ＤＮＡ二本鎖形成制御
【課題】２本鎖ＤＮＡにおける融解温度（Ｔｍ）を上昇させるための方法、及びそのための試薬を提供する。
【解決手段】次の一般式（１）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、それを用いた方法に関する。
【解決手段】次の一般式（１）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤、それを用いた方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のミスマッチを有するＤＮＡ分子を安定化させ、その融解温度（Ｔｍ）を上昇されるための低分子化合物からなる融解温度（Ｔｍ）を上昇化剤、ＤＮＡ分子の安定化剤、又は不安定なＤＮＡ分子を接着させるための「分子糊」のような機能を有する機能性材料に関する。より詳細には、本発明は、後述する一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤に関する。また、本発明は、後述する一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体に関する。さらに、本発明は、これらの低分子化合物を用いた複数のミスマッチを含有する不安定なＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸がハイブリダイズして２本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。例えば、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）という具合になっている。そして、通常は全ての塩基がこのような対を形成してハイブリダイズしているのであるが、ときとして塩基配列の中の一部にこのような対を形成することができない場合がある。例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個又は数個の一部の塩基はこのような対を形成することができない場合がある。このような通常の塩基対を形成することができない塩基対のことを、以下ではミスマッチという。
【０００３】
一方、最近１個又は２個以上の塩基が異なることに起因する各種の遺伝病についての研究が行われてきている。例えば、遺伝情報の個人差である遺伝子一塩基多形（ＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphism））は、罹病しやすさや、薬理作用の個人差の原因となる。現在、各個人に最適化された医療の実現へ向け、ＳＮＰｓの研究がポストゲノムの重要な位置を占めており、効率的なＳＮＰｓの検出法の開発が期待されている。ＳＮＰｓを含むＤＮＡは、変異を含まない相補的なＤＮＡと混合しアニールさせるとミスマッチ塩基対を形成するので、このミスマッチ塩基対に選択的に結合する低分子リガンドを開発すれば、ＳＮＰｓの効率的な検出が可能になると考えられる。
現在、このようなミスマッチを検出する方法は、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率を比較する手法が一般的である。しかし、この方法を用いるためにはミスマッチを含むＤＮＡの塩基配列をあらかじめ知っておかなければならないために多大な労力が必要となり、多くの検体を処理する方法としては不適当である。また、ＭｕｔＳ等のＤＮＡの修復蛋白が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する手法もあるが、タンパク質を用いる場合、低分子リガンドを用いる方法に比べて熱安定性や活性な構造（フォールディング）を維持する事が必要となり使用条件の制約が多く、また操作も煩雑となり効率的にミスマッチを検出することは難しい。
【０００４】
このように、ハイブリダイズしたＤＮＡなどにおける一部のミスマッチを検出する方法は大変難しく、またその感度も不十分なものであり、これを簡便に且つ高感度で検出できる方法の確立が求められている。
ところで、本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特許文献１参照）。このバルジ認識分子は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものである。そして、本発明者らは、このような周辺の塩基の存在によるスタッキング効果を利用した不対塩基に対する作用についてさらに研究を行ってきたところ、塩基 対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を２個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれる得ることを見出し、具体的にはビス（２−メチルナフチリジン）アミド誘導体がＧＧミスマッチやＧＡミスマッチを検出できることを示してきた（特許文献２及び３参照）。しかし、このものは特定のミスマッチには極めて高感度で安定に取り込まれる得ることができるが、他のミスマッチに対しては取り込みが不十分であり、即ち特定のミスマッチに対する特異性が大きすぎて必ずしも実用的ではなかった。例えば、ＧＧミスマッチに対しては高い特異性を有するが、ＧＡミスマッチやＧＴミスマッチに対しては必ずしも十分な取り込みがなされなかった。
さらに、本発明者らは、このようなミスマッチ認識分子として、特にアミノナフチリジンダイマーに着目して、多数の誘導体を検討してきた（特許文献４〜８参照）。
【０００５】
遺伝子の変異を調べる方法として、変異の有無を検査したい遺伝子とその変異の無い野生型遺伝子の５０塩基程度のオリゴマーＤＮＡを混合、加熱、冷却により二つの遺伝子をクロスハイブリダイゼーションする方法がある。検査する遺伝子に変異がある場合には遺伝子の融解温度や融解温度差に異常が見出される。この操作は比較的簡便ではあるが、変異があることが分かるだけであり、どの位置にどのような変異が生じているのかということを知ることはできない。
前記してきた本発明者が報告してきた方法によれば（特許文献２〜８参照）、このクロスハイブリダイゼーションする方法により特定のミスマッチの存在を知ることはできるが、このミスマッチ認識分子は特異性が高く、例えば、グアニン塩基に対するミスマッチを調べる場合においても、ＧＧミスマッチ用のもの、ＧＡミスマッチ用のもの、ＧＴミスマッチ用のものと複数のミスマッチ認識分子を用意しなければならなかった。
【０００６】
また、本発明者らは、アミノナフチリジンダイマーのようなミスマッチ認識分子が、ミスマッチ部分においてどのような形態で結合しているのかということも検討してきた（非特許文献１参照）。例えば、ナフチリジンカルバメートダイマー（以下、単にＮＣということもある。）が、Ｇ−Ｃ塩基対に挟まれたＧ−Ｇミスマッチにおいては、ＮＣ：ＤＮＡが２：１の化学量論的量で結合していることを報告してきた（非特許文献２参照）。これらの解析は、Ｇ−Ｇのひとつのミスマッチについてなされてきたものであり、ＤＮＡ分子中のひとつだけのミスマッチでは、その融解温度（Ｔｍ）にそれほどおおきな影響は与えないが、ミスマッチが２個以上になると融解温度（Ｔｍ）に大きな影響が生じる。このようなことから、さらに多数のミスマッチを有するＤＮＡ分子についてのミスマッチにおける挙動が注目されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−８９４７８号公報
【特許文献２】特開２００１−１４９０９６号公報
【特許文献３】特開２００３−２５９８９９号公報
【特許文献４】特開２００４−２６１０８３号公報
【特許文献５】特開２００４−２７５１７９号公報
【特許文献６】特開２００４−３２５０７４号公報
【特許文献７】特開２００６−９４７２５号公報
【特許文献８】特開２００６−１０４１５９号公報
【非特許文献１】Nakatani, K., Hagihara, S., et al., Nat. Chem. Biol., 2005, 1, 39-43
【非特許文献２】Peng, T., Nakatani, K., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2005, 44, 7280-7283
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、２本鎖ＤＮＡにおける融解温度（Ｔｍ）を上昇させるための方法、及びそのための試薬を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ミスマッチ認識分子を開発してきたが、このようなミスマッチ認識分子は１塩基対のミスマッチを認識して融解温度（Ｔｍ）の変化をもたらすものであった。ＤＮＡ分子中のミスマッチが２塩基対以上の場合には融解温度（Ｔｍ）は大きく下降し、極端な場合にはハイブリダイズすることもできなくなる。このようなＤＮＡ分子を充分にハイブリダイズさせて融解温度（Ｔｍ）を上昇させることができれば、ＤＮＡ分子のハイブリダイズ（接着）が可能となるだけでなく、当該ＤＮＡ分子に結合した分子の接近や離脱を制御することも可能となる。
本発明者らは、本発明者らが開発したミスマッチ認識分子を詳細に検討して結果、これらのミスマッチ認識分子に中のいくつかのものは、２塩基対以上のミスマッチを有するＤＮＡ分子における融解温度（Ｔｍ）を極度に上昇させることができる分子であることが見出した。
即ち、本発明は、次の一般式（１）
【００１０】
【化４】
【００１１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ３は水素原子又は次の一般式（２）
【００１２】
【化５】
【００１３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは２つの窒素原子を結合させるリンカー基を示す。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤に関する。
また、本発明は、前記した一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法に関する。
さらに、本発明は、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記した一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法に関する。
また、本発明は、次の一般式（４）
【００１４】
【化６】
【００１５】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基を示す。）
で表される新規なナフチリジンカルバメートダイマー誘導体に関する。
さらに、本発明は、前記した一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法、及び、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記した一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法に関する。より詳細には、前記した方法が、前記一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体の光の照射によるアゾ基のシン−アンチ異性化によるものである前記方法に関する。
【００１６】
本発明をより具体的に記述すれば、以下のとおりとなる。
（１） 次の一般式（１）
【００１７】
【化７】
【００１８】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ３は水素原子又は次の一般式（２）
【００１９】
【化８】
【００２０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは２つの窒素原子を結合させるリンカー基を示す。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤。
（２）同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも１５℃以上である前記（１）に記載の上昇化剤。
（３）同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも２５℃以上である前記（１）又は（２）に記載の上昇化剤。
（４）ＤＮＡ分子が、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチを有するＤＮＡ分子である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の上昇化剤。
（５）Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチが、Ｔ−Ｇミスマッチである前記（４）に記載の上昇化剤。
（６）ＤＮＡ分子が、３個以上のミスマッチを有するものである前記（１）〜（４）のいずれかに記載の上昇化剤。
（７）３個目のミスマッチが、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置にある前記（６）に記載の上昇化剤。
（８）ＤＮＡ分子におけるミスマッチが、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’又は５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の上昇化剤。
（９）一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である前記（１）〜（８）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１０）一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である前記（９）に記載の上昇化剤。
（１１）一般式（１）及び（２）におけるＸが、酸素原子である前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１２）一般式（１）及び（２）におけるＲが、プロピレン基である前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１３）一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、アゾ基を含有するものである前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１４）一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基である前記（１３）に記載の上昇化剤。
（１５）一般式（３）におけるＲ４及びＲ５がメチレン基で、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である前記（１４）に記載の上昇化剤。
（１６）一般式（３）におけるアゾ基が、シン配置である前記（１４）又は（１５）に記載の上昇化剤。
【００２１】
（１７）前記（１）〜（１６）に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
（１８）２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記（１）〜（１６）に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
（１９）次の一般式（４）
【００２２】
【化９】
【００２３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２０）一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である前記（１９）に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２１）一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である前記（２０）に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２２）一般式（４）におけるＸが、酸素原子である前記（１９）〜（２１）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２３）一般式（４）におけるＲが、プロピレン基である前記（１９）〜（２２）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２４）一般式（３）におけるＲ４及びＲ５がメチレン基で、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である前記（１９）〜（２３）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２５）前記（１９）〜（２４）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
（２６）２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記（１９）〜（２４）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
（２７）前記（２５）又は（２６）に記載の方法が、光の照射によるアゾ基のシン−アンチ異性化によるものである前記（２５）又は（２６）に記載の方法。
（２８）次の一般式（１０）、
Ｚ１−Ｎ（Ｚ２）−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５−Ｎ（Ｚ３）−Ｚ４ （１０）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置であり、Ｚ１及びＺ４は次の一般式（１１）
【００２４】
【化１０】
【００２５】
（式中、Ｒ８は、水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示し、Ｚ２及びＺ３はそれぞれ独立して水素原子又は前記一般式（１１）で表される基を示す。）
で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメート誘導体。
（２９）一般式（１１）におけるＺ２及びＺ３が水素原子である前記（２８）に記載のナフチリジンカルバメート誘導体。
（３０）次の式（９）
【００２６】
【化１１】
【００２７】
で表されるアゾベンゼン誘導体。
（３１）前記（２８）〜（３０）に記載のいずれかの化合物からなる、ミスマッチを含有する不安定なＤＮＡ分子の安定性を光照射による光異性化により可逆的切り替えるためのＤＮＡ分子安定化剤。
（３２）前記（２８）〜（３０）に記載のいずれかの化合物を含有してなる、ミスマッチを含有する不安定なＤＮＡ分子の安定性を光照射による光異性化により可逆的に当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）制御剤。より詳細には、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）の上昇剤又は下降剤。
【００２８】
本発明者らは、５’−ＣＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列を有する１塩基のミスマッチにおけるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体の構造を解析してきた（非特許文献１及び２参照）。そして、これらの結果から、本発明者らは、当該ナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、特に一般式（１）におけるＲ１及びＲ２がメチル基であって、Ｒがプロピレン基であって、Ｒ３が水素原子であって、Ｘが酸素原子であるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（以下、ＮＣと略すことがある。）がグアニン（Ｇ）と水素結合をし、２分子のＮＣがＧＧの連続する配列に対して水素結合するものと仮定した。この仮定を図１により説明する。図１のａ（図１の左側）はＮＣとグアニン（Ｇ）との水素結合の様子を示したものであり、図１ｂ（図１の右側）はＧ−Ｇの１塩基のミスマッチ配列に対するＮＣの入り方を模式的に示したものである。連続するＧＧの配列に対して２分子のＮＣが水素結合する。そして、この結果、連続するＧＧの配列に隣接する塩基がＤＮＡのらせんの外側に出されると仮定した。そして本発明者らは、この仮定が正しいのであれば、連続するＧＧの配列に隣接する塩基はマッチするシトシン（Ｃ）である必要はなく、ミスマッチの塩基であっても可能ではないかと考えた。なお、図１ｂでは、この塩基をＸで示している。そこで、本発明者らは、この仮説を立証するために５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列を有する２塩基対のミスマッチについて実験をした。
【００２９】
このために１１塩基からなるＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）を作製した。それぞれの塩基配列は、
Ｔ１ ： ５’−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’
Ｃ１ ： ３’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣ−５’
であり、Ｔ−Ｇ及びＧ−Ｇの２カ所のミスマッチを有するものである（下線部参照）。
このＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）（５μＭ）の０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中での融解温度（Ｔｍ）は３５．７℃であった。これにＮＣ１００μＭを添加して、同様に融解温度（Ｔｍ）を測定したところ７１．１℃になった。実に３５．７℃もの融解温度の上昇を観測することができた。この結果を図２に示す。図２の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は２６０ｎｍにおける吸光度を示す。温度は毎分１℃の速度で上昇させ、１℃毎に吸光度を３回測定し、その平均値を図２のグラフに示した。図２の上側の曲線（原図では黒色）はＮＣが不存在の場合を示し、下側の曲線（原図では赤色）はＮＣが存在する場合を示している。
図２からもわかるように、特に４５℃〜５５℃の範囲においては、ＮＣが存在していない場合にはＴ１及びＣ１は、１本鎖で存在しているが、ＮＣが存在する場合にはＴ１及びＣ１は２本鎖で存在している。
【００３０】
これをさらに確認するために、ＣＳＩ−ＴＯＦ（cold spray ionization timt-of-flight）マススペクトルをとった。Ｔ１及びＣ１の２０μＭの、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液におけるＮＣ４０μＭの存在下又は不存在下におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を図３に示す。試料は−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度で注入された。図３ａ（図３の左側）はＮＣ不存在下のものであり、図３ｂ（図３の右側）はＮＣ存在下のものである。
図３ａに示されるように、１本鎖のＴ１は３−イオンとして（［Ｔ１］３−）、ｍ／ｚが１０９６．２に観測された（計算値：１０９６．２）。Ｔ１とＣ１の２本鎖のもは５−イオンとして（［Ｔ１／Ｃ１］５−）、ｍ／ｚが１３４４．８に観測された（計算値：１３４４．６）。一方、ＮＣを添加することにより、新たなピークであるＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−）のピークが、ｍ／ｚ１５４６．３に観測された（計算値：１５４５．９）。
また、ＮＣの濃度を変化させると、１本鎖のＴ１イオン（［Ｔ１］３−）が減少し、ＮＣとの複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−）が増加してくる様子が観察された。図４ａ（図４の左側）は２０μＭのＴ１に対するＮＣの濃度が２０μＭ（Ｔ１：ＮＣ＝１：１）の場合のＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルであり、図４ｂ（図４の右側）は２０μＭのＴ１に対するＮＣの濃度が６０μＭ（Ｔ１：ＮＣ＝１：３）の場合のＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルである。この結果、ＮＣの濃度の増加と共に１本鎖のＴ１イオン（［Ｔ１］３−）が減少し、ＮＣとの複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−）が増加してくることが示された。
