ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息および慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤
本発明は、線維芽細胞増殖因子２(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2)または塩基性線維芽細胞増殖因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)を有効成分として含む喘息(Asthma)および慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)の予防または治療剤に関するものである。また、本発明は、卵アルブミン(Ovalbumin, OA)および二重鎖ＲＮＡ(dsRNA)によって誘導されるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤマウス動物モデルに関するものである。
本発明によるＦＧＦ２を有効成分として含む治療剤は、気道線維化(fibrosis)、気道炎症、気道過敏性、気道リモデリング、喘息およびＣＯＰＤの治療または予防に有用に使用することができる。また、卵アルブミンおよび二重鎖ＲＮＡを使用して開発された喘息およびＣＯＰＤ動物モデルは、喘息およびＣＯＰＤ治療剤の開発に有用に使用することができる。
本発明によるＦＧＦ２を有効成分として含む治療剤は、気道線維化(fibrosis)、気道炎症、気道過敏性、気道リモデリング、喘息およびＣＯＰＤの治療または予防に有用に使用することができる。また、卵アルブミンおよび二重鎖ＲＮＡを使用して開発された喘息およびＣＯＰＤ動物モデルは、喘息およびＣＯＰＤ治療剤の開発に有用に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞増殖因子２(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2)または塩基性線維芽細胞増殖因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)を有効成分として含む喘息(Asthma)および慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)の予防または治療剤に関するものである。また、本発明は、卵アルブミン(Ovalbumin, OA)および二重鎖ＲＮＡ(dsRNA)によって誘導されるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤマウス動物モデルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この２０年間、喘息の発病率は二倍に増加し、今日、世界人口の８％〜１０％に影響を及ぼしている。喘息は主に、気道の慢性炎症疾患によって生じ、非特異的刺激に対する気道過敏性(Airway HyperResponsiveness, AHR)および気道リモデリングで特徴付けられ、後者は線維芽細胞(Fibroblast)および筋線維芽細胞(myofibroblasts)のような構成成分の構造および機能の変化を伴う。喘息の種類には、気管支喘息、心臓性喘息等があり、単純に喘息と言えば気管支喘息を意味する。
【０００３】
喘息と共に代表的な肺疾患の一つである慢性閉塞性肺疾患は、非可逆的な気道の閉塞を伴うという点で喘息とは異なり、現在世界の死亡率の４位を占めていて、１０大疾患中で唯一その発病率が増加している重要な疾患である。ＣＯＰＤは、気道および肺実質の炎症による細気管支および肺実質の病理学的変化によって発生する病気で、閉塞性細気管支炎および肺気腫(肺実質破壊)を特徴とする。慢性閉塞性肺疾患の種類には、慢性閉塞性気管支炎(Chronic obstructive bronchitis)、慢性細気管支炎(Chronic bronchiolitis)および肺気腫(Emphysema)がある。
【０００４】
このような喘息および慢性閉塞性肺疾患を治療する従来の方法は、抗炎症作用を持つ治療剤や気管支拡張効果を持つ治療剤を使用するものである。前記抗炎症作用を持つ代表的な治療剤には、グルココルチコイド(glucocorticoid)、ロイコトリエンモディファイアー(leukotriene modifiers)、テオフィリン(theophylline)等がある。
【０００５】
しかし、前記グルココルチコイドは効果面では強力であるが、薬物副作用が問題となるため吸入治療を必要とし、治療効果も選択的に作用するのではなく、すべての免疫反応と抗炎症反応を抑制するため、場合によっては必要な免疫反応まで抑制する問題点がある。前記ロイコトリエンモディファイアーは、副作用は少ないが効果面で限界があり、単独使用時には喘息を調節することができない。したがって、大部分補助的に使用しているという問題点がある。前記テオフィリンは効果面でも優秀ではなく、副作用の心配があるという問題点がある。
【０００６】
したがって、効果が優秀で副作用が少ない治療剤の開発が切実に求められており、それのためには喘息の発生機序に対する正確な理解が必要である。
【０００７】
これと関連して、喘息発生においてタイプ１のヘルパーＴ細胞(type1 helper T cells, Th1)またはタイプ２のヘルパーＴ細胞(type2 helper T cells, Th2)が分泌するサイトカインが重要な役割をし、Ｔｈ１とＴｈ２によって分泌されるサイトカイン間の不均衡によって喘息が誘発されるということが従来の一般的な仮説であるが(Ｔｈ１／Ｔｈ２仮説)(Mosmann等, J. Immunol., 1986年, 第136巻, 2348〜57頁; Robinson等, N. Engl. J. Med., 1992年, 第326巻, 298〜304頁; Grunig等, Science, 1998年, 第282巻, 2261〜3頁; Richter等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001年,第25巻,385〜91頁)、それに関する詳しい機序は、明らかにされていない。
【０００８】
Ｔｈ２細胞によって生産されるサイトカインの中で、特にインターロイキン１３(Interleukin-13, IL-13)が喘息の発生機序において重要なものであると考えられている(Grunig 等, Science, 1998年, 第282巻, 2261〜3)。それは、次の報告によって裏付される。アレルギー性喘息動物モデルにおいて、ＩＬ−１３を遮断した時、アレルゲンによる気道過敏性が抑制され、再び組換えＩＬ−１３を気道内に投与した時、気道過敏性が誘導され(Marsha等, Science, 1998年, 第282巻，2258〜2261)、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウスで見られる組織所見は、喘息患者に見られるものと類似しており、過剰発現したＩＬ−１３が気道の炎症、粘液分泌の増加、上皮細胞線維化等を誘導する(Zhu等, J. Clin. Invest., 1999年，第103巻，779〜788頁)。
【０００９】
一方、ＩＬ−１３は好酸球(eosinophils)のような炎症細胞の浸潤を増進させてＡＨＲを促進すると報告されたが(Hargreave等, J. Allergy clin. Immunol., 1986年， 第78巻，825〜-32頁)、最近では、ＩＬ−１３による気道過敏性の誘導が好酸球の浸潤と関係なく起きるという証拠が提示されている(Venkayya等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002年，第26巻，202〜8頁)。
【００１０】
このようなＩＬ−１３による喘息は、形質転換増殖因子β１(Transforming Growth Factor β1, TGF-β1)または血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)を通じて発生することが知られている(Lee等, Nat. Med., 2004年，第10巻，1095〜1103頁)。
【００１１】
ＴＧＦ−β１は、組織損傷後の傷部を治療する最も重要な物質で、気道リモデリングの重要な病理学的変化である組織線維化を誘導する。すなわち、線維芽細胞を筋線維芽細胞に変化させて、筋線維芽細胞は休止線維芽細胞(resting fibroblasts)よりコラーゲンをさらに多量に分泌させて組織線維化を通じた気道リモデリングを誘発する(Vignola等, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997年，第156巻，591〜599頁)。これは、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウスが主にＴＧＦ−β１依存的な経路を通じて肺の線維化を誘導するという報告と一致するものである(Lee等, J. Exp. Med., 2001年，第194巻，809〜21頁)。
【００１２】
前記の組織線維化過程で、ＴＧＦ−β１は線維芽細胞増殖因子２または塩基性線維芽細胞増殖因子およびその受容体であるＦＧＦレセプター１（ＦＧＦＲ１）またはＦＧＦレセプター２（ＦＧＦＲ２）を誘導するものとして報告された。このようなＦＧＦ２は、従来から内皮細胞または平滑筋細胞の増殖に関与し、血管新生に重要な役割を果たすことが知られていたが(Nugent等, Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000年，第32巻，115〜20頁)、気道過敏性と喘息の発病におけるＦＧＦ２の役割については、現在まで全く知られていない状態であった。
【００１３】
血管内皮増殖因子は、毛細管で血漿タンパク質の透過を増加させるサイトカインの一種で、細胞の分裂と移動を促進して細胞の再構成を起こすタンパク質分解酵素を誘導する機能をする。また、アポトーシスの抑制を通じた新しく形成された血管の生存の維持、神経抗原の抑制による免疫調節、および細胞の成長および分裂の誘導に関与する。本発明者らは、抗原および異物に対する免疫反応において、ＩＬ−１３とＶＥＧＦが互いに陽性のフィードバックループを形成することができることをすでに明らかにした(Lee等, Nat. Med., 2004年，第10巻，1095〜1103頁)。ＶＥＧＦを通じた喘息の発生においても、ＦＧＦ２の役割は現在まで全く知られていない状態である。
【００１４】
次に、喘息の発生と関連して論議される他の機序は、Ｔｈ１が分泌するサイトカインであるインターフェロンガンマ(Interferon-γ, IFN-γ)によるものである。ＩＦＮ−γは、病原体に対する防御機序でＴｈ１細胞から分泌される物質で(Fong等, J. Imunol., 1989年，第143巻，2887〜93頁)、Ｔｈ２によるサイトカインの生産を阻害するものとして知られてきた(Mosann等, J. Immunol., 1986年，第136巻，2348〜57頁)。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２仮説によれば、ＩＦＮ−γがそれによって発生する喘息を抑制することができるものと考えられた。しかし、このような理論に対する見解はするどく対立しており、反対意見は、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスでも喘息と類似の気道リモデリングが観察され(Wang等, J. Exp. Med., 2000年，第192巻，1587〜1600頁)、特に喘息患者の重篤度とＩＦＮ−γの増加が有意な相関関係を持つという多くの報告によって裏付される(Corrogan等, Lancet 1988年，第1巻，1129〜32頁; Mognan等, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2000年，第161巻，1790〜6頁)。
【００１５】
同時に、前記反対意見は、喘息治療剤に現在最も広く使用されているコルチコステロイド(corticosteroids)、ベータ２刺激剤(β2-adrenergic agonists)およびメチルキサンチン系薬物(Methylxanthine derivatives)等の薬理作用が、免疫学的な面ではＴｈ２免疫反応を抑制するよりむしろＴｈ１免疫反応を抑制するという事実によっても裏付される。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２仮説によるＴｈ２免疫反応の増進により喘息の発病機序を説明することには限界がある。
【００１６】
一方、ＣＯＰＤに関して現在まで正確な発生機序はほとんど知られておらず、様々な治療方法が使用されているが、発病および進行を根本的に治療することができる薬剤は存在しないのが実情である。したがって、ＣＯＰＤの病因機序研究および、それを根拠にした根本的薬剤開発が切望されているのが実情である。
【００１７】
しかし、最近のトランスジェニックマウスを使用した研究結果を詳しく見てみると、喘息の発生に関与することが明らかにされたＩＦＮ−γ(Wang等, J. Exp. Med., 2000年，第192巻，1587〜1600頁)およびＩＬ−１３(Zheng等, J. Clin. Invest., 2000年，第106巻，1081〜93頁)が、ヒトのＣＯＰＤと類似の病理所見を導き出すことができる物質として注目されている。先に言及したように、このようなサイトカインは、主に免疫細胞で分泌されるもので、ＣＯＰＤの病因機序において免疫反応の役割が非常に重要であることを示唆している。免疫細胞から分泌されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３は、ＣＯＰＤの主要症状である気道および肺実質の炎症反応において攻撃因子として主な役割を果たし、このような炎症反応による組織損傷等を治癒する過程での防御因子と攻撃因子とのバランスが、気道および肺胞上皮細胞の再生過程において特に重要である(Lee等, J. Exp. Med., 2004年，第200巻，377〜89頁)。この過程で攻撃因子が強過ぎたりそれを治癒する防御因子が過剰に不足する状況で、ＣＯＰＤが発生し得ることが考えられる。
【００１８】
以上のことに鑑みて本発明者らは、ＦＧＦ２の喘息発生およびＣＯＰＤ発生における、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β１、ＶＥＧＦおよびＩＦＮ−γに関連した新しい役割を解明して、ＦＧＦ２がインターロイキン−１３によって誘導される血管内皮増殖因子による気道の気道過敏性を抑制することにより気道過敏性を低減し、インターフェロンガンマによる気道過敏性、気道および肺実質の炎症による肺気腫を抑制することを確認することにより、ＦＧＦ２が喘息およびＣＯＰＤの治療または予防に有用に使用できることを確認した。
【００１９】
また、卵アルブミンおよび二重鎖ＲＮＡを使用して、喘息およびＣＯＰＤモデルを開発し、喘息およびＣＯＰＤ治療剤開発において効率的な実験遂行を可能にする、Ｔｈ１喘息およびＣＯＰＤ動物モデルを確立することによって本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、線維芽細胞増殖因子２または塩基性線維芽細胞増殖因子を有効成分として含む喘息および慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供するものである。また、本発明は、アレルゲンとして卵アルブミン(OAlbumin, OA)および二重鎖ＲＮＡによって誘導されるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤマウス動物モデルを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息予防または治療剤を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記喘息がＩＬ−１３の過剰発現によって誘発されることを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２３】
本発明はまた、前記喘息がＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記ＦＧＦ２がＩＬ−１３の活性を抑制することを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記ＦＧＦ２が血管内皮増殖因子の活性を抑制することを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記ＦＧＦ２がＴＧＦ−β１の活性を抑制することを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ＦＧＦ２を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供する。
【００２８】
本発明はまた、前記慢性閉塞性肺疾患がＩＦＮ−γの過剰発現によって誘導されることを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供する。
【００２９】
本発明はまた、卵アルブミンを含むアレルゲンおよび二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与することを含む、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、前記動物がマウスである、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、前記製造方法が下記の工程を含む、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３２】
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５〜１５μｇの二重鎖ＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸(polyinosinic-polycytidylic acid)および５０〜１００μｇの卵アルブミンを4回鼻腔に投与して感作する工程、
（２）１０日後、２５〜７５μｇの卵アルブミンを鼻腔に感作する工程。
【００３３】
