Ｃｒｉｐｔｏをブロックする抗体およびその使用
【課題】Ｃｒｉｐｔｏブロッキング抗体、またはその生物学的機能フラグメント、およびその使用を提供すること。
【解決手段】Ｃｒｉｐｔｏと結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、腫瘍増殖を調節する抗体もまた提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、シグナル伝達を調節し、腫瘍増殖を調節する抗体もまた提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし、腫瘍増殖を調節する抗体が提供される。本発明はまた、これらの抗体を治療、診断および研究への適用で使用する方法を提供する。
【解決手段】Ｃｒｉｐｔｏと結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体が提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、腫瘍増殖を調節する抗体もまた提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、シグナル伝達を調節し、腫瘍増殖を調節する抗体もまた提供される。Ｃｒｉｐｔｏと結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし、腫瘍増殖を調節する抗体が提供される。本発明はまた、これらの抗体を治療、診断および研究への適用で使用する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００２年３月２２日に出願された、米国特許出願第６０／３６７，００２号の継続出願であり、それは、２００１年６月２６日に出願された米国特許出願第６０／３０１，０９１号の一部継続出願であり、それは、２００１年５月１７日に出願された米国特許出願第６０／２９３，０２０号の一部継続出願であり、それは、２００１年４月２６日に出願された米国特許出願第６０／２８６，７８２号の一部継続出願である。前述の特許出願の各々の全ての開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、一般的に遺伝学ならびに細胞生物学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節する抗体、このような抗体を含むキット、ならびにこれらの抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｃｒｉｐｔｏは、ヒト胚癌腫ライブラリー（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら１９８９、ＥＭＢＯ Ｊ．，８巻、７号、ｐｐ．１９８７−１９９１）のｃＤＮＡスクリーニングにおいて思いがけなくも単離された１８８のアミノ酸残基の細胞表面タンパク質である。このＣｒｉｐｔｏタンパク質は、以下の少なくとも２種類の注目すべきドメインを有する：システインリッチドメイン、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー中に見出されたドメインと類似するとして最初に特徴づけられたドメイン。Ｃｒｉｐｔｏは、このＥＧＦファミリーのメンバーとして、元々分類され（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら、前記）；しかし、引き続く分析は、Ｃｒｉｐｔｏが公知のＥＧＦレセプターのいずれにも結合せず、そしてこのＥＧＦ様ドメインは実際には、このＥＧＦファミリーと相違したことを示した（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：８６２４−８６２９）。
【０００４】
Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達経路は、以下を含むいくつかの異なる経路の活性化を支持する文献での継続的な研究にもかかわらず、理解しにくいままである：ＭＡＰキナーゼ経路（ＤｅＳａｎｔｉｓら、１９９７，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，８：１２５７−１２６６；Ｋａｎｎｎａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３３３０−３３３５）、ＴＧＦ−β経路（Ｇｒｉｔｓｍａｎら，１９９９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：９２１−９３２；Ｓｃｈｉｅｒら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：３８５−３８９），Ｗｎｔ経路との潜在的な相互作用（Ｓａｌｍｏｎら，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｄｅｃ；７（４）：１９９−２２６；およびＥＧＦ経路とのクロストーク（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７４：８６２４−８６２９）。
【０００５】
米国特許第５，２５６，６４３号、およびこれに関する２つの分割出願（米国特許第５，６５４，１４０号および同第５，７９２，６１６号）は、ヒトのＣｒｉｐｔｏ遺伝子、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、およびＣｒｉｐｔｏに対する抗体を開示する。
【０００６】
米国特許第５，２６４，５５７号、およびこれに関する３つの分割出願（米国特許第５，６２０，８６６号、同第５，６５０，２８５号および同第５，８５４，３９９号）は、ヒトのＣｒｉｐｔｏ関連遺伝子、およびＣｒｉｐｔｏ関連タンパク質を開示する。Ｃｒｉｐｔｏ関連タンパク質に結合するが、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質自体に結合することによって交差反応しない抗体もまた、開示される。
【０００７】
Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の過剰発現は、小さなｃｒｉｐｔｏペプチドに対して惹起されたウサギポリクローナル抗体を用いるヒト組織の免疫染色によって、実証されるように、以下の多くの腫瘍型と関連するが、これらに限定されない：乳、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓、および胃。Ｐａｎｉｃｏら、１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６５：５１−５６；Ｂｙｒｎｅら、１９９８，Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１８５：１０８−１１１；Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら、１９９９，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４：４３７−４４０。従って、この分野は、このような過剰発現の制御手段、制限手段、および／または予防手段、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達の調節手段、ならびにＣｒｉｐｔｏ発現の結果の調節（すなわち、細胞形質転換の促進および／または維持）手段を必要としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメインのエピトープと特異的に結合する抗体（項目２）
前記Ｃｒｉｐｔｏが、配列番号１または配列番号２からなる群から選択される、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記エピトープがＥＧＦ様ドメインである、項目２に記載の抗体。
（項目４）
前記エピトープがｃｙｓリッチドメインである、項目２に記載の抗体。
（項目５）
Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、およびＢ６Ｇ７．１０からなる群から選択される、項目２に記載の抗体。
（項目６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ６Ｇ７．１０、Ａ１７Ｇ１２．１およびＡ１８Ｂ３．１１からなる群から選択される、項目３に記載の抗体。
（項目７）
Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群から選択される、項目４に記載の抗体。
（項目８）
Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２にまたがるドメインに含まれるエピトープと特異的に結合する抗体。
（項目９）
Ａ１０Ｂ２．１８およびＢ３Ｆ６．１７である、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
抗体Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、およびＢ６Ｇ７．１０が結合する、エピトープの群から選択されたエピトープと特異的に結合する抗体。
（項目１１）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節し得る抗体。
（項目１２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１１に記載の抗体。
（項目１３）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１およびＡ２７Ｆ６．１から選択される、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１１に記載の抗体。
（項目１５）
Ａ６Ｃ１２．１１である、項目１４に記載の抗体。
（項目１６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群から選択される、項目１１に記載の抗体。
（項目１７）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、腫瘍増殖を調節し得る抗体。
（項目１８）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１７に記載の抗体。
（項目２０）
Ａ２７Ｆ６．１、Ａ８Ｇ３．５およびＢ６Ｇ７．１０からなる群から選択される、項目１７に記載の抗体。
（項目２１）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体。
（項目２２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２１に記載の抗体。
（項目２３）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２１に記載の抗体。
（項目２４）
Ａ２７Ｆ６．１である、項目２１に記載の抗体。
（項目２５）
Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１９）、およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１３）からなる群から選択される、ハイブリドローマによって生成される抗体。
（項目２６）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得る抗体。
（項目２７）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２６に記載の抗体。
（項目２８）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２６に記載の抗体。
（項目２９）
Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群から選択される、項目２６に記載の抗体。
（項目３０）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体。
（項目３１）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目３０に記載の抗体。
（項目３２）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目３０に記載の抗体。
（項目３３）
Ａ８Ｇ３．５である、項目３０に記載の抗体。
（項目３４）
Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得るＣｒｉｐｔｏ抗体。
（項目３５）
前記抗体が化学療法剤に結合されている、項目３４に記載の抗体。
（項目３６）
Ａ２７Ｆ６．１およびＢ３Ｆ６．１７から選択される、項目３４に記載の抗体。
（項目３７）
項目１〜３５のいずれかに記載の抗体の少なくとも１つを含む、Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する被験体に投与するための組成物。
（項目３８）
前記被験体がヒトである、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
さらに医薬的に容認可能な賦形剤を含む、項目３７に記載の組成物。
（項目４０）
前記抗体が化学療法剤に結合されている、項目３７に記載の組成物。
（項目４１）
さらに非結合化学療法剤を含む、項目３７に記載の組成物。
（項目４２）
サンプルに項目３７の組成物を添加する工程を含む、サンプル中でのインビトロの腫瘍細胞の増殖を調節する方法。
（項目４３）
被験体に、有効な量の項目３７に記載の組成物を投与する工程を含む、被験体のインビトロでの腫瘍細胞の増殖を調節する方法。
（項目４４）
前記被験体がヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する被験体を処置する方法であって、有効な量で項目３７に記載の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
（項目４６）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、有効な量で項目３９に記載の組成物を該患者に投与することを含む、方法。
（項目４７）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、有効な量で項目４０に記載の組成物を該患者に投与することを含む、方法。
（項目４８）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、有効な量で項目４１に記載の組成物を該患者に投与することを含む、方法。
（項目４９）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目５０）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５６）
項目１〜３７のいずれかに記載の抗体を用いるイムノアッセイにおいて、被験体由来の組織を分析する工程を含む、組織がＣｒｉｐｔｏを発現するかどうかを決定する方法。
（項目５７）
項目１〜３７のいずれかに記載の抗体を用いるイムノアッセイで細胞株を分析する工程を含む、細胞株がＣｒｉｐｔｏを発現するかどうかを決定する方法。
（項目５８）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目５９）
前記抗体がヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目６０）
前記抗体がヒト抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目６１）
所望でない細胞増殖と関与する状態のための被験体を処置する方法であり、該方法が、項目３７の組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する新規の抗体、ならびにこのような抗体の製造方法および使用方法を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達またはタンパク質相互作用を調節する抗体（例えば、Ｃｒｉｐｔｏと結合し、その結果、Ｃｒｉｐｔｏとのタンパク質の相互作用から生じるシグナルが、下方に調節される抗体）を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そして腫瘍増殖を調節する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し、そして腫瘍増殖を調節する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし、そして腫瘍増殖を調節する抗体を提供する。
【００１０】
本発明の一つの局面においては、本発明の抗体は、以下の抗体が結合するエピトープの群から選択されたエピトープに特異的に結合する：Ａ６Ｃ１２．１１，Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９，Ａ８Ｆ１．３０，Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７），Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ８Ｈ３．２，Ａ１９Ａ１０．３０，Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ２Ｄ３．２３，Ａ７Ａ１０．２９，Ａ９Ｇ９．９，Ａ１５Ｃ１２．１０，Ａ１５Ｅ４．１４，Ａ１７Ａ２．１６，Ａ１７Ｃ１２．２８，Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４），Ａ１７Ｈ６．１，Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２），Ａ１９Ｅ２．７，Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９），Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３），Ｂ１１Ｈ８．４。
【００１１】
本発明の別の局面においては、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する。Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１（配列番号１）またはＣＲ−３（配列番号２）から選択され得る。さらに特定の実施形態においては、リガンド／レセプター結合ドメイン中のこのエピトープに特異的に結合する抗体としては、例えば、以下が挙げられる：Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８），Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７），Ａ１９Ａ１０．３０，Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４），Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２），およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）。
【００１２】
一つの実施形態においては、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦ様ドメイン中にある。ＥＧＦ様ドメイン中のこのエピトープに特異的に結合する抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４），およびＡ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）。
【００１３】
別の実施形態においては、本発明の抗体が結合するエピトープは、ｃｙｓリッチドメイン中にある。このｃｙｓリッチドメイン中のこのエピトープに特異的に結合する抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ１９Ａ１０．３０，Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７），Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）およびＡ６Ｃ１２．１１。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明の抗体が結合するこのエピトープは、Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメイン中にある。Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１），Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９），およびＡ１７Ａ２．１６。
【００１５】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得る抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ８ＨＧ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），およびＡ６Ｃ１２．１１。一つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得る本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン中、またはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１６】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得る抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）およびＡ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、およびＡ６Ｃ１２．１１。１つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得る本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１７】
別の局面においては、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）およびＡ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）。
【００１８】
一つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を調節し得る本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１９】
さらなる別の局面においては、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体としては、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
一つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る本発明の抗体は、ｃｒｉｐｔのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００２１】
さらなる局面においては、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体としては、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
別の実施形態においては、本発明は、以下からなる群から選択されるハイブリドーマによって生成される抗体を提供する：Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）。
【００２３】
本発明の抗体としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびヒト抗体。
【００２４】
本発明はまた、上記される少なくとも１個の抗体を含む、Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する被験体への投与用組成物を提供する。さらに特定の実施形態においては、この被験体は、ヒトである。この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。上記される抗体は、化学療法剤と結合体化され得るか、または結合体化していない化学療法剤との組み合わせで提供され得る。
【００２５】
本発明の別の局面で意図されることは、サンプル中のインビトロでの腫瘍細胞の増殖を調節する方法であり、この方法は、このサンプルに、上記される組成物に添加する工程を包含する。
【００２６】
また意図されることは、被験体におけるインビボでの腫瘍細胞の増殖を調節する方法であり、この方法は、この被験体に、上記される組成物の有効量を投与する工程を包含する。特定の実施形態においては、この被験体は、ヒトである。