【００３１】
そして、本発明者らは、この場合には５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列におけるチミン（Ｔ）は、ＤＮＡのらせんの外側にくるものと予測した。これを確認するために、本発明者らは、ＮＣにより２本鎖を形成したＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）の過マンガン酸カリウムによる酸化を試みた。もし、チミン（Ｔ）が螺旋の外側にあれば、過マンガン酸カリウムによる酸化を受けてチミングリコール（Ｔｇ）になる（Hayatsu, H.;Ukita, T., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1967, 29, 556-561参照）。そして、酸化されたチミングリコール（Ｔｇ）は、ピペリジン中で加熱することによりこの部位で切断される（Rubin, C. M.;Schmid, C. W., Nucleic. Acids Res., 1980, 8, 4613-20 ; Maxam, A. M.;Gilbert, W., Methods Enzymol., 1980, 65, 499-560 ; Gogos, J. A.;Karayiorgou, M., et al., Nucleic. Acids Res., 1990, 18, 6807-6814参照）。
２本鎖ＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）を０℃で過マンガン酸カリウムで酸化し、次いでピペリジン中で９０℃で処理した。この反応の概要を次のスキームで示す。
【００３２】
【化１２】
【００３３】
ＮＣの不存在下における２本鎖のＴ１／Ｃ１は０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムで３２０分間処理しても反応しなかったが、４０μＭのＮＣの存在下での２本鎖のＴ１／Ｃ１ではＴｇ１（チミングリコールに酸化されたＴ１鎖）がＨＰＬＣにより確認された。そして、ピペリジン中での加熱処理により切断されたフラグメントの存在がＨＰＬＣで確認された。これらのＨＰＬＣのチャートを図５に示す。図５ａ（図５の左上側）はＮＣの不存在下での過マンガン酸カリウムによる処理結果のＨＰＬＣを示し、図５ｂ（図５の右上側）はＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる処理結果のＨＰＬＣを示し、図５ｃ（図５の左下側）はＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる処理の後、ピペリジンで加熱処理した結果のＨＰＬＣを示す。この結果、図５ｂではＴｇ１のピークを確認することができ、さらにピペリジン中での加熱処理により切断されたフラグメントＣＣＣＡｐ及びｐＧＧＴＣＣＧを確認することができた。
また、これらのフラグメントをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルで確認した。酸化される前のＴ１はｍ／ｚが３２９３．５に観測され（計算値：３２９３．２）、酸化されたチミングリコール（Ｔｇ）のＴ１、即ちＴｇ１はｍ／ｚが３３２６．１に観測された（計算値：３３２７．２）。
そして、これをピペリジン中で加熱処理して得られたフラグメント５’−ｄ（ＣＣＣＡ）−ＰＯ３Ｈ−３’（ＣＣＣＡｐ）のｍ／ｚは１１９８．６に観測され（計算値：１１９８．８）、もう一方のフラグメント５’−ＨＯ３Ｐ−ｄ（ＧＧＴＣＣＧ）−３’（ｐＧＧＴＣＣＧ）のｍ／ｚは１８８８．４に観測された（計算値：１８８８．２）。
また、これらのオリゴマーは、アルカリホスファターゼにより末端を脱リン酸化し、標準のオリゴマーと共に逆相ＨＰＬＣにおいても確認された。
１１塩基からなるＴ１には２つのチミン（Ｔ）が存在している。即ち、−ＡＴＧＧ−におけるチミン（Ｔ）と、−ＧＧＴＣＣ−におけるチミン（Ｔ）が存在している。しかし、過マンガンサンカリウムによる処理及びそれに続くピペリジンでの処理においては前者、即ち、−ＡＴＧＧ−におけるチミン（Ｔ）だけが反応した結果が得られた。この結果は、当該チミン（Ｔ）のみがＮＣの存在によりＤＮＡのらせんの外側に存在していることを証明している。
【００３４】
これらの結果から、ＮＣが２個のミスマッチを含有するＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、かつ２本鎖ＤＮＡとして安定に存在させることができる試薬であることを証明している。そしてグアニン以外のミスマッチ塩基はＤＮＡの螺旋の外側に追い出されている構造となっている。
さらに、本発明者らは、これらの結果が普遍的なものであるかどうかをさらに確認するために、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’の配列を有する３塩基対のミスマッチ、即ち、Ｔ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ｇミスマッチ、及びＧ−Ｔミスマッチのものについて実験をした。
このために１１塩基からなるＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）を作製した。それぞれの塩基配列は、
Ｔ２ ： ５’−ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ−３’
Ｔ３ ： ３’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＧＴＣ−５’
であり、Ｔ−Ｇ、Ｇ−Ｇ、及びＧ−Ｔの３カ所のミスマッチを有するものである（下線部参照）。このＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）は室温では１本鎖ＤＮＡとして存在しているが、ＮＣの濃度が増加するにつれて２本鎖ＤＮＡとして存在するようになる。そして１００μＭのＮＣの存在下での融解温度（Ｔｍ）は５８．８℃に達した。このように、このＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）（５μＭ）の０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中での融解温度（Ｔｍ）は室温以下であったが、これにＮＣを１００μＭを添加して、同様に融解温度（Ｔｍ）を測定したところ５８．８℃になった。実に３０℃以上もの融解温度の上昇を観測することができた。なお、ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）の融解温度（Ｔｍ）は、１０℃以下であることまでは測定することができたが、正確な融解温度（Ｔｍ）の測定は困難であった。
このＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）（５μＭ）の熱変性特性を図６に示す。図６の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は２６０ｎｍにおける吸光度を示す。温度は毎分１℃の速度で上昇させ、１℃毎に吸光度を３回測定し、その平均値を図６のグラフに示した。図６の８本の曲線は、右末端（８０℃付近）の下からＮＣの濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合をそれぞれ示す。
ＮＣの各濃度におけるＴ２とＴ３の１本鎖から２本鎖への転移をＣＤスペクトルにより観察した。Ｔ２及びＴ３のそれぞれ５μＭの、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、２５℃における、ＮＣの濃度が０、５、１０、１５、及び２０μＭでのそれぞれのＣＤスペクトルを測定した。結果を図７に示す。図７中の（ａ）はＮＣが０、即ち不存在の場合を示し、（ｂ）はＮＣが５μＭの場合を示し、（ｃ）はＮＣが１０μＭの場合を示し、（ｄ）はＮＣが１５μＭの場合を示し、（ｅ）はＮＣが２０μＭの場合を示す。この結果、ＮＣが存在していない場合には２７２ｎｍでプラスのバンドを示し、２５０ｎｍではマイナスのバンドがしめされたが、ＮＣの添加により、モル比が１から４に増加するにつれてプラスのバンドが楕円的に増加することが示された。さらに、３４８ｎｍ及び３２４ｎｍでのＣＤバンドの強度がＮＣの濃度の増加と共に変化した。このＣＤの変化はイソ二色性（isodichroic）のポイントを包含しており、Ｔ２及びＴ３の１本鎖からＮＣを含む２本鎖への転移を示している。
【００３５】
Ｔ２及びＴ３のＮＣを含む２本鎖の複合体の形成は、ＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルによっても確認された。Ｔ２及びＴ３の２０μＭの、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液におけるＮＣの不存在（図８の（ａ））、ＮＣが２０μＭ存在（図８の（ｂ））、ＮＣが４０μＭ存在（図８の（ｃ））、及びＮＣが６０μＭ存在（図８の（ｄ））におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を図８に示す。試料は−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度で注入された。図８（ａ）（図８の左上側）はＮＣ不存在下のものであり、図８（ｂ）（図８の右上側）はＮＣが２０μＭ存在下のものであり、図８（ｃ）（図８の左下側）はＮＣが４０μＭ存在下のものであり、図８（ｄ）（図８の右下側）はＮＣが６０μＭ存在下のものである。
図８（ａ）に示されるように、１本鎖のＴ２は３−イオンとして（［Ｔ２］３−）、ｍ／ｚが１１０７．６に観測された（計算値：１１０６．２）。１本鎖のＴ３も３−イオンとして（［Ｔ３］３−）、ｍ／ｚが１１４０．２に観測された（計算値：１１３８．９）。Ｔ２とＴ３の２本鎖のものは５−イオンとして（［Ｔ２／Ｔ３］５−）、ｍ／ｚが１３４９．０に観測された（計算値：１３４７．２）。また、Ｔ２とＴ３の２本鎖のもので４−イオンとして（［Ｔ２／Ｔ３］４−）、ｍ／ｚが１６８７．２に観測された（計算値：１６８４．３）。一方、ＮＣを２０μＭ、即ちモル比で１：１の量を添加した場合（図８の（ｂ））には、新たなピークであるＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ２／Ｔ３＋２ＮＣ］５−）のピークが、ｍ／ｚ１５５０．７に観測された（計算値：１５４８．５）。
また、ＮＣの濃度を変化させると、１本鎖のＴ２イオン（［Ｔ２］３−）及びＴ３イオン（［Ｔ３］３−）が減少し、ＮＣとの複合体（［Ｔ２／Ｔ３＋２ＮＣ］５−）が増加してくる様子が観察された（図８（ｃ）（図８の左下側）及び図８（ｄ）（図８の右下側）参照）。
この場合においても、ＤＮＡ：ＮＣのモル比が１：２の化学量論量での複合体の形成が確認された。
【００３６】
さらに、前記の場合と同様に過マンガン酸カリウムによる酸化切断を次に示す１１塩基からなるＤＮＡを用いて実験した。
Ｔ４ ： ５’−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ−３’
Ｔ４ ： ３’−ＣＧＴＴＧＧＴＡＡＣＧ−５’
この反応スキームを前記したスキームと同様に次に示す。
【００３７】
【化１３】
【００３８】
ＮＣの不存在下におけるＴ４を、０℃で０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムで４０分間処理しても反応しなかった（図９（ａ）参照）が、４０μＭのＮＣの存在下での２本鎖のＴ４／Ｔ４では、続くピリミジンでの加熱処理後で生成物１及び２が確認された（図９（ｂ）参照）。０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムでの処理を５時間とすることにより、生成物１及び２を主生成物として得ることが出来る（図９（ｃ）参照）。０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムでの処理で得られるＴｇ４（チミングリコールに酸化されたＴ４鎖）は、ＨＰＬＣではＴ４のすぐそばにあらわれ、ＨＰＬＣにより確認することは困難であったが、酸化に続くピペリジンの加熱処理により生成物１及び２が得られることから容易に確認することができた。ここで得られた生成物１及び２は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにより確認された。即ち生成物１はオリゴマー５’−ｄ（ＧＣＡＡ）−ＰＯ３Ｈ−３’であり、ｍ／ｚが１２６１．６に観測され（計算値：１２６２．２）、生成物２はオリゴマー５’−ＨＯ３Ｐ−ｄ（ＧＧＴＴＧＣ）−３’であり、ｍ／ｚが１９０１．７に観測された（計算値：１９０２．３）。これらのオリゴマーは、アルカリホスファターゼの存在したで、３７℃で３０分間処理することにより脱リン酸化してそれぞれ５’−ｄ（ＧＣＡＡ）−３’及び５’−ｄ（ＧＧＴＴＧＣ）−３’として、これを標品ののものと比較して同じリテンションタイムを有するものであることを確認した（図９（ｄ）参照）。
これらのＨＰＬＣのチャートを図９に示す。図９（ａ）（図９の左上側）はＮＣの不存在下での過マンガン酸カリウムによる処理結果のＨＰＬＣを示し、図９（ｂ）（図９の右上側）は４０μＭのＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる４０分間の処理、続くピペリジン中での加熱処理後のＨＰＬＣを示し、図９（ｃ）（図９の左下側）は４０μＭのＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる５時間の処理、続くピペリジン中での加熱処理後のＨＰＬＣを示す。図９（ｄ）（図９の右下側）は生成物１及び２をアルカリホスファターゼで処理した後のＨＰＬＣの結果を示す。
この結果、図５ｂではＴｇ１のピークを確認することができ、さらにピペリジン中での加熱処理により切断されたフラグメントＣＣＣＡｐ及びｐＧＧＴＣＣＧを確認することができた。
また、酸化される前のＴ４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルはｍ／ｚが３３７２．０１に観測され（計算値：３３７０．６０）、酸化されたチミングリコール（Ｔｇ）のＴ４、即ちＴｇ４はｍ／ｚが３４０４．３７に観測された（計算値：３４０４．６１）。このことからも前記した５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列を有する２塩基対のミスマッチと同様な化学量論的な構造が、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’の配列を有する３塩基対のミスマッチいおいても生起していることが確認された。
これらの結果から、ＮＣが３個のミスマッチを有するＤＮＡ分子についても、前記した２個のミスマッチを含有するＤＮＡの場合と同様に、融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、かつ２本鎖ＤＮＡとして安定に存在させることができる試薬であることが証明された。そしてグアニン以外のミスマッチ塩基はＤＮＡのらせんの外側に追い出されている構造となっていることが証明された。
【００３９】
これらの実験結果は、ナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）が、２つ以上のミスマッチを有するＤＮＡにおいて充分な安定化効果、即ち、融解温度（Ｔｍ）を上昇させる作用をゆうしていることを実証するものである。これは、このようなナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）は、通常の温度域でハイブリダイズすることができない程度に塩基配列が相違している１本鎖のＤＮＡを安定化させてハイブリダイズさせることができるという特性を有していることを実証するものである。そして、この事実はシトシン（Ｃ）やチミン（Ｔ）などのピリミジン塩基に限定されるものではなく、アデニン（Ａ）やグアニン（Ｇ）などのプリン塩基においても同等に、即ち、ＮＣの存在によりミスマッチの塩基対の塩基がＤＮＡのらせんの外側に追い出されることを示すものでもある。
このように、本発明が開示するナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ類）は、ＤＮＡの安定化や融解温度（Ｔｍ）の上昇という現象だけでなく、ＤＮＡの構造を水素結合とπ電子系によるπ−スタッキング効果により構造的に安定化させる作用を有するものであることが本発明により具体的に明らかにされたのである。
【００４０】
本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ類）は、一般式（１）で示されるものであるり、当該一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体について、さらに詳細に説明する。
本発明の一般式（１）における、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示ものである。ここで、炭素数１〜５の炭化水素基としては、飽和であっても不飽和であってもよく、また直鎖状であっても分岐状であってもよい。かかる炭化水素基としては、炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜５の直鎖状又は分岐状のアルケニル基、炭素数３〜５のシクロアルキル基などが挙げられる。このような炭化水素基としては、具体的には例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基等のアルケニル基；エチニル基、プロピニル基等のアルキニル基等を挙げることができる。好ましい炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などの炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられる。また、Ｒ１及びＲ２における、炭素数１〜５の炭化水素基の少なくとも１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基としては、１個の炭素原子が酸素原子で置換された炭素数１〜４のアルコキシル基、炭素数１〜４のアルコキシアルキル基、１この炭素原子が窒素原子で置換された炭素数１〜４のジアルキルアミノ基、炭素数１〜４の（ジ又はモノ）−アルキルアミノアルキル基、２個の炭素原子が酸素原子で置換された炭素数１〜３のアルコキシアルコキシ基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の一般式（１）におけるＸとしては、酸素原子又は硫黄原子が挙げられる。Ｘが酸素原子の場合には隣接するアミド基と共にカルバメート基を形成することになり、Ｘが硫黄原子の場合には、隣接するアミド基と共にチオカルバメート基を形成することになる。このように、本発明におけるカルバメート基としては、酸素源ｓにからなるカルバメート基であってもよいし、１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオカルバメート基であってもよい。好ましいカルバメート基としては、酸素原子からなるカルバメート基、即ちＸが酸素原子であるカルバメート基が挙げられる。
本発明の一般式（１）におけるＲとしては、炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、具体的には例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの直鎖状のアルキレン基、メチルメチレン基、エチルメチレン基、１−メチルエチレン基、２−メチルエチレン基、１−エチルエチレン基、２−エチルエチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、３−メチルプロピレン基、１−エチルプロピレン基、２−エチルプロピレン基、３−エチルプロピレン基などの分岐状のアルキレン基などが挙げられる。好ましいＲとしては、２個のナフチリジン環がグアニン等と水素結合を形成し、立体的にπ−スタッキング効果を得ることが出来る長さと自由度を有し、分子の熱安定性が優れたアルキレン基が挙げられ、具体的には直鎖状における炭素数が３のプロピレン基又はそのそのアルキル基置換体が挙げられる。より好ましいＲとしては、直鎖状のプロピレン基が挙げられる。
【００４２】
一般式（１）におけるＲ３としては、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマーを単独で使用とする場合には水素原子であってよいが、これに限定されるものではない。水素原子以外の基としては炭素数１〜５、好ましくは１〜３程度の立体的に余り大きくなく、かつ化学的に不活性な基、例えばアルキル基などが挙げられる。
また、発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマーは、前述してきたようにＤＮＡ分子とモル比で１：２の化学量論量で結合することから、この二量体構造を有するものとして使用することもできる。このような二量体構造を有するものとしては、一般式（１）におけるＲ３が一般式（２）で示される構造を有するものが挙げられる。一般式（２）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ、及びＸは前記したものと同じである。一般式（２）におけるＬとしては、それぞれのナフチリジンカルバメートダイマー部分を化学結合で結合させることができるものであって、両者の距離及び自由度を適度に保てるものであれば特に制限はない。好ましい、Ｌとしては、炭素数５〜１５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基、炭素数１２〜２０のフェニレン基を有するアルキレン基、次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表されるアゾ基を含有する基などが挙げれる。
前記した一般式（３）におけるＲ４及びＲ５としては、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などが挙げられる。好ましいアルキレン基としてはメチレン基が挙げられる。また、Ａｒ１及びＡｒ２で表されるアリーレン基としては、炭素数６〜３０、好ましくは６〜１２の６員芳香環からなるアリール基から誘導される２価のアリーレン基が挙げられる。好ましいアリーレン基としては、ｐ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基、ｏ−フェニレン基などのフェニレン基があげられる。好ましいＡｒ１及びＡｒ２としては、ｐ−フェニレン基が挙げられる。一般式式（３）におけるアゾ基はシン配置であってもアンチ配置であってもよいが、アゾ基の立体配置によりＤＮＡ分子の安定性が異なってくることは後述する。
本発明の一般式（１）における好ましい化合物としては、次の式（５）
【００４３】
【化１４】
【００４４】
で表される化合物、即ち、一般式（１）におけるＲ１及びＲ２がメチル基であって、Ｒがプロピレン基であって、Ｒ３が水素原子であって、Ｘが酸素原子であるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、次の式（６）又は（７）
【００４５】
【化１５】
【００４６】
【化１６】
【００４７】
で表される化合物、即ち、一般式（１）におけるＲ１及びＲ２がメチル基であって、Ｒがプロピレン基であって、Ｒ３がＮ−（アゾ−ビス（ｐ−フェニレンメチレン））−ナフチリジンカルバメートダイマーであって、Ｘが酸素原子であるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のうちのアンチ異性体（６）及びシン異性体（７）が挙げられる。
【００４８】
本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のうちのＲ３が水素原子である化合物は、公知化合物であり、例えば、特許文献８に記載された方法により製造することができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシアルキル）アミン又はそのＮ−保護体をサクシノイル基などのＯ−保護基で保護されたカーボネートとし、これに２−アミノ−１，８−ナフチリジン又はその７位が上記Ｒ１又はＲ２で置換された２−アミノ−１，８−ナフチリジンを反応させて、製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。
【００４９】
本発明の一般式（１）におけるＲ３が水素原子以外のものである化合物、即ち、一般式（４）で表される化合物は新規化合物である。
本発明の一般式（４）で表される化合物は、例えば、次の一般式（８）