本発明はまた、前記工程（１）の感作する二重鎖ＲＮＡが１０μｇで使用される、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、前記工程（１）の感作する卵アルブミンが、７５μｇの卵アルブミンであり、工程（２）の１０日後、５０μｇの卵アルブミンを使用する、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、前記喘息が非好酸球性であることを特徴とする、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、前記方法によって製造された、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルを提供する。
【００３７】
本発明はまた、前記動物がマウスである、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルを提供する。
【００３８】
本発明はまた、ＦＧＦ２を有効成分として含むＩＬ−１３、ＶＥＧＦまたはＴＧＦ−β１活性抑制剤を提供する。
【００３９】
本発明はまた、ＦＧＦ２を有効成分として含む気道線維化、気道炎症、気道過敏性または気道リモデリング抑制剤を提供する。
【００４０】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息の治療または予防用製薬組成物を提供する。前記喘息が、ＩＬ−１３またはＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする喘息予防または治療剤を提供する。前記ＦＧＦ２が、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子、またはＴＧＦ−β１の活性を抑制することを特徴とする喘息予防または治療剤を提供する。
【００４１】
喘息とは、気管支喘息、心臓性喘息等を含み、好ましくは気管支喘息を意味する。喘息の特徴的症状は、気道過敏性および気道リモデリングである。
【００４２】
気道リモデリングは、遺伝的素因がある人において、アレルギー抗原、感染、または刺激剤等によって免疫反応が増加して起きるようになり、Ｔ細胞が細胞間の情報交換物質であるサイトカインを分泌するようになり、分泌されたサイトカインは炎症細胞を組織内に移動させて気道の慢性的な炎症を繰り返し誘発し、結局気道がリモデリングされるものである。
【００４３】
気道過敏性は、喘息発生の主要因子であると考えられ、それが他の呼吸器疾患と区別される点である。しかし、このような気道過敏性症状は、気道リモデリングの特徴である気道平滑筋増殖症(airway smooth muscle hyperplasia)、収縮性(contractility)および上皮下および肺柔組織線維化等を伴う。よって、気道炎症、気道過敏性および気道リモデリングは、お互いに密接不可分の関係があり、一症状の治療が別の症状の治療を伴うことがあり、一つの治療剤で気道炎症、気道過敏性および気道リモデリングのすべてを治療することができる。
【００４４】
このような特徴を持つ喘息の経路と関連して、古典的によく知られた代表的なＴｈ２サイトカインＩＬ−４を過剰発現するトランスジェニックマウス(IL-4 TG(+))は、正常マウス(WT)と比較した時、気道過敏性に差がなかったが（図１Ａ）、一方Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−９過剰発現トランスジェニックマウス(IL-9(+)/IL-13(+/+))の場合、正常マウスに比較して気道過敏性が増加しているが、ＩＬ−１３遺伝子を除去した場合(IL-9(+)/IL-13(-/-))気道過敏性が消えるという事実によって、ＩＬ−９過剰発現による喘息がＩＬ−１３を通じて媒介されることが裏付けされる（図１Ｂ参照）。
【００４５】
これを証明するために、ＩＬ−１３を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製して気道過敏性、ＩＬ−１３によって過剰発現されることが知られたＴＧＦ−β１とＶＥＧＦとの関係を評価した時、平均的にＩＬ−１３を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、気道過敏性が正常マウスに比較して増加していることが分かる（図２参照）。
【００４６】
また、ＩＬ−１３過剰発現されたトランスジェニックマウスの気管支肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavage, BAL)において、ＴＧＦ−β１とＶＥＧＦの生成が増加した（図３参照）。このような結果はまた、ＩＬ−１３による気道過敏性が下流の物質であるＴＧＦ−β１とＶＥＧＦとによって調節されることを意味する。
【００４７】
さらに、ＩＬ−１３経路による気道過敏性が下流でＶＥＧＦによって調節されるということは、受容体２の信号伝達遮断剤(signaling blocker)であるＳＵ１４９８を使用してＩＬ−１３によって誘導される気道過敏性が阻害されることを確認して証明された（図４参照）。
【００４８】
さらに、前記のようなＩＬ−１３経路による喘息において、ＦＧＦ２の役割は解明されていない状態であり、本発明者らはＦＧＦ２がＩＬ−１３によって誘導されるＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１を通じた喘息の症状の治療に効果的であることを確認した。
【００４９】
ＦＧＦ２欠損マウスを使用してＦＧＦ２が遮断されると正常マウスに比較してＶＥＧＦの量が増加することを観察した（図５参照）。したがって、気道過敏性も増加することを確認した（図６参照）。これは、ＦＧＦ２欠損マウスにおいてＶＥＧＦを同時に遮断した場合、気道過敏性が抑制されるという実験結果（図６参照）と一致するものである。
【００５０】
これは、ＦＧＦ２が、ＩＬ−１３からのＶＥＧＦを介した喘息の治療に効果的であることを示すもので、下記の結果から証明される。
【００５１】
ＩＬ−１３が主要媒介物として作用するＴｈ２喘息モデルにおいて、ＦＧＦ２を投与した後その効果を測定した結果、ＦＧＦ２はメタコリンに対する気道過敏性を低減し（図２０参照）、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数を減少させ（図２１参照）、Ｔｈ２喘息の重要な媒介因子であるＩＬ−１３およびＶＥＧＦの発現を抑制することを観察した（図２２参照）。また、組織学的検査の結果、ＦＧＦ２によって肺気管支壁の肥厚および閉塞が減少して、肺組織が正常と類似したものになることを確認した（図２３参照）。前記結果から、ＦＧＦ２がＶＥＧＦおよびＩＬ−１３の生成を阻害して気道過敏性と炎症を抑制し、喘息の治療に効果的に使用できることが分かった。
【００５２】
ＩＬ−１３喘息経路の別の下流物質であるＴＧＦ−β１と関連して、以前にＴＧＦ−β１で形質転換されたマウスで肺気管支の気道リモデリングが観察され(Lee等, J. Exp. Med., 2004年，第200巻，377〜389頁)、ＩＬ−１３によって誘導される肺気管支の線維化は 、ＴＧＦ−β１に依存性であることが報告された(Lee等, J. Exp. Med. 2001年，第194巻，809〜821頁)。ＴＧＦ−β１で形質転換されたマウスにおいて、ＴＧＦ−β１によって気道の抵抗力と気道閉塞が重度に誘導され（図７参照）、メタコリンによる気道過敏性は抑制されることを観察した（図８参照）。
【００５３】
このようなＴＧＦ−β１を通じたＩＬ−１３経路による喘息において、ＦＧＦ２の役割解明のためにＦＧＦ２を欠損させたマウスで気道過敏性を測定して比較した結果、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少効果がＦＧＦ２欠損マウスでは現われないことを確認することができた（図９参照）。前記結果は、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少が、ＴＧＦ−β１自体によるものであるというよりは、ＴＧＦ−β１と一緒に発現されるＦＧＦ２に起因するものであることを示す。すなわち、ＦＧＦ２が存在する状態でのＴＧＦ−β１の増加は気道過敏性を低減するが、ＦＧＦ２が存在しない状態では、ＴＧＦ−β１にかかわらず気道過敏性が増加することが分かる。
【００５４】
以上の実験結果からＦＧＦ２の役割を叙述すると、気道の組織が損傷を被れば免疫システムが作動して、ＴＧＦ−β１によって気道平滑筋細胞と線維芽細胞とが筋線維芽細胞に変換され、変換された筋線維芽細胞によって線維症が誘発される。この時、ＴＧＦ−β１によって減少した気道平滑筋細胞および線維芽細胞の細胞数を補うために、ＦＧＦ２は、気道平滑筋細胞および線維芽細胞を増殖させると同時に、前記筋線維芽細胞の気道平滑筋細胞および線維芽細胞への変換を誘導する。したがって、ＦＧＦ２は筋線維芽細胞を線維芽細胞に変化させて筋線維芽細胞の細胞数を減らして気道リモデリングを低減し、同時に気道過敏性を低減する役割を果たすということが分かる。
【００５５】
このようなＦＧＦ２による気道リモデリングの抑制を説明するために、ＦＧＦ２欠損マウスでコラーゲン量と気道過敏性を測定した結果、ＦＧＦ２欠損マウスの肺では、コラーゲンを分泌する線維芽細胞の数が正常実験マウスに比較して相対的に少なかった（図１０参照）。これは、ＦＧＦ２による線維芽細胞の増殖が行われずに細胞数が少なくなり、それにより線維芽細胞から分泌されるコラーゲンの量が少なくなったことを示している。また、メタコリンによる気道過敏性を測定した結果、ＦＧＦ２が正常に存在する正常マウスは気道過敏性に大きな影響を受けないのに比べて、ＦＧＦ２が欠損した場合、気道過敏性が大幅に増大することを観察した（図９参照）。前記の結果は、ＩＬ−１３からＴＧＦ−β１に至る経路においてＦＧＦ２が欠損すると線維芽細胞の増殖および筋線維細胞から線維芽細胞への変換が成立せず、気道リモデリングが進行してメタコリン反応に強い線維芽細胞の数が減少し、気道過敏性が増大したと解釈される。よって、これは、ＦＧＦ２がＩＬ−１３からＴＧＦ−β１への経路による喘息の治療にも効果的に使用できることを示すものである。
【００５６】
以前のＩＬ−１３を通じた喘息の経路以外に、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γも喘息の発生に重要であるという見方が台頭してきている。Ｔｈ１から分泌されるサイトカイン、特にＩＦＮ−γは、喘息と深い関係があることが多くの研究から明らかにされている。このようなＴｈ１の活性化によって進行する喘息モデルはまだ存在しない。これは、既存の喘息研究の大部分が、Ｔｈ２の活性化によって喘息が発生するというＴｈ１／Ｔｈ２理論に焦点を合わせていたため、好酸球や免疫グロブリンＥ(Immunoglobulin E, IgE)が過剰発現され得る喘息モデルのみを作製し、使用したためである。
【００５７】
しかし最近、好酸球性炎症がなくても気道過敏性が誘導され得る(Venkayya R, Am J Respir Cell Mol Biol 2002年，第26巻，202〜8頁)、非好酸球性喘息患者が喘息患者全体の過半数であるという研究結果等が報告されている(Douwes等, Thorax, 2002年，第57巻，643〜8頁)。したがって、既存の仮説を飛び越えて、Ｔｈ１タイプの喘息モデル製造およびそれを使用した研究が至急な実情である。
【００５８】
そこで本発明者らは、ＩＦＮ−γによって誘導されたＴｈ１喘息およびＣＯＰＤ動物モデルを作出し、これによりＦＧＦ２の役割を解明してＦＧＦ２がＩＦＮ−γによる喘息およびＣＯＰＤの治療にも有用であることを発見した。
【００５９】
したがって、本発明は、ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息の予防または治療剤以外に、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供する。前記慢性閉塞性肺疾患は、ＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発され得る。
【００６０】
まず、ＩＦＮ−γによる喘息でのＩＦＮ−γとＦＧＦ２との関係を解明するために、ＩＦＮ−γにより形質転換されたマウスの肺からＦＧＦ２の発現をＲＴ‐ＰＣＲを使用して測定した結果、正常マウスと対照的にＦＧＦ２の発現が著しく阻害されていることを観察した（図１３参照）。前記結果は、ＦＧＦ２がＩＦＮ−γシグナリング経路によってその発現が抑制されることを意味する。
【００６１】
一方、ＩＦＮ−γによって誘導される気道炎症および気道過敏性からＦＧＦ２の役割を詳しくみてみる。ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス(IFN-γ(+)/FGF2(+/+))にＦＧＦ２遺伝子欠損を誘導して気道過敏性を測定した。ＢＡＬ中の炎症細胞数、および炎症関連サイトカインの発現量を測定した。その結果、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスで、ＦＧＦ２遺伝子欠損の時(IFN-γ(+)/FGF2(-/-))、気道過敏性および炎症が顕著に増加することを観察した（図１４Ａ、Ｂ参照）。このようなＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスでの、ＦＧＦ２欠損による気道過敏性および炎症の増加において、ＶＥＧＦの増加が重要な役割を果たすと考えられる（図１４Ｃ参照）。前記結果は、ＩＦＮ−γによって誘導される気道炎症および気道過敏性もまた、ＦＧＦ２で有用に治療可能であることを示している。
【００６２】
ＩＦＮ−γが主に媒介物として作用するＴｈ１喘息モデルにおいて、ＦＧＦ２の活性を測定した結果、ＦＧＦ２はメタコリンに対する気道過敏性を低減する（図２７参照）。前記結果から、ＦＧＦ２がＩＦＮ−γ経路を通じた喘息の治療に有用に使用できることが分かる。
【００６３】
続いて、ＦＧＦ２を前記Ｔｈ１喘息およびＣＯＰＤマウスに投与して治療効果を測定した。
【００６４】
ＦＧＦ２処置時に、前記マウスでは、ＢＡＬ内の炎症細胞数（図２６参照）およびメタコリンに対する気道過敏性（図３６参照）が減少した。
【００６５】
さらに前記マウスは、気道過敏性以外にＣＯＰＤの症状である肺実質細胞のアポトーシスを誘発する。このような気道過敏性と肺実質細胞のアポトーシスは、ＦＧＦ２の有無によって影響を受ける。ＩＦＮ−γが過剰発現された実験マウスにおいて、ＦＧＦ２を投与すると気道過敏性が低減し（図２７参照）、ＩＦＮ−γによって誘導される肺実質細胞の破壊もＦＧＦ２の投与によって減少する（図２８および図２９参照）。また、ＩＦＮ−γによる組織損傷および肺胞破壊または肺気腫もやはりＦＧＦ２の投与によって減少する（図３０および図３１参照）。
【００６６】
以上で詳しく見たように、喘息およびＣＯＰＤにおいて増殖因子として知られたＦＧＦ２が、むしろ気道過敏性を低減させて肺胞破壊を抑制し、喘息およびＣＯＰＤの治療または予防剤としての効果があることが分かる。
【００６７】
一方、本発明のＦＧＦ２を有効成分として含む喘息またはＣＯＰＤの予防または治療剤は、組成物総重量に対して前記有効成分を０．０００１〜５０重量％含むことができる。
【００６８】
本発明の治療剤は、前記有効成分に同様または類似の機能を示す有効成分をさらに１種以上含むことができる。
【００６９】
本発明の治療剤は、投与のために、前記有効成分以外に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール、リポソームおよびこれら成分の中から１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するように標的器官特異的抗体またはその他のリガンドを前記担体と結合させて使用することができる。さらに当該技術分野の適正な方法でまたはレミングトンの文献(Remington's Pharmaceutical Science(最新版)、Mack Publishing Company, Easton PA)に開示されている方法を使用して、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００７０】
本発明の治療剤の投与方法は、特別にこれに制限されるものではないが、目的と方法に応じて非経口投与(例えば静脈内、皮下、腹腔内、局所または鼻腔に適用)したり経口投与することができ、非経口投与が好ましく、鼻腔投与が好ましい。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。
【００７１】
一日投与量は、化合物の場合約０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【００７２】
本発明の治療剤は、治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００７３】
本発明のＦＧＦ２をマウスの鼻腔内に投与して毒性実験を遂行した結果、毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）が少なくとも１，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。
【００７４】
さらに、本発明は卵アルブミンを含むアレルゲンおよび二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与することを含む、Ｔｈ１喘息またはＣＯＰＤ動物モデルの製造方法を提供する。
【００７５】
前記の方法は、下記の工程を含む。
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５〜１５μｇの二重鎖ＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸および５０〜１５０μｇの卵アルブミンを４回鼻腔に投与する感作工程、および
（２）１０日後に２５〜７５μｇの卵アルブミンを鼻腔に感作する工程。
【００７６】
前記工程（１）の感作する二重鎖ＲＮＡは、１０μｇで使用することが好ましい。前記工程（１）の卵アルブミンは、７５μｇで使用するのが好ましい。前記工程（２）の１０日後に使用する卵アルブミンは、５０μｇで使用するのが好ましい。
【００７７】
前記喘息は、非好酸球性であり得る。
【００７８】
さらに本発明は、前記方法によって製造されたＴｈ１喘息またはＣＯＰＤ動物モデルを提供する。
【００７９】
前記の動物は、実験用に使用されるすべての哺乳類に属する動物を含み、好ましくはマウスである。
【００８０】