【００２７】
本発明の別の局面は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する被験体を処置する方法であり、この方法は、この被験体に、上記される組成物を有効量で投与する工程を包含する。投与用組成物は、以下を含み得る：薬学的に受容可能な賦形剤、化学療法剤に結合体化した抗体、および結合体化されない化学療法剤との組み合わせで投与される抗体。
【００２８】
本発明の方法は、腫瘍細胞の増殖の調節および／または腫瘍を有する被験体（すなわち、ヒト）の処置において特に有用であり、ここで腫瘍細胞は、乳癌細胞、精巣腫瘍細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される。
【００２９】
さらなる別の実施形態においては、本発明は、組織がＣｒｉｐｔｏを発現するか否かを決定する方法を意図し、上記される抗体のいずれかを使用して、イムノアッセイで被験体に由来する組織を分析する工程を含む。また意図されることは、細胞株がＣｒｉｐｔｏを過剰発現するか否かを決定する方法であり、上記される抗体のいずれかを使用するイムノアッセイにおいて細胞株を分析する工程を含む。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の局面は、下記の発明の詳細な説明において、今まで以上に詳しく記載している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】なし
【図２】なし
【図３】なし
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する抗体、およびＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達もしくはタンパク質の相互作用を調節するための抗体の使用、ならびに／またはＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体、ならびに／または腫瘍細胞の増殖を調節する抗体が発見されている。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する種々のクラスの抗体が発見されており、この抗体としては，例えば、以下が挙げられる：天然Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、またはＣｒｉｐｔｏの変性形態のいずれかのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体；ＥＧＦ様ドメイン、ｃｙｓリッチドメイン、またはアミノ酸残基４６〜１５０を含む領域からのペプチド（例えば、約３個〜約２０個のアミノ酸）を結合する抗体；Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節する抗体；Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そして腫瘍細胞の増殖を調節する抗体；およびＣｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し、そして腫瘍細胞の増殖を調節する抗体。これらの抗体は、リガンド／レセプター結合ドメインに結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節し、または腫瘍細胞の増殖を調節する抗体を選択するために、従来のインビトロアッセイを使用して、選択される。
【００３３】
本発明の方法は、腫瘍の増殖速度（これは、正常組織に対する異常な速度である）が少なくとも部分的にＣｒｉｐｔｏに依存する場合、哺乳動物の悪性腫瘍または良性腫瘍の治療において有用である。異常な増殖速度は、正常ホメオスタシスのために必要な増殖速度を超え、そして同起源の正常組織の増殖速度を超える増殖速度である。
【００３４】
（定義）
種々の定義は、この文書全体にわたってなされる。ほとんどの語は、当業者によりその語が有するとみなされる意味を有する。この文書の、以下または他のいずれかで具体的に定義された語は、全体として、そして当業者によって代表的に理解されるように本発明に関連して提供される意味を有する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「領域」とは、生体分子の一次構造に関する物理的に隣接した部分を意味する。タンパク質の場合においては、領域は、このタンパク質のアミノ酸配列に関する隣接した部分によって、規定される。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「ドメイン」とは、公知の生体分子機能または疑わしい生体分子機能に貢献する、生体分子の構造部分をいう。ドメインは、これらの領域、またはこれらの部分と同一の広がりを持ち得る；ドメインはまた、特定領域部分の全てまたは部分に加えて、特定領域と区別される生体分子部分を組み込み得る。タンパク質ドメインの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞外ドメイン（Ｃｒｉｐｔｏの残基約３１から残基約１８８に及び、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含む）および膜貫通ドメイン（Ｃｒｉｐｔｏの残基約１６９から残基約１８８に及び、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含む）。このＣｒｉｐｔｏタンパク質のリガンド／レセプター結合ドメインは、Ｃｒｉｐｔｏの残基約７５から残基約１５０に及び、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含み、そして例えば、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含み、Ｃｒｉｐｔｏの残基約７５から残基約１１２に及ぶ、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン、そして例えば、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含む、Ｃｒｉｐｔｏの残基約１１４から残基約１５０に及ぶ、Ｃｒｉｐｔｏのシステインリッチドメインを含む。例えば、本発明の多くのモノクローナル抗体は、このＥＦＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメインに結合すると同定されている。さらに、モノクローナル抗体Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）およびＡ１７Ａ２．１６は、アミノ酸残基４６〜６２（ＥＧＦ様ドメインの上流にある）に及ぶ領域内のドメイン中に形成された、エピトープに結合すると同定されている。下記の実施例３を参照のこと。リガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープは、コンホメーションの天然Ｃｒｉｐｔｏタンパク質で形成されるか、または変性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質で形成されるエピトープであり、このエピトープに抗体が結合し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全なインタクトの抗体、およびこれらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ならびに他のフラグメントをいうことを意味する。完全なインタクトの抗体は、以下を含むがこれらに限定されない：モノクローナル抗体（例えば、マウスのモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体。抗体の種々の形態は、標準的な組換えＤＮＡ技術（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−９９，１９９１）を使用して、製造され得る。例えば、動物の抗体に由来する抗原結合ドメインが、ヒト定常ドメインに連結された「キメラ」抗体（組換えＤＮＡ技術を用いて対応するヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖に由来する領域で、重鎖のヒンジ領域および定常領域、ならびに／または軽鎖の定常領域の全てまたは部分を置換されている、最初に非ヒトの哺乳動物に由来する抗体）が構成され得る。（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５，１９８４を参照のこと）。キメラ抗体は、ヒトの臨床処置に使用される場合、動物の抗体によって惹起される免疫応答を減少させる。
【００３８】
さらに、組換え「ヒト化」抗体は、合成され得る。ヒト化抗体は、最初は非ヒトの哺乳動物に由来する抗体であり、ここで組換えＤＮＡ技術は、ヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応する領域からの、アミノ酸と結合する抗原を必要としないアミノ酸のいくつかまたは全てを置換するために使用されている。すなわち、これらは、主にヒト免疫グロブリン配列を含むキメラであり、この中に特異的な抗原結合に関与する領域が挿入されている（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９４／０４６７９を参照のこと）。動物は、所望される抗原を用いて、免疫され、この対応する抗体は、単離され、そして特異的な抗原結合に関与する可変領域の配列に関する部分は、除去される。動物に由来する抗原に結合する領域は次いで、ヒト抗体遺伝子の適切な位置の中にクローン化され、ここでこの抗原を結合する領域は、除去されている。ヒト化抗体は、ヒト治療に使用される抗体における異種（種間）配列の使用を最小化し、そして望まれない免疫応答をほとんど惹起しない。霊長類化（Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体は、同様に生成され得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、非ヒト動物（例えば、１個以上のヒト免疫グロブリン導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物）中で生成され得るヒト抗体の使用を含む。このような動物は、米国特許第５，５６９，８２５号に記載されているようにハイブリドーマを生成するための脾細胞の供給源として、使用され得る。
【００４０】
抗体フラグメントおよび一価抗体もまた、本発明の方法および組成物において使用され得る。一価抗体は、第二の重鎖のＦｃ（または幹）領域に結合した重鎖／軽鎖ダイマーを含む。「Ｆａｂ領域」とは、重鎖のＹ枝部分を含む配列に対して、および軽鎖の全体に対しておおよそ等価、または類似である鎖の部分をいい、そして、集団的に（凝集体で）、抗体活性を示すことが示されている。Ｆａｂタンパク質は、１個の重鎖および１個の軽鎖の凝集体（一般にＦａｂ’として公知）、ならびに抗体Ｙの２個の分枝セグメントに対応するテトラマー（一般にＦ（ａｂ）２として公知）を含む（この凝集体が特定抗原、または特定抗原ファミリーと特異的に反応し得る限りは、上記のいずれかが、共有結合的に凝集されるか、または非共有結合的に凝集される）。
【００４１】
本発明の抗体のいずれかは、必要に応じて、以下で規定されるような化学療法剤に結合体化され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「結合」とは、２個のタンパク質間もしくは２個の化合物間、または関連タンパク質間もしくは関連化合物間、またはこれらの組み合わせ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味し、抗原とタンパク質との間の相互作用を含む。結合としては、以下が挙げられる：イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用など。物理的相互作用、結合は、直接的または間接的のいずれかであり得る（間接的とは、別のタンパク質もしくは化合物の影響を介するか、または影響を原因とする）。直接結合とは、別のタンパク質もしくは化合物の影響を介するか、または影響を原因して起こらないだけでなく、代わりに他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。結合は、多くの異なった様式で検出され得る。結合を検出する方法は、当業者に対して周知である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得る抗体」とは、Ｃｒｉｐｔｏを細胞表面から除去する一方、この細胞に入る抗体を意味する。蛍光標識したＣｒｉｐｔｏのモノクローナル抗体を使用することによって、Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得るＣｒｉｐｔｏ抗体についてスクリーニングし得る。Ｃｒｉｐｔｏ陽性細胞中にインターナライズする抗体を測定するために、蛍光顕微鏡および／または共焦点顕微鏡下で、細胞を見ることによって、この細胞への抗体の蛍光シグナルの取り込みについてアッセイし得る。インターナライズしたこれらの抗体は、細胞質および／または（ａｎｄ ｏｒ）細胞の小胞中の蛍光シグナルとして見られる。Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得るＣｒｉｐｔｏ抗体の非限定的な例としては、Ａ２７Ｆ６．１およびＢ３Ｆ６．１７が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「化合物」とは、以下が挙げられるが、これらに限定されない、任意の同定可能な化学物質または分子を意味する：イオン、原子、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸であり、そしてこのような化合物は、天然または合成であり得る。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」または用語「改変する」とは、特定の活性またはタンパク質の量、質、または影響における増大または低下を意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する」とは、以下のＣｒｉｐｔｏ活性の量、質、または影響における増大または減少を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。活性は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例３に示されるヌル細胞アッセイ）によって測定され得る。別の実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質と別のタンパク質との間のタンパク質相互作用は、本発明の抗体の結合を介して、同様に下方に調節される。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする」とは、相互作用（すなわち、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の結合）における以下の増大または低下を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。活性は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例８に示される結合アッセイ）によって、測定され得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「インビトロで腫瘍細胞の増殖を調節する」とは、以下のインビトロでの腫瘍細胞数における増大または低下を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。インビトロでの腫瘍細胞の増殖の調節は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例４に示されるＧＥＯ細胞の軟寒天アッセイ）によって測定され得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「インビボでの腫瘍細胞の増殖を調節する」とは、以下のインビボで腫瘍細胞数における増大または低下を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。インビボでの腫瘍細胞の増殖の調節は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例５に示されるアッセイ）によって測定され得る。
【００５０】
用語「予防」は、生物が、異常な状態になる、または異常な状態を進展させる可能性を減少させることを称する。
【００５１】
用語「処置」は、生物において、治療効果を有することおよび少なくとも部分的に生物における異常な状態を緩和するもしくは抑制することを称する。処置としては、抑制された腫瘍の増殖を維持すること、および緩解の誘導が挙げられる。
【００５２】
用語「治療効果」とは、異常な状態の阻害を称する。治療効果は異常な状態の１以上の症状をある程度まで軽減する。異常な状態の治療に関して、治療効果は、下記のうちの１以上を称し得る：（ａ）細胞の増殖、成長、および／または分化における増加または減少；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、緩徐化もしくは停止）もしくは促進；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関係する１以上の症状をある程度まで軽減；および（ｅ）細胞の集団の機能を増強。異常な状態に対して効力を示す化合物は、本明細書中に記載されるように同定され得る。
【００５３】
用語「投与」は、生物の細胞中もしくは組織中に化合物を取り込む方法に関連する。生物の細胞もしくは組織が生物内に存在する場合、またはその生物の外部に存在する場合に、異常な状態は予防もしくは処置され得る。生物の外部に存在する細胞は、細胞培養ディッシュの中もしくは別の生物の中で、維持または育成され得る。生物内に宿る（ｈａｒｂｏｒ）細胞に対して、当該分野に存在する化合物を投与するための多くの技術には、経口、非経口、経皮、およびエアロゾルの適用（これらに限定されない）が挙げられる。生物の外部にある細胞に対し、化合物を投与するための複数の技術が当該分野に存在し、この技術としては、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術およびキャリア技術（これらに限定されない）が挙げられる。投与は、当該分野で公知である多くの様式（例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内など）により、実施され得る。インビボ療法において使用される場合、本発明の抗体は、有効量で、患者に投与される。本明細書中で使用される「有効量」は、有益な臨床結果もしくは所望される臨床結果をもたらすために十分な量（すなわち、患者の負担を除去する量、もしくは軽減する量）である。有効量は、１以上の投与において、投与され得る。本発明の目的として、本発明の抗体の有効量は、Ｃｒｉｐｔｏ関連疾患状態、特にＣｒｉｐｔｏ関連腫瘍の進展を改善、安定化もしくは遅延するために十分な抗体量である。これらの有効性の指標の検出および測定は、下記に記載される。代表的な処置レジメンの例として、毎週のスケジュールにおいて、約２〜５ｍｇ／ｋｇの用量で本発明の対象の抗体の静脈内注射よる投与が挙げられる。患者が入院を望まない場合は、抗体は、外来患者化学療法注入単位（ｃｈｅｍｏｉｎｆｕｓｉｏｎ ｕｎｉｔ）において、投与される。当該分野で公知である他の投与レジメンもまた、検討される。
【００５４】
異常状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞群に本発明の抗体を投与することにより、予防もしくは処置され得る。その後、生物の機能における化合物の投与の効果は、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、ヒトである。
【００５５】
「Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現」は、発現が、統計学的に有意な量において、隣接する正常組織のＣｒｉｐｔｏの発現より強い組織によるＣｒｉｐｔｏの発現を意味することを意図される。
【００５６】
「化学療法剤」は、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍抑制の維持、および／もしくは緩解の誘導において治療効果を有する（天然化合物、合成化合物、タンパク質、修飾されたタンパク質、および放射性化合物のような）当該分野で同定される任意の薬剤を称する。本明細書中で企図される化学療法剤は、本発明の抗体と結合され得る薬剤、もしくは別に、それらの抗体と結合体化されることなく、本発明の抗体と併用され得る薬剤を包含する。本発明の抗体と結合体化され得る例示的な化学療法剤として、放射性結合体（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈなど）、腫瘍活性化プロドラッグ（メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ＣＣ−１０６５アナログ、クリケアマイシン（ｃｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）誘導体、アントラサイクリン、ビンカアルカロイドなど）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（これらに限定されない）が挙げられる。
【００５７】
化学療法剤は、本発明の抗体に結合されるよりむしろ、抗体と組み合わせて（すなわち、非結合体化化学療法剤）使用され得、以下を含み得る：白金（すなわち、シスプラチン）、アントラサイクリン、ヌクレオシドアナログ（プリンおよびピリミジン）、タキサン、カンプトテシン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ＤＮＡアルキル化剤、葉酸塩拮抗薬、ビンカアルカロイド、リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター、エストロゲンインヒビター、プロゲステロンインヒビター、アンドロゲンインヒビター、アロマターゼインヒビター、インターフェロン、インターロイキン、モノクローナル抗体、タキソール、カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、アドリアマイシン（ｄｏｘ）、５−ＦＵおよびゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）。このような化学療法剤は、抗体および非結合化化学療法剤の同時投与により、本発明の抗体と組合せ、本発明の実施において使用され得る。
【００５８】
「薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤」は、当該分野で公知である生物学的に不活性な化合物を称し、本発明の抗体の投与において使用される。受容可能なキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０において記載される。受容可能なキャリアは、生体適合性塩、不活性塩もしくは生体吸収性塩、緩衝化薬剤、オリゴ糖もしくは多糖、ポリマー、ヒアルロン酸のような粘弾性の化合物、防腐剤などを包含し得る。
【００５９】
「被験体」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを称し、そして被験体には、家畜、スポーツ動物、およびヒトを含む霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
（本発明の抗体）
本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する。本明細書中に使用されるように、Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１ Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＲ−３ Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、およびそれらのフラグメントを含む。これらのフラグメントは、細胞外ドメインもしくは細胞内ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ｃｙｓリッチドメイン、レセプター結合ドメインなどのような完全なドメインであり得る。このようなフラグメントは、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の任意のドメインにおける隣接するエピトープおよび非隣接のエピトープも含み得る。
【００６１】
【化１】
