル、またはトリエステル（例えば、トリグリセリドおよび１，２−プロパンジオールまたは類似のポリヒドロキシアルコールのエステル））としてかのいずれかであり得る。アルコールは、アミノ官能化酸またはポリ官能化酸（ａｍｉｎｏ− ｏｒ ｐｏｌｙ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｉｄ）（例えば、酢酸、プロピオン酸、クエン酸など）を使用してアシル化され得る。油でありかつ本明細書中に示される他の基準を満たす長さアルコールから誘導されたエーテルもまた、使用され得る。
【００３８】
この個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般的に、約６〜約３０個の炭素原子を有する。この部分は、直鎖構造または分子鎖構造を有し得る。その部分は、完全に飽和していてもよいし、あるいは１つ以上の二重結合または三重結合を有してもよい。モノエステルまたはポリエステルまたはエーテルベースの油が使用される場合、約６〜約３０個の炭素という限定が、その個々の脂肪酸部分または脂肪アルコール部分に適用され、全体の炭素数には適用されない。
【００３９】
任意の代謝可能な油（特に、動物供給源、魚供給源または植物供給源由来）が、本明細書中で使用され得る。その油が、投与される宿主により代謝されることが必須であり、さもなければ、その油の成分が、膿瘍、肉芽種または癌腫さえ引き起こし得るか、または（獣医学の実施にて使用される場合）その油の成分が、代謝されない油が消費者に対して有し得る有害な効果に起因して、ワクチンされたトリおよび動物の肉をヒトでの消費のために受容不可能にし得る。
【００４０】
植物油の例示的供給源としては、堅果、種子、および穀物が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油であり、堅果油が最も一般的に利用可能であることを示す。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが、挙げられる。穀物群においては、トウモロコシ油が、最も容易に利用可能であるが、他の穀物（例えば、コムギ、オーツ麦、ライ麦、イネ、テフ、ライコムギなど）の油もまた、使用され得る。
【００４１】
植物油を入手するための技術は、十分に発達しており、かつ周知である。これらの油および他の類似の油の組成は、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、ならびに食物、栄養および食物技術に関する原資料にて見出され得る。
【００４２】
グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素脂肪酸のエステル（種子油に天然には存在しないが）が、堅果油および種子油から開始する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。これらの産物は、ＰＶＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，４１６ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂｏｏｎｇｏｎ，ＮＪなどから、名称ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）の下で市販されている。
【００４３】
任意の動物供給源由来の油もまた、本発明の免疫原性組成物に用いられ得る。動物油および動物脂肪は、通常、それらがトリグリセリドとして存在し、そして魚類または植物由来の油よりも高い飽和度を有するという事実に起因して体温で固体である。しかし、脂肪酸は、遊離脂肪酸を提供する、部分的または完全なトリグリセリドのけん化によって動物脂肪から入手可能である。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は、代謝可能であり、従って、本発明の実施に使用され得る。動物供給源から分離、精製、けん化および純粋な油を得るために必要な他の手段についての手順は、当該分野において周知である。
【００４４】
ほとんどの魚類は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、およびクジラ油（例えば、鯨蝋）が、本明細書中に使用され得るいくつかの魚油の例である。多くの分岐鎖油が、５個の炭素のイソプレン単位において生化学的に合成され、そして一般に、テルペノイドといわれる。サメ肝油は、スクアレンとして公知の分岐した不飽和のテルペノイド（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）（これは、本明細書中で特に好ましい）を含む。スクアラン（ｓｑｕａｌａｎｅ）（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、特に好ましい油である。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給元から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法によって得られ得る。
【００４５】
これらの免疫原性組成物の油成分は、約０．５体積％〜約２０体積％、ただし好ましくは約１５％以下の量において、特に約１％〜約１２％の量において存在する。約１％〜約４％の油を使用することが、最も好ましい。
【００４６】
これらの免疫原性組成物の水性部分は、好ましくは緩衝化生理食塩水であるか、またはより好ましくは不純物が混入していない水である。これらの組成物は非経口投与が意図されるので、組成物と生理学的流体との間の示差的イオン濃度のために、組成物の投与後の膨張または迅速な吸収を予防するために、張度（すなわち、重量オスモル濃度）が通常の生理学的流体と本質的に同じであるように、免疫原性組成物として使用される最終緩衝化溶液を作製することが好ましい。通常の生理学的条件と適合するｐＨを維持するために、生理学的食塩水を緩衝化することもまた、好ましい。また、特定の例において、特定の組成物成分（例えば、糖ペプチド）の安定性を保証するために、特定のレベルにｐＨを維持することが、必要であり得る。
【００４７】
任意の生理学的に受容可能な緩衝液が、本明細書中で使用され得るが、リン酸緩衝液が好ましい。他の受容可能な緩衝液（例えば、酢酸塩、トリス（ｔｒｉｓ）、炭酸水素塩、炭酸塩など）が、リン酸緩衝液に対する代替物として使用され得る。水性成分のｐＨは、好ましくは、約６．０〜８．０の間である。
【００４８】
しかし、免疫原性組成物が最初に調製される場合、不純物が混入していない水が、エマルジョンの水性成分として好ましい。塩濃度を増加させると、所望の小さな液滴サイズを達成することがより困難になる。最終免疫原性組成物が、油液滴アジュバントから調製される場合、抗原性物質が、緩衝液に適切な重量オスモル濃度にて加えられて、所望の免疫原性組成物を提供し得る。
【００４９】
これらの組成物に用いられる水性成分の量は、組成物の値を単一にするに必要な量である。すなわち、１００％になるに十分な水性成分の量が、組成物を容量調整にするために、上記の他の成分とともに混合される。
【００５０】
かなりの乳化剤または懸濁剤が、一般に、薬学科学において使用され得る。乳化剤は、本明細書中で使用される場合、代謝可能な油ではない。乳化剤としては、天然に由来する物質（樹木由来のゴム）、植物性タンパク質、糖ベースのポリマー（例えば、アルギネートおよびセルロース）などが挙げられる。炭素骨格上に水酸化物または他の親水性置換基を有する、特定のオキシポリマーまたはポリマー（例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグルコールエーテルベースの一官能基および多官能基化合物）は、界面活性剤活性を有する。長鎖脂肪酸由来の化合物は、本発明に使用され得る乳化剤および懸濁剤の実質的に第３の群を形成する。任意の前述の界面活性剤は、それらが非毒性である限り有用である。
【００５１】
本発明に従って使用され得る適切な乳化剤（界面活性剤または洗剤ともいわれる）の特定の例は、以下を含む：
１．水溶性石けん（例えば、高級脂肪酸（Ｃ10〜Ｃ22）のナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩、ならびに特に、ナトリウムおよびカリウムの獣脂およびココナツ石けん）。
【００５２】
２．陰イオン性合成非石けん洗剤（これは、約８〜２２個の炭素原子を含むアルキルラジカルをそれらの分子構造において有する有機硫酸反応生成物の水溶性塩によって示され得、そしてラジカルは、硫酸および硫酸エステルラジカルからなる群より選択される）。これらの例は、以下である：獣脂またはココナツ油から誘導されるアルキル硫酸ナトリウムまたはカリウム；アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはカリウム；アルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム；ココナツ油脂肪酸モノグリセリドのスルホン酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム；１モルの高級脂肪アルコールと約１〜６モルのエチレンオキシドとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩；１分子あたり１〜１０単位のエチレンオキシドを有し、その中でアルキルラジカルが８〜１２個の炭素原子を含む、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホン酸ナトリウムまたはカリウム；イセチオン酸でエステル化され、そして水酸化ナトリウムで中和された、脂肪酸の反応生成物；メチルタウリド（ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドでのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ3−スルホン酸化Ｃ10〜Ｃ24α−オレフィンのナトリウムおよびカリウム塩。
【００５３】
３．有機疎水性化合物とのアルキレンオキシド基の縮合によって作製された非イオン性合成洗剤。代表的な疎水性基としては、プロピレングリコールとのプロピレンオキシドの縮合生成物、アルキルフェノール、エチレンジアミンとのプロピレンオキシドの縮合生成物、８〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコール、ならびに脂肪酸のアミドが挙げられる。
【００５４】
４．非イオン性洗剤（例えば、半極性の特徴を有する、アミンオキシド、ホスフィンオキシドおよびスルホキシド）。長鎖３級アミンオキシドの特定の例としては、ジメチルドデシルアミンオキシドおよびビス（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンが挙げられる。ホスフィンオキシドの特定の例は、米国特許第３．３０４，２６３号（１９６７年２月１４日発行）に見出され、そしてジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル−（２−ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドが挙げられる。
【００５５】
５．長鎖スルホキシド（式Ｒ1−ＳＯ−Ｒ2であって、ここでＲ1およびＲ2が、置換または非置換アルキルラジカルであり、前者が、約１０〜約２８個の炭素原子を含み、一方、Ｒ2が、約１〜３個の炭素原子を含む、長鎖スルホキシドを含む）。これらのスルホキシドの特定の例としては、ドデシルメチルスルホキシドおよび３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが挙げられる。
【００５６】
６．両性合成洗剤（例えば、３−ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウムおよび３−ドデシルアミノプロピオンスルホン酸ナトリウム）。
【００５７】
７．両性イオン性合成洗剤（例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネートおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）２ヒドロキシプロパン−１−スルホネート）。
【００５８】
さらに、以下の型の乳化剤の全てが、本発明の組成物に使用され得る：（ａ）脂肪酸、ロジン酸（ｒｏｓｉｎ ａｃｉｄ）およびトール油（ｔａｌｌ ｏｉｌ）の石けん（すなわち、アルカリ塩）；（ｂ）アルキルアレーンスルホネート；（ｃ）スルホン酸アルキル（分岐鎖および直鎖の両方の疎水性基、ならびに一級および二級の硫酸基を有する界面活性剤を含む）；（ｄ）疎水性基と親水性基との間の中間結合を含むサルフェートおよびスルホネート（例えば、脂肪酸アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリド）（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖酸エステル、特にトール油エステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；（ｇ）長鎖アルコールおよびメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。界面活性剤は、１つより多くの様式で分類され得るので、この段落に示される界面活性剤の多数のクラスが、以前に記載された界面活性剤のクラスと重複する。
【００５９】
生物学的状況のために特異的に設計されかつ一般的に使用される多くの乳化剤が、存在する。例えば、多くの生物学的洗剤（界面活性剤）がそれ自体、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙの１９８７ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓの３１０〜３１６頁に列挙されている。このような界面活性剤は、４つの基本的な型（陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、非イオン性）に分けられる。陰イオン性洗剤の例としては、アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびタウロコール酸が挙げられる。陽イオン性洗剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンズアルコニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、メチルベンズエトニウムクロリド、および４−ピコリンドデシルサルフェートが挙げられる。両性イオン性洗剤の例としては、３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（一般に、ＣＨＡＰＳと略される）、３−［（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（一般に、ＣＨＡＰＳＯと略される）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、およびｌｙｓｏ−α−ホスファチジルコリンが挙げられる。非イオン性洗剤の例としては、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物（例えば、商標名Ｌｕｂｒｏｌの下で販売）、脂肪酸（特に、Ｃ12〜Ｃ20脂肪酸）のポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、商標名Ｔｗｅｅｎの下で販売）、ならびにソルビタン脂肪酸エーテル（例えば、商標名Ｓｐａｎの下で販売）が挙げられる。
【００６０】
界面活性剤の特に有用な群は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ソルビトールの脱水によって調製され、１．４−ソルビタンを生じ、次いでこれは、１当量以上の脂肪酸と反応される。脂肪酸で置換された部分はさらに、エチレンオキシドと反応されて、界面活性剤の第２の群を生じ得る。
【００６１】
脂肪酸で置換されたソルビタン界面活性剤は、１，４−ソルビタンと脂肪酸（例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸または同様の長鎖脂肪酸）とを反応させることによって作製されて、１，４−ソルビタンモノエステル、１，ｇ−ソルビタンセスキエステルまたは１，４−ソルビタントリエステルを生じる。これらの界面活性剤についての一般名としては、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレート、およびソルビタントリオエレートが挙げられる。これらの界面活性剤は、通常、種々の一置換、二置換および三置換ソルビタンの間を区別する文字または番号の命名を用いて、ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名前の下で市販されている。
【００６２】
ＳＰＡＮ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の界面活性剤は、親水性であり、そして一般に、油に可溶性であるか、または分散可能である。それらはまた、ほとんどの有機溶媒に可溶性である。水中で、それらは、一般に、不溶性であるが分散可能である。一般に、これらの界面活性剤は、１．８〜８．６の間の親水性−疎水性バランス（ＨＬＢ）数を有する。このような界面活性剤は、当該分野において公知の手段によって容易に作製され得るか、または例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから登録印ＡＴＬＡＳ（登録商標）の下で市販されている。
【００６３】
界面活性剤の関連する群としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステルが挙げられる。これらの物質は、１，４−ソルビタンモノエステルまたはトリエステルにエチレンオキシドを添加することによって調製され得る。ポリオキシエチレンの添加は、脂溶性ソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤を、一般に水中で分散可能な油に溶解性でありかつ有機液体に種々の程度に溶解性である、親水性界面活性剤に変換する。
【００６４】
商標ＴＷＥＥＮ（登録商標）の下で市販されているこれらの物質は、水中油エマルジョンおよび分散剤を調製するために、または油を可溶化するために、ならびに水溶性または洗浄性の無水軟膏を作製するために有用である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、関連するソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤と組み合わされて、エマルジョンの安定性を促進し得る。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、一般に、９．６〜１６．７の間に入るＨＬＢ値を有する。
【００６５】
単独でまたはＳＰＡＮ（登録商標）、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）およびＴＷＥＥＮ（登録商標）の界面活性剤と組み合わされて使用され得る非イオン性界面活性剤の第３の群は、エチレンオキシドと長鎖脂肪酸との反応によって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。この型の最も一般的に利用可能な界面活性剤は、名称ＭＹＲＪ（登録商標）の下で販売されており、そしてステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤のように親水性かつ可溶性であるかまたは分散可能である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤と、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）と、もしくはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤混合物と、エマルジョンを形成する使用のために混和され得る。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、当該分野において公知の方法によって作製され得るか、またはＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．から市販されている。
【００６６】
ポリオキシエチレンベースの非イオン性界面活性剤の第４の群は、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの物質は、エチレンオキシドを脂肪アルコールに添加することによって上記のように調製される。これらの界面活性剤についての市販名は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに依存して親水性または脂溶性であり得る。これらの化合物の調製物は技術水準から入手可能であり、一方、それらはまた、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ
Ｉｎｃ．のような市販の供給源から容易に入手可能である。
【００６７】
本発明の実施に潜在的に使用され得る他の非イオン性界面活性剤は、例えば、以下である：ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含むみつろう誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステル、または他のポリオキシエチレン酸アルコール、または１２〜２２個の炭素原子の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体。
【００６８】
本発明の免疫原性組成物は多相系であることが意図されるので、約７〜１６の範囲のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオン性界面活性剤を選択することが好ましい。この値は、単一の非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤）の使用を通して得られ得るか、あるいは例えば、ソルビタンモノエステル、ジエステルもしくはトリエステルベースの界面活性剤；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン誘導体化界面活性剤と組み合わされたソルビタンエステル；高いＨＬＢのポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸と、界面活性剤との混和物の使用によって達成され得る。
【００６９】
単一の非イオン性界面活性剤、最も詳細にはＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤を、本発明の実施においてエマルジョン安定化非イオン性界面活性剤として使用することがより好ましい。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０という名称の界面活性剤（それ以外では、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレートについてのポリソルベート８０として公知）が、前述の界面活性剤のうち最も好ましい。
【００７０】
十分な液滴サイズの減少は、通常、０．０２重量％〜２．５重量％（ｗ／ｗ）の量で存在する界面活性剤を含めることによってもたらされ得る。０．０５％〜１％の量が好ましく、ここで０．０１〜０．５％が特に好ましい。
【００７１】
本発明の液滴サイズが到達する様式は、本発明の実施に重要ではない。ミクロン未満の油性液滴が得られ得る１つの様式は、商業的な乳化器（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡから入手可能なモデル番号１１０Ｙ）の使用によってである。他の商業的な乳化器の例としては、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。これらの乳化器は、高圧下で小さな開口部を通して流体を押し込むことによって開発された高剪断力の原理によって作動する。モデル１１０Ｙが、５，０００〜３０，０００ｐｓｉで作動される場合、１００〜７５０ｎｍの直径を有する油性液滴が、提供される。
【００７２】
油性液滴のサイズは、油に対する洗剤の比率（比率を増加させると、液滴のサイズが減少する）、作動圧力（作動圧力を増加させると、液滴のサイズが減少する）、温度（温度を増加させると、液滴のサイズが減少する）を変化させることによって、および両親媒性免疫刺激剤を加えること（このような因子を加えると、液滴のサイズが減少する）によって変動され得る。実際の液滴サイズは、特定の洗剤、油、および免疫刺激剤（もしあれば）、ならびに選択される特定の作動条件により変動する。液滴のサイズは、サイズ測定（ｓｉｚｉｎｇ）機器（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｉｏｎにより製造される、商業的なＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎ４ＭＤ）の使用によって検証され得、そしてパラメータは、実質的に全ての液滴が直径１ミクロン未満、好ましくは直径０．８ミクロン未満、および最も好ましくは直径０．５ミクロン未満であるまで、上記の指針を使用して変動され得る。実質的に全てとは、少なくとも約８０％（数による）、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８％を意味する。粒子サイズの分布は、代表的には、Ｇａｕｓｓｉａｎであり、その結果、平均直径は、上記の限界よりも小さい。
【００７３】
本発明は、満足のいく免疫原性のためにミクロン未満のエマルジョンで使用され得る先行技術において以前に教示された他の成分（すなわち、ポリオキシロピレン（ｐｏｌｙｏｘｙｌｒｏｐｙｌｅｎｅ）−ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、米国特許第４，７７２，４６６号および同第４，７７０，８７４号ならびにＥＰ−Ａ２−０３１５１５３におけるアジュバントを用いる使用について記載されるもの））の非存在下で油性エマルジョンを調製することによって実施され得る。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物は、ＰＯＰ−ＰＯＥコポリマー以外の代謝可能な水中油の乳化剤を含む。乳化剤は、任意の特定の免疫刺激活性を有する必要がない。なぜなら、油性組成物はそれ自体、油性液滴がミクロン未満の範囲にある場合に、アジュバントとして機能し得るからである。しかし、免疫刺激活性の増加は、組成物中に任意の既知の免疫刺激剤を含めることによって提供され得る。これらの免疫刺激剤は、乳化剤および油または免疫刺激剤から分離され得るかのいずれかであり、そしてこの乳化剤は、１つでありかつ同じ分子であり得る。前者の状況の例としては、殺滅されたミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびその細胞性成分と混合された代謝可能な油が挙げられる。さらなる免疫刺激物質としては、このような細菌の細胞壁の成分であるムラミルペプチドが挙げられ、そしてその誘導体が挙げられる。関節乳化剤／免疫刺激剤の例は、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８８，１４１，１７２０〜１７２７（この開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される）に記載される脂溶性ムラミルペプチドである。これらの物質としては、免疫刺激群である塩基性Ｎ−アセチルムラミルペプチド（親水性部分）が挙げられるが、得られた化合物に表面活性特性を提供する脂溶性部分もまた挙げられる。このような化合物、および他の型の両親媒性免疫刺激物質は、免疫刺激剤および乳化剤の両方として作用し、そして本発明の実施に好ましい。さらに、両親媒性ではない第２の免疫刺激物質と組み合わせて、両親媒性免疫刺激物質を使用することによって本発明を実施することもまた、可能である。例は、本質的に非置換（すなわち、本質的に親水性）のムラミルジペプチドと組み合わせた、脂溶性ムラミルペプチドの使用である。
【００７５】
好ましい油性液滴エマルジョンは、ＭＦ５９である。ＭＦ５９は、例えば、Ｏｔｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９５，Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２７７〜２９６頁；Ｓｉｎｇｈら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９８，１６，１８２２〜１８２７；Ｏｔｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９５，１３，１５５７〜１５６２；ならびにＶａｌｅｎｓｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５３，４０２９〜３９（これらの開示は、それらの全体において本明細書中に参考として援用される）に記載される手順に従って作製され得る。
【００７６】
動物は、腹腔、筋肉内または皮下の経路によって、種々のアジュバント／免疫原性組成物を投与され得る。
【００７７】
本発明の免疫原性組成物の組成は、有効量の抗原を用いる。すなわち、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａにその後に曝されることから被験体を保護するために、被験体が特異的かつ十分な免疫学的応答、好ましくはＴリンパ球応答を生成する量の抗原を、アジュバントと組み合わせて含む。
【００７８】
本発明に用いられ得る各々のかつ全ての抗原に関する詳細な指針を提供する単回用量の指定は、割り当てられ得ない。有効量の抗原は、その固有の活性および純度の関数であり、そして慣用的な実験を通じて、当業者に経験的に決定される。本発明のアジュバント組成物は、細胞全体またはウイルス全体の免疫原性組成物、および組換えＤＮＡ技術または合成により調製された精製抗原またはタンパク質サブユニットもしくはペプチド免疫原性組成物と組み合わせて使用され得ることが意図される。本発明のアジュバント組成物は、安定であることから、抗原およびエマルジョンは、単に振盪することによって混合され得る。他の技術（例えば、アジュバントおよび抗原の溶液または懸濁液の混合物を、小さな開口部（例えば、皮下針）に迅速に通すこと）は、有用な免疫原性組成物を容易に提供する。
【００７９】
本発明に従うアジュバントおよび免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラムの核酸、好ましくはＤＮＡ（例えば、ＣＧオリゴヌクレオチドなど）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１〜約３５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１００マイクログラムの核酸を含む。当業者は、任意の所望の量の核酸を含む免疫原性組成物を容易に処方し得る。本発明に従う免疫原性組成物は、無菌かつ発熱性物質陰性で提供される。免疫原性組成物は、単位投薬形態において従来通りに投与され得、そして薬学分野において周知の任意の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０に記載される）（この開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される）によって調製され得る。
【００８０】
本発明に従う免疫原性組成物は、免疫刺激量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原を含む。免疫刺激量は、測定可能な体液性または細胞性免疫応答を誘導するに十分な量である。例えば、本発明の免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラムの抗原または約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムの抗原を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１〜約３５０マイクログラムの抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムの抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１００マイクログラムの抗原を含む。当業者は、慣用的な実験を通じて当業者により経験的に決定され得る、任意の所望の量の抗原を含む免疫原性組成物を容易に処方する。免疫原性組成物は、単位投薬形態において従来通りに投与され得、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）（この開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。
【００８１】
本発明はまた、本明細書中に記載されるようなＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせて、本明細書中に記載されるようなＣＧオリゴヌクレオチドとともに、本明細書中に記載されるようなアジュバントを含むワクチン組成物に関する。このようなワクチン組成物（例えば、実施例に示されるワクチン組成物）は、殺菌性である体液性免疫応答を誘発する。
【００８２】
本発明はまた、宿主動物において免疫応答を刺激する方法に関する。この方法は、免疫応答を誘導するに有効な量において上記の免疫原性組成物を動物に投与する工程を包含する。この宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。投与に好ましい経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口、ならびに経皮または吸入もしくは坐剤による経路が挙げられるがこれらに限定されない。最も好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下の注射が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態に従うと、免疫原性組成物は、無針注射デバイス（これは周知であり、そして広範に利用可能である）を使用して、宿主動物に投与される。当業者は、本明細書中の教示に従って、無針注射デバイスを使用して、個体の細胞に免疫原性組成物を送達し得る。
【００８３】
本発明はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して宿主動物を免疫する方法またはＮｅｉｓｓｅｒｉａに感染した宿主動物を処置する方法に関する。この方法は、防御応答を誘導するに有効な量において、本明細書中に記載される免疫原性組成物またはワクチン組成物を動物に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路は、本明細書中に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
（発明を実施するための様式）
本発明はさらに、本発明を明解にすることが意図される以下の実施例によって例示される。前述の例は、本発明を例示することを意味し、そして本発明をいかなる様式にも限定すると解釈されるべきではない。当業者は、本発明の精神および範囲内にある改変を認識する。
【実施例】
【００８５】
（実施例１：アジュバント組成物の調製）
ＭＴＰ−ＰＥは、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供された。スクアレンおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＣＦＡおよびＩＦＡを、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。水酸化アンモニウム（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｒ）を、Ｒｅｈｅｉｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＮＪ）から入手した。
【００８６】
油性液滴エマルジョンの調製物を、多くの方法によって作製した。第１の方法において、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％スクアレン、０．００８％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、２５０μｇ／ｍｌ ＭＴＰ−ＰＥおよび抗原からなる混合物を、２３ゲージの針に６回通した。このエマルジョンは、１０ミクロンの範囲内の油性液滴サイズからなり、そしてＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯと呼ばれる。第２の方法は、上記の混合物を、Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化器に５回通す工程を含む。このエマルジョンは、主に１〜２ミクロンの油性液滴からなった。そしてこれは、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥと呼ばれる。Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化器（Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）は、作動チャンバー中で約１０００ｐｓｉで生成する、商業的なナイフ刃のホモジナイザー（例えば、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤおよびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ）の小規模バージョンである。第３の方法において、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０とともに、または、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０なしで、０．３〜１８％スクアレンおよび０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌのＭＴＰ−ＰＥを含む混合物を、５，０００〜３０，０００ｐｓｉにて、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ番号１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に通した。代表的には、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中で、５０ｍｌのエマルジョンを５分間混合するか、または１００ｍｌを１０分間混合した。得られたエマルジョンは、スクアレン、ＭＴＰ−ＰＥ、ならびに洗剤濃度およびマイクロフルイダイザー作動圧力および温度に依存して、１００〜７５０ｎｍの油性液滴からなった。この組成物は、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦと呼ばれる。
【００８７】
（実施例２：抗原調製物）
ＭｅｎＢ抗原９１９をコードする遺伝子を、以下のプライマーを使用してＭｅｎＢ染色体ＤＮＡから増幅した：正方向プライマー５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇｔｇｃｃａａａｇｃａａｇａｇｃａｔｃ−３’（配列番号２８）、逆方向プライマー５’−ｃｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｔａｔｔｃｇｇｇ−３’（配列番号２９）。
【００８８】
増幅後に、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから溶出し、そして１μｇのＤＮＡを、増幅されたフラグメントの５’端および３’端でそれぞれ切断する、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。消化後に、このフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製して、そして予めＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。この連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５細胞を形質転換して、そして組換えプラスミドを保有するコロニーを、アンピシリン含有プレート上で選択した。１つの陽性クローンから、ｐＥＴ−９１９と命名されたプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎからのプラスミド調製キットを使用して調製し、そしてこのプラスミドを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３細胞を形質転換した。