ＯＨＣ−Ｒ６−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ７−ＣＨＯ
（式中、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して化学結合又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示す。）
で表されるジアルデヒド誘導体を、前記した本発明の一般式（１）におけるＲ３が水素原子である化合物と還元条件で反応させて、アミノ基をカップリングさせて製造することができる。これらの反応条件としては、通常の還元的アミノ化反応の条件を採用することができる。
【００５０】
本発明の一般式（４）で示される化合物は、分子中にナフチリジンのような塩基を認識する、即ち塩基と水素結合することができる部位と、光の照射によりシン−アンチ異性化を起こすことができるアゾ基を有していることを特徴とするものである。
例えば、アンチ体（６）（トランス体）に３６０ｎｍの光を照射することにより、シン異性体（７）（シス体）とすることができ、また、シン異性体（７）（シス体）に４３０ｎｍの光を照射することにより、アンチ体（６）（トランス体）に可逆的に変換することができる。これらの光異性化の反応式を次に示しておく。
【００５１】
【化１７】
【００５２】
このように光の照射により可逆的に変換されるシン異性体とアンチ異性体は立体的に大きく異なる構造となり、塩基との相互作用が立体的に制限されることになる。この様子を模式化して図１０に示す。このようなアゾ基を有する分子は光１及び光２により可逆的に変換され、シス−トランスの立体構造を取ることになる。例えば、図１０に示されるようにシン異性体（シス体）となったときにミスマッチのＤＮＡに前記してきたＮＣと同様に相互作用をし、ミスマッチを有するＤＮＡ分子を安定化させることができる。しかし、このような立体構造により安定化されている状態にあったとしても、ここに光２が照射されてアンチ異性体（トランス体）に変化された場合には、もはや安定な相互作用をしうる立体構造をとることはできず、ＤＮＡ分子は不安定になる。
例えば、ＧＧミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ５’−ＣＴＡ ＡＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’／３’−ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣ−５’、及び式（６）で表されるトランス体−３を混合し、２本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を測定した。３６０ｎｍの光照射を５分間行い、トランス体−３（ｉ）からシス体−３（ｉｉ）へと変換される。この時、２本鎖ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）は２９℃から５２℃へと大幅に上昇し（図１１参照）、安定な二本鎖構造をとる。さらにシス体−３（ｉｉ）に対して４３０ｎｍの光を照射するとトランス体−３（ｉｉｉ）へと戻る。そうすると再び二本鎖はミスマッチ塩基対の存在のため大きく不安定化される。さらに３６０ｎｍの光照射を行うとシス体−３（ｉｖ）のまた戻る。これらのそれぞれの状態における熱変性特性を測定した結果を図１１に示す。図１１の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は吸光度（ＡＵ）を示す。図１１中の（ｉ）はトランス体−３（ｉ）の場合を示し、（ｉｉ）はシス体−３（ｉｉ）の場合を示し、（ｉｉｉ）はトランス体−３（ｉｉｉ）の場合を示し、（ｉｖ）はシス体−３（ｉｖ）の場合をそれぞれ示している。
このように、光の照射により「分子糊」の機能を再度よみがえらせることができる。以上のように小分子と光によって可逆的にＤＮＡの二重鎖形成を制御することが可能であった。
【００５３】
前述してきたように、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体は、２つ以上のミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、安定化する。これは、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体がミスマッチ配列中のＧＧ部位に結合することにより、ミスマッチを含んだ二本鎖構造を誘起させ、安定化させるからである。即ち、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体は、ミスマッチを有して不安定なＤＮＡを一本鎖から二本鎖へと変換する「分子糊」としての機能を発揮するからである。本発明の一般式（４）で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメートダイマー誘導体は、このような「分子糊」として機能に、さらに、ＤＮＡの二本鎖形成を光などの外部刺激によって可逆的に制御するための機能を有するものということができる。このような光異性化能を有するアゾベンゼン骨格を本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のリンカー部に導入した分子が本発明の一般式（４）で表される化合物である。光照射によってアゾベンゼン部位のトランス／シスが変換され、それに応じて、トランス体及びシス体のミスマッチＤＮＡに対する結合能も変化する（図１０参照）。即ち、一般式（４）の化合物は、照射する光の波長により「分子糊」としての機能のオン／オフの切り替えを制御することができることになる。
このような光による制御を可能とする化合物としては、前記してきた本発明の一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体だけでなく、より単純な化学構造をしている、次の式（９）
【００５４】
【化１８】
【００５５】
で表される化合物が挙げられる。この化合物は、窒素原子から１つのナフチリジン構造を削除した化学構造を有するものであり、単純な構造で前記した「分子糊」としての機能のオン／オフの切り替えを制御することができることになる。
したがって、本発明における照射する光の波長により「分子糊」としての機能のオン／オフの切り替えを制御することができる化合物を一般式で表すと、次の一般式（１０）、
Ｚ１−Ｎ（Ｚ２）−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５−Ｎ（Ｚ３）−Ｚ４ （１０）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置であり、Ｚ１及びＺ４は次の一般式（１１）
【００５６】
【化１９】
【００５７】
（式中、Ｒ８は、水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示し、Ｚ２及びＺ３はそれぞれ独立して水素原子又は前記一般式（１１）で表される基を示す。）
で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメート誘導体ということができる。
本発明の一般式（１０）におけるＲ４、Ｒ５、Ａｒ１、及びＡｒ２は、それぞれ前記してきたものと同じものを示し、一般式（１１）におけるＲ、及びＸも前記してきたものと同じものを示し、一般式（１１）におけるＲ８は前記してきた一般式（１）におけるＲ１やＲ２と同じ基を示す。
また、一般式（１０）で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメート誘導体も新規化合物であり、前記した一般式（４）で表される化合物と同様な方法で製造することができる。
【００５８】
次に、本発明におけるＤＮＡ分子について説明する。本発明における「２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子」とは、（１）塩基配列として少なくとも２個のＧが連続したＧＧ配列を有すること、（２）Ｇ−Ｇミスマッチを有すること、及び（３）前記したＧ−Ｇミスマッチ以外に、さらに少なくとも１つのミスマッチを有することを条件とするものである。さらに、好ましい態様としては、前記（１）で示した２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列における一方のグアニン（Ｇ）において前記（２）に示したＧ−Ｇミスマッチが有り、前記（３）に示した他のミスマッチが前記（２）で示したＧ−Ｇミスマッチに隣接しているものが挙げられる。即ち、好ましい態様としては、５’−ＮＧＧ−３’／３’−ＧＧＹ−５’（Ｎ及びＹは、それぞれ独立してシトシン（Ｃ）以外の塩基を示す。）の塩基配列を有するＤＮＡ分子が挙げられる。より好ましい態様としては、Ｎ又はＹの少なくとも一方、好ましくは両方がチミン（Ｔ）である塩基配列を有するＤＮＡ分子が挙げられる。本発明における好ましいＧ−Ｇミスマッチ以外のミスマッチとしては、Ｇ−Ｔミスマッチが挙げられる。
本発明における「ミスマッチ」とは、ワトソン−クリック型塩基対、即ち、Ｔ−Ａ又はＧ−Ｃの塩基対以外の塩基であり、バルジ塩基をも包含している。したがって、前記した配列におけるＮ又はＹの一方又は両方が塩基でない場合も包含しているが、好ましい態様としてはＮ及びＹがシトシン（Ｃ）以外の塩基である場合が挙げられる。
本発明のＤＮＡ分子の長さは特別な制限はないが、余り長いとミスマッチ部分に対してマッチしている塩基部分が多くなり、融解温度（Ｔｍ）が低くならないことから、好ましい長さとしては、６〜１５０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜５０ｍｅｒ、さらに好ましくは１０〜３０ｍｅｒ程度が挙げられる。ミスマッチ部分が多数存在している場合には、前記した長さに制限されず、さらに長いものであってもよい。好ましいＤＮＡ分子としては０℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３０℃の範囲で２本鎖ＤＮＡを形成することができない程度のミスマッチを有するＤＮＡ分子が挙げられる。
【００５９】
本発明における融解温度（Ｔｍ）とは、通常の核酸類について使用される意味である。即ち、核酸、例えばＤＮＡを加熱してゆくと、ある温度で立体構造に極端な変化が起こって、この変化があたかも相転移に相当するような変化であることから、このときの温度を融解温度（Ｔｍ）と言っている。例えば、薄い中性の塩溶液中で二重らせん構造をしているＤＮＡの溶液を、温度を上昇させながら溶液の紫外線吸収を測定いくと、ある温度に達したときに、それまではほぼ一定であった紫外線吸収が急激に上昇し、紫外線吸収が約４０〜５０％増加した値に達すると再び一定になる（濃色効果）。この変化の温度幅が極めて狭く、あたかも相転移が起こったかのようにみえるために、ＤＮＡが「融解した」として変化の起こった温度幅の中間の温度を融解温度（Ｔｍ）と呼んでいる。本発明においても「融解温度（Ｔｍ）」はこの意味で使用する。融解温度の測定は紫外線吸収だけでなく、円二色性や赤外線吸収でも測定することができる。
本発明における「融解温度（Ｔｍ）の上昇」とは、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、又は一般式（１１）で表されるナフチリジンカルバメート誘導体のいずれの化合物の不存在下で測定したと同じ測定条件で、前記したナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のいずれかの化合物の存在下、好ましくはＤＮＡ分子とこれらの化合物のモル比（一般式（４）の場合には当量の比）が１：１以上、より好ましくは１：２以上の量の存在下で測定したときの融解温度（Ｔｍ）を比較したときに、これらの本発明の化合物が存在したときに少なくとも１５℃以上、好ましくは２５℃以上上昇することをいう。したがって、本発明における「融解温度（Ｔｍ）」の測定条件、例えば、溶媒の種類、塩の種類、塩の濃度、ＤＮＡの濃度については特に制限はないが、極端な濃度や溶媒の選択は除外されることは当然である。薄い中性の塩溶液での測定であれば特に制限はない。
【００６０】
本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は、ミスマッチを有するＤＮＡ分子を本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体の存在により安定化させて融解温度（Ｔｍ）を上昇させるものである。同じ温度について言えば、１本鎖でしか存在することができないＤＮＡ分子を安定化させて２本鎖のＤＮＡとすることができるということであり、本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は１本鎖の状態で存在しているＤＮＡ分子を２本鎖にする、即ち、このようなＤＮＡ分子を「接着」させる「糊」のような機能を有するものである。この意味で本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は、２つの分子を接着させる「分子糊」ということもできるし、２本鎖ＤＮＡの安定化剤ということもできるし、また、一定の温度における２本鎖ＤＮＡの形成剤ということもできる。
さらに、本発明の一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体や、一般式（１１）で表されるナフチリジンカルバメート誘導体は、前述してきたように、光の照射により可逆的にシン−アンチ異性化を行うことができるアゾ基を含有しているために、光の照射により前記した「分子糊」としての機能をオン又はオフとすることができる。したがって、本発明のこのような「分子糊」としての機能をオン又はオフとすることができる分子は、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させたり、下降させたり、即ち、室温のような一定の温度においてＤＮＡの２本鎖を安定化させたり、不安定にさせたりすることがでることから、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）制御剤ということができる。また、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）の上昇剤及び／又は下降剤ということもできる。
【００６１】
本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は、単にミスマッチを有する不安定なＤＮＡを安定化させるという機能だけでなく、前記したように「分子糊」としての機能をも有するものであることから、各種の応用が可能となる。
例えば、ミスマッチを有する本発明のＤＮＡ分子のそれぞれの鎖に２種類の物質（例えば、蛍光色素、有機分子、核酸分子、タンパク質、糖、ベシクル、金属粒子、金属薄膜、細胞、ベシクル等）を標識しておけば、本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」の存在下でのみ、これらの２種類の物質を空間的に近づけることが出来る。また、アゾ基を有する本発明の上昇剤を使用すれば、光の照射により可逆的のこれらの２種類の物質を空間的に近づけたり遠ざけたりすることが可能となる。
また、細胞内のシグナル伝達系では、異種もしくは同種蛋白の集合が重要であることが知られており、本発明の「分子糊」の機能を利用して本発明の上昇剤の存在下でのみ二つの蛋白を集合させることが可能となる。この方法を用いて、異種蛋白間の相互作用を調べることも可能となる。さらに、光でスイッチングする分子糊を使えば、蛋白間相互作用によるシグナル伝達系を、光の照射により簡便にオン／オフすることが可能になる。
さらに、本発明の上昇剤を基板上に固定化することにより、本発明の上昇剤が固定化されたスポット上でのみ、２種類の物質を空間的に接近させることができ、蛍光発光や蛍光の消光などの２種類の物質の相互作用を簡便な方法で測定することができるようになる。この方法を用いることにより、任意の二つの物質の存在を判別することも簡便に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００６２】
以上のように、本発明は、全く新しい発想により、２種類の分子を分子レベルで空間的に接近させたり遠ざけることが可能となる新規な試薬、及びそれを用いた方法を提供するものである。
また、従来の核酸の構造の制御方法の多くは、光などに応答する部位でＤＮＡを修飾することにより、あらかじめＤＮＡに標識となる物質を導入しておく必要があった。そのため、天然のＤＮＡに対してはこのような方法は全く効果がなく、用途が大きく制限されていた。これに対して本発明では、外部より小分子を加えることにより核酸の構造を制御するため、ＤＮＡ自身に対する修飾は必要がない。すなわち、合成困難な長鎖ＤＮＡや細胞内のＤＮＡを標的とすることができる。その上、光照射により可逆的かつ特定の配列のみに構造制御を行うことが可能である。また、本発明は小さな分子の添加によるミスマッチの多い核酸分子を安定化させることができるというユニークな発想に基づくものであり、本発明の手法は多種多様なミスマッチ分子にも拡張することができ、本発明はその基本的な思想を提供するものである。
さらに、本発明により、ＤＮＡの張り合わせを小分子と光によりコントロールすることができる。例えば、ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションや核酸を基盤としたナノ構造の制御、核酸の二本鎖形成に伴う様々な生化学的現象、複製・転写などの小分子による制御が可能になる。
【００６３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例で使用される式（５）で表される化合物は、特許文献８に記載の方法で製造した。
【実施例１】
【００６４】
ＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の熱変性特性の測定。
以下に示す塩基配列を有する１１塩基からなるＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）を製造した。
Ｔ１ ： ５’−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’
Ｃ１ ： ３’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣ−５’
このＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の５μＭを、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、４℃〜９４℃の範囲における熱変性特性を測定した。温度は毎分１℃の速度で上昇させ、１℃毎に２６０ｎｍにおける吸光度を３回測定し、その平均値を測定した。結果を図２の上の曲線で示す。
同様に、このＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の５μＭ、及び式（５）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（以下、単にＮＣという。）１００μＭを、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、４℃〜９４℃の範囲における熱変性特性を測定した。
結果を図２の下側の曲線で示す。
また、これらの融解温度（Ｔｍ）を測定した。この結果ＮＣ不存在下でのＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の融解温度（Ｔｍ）は３５．７℃であった。これにＮＣ１００μＭを添加して、同様に融解温度（Ｔｍ）を測定したところ７１．１℃であった。
この結果、本発明のＮＣがＤＮＡ分子の誘拐温度（Ｔｍ）を上昇させることがわかった。
【実施例２】
【００６５】
ＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）のＣＳＩ−ＴＯＦ（cold spray ionization timt-of-flight）マススペクトルの測定。
実施例１で製造したＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の２０μＭを、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液に溶解し、−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度でＣＳＩ−ＴＯＦに注入して測定した。ｍ／ｚが１０００−１８００の範囲の結果を図３ａに示す。
同様に、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の２０μＭ、及びＮＣ４０μＭの存在下で、ＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果のｍ／ｚが１０００−１８００の範囲を図３ｂに示す。
１本鎖のＴ１（［Ｔ１］３−） ； 実測値 １０９６．２
計算値 １０９６．２。
２本鎖のＴ１／Ｃ１（［Ｔ１／Ｃ１］５−） ； 実測値 １３４４．８
計算値 １３４４．６。
ＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−） ； 実測値 １５４６．３
計算値 １５４５．９。
【実施例３】
【００６６】
ＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の酸化、及びそれに続くピペリジン加熱による切断。
実施例１で製造したＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の１２．５μＭを、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中に溶解し、これに過マンガン酸カリウム０．２ｍＭを添加し、０℃で３２０分間反応させた。この結果の生成物のＨＰＬＣを図５（ａ）に示す。この結果、反応は生起しなかった。
同様に、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の１２．５μＭ、及びＮＣ４０μＭを、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中に溶解し、これに過マンガン酸カリウム０．２ｍＭを添加し、０℃で３２０分間反応させた。この結果の生成物のＨＰＬＣを図５（ｂ）に示す。この結果、Ｔｇ１（チミングリコールに酸化されたＴ１鎖）の生成が確認された。
単離されたＴｇ１を、ピペリジンで９０℃で３０分間加熱処理した。その結果のＨＰＬＣを図５（ｃ）に示す。
【実施例４】
【００６７】
ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）の熱変性特性の測定。
以下に示す塩基配列を有する１１塩基からなるＤＮＡ分子（Ｔ２／Ｔ３）を製造した。
Ｔ２ ： ５’−ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ−３’
Ｔ３ ： ３’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＧＴＣ−５’
このＤＮＡ分子（Ｔ２／Ｔ３）５μＭの熱変性特性を、ＮＣの濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合のそれぞれについて、実施例１と同様にして測定した。結果を図６に示す。図６の８本の曲線は、右末端（８０℃付近）の下からＮＣの濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合をそれぞれ示す。
また、ＮＣの各濃度におけるＴ２とＴ３の１本鎖から２本鎖への転移をＣＤスペクトルにより観察した。Ｔ２及びＴ３のそれぞれ５μＭの、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、２５℃における、ＮＣの濃度が０、５、１０、１５、及び２０μＭでのそれぞれのＣＤスペクトルを測定した。結果を図７に示す。
また、ＮＣを１００μＭを添加したときの融解温度（Ｔｍ）を測定したところ５８．８℃であった。
【実施例５】
【００６８】
ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）のＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの測定。
実施例４で製造したＤＮＡ分子Ｔ２及びＴ３のそれぞれ２０μＭを、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液に溶解し、−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度でＣＳＩ−ＴＯＦに注入した。結果を図８の（ａ）に示す。