一つの実施形態において、本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに結合する。ＥＧＦ様ドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基７５あたり〜アミノ酸残基１１２あたりに及ぶ。ＥＧＦ様ドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の直鎖状もしくは非直鎖状の範囲を含み得る。企図される直鎖状エピトープの例として、おおよそ残基７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９５〜１０５、１００〜１１０、または１０５〜１１２が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、ＥＧＦドメイン中のエピトープは、変性されたＣｒｉｐｔｏタンパク質に対して、高次構造上、ネイティブのＣｒｉｐｔｏタンパク質において形成されるエピトープである。
【００６２】
別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。ｃｙｓリッチドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のおおよそアミノ酸残基１１４〜アミノ酸残基１５０に及ぶ。ｃｙｓリッチドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の直鎖状もしくは非直鎖状の範囲を含み得る。企図される直鎖状エピトープの例として、おおよそ残基１１４〜１２５、１２０〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３５〜１４５、または１４０〜１５０が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、ｃｙｓリッチドメインのエピトープは、変性されたＣｒｉｐｔｏタンパク質に対して、高次構造上、ネイティブのＣｒｉｐｔｏタンパク質において形成されるエピトープである。
【００６３】
一旦、抗体が作成されれば、Ｃｒｉｐｔｏへの抗体の結合は、ＥＬＩＳＡのような当該分野において公知の標準的な技術を使用してアッセイされ得、一方、細胞表面上のＣｒｉｐｔｏの存在は、実施例２に示されるように、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、アッセイされ得る。このような結合を測定する任意の他の技術が、代わりとして使用され得る。
【００６４】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏまたはそのフラグメントに特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含有する化合物を含む）を提供する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＶを含む抗体フラグメントもまた、本発明により提供される。用語「特異的」および「選択的」は、本発明の抗体の結合を記述するため使用される場合、本発明の抗体の可変領域がＣｒｉｐｔｏポリペプチドを認識し、結合することを示す。本発明の特異的抗体がまた、この抗体の可変領域外の配列（特に、この分子の定常領域の配列）との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡもしくはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用し得ることが、理解される。本発明の抗体（すなわち、エピトープ、リガンド／レセプター結合ドメインおよびアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメインに特異的に結合する抗体）の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは、当該分野において周知であり、ルーチンとして実施される。このようなアッセイの包括的な考察に関して、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）、６章を参照のこと。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のフラグメントを認識および結合する抗体もまた企図されるが、但し、この抗体はＣｒｉｐｔｏポリペプチドに対して特異的である。本発明の抗体は、当該分野において周知の任意の方法を使用して作製され得、ルーチンとして実施され得る。
【００６５】
一つの実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープと特異的に結合する抗体を提供する。抗体の特異性は、下記により詳細に記載される。しかしながら、以前に文献に記載され、都合よく（例えば、両方のペプチド中における類似したエピトープの偶然の存在により）Ｃｒｉｐｔｏと交差反応する能力がある他のポリペプチドから作製され得る抗体は、「交差反応性」抗体とみなされることは強調されるべきである。このような交差反応性抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに対し「特異的」な抗体でない。抗体が特異的にＣｒｉｐｔｏのエピトープに結合するかどうかの決定は、当該分野いおいて周知であるウェスタンブロットアッセイのようないくつかのアッセイのうちの任意のものを使用して達成される。Ｃｒｉｐｔｏを発現する細胞を同定するために、そしてまたＣｒｉｐｔｏリガンド／レセプター結合活性を調節するためにも、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の細胞外エピトープ（すなわち、細胞の外側に見られるＣｒｉｐｔｏタンパク質の部分）と特異的に結合する抗体は、特に有用である。
【００６６】
一つの実施形態において、本発明は、ポリクローナル抗体（ここで、これらの抗体の少なくとも一つは、Ｃｒｉｐｔｏに特異的な本発明の抗体である）を含む無細胞組成物を提供する。動物から単離された抗血清は、例示的な組成物であり、この組成物は、水もしくは他の希釈液、賦形剤、またはキャリア中に再懸濁された抗血清の抗体分画を含む組成物である。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原性部位に向けられている。さらに、代表的に異なるエピトープに向けられた異なる抗体を含有するポリクローナル調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原の単一の決定因子に向けられている。モノクローナル抗体は、抗原−抗体結合を使用する診断的アッセイ方法および分析的アッセイ方法の選択性および特異性を改善するために有用である。モノクローナル抗体の別の利点は、それがハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンの混入がないことである。このような抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の局面として意図される。
【００６８】
さらに別の関連した実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的な抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体のさらに詳細な記載に関しては、例えば、米国特許第６，０６３，３７９号および米国特許第５，７８０，０２９号を参照のこと。
【００６９】
抗体が、化学的にかまたは組換え技術により単離され得る比較的小さい抗原結合ドメインを含むことは、周知である。このようなドメインは、有用なＣｒｉｐｔｏ結合分子そのものであり、そしてまた、ヒト抗体へ再導入され得るか、または化学療法剤もしくはポリペプチドと融合され得る。それ故、さらに別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。ここで、このフラグメントおよび結合された分子は、いくらかでもＣｒｉｐｔｏに結合する。限定されない例として、本発明は、単鎖抗体およびＣＤＲグラフト抗体であるポリペプチドを提供する。ＣＤＲグラフト抗体のさらに詳細な記載に関しては、例えば、米国特許第５，８５９，２０５号を参照のこと。
【００７０】
別の実施形態において、非ヒト抗体は、当該分野において公知の方法のいずれかより、ヒト化され得る。ヒト化抗体は、インビボ治療適用のために有用である。さらに、組換え型「ヒト化」抗体が、合成され得る。ヒト化抗体は、初めに非ヒト哺乳動物に由来する抗体であり、抗原結合に必要のないアミノ酸のいくらかもしくは全部を、ヒト免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖の対応する領域由来のアミノ酸で置換するため、組換えＤＮＡ技術が使用される。つまり、それらは、特異的な抗原結合の原因である領域が挿入されたヒト免疫グロブリン配列を大部分に含むキメラである（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９４／０４６７９を参照のこと）。動物は、所望される抗原で免疫され、対応する抗体は、単離され、そして、特異的な抗原結合の原因である可変領域配列の部分は、取り出される。次いで、動物由来抗原結合領域は、抗原結合領域が欠失されたヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングされる。ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用ために、抗体の非相同（種間）配列の使用を最小化し、望まれない免疫応答を引き起こしそうにない。霊長類化抗体は、霊長類（例えば、アカゲザル、ヒヒおよびチンパンジー）抗体遺伝子を使用して、同様に産生し得る。その後、さらなる変化が、アフィニティもしくは免疫原性を調節するために、抗体のフレームワークに導入され得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号を参照のこと。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、１以上のヒト免疫グロブリントランスジーンを有するトランスジェニック動物のような、非ヒト動物において産生され得るヒト抗体の使用を含む。このような動物は、米国特許第５，５６９，８２５号、ＷＯ０００７６３１０、ＷＯ０００５８４９９およびＷＯ０００３７５０４に記載されるように、そして本明細書中に参考として援用されるように、ハイブリドーマを産生するための脾細胞の供給源として、使用され得る。
【００７２】
（シグナル調節）
別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏシグナル伝達もしくはＣｒｉｐｔｏ−タンパク質相互作用を調節する。Ｃｒｉｐｔｏ活性の過剰発現は、間葉細胞の特性を促進する脱分化状態、増大された増殖、および細胞移動（Ｓａｌｏｍｏｎら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２１：６１−７０，１９９９；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２９１−２９８，１９９４；およびＢａｌｄａｓｓａｒｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：５３８−５４３，１９９６）、腫瘍形成において見られる細胞の形質転換に関連する表現型を導き得る。
【００７３】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の活性およびそのＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する能力を試験する一つの方法は、Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏノックアウト（ＫＯ）細胞株（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、Ｍｅｔｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３−１４２，２０００）を用いた方法である。Ｃｒｉｐｔｏは、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚中でｓｍａｄ２リン酸化および転写因子ＦＡＳＴを刺激し、そして転写因子ＦＡＳＴの活性は、ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター遺伝子からのルシフェラーゼ活性を測定することにより観測され得る（Ｓａｉｊｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：３５−４７，２０００）。Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子を欠失され、故にＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｏ依存的シグナル伝達に対してヌルである（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３−１４２，２０００）。Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子コンストラクト、ＦＡＳＴ遺伝子コンストラクト、およびＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ遺伝子コンストラクトをトランスフェクトすることにより、Ｆ９Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において評価され得る。これらの細胞株中で、Ｃｒｉｐｔｏ ｃＤＮＡ、およびＦＡＳＴＡ ｃＤＮＡがその中へトランスフェクトされなければ、Ｃｒｉｐｔｏ依存的ＦＡＳＴルシフェラーゼ活性は、見られない。Ｃｒｉｐｔｏ依存的なＮｏｄａｌのシグナル伝達を遮断し得る抗体は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達機能を遮断する抗体である。
【００７４】
軟寒天アッセイにおける増殖（下記の実施例４を参照のこと）のような、Ｃｒｉｐｔｏの活性を測定し得る他のアッセイは、当業者により使用され得る。軟寒天中で細胞が増殖する能力は、細胞の形質転換と関連し、そして、このアッセイは、腫瘍細胞増殖の阻害を測定するための古典的なインビトロアッセイである。活性の阻害を決定する際に有用な他のアッセイには、プラスチック上のインビトロアッセイなどが挙げられる。
【００７５】
（治療用途）
本発明の抗体は、腫瘍細胞増殖の調節などの治療目的、Ｃｒｉｐｔｏを検出するかもしくはＣｒｉｐｔｏを定量するための診断目的、およびＣｒｉｐｔｏの精製のためにも有用である。
【００７６】
本発明の一つの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、患者における腫瘍細胞の増殖を調節する抗体が、提供される。一つの実施形態において、腫瘍細胞は、精巣腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸部腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞である。
【００７７】
別の実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を調節する抗体が、提供される。一つの実施形態において、腫瘍細胞は、乳癌、精巣癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、膵臓癌、および胃癌由来の細胞株のようなＣｒｉｐｔｏを過剰発現する細胞株である。
【００７８】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、下記の実施例４に例示されるように、当業者により使用される標準的なプロトコルについて、潜在的な抗癌剤としてのインビボ活性に対し、スクリーニングされ得る。このようなプロトコルの例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）により、「ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」プロトコル、ＮＩＨ 出版番号８４−２６３５（Ｆｅｂ １９８４）中に、概要を述べられている。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は、癌性の腫瘍を有する患者の処置のために使用される。
【００８０】
本発明の抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合され得、治療上有効な用量で、患者に投与され得る。腫瘍の増殖を阻害する方法の考察に関しては、例えば、米国特許第６，１６５，４６４号を参照のこと。
【００８１】
Ｃｒｉｐｔｏの異常なレベル（すなわち、上昇されたレベルもしくは欠失されたレベル）に関連した障害に罹患した被験体を処置する方法もまた、意図される。ここで、この方法は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン（エピトープがＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインもしくはｃｙｓリッチドメイン中にあるドメインを含むが、限定されない）中のエピトープに特異的に結合する有効量の抗体を患者に投与する工程を包含する。
【００８２】
Ｃｒｉｐｔｏの異常なレベル（すなわち、上昇されたレベルもしくは欠失されたレベル）に関連した障害に罹患した被験体を処置する方法もまた、意図される。ここで、この方法は、Ｃｒｉｐｔｏと特異的に複合体を形成し、Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１９）、およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１３）から成る群から選択される抗体が向けられるエピトープに向けられる有効量の抗体を被験体に投与すること工程を包含する。
【００８３】
Ｃｒｉｐｔｏの検出を介した診断は、本発明の新規抗体を使用した標準的な結合アッセイにより容易に達成され、このことは、当業者が多種多様なサンプル、培養物中などで特異的にＣｒｉｐｔｏの存在を検出することを可能にする。
【００８４】
本明細書中に記載される任意の目的のために、本発明の抗体を備えるキットもまた、包含される。一般に、本発明のキットはまた、抗体が免疫特異的であるコントロール抗原も備える。実施形態は、全ての試薬およびその使用のための指示書きを備えるキットを含む。
【００８５】
本発明のさらなる特徴は、下記の例示的な実施例から明らかある。
【実施例】
【００８６】
（実施例１：Ｃｒｉｐｔｏの発現および精製）
ｐＳＧＳ４８０で示される発現プラスミドを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（すなわち、「ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃ」）と融合された、ＣｒｉｐｔｏのヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基１〜１６９[配列番号１のアミノ酸１〜１６９]をコードするｃＤＮＡの、ベクターｐＥＡＧ１１００へのサブクローニングにより構築された。
このベクターのさらに詳細な記載に関しては、同時係属の米国特許出願番号６０／２３３，１４８、２０００年９月１８日出願を参照のこと。ベクターｐＥＡＧ１１００は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのプラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−ｂｅｔａｇａｌの誘導体であり、ＣＨＯ一過性トランスフェクトにおけるその使用は、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉら、１９９９，Ｆｏｃｕｓ ２１：１６により記載された。プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−Ｂｅｔａｇａｌ（カタログ番号１０５８６−０１４）からレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼＮｏｔＩフラグメントを除去することにより、以下のようにそれを作製した：このプラスミドを、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、４．３８ｋｂ ＮｏｔＩベクター骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）フラグメントを、ゲル精製し、連結した。連結されたＤＮＡを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。ｐＥＡＧ１１００を、単離されたシングルコロニーから、所望される組換え体を含むプラスミドとして単離した。プロモーター、ポリリンカー、および転写終結シグナルに及ぶｐＥＡＧ１１００の配列を、確認した。
【００８７】
プラスミドｐＳＧＳ４８０を、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、そしてこの細胞を、２８℃で７日間、増殖させた。これらの細胞内および馴化培地におけるＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質の存在を、ウェスタンブロット解析により試験した。ウェスタンブロット解析のため、馴化培地およびＣｒｉｐｔｏトランスフェクト細胞由来の細胞を、還元条件下で４〜２０％勾配ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースに電気泳動的に移し、そしてＣｒｉｐｔｏ融合タンパク質を、Ｃｒｉｐｔｏ １７マーペプチド（配列番号１の残基９７〜１１３を含む）−キーホールリンペットヘモシアニン結合体に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清で検出した。細胞を除去するための遠心後、ウェスタンブロット解析により、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質が、効率的に馴化培地（上清）中に分泌されたことを示した。上清を、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、結合されたタンパク質を、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出されたタンパク質を、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）で中和し、そして２４０〜３４０ｎｍでの吸光度測定により総タンパク質含量を解析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を解析した。溶出されたタンパク質を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、−７０℃で保存した。
【００８８】
(実施例２：抗体の作製とスクリーニング）
溶出されたＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質を、マウスに注射し、そして当業者に公知の標準的なハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製する。
【００８９】
（Ａ．抗体の作製）
具体的には、メスのロバートソニアンマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、完全フロイントアジュバント（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１５７２１−０１２）で乳化された２５μｇの精製ヒトＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで腹腔内に免疫した。マウスを、不完全フロイントアジュバント（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１５７２０−０１４）で乳化された２５μｇのＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで２回、およびプロテインＡビーズで１回腹腔内に追加免疫した。血清を、スクリーニングし、最後の追加免疫から３週間後に、最高の力価を有するマウスを、融合の３日前、５０μｇの可溶性ＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで、腹腔内に追加免疫した。融合の前日に、マウスを、５０μｇのＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで、静脈内に追加免疫した。マウス脾臓細胞を、ＦＬ６５３ミエローマ細胞と、１脾臓細胞：６ミエローマ細胞の比率で融合し、そして選択培地で９６ウェルの組織培養プレートに１ウェルあたり１００，０００細胞、３３，０００細胞および１１，０００細胞でプレートした。増殖に関して陽性のウェルを、ＦＡＣＳでスクリーニングし、１週間後、ＥＬＡＳＡでスクリーニングした。２回の融合を、実施した。