Ｔｈ１喘息またはＣＯＰＤ動物モデルの作製と関連して、ウイルスの複製工程で生成される二重鎖ＲＮＡ(double-stranded RNA, dsRNA)は、生体内で抗ウイルス活性を示す１型(type1)インターフェロン(IFN)であるＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐βを強力に誘導することが知られている(Guidotti等, Annu. Rev. Immunol., 2001年，第19巻，65〜91頁)。そして、このような１型インターフェロンは、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成を促進する一方、樹枝状細胞の成熟とＴ細胞の初回抗原刺激(priming)を増進させて獲得免疫反応を誘導できることが知られている(Londhe等, FEBS Lett., 2003年，第553巻，33〜8頁)。したがって、本発明者らは、ｄｓＲＮＡで処置してＴｈ１経路によって喘息が誘発された動物モデルを作製した。
【００８１】
動物モデルの作製に使用するｄｓＲＮＡの具体的配列および長さは、Ｔｈ１喘息を誘導する限り制限はなく、市販の物を購入して使用することができるが、好ましくはポリイノシンポリシチジン酸(polyI:C)である。
【００８２】
前記Ｔｈ１経路によって喘息が誘発されたマウスは、気道過敏性が増加することを確認し（図１５参照）、リンパ球、好中球およびマクロファージなどの細胞数は増加したが好酸球数は増加しないことを観察した。媒介因子では、Ｔｈ１反応と関連のあるＩＰ−１０だけが格段に増加した（図１６および図１７参照）。前記結果は、ＯＡおよびｄｓＲＮＡによって非好酸球性気道炎症(non-eosinophilic airway inflammation)が誘導されたことを意味する。また、肺気管支洗浄液におけるＩＦＮ−γの増加と、血液中の抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の増加とを確認した（図１８および図１９参照）。これにより、ＯＡおよびｄｓＲＮＡによる気道感作は、ＩＦＮ−γと抗原特異的ＩｇＧ２ａによるものであり、抗原特異的ＩｇＥとは関連がないと見られ、Ｔｈ１動物モデルの確立を確認した。
【００８３】
同時に、前記動物モデルはまた、ＣＯＰＤの症状を示し、すなわち肺の大きさおよび容積増加と肺胞の破壊とともに、コラーゲン量の増加から深刻な線維化が招来されたことを確認することができた（図２８〜３１参照）。
【００８４】
前記結果から、Ｔｈ１喘息モデルマウスがまた、ＣＯＰＤの病因機序を示すことができるモデルであることを確認することができた。
【００８５】
したがって、アレルゲン(卵アルブミン、ＯＡ)および二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与して作製した本発明のモデルが、Ｔｈ１または非好酸球性喘息動物モデルであることを確認し、喘息およびＣＯＰＤモデルを開発して喘息およびＣＯＰＤ治療剤開発において効率的な実験遂行に有用に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
以下、本発明を例によってより詳しく説明する。
但し、下記の例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の例によって限定されるものではない。
【００８７】
例１：ＩＬ−１３過剰発現による喘息の発生およびＶＥＧＦとＴＧＦ−β１との関連性
ＩＬ−１３による喘息の発生を調査するためにＩＬ−１３が過剰発現されたトランスジェニックマウスを作製して、このマウスでの気道過敏性を測定して、前記マウスでＩＬ−１３の過剰発現がＴＧＦ−β１およびＶＥＧＦの発現に及ぼす影響を調査した。
【００８８】
例１−１：ＩＬ−１３トランスジェニックマウスの作製
ＩＬ−１３を過剰発現するトランスジェニックマウスを以前に記述されたとおり作製した(Zhou Zhu 等, J. Clin. Invest., 1999年，第103巻，779〜788頁; Tang等, J. Clin. Invest., 1996年，第98巻，2845〜2853頁; Ray等, J. Clin. Invest., 1997年，第l00巻，2501〜2511頁)。要約すると、ＩＬ−１３の候補遺伝子を気道に選択的に発現させるために、抗炎症呼吸器細胞の一つのクララ(Clara)細胞１０ｋＤａタンパク質（ＣＣ１０）の発現を誘導するプロモーター(University of CincinnatiのB. StrippおよびJ. Whitsett)に連結したＩＬ−１３候補遺伝子を含むコンストラクトを使用した。マウス内に導入された遺伝子発現を外部から調節することができる誘導性トランスジェニックマウスの作製のために、ＣＣ１０プロモーターにリバーステトラサイクリントランス活性化因子(reverse tetracycline transactivator, rtTA)とヒト成長ホルモン(human growth hormone, hGH)遺伝子とを作動可能に連結してpKS-CC10-rtTA-hGHを準備した(Ray等, J. Clin. Invest., 1997年，第98巻，2501〜2511頁)。Elutip-Dカラム(Schleicher and Schuell Inc, 米国)で前記プラスミドＤＮＡを精製し、微細注入バッファー(０．５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５)で透析した。続いて前記文献による前核内注入法を使用して、ＣＢＡマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを交配させて得たＦ２卵に前記プラスミドＤＮＡを注入して前記文献に記載された方法によってトランスジェニックマウスを作製した。すべてのトランスジェニックマウスは、トランスジェニックマウスと正常マウスに無作為に０．５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン(doxycycline, dox)が含まれた水を飲ませた後、それぞれのマウスから得た気管支肺胞洗浄液でＩＬ−１３タンパク質の数値を評価して形質転換の有無を評価した。
【００８９】
例１−２：ＩＬ−１３が過剰発現されたトランスジェニックマウスでの気道過敏性の測定
ＩＬ−１３によって形質転換されたマウスでの喘息発生の有無を確認するために、喘息の代表的症状である気道過敏性を下記のように測定した。気道過敏性は、当該技術分野で公知の慣用の方法によって、ＤＲＳ(dose response slope)(Pediatric Allergy and Immunology, 2003年，第14巻，193頁)およびＰｅｎｈ(Mckinley等, Clinical & Experimental Immunology, 2004年，第136巻，224〜231頁)で測定することができる。Ｐｅｎｈ(enhanced pause, Penh)は、最大呼気圧(peak expiratory pressure, PEP)を最大吸気圧(peak inspiratory pressure, PIP)で割った値にポーズ(pause)を掛けて得た値を求めて得ることができる。具体的には、例１−１の形質転換されたマウスを、再感作の２４時間後および４８時間後に、メタコリンを３分間噴霧して気道過敏性を誘導し、動物用体容積変動記録機(Whole body plethysmography)を使用して、最大呼気圧および最大吸気圧を１０秒単位で３分間測定し、３分間を平均してデータで示した（図２）。図２は、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示した結果である。
【００９０】
図２に見られるように、全般的にＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウスでは、気道過敏性が正常マウスに比較して増加したことが分かる。
【００９１】
例１−３：トランスジェニックマウスでのＩＬ−１３の過剰発現がＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１の発現に及ぼす影響
ＩＬ−１３の過剰発現によって誘導された気道過敏性と、ＩＬ−１３シグナリング経路の下流に存在することが知られたＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１との関連性を調査するために下記の実験を遂行した。例１−１で作製したマウスの気道にＳＰ４５管(tube)を導管(cannulation)し、０．１％ＢＳＡと０．０５ｍＭ ＥＤＴＡとを含んだ滅菌生理食塩水で洗浄して得た気管支肺胞洗浄液を遠心分離した。採取したＢＡＬ上清において、ＥＬＩＳＡキット(CalBiotech, 米国)を使用してＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１タンパク質の発現量を測定した（図３）。図３は、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群で気管支肺胞洗浄液に存在するＶＥＧＦとＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。
【００９２】
図３に見られるように、ＩＬ−１３の過剰発現によって気道過敏性が誘発されたトランスジェニックマウス由来のＢＡＬにおいて、ＴＧＦ−β１およびＶＥＧＦの生成が増加することを確認した。このような結果は、ＩＬ−１３による気道過敏性が下流の物質であるＴＧＦ−β１とＶＥＧＦとによって調節されることを示唆し、これは次の例１−４の結果によって証明される。
【００９３】
例１−４：ＶＥＧＦの遮断剤による気道過敏性の抑制
前記例１−３の効果を確認するために、ＶＥＧＦ受容体２の信号伝達経路遮断剤(signaling blocker)であるＳＵ１４９８(EMD Biosciece, 米国)を前記例１−１で作製したマウスの腹腔に毎日一回ずつ１０ｍｇ／ｋｇの量で注射した（図４）。図４は、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群における、ＶＥＧＦ受容体２の抑制剤であるＳＵ１４９８の投与による気道過敏性を示したグラフである。
【００９４】
図４に見られるように、ＩＬ−１３の過剰発現によって誘導される気道過敏性がＶＥＧＦ受容体２の信号伝達経路遮断剤によって抑制され、ＩＬ−１３によって誘導される気道過敏性がＶＥＧＦを介した信号伝達によるものであることを確認することができた。
【００９５】
例２：ＩＬ−１３によって誘発された喘息でのＦＧＦ２の役割の解明
ＩＬ−１３およびその下流の物質であるＴＧＦ−β１とＶＥＧＦの調節によって発生する喘息でのＦＧＦ２の役割を調べるために、ＦＧＦ２欠損マウスでの気道過敏性および気道リモデリング発生の有無を調査した。
【００９６】
例２−１：ＦＧＦ２の欠損による気道過敏性
ＦＧＦ２の気道過敏性との関連性を調査するために下記の実験を遂行した。ＦＧＦ２欠損マウスは、ジャクソンラボ(Jackson Lab，CA, 米国)から購入して使用した。気道過敏性は、メタコリンに対するＡＨＲ（ＤＲＳ）、および気道過敏性マウスで増加したことが明らかにされたＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１タンパク質のＢＡＬにおける量をそれぞれ例１−２および１−３に記載したのと同じ方法で測定した（図５および６）。図５は、ＦＧＦ２欠損マウス群および正常マウス群のＢＡＬ中のＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。図６は、ＦＧＦ２欠損マウス、および例１−４に記載したようにＶＥＧＦ遮断剤で処置されたＦＧＦ２欠損マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【００９７】
図５に見られるように、ＦＧＦ２欠損マウスは正常マウスに比較してＶＥＧＦの量が増加した。これは気道過敏性の増大を示唆するもので、図６の結果と一致するものである。
【００９８】
図６に見られるように、ＦＧＦ２が欠損したマウスでは気道過敏性が増大した。このような気道過敏性は、ＶＥＧＦ遮断剤の投与によって抑制されることを観察した。ゆえに、ＦＧＦ２の欠損による気道過敏性はＶＥＧＦの発現によるものであり、ＦＧＦ２の投与がＶＥＧＦの発現を抑制してＶＥＧＦ経路を通じた喘息の予防および治療に有用であることを示すものである。
【００９９】
例２−２：ＦＧＦ２の欠損による気道リモデリング
ＦＧＦ２の気道リモデリングとの関連性を調査するために、気道リモデリングに伴う細胞増殖および変換を測定することができる下記の実験を遂行した。
【０１００】
ＦＧＦ２欠損マウスは、ジャクソンラボ(Jackson Lab，CA, 米国)から購入して使用した。前記マウスから当該技術分野における公知の方法によって肺組織を抽出し、細胞増殖および変換を測定することができる組織内のコラーゲン量を、シルコルコラーゲン分析キット(Sircol Collagen assay kit，Biocolor assay, 北アイルランド)を製造者の指示にしたがって使用して分析した（図１０）。図１０は、ＦＧＦ２欠損マウス群と正常マウス群の肺組織内のコラーゲン量を示したグラフである。
【０１０１】
図１０に見られるように、ＦＧＦ２欠損マウスから分泌されたコラーゲン量が、正常実験マウスに比較して相対的に少ないことを確認した。
【０１０２】
このような結果は、ＦＧＦ２が欠損したマウス肺で、コラーゲンを分泌する線維芽細胞の細胞数が少なくなったことを意味するものであり、これはＦＧＦ２の欠損により肺で線維芽細胞が筋線維芽細胞に変化して移動したことにより線維芽細胞の数が少なくなったことが原因で、気道リモデリングが増大したことを示す。
【０１０３】
したがって、このような結果は、ＦＧＦ２が気道リモデリングおよび気道過敏性を減少させて喘息の治療に効果的に使用できることを示すものである。
【０１０４】
例３：ＴＧＦ−β１による喘息の発生
ＩＬ−１３によって誘導されることが知られたＴＧＦ−β１の発現による喘息の発生を調べるために、前記例１−１と同じ方法でＴＧＦ−β１を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製して下記の実験を遂行した。
【０１０５】
例３−１：ＴＧＦ−β１による気道リモデリングの発生
気道リモデリングによる気道過敏性を例１−２と同じ方法で測定した（図７）。図７は、ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群の時間による気道過敏性を示したグラフである。図８は、ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【０１０６】
図７に見られるように、気道過敏性（Ｐｅｎｈ）を測定した結果、ＴＧＦ−β１によって気道の抵抗力が重度に誘導された。
【０１０７】
しかし、図８に見られるように、メタコリンによる気道過敏性（ＡＨＲ）は抑制されることを確認した。前記結果から、ＴＧＦ−β１の過剰発現は喘息の症状の中で気道リモデリングにだけ関与することが分かる。
【０１０８】
例３−２：ＴＧＦ−β１による気道過敏性減少におけるＦＧＦ２の役割
前記例３−１で詳しく見たように、ＴＧＦ−β１による気道過敏性減少にＦＧＦ２が関与するかどうかを調べるために、ＦＧＦ２を制限したマウスで気道過敏性を測定して比較した（図９）。図９は、正常マウスまたはＦＧＦ２を欠損したマウスにおける、ＴＧＦ−β１(R&D system,米国)投与後の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【０１０９】
図９に見られるように、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少は、ＦＧＦ２の欠損マウスで鈍化した。前記結果は、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少は、ＴＧＦ−β１自体によるものというよりは、ＴＧＦ−β１と一緒に発現されるＦＧＦ２に起因したものであることを示す。ＴＧＦ−β１の増加による気道過敏性の減少には、ＦＧＦ２が関与することが分かる。
【０１１０】
例４：ＩＦＮ−γ過剰発現による喘息の発生およびＦＧＦ２の役割
重症喘息とＣＯＰＤの主な媒介物であるＩＦＮ−γが媒介する喘息モデルを作製して、ＦＧＦ２の役割を解明するために、例１と同じ方法でＩＦＮ−γで形質転換されたマウスを作製して下記の実験を遂行した。
【０１１１】
例４−１：ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性の増大
トランスジェニックマウスでの気道過敏性を例１−２と同じ方法で測定した（図１１）。続いて、例１−３と同じ方法で、ＡＨＲおよびＢＡＬ中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、およびＩＦＮ−γによって誘導されることが知られたＩＰ−１０のタンパク質量を測定した（図１２）。図１１は、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【０１１２】
図１１に見られるように、ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスでは、均質に(homogeneously)気道過敏性が高くなることを確認することができた。
【０１１３】
図１２に見られるように、前記マウスはＴｈ２で発現されるＩＬ−１３によって誘導されるＶＥＧＦやＴＧＦ−β１の量は増加しない代わり、Ｔｈ２とは関係ないＩＰ−１０(Interferon-inducible Protein 10)が増加することを確認し、これは前記マウスで誘導された気道過敏性がＩＦＮ−γに特異的であることを示唆する。
【０１１４】
例４−２：ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性へのＦＧＦ２の役割
ＩＦＮ−γ過剰発現がＦＧＦ２の発現に及ぼす影響
ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性へのＦＧＦ２の役割を調べるために、ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスでＦＧＦ２の転写レベルでの発現量を測定した（図１３）。正常マウスおよびトランスジェニックマウスの肺組織から公知の方法によってＲＮＡを抽出して、ＲＴ(reverse transcription)−ＰＣＲを遂行した。要約すると、正常マウスおよびトランスジェニックマウスの肺組織１ｇを製造者の指示どおりトリゾル試薬(TRIzol Reagent，Life Technology, 米国)を使用して総ＲＮＡを分離した。続いて分離した総ＲＮＡを鋳型にして製造者の推奨どおりにＲＴ−ＰＣＲキット(Promega, 米国)を使用してｃＤＮＡを合成した。続いて、合成されたｃＤＮＡ１μｇを鋳型にして上位プライマー(upper primer: 5'-ACT CAC ATT CGA AAC CCC AAA C-3')および下位プライマー(lower primer: 5'-CGT CAG ATC GCC TGG AGA C-3')を使用して、下記の条件でＰＣＲを遂行してＦＧＦ２特異的ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９５℃で８分間予備変性させた後、９５℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分間を３５回繰り返し遂行して最後に７２℃で１０分間反応させた。図１３は、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の肺組織内のＦＧＦ２特異的ｃＤＮＡの増幅を示したアガロースゲル写真である。