【００８９】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３（ｐＧＥＸ−９１９）株を、１００μｇのアンピシリンを補充した５００ｍｌのＬＢ中において３０℃で増殖させた。ＯＤ600値が０．５に達したときに、この培養物に、１ｍＭ ＩＰＴＧを補充して、そしてさらに３時間培養した。細胞を遠心分離によって収集し、そして７．５ｍｌの氷冷イミダゾール緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、１０ｍＭ イミダゾール（ｐＨ８））中で、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波破砕器Ｂ−１５を使用する氷上での超音波破砕によって破壊した。遠心分離による細胞片の分離の後に、この上清を、１ｍｌのＮｉ2+樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに混合して、そして室温で３０分間維持した。この樹脂を遠心分離によって収集し、１０ｍｌの氷冷１０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて洗浄し、そして小さな使い捨てカラムにロードした。次いで、このカラムを、１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール緩衝液で洗浄して、そして最終的に、このタンパク質を、２５０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて溶出させた。このタンパク質を、ＰＢＳ中で透析して、そして−２０℃で保存した。
【００９０】
ＭｅｎＢ９１９のヌクレオチド配列（配列番号３０）を、以下に示す：
【００９１】
【化１】
「ｙ」は、「ｃ」または「ｔ」のいずれかであると理解されるべきである。
ＭｅｎＢ９１９ペプチドのアミノ酸配列（配列番号３１）を、以下に示す：
【００９２】
【化２】
。
【００９３】
（実施例３：免疫化）
４匹のＣＤ１マウスの群に、５個のワクチン処方物（以下の表１に示される）の１つを与えた。このワクチンを、７５μｌのタンパク質調製物（２０μｇのタンパク質）と７５μｌの特定のアジュバントとを混合することによって処方した。ミョウバンを使用したときは、２０μｇのタンパク質および１ｍｇ/ｍｌの最終濃度でミョウバンを含む１５０μｌの溶液を使用した。最終的に、９１９−ＣｐＧオリゴ−ＣＦＡ処方物の場合には、配列：５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’（配列番号１）を有する２０μｇのホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｓ，Ｅｔｃｄ．ＵＳＡ）を、免疫前に、７５μｌの最終容量のＣＦＡ中で、２０μｇのタンパク質とともに混合した。このワクチンを、１日目および２１日目に腹腔内に投与して、そして血清サンプルを、各注射の１５日後に採取した。
【００９４】
（実施例４：ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＭｅｎＢ Ｍ７細胞を、０．４のＯＤ620値を有する７ｍｌの液体培養物から遠心分離によって収集した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで０．０２５％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に再懸濁した。２時間の室温でのインキュベーションおよび４℃で一晩のさらなるインキュベーションの後に、細胞を９６ウェルのＧｒｅｉｎｅｒプレート（１００μｌ／ウェル）に分配し、そして４℃で一晩維持した。次いでこのウェルを、ＰＢＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ）で三回洗浄して、その後に２００μｌの飽和緩衝液（２．７％ポリビニルピロリドン１０の水）を加えた。ＰＢＴでの洗浄の後に、２００μｌの希釈した血清（希釈緩衝液：１％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ ＮａＮ3のＰＢＳ）を、各ウェルに加えて、そしてプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。洗浄後に、希釈緩衝液で１：２０００に希釈された１００μｌＨＲＰ結合体化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに加えて、そしてこのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＴ緩衝液で三回洗浄した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍｇ Ｏ−フェニルジアミン、１０μｌのＨ2Ｏ2）を、各ウェルに加えて、そしてプレートを室温で２０分間維持した。最終的に、１００μｌのＨ2ＳＯ2を各ウェルに加えて、そしてＯＤ490値を計測した。ＥＬＩＳＡ力価を、０．４のＯ．Ｄ．を与える血清の希釈としてだいたい決定した。各免疫スケジュールからの血清のプールのＥＬＩＳＡ力価を、以下の表１に報告する。示されるように、１用量のワクチン後の最高の抗体力価は、９１９−ＩＦＡおよび９１９−ＣＦＡ−オリゴであった。９１９−ＣＦＡ−オリゴは、９１９−ＩＦＡの２倍高い力価を与えた。さらに、９１９−ＣＦＡ−オリゴは、９１９−ＣＦＡとの応答および９１９−ＣＦＡ単独よりも大きな応答を生じた。抗体力価は測定されることから、応答は同様に、９１９−オリゴ単独よりも大きいことが予測される。第２の用量の後に、９１９−ＣＦＡ−オリゴは、最高の処方物であることがわかった。これは、使用されたいずれの他の処方物よりも、ほとんど１オーダー高い強度の抗体力価を生じた。
【００９５】
表１：異なるアジュバント処方物とともに９１９抗原を使用したＥＬＩＳＡ力価
【００９６】
【表１】
（実施例５：殺菌アッセイ）
ＭｅｎＢ２９９６株を、ＯＤ620値０．５〜０．８に達するまで、液体培養物（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス）中で増殖させた。次いで、この細胞を遠心分離によって収集して、そしてＧｅｙ緩衝液１％ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁して、ＯＤ620が０．５の懸濁液を得た。最終的に、この懸濁液を、Ｇｅｙ緩衝液１％ ＢＳＡで１：２０，０００に希釈して、そして２５℃で保存した。殺菌アッセイについては、１％ ＢＳＡを含む５０μｌのＧｅｙ緩衝液を、２５μｌの希釈したマウス血清（希釈緩衝液：１％ ＢＳＡを含むＧｅｙ緩衝液）、２５μｌの細菌懸濁液およびμｌの熱非働化（５６℃で３０分間）または通常の仔ウサギ補体のいずれかに加えて、各ウェルに添加した。仔ウサギ補体の添加の直後に、２２μｌの各サンプルを、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレート上にプレートして、次いで９６ウェルプレートを、回転下において３７℃でインキュベートした。各ウェルからの２２μｌのサンプルを、１時間のインキュベーションの後に以前に述べたようにプレートした。ＭｅｎＢの増殖速度は、２時間でおよそ２倍である。
【００９７】
各群からの血清のプールの殺菌活性を、表２に示す。プレートをコロニーが目に見えるようになるまで３７℃で維持した。ＭｅｎＢ細菌コロニーの数を、時間０および１時間後に計数した。最高の殺菌活性は、９１９−ＣＦＡ−オリゴ処方物で免疫されたマウス由来の血清で見出された。これは、９１９−ＣＦＡを含む使用された他の処方物よりも少なくとも２倍高い殺菌活性を示した。さらに、９１９−ＣＦＡ−オリゴは、９１９−ＣＦＡとの応答および９１９−ＣＦＡ単独での応答よりも高い応答を生じた。抗体力価が測定されているように、この応答は同様に、９１９−オリゴ単独よりも大きいことが期待される。
表２：異なるアジュバント処方物を使用しての９１９抗原の殺菌活性
【００９８】
【表２】
。
【００９９】
（実施例６：さらなる抗原）
上記の実施例にて使用された抗原「９１９」に加えて、またはこの抗原の代わりに、本発明の組成物は、以下の１以上のタンパク質抗原を含み得る：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２８２７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２９４１２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／０３４１３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；および／または
・ＧＢ−９９２８１９７．４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント。
【０１００】
組成物がＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／２４５７８に開示されるように、以下の配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは、これらの配列番号の１以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）を含む：
【０１０１】
【化３】
この組成物がＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、以下のＷＯ９９／３６５４４に開示されるような、配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）を含む：
【０１０２】
【化４】
組成物がＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／５７２８０に開示されるような、以下の配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を有する配列を含むタンパク質）を含む：
【０１０３】
【化５】
組成物が、ＷＯ９９／２８２７３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９７／２８２７３の図４または図１３に開示されるタンパク質（あるいは、その免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこのタンパク質に対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）を含む。
【０１０４】
組成物がＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９６／２９４１２に開示される配列番号１〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号からなる群より選択される免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０５】
組成物が、ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９５／０３４１３に開示される配列番号１〜２３からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号からなる群より選択される免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０６】
組成物が、ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／３１１３２に開示される配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは配列番号２の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２に配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０７】
組成物が、ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／５８６８３に開示される配列番号２もしくは配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは配列番号２もしくは配列番号４の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２もしくは配列番号４に配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０８】
組成物が、ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／５５８７３に開示される配列番号２もしくは配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは配列番号２もしくは配列番号４の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２もしくは配列番号４に配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０９】
組成物がＧＢ−９９２８１９７．４に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、以下の（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のうちの１つを含む：
（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群（ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）Ｂアミノ酸配列：
【０１１０】
【化６】
あるいはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらに対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質。このタンパク質は、そのシグナルペプチドＭＫＬＫＱＩＡＳＡＬＭＭＬＧＩＳＰＬＡＬＡを欠損し得る；
（ｉｉ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅアミノ酸配列：
【０１１１】
【化７】
あるいはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらに対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質。このタンパク質は、そのシグナルペプチドＭＫＬＫＱＩＡＳＡＬＭＭＬＧＩＳＰＬＡＦＡを欠損し得る；
（ｉｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａアミノ酸配列：
【０１１２】
【化８】
あるいはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらに対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質。このタンパク質は、そのシグナルペプチドＭＫＬＫＱＩＡＳＡＬＭＶＬＧＩＳＰＬＡＬＡを欠損し得る。
【０１１３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原としての使用に好ましいタンパク質は、以下である：
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号３０６９〜３０７４および３２０７〜３２４１によって示されるタンパク質「９１９」（その中の図２３および実施例１５もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号８６９〜８７４および３１４９〜３１７８によって示されるタンパク質「２３５」（その中の図２０および実施例１２もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号３０４５〜３０５６および３１８５〜３２０６によって示されるタンパク質「５１９」（その中の図２２および実施例１４もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号７９３〜８０４および３１１５〜３１４８によって示されるタンパク質「２２５」（その中の図１９および実施例１１もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／３６５４４の実施例１（配列番号１〜６）によって示されるタンパク質「ＯＲＦ４０」（ＧＢ−９９１０１６８．５の図１もまた参照のこと；ＷＯ９９／３１１３２およびＷＯ９９／５８６８３もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／２４５７８の実施例２６（配列番号２１５〜２２６）によって示されるタンパク質「ＯＲＦ４」（ＧＢ−９９１０１６８．５の図２もまた参照のこと）。
【０１１４】
本出願は例示の目的のみで本発明を記載し、そして改変は本発明の精神および範囲内に留まるようになされ得ることが理解される。
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に引用されるすべての文書は、その全体が参考として本明細書により援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般には免疫応答の分野に関し、そして詳細には、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原およびＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、治療投与および予防投与のための免疫原性組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａは、グラム陰性球菌であり、直径０．６〜１．０μｍである。以下の２種のＮｅｉｓｓｅｒｉａ：Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（淋病の原因因子）およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（細菌性髄膜炎の原因因子）が、主に医学的に重要である。ヒトは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ属のメンバーの唯一公知の貯蔵庫（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）である。Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対するワクチンが有効であるために、補体の存在下でその細菌を殺傷し得る殺菌性抗体が惹起されなければならないことが、十分認識される。例えば、髄膜炎菌Ｂ株に対する現在のワクチン処方物は、多糖類および外膜タンパク質に焦点を合わせている。この外膜タンパク質は、株間で交差反応性がほとんどないかまたは全くない、非常に変わりやすいタンパク質である。さらに、淋菌株についてのワクチンは現在存在しない。従って、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの両方についての改良された免疫原性組成物（これらは、ワクチン組成物において使用され得る）が、非常に所望される。さらに、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓおよびＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに対する抗殺菌性応答を惹起し得るアジュバントを含む、免疫原性組成物もまた、非常に所望される。
【０００４】
アジュバントとは、抗原に対する免疫応答を増強し得る化合物である。アジュバントは、体液性免疫および細胞性免疫の両方を増強し得る。しかし、特定の病原体について、細胞性免疫、実際にはＴ細胞を刺激することが、好ましい。現在使用されるアジュバントは、Ｔ細胞応答を十分には誘導せず、そして／または有害な副作用を有する。
【０００５】
現在、米国においてヒトでの使用を認可されている唯一のアジュバントは、アルミニウム塩（ミョウバン）である。これらのアジュバントは、Ｂ型肝炎、ジフテリア、ポリオ、狂犬病、およびインフルエンザを含むいくつかのワクチンに有用であるが、その他のワクチンには、特に、細胞媒介性免疫の刺激が防御に必要な場合に、有用ではないかもしれない。例えば、報告によると、ミョウバンが百日咳ワクチンおよび腸チフスワクチンの有効性を改良しなかったこと、およびアデノウイルスワクチンとともにはわずかな効果しか提供しなかったことが、示される。さらに、注射部位での肉芽腫の誘導およびミョウバン調製物のロット間での変動のような問題が、経験されている。