【００９０】
（Ｂ．抗体のスクリーニング）
第１の融合もしくは第２の融合から生じた上清を、Ｃｒｉｐｔｏ ｄｅｌ Ｃおよび／もしくはＣｒｉｐｔｏ ＥＧＦ様ドメインタンパク質の認識に関して、まずＥＬＩＳＡプレートでスクリーニングした。コントロール融合タンパク質（ＬＴ−βレセプター−Ｆｃ）を、ヒトＦｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を捨てるために、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ＥＬＡＳＡを、下記の節Ｃに記載されるように、実施した。第１の融合において、最初の上清を、ＦＡＣＳにより、精巣腫瘍細胞株、ＮＣＣＩＴにおける細胞表面のＣｒｉｐｔｏタンパク質を認識する能力に関しても、スクリーニングした。第２の融合の場合、２種の腫瘍細胞株、ＮＣＣＩＴおよび乳癌株、ＤＵ４４７５におけるＣｒｉｐｔｏを認識する上清の能力を、ＦＡＣｓにより解析した。２次スクリーニングは、腫瘍細胞株のパネルにおける細胞表面Ｃｒｉｐｔｏを認識するモノクローナル抗体上清の能力（結果は、表１および表２を参照のこと）、ヒト乳房腫瘍およびヒト結腸腫瘍組織切片において免疫組織化学的に、ヒトＣｒｉｐｔｏを認識するモノクローナル抗体の能力、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達アッセイでブロックするモノクローナル抗体の能力、プラスチック上もしくは軟寒天アッセイにおいて、腫瘍細胞株の増殖をブロックする能力、および細胞表面Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズする能力を試験すること包含した。
【００９１】
（Ｃ．ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡアッセイが以下のように実施された：
材料：
プレート：Ｃｏｓｔａｒ ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅａｓｙ−ｗａｓｈ ９６Ｗ プレート（０７−２００−６４２）
２’抗体：Ｐｉｅｒｃｅ Ｇｔ ａｎｔｉ−Ｍｓ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｐ１３１４３０）
基質：Ｐｉｅｒｃｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（３４０２１）
停止液：１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
緩衝液：
結合緩衝液：０．１Ｍ ＮａＨＰＯ４ ｐＨ９．０
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ＋１０％ドナー子ウシ血清
洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．１％ ｔｗｅｅｎ−２０
抗原ＣＲ−ｄｅｌ−Ｃ−ＦｃおよびＣＲ−ＥＧＦ−ｆｃ（コントロールｈｕ ＩｇＧ１融合タンパク質）を結合緩衝液で５００ｎｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間または４℃で一晩、インキュベートした。液体をデカントし、プレートを反転させ、乾燥するまでブロットした。次いで、２５０μ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、その後３７℃で３０分間インキュベートした。再び、液体をデカントし、プレートを反転させ、乾燥するまでブロットした。上清を洗浄緩衝液で１：５０に希釈し、５０μｌ／ウェルでプレートし、その後、室温で１時間インキュベートした。プレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を用いて３回、激しく洗浄した。次いで、洗浄緩衝液で１：１０，０００に希釈した２’抗体（１００μｌ／ウェル）を添加し、その後室温で３０分間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液（２５０μｌ／ウェル）を用いて、３回、激しく洗浄し、次いで、基質を１００μｌ／ウェルで添加した。色が、十分に濃くなるまで発色させ、次いで、停止液（１００μｌ／ウェル）を添加し、プレートを４５０ｎｍの吸光度で読み取った。
【００９２】
（Ｄ．フローサイトメトリー）
Ｃｒｉｐｔｏポジティブ細胞株は、以下のように、細胞表面染色およびフローサイトメトリーを用いて、Ｃｒｉｐｔｏとの結合について、モノクローナル抗体をアッセイするために使用され得る：
５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２ｍｌＰＢＳ−が入っている、Ｔ１６２フラスコから３７℃で１０分、細胞を放出する。細胞をバラバラにするため、数回ピペットで吸い上げたり吸い出したりしながら、血清を有する培地で２０ｍｌにする。１２００ｒｐｍで５分間スピンさせる。０．１％ ＢＳＡ（洗浄緩衝液）を含有する４℃のＰＢＳ（５〜１０ｍｌ）で細胞を洗浄する。１２００ｒｐｍで５分間、スピンさせる。洗浄緩衝液に４×１０６〜１０７／ｍｌで再懸濁する。氷の上で維持する。
【００９３】
染色用の抗体を調整する。洗浄緩衝液に、精製された抗体を１〜１０μｇ／ｍｌまで希釈する。５０μｌの細胞を、９６−ウェル Ｌｉｎｂｒｏ Ｖ底プレート（ＩＣＮ ７６３２１０５）に添加する。分析すべき各細胞株に対する、各コントロールのために１ウェルの細胞をプレートする。これらの細胞に対するコントロールとしては、抗体なし、二次抗体のみ、ハイブリドーマ培地、ポジティブコントロール抗体上清（または、入手可能な場合は、精製されたもの）、およびＩｇＧサブクラスコントロール（精製された抗体を使用する場合）が挙げられる。
【００９４】
分析すべき各細胞株について、各実験用サンプルに対して１ウェルの細胞をプレートする。４℃で卓上遠心分離機を用いて、５分間１２００ｒｐｍでプレートをスピンさせる。プレートを反転させることによって緩衝液を飛ばし、液体が実質的に除去されるまで、振盪する。４０−５０μｌの抗体（または、抗体なしのコントロールウェルおよび二次抗体のみのコントロールウェルについては洗浄緩衝液）をウェルに添加する。４℃で少なくとも３０分〜１時間、インキュベートする。１２００ｒｐｍで５分間、プレートをスピンする、抗体溶液を飛ばす。１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝液で２回ずつウェルを洗浄し、各洗浄後にスピンする。緩衝液を飛ばす。
【００９５】
Ｒ−ＰＥ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ カタログ番号１１５−１１６−０７１）の１：２００希釈物（洗浄緩衝液中）の５０μｌを含む各ウェルに細胞を再懸濁する。暗闇で、４℃で２０分間、インキュベートする。各ウェルの細胞に、１５０μｌの洗浄緩衝液を添加する。１２００ｒｐｍで５分間、プレートをスピンする。１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝液で１回洗浄する。ＰＢＳ中１％ ＰＦＡの１５０μｌに細胞を再懸濁する。各ウェルの内容物を別のチューブ（５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ ポリスチレン丸底チューブ−３５２０５２）に移す。チューブをスズ箔で包む。
【００９６】
次いで、チューブの内容物をフローサイトメトリーにより読み取る。
【００９７】
この方法によって得られた、モノクローナル抗体の２回のスクリーニングの結果は、以下の表１および表２に要約された、以下の結果を生じ、ここで第一列は、バイブリドーマサブクローンの指定された名前を提供し、次の２つの列は、ＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示し、残りの列は、４つのＣｒｉｐｔｏ−ポジティブ細胞株についてのフローサイトメトリー分析結果を示す。これらの結果は、平均蛍光係数の単位（ＭＦＩ）で与えられる。
【００９８】
（表１：抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体の特性づけ）
【００９９】
【表１】
（表２：抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体の特性づけ）
【０１００】
【表２】
（実施例３：Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の阻害についてのヌル細胞アッセイ）
以下は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の阻害を評価するために使用される、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏヌル細胞シグナル伝達アッセイを記載する。
【０１０１】
第０日目 １５分間３７℃で、１ウェルあたり２ｍｌの０．１％ゼラチンで６個のウェルプレートをコーティングする。１ウェルあたり６×１０５個のＦ９ ＣＲＩＰＴＯ ＮＵＬＬ細胞で播種する。
【０１０２】
第１日目 トランスフェクション：
以下サンプルの各々を３００μｌのＯｐｔｉＭｅｍｌに添加し、各サンプルについての溶液Ａを生成する：
サンプル１：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼＦＡＳＴレポーターｃＤＮＡ＋１．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル２：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ ＦＡＳＴ、および１μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル３：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ ＡＤＤ
０．５ ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル４：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル５：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル６：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル７：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル８：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル９：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
溶液Ｂは、３０μｌのリポフェクタミン＋２７０μｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を含む。
【０１０３】
各サンプルについて、溶液Ａと溶液Ｂを一緒に混合する。室温で４５分間インキュベートする。２ｍｌ／ウェルのＯｐｔｉＭｅｍ１でウェルをリンスする。次の工程の直前に吸引する。
溶液Ａ＋Ｂの各混合物に２．４ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を添加し、混合し、二組のウェルに１ウェルあたり１．５ｍｌを加える。３７℃で５時間、インキュベートする。１ウェルあたり１．５ｍｌのＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ、Ｐ／Ｓを、サンプル１〜３を受けるウェルに添加する。以下のように、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を添加する：サンプル４ウェル：Ａ２７Ｆ６．１（１０μｇ／ｍｌ）；サンプル５ウェル：Ａ２７Ｆ６．１（２μｇ／ｍｌ）；サンプル６ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８（１０μｇ／ｍｌ）、サンプル７ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８（２μｇ／ｍｌ）；サンプル８ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８（１０μｇ／ｍｌ）；サンプル９ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８（２μｇ／ｍｌ）。
【０１０４】
第２日目 培地を取り除き、ＰＢＳ（２ｍｌ／ウェル）で細胞を洗浄する。ＤＭＥＭ＋０．５％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ、前日と同量のＣｒｉｐｔｏ抗体を含有するＰ／Ｓを、同じウェルに添加する。
【０１０５】
第３日目 ルシフェラーゼシグナルを発生させる。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＰＢＳ＋Ｍｇ２＋（２ｍｌ／ウェル）でウェルを洗浄する。ＬｕｃＬｉｔｅキット（カタログ番号６０１６９１１）を使用する。緩衝液および基質を室温にする。明かりを暗くする。１０ｍｌの緩衝液で基質を再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）する。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＰＢＳ＋Ｍｇ２＋で１：１希釈する。ウェルを吸引する。反復ピペッタを用いて、１ウェルあたり２５０μｌの希釈した基質を素早く添加する。溶液を旋回させ、２００μｌを、９６ウェルの白い不透明な底のプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５−３２９６）のウェルに移す。Ｗｉｎｇｌｏｗを用いて照度計のプレートを読み取り、エクセルにデータを書き出す。
【０１０６】
このアッセイの結果を以下の表３に要約する。
【０１０７】
（表３：Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達アッセイ：抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体での阻害）
【０１０８】
【表３】
（実施例４：腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害についてのアッセイ）
Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の阻害はまた、軟寒天中のＧＥＯ細胞の増殖を測定することによって、アッセイされ得る。例えば、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９４年１月；９（１）：２９１−８；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９１年２月１日；５１（３）１０５１−４を参照のこと。
【０１０９】
初めに、３％ バクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）を溶かす。水浴中に４２℃で保存する。次いで、予め温めた完全培地と３％バクトアガー溶液とを混合し、４２℃で維持しながら、０．６％ バクトアガーの溶液を作製する。６ｃｍ皿に４ｍｌの溶液をプレートし、少なくとも３０分間冷却させ、底面寒天層を形成させる。ＧＥＯ細胞をトリプシン処理し、完全培地で１０５細胞／ｍｌまで再懸濁する。アッセイされるべき抗体（またはコントロール）を、抗体（２０μｇ〜１μｇ）を適定しながら、細胞懸濁物に添加する。等量のＧＥＯ細胞懸濁液と０．６％バクトアガーとを混合し、そして２ｍｌを底面寒天層の上部にかぶせる。少なくとも１時間冷却させる。ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で１４日間インキュベートする。顕微鏡を使用せず可視的なコロニーを数える。ネガティブコントロールと比較して、コロニーの非存在は、試験した抗体がインビトロ腫瘍細胞増殖を阻害することを示す。
【０１１０】
このアッセイは、抗体Ａ２７Ｆ６．１およびＢ６Ｇ７．１０について、表４に示す結果を得るために使用され、これらの抗体は共に、ＧＥＯ細胞コロニーの増殖を低減させる能力を実証している。
（表４：軟寒天アッセイにおける増殖の結果）
【０１１１】
【表４】
（実施例５：腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害についてのアッセイ）
腫瘍細胞増殖の阻害を評価するために、ヒト腫瘍細胞株を胸腺欠損ヌードマウスの皮下に移植し、そして本発明の抗体の効果は、腫瘍阻害へ相乗効果または相加効果を提供し得るさらなる化学療法処置の有無にかかわらず観察された。
【０１１２】
このアッセイは、異なる腫瘍細胞株（例えば、ＧＥＯ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる、ウェル分化型ヒト結腸癌インビトロ細胞株）、ＤＵ−４４７５（ＡＴＣＣから得られた乳癌インビトロ細胞株）、ＮＣＣＴＴ（ＡＴＣＣから得られた精巣腫瘍細胞株）または当該分野に公知の他の細胞株）を用いて代替的に実施され得る。このようなアッセイの１つの例は以下のとおりである：
動物に、耳パンチによって個々に印を付ける。ＧＥＯ細胞株は、１〜４継代にわたって、インビトロまたはインビボで継代する。動物の右腹部位の皮下にＧＥＯ細胞を移植する。以下の動物集団を使用し得る：
【０１１３】
【表５】
第０日目：腫瘍を移植し、動物の初期の体重を記録する。
【０１１４】
第１日目：上記に示すように、処置を開始する。
【０１１５】
第５日目：腫瘍サイズおよび体重の測定を開始し、実験が終了するまで、週に２回続ける。
【０１１６】
初期体重、腫瘍サイズおよび体重の測定、屠殺での組織学、および腫瘍における免疫組織化学的分析法が試験され、Ｃｒｉｐｔｏ発現、腫瘍増殖、およびその阻害を分析する。
【０１１７】
（実施例６：インビトロ異種移植片腫瘍モデル−Ｃｙｓリッチブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌腫細胞株を、ＣｒｉｐｔｏのＣｙｓリッチドメインに結合する抗体とともに皮下に移植した。実験方法を以下に記載する。結果を図１に示す。
【０１１８】
（方法および材料）
動物：胸腺欠損ヌード雄マウスを使用した。耳パンチによって、動物を個々に番号を付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ（元々、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した、縦隔混合型生殖（ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ ｍｉｘｅｄ ｇｅｒｍ）細胞ヒト精巣癌インビトロ細胞株）。細胞株を、抗生物質を有さないＲＰＭＩ−１６４０／１０％ ＦＢＳでの、６継代にわたって、インビトロで継代した。動物の右腹部に５ｘ１０６細胞／０．２ｍｌ マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を皮下移植した。
【０１１９】
【表６】
第１日目に処置を開始する。
試験日程
第−１日目：マウスを無作為にコントロールと処置グループに分けた。動物の初期体重を記録した。抗体グループに最初の処置をほどこした。投与溶液を生成した。アッセイが終了するまで、処置は技術者には見せなかった。
第０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍に、細菌培養を流した。
第１日目：ポジティブ化学療法グループに対して最初の処置を投与した。
第４日目：マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）の腫瘍基準についての初期腫瘍サイズの測定値を記録した。週に２回、マウスの腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。毎日、研究を観測し、動物のいかなる異常な観察をも記録した。
指標：初期の体重
腫瘍サイズおよび体重測定
（実施例７：インビトロ異種移植片腫瘍モデル−ＥＧＦ様ドメインブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌細胞株に、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに結合する抗体を皮下移植した。実験方法を以下に記載する。結果を図２に示す。
【０１２０】
（方法および材料）：
動物：胸腺欠損ヌード雄マウスを使用した。耳パンチによって、動物に個々に番号を付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ（元々Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した、縦隔混合型生殖細胞ヒト精巣癌インビトロ細胞株）。細胞株を、抗体を含まないＲＰＭＩ−１６４０／１０％ ＦＢＳで、８継代にわたってインビトロで継代した。動物の右腹部に５ｘ１０６細胞／０．２ｍｌ ｍａｔｒｉｇｅｌを皮下に移植された動物。
【０１２１】
【表７】
第１日目に処置を開始する。
試験日程：
第−１日目：マウスを無作為にコントロールと処置グループに分けた。動物の初期体重を記録した。抗体グループに最初の処置をほどこした。投与溶液を生成した。アッセイが終了するまで、処置は技術者には見せなかった。
第０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍に、細菌培養物を流した。細菌培養物は、サンプリング後２４時間および４８時間で、混入についてネガティブだった。
第１日目：ポジティブ化学療法グループに対して最初の処置をほどこした。
第４日目：マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌの腫瘍基準についての初期腫瘍サイズの測定値を記録した。週に２回、マウスの腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。毎日、研究を観測し、動物のいかなる異常な観察をも記録した。
指標：初期の体重
腫瘍サイズおよび体重の測定値
（実施例８：ＡＬＫ４結合をブロックするＣｒｉｐｔｏ ｍａｂｓ）
Ｃｒｉｐｔｏ特異的モノクローナル抗体が、Ａｌｋ４（アクチビンＩ型レセプター）に結合するＣｒｉｐｔｏの能力を阻害し得るかどうかを評価するために、Ａｌｋ４を安定に発現する２９３細胞株を用いてフローサイトメトリー分析を使用した。この細胞株を発生するために、２９３細胞を、ＨＡエピトープを用いてＣ末端でタグされたＡｌｋ４を発現するプラスミドおよび、１０：１の割合で薬剤（ピューロマイシン）を発現するプラズミドで同時トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、コロニーが形成されるまで、ピューロマイシンで選択した。次いで、コロニーを取り、増殖させ、そして、ＨＡについてウェスタンブロット法を用いてＡｌｋ４発現を分析した。コントロール（トランスフェクトされなかった２９３細胞）と比較して、クローン２１（２９３−Ａｌｋ４−２１）はＡｌｋ４を高いレベルで発現することが見いだされた。
【０１２２】
フローサイトメトリーによりＣｒｉｐｔｏ−Ａｌｋ４結合を分析するために、ヒトＩｇＧ（ＣｒｄｅｌＣ−Ｆｃ）のＦｃ部分と融合した、精製された、可溶性形態のヒトＣｒｉｐｔｏ（ａａ １−１６９）を使用した。約５μｇ／ｍｌのＣｒｄｅｌＣ−ＦｃまたはコントロールのＦｃタンパク質を、３０分間氷上で、５０μｌ総容量のＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）中の３ｘ１０５ ２９３−Ａｌｋ４−２１細胞と共に、インキュベートした。抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を含むサンプルについて、５μｇ／ｍｌ ＣｒｄｅｌＣ−Ｆｃを、細胞を添加する前に氷上で、５０μ／ｍｌの各Ｃｒｉｐｔｏ抗体（Ａ１０．Ｂ２．１８、Ａ４０．Ｇ１２．８、Ａ２７．Ｆ６．１、Ａ８．Ｈ３．１、Ａ１９．Ａ１０．３０、Ａ６．Ｆ８．６、Ａ８．Ｇ３．５、Ａ６．Ｃ１２．１１）と共に、予めインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｒ−フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓ製）と共に細胞をインキュベートすることによって、結合Ｆｃタンパク質を検出した。次いで、サンプルを再び洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、標準的なフローサイトメトリー手順を用いて分析した。ＦＡＣＳアッセイの結果を図３に示す。
【０１２３】
上記の本発明のいくつかの実施形態は、以下で概説され、次の実施形態を含むが、これらに限定されない。当業者が理解するように、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の様々な実施形態に、多くの変更と修正がなされ得る。このような可変のすべてが本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【０１２４】