【０１１５】
図１３に見られるように、ＩＦＮ−γで形質転換されたマウスでＦＧＦ２の発現が阻害されることを確認することができ、これはＩＦＮ−γによってＦＧＦ２発現が抑制されることを示すものである。
【０１１６】
ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性へのＦＧＦ２の役割
ＩＦＮ−γにより誘導される気道炎症および気道過敏性における具体的なＦＧＦ２の役割を詳しく見るために、下記の遺伝子組換えを有するマウスで気道過敏性、ＢＡＬ中の炎症細胞数および炎症関連タンパク質量を測定した（図１４）。前記マウスは、以前に記述されたとおり作製した(Zhou Zhu等, J. Clin. Invest., 1999年，第103巻，779〜788頁; Tang等, J. Clin. Invest., 1996年，第98巻，2845〜2853頁; Ray等, J. Clin. Invest., 1997年，第l00巻，2501〜2511頁)。図１４で、＋は該当遺伝子が過剰発現されたマウスを示し、−は該当遺伝子が欠損したマウスを示す。図１４のＡは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群における気管支肺胞洗浄液中の総細胞数（Total）、マクロファージ（Ｍ）、リンパ球（Ｌ）、好中球（Ｎ）、好酸球（Ｅ）の細胞数を示したグラフである。図１４のＢは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群における、メタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。図１４のＣは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群における気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＩＰ−１０の発現量を示したグラフである。
【０１１７】
図１４に見られるように、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスでＦＧＦ２遺伝子をなくすと、ＩＦＮ−γによって誘導される気道過敏性がさらに増加し、炎症細胞数が増加することが観察され、気道炎症がさらにひどくなることを確認することができた。これは、ＦＧＦ２がまた、ＩＦＮ−γによって誘発される喘息にも有用に使用できることを示す。
【０１１８】
例５：ＦＧＦ２投与による、ＩＬ−１３によって誘導されたＴｈ２喘息の抑制
ＩＬ−１３によるＴｈ２喘息において、ＦＧＦ２タンパク質による具体的な喘息抑制活性を測定するため、下記の実験を遂行した。
【０１１９】
組換えＦＧＦタンパク質(ｒＦＧＦ２)は、ファーマシアアップジョン(Phamacia-Upjohn、イタリア)社から購入して使用した。
【０１２０】
気道過敏性が誘発されたマウス作製のために、７５μｇの卵アルブミン（ＯＡ）と２ｍｇのアラムをＢＡＬＢ／ｃマウス(Jackson Lab, 米国)の腹腔に二度注射して感作し、１０日後に５０μｇの卵アルブミンを鼻腔に再感作してＴｈ２喘息を誘発した。前記Ｔｈ２喘息が誘発されたマウスを、Ｔｈ２喘息実験マウスと命名した。
【０１２１】
続いて前記マウスおよび正常マウスにそれぞれｒＦＧＦ２を４日間、１日１回１０μｇ／頭の用量で鼻腔に投与または非投与(生理食塩水)後、メタコリンに対する気道過敏性（図２０）、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞（図２１）および、媒介因子としてのＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０（図２２）の量を例１−２および１−３に記載した方法で測定した。
【０１２２】
図２０は、Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２を投与後の、メタコリン濃度に応じた気道過敏性を示したグラフである。図２１は、Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群でｒＦＧＦ２を投与した後、気管支肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。図２２は、Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群における、ｒＦＧＦ２を投与した後の、気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０の量を示したグラフである。
【０１２３】
図２０に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ２喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスでメタコリンに対する気道過敏性が低いことを確認した。
【０１２４】
図２１に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ２喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスにおいて気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数が減少することを確認した。
【０１２５】
図２２に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置されていないＴｈ２喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスでは、Ｔｈ２喘息における重要な媒介因子であるＩＬ−１３とＶＥＧＦの濃度が減少することを確認した。一方、Ｔｈ２喘息と関連性がないことが知られているＩＬ−５およびＩＰ−１０の発現には、変化がないことを確認した。
【０１２６】
また、喘息が誘発されたマウスをｒＦＧＦ２で処置後、肺気管支壁の組織学的検査を行った（図２３）。図２３は、Ｔｈ２喘息実験マウスにｒＦＧＦ２を投与する前（Ａ）および投与した後（Ｂ）の肺組織の病理写真である。
【０１２７】
図２３に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置したマウスの肺気管支壁の組織学的検査の結果（Ｂ）、ＦＧＦ２の投与によって肺気管支壁の肥厚および閉塞が減少して正常（Ｃ）と同様になることを確認した。
【０１２８】
前記結果から、ＦＧＦ２がＶＥＧＦおよびＩＬ−１３生産を阻害してＴｈ２気道過敏性および炎症を抑制し、喘息の予防および治療に有用に使用できることが分かった。
【０１２９】
例６：ＦＧＦ２の投与による、ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤの抑制
ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息においてＦＧＦ２タンパク質による具体的な喘息抑制活性を測定するため、下記の実験を遂行した。
【０１３０】
rＦＧＦ２タンパク質は、ファーマシアアップジョン(Phamacia-Upjohn、イタリア)社から購入して使用した。ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息が誘発されたマウスの作製のために下記の実験を遂行した。
【０１３１】
例６−１：卵アルブミンと二重鎖ＲＮＡを使用したＴｈ１喘息およびＣＯＰＤ動物モデルの確立
ＢＡＬＢ／ｃマウス(Jackson Lab, 米国)を使用して、１０μｇの合成ｄｓＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸(polyinosinic-polycytidylic acid，PolyIC, Sigma, 米国)、７５μｇの卵アルブミン(OvAlbumin, OA)を、それぞれまたは一緒に４回鼻腔に投与して感作し、１０日後に５０μｇの卵アルブミンを鼻腔に再感作して喘息を誘発した。前記マウスをＴｈ１喘息マウスと命名した。陰性対照群マウスには、リン酸緩衝食塩水(PBS, Phospho Buffered Saline)のみを投与した。
【０１３２】
（１）Ｔｈ１喘息の特性確認
続いて、前記マウスで実際にＴｈ１喘息の誘発の有無を確認するために、例１−２および１−３に記載した方法と同様にメタコリンによる気道過敏性（図１５）、ＢＡＬ中の炎症細胞数（図１６）および媒介因子としてのＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０の量（図１７）を例１−２および１−３に記載した方法で測定した。
【０１３３】
図１５は、アレルゲン（卵アルブミンＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した際の、メタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。図１６は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、気管支肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。図１７は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン(ＶＥＧＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＰ−１０)の発現量を示したグラフである。
【０１３４】
図１５に見られるように、ＯＡおよびｄｓＲＮＡによって誘導されたマウスでメタコリン気道過敏性が増加することを確認した。
【０１３５】
図１６に見られるように、前記マウスでリンパ球と好中球、マクロファージ(macrophage)などの細胞の数は増加したが、好酸球の数は増加しないことを確認した。
【０１３６】
図１７に見られるように、前記マウスでは、媒介因子としてＴｈ１反応と関連あるＩＰ−１０だけが格段に増加した。
【０１３７】
前記結果から、卵アルブミンとｄｓＲＮＡによって非好酸球性気道炎症が起きることを確認した。
【０１３８】
また、前記Ｔｈ１喘息がＩＦＮ−γによるものであることを確認するために、気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮ−γならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの量を測定した(図１８および図１９）。図１８は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮ−γ発現量を示したグラフである。図１９は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、血清中のアレルゲン特異抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）の生成量を示したグラフである。
【０１３９】
図１８および図１９に見られるように、気管支肺胞洗浄液中でＩＦＮ−γが３倍以上増加し、血液中のＩｇＧ１とＩｇＧ２の増加も確認された。前記結果から、卵アルブミン抗原とｄｓＲＮＡによって誘発された喘息は、ＩＦＮ−γおよび抗原特異的ＩｇＧ２ａによるものであり、Ｔｈ２喘息で現われることが知られたＩｇＥとは関連がないことが確認された。
【０１４０】
（２）ＣＯＰＤの特性確認
続いて、前記マウスでのＣＯＰＤの誘発の有無を確認するために肺の大きさ、容積およびコラーゲン量を測定した（図２８、図２９および図３０）。図２８は、前記作製されたマウスにおける肺の大きさを示し、図２９は、前記作製されたマウスにおける肺の容積変化を示したグラフである。図３０は、前記作製されたマウスにおける肺線維化の程度を示したグラフである。
【０１４１】
図２８、図２９および図３０に見られるように、Ｔｈ１喘息モデルマウスでそれぞれ肺の大きさ、容積およびコラーゲンの量が顕著に増加しており、ＣＯＰＤの特性を兼ね備えていることを確認した。このような肺の大きさ、容積、コラーゲン量の増加は、肺の組織損傷、肺胞破壊、肺気腫を伴うもので、典型的なＣＯＰＤの特性であり、それは図３１によって確認される。
【０１４２】
図３１のＡは、Ｔｈ１喘息モデルマウスで肺実質組織の破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。図３１に見られるように、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスの肺は、典型的なＣＯＰＤ患者で観察される肺実質細胞の死滅による肺胞面積拡大を確認することができた。
【０１４３】
前記肺の大きさおよび容積増加、肺胞の破壊とともに、コラーゲン量の増加からして、深刻な線維化が招来されたことを確認することができた。
【０１４４】
前記結果から、Ｔｈ１喘息モデルマウスがまた、ＣＯＰＤの病因機序を示すことができるモデルであることを確認することができた。
【０１４５】
例６−２：ＦＧＦ２の投与によるＴｈ１喘息の抑制
ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息においてＦＧＦ２タンパク質による具体的な喘息抑制活性を測定するため下記の実験を遂行した。前記例６−１によって作製されたマウスを、Ｔｈ１喘息実験マウス群と命名した。例６−１で作製されたＴｈ１喘息実験マウスおよび正常マウスに例５と同じ方法でｒＦＧＦ２を投与した。続いて、前記マウスで、メタコリンに対する気道過敏性を例１−２に記載した方法によって測定した。
【０１４６】
図２７は、Ｔｈ１喘息実験マウス群と正常マウス群にｒＦＧＦ２を投与後の、メタコリン濃度に応じた気道過敏性を示したグラフである。
【０１４７】
図２７に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ１喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスにおいて、メタコリンに対する気道過敏性が低いことを確認した。
【０１４８】
図２８は、Ｔｈ１喘息が誘発されたマウスにおいてＦＧＦ２処置をした、およびしていないマウスによる肺の大きさを示した写真である。
【０１４９】
図２８に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ１喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスにおいて肺の大きさが減少することを確認した。
【０１５０】
前記結果は、ＦＧＦ２が、ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスの喘息症状を低減することにより、ＩＦＮ−γによって誘導された喘息の治療に有用に使用できることを示す。
【０１５１】
例６−３：ＦＧＦ２の投与によるＣＯＰＤ抑制
ＦＧＦ２タンパク質のＣＯＰＤ抑制活性を測定するため、下記の実験を遂行した。例６−１で作製されたマウスおよび正常マウスに例５と同じ方法でｒＦＧＦ２を投与した。続いて前記マウスでＣＯＰＤの特徴である肺の大きさ、容積およびコラーゲン量を測定した（図２８、図２９および図３０）。図２８Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ正常肺およびＣＯＰＤマウスモデルでｒＦＧＦを投与した、および投与していない肺を示す。図２９は、図２８の肺の容積を測定したグラフである。図３０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ正常肺およびＣＯＰＤマウスモデルでｒＦＧＦを投与した、および投与していない肺の線維化の程度を示したグラフである。図３１は、ＣＯＰＤ喘息モデルマウスでｒＦＧＦ投与前後の肺実質組織の破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。
【０１５２】
図２８のＣおよびＤそして図２９のＣおよびＤに見られるように、ｒＦＧＦ２の投与で、肺の容積が投与する前と比較して著しく減少することが分かる。図３０のＣおよびＤに見られるように、ｒＦＧＦ２投与後のＣＯＰＤマウスでコラーゲンの量が顕著に減少することを確認した。このような肺の大きさ、容積、コラーゲン量の減少は、ｒＦＧＦ２がＣＯＰＤの治療に効果的に使用できることを示すものであり、これは図３１によって確認される。
【０１５３】
図３１は、ＣＯＰＤマウスで肺実質組織の破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。図３１のＡに見られるように、処置していない肺（Ｂ）の場合、処置したもの（Ａ）と比較して、典型的なＣＯＰＤ患者で観察される肺実質細胞の死滅による肺胞面積拡大を確認することができ、ｒＦＧＦ２の投与がＣＯＰＤの治療に効果的であることが分かる。
【０１５４】
前記結果は、ＣＯＰＤマウスでは、肺の大きさおよび容積増加と肺胞の破壊とともにコラーゲン量が深刻な線維化が招来され、それがＦＧＦ２で治療できることを示すものである。
【０１５５】
例７：ヒトの喘息でのＩＦＮ−γの過剰発現の有無
ヒトの喘息でのＩＦＮ−γの過剰発現の有無と、それが非好酸球性細胞によるものであるかどうかを確認するために下記の実験を遂行した。２１５人の可逆的な気道閉塞を示す成人喘息患者から初日喀痰を分離して、公知の方法によって肺活量測定機(sprimetry)を使用して肺活量を測定した。メタコリン誘発検査(methacholin bronchial challenge)を遂行して肺機能検査を遂行した（図２４）。図２４は、重症喘息患者における、誘発喀痰中の好酸球が陽性の群(Eosinophilic)および陰性の群(Non-eosinophilic)の割合を示したグラフである。図２４に見られるように、成人喘息患者の半分以上は好酸球性というよりは非好酸球性の臨床所見であることを確認した。