また、同様にして、ＮＣが２０μＭ存在（図８の（ｂ））、ＮＣが４０μＭ存在（図８の（ｃ））、及びＮＣが６０μＭ存在（図８の（ｄ））におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルを測定した。結果の１０００−１８００の範囲を図８にそれぞれ示す。
１本鎖のＴ２（［Ｔ２］３−） ； 実測値 １１０７．６
計算値 １１０６．２。
１本鎖のＴ３（［Ｔ３］３−） ； 実測値 １１４０．２
計算値 １１３８．９。
２本鎖Ｔ２／Ｔ３（［Ｔ２／Ｔ３］５−） ； 実測値 １３４９．０
計算値 １３４７．２。
２本鎖Ｔ２／Ｔ３（［Ｔ２／Ｔ３］４−） ； 実測値 １６８７．２
計算値 １６８４．３。
ＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ２／Ｔ３＋２ＮＣ］５−） ； 実測値 １５５０．７
計算値 １５４８．５）。
【実施例６】
【００６９】
ＤＮＡ（Ｔ４／Ｔ４）の酸化、及びそれに続くピペリジン加熱による切断。
以下に示す塩基配列を有する１１塩基からなるＤＮＡ分子（Ｔ４／Ｔ４）を製造した。
Ｔ４ ： ５’−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ−３’
Ｔ４ ： ３’−ＣＧＴＴＧＧＴＡＡＣＧ−５’
ＮＣの不存在下におけるＴ４を、０℃で０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムで４０分間処理しても反応しなかった（図９（ａ）参照）が、４０μＭのＮＣの存在下での２本鎖のＴ４／Ｔ４では、続くピリミジンでの加熱処理後で生成物１及び２が確認された（図９（ｂ）参照）。０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムでの処理を５時間とすることにより、生成物１及び２を主生成物として得ることができた（図９（ｃ）参照）。
Ｔｇ４（チミングリコールに酸化されたＴ４鎖）は、ＨＰＬＣにより確認することは困難であったが、酸化に続くピペリジンの加熱処理により生成物１及び２が得られることから容易に確認することができた。ここで得られた生成物１及び２は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにより確認した。
生成物１：オリゴマー５’−ｄ（ＧＣＡＡ）−ＰＯ３Ｈ−３’
実測値 １２６１．６
計算値 １２６２．２。
生成物２：オリゴマー５’−ＨＯ３Ｐ−ｄ（ＧＧＴＴＧＣ）−３’
実測値 １９０１．７
計算値 １９０２．３。
また、酸化される前のＴ４及びＴｇ４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを測定した。 Ｔ４ ； 実測値 ３３７２．０１
計算値 ３３７０．６０。
Ｔｇ４ ； 実測値 ３４０４．３７
計算値 ３４０４．６１。
【実施例７】
【００７０】
式（９）で表されるアゾベンゼン誘導体の製造
次に示す反応式に従って式（９）で表されるアゾベンゼン誘導体を製造した。
【００７１】
【化２０】
【００７２】
４，４’−アゾベンズアルデヒド（上記の反応式中の化合物番号１１）（７９．７ｍｇ，０．３３５ｍｍｏｌ）と上記の反応式中の化合物番号１２で表されるナフチリジン誘導体（１８３ｍｇ，０．７０３ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、酢酸（５０ｍＬ）の混合溶媒中に加えて室温で１５分間撹拌する。これにシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（４３ｍｇ，０．６８４ｍｍｏｌ）のメタノール（１ｍＬ）溶液を滴下する。室温で２時間撹拌後、飽和重曹水を加えてクロロホルムで抽出、さらに飽和食塩水で有機相を洗浄する。有機相を減圧下濃縮、回収した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１００：５から１００：２０）で精製して、標記の化合物（上記の反応式中の化合物番号１）（９０．６ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）を、収率３７％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ
8.25 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 9.0 Hz, 2H),
7.98 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Azobenzene),
7.65 (brs,2H, NH), 7.47 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Azobenzene), 7.25 (d, 2H),
4.35 (t, J = 6.3 Hz, 4H, CH2), 3.90 (s, 4H, Bn),
2.80 (t, J = 6.6 Hz, 4H, CH2), 2.76 (s, 6H, CH3),
1.95 (pseudo quintet, 4H, CH2);
ＥＳＩＭＳ 計算値 ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ７４９．３３，
実測値 ： ７４９．２８．
【実施例８】
【００７３】
式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体の製造
次に示す反応式に従って式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体を製造した。
【００７４】
【化２１】
【００７５】
（１） ４，４’−アゾベンズアルデヒド（上記の反応式中の化合物番号１１）（２６．２ｍｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）と上記の反応式中の化合物番号１３で表されるナフチリジンカーバメイトダイマー（６２．３ｍｇ，０．１２４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１．５ｍＬ）、アセトニトリル（４．５ｍＬ）、酢酸（７ｍＬ）の混合溶媒中に加えて室温で２時間間撹拌する。これにシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（６．９ｍｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で４日間撹拌する。飽和重曹水を加えてクロロホルムで抽出、さらに飽和食塩水で有機相を洗浄する。有機相を減圧下濃縮、回収した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１００：２から１００：２．５）で精製して、上記の反応式中の化合物番号１４で表されるモノアルキルアミノアルデヒド（３６．９ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）を、収率４６％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ
10.06 (s, 1H, CHO), 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H),
7.89 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 8.3 Hz, 2H),
7.86 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.60 (brs,2H, NH),
7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.3 Hz, 2H),
4.31 (t, J = 6.2 Hz, 4H, CH2), 3.64 (s, 2H, Bn), 2.72 (s, 6H, CH3),
2.61 (t, J = 6.6 Hz, 4H, CH2), 1.92 (pseudo quintet, 4H, CH2)；
ＥＳＩＭＳ 計算値 ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ７４８．３０，
実測値 ： ７４８．１４．
【００７６】
（２）前記（１）で得られたモノアルキルアミノアルデヒド１４（３２．８ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）と上記の反応式中の化合物番号１３で表されるナフチリジンカーバメイトダイマー（３２．４ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２．５ｍＬ）、アセトニトリル（２ｍＬ）、酢酸（６．２ｍＬ）の混合溶媒中に加えて４０℃で２時間間撹拌する。これにシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（４．２ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）を加えて、３５℃で１２時間撹拌する。飽和重曹水を加えてクロロホルムで抽出、さらに飽和食塩水で有機相を洗浄する。有機相を減圧下濃縮、回収した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール：酢酸＝１００：５：０．５から１００：８：０．５）で精製して、標記の化合物（上記の反応式中の化合物番号２）（１７．８ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を、収率３３％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ
8.27 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.09 (d, J = 8.8 Hz, 4H),
7.92 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.69 (d, J = 8.6 Hz, 4H, Azobenzene),
7.68 (brs,4H, NH), 7.39 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Azobenzene),
7.22 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 4.32 (t, J = 6.5 Hz, 8H, CH2),
3.62 (s, 4H, Bn), 2.73 (s, 12H, CH3), 2.61 (t, J = 6.6 Hz, 8H, CH2),
1.93 (pseudo quintet, 4H, CH2)；
ＥＳＩＭＳ 計算値 ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ １２３５．５３，
実測値 ： １２３４．９３．
【実施例９】
【００７７】
実施例８で製造した式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体の光異性化。
ＧＧミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ５’−ＣＴＡ ＡＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’／３’−ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣ−５’の４．５ｍＭ、及び実施例８で製造した式（６）で表される光感応性リガンド２（６．８ｍＭ）を混合し、２本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を測定した。３６０ｎｍの光照射を５分間行い、トランス体からシス体へと変換される。この時、２本鎖ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）は２９℃から５２℃へと大幅に上昇し（図１１参照）、安定な二本鎖構造をとる。さらにシス体（ｉｉ）に対して４３０ｎｍの光を照射するとトランス体の３（ｉｉｉ）へと戻る。そうすると再び二本鎖はミスマッチ塩基対の存在のため大きく不安定化される。さらに３６０ｎｍの光照射を行うと「分子糊」の機能を再度よみがえらせることができる。以上のように小分子と光によって可逆的にＤＮＡの二重鎖形成を制御することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、ミスマッチにより不安定になっているＤＮＡ分子を低分子化合物の化合物の添加により安定化させるための融解温度（Ｔｍ）の上昇化剤、及びそれを用いた方法、並びにそのための新規な化学物質を提供するものである。
本発明の試薬や方法は、ＤＮＡなどの核酸類やタンパク質などの各種のアッセイにおいて有用なだけでなく、核酸類やタンパク質などの同定や機能の解析などにおいても有用であり、各種の検査試薬や診断剤用の薬品として産業上の利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１ａ（図１の左側）は、ナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）とグアニン（Ｇ）との水素結合の様子を示したものであり、図１ｂ（図１の右側）はＧ−Ｇの１塩基のミスマッチ配列に対するＮＣの入り方を模式的に示したものである。
【図２】図２は、ＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）（５μＭ）溶液の熱変性を、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の存在下（図２の下側の曲線）及び不存在下（図２の上側の曲線）で測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の２０μＭ溶液における、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の４０μＭの存在下（図３ｂ）又は不存在下（図３ａ）におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を示すものである。
【図４】図４は、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の２０μＭ溶液における、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の２０μＭの存在下（図４ａ）、又は６０μＭの存在下（図４ｂ）におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を示すものである。
【図５】図５は、ＮＣの不存在下における２本鎖のＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）の本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の存在下（図５ｂ）又は不存在下（図５ａ）における、過マンガン酸カリウムでの酸化反応の結果のＨＰＬＣのチャートである。図５ｃ（図５の左下側）はＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる処理の後、ピペリジンで加熱処理した結果のＨＰＬＣを示す。
【図６】図６は、ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）（５μＭ）の熱変性特性を示す。図６の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は２６０ｎｍにおける吸光度を示す。図６の８本の曲線は、右末端（８０℃付近）の下から本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合をそれぞれ示す。
【図７】図７は、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の各濃度におけるＴ２とＴ３の１本鎖から２本鎖への転移をＣＤスペクトルにより測定した結果を示すものである。図７中の（ａ）はＮＣが０、即ち不存在の場合を示し、（ｂ）はＮＣが５μＭの場合を示し、（ｃ）はＮＣが１０μＭの場合を示し、（ｄ）はＮＣが１５μＭの場合を示し、（ｅ）はＮＣが２０μＭの場合を示す。
【図８】図８は、Ｔ２及びＴ３の本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）を含む２本鎖の複合体の形成を、ＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルにより確認した結果を示すものである。ＮＣの不存在（図８の（ａ））、ＮＣが２０μＭ存在（図８の（ｂ））、ＮＣが４０μＭ存在（図８の（ｃ））、及びＮＣが６０μＭ存在（図８の（ｄ））におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を示す。
【図９】図９は、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の不存在下（図９（ａ））、又は存在下（図９（ｂ））におけるＤＮＡ分子Ｔ４の過マンガン酸カリウムでの酸化反応、続くピリミジンでの加熱処理後の生成物のＨＰＬＣのチャートである。図９（ｃ）（図９の左下側）は４０μＭのＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる５時間の処理、続くピペリジン中での加熱処理後のＨＰＬＣを示す。図９（ｄ）（図９の右下側）は生成物１及び２をアルカリホスファターゼで処理した後のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１０】図１０は、光の照射により可逆的に変換されるシン異性体とアンチ異性体は立体的に大きく異なる構造となり、塩基との相互作用が立体的に制限されることになる様子を模式化して示したものである。
【図１１】図１１は、本発明の式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体を用いて光の照射によるＤＮＡ分子の熱変性特性を測定した結果を示すものである。図１１中の（ｉ）はトランス体−３（ｉ）の場合を示し、（ｉｉ）はシス体−３（ｉｉ）の場合を示し、（ｉｉｉ）はトランス体−３（ｉｉｉ）の場合を示し、（ｉｖ）はシス体−３（ｉｖ）の場合をそれぞれ示している。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
Ｔ１ ： ５’−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’
Ｔ２ ： ５’−ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ−３’
Ｔ４ ： ５’−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ−３’
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数のミスマッチを有するＤＮＡ分子を安定化させ、その融解温度（Ｔｍ）を上昇されるための低分子化合物からなる融解温度（Ｔｍ）を上昇化剤、ＤＮＡ分子の安定化剤、又は不安定なＤＮＡ分子を接着させるための「分子糊」のような機能を有する機能性材料に関する。より詳細には、本発明は、後述する一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤に関する。また、本発明は、後述する一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体に関する。さらに、本発明は、これらの低分子化合物を用いた複数のミスマッチを含有する不安定なＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸がハイブリダイズして２本鎖となる場合には、対をなす塩基が決まっている。例えば、グアニン（Ｇ）にはシトシン（Ｃ）、アデニン（Ａ）にはチミン（Ｔ）という具合になっている。そして、通常は全ての塩基がこのような対を形成してハイブリダイズしているのであるが、ときとして塩基配列の中の一部にこのような対を形成することができない場合がある。例えば、あるＤＮＡと他のＤＮＡをハイブリダイズし得る条件下においた場合に、大部分の塩基はこのような対を形成することができるが、１個又は数個の一部の塩基はこのような対を形成することができない場合がある。このような通常の塩基対を形成することができない塩基対のことを、以下ではミスマッチという。
【０００３】
一方、最近１個又は２個以上の塩基が異なることに起因する各種の遺伝病についての研究が行われてきている。例えば、遺伝情報の個人差である遺伝子一塩基多形（ＳＮＰｓ（Single Nucleotide Polymorphism））は、罹病しやすさや、薬理作用の個人差の原因となる。現在、各個人に最適化された医療の実現へ向け、ＳＮＰｓの研究がポストゲノムの重要な位置を占めており、効率的なＳＮＰｓの検出法の開発が期待されている。ＳＮＰｓを含むＤＮＡは、変異を含まない相補的なＤＮＡと混合しアニールさせるとミスマッチ塩基対を形成するので、このミスマッチ塩基対に選択的に結合する低分子リガンドを開発すれば、ＳＮＰｓの効率的な検出が可能になると考えられる。
現在、このようなミスマッチを検出する方法は、２本鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション効率を比較する手法が一般的である。しかし、この方法を用いるためにはミスマッチを含むＤＮＡの塩基配列をあらかじめ知っておかなければならないために多大な労力が必要となり、多くの検体を処理する方法としては不適当である。また、ＭｕｔＳ等のＤＮＡの修復蛋白が遺伝子損傷箇所に選択的に結合することを利用する手法もあるが、タンパク質を用いる場合、低分子リガンドを用いる方法に比べて熱安定性や活性な構造（フォールディング）を維持する事が必要となり使用条件の制約が多く、また操作も煩雑となり効率的にミスマッチを検出することは難しい。
【０００４】
このように、ハイブリダイズしたＤＮＡなどにおける一部のミスマッチを検出する方法は大変難しく、またその感度も不十分なものであり、これを簡便に且つ高感度で検出できる方法の確立が求められている。
ところで、本発明者らは、２本鎖ＤＮＡ中に生成する不対塩基（バルジ塩基）を持つＤＮＡ（バルジＤＮＡ）に特異的に結合し、安定化する分子であるバルジＤＮＡ認識分子を開発してきた（特許文献１参照）。このバルジ認識分子は、不対塩基と水素結合をするだけでなく、バルジ塩基の存在により生じてくる空間に、芳香環とバルジ近傍の塩基とのスタッキング相互作用を利用してインターカーレーションし、安定化されているものである。そして、本発明者らは、このような周辺の塩基の存在によるスタッキング効果を利用した不対塩基に対する作用についてさらに研究を行ってきたところ、塩基 対のミスマッチが生じている箇所においても、塩基と対を形成し得る分子種を２個有する化合物がこのようなスタッキング効果により比較的安定に取り込まれる得ることを見出し、具体的にはビス（２−メチルナフチリジン）アミド誘導体がＧＧミスマッチやＧＡミスマッチを検出できることを示してきた（特許文献２及び３参照）。しかし、このものは特定のミスマッチには極めて高感度で安定に取り込まれる得ることができるが、他のミスマッチに対しては取り込みが不十分であり、即ち特定のミスマッチに対する特異性が大きすぎて必ずしも実用的ではなかった。例えば、ＧＧミスマッチに対しては高い特異性を有するが、ＧＡミスマッチやＧＴミスマッチに対しては必ずしも十分な取り込みがなされなかった。
さらに、本発明者らは、このようなミスマッチ認識分子として、特にアミノナフチリジンダイマーに着目して、多数の誘導体を検討してきた（特許文献４〜８参照）。
【０００５】
遺伝子の変異を調べる方法として、変異の有無を検査したい遺伝子とその変異の無い野生型遺伝子の５０塩基程度のオリゴマーＤＮＡを混合、加熱、冷却により二つの遺伝子をクロスハイブリダイゼーションする方法がある。検査する遺伝子に変異がある場合には遺伝子の融解温度や融解温度差に異常が見出される。この操作は比較的簡便ではあるが、変異があることが分かるだけであり、どの位置にどのような変異が生じているのかということを知ることはできない。
前記してきた本発明者が報告してきた方法によれば（特許文献２〜８参照）、このクロスハイブリダイゼーションする方法により特定のミスマッチの存在を知ることはできるが、このミスマッチ認識分子は特異性が高く、例えば、グアニン塩基に対するミスマッチを調べる場合においても、ＧＧミスマッチ用のもの、ＧＡミスマッチ用のもの、ＧＴミスマッチ用のものと複数のミスマッチ認識分子を用意しなければならなかった。
【０００６】