本明細書に引用される各刊行物の開示全体が、参考として本明細書に援用される。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、２００２年３月２２日に出願された、米国特許出願第６０／３６７，００２号の継続出願であり、それは、２００１年６月２６日に出願された米国特許出願第６０／３０１，０９１号の一部継続出願であり、それは、２００１年５月１７日に出願された米国特許出願第６０／２９３，０２０号の一部継続出願であり、それは、２００１年４月２６日に出願された米国特許出願第６０／２８６，７８２号の一部継続出願である。前述の特許出願の各々の全ての開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、一般的に遺伝学ならびに細胞生物学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節する抗体、このような抗体を含むキット、ならびにこれらの抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
Ｃｒｉｐｔｏは、ヒト胚癌腫ライブラリー（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら１９８９、ＥＭＢＯ Ｊ．，８巻、７号、ｐｐ．１９８７−１９９１）のｃＤＮＡスクリーニングにおいて思いがけなくも単離された１８８のアミノ酸残基の細胞表面タンパク質である。このＣｒｉｐｔｏタンパク質は、以下の少なくとも２種類の注目すべきドメインを有する：システインリッチドメイン、および上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー中に見出されたドメインと類似するとして最初に特徴づけられたドメイン。Ｃｒｉｐｔｏは、このＥＧＦファミリーのメンバーとして、元々分類され（Ｃｉｃｃｏｄｉｃｏｌａら、前記）；しかし、引き続く分析は、Ｃｒｉｐｔｏが公知のＥＧＦレセプターのいずれにも結合せず、そしてこのＥＧＦ様ドメインは実際には、このＥＧＦファミリーと相違したことを示した（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：８６２４−８６２９）。
【０００４】
Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達経路は、以下を含むいくつかの異なる経路の活性化を支持する文献での継続的な研究にもかかわらず、理解しにくいままである：ＭＡＰキナーゼ経路（ＤｅＳａｎｔｉｓら、１９９７，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．，８：１２５７−１２６６；Ｋａｎｎｎａｎら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３３３０−３３３５）、ＴＧＦ−β経路（Ｇｒｉｔｓｍａｎら，１９９９，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：９２１−９３２；Ｓｃｈｉｅｒら、２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０３：３８５−３８９），Ｗｎｔ経路との潜在的な相互作用（Ｓａｌｍｏｎら，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｌａｔ Ｃａｎｃｅｒ．２０００ Ｄｅｃ；７（４）：１９９−２２６；およびＥＧＦ経路とのクロストーク（Ｂｉａｎｃｏら、１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７４：８６２４−８６２９）。
【０００５】
米国特許第５，２５６，６４３号、およびこれに関する２つの分割出願（米国特許第５，６５４，１４０号および同第５，７９２，６１６号）は、ヒトのＣｒｉｐｔｏ遺伝子、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、およびＣｒｉｐｔｏに対する抗体を開示する。
【０００６】
米国特許第５，２６４，５５７号、およびこれに関する３つの分割出願（米国特許第５，６２０，８６６号、同第５，６５０，２８５号および同第５，８５４，３９９号）は、ヒトのＣｒｉｐｔｏ関連遺伝子、およびＣｒｉｐｔｏ関連タンパク質を開示する。Ｃｒｉｐｔｏ関連タンパク質に結合するが、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質自体に結合することによって交差反応しない抗体もまた、開示される。
【０００７】
Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の過剰発現は、小さなｃｒｉｐｔｏペプチドに対して惹起されたウサギポリクローナル抗体を用いるヒト組織の免疫染色によって、実証されるように、以下の多くの腫瘍型と関連するが、これらに限定されない：乳、精巣、結腸、肺、卵巣、膀胱、子宮、頸部、膵臓、および胃。Ｐａｎｉｃｏら、１９９６，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６５：５１−５６；Ｂｙｒｎｅら、１９９８，Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１８５：１０８−１１１；Ｄｅ Ａｎｇｅｌｉｓら、１９９９，Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４：４３７−４４０。従って、この分野は、このような過剰発現の制御手段、制限手段、および／または予防手段、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達の調節手段、ならびにＣｒｉｐｔｏ発現の結果の調節（すなわち、細胞形質転換の促進および／または維持）手段を必要としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメインのエピトープと特異的に結合する抗体（項目２）
前記Ｃｒｉｐｔｏが、配列番号１または配列番号２からなる群から選択される、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記エピトープがＥＧＦ様ドメインである、項目２に記載の抗体。
（項目４）
前記エピトープがｃｙｓリッチドメインである、項目２に記載の抗体。
（項目５）
Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、およびＢ６Ｇ７．１０からなる群から選択される、項目２に記載の抗体。
（項目６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、Ｂ６Ｇ７．１０、Ａ１７Ｇ１２．１およびＡ１８Ｂ３．１１からなる群から選択される、項目３に記載の抗体。
（項目７）
Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群から選択される、項目４に記載の抗体。
（項目８）
Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２にまたがるドメインに含まれるエピトープと特異的に結合する抗体。
（項目９）
Ａ１０Ｂ２．１８およびＢ３Ｆ６．１７である、項目８に記載の抗体。
（項目１０）
抗体Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５、Ａ８Ｈ３．１、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１８、Ａ２７Ｆ６．１、Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７、およびＢ６Ｇ７．１０が結合する、エピトープの群から選択されたエピトープと特異的に結合する抗体。
（項目１１）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節し得る抗体。
（項目１２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１１に記載の抗体。
（項目１３）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１およびＡ２７Ｆ６．１から選択される、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１１に記載の抗体。
（項目１５）
Ａ６Ｃ１２．１１である、項目１４に記載の抗体。
（項目１６）
Ａ４０Ｇ１２．８、Ａ８Ｈ３．１、Ａ２７Ｆ６．１、およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群から選択される、項目１１に記載の抗体。
（項目１７）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、腫瘍増殖を調節し得る抗体。
（項目１８）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１７に記載の抗体。
（項目１９）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目１７に記載の抗体。
（項目２０）
Ａ２７Ｆ６．１、Ａ８Ｇ３．５およびＢ６Ｇ７．１０からなる群から選択される、項目１７に記載の抗体。
（項目２１）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体。
（項目２２）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２１に記載の抗体。
（項目２３）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２１に記載の抗体。
（項目２４）
Ａ２７Ｆ６．１である、項目２１に記載の抗体。
（項目２５）
Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１９）、およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−３３１３）からなる群から選択される、ハイブリドローマによって生成される抗体。
（項目２６）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得る抗体。
（項目２７）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２６に記載の抗体。
（項目２８）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目２６に記載の抗体。
（項目２９）
Ａ８Ｇ３．５、Ａ６Ｆ８．６およびＡ６Ｃ１２．１１からなる群から選択される、項目２６に記載の抗体。
（項目３０）
Ｃｒｉｐｔｏと特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体。
（項目３１）
ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインのエピトープと特異的に結合する、項目３０に記載の抗体。
（項目３２）
Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメインのエピトープと特異的に結合する、項目３０に記載の抗体。
（項目３３）
Ａ８Ｇ３．５である、項目３０に記載の抗体。
（項目３４）
Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得るＣｒｉｐｔｏ抗体。
（項目３５）
前記抗体が化学療法剤に結合されている、項目３４に記載の抗体。
（項目３６）
Ａ２７Ｆ６．１およびＢ３Ｆ６．１７から選択される、項目３４に記載の抗体。
（項目３７）
項目１〜３５のいずれかに記載の抗体の少なくとも１つを含む、Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する被験体に投与するための組成物。
（項目３８）
前記被験体がヒトである、項目３７に記載の組成物。
（項目３９）
さらに医薬的に容認可能な賦形剤を含む、項目３７に記載の組成物。
（項目４０）
前記抗体が化学療法剤に結合されている、項目３７に記載の組成物。
（項目４１）
さらに非結合化学療法剤を含む、項目３７に記載の組成物。
（項目４２）
サンプルに項目３７の組成物を添加する工程を含む、サンプル中でのインビトロの腫瘍細胞の増殖を調節する方法。
（項目４３）
被験体に、有効な量の項目３７に記載の組成物を投与する工程を含む、被験体のインビトロでの腫瘍細胞の増殖を調節する方法。
（項目４４）
前記被験体がヒトである、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する被験体を処置する方法であって、有効な量で項目３７に記載の組成物を該被験体に投与することを含む、方法。
（項目４６）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、有効な量で項目３９に記載の組成物を該患者に投与することを含む、方法。
（項目４７）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、有効な量で項目４０に記載の組成物を該患者に投与することを含む、方法。
（項目４８）
Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する患者を処置する方法であって、有効な量で項目４１に記載の組成物を該患者に投与することを含む、方法。
（項目４９）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４２に記載の方法。
（項目５０）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目５１）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４４に記載の方法。
（項目５２）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４５に記載の方法。
（項目５３）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４６に記載の方法。
（項目５４）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４７に記載の方法。
（項目５５）
前記腫瘍細胞が、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞からなる群から選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５６）
項目１〜３７のいずれかに記載の抗体を用いるイムノアッセイにおいて、被験体由来の組織を分析する工程を含む、組織がＣｒｉｐｔｏを発現するかどうかを決定する方法。
（項目５７）
項目１〜３７のいずれかに記載の抗体を用いるイムノアッセイで細胞株を分析する工程を含む、細胞株がＣｒｉｐｔｏを発現するかどうかを決定する方法。
（項目５８）
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目５９）
前記抗体がヒト化抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目６０）
前記抗体がヒト抗体である、項目１に記載の抗体。
（項目６１）
所望でない細胞増殖と関与する状態のための被験体を処置する方法であり、該方法が、項目３７の組成物を前記被験体に投与することを含む方法。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する新規の抗体、ならびにこのような抗体の製造方法および使用方法を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達またはタンパク質相互作用を調節する抗体（例えば、Ｃｒｉｐｔｏと結合し、その結果、Ｃｒｉｐｔｏとのタンパク質の相互作用から生じるシグナルが、下方に調節される抗体）を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そして腫瘍増殖を調節する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し、そして腫瘍増殖を調節する抗体を提供する。本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし、そして腫瘍増殖を調節する抗体を提供する。
【００１０】
本発明の一つの局面においては、本発明の抗体は、以下の抗体が結合するエピトープの群から選択されたエピトープに特異的に結合する：Ａ６Ｃ１２．１１，Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９，Ａ８Ｆ１．３０，Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７），Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ８Ｈ３．２，Ａ１９Ａ１０．３０，Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ２Ｄ３．２３，Ａ７Ａ１０．２９，Ａ９Ｇ９．９，Ａ１５Ｃ１２．１０，Ａ１５Ｅ４．１４，Ａ１７Ａ２．１６，Ａ１７Ｃ１２．２８，Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４），Ａ１７Ｈ６．１，Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２），Ａ１９Ｅ２．７，Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９），Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３），Ｂ１１Ｈ８．４。
【００１１】
本発明の別の局面においては、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する。Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１（配列番号１）またはＣＲ−３（配列番号２）から選択され得る。さらに特定の実施形態においては、リガンド／レセプター結合ドメイン中のこのエピトープに特異的に結合する抗体としては、例えば、以下が挙げられる：Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８），Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７），Ａ１９Ａ１０．３０，Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４），Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２），およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）。
【００１２】
一つの実施形態においては、本発明の抗体が結合するエピトープは、ＥＧＦ様ドメイン中にある。ＥＧＦ様ドメイン中のこのエピトープに特異的に結合する抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４），およびＡ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）。
【００１３】
別の実施形態においては、本発明の抗体が結合するエピトープは、ｃｙｓリッチドメイン中にある。このｃｙｓリッチドメイン中のこのエピトープに特異的に結合する抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ１９Ａ１０．３０，Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７），Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）およびＡ６Ｃ１２．１１。
【００１４】
別の実施形態においては、本発明の抗体が結合するこのエピトープは、Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメイン中にある。Ｃｒｉｐｔｏのアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１），Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９），およびＡ１７Ａ２．１６。
【００１５】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得る抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６），Ａ８ＨＧ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５），Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），およびＡ６Ｃ１２．１１。一つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得る本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン中、またはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１６】
本発明はまた、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得る抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）およびＡ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、およびＡ６Ｃ１２．１１。１つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そしてＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得る本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１７】
別の局面においては、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０），Ｂ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）およびＡ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）。
【００１８】
一つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、そして腫瘍増殖を調節し得る本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００１９】
さらなる別の局面においては、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体としては、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２０】
一つの実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し得、そして腫瘍増殖を調節し得る本発明の抗体は、ｃｒｉｐｔのＥＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。
【００２１】
さらなる局面においては、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体を意図する。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックし得、そして腫瘍増殖を調節し得る抗体としては、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）が挙げられるが、これに限定されない。
【００２２】
別の実施形態においては、本発明は、以下からなる群から選択されるハイブリドーマによって生成される抗体を提供する：Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１２）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）、およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１３）。
【００２３】
本発明の抗体としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、およびヒト抗体。
【００２４】