【０１５６】
このような喘息を媒介する因子を確認するために、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ遺伝子の量を調査した（図２５）。図２５は、喘息患者の重症度による誘発喀痰中のＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現量を示したグラフである。
【０１５７】
図２５に見られるように、重症喘息患者でＴｈ１喘息と関連があるＩＦＮ−γの発現量が増加したが、Ｔｈ２喘息と関連があるＩＬ−４は変化がないことを確認した。前記結果からヒト、特に重度の喘息を持つ患者でＩＦＮ−γ経路による非好酸球性Ｔｈ１喘息が発生し得ることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明によるＦＧＦ２を有効成分として含む治療剤は、気道線維化、気道炎症、気道過敏性、気道リモデリング、喘息およびＣＯＰＤの治療または予防に有用に使用することができる。また、卵アルブミンおよび二重鎖ＲＮＡを使用して開発された喘息およびＣＯＰＤ動物モデルは、喘息およびＣＯＰＤ治療剤の開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】Ａは、ＩＬ−４過剰発現トランスジェニックマウス群での気道過敏性を示したグラフである。Ｂは、IL-9(-)/IL-13(+/+)、IL-9(-)/IL-13(-/-)、IL-9(+)/IL-13(+/+)およびIL-9(+)/IL-13(-/-)トランスジェニックマウス群での気道過敏性を示したグラフである。
【図２】ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【図３】ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群の気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。
【図４】ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群における、ＶＥＧＦ受容体２の抑制剤であるＳＵ１４９８の投与による気道過敏性を示したグラフである。
【図５】ＦＧＦ２欠損マウス群および正常マウス群の気管支肺胞洗浄液中の血管内皮増殖因子およびＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。
【図６】ＦＧＦ２またはＦＧＦ２およびＶＥＧＦノックアウトマウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【図７】ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【０１６０】
【図８】ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【図９】正常マウスまたはＦＧＦ２欠損マウスにおける、ＴＧＦ−β１投与後の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【図１０】ＦＧＦ２欠損マウス群と正常マウス群の肺組織中のコラーゲン量を示したグラフである。
【図１１】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【図１２】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＩＰ−１０の発現様相を示したグラフである。
【図１３】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の肺組織中のＦＧＦ２の発現を示したアガロースゲル写真である。
【図１４】Ａは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群の気管支肺胞洗浄液中の全細胞（Ｔｏｔａｌ）、マクロファージ（Ｍ）、リンパ球（Ｌ）、好中球（Ｎ）、好酸球（Ｅ）の細胞数を示したグラフである。Ｂは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群のメタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。Ｃは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群の気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＩＰ−１０の発現量を示したグラフである。
【０１６１】
【図１５】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時のメタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。
【図１６】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の気管支肺胞洗浄液中の全細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。
【図１７】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン(ＶＥＧＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＰ−１０)の発現量を示したグラフである。
【図１８】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮ−γの発現量を示したグラフである。
【図１９】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与された時の血清中アレルゲン特異抗体(ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ)生成量を示したグラフである。
【図２０】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）を投与後の、メタコリン濃度による気道過敏性を示したグラフである。
【図２１】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２(rＦＧＦ２)投与した後の、気管支肺胞洗浄液中の全細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。
【図２２】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）投与した後の、気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン（ＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０）の量を示したグラフである。
【図２３】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群の、組換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）投与の有無による肺組織の病理写真である。
【図２４】重症の喘息患者における、誘発喀痰中に好酸球が陽性の群および陰性の群の割合を示したグラフである。
【図２５】喘息患者の重症度による誘発喀痰中のＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現量を示したグラフである。
【０１６２】
【図２６】条件的ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群における、過剰発現誘導物質ドキシサイクリン投与の有無による気管支肺胞洗浄液中の全細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。
【図２７】IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群のメタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。
【図２８】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺の大きさを示した写真である。
【図２９】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺容積の変化を示したグラフである。
【図３０】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺の線維化の程度を示したグラフである。
【図３１】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺実質組織破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、線維芽細胞増殖因子２(Fibroblast Growth Factor-2, FGF2)または塩基性線維芽細胞増殖因子(basic Fibroblast Growth Factor, bFGF)を有効成分として含む喘息(Asthma)および慢性閉塞性肺疾患(Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)の予防または治療剤に関するものである。また、本発明は、卵アルブミン(Ovalbumin, OA)および二重鎖ＲＮＡ(dsRNA)によって誘導されるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤマウス動物モデルに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
この２０年間、喘息の発病率は二倍に増加し、今日、世界人口の８％〜１０％に影響を及ぼしている。喘息は主に、気道の慢性炎症疾患によって生じ、非特異的刺激に対する気道過敏性(Airway HyperResponsiveness, AHR)および気道リモデリングで特徴付けられ、後者は線維芽細胞(Fibroblast)および筋線維芽細胞(myofibroblasts)のような構成成分の構造および機能の変化を伴う。喘息の種類には、気管支喘息、心臓性喘息等があり、単純に喘息と言えば気管支喘息を意味する。
【０００３】
喘息と共に代表的な肺疾患の一つである慢性閉塞性肺疾患は、非可逆的な気道の閉塞を伴うという点で喘息とは異なり、現在世界の死亡率の４位を占めていて、１０大疾患中で唯一その発病率が増加している重要な疾患である。ＣＯＰＤは、気道および肺実質の炎症による細気管支および肺実質の病理学的変化によって発生する病気で、閉塞性細気管支炎および肺気腫(肺実質破壊)を特徴とする。慢性閉塞性肺疾患の種類には、慢性閉塞性気管支炎(Chronic obstructive bronchitis)、慢性細気管支炎(Chronic bronchiolitis)および肺気腫(Emphysema)がある。
【０００４】
このような喘息および慢性閉塞性肺疾患を治療する従来の方法は、抗炎症作用を持つ治療剤や気管支拡張効果を持つ治療剤を使用するものである。前記抗炎症作用を持つ代表的な治療剤には、グルココルチコイド(glucocorticoid)、ロイコトリエンモディファイアー(leukotriene modifiers)、テオフィリン(theophylline)等がある。
【０００５】
しかし、前記グルココルチコイドは効果面では強力であるが、薬物副作用が問題となるため吸入治療を必要とし、治療効果も選択的に作用するのではなく、すべての免疫反応と抗炎症反応を抑制するため、場合によっては必要な免疫反応まで抑制する問題点がある。前記ロイコトリエンモディファイアーは、副作用は少ないが効果面で限界があり、単独使用時には喘息を調節することができない。したがって、大部分補助的に使用しているという問題点がある。前記テオフィリンは効果面でも優秀ではなく、副作用の心配があるという問題点がある。
【０００６】
したがって、効果が優秀で副作用が少ない治療剤の開発が切実に求められており、それのためには喘息の発生機序に対する正確な理解が必要である。
【０００７】
これと関連して、喘息発生においてタイプ１のヘルパーＴ細胞(type1 helper T cells, Th1)またはタイプ２のヘルパーＴ細胞(type2 helper T cells, Th2)が分泌するサイトカインが重要な役割をし、Ｔｈ１とＴｈ２によって分泌されるサイトカイン間の不均衡によって喘息が誘発されるということが従来の一般的な仮説であるが(Ｔｈ１／Ｔｈ２仮説)(Mosmann等, J. Immunol., 1986年, 第136巻, 2348〜57頁; Robinson等, N. Engl. J. Med., 1992年, 第326巻, 298〜304頁; Grunig等, Science, 1998年, 第282巻, 2261〜3頁; Richter等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2001年,第25巻,385〜91頁)、それに関する詳しい機序は、明らかにされていない。
【０００８】
Ｔｈ２細胞によって生産されるサイトカインの中で、特にインターロイキン１３(Interleukin-13, IL-13)が喘息の発生機序において重要なものであると考えられている(Grunig 等, Science, 1998年, 第282巻, 2261〜3)。それは、次の報告によって裏付される。アレルギー性喘息動物モデルにおいて、ＩＬ−１３を遮断した時、アレルゲンによる気道過敏性が抑制され、再び組換えＩＬ−１３を気道内に投与した時、気道過敏性が誘導され(Marsha等, Science, 1998年, 第282巻，2258〜2261)、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウスで見られる組織所見は、喘息患者に見られるものと類似しており、過剰発現したＩＬ−１３が気道の炎症、粘液分泌の増加、上皮細胞線維化等を誘導する(Zhu等, J. Clin. Invest., 1999年，第103巻，779〜788頁)。
【０００９】
一方、ＩＬ−１３は好酸球(eosinophils)のような炎症細胞の浸潤を増進させてＡＨＲを促進すると報告されたが(Hargreave等, J. Allergy clin. Immunol., 1986年， 第78巻，825〜-32頁)、最近では、ＩＬ−１３による気道過敏性の誘導が好酸球の浸潤と関係なく起きるという証拠が提示されている(Venkayya等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2002年，第26巻，202〜8頁)。
【００１０】
このようなＩＬ−１３による喘息は、形質転換増殖因子β１(Transforming Growth Factor β1, TGF-β1)または血管内皮増殖因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)を通じて発生することが知られている(Lee等, Nat. Med., 2004年，第10巻，1095〜1103頁)。
【００１１】
ＴＧＦ−β１は、組織損傷後の傷部を治療する最も重要な物質で、気道リモデリングの重要な病理学的変化である組織線維化を誘導する。すなわち、線維芽細胞を筋線維芽細胞に変化させて、筋線維芽細胞は休止線維芽細胞(resting fibroblasts)よりコラーゲンをさらに多量に分泌させて組織線維化を通じた気道リモデリングを誘発する(Vignola等, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1997年，第156巻，591〜599頁)。これは、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウスが主にＴＧＦ−β１依存的な経路を通じて肺の線維化を誘導するという報告と一致するものである(Lee等, J. Exp. Med., 2001年，第194巻，809〜21頁)。
【００１２】
前記の組織線維化過程で、ＴＧＦ−β１は線維芽細胞増殖因子２または塩基性線維芽細胞増殖因子およびその受容体であるＦＧＦレセプター１（ＦＧＦＲ１）またはＦＧＦレセプター２（ＦＧＦＲ２）を誘導するものとして報告された。このようなＦＧＦ２は、従来から内皮細胞または平滑筋細胞の増殖に関与し、血管新生に重要な役割を果たすことが知られていたが(Nugent等, Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000年，第32巻，115〜20頁)、気道過敏性と喘息の発病におけるＦＧＦ２の役割については、現在まで全く知られていない状態であった。
【００１３】
血管内皮増殖因子は、毛細管で血漿タンパク質の透過を増加させるサイトカインの一種で、細胞の分裂と移動を促進して細胞の再構成を起こすタンパク質分解酵素を誘導する機能をする。また、アポトーシスの抑制を通じた新しく形成された血管の生存の維持、神経抗原の抑制による免疫調節、および細胞の成長および分裂の誘導に関与する。本発明者らは、抗原および異物に対する免疫反応において、ＩＬ−１３とＶＥＧＦが互いに陽性のフィードバックループを形成することができることをすでに明らかにした(Lee等, Nat. Med., 2004年，第10巻，1095〜1103頁)。ＶＥＧＦを通じた喘息の発生においても、ＦＧＦ２の役割は現在まで全く知られていない状態である。
【００１４】
次に、喘息の発生と関連して論議される他の機序は、Ｔｈ１が分泌するサイトカインであるインターフェロンガンマ(Interferon-γ, IFN-γ)によるものである。ＩＦＮ−γは、病原体に対する防御機序でＴｈ１細胞から分泌される物質で(Fong等, J. Imunol., 1989年，第143巻，2887〜93頁)、Ｔｈ２によるサイトカインの生産を阻害するものとして知られてきた(Mosann等, J. Immunol., 1986年，第136巻，2348〜57頁)。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２仮説によれば、ＩＦＮ−γがそれによって発生する喘息を抑制することができるものと考えられた。しかし、このような理論に対する見解はするどく対立しており、反対意見は、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスでも喘息と類似の気道リモデリングが観察され(Wang等, J. Exp. Med., 2000年，第192巻，1587〜1600頁)、特に喘息患者の重篤度とＩＦＮ−γの増加が有意な相関関係を持つという多くの報告によって裏付される(Corrogan等, Lancet 1988年，第1巻，1129〜32頁; Mognan等, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2000年，第161巻，1790〜6頁)。