【０００６】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）は、実験的根拠に基づいて、特に動物研究のために、多くの抗原とともに首尾良く用いられている、強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは、以下の３つの成分：鉱物油、乳化剤（例えば、Ａｒｌａｃｅｌ Ａ）および殺傷されたミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、から構成される。水性抗原溶液が、これらの成分と混合されて、油中水エマルジョンが生成される。しかし、ＣＦＡは、重篤な副作用（痛み、膿瘍、および熱を含む）を引き起こし、これら副作用により、ヒトワクチンまたは脊椎動物ワクチンのいずれかにおけるＣＦＡの使用が、妨げられる。これらの副作用は、主に、ＣＦＡのミコバクテリア成分に対する宿主の反応に起因する。不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）は、この細菌成分を含まないＣＦＡと類似する。米国における使用は未だに認可されていないが、ＩＦＡは、他の国において、いくつかの型のワクチンに有用である。ＩＦＡは、インフルエンザワクチンおよびポリオワクチンとともにヒトにおいて、そしていくつかの動物ワクチン（狂犬病、イヌジステンバー、および口蹄疫を含む）とともに、首尾良く使用されている。しかし、ＩＦＡにおいて使用される油および乳化剤の両方が、マウスにおいて腫瘍を引き起こし得るという実験が示された。このことは、代替のアジュバントが、ヒトでの使用のためにより良い選択であることを示す。
【０００７】
ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）は、ＣＦＡとともに観察されたアジュバント活性を生じる、ミコバクテリア細胞壁複合体の最小単位を示す。Ｅｌｌｏｕｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９７４、５９、１３１７。広範なアジュバント能力および副作用を示す、ＭＤＰの多くの合成アナログが生成されている。Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ、１９７８、２５、６３。ＭＤＰの３つのアナログ−−ＭＤＰのスレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８７、５，２２３）；ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．１９８２、３５、４１７）；およびムラミルトリペプチドの脂肪親和性誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ、Ｙ．ＹａｍａｍｕｒａおよびＳ．Ｋｏｔａｎｉ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１６７頁）−−が、体液媒介性免疫および細胞媒介性免疫を刺激し、そして低レベルの毒性を示すことが示されている。ＭＤＰの別の誘導体（Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−［１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−３（ヒドロキシホスホリル−オキシ）］エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ））は、脂肪親和性である。ＭＴＰ−ＰＥは、リン脂質テールを有し、このテールが、脂質環境とその分子の疎水性部分の会合を可能にしつつ、そのムラミルペプチド部分が、水性環境と会合する。従って、ＭＴＰ−ＰＥ自体は、安定な水中油エマルジョンを生じるための乳化剤として作用し得る。
【０００８】
レバミゾールおよびイソプリノシンは、宿主免疫を増加する他の合成アジュバントである。レバミゾールは、テトラミゾールの左旋性異性体であり、そしてＴ細胞依存性機構を介して、体液性免疫および細胞性免疫を増強する。イソプリノシンは、イノシン、アデノシンのプリン前駆体およびグアノシンを含む複合体であり、Ｔ細胞有糸分裂誘発を促進する。ツフシンは、免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖中の配列と相同な４アミノ酸ペプチド（Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）であり、主に、マクロファージを刺激する。
【０００９】
生分解性および生体適合性ポリマーから調製された微粒子は、ポリ（ラクチド−グリコシド共重合体）（ＰＬＧ）として公知であり、多数の抗原についての有効なアジュバントであることが示されている。さらに、ＰＬＧ微粒子は、捕捉された抗原の放出速度を制御し得、従って、単一用量ワクチンの可能性を与える。さらに、捕捉された抗原との生分解性ポリマーの投与は、強力な免疫応答を誘導することが、一定範囲の動物モデルにて示されている。Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１９９８、３２、２２５〜２４６およびＳｉｎｇｈら、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．１９９８、３４、２８５〜３０４。
【００１０】
均一なサイズの微小液滴を提供するようにミクロな流体にされた、スクアレン、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ８５TM）、およびポリソルビタン８０（Ｔｗｅｅｎ ８０TM）を含むエマルジョン（すなわち、ＭＦ５９）もまた、強力な免疫応答を誘導することが示されている。ＭＦ５９処方物は、アルミニウム塩アジュバントとともに得られる抗体力価よりも５〜１００倍大きい抗体力価を誘導することが示されている。ＭＦ５９は、多数の供給源（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびマラリアを含む）由来の抗原に対する免疫応答を増強することが示されている。Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、２７７〜２９６頁：Ｓｉｎｇｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９８、１６、１８２２〜１８２７；Ｏｔｔら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９９５、１３、１５５７〜１５６２；Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｍｏｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ、１９９７、Ｆｅｂｕｒｕａｒｙ、６９〜７５；およびＴｒａｑｕｉｎａら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９６、１７４、１１６８〜７５（これらの開示は、本明細書中にその全体が参考として援用される）。ＭＦ５９アジュバントは、サブユニット抗原の免疫原性を改善しつつ、ミョウバンアジュバントの安全性および耐性のプロフィールを維持する。Ｖａｎ Ｎｅｓｔら、Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２、１９９２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、５７〜６２およびＶａｌｅｎｓｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４、１５３、４０２９〜３９（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。ＭＦ５９は、１９９５年５月４日出願の、米国特許出願０８／４３４，５１２に記載され、この出願の開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される。動物研究において、ＭＦ５９は、遺伝子毒性、催奇性であることも、感作を引き起こすことも、見出されなかった。ＭＦ５９の作用機構は、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞の生成（すなわち、Ｔｈ２細胞応答）に依存するようである。しかし、ＭＦ５９アジュバントは、Ｔｈ１応答または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を、ほとんど（あったとしても）惹起しない。
【００１１】
抗原と混合されたＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、強力なＴｈ１免疫応答を誘導することが示された。Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９７、３、８４９〜８５４；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７；Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０、８７０〜８７６；Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９７、１８６、１６２３〜１６３１；Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７、２７、２３４０〜２３４４；ならびにＭｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９８８、１６、１２１６〜１２２４（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、細菌ＤＮＡにおいて比較的一般的であるが、脊椎動物ＤＮＡにおいては、少ない比率で示され、そしてメチル化されている。Ｂｉｒｄ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９８７、３、３４２〜３４７。非メチル化ＣｐＧモチーフを含む細菌ＤＮＡまたは合成ＤＮＡもまた、例えば以下を含む、免疫応答を誘導することが公知である：Ｂ細胞増殖、インターロイキン−６および免疫グロブリンの分泌、およびアポトーシス耐性。Ｋｒｉｅｇら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６〜５４９；Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９６、９３、２８７９〜２８８３；Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、１８４０〜１８４５；Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５６、４５７０〜４５７５；Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１６７、７２〜７８；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８８、７９、８６６〜８７３；Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、２１１６〜２１２２；Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１、１４７、１７５９〜１７６４；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、４９１８〜４９２５；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６、１５７、５３４９〜５４０２；Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０、４７５５〜４７６１；ならびにＹｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８、１６０、５８９８〜５９０６；ＰＣＴ公報ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９およびＷＯ９８／５２５８１（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。しかし、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、殺菌性抗体応答を誘導すると示されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
殺菌性抗体を誘導しかつ研究のための動物における予防処置および治療処置に使用され得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせてアジュバントを含む有効な免疫原性組成物が、非常に所望される。さらに、殺菌性抗体を誘導しかつヒトにおける予防処置および治療処置に使用され得る、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせてアジュバントを含む有効な免疫原性組成物もまた、なお所望される。このような応答は、例えば、髄膜炎菌感染または淋菌感染の処置において、ならびに髄膜炎菌感染または淋菌感染に対して感受性である個体を免疫するために、有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の開示）
・本発明は、以下を提供し得る：
・（項目１） 免疫原性組成物であって、以下：
（ａ）免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原；および
（ｂ）免疫を刺激する量のアジュバント組成物であって、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、組成物、
を含む、組成物。
・（項目２） 項目１に記載の組成物であって、上記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、タンパク質、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、多糖類、およびリポ多糖類からなる群より選択される、組成物。
・（項目３） 項目１〜２のいずれか１項に記載の組成物であって、上記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓにかまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する、組成物。
・（項目４） 項目３に記載の組成物であって、上記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ 血清型Ｂペプチドである、組成物。
・（項目５） 項目４に記載の組成物であって、上記ペプチドが配列番号３１を含む、組成物。
・（項目６） 項目１〜５のいずれか１項に記載の組成物であって、成分（ｂ）がさらに第２のアジュバントを含む、組成物。
・（項目７） 項目６に記載の組成物であって、上記第２のアジュバントが油性液滴エマルジョンを含む、組成物。
・（項目８） 項目７に記載の組成物であって、上記油性液滴エマルジョンが、代謝可能な油および乳化剤を含む、組成物。
・（項目９） 項目８に記載の組成物であって、全くポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックコポリマーの非存在下で存在し、上記油および上記乳化剤が、油性液滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、その油性液滴の実質的にすべてが直径１ミクロン未満である、組成物。
・（項目１０） 項目９に記載の組成物であって、上記油が、動物油、不飽和炭化水素、植物油、またはテルペノイドである、組成物。
・（項目１１） 項目１０に記載の組成物であって、上記テルペノイドがスクアレンである、組成物。
・（項目１２） 項目８〜１１のいずれか１項に記載の組成物であって、水性媒体中に０．５〜２０体積％の上記油を含む、組成物。
・（項目１３） 項目８〜１２のいずれか１項に記載の組成物であって、上記乳化剤が、非イオン性洗剤、あるいはポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、もしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステル、またはソルビタンモノエーテル、ソルビタンジエーテル、もしくはソルビタントリエーテルを含む、組成物。
・（項目１４） 項目８〜１３のいずれか１項に記載の組成物であって、０．０１〜０．５重量％の上記乳化剤を含む、組成物。
・（項目１５） 項目１〜１４のいずれか１項に記載の組成物であって、別個の免疫刺激剤をさらに含む、組成物。
・（項目１６） 項目１５に記載の組成物であって、上記免疫刺激剤が、細菌細胞壁成分およびムラミルペプチドからなる群より選択される、組成物。
・（項目１７） 項目６〜１６のいずれか１項に記載の組成物であって、上記第２のアジュバントが、ミョウバン、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、または完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含む、組成物。
・（項目１８） 項目１〜１７のいずれか１項に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、組成物。
・（項目１９） 項目１〜１８のいずれか１項に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目２０） 項目１〜１９のいずれか１項に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、ＣＧモチーフを含み、当該モチーフが、５’側ですぐに２つのプリンと隣接し、そして３’側ですぐに２つのピリミジンと隣接する、組成物。
・（項目２１） 項目２０に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目２２） 項目１〜２１のいずれか１項に記載の組成物であって、以下のタンパク質：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９７／２８２７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；ならびに／あるいは
・ＧＢ−９９２８１９７．４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント、
のうちの１つ以上をさらに含む、組成物。
・（項目２３） ワクチン組成物であって、以下：
ａ）免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原；および
ｂ）免疫を刺激する量のアジュバント組成物であって、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む、組成物、
を含む、ワクチン組成物。
・（項目２４） 項目２３に記載のワクチン組成物であって、成分（ｂ）が、第２のアジュバントをさらに含む、ワクチン組成物。
・（項目２５） 項目２３または項目２４に記載のワクチン組成物であって、上記ペプチドが配列番号３１を含む、ワクチン組成物。
・（項目２６） 項目２３〜２５のいずれか１項に記載のワクチン組成物であって、項目２〜２１のいずれか１項においてさらに規定されるような、ワクチン組成物。
・（項目２７） アジュバント組成物であって、以下：
ａ）オリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つのＣＧモチーフを含む、オリゴヌクレオチド；および
ｂ）完全フロイントアジュバント、
を含む、組成物。
・（項目２８） 項目２７に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む、組成物。
・（項目２９） 項目２７に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目３０） 項目２７に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドがＣＧモチーフを含み、当該モチーフが、５’側ですぐ２つのプリンと隣接し、そして３’側ですぐ２つのピリミジンと隣接する、組成物。
・（項目３１） 項目３０に記載の組成物であって、上記オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、組成物。
・（項目３２） 宿主動物において免疫応答を刺激する方法であって、当該動物に、免疫応答を誘導するに有効な量の項目１〜２２のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目３３） 項目３２に記載の方法であって、上記宿主動物が哺乳動物である、方法。
・（項目３４） Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して宿主動物を免疫する方法であって、当該動物に、防御応答を誘導するに有効な量の項目２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含する、方法。
・（項目３５） 項目３４に記載の方法であって、上記宿主動物が哺乳動物である、方法。
・（項目３６） 項目３５に記載の方法であって、上記哺乳動物がヒトである、方法。