また、本発明者らは、アミノナフチリジンダイマーのようなミスマッチ認識分子が、ミスマッチ部分においてどのような形態で結合しているのかということも検討してきた（非特許文献１参照）。例えば、ナフチリジンカルバメートダイマー（以下、単にＮＣということもある。）が、Ｇ−Ｃ塩基対に挟まれたＧ−Ｇミスマッチにおいては、ＮＣ：ＤＮＡが２：１の化学量論的量で結合していることを報告してきた（非特許文献２参照）。これらの解析は、Ｇ−Ｇのひとつのミスマッチについてなされてきたものであり、ＤＮＡ分子中のひとつだけのミスマッチでは、その融解温度（Ｔｍ）にそれほどおおきな影響は与えないが、ミスマッチが２個以上になると融解温度（Ｔｍ）に大きな影響が生じる。このようなことから、さらに多数のミスマッチを有するＤＮＡ分子についてのミスマッチにおける挙動が注目されていた。
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−８９４７８号公報
【特許文献２】特開２００１−１４９０９６号公報
【特許文献３】特開２００３−２５９８９９号公報
【特許文献４】特開２００４−２６１０８３号公報
【特許文献５】特開２００４−２７５１７９号公報
【特許文献６】特開２００４−３２５０７４号公報
【特許文献７】特開２００６−９４７２５号公報
【特許文献８】特開２００６−１０４１５９号公報
【非特許文献１】Nakatani, K., Hagihara, S., et al., Nat. Chem. Biol., 2005, 1, 39-43
【非特許文献２】Peng, T., Nakatani, K., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2005, 44, 7280-7283
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、２本鎖ＤＮＡにおける融解温度（Ｔｍ）を上昇させるための方法、及びそのための試薬を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、ミスマッチ認識分子を開発してきたが、このようなミスマッチ認識分子は１塩基対のミスマッチを認識して融解温度（Ｔｍ）の変化をもたらすものであった。ＤＮＡ分子中のミスマッチが２塩基対以上の場合には融解温度（Ｔｍ）は大きく下降し、極端な場合にはハイブリダイズすることもできなくなる。このようなＤＮＡ分子を充分にハイブリダイズさせて融解温度（Ｔｍ）を上昇させることができれば、ＤＮＡ分子のハイブリダイズ（接着）が可能となるだけでなく、当該ＤＮＡ分子に結合した分子の接近や離脱を制御することも可能となる。
本発明者らは、本発明者らが開発したミスマッチ認識分子を詳細に検討して結果、これらのミスマッチ認識分子に中のいくつかのものは、２塩基対以上のミスマッチを有するＤＮＡ分子における融解温度（Ｔｍ）を極度に上昇させることができる分子であることが見出した。
即ち、本発明は、次の一般式（１）
【００１０】
【化４】
【００１１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ３は水素原子又は次の一般式（２）
【００１２】
【化５】
【００１３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは２つの窒素原子を結合させるリンカー基を示す。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤に関する。
また、本発明は、前記した一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法に関する。
さらに、本発明は、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記した一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法に関する。
また、本発明は、次の一般式（４）
【００１４】
【化６】
【００１５】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基を示す。）
で表される新規なナフチリジンカルバメートダイマー誘導体に関する。
さらに、本発明は、前記した一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法、及び、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記した一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法に関する。より詳細には、前記した方法が、前記一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体の光の照射によるアゾ基のシン−アンチ異性化によるものである前記方法に関する。
【００１６】
本発明をより具体的に記述すれば、以下のとおりとなる。
（１） 次の一般式（１）
【００１７】
【化７】
【００１８】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ３は水素原子又は次の一般式（２）
【００１９】
【化８】
【００２０】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは２つの窒素原子を結合させるリンカー基を示す。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤。
（２）同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも１５℃以上である前記（１）に記載の上昇化剤。
（３）同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも２５℃以上である前記（１）又は（２）に記載の上昇化剤。
（４）ＤＮＡ分子が、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチを有するＤＮＡ分子である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の上昇化剤。
（５）Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチが、Ｔ−Ｇミスマッチである前記（４）に記載の上昇化剤。
（６）ＤＮＡ分子が、３個以上のミスマッチを有するものである前記（１）〜（４）のいずれかに記載の上昇化剤。
（７）３個目のミスマッチが、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置にある前記（６）に記載の上昇化剤。
（８）ＤＮＡ分子におけるミスマッチが、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’又は５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の上昇化剤。
（９）一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である前記（１）〜（８）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１０）一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である前記（９）に記載の上昇化剤。
（１１）一般式（１）及び（２）におけるＸが、酸素原子である前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１２）一般式（１）及び（２）におけるＲが、プロピレン基である前記（１）〜（１１）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１３）一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、アゾ基を含有するものである前記（１）〜（１２）のいずれかに記載の上昇化剤。
（１４）一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基である前記（１３）に記載の上昇化剤。
（１５）一般式（３）におけるＲ４及びＲ５がメチレン基で、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である前記（１４）に記載の上昇化剤。
（１６）一般式（３）におけるアゾ基が、シン配置である前記（１４）又は（１５）に記載の上昇化剤。
【００２１】
（１７）前記（１）〜（１６）に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
（１８）２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記（１）〜（１６）に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
（１９）次の一般式（４）
【００２２】
【化９】
【００２３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２０）一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である前記（１９）に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２１）一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である前記（２０）に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２２）一般式（４）におけるＸが、酸素原子である前記（１９）〜（２１）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２３）一般式（４）におけるＲが、プロピレン基である前記（１９）〜（２２）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２４）一般式（３）におけるＲ４及びＲ５がメチレン基で、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である前記（１９）〜（２３）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
（２５）前記（１９）〜（２４）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
（２６）２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、前記（１９）〜（２４）のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
（２７）前記（２５）又は（２６）に記載の方法が、光の照射によるアゾ基のシン−アンチ異性化によるものである前記（２５）又は（２６）に記載の方法。
（２８）次の一般式（１０）、
Ｚ１−Ｎ（Ｚ２）−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５−Ｎ（Ｚ３）−Ｚ４ （１０）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置であり、Ｚ１及びＺ４は次の一般式（１１）
【００２４】
【化１０】
【００２５】
（式中、Ｒ８は、水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示し、Ｚ２及びＺ３はそれぞれ独立して水素原子又は前記一般式（１１）で表される基を示す。）
で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメート誘導体。
（２９）一般式（１１）におけるＺ２及びＺ３が水素原子である前記（２８）に記載のナフチリジンカルバメート誘導体。
（３０）次の式（９）
【００２６】
【化１１】
【００２７】
で表されるアゾベンゼン誘導体。
（３１）前記（２８）〜（３０）に記載のいずれかの化合物からなる、ミスマッチを含有する不安定なＤＮＡ分子の安定性を光照射による光異性化により可逆的切り替えるためのＤＮＡ分子安定化剤。
（３２）前記（２８）〜（３０）に記載のいずれかの化合物を含有してなる、ミスマッチを含有する不安定なＤＮＡ分子の安定性を光照射による光異性化により可逆的に当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）制御剤。より詳細には、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）の上昇剤又は下降剤。
【００２８】
本発明者らは、５’−ＣＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列を有する１塩基のミスマッチにおけるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体の構造を解析してきた（非特許文献１及び２参照）。そして、これらの結果から、本発明者らは、当該ナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、特に一般式（１）におけるＲ１及びＲ２がメチル基であって、Ｒがプロピレン基であって、Ｒ３が水素原子であって、Ｘが酸素原子であるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（以下、ＮＣと略すことがある。）がグアニン（Ｇ）と水素結合をし、２分子のＮＣがＧＧの連続する配列に対して水素結合するものと仮定した。この仮定を図１により説明する。図１のａ（図１の左側）はＮＣとグアニン（Ｇ）との水素結合の様子を示したものであり、図１ｂ（図１の右側）はＧ−Ｇの１塩基のミスマッチ配列に対するＮＣの入り方を模式的に示したものである。連続するＧＧの配列に対して２分子のＮＣが水素結合する。そして、この結果、連続するＧＧの配列に隣接する塩基がＤＮＡのらせんの外側に出されると仮定した。そして本発明者らは、この仮定が正しいのであれば、連続するＧＧの配列に隣接する塩基はマッチするシトシン（Ｃ）である必要はなく、ミスマッチの塩基であっても可能ではないかと考えた。なお、図１ｂでは、この塩基をＸで示している。そこで、本発明者らは、この仮説を立証するために５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列を有する２塩基対のミスマッチについて実験をした。
【００２９】
このために１１塩基からなるＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）を作製した。それぞれの塩基配列は、
Ｔ１ ： ５’−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’
Ｃ１ ： ３’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣ−５’
であり、Ｔ−Ｇ及びＧ−Ｇの２カ所のミスマッチを有するものである（下線部参照）。
このＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）（５μＭ）の０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中での融解温度（Ｔｍ）は３５．７℃であった。これにＮＣ１００μＭを添加して、同様に融解温度（Ｔｍ）を測定したところ７１．１℃になった。実に３５．７℃もの融解温度の上昇を観測することができた。この結果を図２に示す。図２の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は２６０ｎｍにおける吸光度を示す。温度は毎分１℃の速度で上昇させ、１℃毎に吸光度を３回測定し、その平均値を図２のグラフに示した。図２の上側の曲線（原図では黒色）はＮＣが不存在の場合を示し、下側の曲線（原図では赤色）はＮＣが存在する場合を示している。
図２からもわかるように、特に４５℃〜５５℃の範囲においては、ＮＣが存在していない場合にはＴ１及びＣ１は、１本鎖で存在しているが、ＮＣが存在する場合にはＴ１及びＣ１は２本鎖で存在している。
【００３０】
これをさらに確認するために、ＣＳＩ−ＴＯＦ（cold spray ionization timt-of-flight）マススペクトルをとった。Ｔ１及びＣ１の２０μＭの、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液におけるＮＣ４０μＭの存在下又は不存在下におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を図３に示す。試料は−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度で注入された。図３ａ（図３の左側）はＮＣ不存在下のものであり、図３ｂ（図３の右側）はＮＣ存在下のものである。
図３ａに示されるように、１本鎖のＴ１は３−イオンとして（［Ｔ１］３−）、ｍ／ｚが１０９６．２に観測された（計算値：１０９６．２）。Ｔ１とＣ１の２本鎖のもは５−イオンとして（［Ｔ１／Ｃ１］５−）、ｍ／ｚが１３４４．８に観測された（計算値：１３４４．６）。一方、ＮＣを添加することにより、新たなピークであるＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−）のピークが、ｍ／ｚ１５４６．３に観測された（計算値：１５４５．９）。
また、ＮＣの濃度を変化させると、１本鎖のＴ１イオン（［Ｔ１］３−）が減少し、ＮＣとの複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−）が増加してくる様子が観察された。図４ａ（図４の左側）は２０μＭのＴ１に対するＮＣの濃度が２０μＭ（Ｔ１：ＮＣ＝１：１）の場合のＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルであり、図４ｂ（図４の右側）は２０μＭのＴ１に対するＮＣの濃度が６０μＭ（Ｔ１：ＮＣ＝１：３）の場合のＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルである。この結果、ＮＣの濃度の増加と共に１本鎖のＴ１イオン（［Ｔ１］３−）が減少し、ＮＣとの複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−）が増加してくることが示された。
【００３１】
そして、本発明者らは、この場合には５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列におけるチミン（Ｔ）は、ＤＮＡのらせんの外側にくるものと予測した。これを確認するために、本発明者らは、ＮＣにより２本鎖を形成したＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）の過マンガン酸カリウムによる酸化を試みた。もし、チミン（Ｔ）が螺旋の外側にあれば、過マンガン酸カリウムによる酸化を受けてチミングリコール（Ｔｇ）になる（Hayatsu, H.;Ukita, T., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1967, 29, 556-561参照）。そして、酸化されたチミングリコール（Ｔｇ）は、ピペリジン中で加熱することによりこの部位で切断される（Rubin, C. M.;Schmid, C. W., Nucleic. Acids Res., 1980, 8, 4613-20 ; Maxam, A. M.;Gilbert, W., Methods Enzymol., 1980, 65, 499-560 ; Gogos, J. A.;Karayiorgou, M., et al., Nucleic. Acids Res., 1990, 18, 6807-6814参照）。
２本鎖ＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）を０℃で過マンガン酸カリウムで酸化し、次いでピペリジン中で９０℃で処理した。この反応の概要を次のスキームで示す。
【００３２】
【化１２】
【００３３】
ＮＣの不存在下における２本鎖のＴ１／Ｃ１は０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムで３２０分間処理しても反応しなかったが、４０μＭのＮＣの存在下での２本鎖のＴ１／Ｃ１ではＴｇ１（チミングリコールに酸化されたＴ１鎖）がＨＰＬＣにより確認された。そして、ピペリジン中での加熱処理により切断されたフラグメントの存在がＨＰＬＣで確認された。これらのＨＰＬＣのチャートを図５に示す。図５ａ（図５の左上側）はＮＣの不存在下での過マンガン酸カリウムによる処理結果のＨＰＬＣを示し、図５ｂ（図５の右上側）はＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる処理結果のＨＰＬＣを示し、図５ｃ（図５の左下側）はＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる処理の後、ピペリジンで加熱処理した結果のＨＰＬＣを示す。この結果、図５ｂではＴｇ１のピークを確認することができ、さらにピペリジン中での加熱処理により切断されたフラグメントＣＣＣＡｐ及びｐＧＧＴＣＣＧを確認することができた。
また、これらのフラグメントをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルで確認した。酸化される前のＴ１はｍ／ｚが３２９３．５に観測され（計算値：３２９３．２）、酸化されたチミングリコール（Ｔｇ）のＴ１、即ちＴｇ１はｍ／ｚが３３２６．１に観測された（計算値：３３２７．２）。
そして、これをピペリジン中で加熱処理して得られたフラグメント５’−ｄ（ＣＣＣＡ）−ＰＯ３Ｈ−３’（ＣＣＣＡｐ）のｍ／ｚは１１９８．６に観測され（計算値：１１９８．８）、もう一方のフラグメント５’−ＨＯ３Ｐ−ｄ（ＧＧＴＣＣＧ）−３’（ｐＧＧＴＣＣＧ）のｍ／ｚは１８８８．４に観測された（計算値：１８８８．２）。
また、これらのオリゴマーは、アルカリホスファターゼにより末端を脱リン酸化し、標準のオリゴマーと共に逆相ＨＰＬＣにおいても確認された。
１１塩基からなるＴ１には２つのチミン（Ｔ）が存在している。即ち、−ＡＴＧＧ−におけるチミン（Ｔ）と、−ＧＧＴＣＣ−におけるチミン（Ｔ）が存在している。しかし、過マンガンサンカリウムによる処理及びそれに続くピペリジンでの処理においては前者、即ち、−ＡＴＧＧ−におけるチミン（Ｔ）だけが反応した結果が得られた。この結果は、当該チミン（Ｔ）のみがＮＣの存在によりＤＮＡのらせんの外側に存在していることを証明している。
【００３４】
これらの結果から、ＮＣが２個のミスマッチを含有するＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、かつ２本鎖ＤＮＡとして安定に存在させることができる試薬であることを証明している。そしてグアニン以外のミスマッチ塩基はＤＮＡの螺旋の外側に追い出されている構造となっている。
さらに、本発明者らは、これらの結果が普遍的なものであるかどうかをさらに確認するために、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’の配列を有する３塩基対のミスマッチ、即ち、Ｔ−Ｇミスマッチ、Ｇ−Ｇミスマッチ、及びＧ−Ｔミスマッチのものについて実験をした。
このために１１塩基からなるＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）を作製した。それぞれの塩基配列は、
Ｔ２ ： ５’−ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ−３’
Ｔ３ ： ３’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＧＴＣ−５’
であり、Ｔ−Ｇ、Ｇ−Ｇ、及びＧ−Ｔの３カ所のミスマッチを有するものである（下線部参照）。このＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）は室温では１本鎖ＤＮＡとして存在しているが、ＮＣの濃度が増加するにつれて２本鎖ＤＮＡとして存在するようになる。そして１００μＭのＮＣの存在下での融解温度（Ｔｍ）は５８．８℃に達した。このように、このＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）（５μＭ）の０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中での融解温度（Ｔｍ）は室温以下であったが、これにＮＣを１００μＭを添加して、同様に融解温度（Ｔｍ）を測定したところ５８．８℃になった。実に３０℃以上もの融解温度の上昇を観測することができた。なお、ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）の融解温度（Ｔｍ）は、１０℃以下であることまでは測定することができたが、正確な融解温度（Ｔｍ）の測定は困難であった。
このＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）（５μＭ）の熱変性特性を図６に示す。図６の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は２６０ｎｍにおける吸光度を示す。温度は毎分１℃の速度で上昇させ、１℃毎に吸光度を３回測定し、その平均値を図６のグラフに示した。図６の８本の曲線は、右末端（８０℃付近）の下からＮＣの濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合をそれぞれ示す。
ＮＣの各濃度におけるＴ２とＴ３の１本鎖から２本鎖への転移をＣＤスペクトルにより観察した。Ｔ２及びＴ３のそれぞれ５μＭの、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、２５℃における、ＮＣの濃度が０、５、１０、１５、及び２０μＭでのそれぞれのＣＤスペクトルを測定した。結果を図７に示す。図７中の（ａ）はＮＣが０、即ち不存在の場合を示し、（ｂ）はＮＣが５μＭの場合を示し、（ｃ）はＮＣが１０μＭの場合を示し、（ｄ）はＮＣが１５μＭの場合を示し、（ｅ）はＮＣが２０μＭの場合を示す。この結果、ＮＣが存在していない場合には２７２ｎｍでプラスのバンドを示し、２５０ｎｍではマイナスのバンドがしめされたが、ＮＣの添加により、モル比が１から４に増加するにつれてプラスのバンドが楕円的に増加することが示された。さらに、３４８ｎｍ及び３２４ｎｍでのＣＤバンドの強度がＮＣの濃度の増加と共に変化した。このＣＤの変化はイソ二色性（isodichroic）のポイントを包含しており、Ｔ２及びＴ３の１本鎖からＮＣを含む２本鎖への転移を示している。
【００３５】
Ｔ２及びＴ３のＮＣを含む２本鎖の複合体の形成は、ＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルによっても確認された。Ｔ２及びＴ３の２０μＭの、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液におけるＮＣの不存在（図８の（ａ））、ＮＣが２０μＭ存在（図８の（ｂ））、ＮＣが４０μＭ存在（図８の（ｃ））、及びＮＣが６０μＭ存在（図８の（ｄ））におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を図８に示す。試料は−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度で注入された。図８（ａ）（図８の左上側）はＮＣ不存在下のものであり、図８（ｂ）（図８の右上側）はＮＣが２０μＭ存在下のものであり、図８（ｃ）（図８の左下側）はＮＣが４０μＭ存在下のものであり、図８（ｄ）（図８の右下側）はＮＣが６０μＭ存在下のものである。
図８（ａ）に示されるように、１本鎖のＴ２は３−イオンとして（［Ｔ２］３−）、ｍ／ｚが１１０７．６に観測された（計算値：１１０６．２）。１本鎖のＴ３も３−イオンとして（［Ｔ３］３−）、ｍ／ｚが１１４０．２に観測された（計算値：１１３８．９）。Ｔ２とＴ３の２本鎖のものは５−イオンとして（［Ｔ２／Ｔ３］５−）、ｍ／ｚが１３４９．０に観測された（計算値：１３４７．２）。また、Ｔ２とＴ３の２本鎖のもので４−イオンとして（［Ｔ２／Ｔ３］４−）、ｍ／ｚが１６８７．２に観測された（計算値：１６８４．３）。一方、ＮＣを２０μＭ、即ちモル比で１：１の量を添加した場合（図８の（ｂ））には、新たなピークであるＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ２／Ｔ３＋２ＮＣ］５−）のピークが、ｍ／ｚ１５５０．７に観測された（計算値：１５４８．５）。
また、ＮＣの濃度を変化させると、１本鎖のＴ２イオン（［Ｔ２］３−）及びＴ３イオン（［Ｔ３］３−）が減少し、ＮＣとの複合体（［Ｔ２／Ｔ３＋２ＮＣ］５−）が増加してくる様子が観察された（図８（ｃ）（図８の左下側）及び図８（ｄ）（図８の右下側）参照）。
この場合においても、ＤＮＡ：ＮＣのモル比が１：２の化学量論量での複合体の形成が確認された。
【００３６】
さらに、前記の場合と同様に過マンガン酸カリウムによる酸化切断を次に示す１１塩基からなるＤＮＡを用いて実験した。
Ｔ４ ： ５’−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ−３’
Ｔ４ ： ３’−ＣＧＴＴＧＧＴＡＡＣＧ−５’
この反応スキームを前記したスキームと同様に次に示す。
【００３７】
【化１３】
【００３８】
ＮＣの不存在下におけるＴ４を、０℃で０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムで４０分間処理しても反応しなかった（図９（ａ）参照）が、４０μＭのＮＣの存在下での２本鎖のＴ４／Ｔ４では、続くピリミジンでの加熱処理後で生成物１及び２が確認された（図９（ｂ）参照）。０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムでの処理を５時間とすることにより、生成物１及び２を主生成物として得ることが出来る（図９（ｃ）参照）。０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムでの処理で得られるＴｇ４（チミングリコールに酸化されたＴ４鎖）は、ＨＰＬＣではＴ４のすぐそばにあらわれ、ＨＰＬＣにより確認することは困難であったが、酸化に続くピペリジンの加熱処理により生成物１及び２が得られることから容易に確認することができた。ここで得られた生成物１及び２は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにより確認された。即ち生成物１はオリゴマー５’−ｄ（ＧＣＡＡ）−ＰＯ３Ｈ−３’であり、ｍ／ｚが１２６１．６に観測され（計算値：１２６２．２）、生成物２はオリゴマー５’−ＨＯ３Ｐ−ｄ（ＧＧＴＴＧＣ）−３’であり、ｍ／ｚが１９０１．７に観測された（計算値：１９０２．３）。これらのオリゴマーは、アルカリホスファターゼの存在したで、３７℃で３０分間処理することにより脱リン酸化してそれぞれ５’−ｄ（ＧＣＡＡ）−３’及び５’−ｄ（ＧＧＴＴＧＣ）−３’として、これを標品ののものと比較して同じリテンションタイムを有するものであることを確認した（図９（ｄ）参照）。
これらのＨＰＬＣのチャートを図９に示す。図９（ａ）（図９の左上側）はＮＣの不存在下での過マンガン酸カリウムによる処理結果のＨＰＬＣを示し、図９（ｂ）（図９の右上側）は４０μＭのＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる４０分間の処理、続くピペリジン中での加熱処理後のＨＰＬＣを示し、図９（ｃ）（図９の左下側）は４０μＭのＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる５時間の処理、続くピペリジン中での加熱処理後のＨＰＬＣを示す。図９（ｄ）（図９の右下側）は生成物１及び２をアルカリホスファターゼで処理した後のＨＰＬＣの結果を示す。
この結果、図５ｂではＴｇ１のピークを確認することができ、さらにピペリジン中での加熱処理により切断されたフラグメントＣＣＣＡｐ及びｐＧＧＴＣＣＧを確認することができた。
また、酸化される前のＴ４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルはｍ／ｚが３３７２．０１に観測され（計算値：３３７０．６０）、酸化されたチミングリコール（Ｔｇ）のＴ４、即ちＴｇ４はｍ／ｚが３４０４．３７に観測された（計算値：３４０４．６１）。このことからも前記した５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’の配列を有する２塩基対のミスマッチと同様な化学量論的な構造が、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’の配列を有する３塩基対のミスマッチいおいても生起していることが確認された。
これらの結果から、ＮＣが３個のミスマッチを有するＤＮＡ分子についても、前記した２個のミスマッチを含有するＤＮＡの場合と同様に、融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、かつ２本鎖ＤＮＡとして安定に存在させることができる試薬であることが証明された。そしてグアニン以外のミスマッチ塩基はＤＮＡのらせんの外側に追い出されている構造となっていることが証明された。
【００３９】
これらの実験結果は、ナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）が、２つ以上のミスマッチを有するＤＮＡにおいて充分な安定化効果、即ち、融解温度（Ｔｍ）を上昇させる作用をゆうしていることを実証するものである。これは、このようなナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）は、通常の温度域でハイブリダイズすることができない程度に塩基配列が相違している１本鎖のＤＮＡを安定化させてハイブリダイズさせることができるという特性を有していることを実証するものである。そして、この事実はシトシン（Ｃ）やチミン（Ｔ）などのピリミジン塩基に限定されるものではなく、アデニン（Ａ）やグアニン（Ｇ）などのプリン塩基においても同等に、即ち、ＮＣの存在によりミスマッチの塩基対の塩基がＤＮＡのらせんの外側に追い出されることを示すものでもある。
このように、本発明が開示するナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ類）は、ＤＮＡの安定化や融解温度（Ｔｍ）の上昇という現象だけでなく、ＤＮＡの構造を水素結合とπ電子系によるπ−スタッキング効果により構造的に安定化させる作用を有するものであることが本発明により具体的に明らかにされたのである。
【００４０】
本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ類）は、一般式（１）で示されるものであるり、当該一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体について、さらに詳細に説明する。
本発明の一般式（１）における、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示ものである。ここで、炭素数１〜５の炭化水素基としては、飽和であっても不飽和であってもよく、また直鎖状であっても分岐状であってもよい。かかる炭化水素基としては、炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基、炭素数２〜５の直鎖状又は分岐状のアルケニル基、炭素数３〜５のシクロアルキル基などが挙げられる。このような炭化水素基としては、具体的には例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基等のアルキル基；ビニル基、アリル基、イソプロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基等のアルケニル基；エチニル基、プロピニル基等のアルキニル基等を挙げることができる。好ましい炭化水素基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基などの炭素数１〜５の直鎖状又は分岐状のアルキル基が挙げられる。また、Ｒ１及びＲ２における、炭素数１〜５の炭化水素基の少なくとも１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基としては、１個の炭素原子が酸素原子で置換された炭素数１〜４のアルコキシル基、炭素数１〜４のアルコキシアルキル基、１この炭素原子が窒素原子で置換された炭素数１〜４のジアルキルアミノ基、炭素数１〜４の（ジ又はモノ）−アルキルアミノアルキル基、２個の炭素原子が酸素原子で置換された炭素数１〜３のアルコキシアルコキシ基等が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の一般式（１）におけるＸとしては、酸素原子又は硫黄原子が挙げられる。Ｘが酸素原子の場合には隣接するアミド基と共にカルバメート基を形成することになり、Ｘが硫黄原子の場合には、隣接するアミド基と共にチオカルバメート基を形成することになる。このように、本発明におけるカルバメート基としては、酸素源ｓにからなるカルバメート基であってもよいし、１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオカルバメート基であってもよい。好ましいカルバメート基としては、酸素原子からなるカルバメート基、即ちＸが酸素原子であるカルバメート基が挙げられる。
本発明の一般式（１）におけるＲとしては、炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、具体的には例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などの直鎖状のアルキレン基、メチルメチレン基、エチルメチレン基、１−メチルエチレン基、２−メチルエチレン基、１−エチルエチレン基、２−エチルエチレン基、１−メチルプロピレン基、２−メチルプロピレン基、３−メチルプロピレン基、１−エチルプロピレン基、２−エチルプロピレン基、３−エチルプロピレン基などの分岐状のアルキレン基などが挙げられる。好ましいＲとしては、２個のナフチリジン環がグアニン等と水素結合を形成し、立体的にπ−スタッキング効果を得ることが出来る長さと自由度を有し、分子の熱安定性が優れたアルキレン基が挙げられ、具体的には直鎖状における炭素数が３のプロピレン基又はそのそのアルキル基置換体が挙げられる。より好ましいＲとしては、直鎖状のプロピレン基が挙げられる。
【００４２】
一般式（１）におけるＲ３としては、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマーを単独で使用とする場合には水素原子であってよいが、これに限定されるものではない。水素原子以外の基としては炭素数１〜５、好ましくは１〜３程度の立体的に余り大きくなく、かつ化学的に不活性な基、例えばアルキル基などが挙げられる。
また、発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマーは、前述してきたようにＤＮＡ分子とモル比で１：２の化学量論量で結合することから、この二量体構造を有するものとして使用することもできる。このような二量体構造を有するものとしては、一般式（１）におけるＲ３が一般式（２）で示される構造を有するものが挙げられる。一般式（２）におけるＲ１、Ｒ２、Ｒ、及びＸは前記したものと同じである。一般式（２）におけるＬとしては、それぞれのナフチリジンカルバメートダイマー部分を化学結合で結合させることができるものであって、両者の距離及び自由度を適度に保てるものであれば特に制限はない。好ましい、Ｌとしては、炭素数５〜１５の直鎖状又は分岐状のアルキレン基、炭素数１２〜２０のフェニレン基を有するアルキレン基、次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表されるアゾ基を含有する基などが挙げれる。
前記した一般式（３）におけるＲ４及びＲ５としては、炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基、例えば、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ブチレン基などが挙げられる。好ましいアルキレン基としてはメチレン基が挙げられる。また、Ａｒ１及びＡｒ２で表されるアリーレン基としては、炭素数６〜３０、好ましくは６〜１２の６員芳香環からなるアリール基から誘導される２価のアリーレン基が挙げられる。好ましいアリーレン基としては、ｐ−フェニレン基、ｍ−フェニレン基、ｏ−フェニレン基などのフェニレン基があげられる。好ましいＡｒ１及びＡｒ２としては、ｐ−フェニレン基が挙げられる。一般式式（３）におけるアゾ基はシン配置であってもアンチ配置であってもよいが、アゾ基の立体配置によりＤＮＡ分子の安定性が異なってくることは後述する。
本発明の一般式（１）における好ましい化合物としては、次の式（５）
【００４３】
【化１４】
【００４４】
で表される化合物、即ち、一般式（１）におけるＲ１及びＲ２がメチル基であって、Ｒがプロピレン基であって、Ｒ３が水素原子であって、Ｘが酸素原子であるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、次の式（６）又は（７）
【００４５】
【化１５】
【００４６】
【化１６】
【００４７】
で表される化合物、即ち、一般式（１）におけるＲ１及びＲ２がメチル基であって、Ｒがプロピレン基であって、Ｒ３がＮ−（アゾ−ビス（ｐ−フェニレンメチレン））−ナフチリジンカルバメートダイマーであって、Ｘが酸素原子であるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のうちのアンチ異性体（６）及びシン異性体（７）が挙げられる。
【００４８】
本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のうちのＲ３が水素原子である化合物は、公知化合物であり、例えば、特許文献８に記載された方法により製造することができる。例えば、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシアルキル）アミン又はそのＮ−保護体をサクシノイル基などのＯ−保護基で保護されたカーボネートとし、これに２−アミノ−１，８−ナフチリジン又はその７位が上記Ｒ１又はＲ２で置換された２−アミノ−１，８−ナフチリジンを反応させて、製造することができる。この際の保護基としては、塩酸塩やアシル基やアルコキシカルボニル基などのペプチド合成において使用されるアミノ保護基を使用することができる。
【００４９】
本発明の一般式（１）におけるＲ３が水素原子以外のものである化合物、即ち、一般式（４）で表される化合物は新規化合物である。
本発明の一般式（４）で表される化合物は、例えば、次の一般式（８）
ＯＨＣ−Ｒ６−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ７−ＣＨＯ
（式中、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立して化学結合又は炭素数１〜４の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示す。）
で表されるジアルデヒド誘導体を、前記した本発明の一般式（１）におけるＲ３が水素原子である化合物と還元条件で反応させて、アミノ基をカップリングさせて製造することができる。これらの反応条件としては、通常の還元的アミノ化反応の条件を採用することができる。
【００５０】
本発明の一般式（４）で示される化合物は、分子中にナフチリジンのような塩基を認識する、即ち塩基と水素結合することができる部位と、光の照射によりシン−アンチ異性化を起こすことができるアゾ基を有していることを特徴とするものである。
例えば、アンチ体（６）（トランス体）に３６０ｎｍの光を照射することにより、シン異性体（７）（シス体）とすることができ、また、シン異性体（７）（シス体）に４３０ｎｍの光を照射することにより、アンチ体（６）（トランス体）に可逆的に変換することができる。これらの光異性化の反応式を次に示しておく。
【００５１】
【化１７】
【００５２】
このように光の照射により可逆的に変換されるシン異性体とアンチ異性体は立体的に大きく異なる構造となり、塩基との相互作用が立体的に制限されることになる。この様子を模式化して図１０に示す。このようなアゾ基を有する分子は光１及び光２により可逆的に変換され、シス−トランスの立体構造を取ることになる。例えば、図１０に示されるようにシン異性体（シス体）となったときにミスマッチのＤＮＡに前記してきたＮＣと同様に相互作用をし、ミスマッチを有するＤＮＡ分子を安定化させることができる。しかし、このような立体構造により安定化されている状態にあったとしても、ここに光２が照射されてアンチ異性体（トランス体）に変化された場合には、もはや安定な相互作用をしうる立体構造をとることはできず、ＤＮＡ分子は不安定になる。
例えば、ＧＧミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ５’−ＣＴＡ ＡＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’／３’−ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣ−５’、及び式（６）で表されるトランス体−３を混合し、２本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を測定した。３６０ｎｍの光照射を５分間行い、トランス体−３（ｉ）からシス体−３（ｉｉ）へと変換される。この時、２本鎖ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）は２９℃から５２℃へと大幅に上昇し（図１１参照）、安定な二本鎖構造をとる。さらにシス体−３（ｉｉ）に対して４３０ｎｍの光を照射するとトランス体−３（ｉｉｉ）へと戻る。そうすると再び二本鎖はミスマッチ塩基対の存在のため大きく不安定化される。さらに３６０ｎｍの光照射を行うとシス体−３（ｉｖ）のまた戻る。これらのそれぞれの状態における熱変性特性を測定した結果を図１１に示す。図１１の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は吸光度（ＡＵ）を示す。図１１中の（ｉ）はトランス体−３（ｉ）の場合を示し、（ｉｉ）はシス体−３（ｉｉ）の場合を示し、（ｉｉｉ）はトランス体−３（ｉｉｉ）の場合を示し、（ｉｖ）はシス体−３（ｉｖ）の場合をそれぞれ示している。
このように、光の照射により「分子糊」の機能を再度よみがえらせることができる。以上のように小分子と光によって可逆的にＤＮＡの二重鎖形成を制御することが可能であった。
【００５３】
前述してきたように、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体は、２つ以上のミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させ、安定化する。これは、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体がミスマッチ配列中のＧＧ部位に結合することにより、ミスマッチを含んだ二本鎖構造を誘起させ、安定化させるからである。即ち、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体は、ミスマッチを有して不安定なＤＮＡを一本鎖から二本鎖へと変換する「分子糊」としての機能を発揮するからである。本発明の一般式（４）で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメートダイマー誘導体は、このような「分子糊」として機能に、さらに、ＤＮＡの二本鎖形成を光などの外部刺激によって可逆的に制御するための機能を有するものということができる。このような光異性化能を有するアゾベンゼン骨格を本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のリンカー部に導入した分子が本発明の一般式（４）で表される化合物である。光照射によってアゾベンゼン部位のトランス／シスが変換され、それに応じて、トランス体及びシス体のミスマッチＤＮＡに対する結合能も変化する（図１０参照）。即ち、一般式（４）の化合物は、照射する光の波長により「分子糊」としての機能のオン／オフの切り替えを制御することができることになる。
このような光による制御を可能とする化合物としては、前記してきた本発明の一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体だけでなく、より単純な化学構造をしている、次の式（９）
【００５４】
【化１８】
【００５５】
で表される化合物が挙げられる。この化合物は、窒素原子から１つのナフチリジン構造を削除した化学構造を有するものであり、単純な構造で前記した「分子糊」としての機能のオン／オフの切り替えを制御することができることになる。
したがって、本発明における照射する光の波長により「分子糊」としての機能のオン／オフの切り替えを制御することができる化合物を一般式で表すと、次の一般式（１０）、
Ｚ１−Ｎ（Ｚ２）−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５−Ｎ（Ｚ３）−Ｚ４ （１０）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置であり、Ｚ１及びＺ４は次の一般式（１１）