【００１５】
同時に、前記反対意見は、喘息治療剤に現在最も広く使用されているコルチコステロイド(corticosteroids)、ベータ２刺激剤(β2-adrenergic agonists)およびメチルキサンチン系薬物(Methylxanthine derivatives)等の薬理作用が、免疫学的な面ではＴｈ２免疫反応を抑制するよりむしろＴｈ１免疫反応を抑制するという事実によっても裏付される。したがって、Ｔｈ１／Ｔｈ２仮説によるＴｈ２免疫反応の増進により喘息の発病機序を説明することには限界がある。
【００１６】
一方、ＣＯＰＤに関して現在まで正確な発生機序はほとんど知られておらず、様々な治療方法が使用されているが、発病および進行を根本的に治療することができる薬剤は存在しないのが実情である。したがって、ＣＯＰＤの病因機序研究および、それを根拠にした根本的薬剤開発が切望されているのが実情である。
【００１７】
しかし、最近のトランスジェニックマウスを使用した研究結果を詳しく見てみると、喘息の発生に関与することが明らかにされたＩＦＮ−γ(Wang等, J. Exp. Med., 2000年，第192巻，1587〜1600頁)およびＩＬ−１３(Zheng等, J. Clin. Invest., 2000年，第106巻，1081〜93頁)が、ヒトのＣＯＰＤと類似の病理所見を導き出すことができる物質として注目されている。先に言及したように、このようなサイトカインは、主に免疫細胞で分泌されるもので、ＣＯＰＤの病因機序において免疫反応の役割が非常に重要であることを示唆している。免疫細胞から分泌されるＩＦＮ−γおよびＩＬ−１３は、ＣＯＰＤの主要症状である気道および肺実質の炎症反応において攻撃因子として主な役割を果たし、このような炎症反応による組織損傷等を治癒する過程での防御因子と攻撃因子とのバランスが、気道および肺胞上皮細胞の再生過程において特に重要である(Lee等, J. Exp. Med., 2004年，第200巻，377〜89頁)。この過程で攻撃因子が強過ぎたりそれを治癒する防御因子が過剰に不足する状況で、ＣＯＰＤが発生し得ることが考えられる。
【００１８】
以上のことに鑑みて本発明者らは、ＦＧＦ２の喘息発生およびＣＯＰＤ発生における、ＩＬ−１３、ＴＧＦ−β１、ＶＥＧＦおよびＩＦＮ−γに関連した新しい役割を解明して、ＦＧＦ２がインターロイキン−１３によって誘導される血管内皮増殖因子による気道の気道過敏性を抑制することにより気道過敏性を低減し、インターフェロンガンマによる気道過敏性、気道および肺実質の炎症による肺気腫を抑制することを確認することにより、ＦＧＦ２が喘息およびＣＯＰＤの治療または予防に有用に使用できることを確認した。
【００１９】
また、卵アルブミンおよび二重鎖ＲＮＡを使用して、喘息およびＣＯＰＤモデルを開発し、喘息およびＣＯＰＤ治療剤開発において効率的な実験遂行を可能にする、Ｔｈ１喘息およびＣＯＰＤ動物モデルを確立することによって本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、線維芽細胞増殖因子２または塩基性線維芽細胞増殖因子を有効成分として含む喘息および慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供するものである。また、本発明は、アレルゲンとして卵アルブミン(OAlbumin, OA)および二重鎖ＲＮＡによって誘導されるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤマウス動物モデルを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息予防または治療剤を提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記喘息がＩＬ−１３の過剰発現によって誘発されることを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２３】
本発明はまた、前記喘息がＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記ＦＧＦ２がＩＬ−１３の活性を抑制することを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記ＦＧＦ２が血管内皮増殖因子の活性を抑制することを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記ＦＧＦ２がＴＧＦ−β１の活性を抑制することを特徴とする、喘息予防または治療剤を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ＦＧＦ２を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供する。
【００２８】
本発明はまた、前記慢性閉塞性肺疾患がＩＦＮ−γの過剰発現によって誘導されることを特徴とする、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供する。
【００２９】
本発明はまた、卵アルブミンを含むアレルゲンおよび二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与することを含む、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、前記動物がマウスである、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３１】
本発明はまた、前記製造方法が下記の工程を含む、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３２】
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５〜１５μｇの二重鎖ＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸(polyinosinic-polycytidylic acid)および５０〜１００μｇの卵アルブミンを4回鼻腔に投与して感作する工程、
（２）１０日後、２５〜７５μｇの卵アルブミンを鼻腔に感作する工程。
【００３３】
本発明はまた、前記工程（１）の感作する二重鎖ＲＮＡが１０μｇで使用される、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３４】
本発明はまた、前記工程（１）の感作する卵アルブミンが、７５μｇの卵アルブミンであり、工程（２）の１０日後、５０μｇの卵アルブミンを使用する、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３５】
本発明はまた、前記喘息が非好酸球性であることを特徴とする、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法を提供する。
【００３６】
本発明はまた、前記方法によって製造された、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルを提供する。
【００３７】
本発明はまた、前記動物がマウスである、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルを提供する。
【００３８】
本発明はまた、ＦＧＦ２を有効成分として含むＩＬ−１３、ＶＥＧＦまたはＴＧＦ−β１活性抑制剤を提供する。
【００３９】
本発明はまた、ＦＧＦ２を有効成分として含む気道線維化、気道炎症、気道過敏性または気道リモデリング抑制剤を提供する。
【００４０】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明は、ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息の治療または予防用製薬組成物を提供する。前記喘息が、ＩＬ−１３またはＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする喘息予防または治療剤を提供する。前記ＦＧＦ２が、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子、またはＴＧＦ−β１の活性を抑制することを特徴とする喘息予防または治療剤を提供する。
【００４１】
喘息とは、気管支喘息、心臓性喘息等を含み、好ましくは気管支喘息を意味する。喘息の特徴的症状は、気道過敏性および気道リモデリングである。
【００４２】
気道リモデリングは、遺伝的素因がある人において、アレルギー抗原、感染、または刺激剤等によって免疫反応が増加して起きるようになり、Ｔ細胞が細胞間の情報交換物質であるサイトカインを分泌するようになり、分泌されたサイトカインは炎症細胞を組織内に移動させて気道の慢性的な炎症を繰り返し誘発し、結局気道がリモデリングされるものである。
【００４３】
気道過敏性は、喘息発生の主要因子であると考えられ、それが他の呼吸器疾患と区別される点である。しかし、このような気道過敏性症状は、気道リモデリングの特徴である気道平滑筋増殖症(airway smooth muscle hyperplasia)、収縮性(contractility)および上皮下および肺柔組織線維化等を伴う。よって、気道炎症、気道過敏性および気道リモデリングは、お互いに密接不可分の関係があり、一症状の治療が別の症状の治療を伴うことがあり、一つの治療剤で気道炎症、気道過敏性および気道リモデリングのすべてを治療することができる。
【００４４】
このような特徴を持つ喘息の経路と関連して、古典的によく知られた代表的なＴｈ２サイトカインＩＬ−４を過剰発現するトランスジェニックマウス(IL-4 TG(+))は、正常マウス(WT)と比較した時、気道過敏性に差がなかったが（図１Ａ）、一方Ｔｈ２サイトカインであるＩＬ−９過剰発現トランスジェニックマウス(IL-9(+)/IL-13(+/+))の場合、正常マウスに比較して気道過敏性が増加しているが、ＩＬ−１３遺伝子を除去した場合(IL-9(+)/IL-13(-/-))気道過敏性が消えるという事実によって、ＩＬ−９過剰発現による喘息がＩＬ−１３を通じて媒介されることが裏付けされる（図１Ｂ参照）。
【００４５】
これを証明するために、ＩＬ−１３を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製して気道過敏性、ＩＬ−１３によって過剰発現されることが知られたＴＧＦ−β１とＶＥＧＦとの関係を評価した時、平均的にＩＬ−１３を過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて、気道過敏性が正常マウスに比較して増加していることが分かる（図２参照）。
【００４６】
また、ＩＬ−１３過剰発現されたトランスジェニックマウスの気管支肺胞洗浄液(bronchoalveolar lavage, BAL)において、ＴＧＦ−β１とＶＥＧＦの生成が増加した（図３参照）。このような結果はまた、ＩＬ−１３による気道過敏性が下流の物質であるＴＧＦ−β１とＶＥＧＦとによって調節されることを意味する。
【００４７】
さらに、ＩＬ−１３経路による気道過敏性が下流でＶＥＧＦによって調節されるということは、受容体２の信号伝達遮断剤(signaling blocker)であるＳＵ１４９８を使用してＩＬ−１３によって誘導される気道過敏性が阻害されることを確認して証明された（図４参照）。
【００４８】
さらに、前記のようなＩＬ−１３経路による喘息において、ＦＧＦ２の役割は解明されていない状態であり、本発明者らはＦＧＦ２がＩＬ−１３によって誘導されるＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１を通じた喘息の症状の治療に効果的であることを確認した。
【００４９】
ＦＧＦ２欠損マウスを使用してＦＧＦ２が遮断されると正常マウスに比較してＶＥＧＦの量が増加することを観察した（図５参照）。したがって、気道過敏性も増加することを確認した（図６参照）。これは、ＦＧＦ２欠損マウスにおいてＶＥＧＦを同時に遮断した場合、気道過敏性が抑制されるという実験結果（図６参照）と一致するものである。
【００５０】
これは、ＦＧＦ２が、ＩＬ−１３からのＶＥＧＦを介した喘息の治療に効果的であることを示すもので、下記の結果から証明される。
【００５１】
ＩＬ−１３が主要媒介物として作用するＴｈ２喘息モデルにおいて、ＦＧＦ２を投与した後その効果を測定した結果、ＦＧＦ２はメタコリンに対する気道過敏性を低減し（図２０参照）、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数を減少させ（図２１参照）、Ｔｈ２喘息の重要な媒介因子であるＩＬ−１３およびＶＥＧＦの発現を抑制することを観察した（図２２参照）。また、組織学的検査の結果、ＦＧＦ２によって肺気管支壁の肥厚および閉塞が減少して、肺組織が正常と類似したものになることを確認した（図２３参照）。前記結果から、ＦＧＦ２がＶＥＧＦおよびＩＬ−１３の生成を阻害して気道過敏性と炎症を抑制し、喘息の治療に効果的に使用できることが分かった。
【００５２】
ＩＬ−１３喘息経路の別の下流物質であるＴＧＦ−β１と関連して、以前にＴＧＦ−β１で形質転換されたマウスで肺気管支の気道リモデリングが観察され(Lee等, J. Exp. Med., 2004年，第200巻，377〜389頁)、ＩＬ−１３によって誘導される肺気管支の線維化は 、ＴＧＦ−β１に依存性であることが報告された(Lee等, J. Exp. Med. 2001年，第194巻，809〜821頁)。ＴＧＦ−β１で形質転換されたマウスにおいて、ＴＧＦ−β１によって気道の抵抗力と気道閉塞が重度に誘導され（図７参照）、メタコリンによる気道過敏性は抑制されることを観察した（図８参照）。
【００５３】
このようなＴＧＦ−β１を通じたＩＬ−１３経路による喘息において、ＦＧＦ２の役割解明のためにＦＧＦ２を欠損させたマウスで気道過敏性を測定して比較した結果、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少効果がＦＧＦ２欠損マウスでは現われないことを確認することができた（図９参照）。前記結果は、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少が、ＴＧＦ−β１自体によるものであるというよりは、ＴＧＦ−β１と一緒に発現されるＦＧＦ２に起因するものであることを示す。すなわち、ＦＧＦ２が存在する状態でのＴＧＦ−β１の増加は気道過敏性を低減するが、ＦＧＦ２が存在しない状態では、ＴＧＦ−β１にかかわらず気道過敏性が増加することが分かる。
【００５４】
以上の実験結果からＦＧＦ２の役割を叙述すると、気道の組織が損傷を被れば免疫システムが作動して、ＴＧＦ−β１によって気道平滑筋細胞と線維芽細胞とが筋線維芽細胞に変換され、変換された筋線維芽細胞によって線維症が誘発される。この時、ＴＧＦ−β１によって減少した気道平滑筋細胞および線維芽細胞の細胞数を補うために、ＦＧＦ２は、気道平滑筋細胞および線維芽細胞を増殖させると同時に、前記筋線維芽細胞の気道平滑筋細胞および線維芽細胞への変換を誘導する。したがって、ＦＧＦ２は筋線維芽細胞を線維芽細胞に変化させて筋線維芽細胞の細胞数を減らして気道リモデリングを低減し、同時に気道過敏性を低減する役割を果たすということが分かる。
【００５５】
このようなＦＧＦ２による気道リモデリングの抑制を説明するために、ＦＧＦ２欠損マウスでコラーゲン量と気道過敏性を測定した結果、ＦＧＦ２欠損マウスの肺では、コラーゲンを分泌する線維芽細胞の数が正常実験マウスに比較して相対的に少なかった（図１０参照）。これは、ＦＧＦ２による線維芽細胞の増殖が行われずに細胞数が少なくなり、それにより線維芽細胞から分泌されるコラーゲンの量が少なくなったことを示している。また、メタコリンによる気道過敏性を測定した結果、ＦＧＦ２が正常に存在する正常マウスは気道過敏性に大きな影響を受けないのに比べて、ＦＧＦ２が欠損した場合、気道過敏性が大幅に増大することを観察した（図９参照）。前記の結果は、ＩＬ−１３からＴＧＦ−β１に至る経路においてＦＧＦ２が欠損すると線維芽細胞の増殖および筋線維細胞から線維芽細胞への変換が成立せず、気道リモデリングが進行してメタコリン反応に強い線維芽細胞の数が減少し、気道過敏性が増大したと解釈される。よって、これは、ＦＧＦ２がＩＬ−１３からＴＧＦ−β１への経路による喘息の治療にも効果的に使用できることを示すものである。
【００５６】
以前のＩＬ−１３を通じた喘息の経路以外に、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γも喘息の発生に重要であるという見方が台頭してきている。Ｔｈ１から分泌されるサイトカイン、特にＩＦＮ−γは、喘息と深い関係があることが多くの研究から明らかにされている。このようなＴｈ１の活性化によって進行する喘息モデルはまだ存在しない。これは、既存の喘息研究の大部分が、Ｔｈ２の活性化によって喘息が発生するというＴｈ１／Ｔｈ２理論に焦点を合わせていたため、好酸球や免疫グロブリンＥ(Immunoglobulin E, IgE)が過剰発現され得る喘息モデルのみを作製し、使用したためである。
【００５７】
しかし最近、好酸球性炎症がなくても気道過敏性が誘導され得る(Venkayya R, Am J Respir Cell Mol Biol 2002年，第26巻，202〜8頁)、非好酸球性喘息患者が喘息患者全体の過半数であるという研究結果等が報告されている(Douwes等, Thorax, 2002年，第57巻，643〜8頁)。したがって、既存の仮説を飛び越えて、Ｔｈ１タイプの喘息モデル製造およびそれを使用した研究が至急な実情である。
【００５８】
そこで本発明者らは、ＩＦＮ−γによって誘導されたＴｈ１喘息およびＣＯＰＤ動物モデルを作出し、これによりＦＧＦ２の役割を解明してＦＧＦ２がＩＦＮ−γによる喘息およびＣＯＰＤの治療にも有用であることを発見した。
【００５９】
したがって、本発明は、ＦＧＦ２を有効成分として含む喘息の予防または治療剤以外に、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤を提供する。前記慢性閉塞性肺疾患は、ＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発され得る。