・（項目３７） Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対して宿主動物を免疫する方法であって、当該動物に、防御応答を誘導するに有効な量の項目２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物を投与する工程を包含し、上記抗原がＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドである、方法。
・（項目３８） 項目３７に記載の方法であって、上記ペプチドが配列番号３１を含む、方法。
・（項目３９） 項目３８に記載の方法であって、上記宿主動物がヒトである、方法。
・（項目４０） 薬剤における使用のための、項目１〜２９のいずれか１項に規定されるような組成物。
・（項目４１） 動物において免疫応答を誘導するための医薬の製造における、項目１〜３１のいずれか１項に規定されるような組成物の使用。
・（項目４２） 項目４１に記載の使用であって、上記組成物が項目１に規定されるような組成物であり、そして上記医薬が動物における防御免疫応答を誘導するためのものである、使用。
・本発明は、少なくとも１つのＣＧモチーフ、および完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含むオリゴヌクレオチドを含む、アジュバント組成物に関する。好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのホスホロチオエート結合を含む。このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７。本発明のいくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ＣＧモチーフを含み、そのＣＧモチーフは、その５’側ですぐに２つのプリンに隣接し、そしてその３’側ですぐに２つのピリミジンに隣接する。本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５。
【００１４】
本発明はまた、免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、および少なくとも１つのＣＧモチーフを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、免疫を刺激する量のアジュバント組成物を含む、免疫原性組成物に関する。好ましくは、このアジュバント組成物は、少なくとも１つのＣＧモチーフを第２のアジュバントとともに含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む。好ましくは、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、以下からなる群より選択される：タンパク質、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、多糖類、およびリポ多糖類。好ましくは、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する。本発明の好ましい実施形態において、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドであり、好ましくは、これは、配列番号３１を含む。本発明のいくつかの実施形態において、このアジュバント組成物は、第２のアジュバント（例えば、ミョウバン、完全フロイントアジュバント、または完全フロイントアジュバントなど）を含む。本発明の他の実施形態において、このアジュバント組成物は、油性液滴エマルジョンを第２のアジュバントとして含み、これは好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含む。好ましくは、この油および乳化剤は、油性液滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、その油性液滴の実質的にすべてが、１ミクロン未満の直径であり、そしてそのエマルジョンは、全くポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーの非存在下で存在する。好ましくは、この油は、動物油または植物油であり、より好ましくは、不飽和炭化水素、より好ましくは、テルペノイド(例えば、スクアレン）である。好ましい実施形態において、この組成物は、０．５〜２０体積％の油を水性媒体中に含む。好ましくは、この乳化剤は、非イオン性洗剤を含む。好ましくは、この乳化剤はポリオキシエチレンソルビタンモノエステル、ポリオキシエチレンソルビタンジエステル、もしくはポリオキシエチレンソルビタントリエステルまたはソルビタンモノエーテル、ソルビタンジエーテル、もしくはソルビタントリエーテルを含む。本発明のいくつかの実施形態において、この組成物は、０．０１〜０．５重量％のこの乳化剤を含む。
【００１５】
本発明の組成物はまた、別個の免疫刺激剤（例えば、細菌細胞壁成分およびムラミルペプチド）も含み得る。本発明の好ましい実施形態において、この組成物は、本明細書中に記載される少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドのいずれかを含む。
【００１６】
本発明はまた、本明細書中に記載されるような、免疫を刺激する量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、および本明細書中に記載されるような、免疫を刺激する量のアジュバント組成物を含む、ワクチンに関し、このアジュバント組成物は、本明細書中に記載されるような、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む。
【００１７】
本発明はまた、宿主動物において免疫応答を刺激する方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書中に記載されるような免疫原性組成物を、免疫応答を誘導するに有効な量で投与する工程を包含する。好ましくは、その宿主動物は、哺乳動物である。
【００１８】
本発明はまた、宿主動物をＮｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して免疫する方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書中に記載されるようなワクチン組成物を、防御応答を誘導するに有効な量で投与する工程を包含する。好ましくは、その宿主動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。
【００１９】
本発明はまた、宿主動物をＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ感染に対して免疫する方法に関し、この方法は、その動物に、本明細書中に記載されるようなワクチン組成物を、防御応答を誘導するに有効な量で投与する工程を包含し、そのワクチン組成物において、抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドであり、好ましくは、配列番号３１を含む。好ましくは、その宿主動物は、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。
【００２０】
本発明の実施は、他のように示さない限り、当業者の範囲内にある、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ−ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照のこと。
【００２１】
本発明は、部分的に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原、アジュバント、および少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを含む免疫原性組成物に関する。本発明の免疫原性組成物は、抗体力価で判断した場合に、ほぼ１０倍その抗原の免疫原性を増加した。驚くべきことに、免疫された動物由来の血清が、ＭｅｎＢ殺菌アッセイにおいて試験された場合に、ＭｅｎＢ細胞を殺傷する能力の２倍の増加が観察された。
【００２２】
本明細書中で使用される場合、句「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらから形成されるキメラをいう。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、句「少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチド」とは、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをいう。少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、複数のＣＧモチーフを含み得る。これらのオリゴヌクレオチドはまた、当該分野における「ＣｐＧ」オリゴヌクレオチドとしても当該分野において公知である。本明細書中で使用される場合、句「ＣＧモチーフ」とは、シトシンヌクレオチドに続いてグアノシンヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドのジヌクレオチド部分をいう。５−メチルシトシンもまた、シトシンの代わりに使用され得る。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、句「油性液滴エマルジョン」とは、代謝可能な油および乳化剤を含むエマルジョンをいう。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、用語「約」とは、その用語が修飾する値の±１０％を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、句「Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原」とは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ細菌に由来する、任意のタンパク質、ペプチド、タンパク質−多糖類、タンパク質−リポ多糖類、ペプチド−多糖類、ペプチド−リポ多糖類、多糖類、またはリポ多糖類を意味する。好ましくは、このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、特異的抗体の形成を刺激し、そして相同抗体とインビボまたはインビトロで特異的に反応し、そして／または細胞性Ｔ細胞応答を刺激する。このＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、任意のＮｅｉｓｓｅｒｉａ種に由来し得るが、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓまたはＮ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅのいずれかに由来する。当業者は、多数のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原を容易に同定し得かつ調製し得る。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」とは、殺菌性免疫応答を誘導し得る、免疫原性組成物を意味する。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、殺菌性抗体応答を惹起する。
【００２８】
本発明によると、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して宿主動物を予防的および／または治療的に、免疫または処置する、組成物および方法が提供される。本発明の方法は、哺乳動物、好ましくはヒトに対して、予防的免疫および治療的免疫を付与するために有用である。本発明の方法はまた、ヒト以外の哺乳動物に対して、生物医学的研究のために、実施され得る。
【００２９】
本発明の１つの実施形態において、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドが、ＣＦＡと混合されて、アジュバント組成物が形成され、このアジュバント組成物は、任意の抗原と使用され得る。少なくとも１つのＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドは、当業者に周知の従来のオリゴヌクレオチド合成を使用して調製され得る。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、改変された骨格（例えば、ホスホロチオエートまたはペプチド核酸）を含み、このオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する。本発明において使用され得るさらなる骨格は、当業者に周知である。さらに、このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約６個と約１００個との間のヌクレオチド、より好ましくは、約８個と約５０個との間のヌクレオチド、最も好ましくは、約１０個と約４０個との間のヌクレオチドを含む。さらに、本発明のオリゴヌクレオチドは、当業者に周知である、糖部分および窒素性塩基部分の置換を含み得る。少なくとも１つのＣＧモチーフを含む好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下に開示される：Ｋｒｉｅｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８，９５，１２６３１−１２６３６、Ｋｌｉｎｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３，２８７９−２８８３、Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９７、９４、１０８３３〜１０８３７、Ｃｈｕら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９７，１８６，１６２３−１６３１、Ｂｒａｚｏｌｏｔ−Ｍｉｌｌａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５５３〜１５５５８、Ｂａｌｌａｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、１８４０〜１８４５、Ｃｏｗｄｅｒｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５６、４５７０〜４５７５、Ｈａｌｐｅｒｎら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１６７、７２〜７８、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，１９８８，７９，８６６〜８７３、Ｓｔａｃｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２１１６〜２１２２、Ｍｅｓｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７，１７５９−１７６４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７．４９１８〜４９２５、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９６，１５７，５３９４−５４０２、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、４７５５〜４７６１、Ｒｏｍａｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９９７，３，８４９−８５４、Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１６０、８７０〜８７６、Ｌｉｐｆｏｒｄら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９７，２７，２３４０−２３４４、Ｍｏｌｄｏｖｅａｎｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９８８、１６、１２１６〜１２２４、Ｙｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９８，１６０，５８９８−５９０６、ＰＣＴ公報ＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ ９８／１６２４７、ＷＯ９８／１８８１０、ＷＯ９８／４０１００、ＷＯ９８／５５４９５、ＷＯ９８／３７９１９、ＷＯ９８／５２５８１（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）。本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣＧモチーフを含むが、複数のＣＧモチーフを含み得ることが、理解されるべきである。
【００３０】
好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、以下のヌクレオチド配列を含む：ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ（配列番号１）、ａｔａａｔｃｇａｃｇｔｔｃａａｇｃａａｇ（配列番号２）、ｇｇｇｇｔｃａａｃｇｔｔｇａｇｇｇｇｇｇ（配列番号３）、ｔｃｔｃｃｃａｇｃｇｔｇｃｇｃｃａｔ（配列番号４）、ｇａｇａａｃｇｃｔｃｇａｃｃｔｔｃｇａｔ（配列番号５）、ｔｃｃａｔｇｔｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ（配列番号６）、ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｔｇｃｔ（配列番号７）、ｇｃｔａｇａｃｇｔｔａｇｃｇｔ（配列番号８）、ａｔｃｇａｃｔｃｔｃｇａｇｃｇｔｔｃｔｃ（配列番号９）、ｇａａｃｃｔｔｃｃａｔｇｃｔｇｔｔｃｃｇ（配列番号１０）、ｇｃｔａｇａｔｇｔｔａｇｃｇｔ（配列番号１１）、ｔｃａａｃｇｔｔ（配列番号１２）、ｇｃａａｃｇｔｔ（配列番号１３）、ｔｃｇａｃｇｔｃ（配列番号１４）、ｔｃａｇｃｇｃｔ（配列番号１５）、ｔｃａａｃｇｃｔ（配列番号１６）、ｔｃａｔｃｇａｔ（配列番号１７）、ｔｃｔｔｃｇａａ（配列番号１８）、ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔｃｇａｇａｔｇａ（配列番号１９）、ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔａｇｃｇａｔｇａ（配列番号２０）、ｔｇａｃｔｇｔｇａａｃｇｔｔａｇａｇｃｇｇａ（配列番号２１）、ｇｔｔｔｇｃｇｃａａｃｇｔｔｇｔｔｇｃｃａｔ（配列番号２２）、ａｔｇｇｃａａｃａａｃｇｔｔｇｃｇｃａａａｃ（配列番号２３）、ｃａｔｔｇｇａａａａｃｇｔｔｃｔｔｃｇｇｇｇ（配列番号２４）、ｃｃｃｃｇａａｇａａｃｇｔｔｔｔｃｃａａｔｇ（配列番号２５）、ａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔ（配列番号２６）、およびｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔ（配列番号２７）。本発明の好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、ＣＧモチーフを含み、このモチーフは、その５’側で２つのプリンに隣接し、そしてその３’側で２つのピリミジンに隣接する。しかし、ＣＧモチーフを含む任意のオリゴヌクレオチドが、そのオリゴヌクレオチドが免疫応答の増加を誘導する限り、本発明において使用され得ることが理解されるべきである。
【００３１】