本発明はまた、上記される少なくとも１個の抗体を含む、Ｃｒｉｐｔｏを発現する腫瘍を有する被験体への投与用組成物を提供する。さらに特定の実施形態においては、この被験体は、ヒトである。この組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤を含み得る。上記される抗体は、化学療法剤と結合体化され得るか、または結合体化していない化学療法剤との組み合わせで提供され得る。
【００２５】
本発明の別の局面で意図されることは、サンプル中のインビトロでの腫瘍細胞の増殖を調節する方法であり、この方法は、このサンプルに、上記される組成物に添加する工程を包含する。
【００２６】
また意図されることは、被験体におけるインビボでの腫瘍細胞の増殖を調節する方法であり、この方法は、この被験体に、上記される組成物の有効量を投与する工程を包含する。特定の実施形態においては、この被験体は、ヒトである。
【００２７】
本発明の別の局面は、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍を有する被験体を処置する方法であり、この方法は、この被験体に、上記される組成物を有効量で投与する工程を包含する。投与用組成物は、以下を含み得る：薬学的に受容可能な賦形剤、化学療法剤に結合体化した抗体、および結合体化されない化学療法剤との組み合わせで投与される抗体。
【００２８】
本発明の方法は、腫瘍細胞の増殖の調節および／または腫瘍を有する被験体（すなわち、ヒト）の処置において特に有用であり、ここで腫瘍細胞は、乳癌細胞、精巣腫瘍細胞、結腸癌細胞、肺癌細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、頸部腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞から選択される。
【００２９】
さらなる別の実施形態においては、本発明は、組織がＣｒｉｐｔｏを発現するか否かを決定する方法を意図し、上記される抗体のいずれかを使用して、イムノアッセイで被験体に由来する組織を分析する工程を含む。また意図されることは、細胞株がＣｒｉｐｔｏを過剰発現するか否かを決定する方法であり、上記される抗体のいずれかを使用するイムノアッセイにおいて細胞株を分析する工程を含む。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の局面は、下記の発明の詳細な説明において、今まで以上に詳しく記載している。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】なし
【図２】なし
【図３】なし
【発明を実施するための形態】
【００３２】
（発明の詳細な説明）
Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する抗体、およびＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達もしくはタンパク質の相互作用を調節するための抗体の使用、ならびに／またはＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする抗体、ならびに／または腫瘍細胞の増殖を調節する抗体が発見されている。Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する種々のクラスの抗体が発見されており、この抗体としては，例えば、以下が挙げられる：天然Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、またはＣｒｉｐｔｏの変性形態のいずれかのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープに特異的に結合する抗体；ＥＧＦ様ドメイン、ｃｙｓリッチドメイン、またはアミノ酸残基４６〜１５０を含む領域からのペプチド（例えば、約３個〜約２０個のアミノ酸）を結合する抗体；Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節する抗体；Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そして腫瘍細胞の増殖を調節する抗体；およびＣｒｉｐｔｏに結合し、Ｃｒｉｐｔｏのシグナル伝達を調節し、そして腫瘍細胞の増殖を調節する抗体。これらの抗体は、リガンド／レセプター結合ドメインに結合し、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節し、または腫瘍細胞の増殖を調節する抗体を選択するために、従来のインビトロアッセイを使用して、選択される。
【００３３】
本発明の方法は、腫瘍の増殖速度（これは、正常組織に対する異常な速度である）が少なくとも部分的にＣｒｉｐｔｏに依存する場合、哺乳動物の悪性腫瘍または良性腫瘍の治療において有用である。異常な増殖速度は、正常ホメオスタシスのために必要な増殖速度を超え、そして同起源の正常組織の増殖速度を超える増殖速度である。
【００３４】
（定義）
種々の定義は、この文書全体にわたってなされる。ほとんどの語は、当業者によりその語が有するとみなされる意味を有する。この文書の、以下または他のいずれかで具体的に定義された語は、全体として、そして当業者によって代表的に理解されるように本発明に関連して提供される意味を有する。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「領域」とは、生体分子の一次構造に関する物理的に隣接した部分を意味する。タンパク質の場合においては、領域は、このタンパク質のアミノ酸配列に関する隣接した部分によって、規定される。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「ドメイン」とは、公知の生体分子機能または疑わしい生体分子機能に貢献する、生体分子の構造部分をいう。ドメインは、これらの領域、またはこれらの部分と同一の広がりを持ち得る；ドメインはまた、特定領域部分の全てまたは部分に加えて、特定領域と区別される生体分子部分を組み込み得る。タンパク質ドメインの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：細胞外ドメイン（Ｃｒｉｐｔｏの残基約３１から残基約１８８に及び、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含む）および膜貫通ドメイン（Ｃｒｉｐｔｏの残基約１６９から残基約１８８に及び、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含む）。このＣｒｉｐｔｏタンパク質のリガンド／レセプター結合ドメインは、Ｃｒｉｐｔｏの残基約７５から残基約１５０に及び、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含み、そして例えば、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含み、Ｃｒｉｐｔｏの残基約７５から残基約１１２に及ぶ、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン、そして例えば、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＲ−１（配列番号１）およびＣＲ−３（配列番号２）を含む、Ｃｒｉｐｔｏの残基約１１４から残基約１５０に及ぶ、Ｃｒｉｐｔｏのシステインリッチドメインを含む。例えば、本発明の多くのモノクローナル抗体は、このＥＦＧＦ様ドメインまたはｃｙｓリッチドメインに結合すると同定されている。さらに、モノクローナル抗体Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１１）、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３３１９）およびＡ１７Ａ２．１６は、アミノ酸残基４６〜６２（ＥＧＦ様ドメインの上流にある）に及ぶ領域内のドメイン中に形成された、エピトープに結合すると同定されている。下記の実施例３を参照のこと。リガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープは、コンホメーションの天然Ｃｒｉｐｔｏタンパク質で形成されるか、または変性Ｃｒｉｐｔｏタンパク質で形成されるエピトープであり、このエピトープに抗体が結合し得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」とは、完全なインタクトの抗体、およびこれらのＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、ならびに他のフラグメントをいうことを意味する。完全なインタクトの抗体は、以下を含むがこれらに限定されない：モノクローナル抗体（例えば、マウスのモノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体。抗体の種々の形態は、標準的な組換えＤＮＡ技術（ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ３４９：２９３−９９，１９９１）を使用して、製造され得る。例えば、動物の抗体に由来する抗原結合ドメインが、ヒト定常ドメインに連結された「キメラ」抗体（組換えＤＮＡ技術を用いて対応するヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖に由来する領域で、重鎖のヒンジ領域および定常領域、ならびに／または軽鎖の定常領域の全てまたは部分を置換されている、最初に非ヒトの哺乳動物に由来する抗体）が構成され得る。（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５，１９８４を参照のこと）。キメラ抗体は、ヒトの臨床処置に使用される場合、動物の抗体によって惹起される免疫応答を減少させる。
【００３８】
さらに、組換え「ヒト化」抗体は、合成され得る。ヒト化抗体は、最初は非ヒトの哺乳動物に由来する抗体であり、ここで組換えＤＮＡ技術は、ヒト免疫グロブリン軽鎖または重鎖の対応する領域からの、アミノ酸と結合する抗原を必要としないアミノ酸のいくつかまたは全てを置換するために使用されている。すなわち、これらは、主にヒト免疫グロブリン配列を含むキメラであり、この中に特異的な抗原結合に関与する領域が挿入されている（例えば、ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９４／０４６７９を参照のこと）。動物は、所望される抗原を用いて、免疫され、この対応する抗体は、単離され、そして特異的な抗原結合に関与する可変領域の配列に関する部分は、除去される。動物に由来する抗原に結合する領域は次いで、ヒト抗体遺伝子の適切な位置の中にクローン化され、ここでこの抗原を結合する領域は、除去されている。ヒト化抗体は、ヒト治療に使用される抗体における異種（種間）配列の使用を最小化し、そして望まれない免疫応答をほとんど惹起しない。霊長類化（Ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体は、同様に生成され得る。
【００３９】
本発明の別の実施形態は、非ヒト動物（例えば、１個以上のヒト免疫グロブリン導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物）中で生成され得るヒト抗体の使用を含む。このような動物は、米国特許第５，５６９，８２５号に記載されているようにハイブリドーマを生成するための脾細胞の供給源として、使用され得る。
【００４０】
抗体フラグメントおよび一価抗体もまた、本発明の方法および組成物において使用され得る。一価抗体は、第二の重鎖のＦｃ（または幹）領域に結合した重鎖／軽鎖ダイマーを含む。「Ｆａｂ領域」とは、重鎖のＹ枝部分を含む配列に対して、および軽鎖の全体に対しておおよそ等価、または類似である鎖の部分をいい、そして、集団的に（凝集体で）、抗体活性を示すことが示されている。Ｆａｂタンパク質は、１個の重鎖および１個の軽鎖の凝集体（一般にＦａｂ’として公知）、ならびに抗体Ｙの２個の分枝セグメントに対応するテトラマー（一般にＦ（ａｂ）２として公知）を含む（この凝集体が特定抗原、または特定抗原ファミリーと特異的に反応し得る限りは、上記のいずれかが、共有結合的に凝集されるか、または非共有結合的に凝集される）。
【００４１】
本発明の抗体のいずれかは、必要に応じて、以下で規定されるような化学療法剤に結合体化され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「結合」とは、２個のタンパク質間もしくは２個の化合物間、または関連タンパク質間もしくは関連化合物間、またはこれらの組み合わせ間の物理的相互作用または化学的相互作用を意味し、抗原とタンパク質との間の相互作用を含む。結合としては、以下が挙げられる：イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用など。物理的相互作用、結合は、直接的または間接的のいずれかであり得る（間接的とは、別のタンパク質もしくは化合物の影響を介するか、または影響を原因とする）。直接結合とは、別のタンパク質もしくは化合物の影響を介するか、または影響を原因して起こらないだけでなく、代わりに他の実質的な化学的中間体がない相互作用をいう。結合は、多くの異なった様式で検出され得る。結合を検出する方法は、当業者に対して周知である。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得る抗体」とは、Ｃｒｉｐｔｏを細胞表面から除去する一方、この細胞に入る抗体を意味する。蛍光標識したＣｒｉｐｔｏのモノクローナル抗体を使用することによって、Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得るＣｒｉｐｔｏ抗体についてスクリーニングし得る。Ｃｒｉｐｔｏ陽性細胞中にインターナライズする抗体を測定するために、蛍光顕微鏡および／または共焦点顕微鏡下で、細胞を見ることによって、この細胞への抗体の蛍光シグナルの取り込みについてアッセイし得る。インターナライズしたこれらの抗体は、細胞質および／または（ａｎｄ ｏｒ）細胞の小胞中の蛍光シグナルとして見られる。Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズし得るＣｒｉｐｔｏ抗体の非限定的な例としては、Ａ２７Ｆ６．１およびＢ３Ｆ６．１７が挙げられる。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「化合物」とは、以下が挙げられるが、これらに限定されない、任意の同定可能な化学物質または分子を意味する：イオン、原子、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸であり、そしてこのような化合物は、天然または合成であり得る。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する」または用語「改変する」とは、特定の活性またはタンパク質の量、質、または影響における増大または低下を意味する。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する」とは、以下のＣｒｉｐｔｏ活性の量、質、または影響における増大または減少を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。活性は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例３に示されるヌル細胞アッセイ）によって測定され得る。別の実施形態においては、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質と別のタンパク質との間のタンパク質相互作用は、本発明の抗体の結合を介して、同様に下方に調節される。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、用語「ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の相互作用をブロックする」とは、相互作用（すなわち、ＣｒｉｐｔｏとＡＬＫ４との間の結合）における以下の増大または低下を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。活性は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例８に示される結合アッセイ）によって、測定され得る。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「インビトロで腫瘍細胞の増殖を調節する」とは、以下のインビトロでの腫瘍細胞数における増大または低下を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。インビトロでの腫瘍細胞の増殖の調節は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例４に示されるＧＥＯ細胞の軟寒天アッセイ）によって測定され得る。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「インビボでの腫瘍細胞の増殖を調節する」とは、以下のインビボで腫瘍細胞数における増大または低下を意味する：約５％、好ましくは約１０％、さらに好ましくは約２０％、さらに好ましくは約３０％、さらに好ましくは約４０％、さらに好ましくは約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは約１００％。インビボでの腫瘍細胞の増殖の調節は、当該分野で公知のアッセイ（例えば、実施例５に示されるアッセイ）によって測定され得る。
【００５０】
用語「予防」は、生物が、異常な状態になる、または異常な状態を進展させる可能性を減少させることを称する。
【００５１】
用語「処置」は、生物において、治療効果を有することおよび少なくとも部分的に生物における異常な状態を緩和するもしくは抑制することを称する。処置としては、抑制された腫瘍の増殖を維持すること、および緩解の誘導が挙げられる。
【００５２】
用語「治療効果」とは、異常な状態の阻害を称する。治療効果は異常な状態の１以上の症状をある程度まで軽減する。異常な状態の治療に関して、治療効果は、下記のうちの１以上を称し得る：（ａ）細胞の増殖、成長、および／または分化における増加または減少；（ｂ）細胞死の阻害（すなわち、緩徐化もしくは停止）もしくは促進；（ｃ）変性の阻害；（ｄ）異常な状態に関係する１以上の症状をある程度まで軽減；および（ｅ）細胞の集団の機能を増強。異常な状態に対して効力を示す化合物は、本明細書中に記載されるように同定され得る。
【００５３】
用語「投与」は、生物の細胞中もしくは組織中に化合物を取り込む方法に関連する。生物の細胞もしくは組織が生物内に存在する場合、またはその生物の外部に存在する場合に、異常な状態は予防もしくは処置され得る。生物の外部に存在する細胞は、細胞培養ディッシュの中もしくは別の生物の中で、維持または育成され得る。生物内に宿る（ｈａｒｂｏｒ）細胞に対して、当該分野に存在する化合物を投与するための多くの技術には、経口、非経口、経皮、およびエアロゾルの適用（これらに限定されない）が挙げられる。生物の外部にある細胞に対し、化合物を投与するための複数の技術が当該分野に存在し、この技術としては、細胞マイクロインジェクション技術、形質転換技術およびキャリア技術（これらに限定されない）が挙げられる。投与は、当該分野で公知である多くの様式（例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内など）により、実施され得る。インビボ療法において使用される場合、本発明の抗体は、有効量で、患者に投与される。本明細書中で使用される「有効量」は、有益な臨床結果もしくは所望される臨床結果をもたらすために十分な量（すなわち、患者の負担を除去する量、もしくは軽減する量）である。有効量は、１以上の投与において、投与され得る。本発明の目的として、本発明の抗体の有効量は、Ｃｒｉｐｔｏ関連疾患状態、特にＣｒｉｐｔｏ関連腫瘍の進展を改善、安定化もしくは遅延するために十分な抗体量である。これらの有効性の指標の検出および測定は、下記に記載される。代表的な処置レジメンの例として、毎週のスケジュールにおいて、約２〜５ｍｇ／ｋｇの用量で本発明の対象の抗体の静脈内注射よる投与が挙げられる。患者が入院を望まない場合は、抗体は、外来患者化学療法注入単位（ｃｈｅｍｏｉｎｆｕｓｉｏｎ ｕｎｉｔ）において、投与される。当該分野で公知である他の投与レジメンもまた、検討される。
【００５４】
異常状態はまた、生物へのシグナル伝達経路に異常を有する細胞群に本発明の抗体を投与することにより、予防もしくは処置され得る。その後、生物の機能における化合物の投与の効果は、モニターされ得る。この生物は、好ましくは、ヒトである。
【００５５】
「Ｃｒｉｐｔｏ過剰発現」は、発現が、統計学的に有意な量において、隣接する正常組織のＣｒｉｐｔｏの発現より強い組織によるＣｒｉｐｔｏの発現を意味することを意図される。
【００５６】
「化学療法剤」は、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍抑制の維持、および／もしくは緩解の誘導において治療効果を有する（天然化合物、合成化合物、タンパク質、修飾されたタンパク質、および放射性化合物のような）当該分野で同定される任意の薬剤を称する。本明細書中で企図される化学療法剤は、本発明の抗体と結合され得る薬剤、もしくは別に、それらの抗体と結合体化されることなく、本発明の抗体と併用され得る薬剤を包含する。本発明の抗体と結合体化され得る例示的な化学療法剤として、放射性結合体（９０Ｙ、１３１Ｉ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１８６Ｒｈなど）、腫瘍活性化プロドラッグ（メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）、ＣＣ−１０６５アナログ、クリケアマイシン（ｃｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）誘導体、アントラサイクリン、ビンカアルカロイドなど）、リシン（ｒｉｃｉｎ）、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素（これらに限定されない）が挙げられる。
【００５７】
化学療法剤は、本発明の抗体に結合されるよりむしろ、抗体と組み合わせて（すなわち、非結合体化化学療法剤）使用され得、以下を含み得る：白金（すなわち、シスプラチン）、アントラサイクリン、ヌクレオシドアナログ（プリンおよびピリミジン）、タキサン、カンプトテシン、エピポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、ＤＮＡアルキル化剤、葉酸塩拮抗薬、ビンカアルカロイド、リボヌクレオチドレダクターゼインヒビター、エストロゲンインヒビター、プロゲステロンインヒビター、アンドロゲンインヒビター、アロマターゼインヒビター、インターフェロン、インターロイキン、モノクローナル抗体、タキソール、カンプトサール（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、アドリアマイシン（ｄｏｘ）、５−ＦＵおよびゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）。このような化学療法剤は、抗体および非結合化化学療法剤の同時投与により、本発明の抗体と組合せ、本発明の実施において使用され得る。
【００５８】
「薬学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤」は、当該分野で公知である生物学的に不活性な化合物を称し、本発明の抗体の投与において使用される。受容可能なキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｒｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１９９０において記載される。受容可能なキャリアは、生体適合性塩、不活性塩もしくは生体吸収性塩、緩衝化薬剤、オリゴ糖もしくは多糖、ポリマー、ヒアルロン酸のような粘弾性の化合物、防腐剤などを包含し得る。
【００５９】
「被験体」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを称し、そして被験体には、家畜、スポーツ動物、およびヒトを含む霊長類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６０】
（本発明の抗体）
本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合する。本明細書中に使用されるように、Ｃｒｉｐｔｏは、ＣＲ−１ Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、ＣＲ−３ Ｃｒｉｐｔｏタンパク質、およびそれらのフラグメントを含む。これらのフラグメントは、細胞外ドメインもしくは細胞内ドメイン、ＥＧＦ様ドメイン、ｃｙｓリッチドメイン、レセプター結合ドメインなどのような完全なドメインであり得る。このようなフラグメントは、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の任意のドメインにおける隣接するエピトープおよび非隣接のエピトープも含み得る。