【００６０】
まず、ＩＦＮ−γによる喘息でのＩＦＮ−γとＦＧＦ２との関係を解明するために、ＩＦＮ−γにより形質転換されたマウスの肺からＦＧＦ２の発現をＲＴ‐ＰＣＲを使用して測定した結果、正常マウスと対照的にＦＧＦ２の発現が著しく阻害されていることを観察した（図１３参照）。前記結果は、ＦＧＦ２がＩＦＮ−γシグナリング経路によってその発現が抑制されることを意味する。
【００６１】
一方、ＩＦＮ−γによって誘導される気道炎症および気道過敏性からＦＧＦ２の役割を詳しくみてみる。ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス(IFN-γ(+)/FGF2(+/+))にＦＧＦ２遺伝子欠損を誘導して気道過敏性を測定した。ＢＡＬ中の炎症細胞数、および炎症関連サイトカインの発現量を測定した。その結果、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスで、ＦＧＦ２遺伝子欠損の時(IFN-γ(+)/FGF2(-/-))、気道過敏性および炎症が顕著に増加することを観察した（図１４Ａ、Ｂ参照）。このようなＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスでの、ＦＧＦ２欠損による気道過敏性および炎症の増加において、ＶＥＧＦの増加が重要な役割を果たすと考えられる（図１４Ｃ参照）。前記結果は、ＩＦＮ−γによって誘導される気道炎症および気道過敏性もまた、ＦＧＦ２で有用に治療可能であることを示している。
【００６２】
ＩＦＮ−γが主に媒介物として作用するＴｈ１喘息モデルにおいて、ＦＧＦ２の活性を測定した結果、ＦＧＦ２はメタコリンに対する気道過敏性を低減する（図２７参照）。前記結果から、ＦＧＦ２がＩＦＮ−γ経路を通じた喘息の治療に有用に使用できることが分かる。
【００６３】
続いて、ＦＧＦ２を前記Ｔｈ１喘息およびＣＯＰＤマウスに投与して治療効果を測定した。
【００６４】
ＦＧＦ２処置時に、前記マウスでは、ＢＡＬ内の炎症細胞数（図２６参照）およびメタコリンに対する気道過敏性（図３６参照）が減少した。
【００６５】
さらに前記マウスは、気道過敏性以外にＣＯＰＤの症状である肺実質細胞のアポトーシスを誘発する。このような気道過敏性と肺実質細胞のアポトーシスは、ＦＧＦ２の有無によって影響を受ける。ＩＦＮ−γが過剰発現された実験マウスにおいて、ＦＧＦ２を投与すると気道過敏性が低減し（図２７参照）、ＩＦＮ−γによって誘導される肺実質細胞の破壊もＦＧＦ２の投与によって減少する（図２８および図２９参照）。また、ＩＦＮ−γによる組織損傷および肺胞破壊または肺気腫もやはりＦＧＦ２の投与によって減少する（図３０および図３１参照）。
【００６６】
以上で詳しく見たように、喘息およびＣＯＰＤにおいて増殖因子として知られたＦＧＦ２が、むしろ気道過敏性を低減させて肺胞破壊を抑制し、喘息およびＣＯＰＤの治療または予防剤としての効果があることが分かる。
【００６７】
一方、本発明のＦＧＦ２を有効成分として含む喘息またはＣＯＰＤの予防または治療剤は、組成物総重量に対して前記有効成分を０．０００１〜５０重量％含むことができる。
【００６８】
本発明の治療剤は、前記有効成分に同様または類似の機能を示す有効成分をさらに１種以上含むことができる。
【００６９】
本発明の治療剤は、投与のために、前記有効成分以外に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んで製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体としては、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコール、リポソームおよびこれら成分の中から１成分以上を混合して使用することができ、必要によって抗酸化剤、緩衝液、静菌剤等他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液等のような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができ、標的器官に特異的に作用するように標的器官特異的抗体またはその他のリガンドを前記担体と結合させて使用することができる。さらに当該技術分野の適正な方法でまたはレミングトンの文献(Remington's Pharmaceutical Science(最新版)、Mack Publishing Company, Easton PA)に開示されている方法を使用して、各疾患に応じてまたは成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００７０】
本発明の治療剤の投与方法は、特別にこれに制限されるものではないが、目的と方法に応じて非経口投与(例えば静脈内、皮下、腹腔内、局所または鼻腔に適用)したり経口投与することができ、非経口投与が好ましく、鼻腔投与が好ましい。投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度等によってその範囲が多様である。
【００７１】
一日投与量は、化合物の場合約０．００５〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１ｍｇ／ｋｇであり、一日一回〜数回に分けて投与することがさらに好ましい。
【００７２】
本発明の治療剤は、治療のために単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を使用する方法等と併用して使用することができる。
【００７３】
本発明のＦＧＦ２をマウスの鼻腔内に投与して毒性実験を遂行した結果、毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）が少なくとも１，０００ｍｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。
【００７４】
さらに、本発明は卵アルブミンを含むアレルゲンおよび二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与することを含む、Ｔｈ１喘息またはＣＯＰＤ動物モデルの製造方法を提供する。
【００７５】
前記の方法は、下記の工程を含む。
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５〜１５μｇの二重鎖ＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸および５０〜１５０μｇの卵アルブミンを４回鼻腔に投与する感作工程、および
（２）１０日後に２５〜７５μｇの卵アルブミンを鼻腔に感作する工程。
【００７６】
前記工程（１）の感作する二重鎖ＲＮＡは、１０μｇで使用することが好ましい。前記工程（１）の卵アルブミンは、７５μｇで使用するのが好ましい。前記工程（２）の１０日後に使用する卵アルブミンは、５０μｇで使用するのが好ましい。
【００７７】
前記喘息は、非好酸球性であり得る。
【００７８】
さらに本発明は、前記方法によって製造されたＴｈ１喘息またはＣＯＰＤ動物モデルを提供する。
【００７９】
前記の動物は、実験用に使用されるすべての哺乳類に属する動物を含み、好ましくはマウスである。
【００８０】
Ｔｈ１喘息またはＣＯＰＤ動物モデルの作製と関連して、ウイルスの複製工程で生成される二重鎖ＲＮＡ(double-stranded RNA, dsRNA)は、生体内で抗ウイルス活性を示す１型(type1)インターフェロン(IFN)であるＩＦＮ‐α、ＩＦＮ‐βを強力に誘導することが知られている(Guidotti等, Annu. Rev. Immunol., 2001年，第19巻，65〜91頁)。そして、このような１型インターフェロンは、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γの生成を促進する一方、樹枝状細胞の成熟とＴ細胞の初回抗原刺激(priming)を増進させて獲得免疫反応を誘導できることが知られている(Londhe等, FEBS Lett., 2003年，第553巻，33〜8頁)。したがって、本発明者らは、ｄｓＲＮＡで処置してＴｈ１経路によって喘息が誘発された動物モデルを作製した。
【００８１】
動物モデルの作製に使用するｄｓＲＮＡの具体的配列および長さは、Ｔｈ１喘息を誘導する限り制限はなく、市販の物を購入して使用することができるが、好ましくはポリイノシンポリシチジン酸(polyI:C)である。
【００８２】
前記Ｔｈ１経路によって喘息が誘発されたマウスは、気道過敏性が増加することを確認し（図１５参照）、リンパ球、好中球およびマクロファージなどの細胞数は増加したが好酸球数は増加しないことを観察した。媒介因子では、Ｔｈ１反応と関連のあるＩＰ−１０だけが格段に増加した（図１６および図１７参照）。前記結果は、ＯＡおよびｄｓＲＮＡによって非好酸球性気道炎症(non-eosinophilic airway inflammation)が誘導されたことを意味する。また、肺気管支洗浄液におけるＩＦＮ−γの増加と、血液中の抗原特異的ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の増加とを確認した（図１８および図１９参照）。これにより、ＯＡおよびｄｓＲＮＡによる気道感作は、ＩＦＮ−γと抗原特異的ＩｇＧ２ａによるものであり、抗原特異的ＩｇＥとは関連がないと見られ、Ｔｈ１動物モデルの確立を確認した。
【００８３】
同時に、前記動物モデルはまた、ＣＯＰＤの症状を示し、すなわち肺の大きさおよび容積増加と肺胞の破壊とともに、コラーゲン量の増加から深刻な線維化が招来されたことを確認することができた（図２８〜３１参照）。
【００８４】
前記結果から、Ｔｈ１喘息モデルマウスがまた、ＣＯＰＤの病因機序を示すことができるモデルであることを確認することができた。
【００８５】
したがって、アレルゲン(卵アルブミン、ＯＡ)および二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与して作製した本発明のモデルが、Ｔｈ１または非好酸球性喘息動物モデルであることを確認し、喘息およびＣＯＰＤモデルを開発して喘息およびＣＯＰＤ治療剤開発において効率的な実験遂行に有用に使用できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８６】
以下、本発明を例によってより詳しく説明する。
但し、下記の例は本発明を例示するだけのものであり、本発明の内容が下記の例によって限定されるものではない。
【００８７】
例１：ＩＬ−１３過剰発現による喘息の発生およびＶＥＧＦとＴＧＦ−β１との関連性
ＩＬ−１３による喘息の発生を調査するためにＩＬ−１３が過剰発現されたトランスジェニックマウスを作製して、このマウスでの気道過敏性を測定して、前記マウスでＩＬ−１３の過剰発現がＴＧＦ−β１およびＶＥＧＦの発現に及ぼす影響を調査した。
【００８８】
例１−１：ＩＬ−１３トランスジェニックマウスの作製
ＩＬ−１３を過剰発現するトランスジェニックマウスを以前に記述されたとおり作製した(Zhou Zhu 等, J. Clin. Invest., 1999年，第103巻，779〜788頁; Tang等, J. Clin. Invest., 1996年，第98巻，2845〜2853頁; Ray等, J. Clin. Invest., 1997年，第l00巻，2501〜2511頁)。要約すると、ＩＬ−１３の候補遺伝子を気道に選択的に発現させるために、抗炎症呼吸器細胞の一つのクララ(Clara)細胞１０ｋＤａタンパク質（ＣＣ１０）の発現を誘導するプロモーター(University of CincinnatiのB. StrippおよびJ. Whitsett)に連結したＩＬ−１３候補遺伝子を含むコンストラクトを使用した。マウス内に導入された遺伝子発現を外部から調節することができる誘導性トランスジェニックマウスの作製のために、ＣＣ１０プロモーターにリバーステトラサイクリントランス活性化因子(reverse tetracycline transactivator, rtTA)とヒト成長ホルモン(human growth hormone, hGH)遺伝子とを作動可能に連結してpKS-CC10-rtTA-hGHを準備した(Ray等, J. Clin. Invest., 1997年，第98巻，2501〜2511頁)。Elutip-Dカラム(Schleicher and Schuell Inc, 米国)で前記プラスミドＤＮＡを精製し、微細注入バッファー(０．５ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ、２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５)で透析した。続いて前記文献による前核内注入法を使用して、ＣＢＡマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウスを交配させて得たＦ２卵に前記プラスミドＤＮＡを注入して前記文献に記載された方法によってトランスジェニックマウスを作製した。すべてのトランスジェニックマウスは、トランスジェニックマウスと正常マウスに無作為に０．５ｍｇ／ｍｌドキシサイクリン(doxycycline, dox)が含まれた水を飲ませた後、それぞれのマウスから得た気管支肺胞洗浄液でＩＬ−１３タンパク質の数値を評価して形質転換の有無を評価した。
【００８９】
例１−２：ＩＬ−１３が過剰発現されたトランスジェニックマウスでの気道過敏性の測定
ＩＬ−１３によって形質転換されたマウスでの喘息発生の有無を確認するために、喘息の代表的症状である気道過敏性を下記のように測定した。気道過敏性は、当該技術分野で公知の慣用の方法によって、ＤＲＳ(dose response slope)(Pediatric Allergy and Immunology, 2003年，第14巻，193頁)およびＰｅｎｈ(Mckinley等, Clinical & Experimental Immunology, 2004年，第136巻，224〜231頁)で測定することができる。Ｐｅｎｈ(enhanced pause, Penh)は、最大呼気圧(peak expiratory pressure, PEP)を最大吸気圧(peak inspiratory pressure, PIP)で割った値にポーズ(pause)を掛けて得た値を求めて得ることができる。具体的には、例１−１の形質転換されたマウスを、再感作の２４時間後および４８時間後に、メタコリンを３分間噴霧して気道過敏性を誘導し、動物用体容積変動記録機(Whole body plethysmography)を使用して、最大呼気圧および最大吸気圧を１０秒単位で３分間測定し、３分間を平均してデータで示した（図２）。図２は、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示した結果である。
【００９０】
図２に見られるように、全般的にＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウスでは、気道過敏性が正常マウスに比較して増加したことが分かる。
【００９１】
例１−３：トランスジェニックマウスでのＩＬ−１３の過剰発現がＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１の発現に及ぼす影響
ＩＬ−１３の過剰発現によって誘導された気道過敏性と、ＩＬ−１３シグナリング経路の下流に存在することが知られたＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１との関連性を調査するために下記の実験を遂行した。例１−１で作製したマウスの気道にＳＰ４５管(tube)を導管(cannulation)し、０．１％ＢＳＡと０．０５ｍＭ ＥＤＴＡとを含んだ滅菌生理食塩水で洗浄して得た気管支肺胞洗浄液を遠心分離した。採取したＢＡＬ上清において、ＥＬＩＳＡキット(CalBiotech, 米国)を使用してＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１タンパク質の発現量を測定した（図３）。図３は、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群で気管支肺胞洗浄液に存在するＶＥＧＦとＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。
【００９２】
図３に見られるように、ＩＬ−１３の過剰発現によって気道過敏性が誘発されたトランスジェニックマウス由来のＢＡＬにおいて、ＴＧＦ−β１およびＶＥＧＦの生成が増加することを確認した。このような結果は、ＩＬ−１３による気道過敏性が下流の物質であるＴＧＦ−β１とＶＥＧＦとによって調節されることを示唆し、これは次の例１−４の結果によって証明される。
【００９３】
例１−４：ＶＥＧＦの遮断剤による気道過敏性の抑制
前記例１−３の効果を確認するために、ＶＥＧＦ受容体２の信号伝達経路遮断剤(signaling blocker)であるＳＵ１４９８(EMD Biosciece, 米国)を前記例１−１で作製したマウスの腹腔に毎日一回ずつ１０ｍｇ／ｋｇの量で注射した（図４）。図４は、ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群における、ＶＥＧＦ受容体２の抑制剤であるＳＵ１４９８の投与による気道過敏性を示したグラフである。
【００９４】
図４に見られるように、ＩＬ−１３の過剰発現によって誘導される気道過敏性がＶＥＧＦ受容体２の信号伝達経路遮断剤によって抑制され、ＩＬ−１３によって誘導される気道過敏性がＶＥＧＦを介した信号伝達によるものであることを確認することができた。
【００９５】
例２：ＩＬ−１３によって誘発された喘息でのＦＧＦ２の役割の解明
ＩＬ−１３およびその下流の物質であるＴＧＦ−β１とＶＥＧＦの調節によって発生する喘息でのＦＧＦ２の役割を調べるために、ＦＧＦ２欠損マウスでの気道過敏性および気道リモデリング発生の有無を調査した。
【００９６】
例２−１：ＦＧＦ２の欠損による気道過敏性
ＦＧＦ２の気道過敏性との関連性を調査するために下記の実験を遂行した。ＦＧＦ２欠損マウスは、ジャクソンラボ(Jackson Lab，CA, 米国)から購入して使用した。気道過敏性は、メタコリンに対するＡＨＲ（ＤＲＳ）、および気道過敏性マウスで増加したことが明らかにされたＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１タンパク質のＢＡＬにおける量をそれぞれ例１−２および１−３に記載したのと同じ方法で測定した（図５および６）。図５は、ＦＧＦ２欠損マウス群および正常マウス群のＢＡＬ中のＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。図６は、ＦＧＦ２欠損マウス、および例１−４に記載したようにＶＥＧＦ遮断剤で処置されたＦＧＦ２欠損マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【００９７】