本発明はまた、上記のような少なくとも１つのＣＧオリゴヌクレオチド、およびアジュバントを少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせて含む、免疫原性組成物に関する。本発明のいくつかの実施形態において、このアジュバントは、ミョウバン、完全フロイントアジュバント、または不完全フロイントアジュバントである。本発明の他の実施形態において、このアジュバントは、免疫原性の量の油性液滴エマルジョンを含む。このアジュバント組成物は、免疫原性組成物において使用される抗原とアジュバントを混合する前に、下記の成分から一般的に調製される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態において、その抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅに由来する。本発明の他の実施形態において、その抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに由来する。好ましくは、その抗原は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ Ｂ群ペプチドである。好ましくは、そのペプチドのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、（配列番号３０）および（配列番号３１）を含む。しかし、任意のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、本発明において使用され得る。さらなるＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原は、下記に、実施例において記載される。さらに、本発明のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原として役立ち得るペプチドは、以下の同時係属中の出願に開示される：米国特許出願番号６０／０８３７５８、６０／０９４６８９、６０／０９８、９９４、６０／１０３、７４９、６０／１０３、７９４、６０／０９９、０６２、６０／１２１、５２８および６０／１０３、７９６、そしてＷＯ９９／２４５７８、ＷＯ９９／３６５４４およびＷＯ９９／５７２８０（これらの開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される）。単一または複数の、保存的アミノ酸置換が、本発明の抗原の免疫原性を変化することを伴ってなされ得ることが、理解されるべきである。さらに、細菌株におけるバリエーションもまた、本明細書中に開示されるヌクレオチド配列およびアミノ酸排列内に包含される。例えば、いくつかの株は、アミノ酸１１位においてＣではなくＹを、４８位にてＤではなくＡを、５５位にてＧではなくＡを、２０７位にてＲではなくＱを、３１２位にてＳではなくＡを、３３８位にてＡではなくＴを、そして３４１位にてＳではなくＧを含み得る。
【００３３】
抗原は、調製後にアジュバント組成物に添加され得る。この抗原およびエマルジョンは、振盪により混合され得る。ＣＦＡおよびＩＦＡを使用する場合、ＰＢＳ中の抗原が、等量のＣＦＡまたはＩＦＡのいずれかと混合され得る。その混合物は、濃いエマルジョンが達成されるまで、皮下注射針を通すことによって、乳化され得る。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態において、免疫を刺激する量の、少なくとも１つのＣＧモチーフを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、および少なくとも１つのＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原が、油性液滴エマルジョンを含むアジュバントと混合される。この油性液滴エマルジョンは、好ましくは、代謝可能な油および乳化剤を含み、この油および乳化剤は、油性液滴を有する水中油エマルジョンの形態で存在し、この液滴の実質的にすべては、直径が１ミクロン未満である。このような液滴は、油性液滴が本発明により提供されるものより有意に大きい油および乳化剤を含むアジュバント組成物に対して、驚くべき優位性を示す。
【００３５】
本発明の個々の成分は、両方とも一般的にそして好ましい実施形態においていくらか詳細に、下記に示されるが、当該分野で周知であり、そして本明細書中で使用される用語、例えば、代謝可能な油、乳化剤、免疫刺激剤、ムラミルペプチド、および脂肪親和性ムラミルペプチドは、これらの化合物を記載することが、さらなる説明なしに、当業者に十分に周知である。
【００３６】
これらの組成物の１つの成分は、代謝可能な、非毒性の油であり、好ましくは、６〜３０個の炭素原子であり、アルカン、アルケン、アルキン、およびそれらの対応する酸およびアルコール、それらのエーテルおよびエステル、ならびにそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。この油は、任意の植物油、魚油、動物油、または合成して調製された油であり得、それらは、免疫原性組成物が投与される宿主動物の身体により代謝され得、そしてその被検体に対して非毒性である。その宿主動物は、代表的には、哺乳動物であり、そして好ましくはヒトである。鉱物油および類似の毒性石油留出油は、本発明から明らかに除外される。
【００３７】
本発明の油成分はまた、任意の長鎖のアルカン、アルケン、またはアルキン、あるいはそれらの酸またはアルコール誘導体であり得、遊離酸としてか、その塩としてか、またはエステル（例えば、モノエステル、またはジエステル、またはトリエステル（例えば、トリグリセリドおよび１，２−プロパンジオールまたは類似のポリヒドロキシアルコールのエステル））としてかのいずれかであり得る。アルコールは、アミノ官能化酸またはポリ官能化酸（ａｍｉｎｏ− ｏｒ ｐｏｌｙ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｃｉｄ）（例えば、酢酸、プロピオン酸、クエン酸など）を使用してアシル化され得る。油でありかつ本明細書中に示される他の基準を満たす長さアルコールから誘導されたエーテルもまた、使用され得る。
【００３８】
この個々のアルカン、アルケン、またはアルキンの部分、およびその酸誘導体またはアルコール誘導体は、一般的に、約６〜約３０個の炭素原子を有する。この部分は、直鎖構造または分子鎖構造を有し得る。その部分は、完全に飽和していてもよいし、あるいは１つ以上の二重結合または三重結合を有してもよい。モノエステルまたはポリエステルまたはエーテルベースの油が使用される場合、約６〜約３０個の炭素という限定が、その個々の脂肪酸部分または脂肪アルコール部分に適用され、全体の炭素数には適用されない。
【００３９】
任意の代謝可能な油（特に、動物供給源、魚供給源または植物供給源由来）が、本明細書中で使用され得る。その油が、投与される宿主により代謝されることが必須であり、さもなければ、その油の成分が、膿瘍、肉芽種または癌腫さえ引き起こし得るか、または（獣医学の実施にて使用される場合）その油の成分が、代謝されない油が消費者に対して有し得る有害な効果に起因して、ワクチンされたトリおよび動物の肉をヒトでの消費のために受容不可能にし得る。
【００４０】
植物油の例示的供給源としては、堅果、種子、および穀物が挙げられる。ラッカセイ油、ダイズ油、ココナッツ油、およびオリーブ油であり、堅果油が最も一般的に利用可能であることを示す。種子油としては、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などが、挙げられる。穀物群においては、トウモロコシ油が、最も容易に利用可能であるが、他の穀物（例えば、コムギ、オーツ麦、ライ麦、イネ、テフ、ライコムギなど）の油もまた、使用され得る。
【００４１】
植物油を入手するための技術は、十分に発達しており、かつ周知である。これらの油および他の類似の油の組成は、例えば、Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ、ならびに食物、栄養および食物技術に関する原資料にて見出され得る。
【００４２】
グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０個の炭素脂肪酸のエステル（種子油に天然には存在しないが）が、堅果油および種子油から開始する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化によって調製され得る。これらの産物は、ＰＶＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，４１６ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｂｏｏｎｇｏｎ，ＮＪなどから、名称ＮＥＯＢＥＥ（登録商標）の下で市販されている。
【００４３】
任意の動物供給源由来の油もまた、本発明の免疫原性組成物に用いられ得る。動物油および動物脂肪は、通常、それらがトリグリセリドとして存在し、そして魚類または植物由来の油よりも高い飽和度を有するという事実に起因して体温で固体である。しかし、脂肪酸は、遊離脂肪酸を提供する、部分的または完全なトリグリセリドのけん化によって動物脂肪から入手可能である。哺乳動物のミルク由来の脂肪および油は、代謝可能であり、従って、本発明の実施に使用され得る。動物供給源から分離、精製、けん化および純粋な油を得るために必要な他の手段についての手順は、当該分野において周知である。
【００４４】
ほとんどの魚類は、容易に回収され得る代謝可能な油を含む。例えば、タラ肝油、サメ肝油、およびクジラ油（例えば、鯨蝋）が、本明細書中に使用され得るいくつかの魚油の例である。多くの分岐鎖油が、５個の炭素のイソプレン単位において生化学的に合成され、そして一般に、テルペノイドといわれる。サメ肝油は、スクアレンとして公知の分岐した不飽和のテルペノイド（２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン）（これは、本明細書中で特に好ましい）を含む。スクアラン（ｓｑｕａｌａｎｅ）（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、特に好ましい油である。魚油（スクアレンおよびスクアランを含む）は、市販の供給元から容易に入手可能であるか、または当該分野において公知の方法によって得られ得る。
【００４５】
これらの免疫原性組成物の油成分は、約０．５体積％〜約２０体積％、ただし好ましくは約１５％以下の量において、特に約１％〜約１２％の量において存在する。約１％〜約４％の油を使用することが、最も好ましい。
【００４６】
これらの免疫原性組成物の水性部分は、好ましくは緩衝化生理食塩水であるか、またはより好ましくは不純物が混入していない水である。これらの組成物は非経口投与が意図されるので、組成物と生理学的流体との間の示差的イオン濃度のために、組成物の投与後の膨張または迅速な吸収を予防するために、張度（すなわち、重量オスモル濃度）が通常の生理学的流体と本質的に同じであるように、免疫原性組成物として使用される最終緩衝化溶液を作製することが好ましい。通常の生理学的条件と適合するｐＨを維持するために、生理学的食塩水を緩衝化することもまた、好ましい。また、特定の例において、特定の組成物成分（例えば、糖ペプチド）の安定性を保証するために、特定のレベルにｐＨを維持することが、必要であり得る。
【００４７】
任意の生理学的に受容可能な緩衝液が、本明細書中で使用され得るが、リン酸緩衝液が好ましい。他の受容可能な緩衝液（例えば、酢酸塩、トリス（ｔｒｉｓ）、炭酸水素塩、炭酸塩など）が、リン酸緩衝液に対する代替物として使用され得る。水性成分のｐＨは、好ましくは、約６．０〜８．０の間である。
【００４８】
しかし、免疫原性組成物が最初に調製される場合、不純物が混入していない水が、エマルジョンの水性成分として好ましい。塩濃度を増加させると、所望の小さな液滴サイズを達成することがより困難になる。最終免疫原性組成物が、油液滴アジュバントから調製される場合、抗原性物質が、緩衝液に適切な重量オスモル濃度にて加えられて、所望の免疫原性組成物を提供し得る。
【００４９】
これらの組成物に用いられる水性成分の量は、組成物の値を単一にするに必要な量である。すなわち、１００％になるに十分な水性成分の量が、組成物を容量調整にするために、上記の他の成分とともに混合される。
【００５０】
かなりの乳化剤または懸濁剤が、一般に、薬学科学において使用され得る。乳化剤は、本明細書中で使用される場合、代謝可能な油ではない。乳化剤としては、天然に由来する物質（樹木由来のゴム）、植物性タンパク質、糖ベースのポリマー（例えば、アルギネートおよびセルロース）などが挙げられる。炭素骨格上に水酸化物または他の親水性置換基を有する、特定のオキシポリマーまたはポリマー（例えば、ポビドン、ポリビニルアルコール、およびグルコールエーテルベースの一官能基および多官能基化合物）は、界面活性剤活性を有する。長鎖脂肪酸由来の化合物は、本発明に使用され得る乳化剤および懸濁剤の実質的に第３の群を形成する。任意の前述の界面活性剤は、それらが非毒性である限り有用である。
【００５１】
本発明に従って使用され得る適切な乳化剤（界面活性剤または洗剤ともいわれる）の特定の例は、以下を含む：
１．水溶性石けん（例えば、高級脂肪酸（Ｃ10〜Ｃ22）のナトリウム、カリウム、アンモニウムおよびアルカノールアンモニウム塩、ならびに特に、ナトリウムおよびカリウムの獣脂およびココナツ石けん）。
【００５２】
２．陰イオン性合成非石けん洗剤（これは、約８〜２２個の炭素原子を含むアルキルラジカルをそれらの分子構造において有する有機硫酸反応生成物の水溶性塩によって示され得、そしてラジカルは、硫酸および硫酸エステルラジカルからなる群より選択される）。これらの例は、以下である：獣脂またはココナツ油から誘導されるアルキル硫酸ナトリウムまたはカリウム；アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムまたはカリウム；アルキルグリセリルエーテルスルホン酸ナトリウム；ココナツ油脂肪酸モノグリセリドのスルホン酸ナトリウムおよび硫酸ナトリウム；１モルの高級脂肪アルコールと約１〜６モルのエチレンオキシドとの反応生成物の硫酸エステルのナトリウムまたはカリウム塩；１分子あたり１〜１０単位のエチレンオキシドを有し、その中でアルキルラジカルが８〜１２個の炭素原子を含む、アルキルフェノールエチレンオキシドエーテルスルホン酸ナトリウムまたはカリウム；イセチオン酸でエステル化され、そして水酸化ナトリウムで中和された、脂肪酸の反応生成物；メチルタウリド（ｔａｕｒｉｄｅ）の脂肪酸アミドでのナトリウムまたはカリウム塩；ならびにＳＯ3−スルホン酸化Ｃ10〜Ｃ24α−オレフィンのナトリウムおよびカリウム塩。
【００５３】
３．有機疎水性化合物とのアルキレンオキシド基の縮合によって作製された非イオン性合成洗剤。代表的な疎水性基としては、プロピレングリコールとのプロピレンオキシドの縮合生成物、アルキルフェノール、エチレンジアミンとのプロピレンオキシドの縮合生成物、８〜２２個の炭素原子を有する脂肪族アルコール、ならびに脂肪酸のアミドが挙げられる。
【００５４】
４．非イオン性洗剤（例えば、半極性の特徴を有する、アミンオキシド、ホスフィンオキシドおよびスルホキシド）。長鎖３級アミンオキシドの特定の例としては、ジメチルドデシルアミンオキシドおよびビス（２−ヒドロキシエチル）ドデシルアミンが挙げられる。ホスフィンオキシドの特定の例は、米国特許第３．３０４，２６３号（１９６７年２月１４日発行）に見出され、そしてジメチルドデシルホスフィンオキシドおよびジメチル−（２−ヒドロキシドデシル）ホスフィンオキシドが挙げられる。
【００５５】
５．長鎖スルホキシド（式Ｒ1−ＳＯ−Ｒ2であって、ここでＲ1およびＲ2が、置換または非置換アルキルラジカルであり、前者が、約１０〜約２８個の炭素原子を含み、一方、Ｒ2が、約１〜３個の炭素原子を含む、長鎖スルホキシドを含む）。これらのスルホキシドの特定の例としては、ドデシルメチルスルホキシドおよび３−ヒドロキシトリデシルメチルスルホキシドが挙げられる。
【００５６】
６．両性合成洗剤（例えば、３−ドデシルアミノプロピオン酸ナトリウムおよび３−ドデシルアミノプロピオンスルホン酸ナトリウム）。
【００５７】
７．両性イオン性合成洗剤（例えば、３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）プロパン−１−スルホネートおよび３−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヘキサデシルアンモニオ）２ヒドロキシプロパン−１−スルホネート）。
【００５８】
さらに、以下の型の乳化剤の全てが、本発明の組成物に使用され得る：（ａ）脂肪酸、ロジン酸（ｒｏｓｉｎ ａｃｉｄ）およびトール油（ｔａｌｌ ｏｉｌ）の石けん（すなわち、アルカリ塩）；（ｂ）アルキルアレーンスルホネート；（ｃ）スルホン酸アルキル（分岐鎖および直鎖の両方の疎水性基、ならびに一級および二級の硫酸基を有する界面活性剤を含む）；（ｄ）疎水性基と親水性基との間の中間結合を含むサルフェートおよびスルホネート（例えば、脂肪酸アシル化メチルタウリドおよび硫酸化脂肪モノグリセリド）（ｅ）ポリエチレングリコールの長鎖酸エステル、特にトール油エステル；（ｆ）アルキルフェノールのポリエチレングリコールエーテル；（ｇ）長鎖アルコールおよびメルカプタンのポリエチレングリコールエーテル；ならびに（ｈ）脂肪アシルジエタノールアミド。界面活性剤は、１つより多くの様式で分類され得るので、この段落に示される界面活性剤の多数のクラスが、以前に記載された界面活性剤のクラスと重複する。
【００５９】
生物学的状況のために特異的に設計されかつ一般的に使用される多くの乳化剤が、存在する。例えば、多くの生物学的洗剤（界面活性剤）がそれ自体、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙの１９８７ Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓの３１０〜３１６頁に列挙されている。このような界面活性剤は、４つの基本的な型（陰イオン性、陽イオン性、両性イオン性、非イオン性）に分けられる。陰イオン性洗剤の例としては、アルギン酸、カプリル酸、コール酸、１−デカンスルホン酸、デオキシコール酸、１−ドデカンスルホン酸、Ｎ−ラウロイルサルコシン、およびタウロコール酸が挙げられる。陽イオン性洗剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンズアルコニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、メチルベンズエトニウムクロリド、および４−ピコリンドデシルサルフェートが挙げられる。両性イオン性洗剤の例としては、３−［（３−コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（一般に、ＣＨＡＰＳと略される）、３−［（コールアミドプロピル）−ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（一般に、ＣＨＡＰＳＯと略される）、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート、およびｌｙｓｏ−α−ホスファチジルコリンが挙げられる。非イオン性洗剤の例としては、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノシド、脂肪アルコールのエチレンオキシド縮合物（例えば、商標名Ｌｕｂｒｏｌの下で販売）、脂肪酸（特に、Ｃ12〜Ｃ20脂肪酸）のポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、商標名Ｔｗｅｅｎの下で販売）、ならびにソルビタン脂肪酸エーテル（例えば、商標名Ｓｐａｎの下で販売）が挙げられる。
【００６０】
界面活性剤の特に有用な群は、ソルビタンベースの非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、ソルビトールの脱水によって調製され、１．４−ソルビタンを生じ、次いでこれは、１当量以上の脂肪酸と反応される。脂肪酸で置換された部分はさらに、エチレンオキシドと反応されて、界面活性剤の第２の群を生じ得る。
【００６１】
脂肪酸で置換されたソルビタン界面活性剤は、１，４−ソルビタンと脂肪酸（例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸または同様の長鎖脂肪酸）とを反応させることによって作製されて、１，４−ソルビタンモノエステル、１，ｇ−ソルビタンセスキエステルまたは１，４−ソルビタントリエステルを生じる。これらの界面活性剤についての一般名としては、例えば、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレート、およびソルビタントリオエレートが挙げられる。これらの界面活性剤は、通常、種々の一置換、二置換および三置換ソルビタンの間を区別する文字または番号の命名を用いて、ＳＰＡＮ（登録商標）またはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の名前の下で市販されている。
【００６２】
ＳＰＡＮ（登録商標）およびＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）の界面活性剤は、親水性であり、そして一般に、油に可溶性であるか、または分散可能である。それらはまた、ほとんどの有機溶媒に可溶性である。水中で、それらは、一般に、不溶性であるが分散可能である。一般に、これらの界面活性剤は、１．８〜８．６の間の親水性−疎水性バランス（ＨＬＢ）数を有する。このような界面活性剤は、当該分野において公知の手段によって容易に作製され得るか、または例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥから登録印ＡＴＬＡＳ（登録商標）の下で市販されている。
【００６３】