【００６１】
【化１】
一つの実施形態において、本発明の抗体は、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメイン中のエピトープに結合する。ＥＧＦ様ドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のアミノ酸残基７５あたり〜アミノ酸残基１１２あたりに及ぶ。ＥＧＦ様ドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の直鎖状もしくは非直鎖状の範囲を含み得る。企図される直鎖状エピトープの例として、おおよそ残基７５〜８５、８０〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９５〜１０５、１００〜１１０、または１０５〜１１２が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、ＥＧＦドメイン中のエピトープは、変性されたＣｒｉｐｔｏタンパク質に対して、高次構造上、ネイティブのＣｒｉｐｔｏタンパク質において形成されるエピトープである。
【００６２】
別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏのｃｙｓリッチドメイン中のエピトープに結合する。ｃｙｓリッチドメインは、成熟Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のおおよそアミノ酸残基１１４〜アミノ酸残基１５０に及ぶ。ｃｙｓリッチドメイン中のエピトープは、アミノ酸残基の直鎖状もしくは非直鎖状の範囲を含み得る。企図される直鎖状エピトープの例として、おおよそ残基１１４〜１２５、１２０〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３５〜１４５、または１４０〜１５０が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、ｃｙｓリッチドメインのエピトープは、変性されたＣｒｉｐｔｏタンパク質に対して、高次構造上、ネイティブのＣｒｉｐｔｏタンパク質において形成されるエピトープである。
【００６３】
一旦、抗体が作成されれば、Ｃｒｉｐｔｏへの抗体の結合は、ＥＬＩＳＡのような当該分野において公知の標準的な技術を使用してアッセイされ得、一方、細胞表面上のＣｒｉｐｔｏの存在は、実施例２に示されるように、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用して、アッセイされ得る。このような結合を測定する任意の他の技術が、代わりとして使用され得る。
【００６４】
本発明は、Ｃｒｉｐｔｏまたはそのフラグメントに特異的な抗体（例えば、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、二官能性／二特異性抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、および相補性決定領域（ＣＤＲ）グラフト抗体（本発明のポリペプチドを特異的に認識するＣＤＲ配列を含有する化合物を含む）を提供する。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦＶを含む抗体フラグメントもまた、本発明により提供される。用語「特異的」および「選択的」は、本発明の抗体の結合を記述するため使用される場合、本発明の抗体の可変領域がＣｒｉｐｔｏポリペプチドを認識し、結合することを示す。本発明の特異的抗体がまた、この抗体の可変領域外の配列（特に、この分子の定常領域の配列）との相互作用を介して、他のタンパク質（例えば、Ｓ．ａｕｒｅｕｓプロテインＡもしくはＥＬＩＳＡ技術における他の抗体）とも相互作用し得ることが、理解される。本発明の抗体（すなわち、エピトープ、リガンド／レセプター結合ドメインおよびアミノ酸残基４６〜６２に及ぶドメインに特異的に結合する抗体）の結合特異性を決定するスクリーニングアッセイは、当該分野において周知であり、ルーチンとして実施される。このようなアッセイの包括的な考察に関して、Ｈａｒｌｏｗら（編）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８８）、６章を参照のこと。Ｃｒｉｐｔｏタンパク質のフラグメントを認識および結合する抗体もまた企図されるが、但し、この抗体はＣｒｉｐｔｏポリペプチドに対して特異的である。本発明の抗体は、当該分野において周知の任意の方法を使用して作製され得、ルーチンとして実施され得る。
【００６５】
一つの実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン中のエピトープと特異的に結合する抗体を提供する。抗体の特異性は、下記により詳細に記載される。しかしながら、以前に文献に記載され、都合よく（例えば、両方のペプチド中における類似したエピトープの偶然の存在により）Ｃｒｉｐｔｏと交差反応する能力がある他のポリペプチドから作製され得る抗体は、「交差反応性」抗体とみなされることは強調されるべきである。このような交差反応性抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに対し「特異的」な抗体でない。抗体が特異的にＣｒｉｐｔｏのエピトープに結合するかどうかの決定は、当該分野いおいて周知であるウェスタンブロットアッセイのようないくつかのアッセイのうちの任意のものを使用して達成される。Ｃｒｉｐｔｏを発現する細胞を同定するために、そしてまたＣｒｉｐｔｏリガンド／レセプター結合活性を調節するためにも、Ｃｒｉｐｔｏタンパク質の細胞外エピトープ（すなわち、細胞の外側に見られるＣｒｉｐｔｏタンパク質の部分）と特異的に結合する抗体は、特に有用である。
【００６６】
一つの実施形態において、本発明は、ポリクローナル抗体（ここで、これらの抗体の少なくとも一つは、Ｃｒｉｐｔｏに特異的な本発明の抗体である）を含む無細胞組成物を提供する。動物から単離された抗血清は、例示的な組成物であり、この組成物は、水もしくは他の希釈液、賦形剤、またはキャリア中に再懸濁された抗血清の抗体分画を含む組成物である。
【００６７】
別の実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を提供する。モノクローナル抗体は、非常に特異的であり、単一の抗原性部位に向けられている。さらに、代表的に異なるエピトープに向けられた異なる抗体を含有するポリクローナル調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原の単一の決定因子に向けられている。モノクローナル抗体は、抗原−抗体結合を使用する診断的アッセイ方法および分析的アッセイ方法の選択性および特異性を改善するために有用である。モノクローナル抗体の別の利点は、それがハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンの混入がないことである。このような抗体を産生するハイブリドーマもまた、本発明の局面として意図される。
【００６８】
さらに別の関連した実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏに特異的な抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体を提供する。抗イディオタイプ抗体のさらに詳細な記載に関しては、例えば、米国特許第６，０６３，３７９号および米国特許第５，７８０，０２９号を参照のこと。
【００６９】
抗体が、化学的にかまたは組換え技術により単離され得る比較的小さい抗原結合ドメインを含むことは、周知である。このようなドメインは、有用なＣｒｉｐｔｏ結合分子そのものであり、そしてまた、ヒト抗体へ再導入され得るか、または化学療法剤もしくはポリペプチドと融合され得る。それ故、さらに別の実施形態において、本発明は、Ｃｒｉｐｔｏ特異的抗体のフラグメントを含むポリペプチドを提供する。ここで、このフラグメントおよび結合された分子は、いくらかでもＣｒｉｐｔｏに結合する。限定されない例として、本発明は、単鎖抗体およびＣＤＲグラフト抗体であるポリペプチドを提供する。ＣＤＲグラフト抗体のさらに詳細な記載に関しては、例えば、米国特許第５，８５９，２０５号を参照のこと。
【００７０】
別の実施形態において、非ヒト抗体は、当該分野において公知の方法のいずれかより、ヒト化され得る。ヒト化抗体は、インビボ治療適用のために有用である。さらに、組換え型「ヒト化」抗体が、合成され得る。ヒト化抗体は、初めに非ヒト哺乳動物に由来する抗体であり、抗原結合に必要のないアミノ酸のいくらかもしくは全部を、ヒト免疫グロブリン軽鎖もしくは重鎖の対応する領域由来のアミノ酸で置換するため、組換えＤＮＡ技術が使用される。つまり、それらは、特異的な抗原結合の原因である領域が挿入されたヒト免疫グロブリン配列を大部分に含むキメラである（例えば、ＰＣＴ特許出願番号ＷＯ９４／０４６７９を参照のこと）。動物は、所望される抗原で免疫され、対応する抗体は、単離され、そして、特異的な抗原結合の原因である可変領域配列の部分は、取り出される。次いで、動物由来抗原結合領域は、抗原結合領域が欠失されたヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローニングされる。ヒト化抗体は、ヒトの治療における使用ために、抗体の非相同（種間）配列の使用を最小化し、望まれない免疫応答を引き起こしそうにない。霊長類化抗体は、霊長類（例えば、アカゲザル、ヒヒおよびチンパンジー）抗体遺伝子を使用して、同様に産生し得る。その後、さらなる変化が、アフィニティもしくは免疫原性を調節するために、抗体のフレームワークに導入され得る。例えば、米国特許第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、および第６，１８０，３７０号を参照のこと。
【００７１】
本発明の別の実施形態は、１以上のヒト免疫グロブリントランスジーンを有するトランスジェニック動物のような、非ヒト動物において産生され得るヒト抗体の使用を含む。このような動物は、米国特許第５，５６９，８２５号、ＷＯ０００７６３１０、ＷＯ０００５８４９９およびＷＯ０００３７５０４に記載されるように、そして本明細書中に参考として援用されるように、ハイブリドーマを産生するための脾細胞の供給源として、使用され得る。
【００７２】
（シグナル調節）
別の実施形態において、本発明の抗体は、Ｃｒｉｐｔｏに結合し、そしてＣｒｉｐｔｏシグナル伝達もしくはＣｒｉｐｔｏ−タンパク質相互作用を調節する。Ｃｒｉｐｔｏ活性の過剰発現は、間葉細胞の特性を促進する脱分化状態、増大された増殖、および細胞移動（Ｓａｌｏｍｏｎら、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ ２１：６１−７０，１９９９；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：２９１−２９８，１９９４；およびＢａｌｄａｓｓａｒｒｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６６：５３８−５４３，１９９６）、腫瘍形成において見られる細胞の形質転換に関連する表現型を導き得る。
【００７３】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体の活性およびそのＣｒｉｐｔｏシグナル伝達を調節する能力を試験する一つの方法は、Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏノックアウト（ＫＯ）細胞株（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら、Ｍｅｔｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３−１４２，２０００）を用いた方法である。Ｃｒｉｐｔｏは、Ｘｅｎｏｐｕｓ胚中でｓｍａｄ２リン酸化および転写因子ＦＡＳＴを刺激し、そして転写因子ＦＡＳＴの活性は、ＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼレポーター遺伝子からのルシフェラーゼ活性を測定することにより観測され得る（Ｓａｉｊｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５：３５−４７，２０００）。Ｆ９−Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子を欠失され、故にＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｏ依存的シグナル伝達に対してヌルである（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉら，Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９０：１３３−１４２，２０００）。Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達は、Ｃｒｉｐｔｏ遺伝子コンストラクト、ＦＡＳＴ遺伝子コンストラクト、およびＦＡＳＴ調節エレメント−ルシフェラーゼ遺伝子コンストラクトをトランスフェクトすることにより、Ｆ９Ｃｒｉｐｔｏ ＫＯ細胞において評価され得る。これらの細胞株中で、Ｃｒｉｐｔｏ ｃＤＮＡ、およびＦＡＳＴＡ ｃＤＮＡがその中へトランスフェクトされなければ、Ｃｒｉｐｔｏ依存的ＦＡＳＴルシフェラーゼ活性は、見られない。Ｃｒｉｐｔｏ依存的なＮｏｄａｌのシグナル伝達を遮断し得る抗体は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達機能を遮断する抗体である。
【００７４】
軟寒天アッセイにおける増殖（下記の実施例４を参照のこと）のような、Ｃｒｉｐｔｏの活性を測定し得る他のアッセイは、当業者により使用され得る。軟寒天中で細胞が増殖する能力は、細胞の形質転換と関連し、そして、このアッセイは、腫瘍細胞増殖の阻害を測定するための古典的なインビトロアッセイである。活性の阻害を決定する際に有用な他のアッセイには、プラスチック上のインビトロアッセイなどが挙げられる。
【００７５】
（治療用途）
本発明の抗体は、腫瘍細胞増殖の調節などの治療目的、Ｃｒｉｐｔｏを検出するかもしくはＣｒｉｐｔｏを定量するための診断目的、およびＣｒｉｐｔｏの精製のためにも有用である。
【００７６】
本発明の一つの実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、患者における腫瘍細胞の増殖を調節する抗体が、提供される。一つの実施形態において、腫瘍細胞は、精巣腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、精巣腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、子宮腫瘍細胞、子宮頸部腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、および胃腫瘍細胞である。
【００７７】
別の実施形態において、Ｃｒｉｐｔｏに特異的に結合し得、Ｃｒｉｐｔｏを過剰発現する腫瘍細胞の増殖を調節する抗体が、提供される。一つの実施形態において、腫瘍細胞は、乳癌、精巣癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、膵臓癌、および胃癌由来の細胞株のようなＣｒｉｐｔｏを過剰発現する細胞株である。
【００７８】
抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体は、下記の実施例４に例示されるように、当業者により使用される標準的なプロトコルについて、潜在的な抗癌剤としてのインビボ活性に対し、スクリーニングされ得る。このようなプロトコルの例は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）により、「ｉｎ ｖｉｖｏ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ」プロトコル、ＮＩＨ 出版番号８４−２６３５（Ｆｅｂ １９８４）中に、概要を述べられている。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、本発明の抗体は、癌性の腫瘍を有する患者の処置のために使用される。
【００８０】
本発明の抗体は、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合され得、治療上有効な用量で、患者に投与され得る。腫瘍の増殖を阻害する方法の考察に関しては、例えば、米国特許第６，１６５，４６４号を参照のこと。
【００８１】
Ｃｒｉｐｔｏの異常なレベル（すなわち、上昇されたレベルもしくは欠失されたレベル）に関連した障害に罹患した被験体を処置する方法もまた、意図される。ここで、この方法は、Ｃｒｉｐｔｏのリガンド／レセプター結合ドメイン（エピトープがＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインもしくはｃｙｓリッチドメイン中にあるドメインを含むが、限定されない）中のエピトープに特異的に結合する有効量の抗体を患者に投与する工程を包含する。
【００８２】
Ｃｒｉｐｔｏの異常なレベル（すなわち、上昇されたレベルもしくは欠失されたレベル）に関連した障害に罹患した被験体を処置する方法もまた、意図される。ここで、この方法は、Ｃｒｉｐｔｏと特異的に複合体を形成し、Ａ６Ｃ１２．１１、Ａ６Ｆ８．６（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１８）、Ａ７Ｈ１．１９、Ａ８Ｆ１．３０、Ａ８Ｇ３．５（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１７）、Ａ８Ｈ３．１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１５）、Ａ８Ｈ３．２、Ａ１９Ａ１０．３０、Ａ１０Ｂ２．１８（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１１）、Ａ２７Ｆ６．１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１０）、Ａ４０Ｇ１２．８（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１６）、Ａ２Ｄ３．２３、Ａ７Ａ１０．２９、Ａ９Ｇ９．９、Ａ１５Ｃ１２．１０、Ａ１５Ｅ４．１４、Ａ１７Ａ２．１６、Ａ１７Ｃ１２．２８、Ａ１７Ｇ１２．１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１４）、Ａ１７Ｈ６．１、Ａ１８Ｂ３．１１（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１２）、Ａ１９Ｅ２．７、Ｂ３Ｆ６．１７（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１９）、およびＢ６Ｇ７．１０（ＡＴＣＣ 登録番号ＰＴＡ−３３１３）から成る群から選択される抗体が向けられるエピトープに向けられる有効量の抗体を被験体に投与すること工程を包含する。
【００８３】
Ｃｒｉｐｔｏの検出を介した診断は、本発明の新規抗体を使用した標準的な結合アッセイにより容易に達成され、このことは、当業者が多種多様なサンプル、培養物中などで特異的にＣｒｉｐｔｏの存在を検出することを可能にする。
【００８４】
本明細書中に記載される任意の目的のために、本発明の抗体を備えるキットもまた、包含される。一般に、本発明のキットはまた、抗体が免疫特異的であるコントロール抗原も備える。実施形態は、全ての試薬およびその使用のための指示書きを備えるキットを含む。
【００８５】
本発明のさらなる特徴は、下記の例示的な実施例から明らかある。
【実施例】
【００８６】
（実施例１：Ｃｒｉｐｔｏの発現および精製）
ｐＳＧＳ４８０で示される発現プラスミドを、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（すなわち、「ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃ」）と融合された、ＣｒｉｐｔｏのヒトＣｒｉｐｔｏアミノ酸残基１〜１６９[配列番号１のアミノ酸１〜１６９]をコードするｃＤＮＡの、ベクターｐＥＡＧ１１００へのサブクローニングにより構築された。
このベクターのさらに詳細な記載に関しては、同時係属の米国特許出願番号６０／２３３，１４８、２０００年９月１８日出願を参照のこと。ベクターｐＥＡＧ１１００は、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのプラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−ｂｅｔａｇａｌの誘導体であり、ＣＨＯ一過性トランスフェクトにおけるその使用は、Ｓｃｈｉｆｆｅｒｌｉら、１９９９，Ｆｏｃｕｓ ２１：１６により記載された。プラスミドｐＣＭＶ−Ｓｐｏｒｔ−Ｂｅｔａｇａｌ（カタログ番号１０５８６−０１４）からレポーター遺伝子β−ガラクトシダーゼＮｏｔＩフラグメントを除去することにより、以下のようにそれを作製した：このプラスミドを、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、４．３８ｋｂ ＮｏｔＩベクター骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）フラグメントを、ゲル精製し、連結した。連結されたＤＮＡを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αに形質転換した。ｐＥＡＧ１１００を、単離されたシングルコロニーから、所望される組換え体を含むプラスミドとして単離した。プロモーター、ポリリンカー、および転写終結シグナルに及ぶｐＥＡＧ１１００の配列を、確認した。
【００８７】
プラスミドｐＳＧＳ４８０を、ＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、そしてこの細胞を、２８℃で７日間、増殖させた。これらの細胞内および馴化培地におけるＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質の存在を、ウェスタンブロット解析により試験した。ウェスタンブロット解析のため、馴化培地およびＣｒｉｐｔｏトランスフェクト細胞由来の細胞を、還元条件下で４〜２０％勾配ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロースに電気泳動的に移し、そしてＣｒｉｐｔｏ融合タンパク質を、Ｃｒｉｐｔｏ １７マーペプチド（配列番号１の残基９７〜１１３を含む）−キーホールリンペットヘモシアニン結合体に対して惹起されたウサギポリクローナル抗血清で検出した。細胞を除去するための遠心後、ウェスタンブロット解析により、ＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質が、効率的に馴化培地（上清）中に分泌されたことを示した。上清を、プロテインＡ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用し、結合されたタンパク質を、２５ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ２．８）、１００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出されたタンパク質を、０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８．６）で中和し、そして２４０〜３４０ｎｍでの吸光度測定により総タンパク質含量を解析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を解析した。溶出されたタンパク質を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過し、−７０℃で保存した。
【００８８】
(実施例２：抗体の作製とスクリーニング）
溶出されたＣＲ（ｄｅｌ Ｃ）−Ｆｃタンパク質を、マウスに注射し、そして当業者に公知の標準的なハイブリドーマ技術を使用して、モノクローナル抗体を作製する。
【００８９】
（Ａ．抗体の作製）
具体的には、メスのロバートソニアンマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）を、完全フロイントアジュバント（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１５７２１−０１２）で乳化された２５μｇの精製ヒトＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで腹腔内に免疫した。マウスを、不完全フロイントアジュバント（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１５７２０−０１４）で乳化された２５μｇのＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで２回、およびプロテインＡビーズで１回腹腔内に追加免疫した。血清を、スクリーニングし、最後の追加免疫から３週間後に、最高の力価を有するマウスを、融合の３日前、５０μｇの可溶性ＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで、腹腔内に追加免疫した。融合の前日に、マウスを、５０μｇのＣＲ ｄｅｌ Ｃ−Ｆｃで、静脈内に追加免疫した。マウス脾臓細胞を、ＦＬ６５３ミエローマ細胞と、１脾臓細胞：６ミエローマ細胞の比率で融合し、そして選択培地で９６ウェルの組織培養プレートに１ウェルあたり１００，０００細胞、３３，０００細胞および１１，０００細胞でプレートした。増殖に関して陽性のウェルを、ＦＡＣＳでスクリーニングし、１週間後、ＥＬＡＳＡでスクリーニングした。２回の融合を、実施した。