【００５６】
【化１９】
【００５７】
（式中、Ｒ８は、水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示す。）
で表される基を示し、Ｚ２及びＺ３はそれぞれ独立して水素原子又は前記一般式（１１）で表される基を示す。）
で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメート誘導体ということができる。
本発明の一般式（１０）におけるＲ４、Ｒ５、Ａｒ１、及びＡｒ２は、それぞれ前記してきたものと同じものを示し、一般式（１１）におけるＲ、及びＸも前記してきたものと同じものを示し、一般式（１１）におけるＲ８は前記してきた一般式（１）におけるＲ１やＲ２と同じ基を示す。
また、一般式（１０）で表されるアゾ基を有するナフチリジンカルバメート誘導体も新規化合物であり、前記した一般式（４）で表される化合物と同様な方法で製造することができる。
【００５８】
次に、本発明におけるＤＮＡ分子について説明する。本発明における「２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子」とは、（１）塩基配列として少なくとも２個のＧが連続したＧＧ配列を有すること、（２）Ｇ−Ｇミスマッチを有すること、及び（３）前記したＧ−Ｇミスマッチ以外に、さらに少なくとも１つのミスマッチを有することを条件とするものである。さらに、好ましい態様としては、前記（１）で示した２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列における一方のグアニン（Ｇ）において前記（２）に示したＧ−Ｇミスマッチが有り、前記（３）に示した他のミスマッチが前記（２）で示したＧ−Ｇミスマッチに隣接しているものが挙げられる。即ち、好ましい態様としては、５’−ＮＧＧ−３’／３’−ＧＧＹ−５’（Ｎ及びＹは、それぞれ独立してシトシン（Ｃ）以外の塩基を示す。）の塩基配列を有するＤＮＡ分子が挙げられる。より好ましい態様としては、Ｎ又はＹの少なくとも一方、好ましくは両方がチミン（Ｔ）である塩基配列を有するＤＮＡ分子が挙げられる。本発明における好ましいＧ−Ｇミスマッチ以外のミスマッチとしては、Ｇ−Ｔミスマッチが挙げられる。
本発明における「ミスマッチ」とは、ワトソン−クリック型塩基対、即ち、Ｔ−Ａ又はＧ−Ｃの塩基対以外の塩基であり、バルジ塩基をも包含している。したがって、前記した配列におけるＮ又はＹの一方又は両方が塩基でない場合も包含しているが、好ましい態様としてはＮ及びＹがシトシン（Ｃ）以外の塩基である場合が挙げられる。
本発明のＤＮＡ分子の長さは特別な制限はないが、余り長いとミスマッチ部分に対してマッチしている塩基部分が多くなり、融解温度（Ｔｍ）が低くならないことから、好ましい長さとしては、６〜１５０ｍｅｒ、より好ましくは１０〜５０ｍｅｒ、さらに好ましくは１０〜３０ｍｅｒ程度が挙げられる。ミスマッチ部分が多数存在している場合には、前記した長さに制限されず、さらに長いものであってもよい。好ましいＤＮＡ分子としては０℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３０℃の範囲で２本鎖ＤＮＡを形成することができない程度のミスマッチを有するＤＮＡ分子が挙げられる。
【００５９】
本発明における融解温度（Ｔｍ）とは、通常の核酸類について使用される意味である。即ち、核酸、例えばＤＮＡを加熱してゆくと、ある温度で立体構造に極端な変化が起こって、この変化があたかも相転移に相当するような変化であることから、このときの温度を融解温度（Ｔｍ）と言っている。例えば、薄い中性の塩溶液中で二重らせん構造をしているＤＮＡの溶液を、温度を上昇させながら溶液の紫外線吸収を測定いくと、ある温度に達したときに、それまではほぼ一定であった紫外線吸収が急激に上昇し、紫外線吸収が約４０〜５０％増加した値に達すると再び一定になる（濃色効果）。この変化の温度幅が極めて狭く、あたかも相転移が起こったかのようにみえるために、ＤＮＡが「融解した」として変化の起こった温度幅の中間の温度を融解温度（Ｔｍ）と呼んでいる。本発明においても「融解温度（Ｔｍ）」はこの意味で使用する。融解温度の測定は紫外線吸収だけでなく、円二色性や赤外線吸収でも測定することができる。
本発明における「融解温度（Ｔｍ）の上昇」とは、本発明の一般式（１）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体、又は一般式（１１）で表されるナフチリジンカルバメート誘導体のいずれの化合物の不存在下で測定したと同じ測定条件で、前記したナフチリジンカルバメートダイマー誘導体のいずれかの化合物の存在下、好ましくはＤＮＡ分子とこれらの化合物のモル比（一般式（４）の場合には当量の比）が１：１以上、より好ましくは１：２以上の量の存在下で測定したときの融解温度（Ｔｍ）を比較したときに、これらの本発明の化合物が存在したときに少なくとも１５℃以上、好ましくは２５℃以上上昇することをいう。したがって、本発明における「融解温度（Ｔｍ）」の測定条件、例えば、溶媒の種類、塩の種類、塩の濃度、ＤＮＡの濃度については特に制限はないが、極端な濃度や溶媒の選択は除外されることは当然である。薄い中性の塩溶液での測定であれば特に制限はない。
【００６０】
本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は、ミスマッチを有するＤＮＡ分子を本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体の存在により安定化させて融解温度（Ｔｍ）を上昇させるものである。同じ温度について言えば、１本鎖でしか存在することができないＤＮＡ分子を安定化させて２本鎖のＤＮＡとすることができるということであり、本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は１本鎖の状態で存在しているＤＮＡ分子を２本鎖にする、即ち、このようなＤＮＡ分子を「接着」させる「糊」のような機能を有するものである。この意味で本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は、２つの分子を接着させる「分子糊」ということもできるし、２本鎖ＤＮＡの安定化剤ということもできるし、また、一定の温度における２本鎖ＤＮＡの形成剤ということもできる。
さらに、本発明の一般式（４）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体や、一般式（１１）で表されるナフチリジンカルバメート誘導体は、前述してきたように、光の照射により可逆的にシン−アンチ異性化を行うことができるアゾ基を含有しているために、光の照射により前記した「分子糊」としての機能をオン又はオフとすることができる。したがって、本発明のこのような「分子糊」としての機能をオン又はオフとすることができる分子は、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させたり、下降させたり、即ち、室温のような一定の温度においてＤＮＡの２本鎖を安定化させたり、不安定にさせたりすることがでることから、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）制御剤ということができる。また、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）の上昇剤及び／又は下降剤ということもできる。
【００６１】
本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」は、単にミスマッチを有する不安定なＤＮＡを安定化させるという機能だけでなく、前記したように「分子糊」としての機能をも有するものであることから、各種の応用が可能となる。
例えば、ミスマッチを有する本発明のＤＮＡ分子のそれぞれの鎖に２種類の物質（例えば、蛍光色素、有機分子、核酸分子、タンパク質、糖、ベシクル、金属粒子、金属薄膜、細胞、ベシクル等）を標識しておけば、本発明の「ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤」の存在下でのみ、これらの２種類の物質を空間的に近づけることが出来る。また、アゾ基を有する本発明の上昇剤を使用すれば、光の照射により可逆的のこれらの２種類の物質を空間的に近づけたり遠ざけたりすることが可能となる。
また、細胞内のシグナル伝達系では、異種もしくは同種蛋白の集合が重要であることが知られており、本発明の「分子糊」の機能を利用して本発明の上昇剤の存在下でのみ二つの蛋白を集合させることが可能となる。この方法を用いて、異種蛋白間の相互作用を調べることも可能となる。さらに、光でスイッチングする分子糊を使えば、蛋白間相互作用によるシグナル伝達系を、光の照射により簡便にオン／オフすることが可能になる。
さらに、本発明の上昇剤を基板上に固定化することにより、本発明の上昇剤が固定化されたスポット上でのみ、２種類の物質を空間的に接近させることができ、蛍光発光や蛍光の消光などの２種類の物質の相互作用を簡便な方法で測定することができるようになる。この方法を用いることにより、任意の二つの物質の存在を判別することも簡便に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００６２】
以上のように、本発明は、全く新しい発想により、２種類の分子を分子レベルで空間的に接近させたり遠ざけることが可能となる新規な試薬、及びそれを用いた方法を提供するものである。
また、従来の核酸の構造の制御方法の多くは、光などに応答する部位でＤＮＡを修飾することにより、あらかじめＤＮＡに標識となる物質を導入しておく必要があった。そのため、天然のＤＮＡに対してはこのような方法は全く効果がなく、用途が大きく制限されていた。これに対して本発明では、外部より小分子を加えることにより核酸の構造を制御するため、ＤＮＡ自身に対する修飾は必要がない。すなわち、合成困難な長鎖ＤＮＡや細胞内のＤＮＡを標的とすることができる。その上、光照射により可逆的かつ特定の配列のみに構造制御を行うことが可能である。また、本発明は小さな分子の添加によるミスマッチの多い核酸分子を安定化させることができるというユニークな発想に基づくものであり、本発明の手法は多種多様なミスマッチ分子にも拡張することができ、本発明はその基本的な思想を提供するものである。
さらに、本発明により、ＤＮＡの張り合わせを小分子と光によりコントロールすることができる。例えば、ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーションや核酸を基盤としたナノ構造の制御、核酸の二本鎖形成に伴う様々な生化学的現象、複製・転写などの小分子による制御が可能になる。
【００６３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
なお、以下の実施例で使用される式（５）で表される化合物は、特許文献８に記載の方法で製造した。
【実施例１】
【００６４】
ＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の熱変性特性の測定。
以下に示す塩基配列を有する１１塩基からなるＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）を製造した。
Ｔ１ ： ５’−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’
Ｃ１ ： ３’−ＧＧＧＴＧＧＣＡＧＧＣ−５’
このＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の５μＭを、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、４℃〜９４℃の範囲における熱変性特性を測定した。温度は毎分１℃の速度で上昇させ、１℃毎に２６０ｎｍにおける吸光度を３回測定し、その平均値を測定した。結果を図２の上の曲線で示す。
同様に、このＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の５μＭ、及び式（５）で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（以下、単にＮＣという。）１００μＭを、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、４℃〜９４℃の範囲における熱変性特性を測定した。
結果を図２の下側の曲線で示す。
また、これらの融解温度（Ｔｍ）を測定した。この結果ＮＣ不存在下でのＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の融解温度（Ｔｍ）は３５．７℃であった。これにＮＣ１００μＭを添加して、同様に融解温度（Ｔｍ）を測定したところ７１．１℃であった。
この結果、本発明のＮＣがＤＮＡ分子の誘拐温度（Ｔｍ）を上昇させることがわかった。
【実施例２】
【００６５】
ＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）のＣＳＩ−ＴＯＦ（cold spray ionization timt-of-flight）マススペクトルの測定。
実施例１で製造したＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の２０μＭを、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液に溶解し、−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度でＣＳＩ−ＴＯＦに注入して測定した。ｍ／ｚが１０００−１８００の範囲の結果を図３ａに示す。
同様に、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の２０μＭ、及びＮＣ４０μＭの存在下で、ＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果のｍ／ｚが１０００−１８００の範囲を図３ｂに示す。
１本鎖のＴ１（［Ｔ１］３−） ； 実測値 １０９６．２
計算値 １０９６．２。
２本鎖のＴ１／Ｃ１（［Ｔ１／Ｃ１］５−） ； 実測値 １３４４．８
計算値 １３４４．６。
ＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ１／Ｃ１＋２ＮＣ］５−） ； 実測値 １５４６．３
計算値 １５４５．９。
【実施例３】
【００６６】
ＤＮＡ分子（Ｔ１／Ｃ１）の酸化、及びそれに続くピペリジン加熱による切断。
実施例１で製造したＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の１２．５μＭを、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中に溶解し、これに過マンガン酸カリウム０．２ｍＭを添加し、０℃で３２０分間反応させた。この結果の生成物のＨＰＬＣを図５（ａ）に示す。この結果、反応は生起しなかった。
同様に、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の各々の１２．５μＭ、及びＮＣ４０μＭを、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中に溶解し、これに過マンガン酸カリウム０．２ｍＭを添加し、０℃で３２０分間反応させた。この結果の生成物のＨＰＬＣを図５（ｂ）に示す。この結果、Ｔｇ１（チミングリコールに酸化されたＴ１鎖）の生成が確認された。
単離されたＴｇ１を、ピペリジンで９０℃で３０分間加熱処理した。その結果のＨＰＬＣを図５（ｃ）に示す。
【実施例４】
【００６７】
ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）の熱変性特性の測定。
以下に示す塩基配列を有する１１塩基からなるＤＮＡ分子（Ｔ２／Ｔ３）を製造した。
Ｔ２ ： ５’−ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ−３’
Ｔ３ ： ３’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＧＴＣ−５’
このＤＮＡ分子（Ｔ２／Ｔ３）５μＭの熱変性特性を、ＮＣの濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合のそれぞれについて、実施例１と同様にして測定した。結果を図６に示す。図６の８本の曲線は、右末端（８０℃付近）の下からＮＣの濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合をそれぞれ示す。
また、ＮＣの各濃度におけるＴ２とＴ３の１本鎖から２本鎖への転移をＣＤスペクトルにより観察した。Ｔ２及びＴ３のそれぞれ５μＭの、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ＝７．０）緩衝液中で、２５℃における、ＮＣの濃度が０、５、１０、１５、及び２０μＭでのそれぞれのＣＤスペクトルを測定した。結果を図７に示す。
また、ＮＣを１００μＭを添加したときの融解温度（Ｔｍ）を測定したところ５８．８℃であった。
【実施例５】
【００６８】
ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）のＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの測定。
実施例４で製造したＤＮＡ分子Ｔ２及びＴ３のそれぞれ２０μＭを、１００ｍＭ酢酸アンモニウムを含有する５０％含水メタノール溶液に溶解し、−１０℃に冷却して０．５ｍＬ／時間の速度でＣＳＩ−ＴＯＦに注入した。結果を図８の（ａ）に示す。
また、同様にして、ＮＣが２０μＭ存在（図８の（ｂ））、ＮＣが４０μＭ存在（図８の（ｃ））、及びＮＣが６０μＭ存在（図８の（ｄ））におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルを測定した。結果の１０００−１８００の範囲を図８にそれぞれ示す。
１本鎖のＴ２（［Ｔ２］３−） ； 実測値 １１０７．６
計算値 １１０６．２。
１本鎖のＴ３（［Ｔ３］３−） ； 実測値 １１４０．２
計算値 １１３８．９。
２本鎖Ｔ２／Ｔ３（［Ｔ２／Ｔ３］５−） ； 実測値 １３４９．０
計算値 １３４７．２。
２本鎖Ｔ２／Ｔ３（［Ｔ２／Ｔ３］４−） ； 実測値 １６８７．２
計算値 １６８４．３。
ＮＣとの２：１の複合体（［Ｔ２／Ｔ３＋２ＮＣ］５−） ； 実測値 １５５０．７
計算値 １５４８．５）。
【実施例６】
【００６９】
ＤＮＡ（Ｔ４／Ｔ４）の酸化、及びそれに続くピペリジン加熱による切断。
以下に示す塩基配列を有する１１塩基からなるＤＮＡ分子（Ｔ４／Ｔ４）を製造した。
Ｔ４ ： ５’−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ−３’
Ｔ４ ： ３’−ＣＧＴＴＧＧＴＡＡＣＧ−５’
ＮＣの不存在下におけるＴ４を、０℃で０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムで４０分間処理しても反応しなかった（図９（ａ）参照）が、４０μＭのＮＣの存在下での２本鎖のＴ４／Ｔ４では、続くピリミジンでの加熱処理後で生成物１及び２が確認された（図９（ｂ）参照）。０．２ｍＭの過マンガン酸カリウムでの処理を５時間とすることにより、生成物１及び２を主生成物として得ることができた（図９（ｃ）参照）。
Ｔｇ４（チミングリコールに酸化されたＴ４鎖）は、ＨＰＬＣにより確認することは困難であったが、酸化に続くピペリジンの加熱処理により生成物１及び２が得られることから容易に確認することができた。ここで得られた生成物１及び２は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルにより確認した。
生成物１：オリゴマー５’−ｄ（ＧＣＡＡ）−ＰＯ３Ｈ−３’
実測値 １２６１．６
計算値 １２６２．２。
生成物２：オリゴマー５’−ＨＯ３Ｐ−ｄ（ＧＧＴＴＧＣ）−３’
実測値 １９０１．７
計算値 １９０２．３。
また、酸化される前のＴ４及びＴｇ４のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトルを測定した。 Ｔ４ ； 実測値 ３３７２．０１
計算値 ３３７０．６０。
Ｔｇ４ ； 実測値 ３４０４．３７
計算値 ３４０４．６１。
【実施例７】
【００７０】
式（９）で表されるアゾベンゼン誘導体の製造
次に示す反応式に従って式（９）で表されるアゾベンゼン誘導体を製造した。
【００７１】
【化２０】
【００７２】
４，４’−アゾベンズアルデヒド（上記の反応式中の化合物番号１１）（７９．７ｍｇ，０．３３５ｍｍｏｌ）と上記の反応式中の化合物番号１２で表されるナフチリジン誘導体（１８３ｍｇ，０．７０３ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１０ｍＬ）、メタノール（５ｍＬ）、酢酸（５０ｍＬ）の混合溶媒中に加えて室温で１５分間撹拌する。これにシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（４３ｍｇ，０．６８４ｍｍｏｌ）のメタノール（１ｍＬ）溶液を滴下する。室温で２時間撹拌後、飽和重曹水を加えてクロロホルムで抽出、さらに飽和食塩水で有機相を洗浄する。有機相を減圧下濃縮、回収した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１００：５から１００：２０）で精製して、標記の化合物（上記の反応式中の化合物番号１）（９０．６ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）を、収率３７％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ
8.25 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.11 (d, J = 9.0 Hz, 2H),
7.98 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Azobenzene),
7.65 (brs,2H, NH), 7.47 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Azobenzene), 7.25 (d, 2H),
4.35 (t, J = 6.3 Hz, 4H, CH2), 3.90 (s, 4H, Bn),
2.80 (t, J = 6.6 Hz, 4H, CH2), 2.76 (s, 6H, CH3),
1.95 (pseudo quintet, 4H, CH2);
ＥＳＩＭＳ 計算値 ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ７４９．３３，
実測値 ： ７４９．２８．
【実施例８】
【００７３】
式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体の製造
次に示す反応式に従って式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体を製造した。
【００７４】
【化２１】
【００７５】
（１） ４，４’−アゾベンズアルデヒド（上記の反応式中の化合物番号１１）（２６．２ｍｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）と上記の反応式中の化合物番号１３で表されるナフチリジンカーバメイトダイマー（６２．３ｍｇ，０．１２４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（１．５ｍＬ）、アセトニトリル（４．５ｍＬ）、酢酸（７ｍＬ）の混合溶媒中に加えて室温で２時間間撹拌する。これにシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（６．９ｍｇ，０．１１０ｍｍｏｌ）を加えて、室温で４日間撹拌する。飽和重曹水を加えてクロロホルムで抽出、さらに飽和食塩水で有機相を洗浄する。有機相を減圧下濃縮、回収した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール＝１００：２から１００：２．５）で精製して、上記の反応式中の化合物番号１４で表されるモノアルキルアミノアルデヒド（３６．９ｍｇ，０．０５１ｍｍｏｌ）を、収率４６％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ
10.06 (s, 1H, CHO), 8.26 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 8.06 (d, J = 8.8 Hz, 2H),