界面活性剤の関連する群としては、ポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステルが挙げられる。これらの物質は、１，４−ソルビタンモノエステルまたはトリエステルにエチレンオキシドを添加することによって調製され得る。ポリオキシエチレンの添加は、脂溶性ソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤を、一般に水中で分散可能な油に溶解性でありかつ有機液体に種々の程度に溶解性である、親水性界面活性剤に変換する。
【００６４】
商標ＴＷＥＥＮ（登録商標）の下で市販されているこれらの物質は、水中油エマルジョンおよび分散剤を調製するために、または油を可溶化するために、ならびに水溶性または洗浄性の無水軟膏を作製するために有用である。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、関連するソルビタンモノエステルまたはトリエステル界面活性剤と組み合わされて、エマルジョンの安定性を促進し得る。ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤は、一般に、９．６〜１６．７の間に入るＨＬＢ値を有する。
【００６５】
単独でまたはＳＰＡＮ（登録商標）、ＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）およびＴＷＥＥＮ（登録商標）の界面活性剤と組み合わされて使用され得る非イオン性界面活性剤の第３の群は、エチレンオキシドと長鎖脂肪酸との反応によって作製されるポリオキシエチレン脂肪酸である。この型の最も一般的に利用可能な界面活性剤は、名称ＭＹＲＪ（登録商標）の下で販売されており、そしてステアリン酸のポリオキシエチレン誘導体である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤のように親水性かつ可溶性であるかまたは分散可能である。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤と、またはＴＷＥＥＮ（登録商標）／ＳＰＡＮ（登録商標）と、もしくはＡＲＬＡＣＥＬ（登録商標）界面活性剤混合物と、エマルジョンを形成する使用のために混和され得る。ＭＹＲＪ（登録商標）界面活性剤は、当該分野において公知の方法によって作製され得るか、またはＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．から市販されている。
【００６６】
ポリオキシエチレンベースの非イオン性界面活性剤の第４の群は、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪酸エーテルである。これらの物質は、エチレンオキシドを脂肪アルコールに添加することによって上記のように調製される。これらの界面活性剤についての市販名は、ＢＲＩＪ（登録商標）である。ＢＲＩＪ（登録商標）界面活性剤は、界面活性剤中のポリオキシエチレン部分のサイズに依存して親水性または脂溶性であり得る。これらの化合物の調製物は技術水準から入手可能であり、一方、それらはまた、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ
Ｉｎｃ．のような市販の供給源から容易に入手可能である。
【００６７】
本発明の実施に潜在的に使用され得る他の非イオン性界面活性剤は、例えば、以下である：ポリオキシエチレン、ポリオール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシプロピレン脂肪エーテル、ポリオキシエチレンを含むみつろう誘導体、ポリオキシエチレンラノリン誘導体、ポリオキシエチレン脂肪グリセリド、グリセロール脂肪酸エステル、または他のポリオキシエチレン酸アルコール、または１２〜２２個の炭素原子の長鎖脂肪酸のエーテル誘導体。
【００６８】
本発明の免疫原性組成物は多相系であることが意図されるので、約７〜１６の範囲のＨＬＢ値を有するエマルジョン形成非イオン性界面活性剤を選択することが好ましい。この値は、単一の非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤）の使用を通して得られ得るか、あるいは例えば、ソルビタンモノエステル、ジエステルもしくはトリエステルベースの界面活性剤；ソルビタンエステルポリオキシエチレン脂肪酸；ポリオキシエチレンラノリン誘導体化界面活性剤と組み合わされたソルビタンエステル；高いＨＬＢのポリオキシエチレン脂肪エーテル界面活性剤と組み合わせたソルビタンエステル界面活性剤；またはポリエチレン脂肪エーテル界面活性剤もしくはポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸と、界面活性剤との混和物の使用によって達成され得る。
【００６９】
単一の非イオン性界面活性剤、最も詳細にはＴＷＥＥＮ（登録商標）界面活性剤を、本発明の実施においてエマルジョン安定化非イオン性界面活性剤として使用することがより好ましい。ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０という名称の界面活性剤（それ以外では、ポリオキシエチレン２０ソルビタンモノオレートについてのポリソルベート８０として公知）が、前述の界面活性剤のうち最も好ましい。
【００７０】
十分な液滴サイズの減少は、通常、０．０２重量％〜２．５重量％（ｗ／ｗ）の量で存在する界面活性剤を含めることによってもたらされ得る。０．０５％〜１％の量が好ましく、ここで０．０１〜０．５％が特に好ましい。
【００７１】
本発明の液滴サイズが到達する様式は、本発明の実施に重要ではない。ミクロン未満の油性液滴が得られ得る１つの様式は、商業的な乳化器（例えば、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡから入手可能なモデル番号１１０Ｙ）の使用によってである。他の商業的な乳化器の例としては、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，Ｉｎｃ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）が挙げられる。これらの乳化器は、高圧下で小さな開口部を通して流体を押し込むことによって開発された高剪断力の原理によって作動する。モデル１１０Ｙが、５，０００〜３０，０００ｐｓｉで作動される場合、１００〜７５０ｎｍの直径を有する油性液滴が、提供される。
【００７２】
油性液滴のサイズは、油に対する洗剤の比率（比率を増加させると、液滴のサイズが減少する）、作動圧力（作動圧力を増加させると、液滴のサイズが減少する）、温度（温度を増加させると、液滴のサイズが減少する）を変化させることによって、および両親媒性免疫刺激剤を加えること（このような因子を加えると、液滴のサイズが減少する）によって変動され得る。実際の液滴サイズは、特定の洗剤、油、および免疫刺激剤（もしあれば）、ならびに選択される特定の作動条件により変動する。液滴のサイズは、サイズ測定（ｓｉｚｉｎｇ）機器（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｉｏｎにより製造される、商業的なＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎ４ＭＤ）の使用によって検証され得、そしてパラメータは、実質的に全ての液滴が直径１ミクロン未満、好ましくは直径０．８ミクロン未満、および最も好ましくは直径０．５ミクロン未満であるまで、上記の指針を使用して変動され得る。実質的に全てとは、少なくとも約８０％（数による）、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８％を意味する。粒子サイズの分布は、代表的には、Ｇａｕｓｓｉａｎであり、その結果、平均直径は、上記の限界よりも小さい。
【００７３】
本発明は、満足のいく免疫原性のためにミクロン未満のエマルジョンで使用され得る先行技術において以前に教示された他の成分（すなわち、ポリオキシロピレン（ｐｏｌｙｏｘｙｌｒｏｐｙｌｅｎｅ）−ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、米国特許第４，７７２，４６６号および同第４，７７０，８７４号ならびにＥＰ−Ａ２−０３１５１５３におけるアジュバントを用いる使用について記載されるもの））の非存在下で油性エマルジョンを調製することによって実施され得る。
【００７４】
本発明の免疫原性組成物は、ＰＯＰ−ＰＯＥコポリマー以外の代謝可能な水中油の乳化剤を含む。乳化剤は、任意の特定の免疫刺激活性を有する必要がない。なぜなら、油性組成物はそれ自体、油性液滴がミクロン未満の範囲にある場合に、アジュバントとして機能し得るからである。しかし、免疫刺激活性の増加は、組成物中に任意の既知の免疫刺激剤を含めることによって提供され得る。これらの免疫刺激剤は、乳化剤および油または免疫刺激剤から分離され得るかのいずれかであり、そしてこの乳化剤は、１つでありかつ同じ分子であり得る。前者の状況の例としては、殺滅されたミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびその細胞性成分と混合された代謝可能な油が挙げられる。さらなる免疫刺激物質としては、このような細菌の細胞壁の成分であるムラミルペプチドが挙げられ、そしてその誘導体が挙げられる。関節乳化剤／免疫刺激剤の例は、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９８８，１４１，１７２０〜１７２７（この開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される）に記載される脂溶性ムラミルペプチドである。これらの物質としては、免疫刺激群である塩基性Ｎ−アセチルムラミルペプチド（親水性部分）が挙げられるが、得られた化合物に表面活性特性を提供する脂溶性部分もまた挙げられる。このような化合物、および他の型の両親媒性免疫刺激物質は、免疫刺激剤および乳化剤の両方として作用し、そして本発明の実施に好ましい。さらに、両親媒性ではない第２の免疫刺激物質と組み合わせて、両親媒性免疫刺激物質を使用することによって本発明を実施することもまた、可能である。例は、本質的に非置換（すなわち、本質的に親水性）のムラミルジペプチドと組み合わせた、脂溶性ムラミルペプチドの使用である。
【００７５】
好ましい油性液滴エマルジョンは、ＭＦ５９である。ＭＦ５９は、例えば、Ｏｔｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ Ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９５，Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２７７〜２９６頁；Ｓｉｎｇｈら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９８，１６，１８２２〜１８２７；Ｏｔｔら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９５，１３，１５５７〜１５６２；ならびにＶａｌｅｎｓｉら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，１５３，４０２９〜３９（これらの開示は、それらの全体において本明細書中に参考として援用される）に記載される手順に従って作製され得る。
【００７６】
動物は、腹腔、筋肉内または皮下の経路によって、種々のアジュバント／免疫原性組成物を投与され得る。
【００７７】
本発明の免疫原性組成物の組成は、有効量の抗原を用いる。すなわち、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａにその後に曝されることから被験体を保護するために、被験体が特異的かつ十分な免疫学的応答、好ましくはＴリンパ球応答を生成する量の抗原を、アジュバントと組み合わせて含む。
【００７８】
本発明に用いられ得る各々のかつ全ての抗原に関する詳細な指針を提供する単回用量の指定は、割り当てられ得ない。有効量の抗原は、その固有の活性および純度の関数であり、そして慣用的な実験を通じて、当業者に経験的に決定される。本発明のアジュバント組成物は、細胞全体またはウイルス全体の免疫原性組成物、および組換えＤＮＡ技術または合成により調製された精製抗原またはタンパク質サブユニットもしくはペプチド免疫原性組成物と組み合わせて使用され得ることが意図される。本発明のアジュバント組成物は、安定であることから、抗原およびエマルジョンは、単に振盪することによって混合され得る。他の技術（例えば、アジュバントおよび抗原の溶液または懸濁液の混合物を、小さな開口部（例えば、皮下針）に迅速に通すこと）は、有用な免疫原性組成物を容易に提供する。
【００７９】
本発明に従うアジュバントおよび免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラムの核酸、好ましくはＤＮＡ（例えば、ＣＧオリゴヌクレオチドなど）を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１〜約３５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムの核酸を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１００マイクログラムの核酸を含む。当業者は、任意の所望の量の核酸を含む免疫原性組成物を容易に処方し得る。本発明に従う免疫原性組成物は、無菌かつ発熱性物質陰性で提供される。免疫原性組成物は、単位投薬形態において従来通りに投与され得、そして薬学分野において周知の任意の方法（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０に記載される）（この開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される）によって調製され得る。
【００８０】
本発明に従う免疫原性組成物は、免疫刺激量のＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原を含む。免疫刺激量は、測定可能な体液性または細胞性免疫応答を誘導するに十分な量である。例えば、本発明の免疫原性組成物は、約１ナノグラム〜約１０００マイクログラムの抗原または約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムの抗原を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムの抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１〜約３５０マイクログラムの抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約２５〜約２５０マイクログラムの抗原を含む。いくつかの好ましい実施形態において、免疫原性組成物は、約１００マイクログラムの抗原を含む。当業者は、慣用的な実験を通じて当業者により経験的に決定され得る、任意の所望の量の抗原を含む免疫原性組成物を容易に処方する。免疫原性組成物は、単位投薬形態において従来通りに投与され得、そして例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９８０）（この開示は、その全体において本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。
【００８１】
本発明はまた、本明細書中に記載されるようなＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原と組み合わせて、本明細書中に記載されるようなＣＧオリゴヌクレオチドとともに、本明細書中に記載されるようなアジュバントを含むワクチン組成物に関する。このようなワクチン組成物（例えば、実施例に示されるワクチン組成物）は、殺菌性である体液性免疫応答を誘発する。
【００８２】
本発明はまた、宿主動物において免疫応答を刺激する方法に関する。この方法は、免疫応答を誘導するに有効な量において上記の免疫原性組成物を動物に投与する工程を包含する。この宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。投与に好ましい経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口、ならびに経皮または吸入もしくは坐剤による経路が挙げられるがこれらに限定されない。最も好ましい投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下の注射が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態に従うと、免疫原性組成物は、無針注射デバイス（これは周知であり、そして広範に利用可能である）を使用して、宿主動物に投与される。当業者は、本明細書中の教示に従って、無針注射デバイスを使用して、個体の細胞に免疫原性組成物を送達し得る。
【００８３】
本発明はまた、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ感染に対して宿主動物を免疫する方法またはＮｅｉｓｓｅｒｉａに感染した宿主動物を処置する方法に関する。この方法は、防御応答を誘導するに有効な量において、本明細書中に記載される免疫原性組成物またはワクチン組成物を動物に投与する工程を包含する。宿主動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはヒトである。好ましい投与経路は、本明細書中に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
（発明を実施するための様式）
本発明はさらに、本発明を明解にすることが意図される以下の実施例によって例示される。前述の例は、本発明を例示することを意味し、そして本発明をいかなる様式にも限定すると解釈されるべきではない。当業者は、本発明の精神および範囲内にある改変を認識する。
【実施例】
【００８５】
（実施例１：アジュバント組成物の調製）
ＭＴＰ−ＰＥは、ＣＩＢＡ−ＧＥＩＧＹ（Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供された。スクアレンおよびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。ＣＦＡおよびＩＦＡを、Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手した。水酸化アンモニウム（Ｒｅｈｓｏｒｐｔａｒ）を、Ｒｅｈｅｉｓ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ ＮＪ）から入手した。
【００８６】
油性液滴エマルジョンの調製物を、多くの方法によって作製した。第１の方法において、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の４％スクアレン、０．００８％ ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、２５０μｇ／ｍｌ ＭＴＰ−ＰＥおよび抗原からなる混合物を、２３ゲージの針に６回通した。このエマルジョンは、１０ミクロンの範囲内の油性液滴サイズからなり、そしてＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯと呼ばれる。第２の方法は、上記の混合物を、Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化器に５回通す工程を含む。このエマルジョンは、主に１〜２ミクロンの油性液滴からなった。そしてこれは、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＫＥと呼ばれる。Ｋｉｒｋｌａｎｄ乳化器（Ｋｉｒｋｌａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗａｌｎｕｔ Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）は、作動チャンバー中で約１０００ｐｓｉで生成する、商業的なナイフ刃のホモジナイザー（例えば、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤおよびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ）の小規模バージョンである。第３の方法において、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０とともに、または、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０なしで、０．３〜１８％スクアレンおよび０．２〜１．０ｍｇ／ｍｌのＭＴＰ−ＰＥを含む混合物を、５，０００〜３０，０００ｐｓｉにて、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ番号１１０Ｙ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）に通した。代表的には、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中で、５０ｍｌのエマルジョンを５分間混合するか、または１００ｍｌを１０分間混合した。得られたエマルジョンは、スクアレン、ＭＴＰ−ＰＥ、ならびに洗剤濃度およびマイクロフルイダイザー作動圧力および温度に依存して、１００〜７５０ｎｍの油性液滴からなった。この組成物は、ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ−ＭＦと呼ばれる。