【００９０】
（Ｂ．抗体のスクリーニング）
第１の融合もしくは第２の融合から生じた上清を、Ｃｒｉｐｔｏ ｄｅｌ Ｃおよび／もしくはＣｒｉｐｔｏ ＥＧＦ様ドメインタンパク質の認識に関して、まずＥＬＩＳＡプレートでスクリーニングした。コントロール融合タンパク質（ＬＴ−βレセプター−Ｆｃ）を、ヒトＦｃエピトープを認識するモノクローナル抗体を捨てるために、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングした。ＥＬＡＳＡを、下記の節Ｃに記載されるように、実施した。第１の融合において、最初の上清を、ＦＡＣＳにより、精巣腫瘍細胞株、ＮＣＣＩＴにおける細胞表面のＣｒｉｐｔｏタンパク質を認識する能力に関しても、スクリーニングした。第２の融合の場合、２種の腫瘍細胞株、ＮＣＣＩＴおよび乳癌株、ＤＵ４４７５におけるＣｒｉｐｔｏを認識する上清の能力を、ＦＡＣｓにより解析した。２次スクリーニングは、腫瘍細胞株のパネルにおける細胞表面Ｃｒｉｐｔｏを認識するモノクローナル抗体上清の能力（結果は、表１および表２を参照のこと）、ヒト乳房腫瘍およびヒト結腸腫瘍組織切片において免疫組織化学的に、ヒトＣｒｉｐｔｏを認識するモノクローナル抗体の能力、Ｃｒｉｐｔｏ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達アッセイでブロックするモノクローナル抗体の能力、プラスチック上もしくは軟寒天アッセイにおいて、腫瘍細胞株の増殖をブロックする能力、および細胞表面Ｃｒｉｐｔｏをインターナライズする能力を試験すること包含した。
【００９１】
（Ｃ．ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡアッセイが以下のように実施された：
材料：
プレート：Ｃｏｓｔａｒ ｈｉｇｈ−ｂｉｎｄｉｎｇ Ｅａｓｙ−ｗａｓｈ ９６Ｗ プレート（０７−２００−６４２）
２’抗体：Ｐｉｅｒｃｅ Ｇｔ ａｎｔｉ−Ｍｓ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−ＨＲＰ（Ｐ１３１４３０）
基質：Ｐｉｅｒｃｅ ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ（３４０２１）
停止液：１Ｎ Ｈ２ＳＯ４
緩衝液：
結合緩衝液：０．１Ｍ ＮａＨＰＯ４ ｐＨ９．０
ブロッキング緩衝液：ＰＢＳ＋１０％ドナー子ウシ血清
洗浄緩衝液：ＰＢＳ＋０．１％ ｔｗｅｅｎ−２０
抗原ＣＲ−ｄｅｌ−Ｃ−ＦｃおよびＣＲ−ＥＧＦ−ｆｃ（コントロールｈｕ ＩｇＧ１融合タンパク質）を結合緩衝液で５００ｎｇ／ｍｌに希釈した。１００μｌを各ウェルに添加し、３７℃で１時間または４℃で一晩、インキュベートした。液体をデカントし、プレートを反転させ、乾燥するまでブロットした。次いで、２５０μ／ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、その後３７℃で３０分間インキュベートした。再び、液体をデカントし、プレートを反転させ、乾燥するまでブロットした。上清を洗浄緩衝液で１：５０に希釈し、５０μｌ／ウェルでプレートし、その後、室温で１時間インキュベートした。プレートを２５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液を用いて３回、激しく洗浄した。次いで、洗浄緩衝液で１：１０，０００に希釈した２’抗体（１００μｌ／ウェル）を添加し、その後室温で３０分間、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄緩衝液（２５０μｌ／ウェル）を用いて、３回、激しく洗浄し、次いで、基質を１００μｌ／ウェルで添加した。色が、十分に濃くなるまで発色させ、次いで、停止液（１００μｌ／ウェル）を添加し、プレートを４５０ｎｍの吸光度で読み取った。
【００９２】
（Ｄ．フローサイトメトリー）
Ｃｒｉｐｔｏポジティブ細胞株は、以下のように、細胞表面染色およびフローサイトメトリーを用いて、Ｃｒｉｐｔｏとの結合について、モノクローナル抗体をアッセイするために使用され得る：
５ｍＭ ＥＤＴＡを含有する２ｍｌＰＢＳ−が入っている、Ｔ１６２フラスコから３７℃で１０分、細胞を放出する。細胞をバラバラにするため、数回ピペットで吸い上げたり吸い出したりしながら、血清を有する培地で２０ｍｌにする。１２００ｒｐｍで５分間スピンさせる。０．１％ ＢＳＡ（洗浄緩衝液）を含有する４℃のＰＢＳ（５〜１０ｍｌ）で細胞を洗浄する。１２００ｒｐｍで５分間、スピンさせる。洗浄緩衝液に４×１０６〜１０７／ｍｌで再懸濁する。氷の上で維持する。
【００９３】
染色用の抗体を調整する。洗浄緩衝液に、精製された抗体を１〜１０μｇ／ｍｌまで希釈する。５０μｌの細胞を、９６−ウェル Ｌｉｎｂｒｏ Ｖ底プレート（ＩＣＮ ７６３２１０５）に添加する。分析すべき各細胞株に対する、各コントロールのために１ウェルの細胞をプレートする。これらの細胞に対するコントロールとしては、抗体なし、二次抗体のみ、ハイブリドーマ培地、ポジティブコントロール抗体上清（または、入手可能な場合は、精製されたもの）、およびＩｇＧサブクラスコントロール（精製された抗体を使用する場合）が挙げられる。
【００９４】
分析すべき各細胞株について、各実験用サンプルに対して１ウェルの細胞をプレートする。４℃で卓上遠心分離機を用いて、５分間１２００ｒｐｍでプレートをスピンさせる。プレートを反転させることによって緩衝液を飛ばし、液体が実質的に除去されるまで、振盪する。４０−５０μｌの抗体（または、抗体なしのコントロールウェルおよび二次抗体のみのコントロールウェルについては洗浄緩衝液）をウェルに添加する。４℃で少なくとも３０分〜１時間、インキュベートする。１２００ｒｐｍで５分間、プレートをスピンする、抗体溶液を飛ばす。１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝液で２回ずつウェルを洗浄し、各洗浄後にスピンする。緩衝液を飛ばす。
【００９５】
Ｒ−ＰＥ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ カタログ番号１１５−１１６−０７１）の１：２００希釈物（洗浄緩衝液中）の５０μｌを含む各ウェルに細胞を再懸濁する。暗闇で、４℃で２０分間、インキュベートする。各ウェルの細胞に、１５０μｌの洗浄緩衝液を添加する。１２００ｒｐｍで５分間、プレートをスピンする。１ウェルあたり２００μｌの洗浄緩衝液で１回洗浄する。ＰＢＳ中１％ ＰＦＡの１５０μｌに細胞を再懸濁する。各ウェルの内容物を別のチューブ（５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ ポリスチレン丸底チューブ−３５２０５２）に移す。チューブをスズ箔で包む。
【００９６】
次いで、チューブの内容物をフローサイトメトリーにより読み取る。
【００９７】
この方法によって得られた、モノクローナル抗体の２回のスクリーニングの結果は、以下の表１および表２に要約された、以下の結果を生じ、ここで第一列は、バイブリドーマサブクローンの指定された名前を提供し、次の２つの列は、ＥＬＩＳＡスクリーンの結果を示し、残りの列は、４つのＣｒｉｐｔｏ−ポジティブ細胞株についてのフローサイトメトリー分析結果を示す。これらの結果は、平均蛍光係数の単位（ＭＦＩ）で与えられる。
【００９８】
（表１：抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体の特性づけ）
【００９９】
【表１】
（表２：抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体の特性づけ）
【０１００】
【表２】
（実施例３：Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の阻害についてのヌル細胞アッセイ）
以下は、Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の阻害を評価するために使用される、Ｆ９ Ｃｒｉｐｔｏヌル細胞シグナル伝達アッセイを記載する。
【０１０１】
第０日目 １５分間３７℃で、１ウェルあたり２ｍｌの０．１％ゼラチンで６個のウェルプレートをコーティングする。１ウェルあたり６×１０５個のＦ９ ＣＲＩＰＴＯ ＮＵＬＬ細胞で播種する。
【０１０２】
第１日目 トランスフェクション：
以下サンプルの各々を３００μｌのＯｐｔｉＭｅｍｌに添加し、各サンプルについての溶液Ａを生成する：
サンプル１：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼＦＡＳＴレポーターｃＤＮＡ＋１．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル２：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ ＦＡＳＴ、および１μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル３：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ ＡＤＤ
０．５ ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル４：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル５：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル６：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル７：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル８：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
サンプル９：０．５μｇ（Ｎ２）７ルシフェラーゼ、０．５μｇ Ｃｒｉｐｔｏ、０．５
ＦＡＳＴ、および０．５μｇ空ベクターｃＤＮＡ。
溶液Ｂは、３０μｌのリポフェクタミン＋２７０μｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を含む。
【０１０３】
各サンプルについて、溶液Ａと溶液Ｂを一緒に混合する。室温で４５分間インキュベートする。２ｍｌ／ウェルのＯｐｔｉＭｅｍ１でウェルをリンスする。次の工程の直前に吸引する。
溶液Ａ＋Ｂの各混合物に２．４ｍｌのＯｐｔｉＭｅｍ１を添加し、混合し、二組のウェルに１ウェルあたり１．５ｍｌを加える。３７℃で５時間、インキュベートする。１ウェルあたり１．５ｍｌのＤＭＥＭ＋２０％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ、Ｐ／Ｓを、サンプル１〜３を受けるウェルに添加する。以下のように、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を添加する：サンプル４ウェル：Ａ２７Ｆ６．１（１０μｇ／ｍｌ）；サンプル５ウェル：Ａ２７Ｆ６．１（２μｇ／ｍｌ）；サンプル６ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８（１０μｇ／ｍｌ）、サンプル７ウェル：Ａ４０Ｇ１２．８（２μｇ／ｍｌ）；サンプル８ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８（１０μｇ／ｍｌ）；サンプル９ウェル：Ａ１０Ｂ２．１８（２μｇ／ｍｌ）。
【０１０４】
第２日目 培地を取り除き、ＰＢＳ（２ｍｌ／ウェル）で細胞を洗浄する。ＤＭＥＭ＋０．５％ ＦＣＳ、２ｍＭ Ｇｌｎ、前日と同量のＣｒｉｐｔｏ抗体を含有するＰ／Ｓを、同じウェルに添加する。
【０１０５】
第３日目 ルシフェラーゼシグナルを発生させる。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＰＢＳ＋Ｍｇ２＋（２ｍｌ／ウェル）でウェルを洗浄する。ＬｕｃＬｉｔｅキット（カタログ番号６０１６９１１）を使用する。緩衝液および基質を室温にする。明かりを暗くする。１０ｍｌの緩衝液で基質を再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅ）する。ＰＢＳ＋Ｃａ２＋およびＰＢＳ＋Ｍｇ２＋で１：１希釈する。ウェルを吸引する。反復ピペッタを用いて、１ウェルあたり２５０μｌの希釈した基質を素早く添加する。溶液を旋回させ、２００μｌを、９６ウェルの白い不透明な底のプレート（Ｆａｌｃｏｎ ３５−３２９６）のウェルに移す。Ｗｉｎｇｌｏｗを用いて照度計のプレートを読み取り、エクセルにデータを書き出す。
【０１０６】
このアッセイの結果を以下の表３に要約する。
【０１０７】
（表３：Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達アッセイ：抗Ｃｒｉｐｔｏモノクローナル抗体での阻害）
【０１０８】
【表３】
（実施例４：腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害についてのアッセイ）
Ｃｒｉｐｔｏシグナル伝達の阻害はまた、軟寒天中のＧＥＯ細胞の増殖を測定することによって、アッセイされ得る。例えば、Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．１９９４年１月；９（１）：２９１−８；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９１年２月１日；５１（３）１０５１−４を参照のこと。
【０１０９】
初めに、３％ バクトアガー（ｂａｃｔｏａｇａｒ）を溶かす。水浴中に４２℃で保存する。次いで、予め温めた完全培地と３％バクトアガー溶液とを混合し、４２℃で維持しながら、０．６％ バクトアガーの溶液を作製する。６ｃｍ皿に４ｍｌの溶液をプレートし、少なくとも３０分間冷却させ、底面寒天層を形成させる。ＧＥＯ細胞をトリプシン処理し、完全培地で１０５細胞／ｍｌまで再懸濁する。アッセイされるべき抗体（またはコントロール）を、抗体（２０μｇ〜１μｇ）を適定しながら、細胞懸濁物に添加する。等量のＧＥＯ細胞懸濁液と０．６％バクトアガーとを混合し、そして２ｍｌを底面寒天層の上部にかぶせる。少なくとも１時間冷却させる。ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で１４日間インキュベートする。顕微鏡を使用せず可視的なコロニーを数える。ネガティブコントロールと比較して、コロニーの非存在は、試験した抗体がインビトロ腫瘍細胞増殖を阻害することを示す。
【０１１０】
このアッセイは、抗体Ａ２７Ｆ６．１およびＢ６Ｇ７．１０について、表４に示す結果を得るために使用され、これらの抗体は共に、ＧＥＯ細胞コロニーの増殖を低減させる能力を実証している。
（表４：軟寒天アッセイにおける増殖の結果）
【０１１１】
【表４】
（実施例５：腫瘍細胞増殖のインビトロ阻害についてのアッセイ）
腫瘍細胞増殖の阻害を評価するために、ヒト腫瘍細胞株を胸腺欠損ヌードマウスの皮下に移植し、そして本発明の抗体の効果は、腫瘍阻害へ相乗効果または相加効果を提供し得るさらなる化学療法処置の有無にかかわらず観察された。
【０１１２】
このアッセイは、異なる腫瘍細胞株（例えば、ＧＥＯ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得られる、ウェル分化型ヒト結腸癌インビトロ細胞株）、ＤＵ−４４７５（ＡＴＣＣから得られた乳癌インビトロ細胞株）、ＮＣＣＴＴ（ＡＴＣＣから得られた精巣腫瘍細胞株）または当該分野に公知の他の細胞株）を用いて代替的に実施され得る。このようなアッセイの１つの例は以下のとおりである：
動物に、耳パンチによって個々に印を付ける。ＧＥＯ細胞株は、１〜４継代にわたって、インビトロまたはインビボで継代する。動物の右腹部位の皮下にＧＥＯ細胞を移植する。以下の動物集団を使用し得る：
【０１１３】
【表５】
第０日目：腫瘍を移植し、動物の初期の体重を記録する。
【０１１４】
第１日目：上記に示すように、処置を開始する。
【０１１５】
第５日目：腫瘍サイズおよび体重の測定を開始し、実験が終了するまで、週に２回続ける。
【０１１６】
初期体重、腫瘍サイズおよび体重の測定、屠殺での組織学、および腫瘍における免疫組織化学的分析法が試験され、Ｃｒｉｐｔｏ発現、腫瘍増殖、およびその阻害を分析する。
【０１１７】
（実施例６：インビトロ異種移植片腫瘍モデル−Ｃｙｓリッチブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌腫細胞株を、ＣｒｉｐｔｏのＣｙｓリッチドメインに結合する抗体とともに皮下に移植した。実験方法を以下に記載する。結果を図１に示す。
【０１１８】
（方法および材料）
動物：胸腺欠損ヌード雄マウスを使用した。耳パンチによって、動物を個々に番号を付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ（元々、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した、縦隔混合型生殖（ｍｅｄｉａｓｔｉｎａｌ ｍｉｘｅｄ ｇｅｒｍ）細胞ヒト精巣癌インビトロ細胞株）。細胞株を、抗生物質を有さないＲＰＭＩ−１６４０／１０％ ＦＢＳでの、６継代にわたって、インビトロで継代した。動物の右腹部に５ｘ１０６細胞／０．２ｍｌ マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）を皮下移植した。
【０１１９】
【表６】
第１日目に処置を開始する。
試験日程
第−１日目：マウスを無作為にコントロールと処置グループに分けた。動物の初期体重を記録した。抗体グループに最初の処置をほどこした。投与溶液を生成した。アッセイが終了するまで、処置は技術者には見せなかった。
第０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍に、細菌培養を流した。
第１日目：ポジティブ化学療法グループに対して最初の処置を投与した。
第４日目：マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）の腫瘍基準についての初期腫瘍サイズの測定値を記録した。週に２回、マウスの腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。毎日、研究を観測し、動物のいかなる異常な観察をも記録した。
指標：初期の体重
腫瘍サイズおよび体重測定
（実施例７：インビトロ異種移植片腫瘍モデル−ＥＧＦ様ドメインブロッキング抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体）
ＮＣＣＩＴの応答を評価するために、ヒト精巣癌細胞株に、ＣｒｉｐｔｏのＥＧＦ様ドメインに結合する抗体を皮下移植した。実験方法を以下に記載する。結果を図２に示す。
【０１２０】
（方法および材料）：
動物：胸腺欠損ヌード雄マウスを使用した。耳パンチによって、動物に個々に番号を付けた。
腫瘍：ＮＣＣＩＴ（元々Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した、縦隔混合型生殖細胞ヒト精巣癌インビトロ細胞株）。細胞株を、抗体を含まないＲＰＭＩ−１６４０／１０％ ＦＢＳで、８継代にわたってインビトロで継代した。動物の右腹部に５ｘ１０６細胞／０．２ｍｌ ｍａｔｒｉｇｅｌを皮下に移植された動物。
【０１２１】
【表７】
第１日目に処置を開始する。
試験日程：
第−１日目：マウスを無作為にコントロールと処置グループに分けた。動物の初期体重を記録した。抗体グループに最初の処置をほどこした。投与溶液を生成した。アッセイが終了するまで、処置は技術者には見せなかった。
第０日目：腫瘍を移植した。マウスに移植された腫瘍に、細菌培養物を流した。細菌培養物は、サンプリング後２４時間および４８時間で、混入についてネガティブだった。
第１日目：ポジティブ化学療法グループに対して最初の処置をほどこした。
第４日目：マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌの腫瘍基準についての初期腫瘍サイズの測定値を記録した。週に２回、マウスの腫瘍サイズおよび体重を記録し続けた。毎日、研究を観測し、動物のいかなる異常な観察をも記録した。
指標：初期の体重
腫瘍サイズおよび体重の測定値
（実施例８：ＡＬＫ４結合をブロックするＣｒｉｐｔｏ ｍａｂｓ）
Ｃｒｉｐｔｏ特異的モノクローナル抗体が、Ａｌｋ４（アクチビンＩ型レセプター）に結合するＣｒｉｐｔｏの能力を阻害し得るかどうかを評価するために、Ａｌｋ４を安定に発現する２９３細胞株を用いてフローサイトメトリー分析を使用した。この細胞株を発生するために、２９３細胞を、ＨＡエピトープを用いてＣ末端でタグされたＡｌｋ４を発現するプラスミドおよび、１０：１の割合で薬剤（ピューロマイシン）を発現するプラズミドで同時トランスフェクトした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、コロニーが形成されるまで、ピューロマイシンで選択した。次いで、コロニーを取り、増殖させ、そして、ＨＡについてウェスタンブロット法を用いてＡｌｋ４発現を分析した。コントロール（トランスフェクトされなかった２９３細胞）と比較して、クローン２１（２９３−Ａｌｋ４−２１）はＡｌｋ４を高いレベルで発現することが見いだされた。
【０１２２】
フローサイトメトリーによりＣｒｉｐｔｏ−Ａｌｋ４結合を分析するために、ヒトＩｇＧ（ＣｒｄｅｌＣ−Ｆｃ）のＦｃ部分と融合した、精製された、可溶性形態のヒトＣｒｉｐｔｏ（ａａ １−１６９）を使用した。約５μｇ／ｍｌのＣｒｄｅｌＣ−ＦｃまたはコントロールのＦｃタンパク質を、３０分間氷上で、５０μｌ総容量のＦＡＣＳ緩衝液（０．１％ ＢＳＡを含むＰＢＳ）中の３ｘ１０５ ２９３−Ａｌｋ４−２１細胞と共に、インキュベートした。抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体を含むサンプルについて、５μｇ／ｍｌ ＣｒｄｅｌＣ−Ｆｃを、細胞を添加する前に氷上で、５０μ／ｍｌの各Ｃｒｉｐｔｏ抗体（Ａ１０．Ｂ２．１８、Ａ４０．Ｇ１２．８、Ａ２７．Ｆ６．１、Ａ８．Ｈ３．１、Ａ１９．Ａ１０．３０、Ａ６．Ｆ８．６、Ａ８．Ｇ３．５、Ａ６．Ｃ１２．１１）と共に、予めインキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｒ−フィコエリトリン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃフラグメント特異的）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃｓ製）と共に細胞をインキュベートすることによって、結合Ｆｃタンパク質を検出した。次いで、サンプルを再び洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中で固定し、標準的なフローサイトメトリー手順を用いて分析した。ＦＡＣＳアッセイの結果を図３に示す。
【０１２３】
上記の本発明のいくつかの実施形態は、以下で概説され、次の実施形態を含むが、これらに限定されない。当業者が理解するように、本発明の精神から逸脱することなく、本発明の様々な実施形態に、多くの変更と修正がなされ得る。このような可変のすべてが本発明の範囲内に含まれることを意図する。
【０１２４】
本明細書に引用される各刊行物の開示全体が、参考として本明細書に援用される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【請求項１】
明細書に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１６３４３８（Ｐ２０１０−１６３４３８Ａ）
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−３０６８３（Ｐ２０１０−３０６８３）
【出願日】平成２２年２月１５日（２０１０．２．１５）
【分割の表示】特願２００９−２５４２０（Ｐ２００９−２５４２０）の分割
【原出願日】平成１４年４月１７日（２００２．４．１７）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１５日（２０１０．２．１５）
【分割の表示】特願２００９−２５４２０（Ｐ２００９−２５４２０）の分割
【原出願日】平成１４年４月１７日（２００２．４．１７）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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