7.89 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.88 (d, J = 8.3 Hz, 2H),
7.86 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.60 (brs,2H, NH),
7.50 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 8.3 Hz, 2H),
4.31 (t, J = 6.2 Hz, 4H, CH2), 3.64 (s, 2H, Bn), 2.72 (s, 6H, CH3),
2.61 (t, J = 6.6 Hz, 4H, CH2), 1.92 (pseudo quintet, 4H, CH2)；
ＥＳＩＭＳ 計算値 ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ ７４８．３０，
実測値 ： ７４８．１４．
【００７６】
（２）前記（１）で得られたモノアルキルアミノアルデヒド１４（３２．８ｍｇ，０．０４５ｍｍｏｌ）と上記の反応式中の化合物番号１３で表されるナフチリジンカーバメイトダイマー（３２．４ｍｇ，０．０６４ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２．５ｍＬ）、アセトニトリル（２ｍＬ）、酢酸（６．２ｍＬ）の混合溶媒中に加えて４０℃で２時間間撹拌する。これにシアノトリヒドロホウ酸ナトリウム（４．２ｍｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）を加えて、３５℃で１２時間撹拌する。飽和重曹水を加えてクロロホルムで抽出、さらに飽和食塩水で有機相を洗浄する。有機相を減圧下濃縮、回収した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロホルム：メタノール：酢酸＝１００：５：０．５から１００：８：０．５）で精製して、標記の化合物（上記の反応式中の化合物番号２）（１７．８ｍｇ，０．０１５ｍｍｏｌ）を、収率３３％で得た。
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ） δ
8.27 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.09 (d, J = 8.8 Hz, 4H),
7.92 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 7.69 (d, J = 8.6 Hz, 4H, Azobenzene),
7.68 (brs,4H, NH), 7.39 (d, J = 8.3 Hz, 4H, Azobenzene),
7.22 (d, J = 8.3 Hz, 4H), 4.32 (t, J = 6.5 Hz, 8H, CH2),
3.62 (s, 4H, Bn), 2.73 (s, 12H, CH3), 2.61 (t, J = 6.6 Hz, 8H, CH2),
1.93 (pseudo quintet, 4H, CH2)；
ＥＳＩＭＳ 計算値 ： ［Ｍ＋Ｎａ］＋ １２３５．５３，
実測値 ： １２３４．９３．
【実施例９】
【００７７】
実施例８で製造した式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体の光異性化。
ＧＧミスマッチを含む二本鎖ＤＮＡ５’−ＣＴＡ ＡＣＧ ＧＡＡ ＴＧ−３’／３’−ＧＡＴ ＴＧＧ ＣＴＴ ＡＣ−５’の４．５ｍＭ、及び実施例８で製造した式（６）で表される光感応性リガンド２（６．８ｍＭ）を混合し、２本鎖ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）を測定した。３６０ｎｍの光照射を５分間行い、トランス体からシス体へと変換される。この時、２本鎖ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）は２９℃から５２℃へと大幅に上昇し（図１１参照）、安定な二本鎖構造をとる。さらにシス体（ｉｉ）に対して４３０ｎｍの光を照射するとトランス体の３（ｉｉｉ）へと戻る。そうすると再び二本鎖はミスマッチ塩基対の存在のため大きく不安定化される。さらに３６０ｎｍの光照射を行うと「分子糊」の機能を再度よみがえらせることができる。以上のように小分子と光によって可逆的にＤＮＡの二重鎖形成を制御することが可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明は、ミスマッチにより不安定になっているＤＮＡ分子を低分子化合物の化合物の添加により安定化させるための融解温度（Ｔｍ）の上昇化剤、及びそれを用いた方法、並びにそのための新規な化学物質を提供するものである。
本発明の試薬や方法は、ＤＮＡなどの核酸類やタンパク質などの各種のアッセイにおいて有用なだけでなく、核酸類やタンパク質などの同定や機能の解析などにおいても有用であり、各種の検査試薬や診断剤用の薬品として産業上の利用可能性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】図１ａ（図１の左側）は、ナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）とグアニン（Ｇ）との水素結合の様子を示したものであり、図１ｂ（図１の右側）はＧ−Ｇの１塩基のミスマッチ配列に対するＮＣの入り方を模式的に示したものである。
【図２】図２は、ＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）（５μＭ）溶液の熱変性を、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の存在下（図２の下側の曲線）及び不存在下（図２の上側の曲線）で測定した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の２０μＭ溶液における、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の４０μＭの存在下（図３ｂ）又は不存在下（図３ａ）におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を示すものである。
【図４】図４は、ＤＮＡ分子Ｔ１及びＣ１の２０μＭ溶液における、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の２０μＭの存在下（図４ａ）、又は６０μＭの存在下（図４ｂ）におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を示すものである。
【図５】図５は、ＮＣの不存在下における２本鎖のＤＮＡ（Ｔ１／Ｃ１）の本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の存在下（図５ｂ）又は不存在下（図５ａ）における、過マンガン酸カリウムでの酸化反応の結果のＨＰＬＣのチャートである。図５ｃ（図５の左下側）はＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる処理の後、ピペリジンで加熱処理した結果のＨＰＬＣを示す。
【図６】図６は、ＤＮＡ（Ｔ２／Ｔ３）（５μＭ）の熱変性特性を示す。図６の横軸は温度（℃）を示し、縦軸は２６０ｎｍにおける吸光度を示す。図６の８本の曲線は、右末端（８０℃付近）の下から本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の濃度が０、２．５、５、１０、２０、４０、６０、及び１００μＭである場合をそれぞれ示す。
【図７】図７は、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の各濃度におけるＴ２とＴ３の１本鎖から２本鎖への転移をＣＤスペクトルにより測定した結果を示すものである。図７中の（ａ）はＮＣが０、即ち不存在の場合を示し、（ｂ）はＮＣが５μＭの場合を示し、（ｃ）はＮＣが１０μＭの場合を示し、（ｄ）はＮＣが１５μＭの場合を示し、（ｅ）はＮＣが２０μＭの場合を示す。
【図８】図８は、Ｔ２及びＴ３の本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）を含む２本鎖の複合体の形成を、ＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルにより確認した結果を示すものである。ＮＣの不存在（図８の（ａ））、ＮＣが２０μＭ存在（図８の（ｂ））、ＮＣが４０μＭ存在（図８の（ｃ））、及びＮＣが６０μＭ存在（図８の（ｄ））におけるＣＳＩ−ＴＯＦマススペクトルの結果の１０００−１８００の範囲を示す。
【図９】図９は、本発明のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体（ＮＣ）の不存在下（図９（ａ））、又は存在下（図９（ｂ））におけるＤＮＡ分子Ｔ４の過マンガン酸カリウムでの酸化反応、続くピリミジンでの加熱処理後の生成物のＨＰＬＣのチャートである。図９（ｃ）（図９の左下側）は４０μＭのＮＣの存在下での過マンガン酸カリウムによる５時間の処理、続くピペリジン中での加熱処理後のＨＰＬＣを示す。図９（ｄ）（図９の右下側）は生成物１及び２をアルカリホスファターゼで処理した後のＨＰＬＣの結果を示す。
【図１０】図１０は、光の照射により可逆的に変換されるシン異性体とアンチ異性体は立体的に大きく異なる構造となり、塩基との相互作用が立体的に制限されることになる様子を模式化して示したものである。
【図１１】図１１は、本発明の式（６）で表されるアゾベンゼンダイマー誘導体を用いて光の照射によるＤＮＡ分子の熱変性特性を測定した結果を示すものである。図１１中の（ｉ）はトランス体−３（ｉ）の場合を示し、（ｉｉ）はシス体−３（ｉｉ）の場合を示し、（ｉｉｉ）はトランス体−３（ｉｉｉ）の場合を示し、（ｉｖ）はシス体−３（ｉｖ）の場合をそれぞれ示している。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
Ｔ１ ： ５’−ＣＣＣＡＴＧＧＴＣＣＧ−３’
Ｔ２ ： ５’−ＣＣＴＴＴＧＧＴＣＡＧ−３’
Ｔ４ ： ５’−ＧＣＡＡＴＧＧＴＴＧＣ−３’
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ３は水素原子又は次の一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは２つの窒素原子を結合させるリンカー基を示す。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤。
【請求項２】
同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも１５℃以上である請求項１に記載の上昇化剤。
【請求項３】
同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも２５℃以上である請求項１又は２に記載の上昇化剤。
【請求項４】
ＤＮＡ分子が、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチを有するＤＮＡ分子である請求項１〜３のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項５】
Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチが、Ｔ−Ｇミスマッチである請求項４に記載の上昇化剤。
【請求項６】
ＤＮＡ分子が、３個以上のミスマッチを有するものである請求項１〜４のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項７】
３個目のミスマッチが、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置にある請求項６に記載の上昇化剤。
【請求項８】
ＤＮＡ分子におけるミスマッチが、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’又は５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’である請求項１〜７のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項９】
一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である請求項１〜８のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１０】
一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である請求項９に記載の上昇化剤。
【請求項１１】
一般式（１）及び（２）におけるＸが、酸素原子である請求項１〜１０のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１２】
一般式（１）及び（２）におけるＲが、プロピレン基である請求項１〜１１のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１３】
一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、アゾ基を含有するものである請求項１〜１２のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１４】
一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基である請求項１３に記載の上昇化剤。
【請求項１５】
一般式（３）におけるＲ４及びＲ５が、メチレン基であり、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である請求項１４に記載の上昇化剤。
【請求項１６】
一般式（３）におけるアゾ基が、シン配置である請求項１４又は１５に記載の上昇化剤。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
【請求項１８】
２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、請求項１〜１６に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
【請求項１９】
次の一般式（４）
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２０】
一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である請求項１９に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２１】
一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である請求項２０に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２２】
一般式（４）におけるＸが、酸素原子である請求項１９〜２１のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２３】
一般式（４）におけるＲが、プロピレン基である請求項１９〜２２のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２４】
一般式（３）におけるＲ４及びＲ５がメチレン基であり、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である請求項１９〜２３のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
【請求項２６】
２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、請求項１９〜２４のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法が、光の照射によるアゾ基のシン−アンチ異性化によるものである請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項１】
次の一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｒ３は水素原子又は次の一般式（２）
【化２】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは２つの窒素原子を結合させるリンカー基を示す。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなる、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤。
【請求項２】
同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも１５℃以上である請求項１に記載の上昇化剤。
【請求項３】
同じ条件で測定したときの融解温度（Ｔｍ）の上昇が、少なくとも２５℃以上である請求項１又は２に記載の上昇化剤。
【請求項４】
ＤＮＡ分子が、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチを有するＤＮＡ分子である請求項１〜３のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項５】
Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置に他のミスマッチが、Ｔ−Ｇミスマッチである請求項４に記載の上昇化剤。
【請求項６】
ＤＮＡ分子が、３個以上のミスマッチを有するものである請求項１〜４のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項７】
３個目のミスマッチが、Ｇ−Ｇミスマッチの隣接する位置にある請求項６に記載の上昇化剤。
【請求項８】
ＤＮＡ分子におけるミスマッチが、５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＴ−５’又は５’−ＴＧＧ−３’／３’−ＧＧＣ−５’である請求項１〜７のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項９】
一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である請求項１〜８のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１０】
一般式（１）及び（２）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である請求項９に記載の上昇化剤。
【請求項１１】
一般式（１）及び（２）におけるＸが、酸素原子である請求項１〜１０のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１２】
一般式（１）及び（２）におけるＲが、プロピレン基である請求項１〜１１のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１３】
一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、アゾ基を含有するものである請求項１〜１２のいずれかに記載の上昇化剤。
【請求項１４】
一般式（２）におけるリンカー基Ｌが、次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基である請求項１３に記載の上昇化剤。
【請求項１５】
一般式（３）におけるＲ４及びＲ５が、メチレン基であり、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である請求項１４に記載の上昇化剤。
【請求項１６】
一般式（３）におけるアゾ基が、シン配置である請求項１４又は１５に記載の上昇化剤。
【請求項１７】
請求項１〜１６に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
【請求項１８】
２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、請求項１〜１６に記載のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
【請求項１９】
次の一般式（４）
【化３】
（式中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して水素原子、炭素数１〜５の炭化水素基、又は当該炭素数１〜５の炭化水素基の１つ以上の炭素原子が窒素原子及び酸素原子からなる群から選ばれる原子で置換されている基を示し、Ｒは炭素数１〜１０の直鎖状又は分岐状のアルキレン基を示し、Ｘは酸素原子又は硫黄原子を示し、Ｌは次の一般式（３）
−Ｒ４−Ａｒ１−Ｎ＝Ｎ−Ａｒ２−Ｒ５− （３）
（式中、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して炭素数１〜５の直鎖状若しくは分岐状のアルキレン基を示し、Ａｒ１及びＡｒ２はそれぞれ独立してアリーレン基を示し、アゾ基はシン又はアンチ配置である。）
で表される基を示す。）
で表されるナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２０】
一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、それぞれ独立して炭素数１〜５のアルキル基である請求項１９に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２１】
一般式（４）におけるＲ１及びＲ２が、メチル基である請求項２０に記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２２】
一般式（４）におけるＸが、酸素原子である請求項１９〜２１のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２３】
一般式（４）におけるＲが、プロピレン基である請求項１９〜２２のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２４】
一般式（３）におけるＲ４及びＲ５がメチレン基であり、かつＡｒ１及びＡｒ２がｐ−フェニレン基である請求項１９〜２３のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を、２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液中に添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させる方法。
【請求項２６】
２個のグアニン（Ｇ）が連続したＧＧ配列を有し、かつＧ−Ｇミスマッチ及び少なくとももう１つのミスマッチを有するＤＮＡ分子が存在する溶液を、当該ＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）以上の温度において、請求項１９〜２４のいずれかに記載のナフチリジンカルバメートダイマー誘導体からなるＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）上昇化剤を添加することにより当該溶液中のＤＮＡ分子の融解温度（Ｔｍ）を上昇させて、当該ＤＮＡ分子をハイブリダイズさせる方法。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の方法が、光の照射によるアゾ基のシン−アンチ異性化によるものである請求項２５又は２６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２００９−２０１３５６（Ｐ２００９−２０１３５６Ａ）
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６２２６５（Ｐ２００６−１６２２６５）
【出願日】平成１８年６月１２日（２００６．６．１２）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年９月１０日（２００９．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１２日（２００６．６．１２）
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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