【００８７】
（実施例２：抗原調製物）
ＭｅｎＢ抗原９１９をコードする遺伝子を、以下のプライマーを使用してＭｅｎＢ染色体ＤＮＡから増幅した：正方向プライマー５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｃａｔａｔｇｔｇｃｃａａａｇｃａａｇａｇｃａｔｃ−３’（配列番号２８）、逆方向プライマー５’−ｃｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｔａｔｔｃｇｇｇ−３’（配列番号２９）。
【００８８】
増幅後に、ＰＣＲ産物をアガロースゲルから溶出し、そして１μｇのＤＮＡを、増幅されたフラグメントの５’端および３’端でそれぞれ切断する、制限酵素ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで消化した。消化後に、このフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製して、そして予めＮｄｅＩおよびＸｈｏＩで切断したプラスミドｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に連結した。この連結混合物を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５細胞を形質転換して、そして組換えプラスミドを保有するコロニーを、アンピシリン含有プレート上で選択した。１つの陽性クローンから、ｐＥＴ−９１９と命名されたプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎからのプラスミド調製キットを使用して調製し、そしてこのプラスミドを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３細胞を形質転換した。
【００８９】
Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１−ＤＥ３（ｐＧＥＸ−９１９）株を、１００μｇのアンピシリンを補充した５００ｍｌのＬＢ中において３０℃で増殖させた。ＯＤ600値が０．５に達したときに、この培養物に、１ｍＭ ＩＰＴＧを補充して、そしてさらに３時間培養した。細胞を遠心分離によって収集し、そして７．５ｍｌの氷冷イミダゾール緩衝液（３００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ リン酸緩衝液、１０ｍＭ イミダゾール（ｐＨ８））中で、Ｂｒａｎｓｏｎ超音波破砕器Ｂ−１５を使用する氷上での超音波破砕によって破壊した。遠心分離による細胞片の分離の後に、この上清を、１ｍｌのＮｉ2+樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに混合して、そして室温で３０分間維持した。この樹脂を遠心分離によって収集し、１０ｍｌの氷冷１０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて洗浄し、そして小さな使い捨てカラムにロードした。次いで、このカラムを、１０ｍｌの２０ｍＭイミダゾール緩衝液で洗浄して、そして最終的に、このタンパク質を、２５０ｍＭイミダゾール緩衝液を用いて溶出させた。このタンパク質を、ＰＢＳ中で透析して、そして−２０℃で保存した。
【００９０】
ＭｅｎＢ９１９のヌクレオチド配列（配列番号３０）を、以下に示す：
【００９１】
【化１】
「ｙ」は、「ｃ」または「ｔ」のいずれかであると理解されるべきである。
ＭｅｎＢ９１９ペプチドのアミノ酸配列（配列番号３１）を、以下に示す：
【００９２】
【化２】
。
【００９３】
（実施例３：免疫化）
４匹のＣＤ１マウスの群に、５個のワクチン処方物（以下の表１に示される）の１つを与えた。このワクチンを、７５μｌのタンパク質調製物（２０μｇのタンパク質）と７５μｌの特定のアジュバントとを混合することによって処方した。ミョウバンを使用したときは、２０μｇのタンパク質および１ｍｇ/ｍｌの最終濃度でミョウバンを含む１５０μｌの溶液を使用した。最終的に、９１９−ＣｐＧオリゴ−ＣＦＡ処方物の場合には、配列：５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’（配列番号１）を有する２０μｇのホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｓ，Ｅｔｃｄ．ＵＳＡ）を、免疫前に、７５μｌの最終容量のＣＦＡ中で、２０μｇのタンパク質とともに混合した。このワクチンを、１日目および２１日目に腹腔内に投与して、そして血清サンプルを、各注射の１５日後に採取した。
【００９４】
（実施例４：ＥＬＩＳＡアッセイ）
ＭｅｎＢ Ｍ７細胞を、０．４のＯＤ620値を有する７ｍｌの液体培養物から遠心分離によって収集した。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、次いで０．０２５％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中に再懸濁した。２時間の室温でのインキュベーションおよび４℃で一晩のさらなるインキュベーションの後に、細胞を９６ウェルのＧｒｅｉｎｅｒプレート（１００μｌ／ウェル）に分配し、そして４℃で一晩維持した。次いでこのウェルを、ＰＢＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０のＰＢＳ）で三回洗浄して、その後に２００μｌの飽和緩衝液（２．７％ポリビニルピロリドン１０の水）を加えた。ＰＢＴでの洗浄の後に、２００μｌの希釈した血清（希釈緩衝液：１％ ＢＳＡ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ ＮａＮ3のＰＢＳ）を、各ウェルに加えて、そしてプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。洗浄後に、希釈緩衝液で１：２０００に希釈された１００μｌＨＲＰ結合体化ウサギ抗マウス（Ｄａｋｏ）血清を、各ウェルに加えて、そしてこのプレートを３７℃で９０分間インキュベートした。ウェルをＰＢＴ緩衝液で三回洗浄した。ＨＲＰに対する１００μｌの基質緩衝液（２５ｍｌクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）、１０ｍｇ Ｏ−フェニルジアミン、１０μｌのＨ2Ｏ2）を、各ウェルに加えて、そしてプレートを室温で２０分間維持した。最終的に、１００μｌのＨ2ＳＯ2を各ウェルに加えて、そしてＯＤ490値を計測した。ＥＬＩＳＡ力価を、０．４のＯ．Ｄ．を与える血清の希釈としてだいたい決定した。各免疫スケジュールからの血清のプールのＥＬＩＳＡ力価を、以下の表１に報告する。示されるように、１用量のワクチン後の最高の抗体力価は、９１９−ＩＦＡおよび９１９−ＣＦＡ−オリゴであった。９１９−ＣＦＡ−オリゴは、９１９−ＩＦＡの２倍高い力価を与えた。さらに、９１９−ＣＦＡ−オリゴは、９１９−ＣＦＡとの応答および９１９−ＣＦＡ単独よりも大きな応答を生じた。抗体力価は測定されることから、応答は同様に、９１９−オリゴ単独よりも大きいことが予測される。第２の用量の後に、９１９−ＣＦＡ−オリゴは、最高の処方物であることがわかった。これは、使用されたいずれの他の処方物よりも、ほとんど１オーダー高い強度の抗体力価を生じた。
【００９５】
表１：異なるアジュバント処方物とともに９１９抗原を使用したＥＬＩＳＡ力価
【００９６】
【表１】
（実施例５：殺菌アッセイ）
ＭｅｎＢ２９９６株を、ＯＤ620値０．５〜０．８に達するまで、液体培養物（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス）中で増殖させた。次いで、この細胞を遠心分離によって収集して、そしてＧｅｙ緩衝液１％ ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁して、ＯＤ620が０．５の懸濁液を得た。最終的に、この懸濁液を、Ｇｅｙ緩衝液１％ ＢＳＡで１：２０，０００に希釈して、そして２５℃で保存した。殺菌アッセイについては、１％ ＢＳＡを含む５０μｌのＧｅｙ緩衝液を、２５μｌの希釈したマウス血清（希釈緩衝液：１％ ＢＳＡを含むＧｅｙ緩衝液）、２５μｌの細菌懸濁液およびμｌの熱非働化（５６℃で３０分間）または通常の仔ウサギ補体のいずれかに加えて、各ウェルに添加した。仔ウサギ補体の添加の直後に、２２μｌの各サンプルを、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎアガープレート上にプレートして、次いで９６ウェルプレートを、回転下において３７℃でインキュベートした。各ウェルからの２２μｌのサンプルを、１時間のインキュベーションの後に以前に述べたようにプレートした。ＭｅｎＢの増殖速度は、２時間でおよそ２倍である。
【００９７】
各群からの血清のプールの殺菌活性を、表２に示す。プレートをコロニーが目に見えるようになるまで３７℃で維持した。ＭｅｎＢ細菌コロニーの数を、時間０および１時間後に計数した。最高の殺菌活性は、９１９−ＣＦＡ−オリゴ処方物で免疫されたマウス由来の血清で見出された。これは、９１９−ＣＦＡを含む使用された他の処方物よりも少なくとも２倍高い殺菌活性を示した。さらに、９１９−ＣＦＡ−オリゴは、９１９−ＣＦＡとの応答および９１９−ＣＦＡ単独での応答よりも高い応答を生じた。抗体力価が測定されているように、この応答は同様に、９１９−オリゴ単独よりも大きいことが期待される。
表２：異なるアジュバント処方物を使用しての９１９抗原の殺菌活性
【００９８】
【表２】
。
【００９９】
（実施例６：さらなる抗原）
上記の実施例にて使用された抗原「９１９」に加えて、またはこの抗原の代わりに、本発明の組成物は、以下の１以上のタンパク質抗原を含み得る：
・ＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２８２７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／２９４１２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／０３４１３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；
・ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント；および／または
・ＧＢ−９９２８１９７．４に開示されるタンパク質、またはその免疫原性フラグメント。
【０１００】
組成物がＷＯ９９／２４５７８に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／２４５７８に開示されるように、以下の配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは、これらの配列番号の１以上の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）を含む：
【０１０１】
【化３】
この組成物がＷＯ９９／３６５４４に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、以下のＷＯ９９／３６５４４に開示されるような、配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）を含む：
【０１０２】
【化４】
組成物がＷＯ９９／５７２８０に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／５７２８０に開示されるような、以下の配列番号からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を有する配列を含むタンパク質）を含む：
【０１０３】
【化５】
組成物が、ＷＯ９９／２８２７３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９７／２８２７３の図４または図１３に開示されるタンパク質（あるいは、その免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこのタンパク質に対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質）を含む。
【０１０４】
組成物がＷＯ９６／２９４１２に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９６／２９４１２に開示される配列番号１〜８からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号からなる群より選択される免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０５】
組成物が、ＷＯ９５／０３４１３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９５／０３４１３に開示される配列番号１〜２３からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは１以上のこれらの配列番号からなる群より選択される免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらの配列番号のうちの１つに配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０６】
組成物が、ＷＯ９９／３１１３２に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／３１１３２に開示される配列番号２からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは配列番号２の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２に配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０７】
組成物が、ＷＯ９９／５８６８３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／５８６８３に開示される配列番号２もしくは配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは配列番号２もしくは配列番号４の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２もしくは配列番号４に配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０８】
組成物が、ＷＯ９９／５５８７３に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、ＷＯ９９／５５８７３に開示される配列番号２もしくは配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列（あるいは配列番号２もしくは配列番号４の免疫原性フラグメントを含むタンパク質、または配列番号２もしくは配列番号４に配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列同一性を含むタンパク質）を含む。
【０１０９】
組成物がＧＢ−９９２８１９７．４に開示されるタンパク質を含む場合、上記のタンパク質は、好ましくは、以下の（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）のうちの１つを含む：
（ｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群（ｓｅｒｏｇｒｏｕｐ）Ｂアミノ酸配列：
【０１１０】
【化６】
あるいはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらに対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質。このタンパク質は、そのシグナルペプチドＭＫＬＫＱＩＡＳＡＬＭＭＬＧＩＳＰＬＡＬＡを欠損し得る；
（ｉｉ）Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅアミノ酸配列：
【０１１１】
【化７】
あるいはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらに対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質。このタンパク質は、そのシグナルペプチドＭＫＬＫＱＩＡＳＡＬＭＭＬＧＩＳＰＬＡＦＡを欠損し得る；
（ｉｉｉ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ａアミノ酸配列：
【０１１２】
【化８】
あるいはその免疫原性フラグメントを含むタンパク質、またはこれらに対して配列同一性（好ましくは、５０％を超える（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上））を有する配列を含むタンパク質。このタンパク質は、そのシグナルペプチドＭＫＬＫＱＩＡＳＡＬＭＶＬＧＩＳＰＬＡＬＡを欠損し得る。
【０１１３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ抗原としての使用に好ましいタンパク質は、以下である：
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号３０６９〜３０７４および３２０７〜３２４１によって示されるタンパク質「９１９」（その中の図２３および実施例１５もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号８６９〜８７４および３１４９〜３１７８によって示されるタンパク質「２３５」（その中の図２０および実施例１２もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号３０４５〜３０５６および３１８５〜３２０６によって示されるタンパク質「５１９」（その中の図２２および実施例１４もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／５７２８０の配列番号７９３〜８０４および３１１５〜３１４８によって示されるタンパク質「２２５」（その中の図１９および実施例１１もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／３６５４４の実施例１（配列番号１〜６）によって示されるタンパク質「ＯＲＦ４０」（ＧＢ−９９１０１６８．５の図１もまた参照のこと；ＷＯ９９／３１１３２およびＷＯ９９／５８６８３もまた参照のこと）。
・ＷＯ９９／２４５７８の実施例２６（配列番号２１５〜２２６）によって示されるタンパク質「ＯＲＦ４」（ＧＢ−９９１０１６８．５の図２もまた参照のこと）。
【０１１４】
本出願は例示の目的のみで本発明を記載し、そして改変は本発明の精神および範囲内に留まるようになされ得ることが理解される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【請求項１】
本明細書に記載される発明。
【公開番号】特開２０１０−１７４０４４（Ｐ２０１０−１７４０４４Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１４８０４（Ｐ２０１０−１１４８０４）
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【分割の表示】特願２０００−６００６８５（Ｐ２０００−６００６８５）の分割
【原出願日】平成１２年２月９日（２０００．２．９）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月１８日（２０１０．５．１８）
【分割の表示】特願２０００−６００６８５（Ｐ２０００−６００６８５）の分割
【原出願日】平成１２年２月９日（２０００．２．９）
【出願人】（５９２２４３７９３）カイロン ソチエタ ア レスポンサビリタ リミタータ (107)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]