図５に見られるように、ＦＧＦ２欠損マウスは正常マウスに比較してＶＥＧＦの量が増加した。これは気道過敏性の増大を示唆するもので、図６の結果と一致するものである。
【００９８】
図６に見られるように、ＦＧＦ２が欠損したマウスでは気道過敏性が増大した。このような気道過敏性は、ＶＥＧＦ遮断剤の投与によって抑制されることを観察した。ゆえに、ＦＧＦ２の欠損による気道過敏性はＶＥＧＦの発現によるものであり、ＦＧＦ２の投与がＶＥＧＦの発現を抑制してＶＥＧＦ経路を通じた喘息の予防および治療に有用であることを示すものである。
【００９９】
例２−２：ＦＧＦ２の欠損による気道リモデリング
ＦＧＦ２の気道リモデリングとの関連性を調査するために、気道リモデリングに伴う細胞増殖および変換を測定することができる下記の実験を遂行した。
【０１００】
ＦＧＦ２欠損マウスは、ジャクソンラボ(Jackson Lab，CA, 米国)から購入して使用した。前記マウスから当該技術分野における公知の方法によって肺組織を抽出し、細胞増殖および変換を測定することができる組織内のコラーゲン量を、シルコルコラーゲン分析キット(Sircol Collagen assay kit，Biocolor assay, 北アイルランド)を製造者の指示にしたがって使用して分析した（図１０）。図１０は、ＦＧＦ２欠損マウス群と正常マウス群の肺組織内のコラーゲン量を示したグラフである。
【０１０１】
図１０に見られるように、ＦＧＦ２欠損マウスから分泌されたコラーゲン量が、正常実験マウスに比較して相対的に少ないことを確認した。
【０１０２】
このような結果は、ＦＧＦ２が欠損したマウス肺で、コラーゲンを分泌する線維芽細胞の細胞数が少なくなったことを意味するものであり、これはＦＧＦ２の欠損により肺で線維芽細胞が筋線維芽細胞に変化して移動したことにより線維芽細胞の数が少なくなったことが原因で、気道リモデリングが増大したことを示す。
【０１０３】
したがって、このような結果は、ＦＧＦ２が気道リモデリングおよび気道過敏性を減少させて喘息の治療に効果的に使用できることを示すものである。
【０１０４】
例３：ＴＧＦ−β１による喘息の発生
ＩＬ−１３によって誘導されることが知られたＴＧＦ−β１の発現による喘息の発生を調べるために、前記例１−１と同じ方法でＴＧＦ−β１を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製して下記の実験を遂行した。
【０１０５】
例３−１：ＴＧＦ−β１による気道リモデリングの発生
気道リモデリングによる気道過敏性を例１−２と同じ方法で測定した（図７）。図７は、ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群の時間による気道過敏性を示したグラフである。図８は、ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【０１０６】
図７に見られるように、気道過敏性（Ｐｅｎｈ）を測定した結果、ＴＧＦ−β１によって気道の抵抗力が重度に誘導された。
【０１０７】
しかし、図８に見られるように、メタコリンによる気道過敏性（ＡＨＲ）は抑制されることを確認した。前記結果から、ＴＧＦ−β１の過剰発現は喘息の症状の中で気道リモデリングにだけ関与することが分かる。
【０１０８】
例３−２：ＴＧＦ−β１による気道過敏性減少におけるＦＧＦ２の役割
前記例３−１で詳しく見たように、ＴＧＦ−β１による気道過敏性減少にＦＧＦ２が関与するかどうかを調べるために、ＦＧＦ２を制限したマウスで気道過敏性を測定して比較した（図９）。図９は、正常マウスまたはＦＧＦ２を欠損したマウスにおける、ＴＧＦ−β１(R&D system,米国)投与後の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【０１０９】
図９に見られるように、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少は、ＦＧＦ２の欠損マウスで鈍化した。前記結果は、ＴＧＦ−β１による気道過敏性の減少は、ＴＧＦ−β１自体によるものというよりは、ＴＧＦ−β１と一緒に発現されるＦＧＦ２に起因したものであることを示す。ＴＧＦ−β１の増加による気道過敏性の減少には、ＦＧＦ２が関与することが分かる。
【０１１０】
例４：ＩＦＮ−γ過剰発現による喘息の発生およびＦＧＦ２の役割
重症喘息とＣＯＰＤの主な媒介物であるＩＦＮ−γが媒介する喘息モデルを作製して、ＦＧＦ２の役割を解明するために、例１と同じ方法でＩＦＮ−γで形質転換されたマウスを作製して下記の実験を遂行した。
【０１１１】
例４−１：ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性の増大
トランスジェニックマウスでの気道過敏性を例１−２と同じ方法で測定した（図１１）。続いて、例１−３と同じ方法で、ＡＨＲおよびＢＡＬ中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１、およびＩＦＮ−γによって誘導されることが知られたＩＰ−１０のタンパク質量を測定した（図１２）。図１１は、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【０１１２】
図１１に見られるように、ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスでは、均質に(homogeneously)気道過敏性が高くなることを確認することができた。
【０１１３】
図１２に見られるように、前記マウスはＴｈ２で発現されるＩＬ−１３によって誘導されるＶＥＧＦやＴＧＦ−β１の量は増加しない代わり、Ｔｈ２とは関係ないＩＰ−１０(Interferon-inducible Protein 10)が増加することを確認し、これは前記マウスで誘導された気道過敏性がＩＦＮ−γに特異的であることを示唆する。
【０１１４】
例４−２：ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性へのＦＧＦ２の役割
ＩＦＮ−γ過剰発現がＦＧＦ２の発現に及ぼす影響
ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性へのＦＧＦ２の役割を調べるために、ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスでＦＧＦ２の転写レベルでの発現量を測定した（図１３）。正常マウスおよびトランスジェニックマウスの肺組織から公知の方法によってＲＮＡを抽出して、ＲＴ(reverse transcription)−ＰＣＲを遂行した。要約すると、正常マウスおよびトランスジェニックマウスの肺組織１ｇを製造者の指示どおりトリゾル試薬(TRIzol Reagent，Life Technology, 米国)を使用して総ＲＮＡを分離した。続いて分離した総ＲＮＡを鋳型にして製造者の推奨どおりにＲＴ−ＰＣＲキット(Promega, 米国)を使用してｃＤＮＡを合成した。続いて、合成されたｃＤＮＡ１μｇを鋳型にして上位プライマー(upper primer: 5'-ACT CAC ATT CGA AAC CCC AAA C-3')および下位プライマー(lower primer: 5'-CGT CAG ATC GCC TGG AGA C-3')を使用して、下記の条件でＰＣＲを遂行してＦＧＦ２特異的ｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、９５℃で８分間予備変性させた後、９５℃で１分、５６℃で１分、７２℃で１分間を３５回繰り返し遂行して最後に７２℃で１０分間反応させた。図１３は、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の肺組織内のＦＧＦ２特異的ｃＤＮＡの増幅を示したアガロースゲル写真である。
【０１１５】
図１３に見られるように、ＩＦＮ−γで形質転換されたマウスでＦＧＦ２の発現が阻害されることを確認することができ、これはＩＦＮ−γによってＦＧＦ２発現が抑制されることを示すものである。
【０１１６】
ＩＦＮ−γ過剰発現による気道過敏性へのＦＧＦ２の役割
ＩＦＮ−γにより誘導される気道炎症および気道過敏性における具体的なＦＧＦ２の役割を詳しく見るために、下記の遺伝子組換えを有するマウスで気道過敏性、ＢＡＬ中の炎症細胞数および炎症関連タンパク質量を測定した（図１４）。前記マウスは、以前に記述されたとおり作製した(Zhou Zhu等, J. Clin. Invest., 1999年，第103巻，779〜788頁; Tang等, J. Clin. Invest., 1996年，第98巻，2845〜2853頁; Ray等, J. Clin. Invest., 1997年，第l00巻，2501〜2511頁)。図１４で、＋は該当遺伝子が過剰発現されたマウスを示し、−は該当遺伝子が欠損したマウスを示す。図１４のＡは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群における気管支肺胞洗浄液中の総細胞数（Total）、マクロファージ（Ｍ）、リンパ球（Ｌ）、好中球（Ｎ）、好酸球（Ｅ）の細胞数を示したグラフである。図１４のＢは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群における、メタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。図１４のＣは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群における気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＩＰ−１０の発現量を示したグラフである。
【０１１７】
図１４に見られるように、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスでＦＧＦ２遺伝子をなくすと、ＩＦＮ−γによって誘導される気道過敏性がさらに増加し、炎症細胞数が増加することが観察され、気道炎症がさらにひどくなることを確認することができた。これは、ＦＧＦ２がまた、ＩＦＮ−γによって誘発される喘息にも有用に使用できることを示す。
【０１１８】
例５：ＦＧＦ２投与による、ＩＬ−１３によって誘導されたＴｈ２喘息の抑制
ＩＬ−１３によるＴｈ２喘息において、ＦＧＦ２タンパク質による具体的な喘息抑制活性を測定するため、下記の実験を遂行した。
【０１１９】
組換えＦＧＦタンパク質(ｒＦＧＦ２)は、ファーマシアアップジョン(Phamacia-Upjohn、イタリア)社から購入して使用した。
【０１２０】
気道過敏性が誘発されたマウス作製のために、７５μｇの卵アルブミン（ＯＡ）と２ｍｇのアラムをＢＡＬＢ／ｃマウス(Jackson Lab, 米国)の腹腔に二度注射して感作し、１０日後に５０μｇの卵アルブミンを鼻腔に再感作してＴｈ２喘息を誘発した。前記Ｔｈ２喘息が誘発されたマウスを、Ｔｈ２喘息実験マウスと命名した。
【０１２１】
続いて前記マウスおよび正常マウスにそれぞれｒＦＧＦ２を４日間、１日１回１０μｇ／頭の用量で鼻腔に投与または非投与(生理食塩水)後、メタコリンに対する気道過敏性（図２０）、気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞（図２１）および、媒介因子としてのＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０（図２２）の量を例１−２および１−３に記載した方法で測定した。
【０１２２】
図２０は、Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２を投与後の、メタコリン濃度に応じた気道過敏性を示したグラフである。図２１は、Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群でｒＦＧＦ２を投与した後、気管支肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。図２２は、Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群における、ｒＦＧＦ２を投与した後の、気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０の量を示したグラフである。
【０１２３】
図２０に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ２喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスでメタコリンに対する気道過敏性が低いことを確認した。
【０１２４】
図２１に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ２喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスにおいて気管支肺胞洗浄液中の炎症細胞数が減少することを確認した。
【０１２５】
図２２に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置されていないＴｈ２喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスでは、Ｔｈ２喘息における重要な媒介因子であるＩＬ−１３とＶＥＧＦの濃度が減少することを確認した。一方、Ｔｈ２喘息と関連性がないことが知られているＩＬ−５およびＩＰ−１０の発現には、変化がないことを確認した。
【０１２６】
また、喘息が誘発されたマウスをｒＦＧＦ２で処置後、肺気管支壁の組織学的検査を行った（図２３）。図２３は、Ｔｈ２喘息実験マウスにｒＦＧＦ２を投与する前（Ａ）および投与した後（Ｂ）の肺組織の病理写真である。
【０１２７】
図２３に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置したマウスの肺気管支壁の組織学的検査の結果（Ｂ）、ＦＧＦ２の投与によって肺気管支壁の肥厚および閉塞が減少して正常（Ｃ）と同様になることを確認した。
【０１２８】
前記結果から、ＦＧＦ２がＶＥＧＦおよびＩＬ−１３生産を阻害してＴｈ２気道過敏性および炎症を抑制し、喘息の予防および治療に有用に使用できることが分かった。
【０１２９】
例６：ＦＧＦ２の投与による、ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息およびＣＯＰＤの抑制
ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息においてＦＧＦ２タンパク質による具体的な喘息抑制活性を測定するため、下記の実験を遂行した。
【０１３０】
rＦＧＦ２タンパク質は、ファーマシアアップジョン(Phamacia-Upjohn、イタリア)社から購入して使用した。ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息が誘発されたマウスの作製のために下記の実験を遂行した。
【０１３１】
例６−１：卵アルブミンと二重鎖ＲＮＡを使用したＴｈ１喘息およびＣＯＰＤ動物モデルの確立
ＢＡＬＢ／ｃマウス(Jackson Lab, 米国)を使用して、１０μｇの合成ｄｓＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸(polyinosinic-polycytidylic acid，PolyIC, Sigma, 米国)、７５μｇの卵アルブミン(OvAlbumin, OA)を、それぞれまたは一緒に４回鼻腔に投与して感作し、１０日後に５０μｇの卵アルブミンを鼻腔に再感作して喘息を誘発した。前記マウスをＴｈ１喘息マウスと命名した。陰性対照群マウスには、リン酸緩衝食塩水(PBS, Phospho Buffered Saline)のみを投与した。
【０１３２】
（１）Ｔｈ１喘息の特性確認
続いて、前記マウスで実際にＴｈ１喘息の誘発の有無を確認するために、例１−２および１−３に記載した方法と同様にメタコリンによる気道過敏性（図１５）、ＢＡＬ中の炎症細胞数（図１６）および媒介因子としてのＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０の量（図１７）を例１−２および１−３に記載した方法で測定した。
【０１３３】
図１５は、アレルゲン（卵アルブミンＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した際の、メタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。図１６は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、気管支肺胞洗浄液中の総細胞数、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。図１７は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン(ＶＥＧＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＰ−１０)の発現量を示したグラフである。
【０１３４】
図１５に見られるように、ＯＡおよびｄｓＲＮＡによって誘導されたマウスでメタコリン気道過敏性が増加することを確認した。
【０１３５】
図１６に見られるように、前記マウスでリンパ球と好中球、マクロファージ(macrophage)などの細胞の数は増加したが、好酸球の数は増加しないことを確認した。
【０１３６】
図１７に見られるように、前記マウスでは、媒介因子としてＴｈ１反応と関連あるＩＰ−１０だけが格段に増加した。
【０１３７】
前記結果から、卵アルブミンとｄｓＲＮＡによって非好酸球性気道炎症が起きることを確認した。
【０１３８】
また、前記Ｔｈ１喘息がＩＦＮ−γによるものであることを確認するために、気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮ−γならびにＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの量を測定した(図１８および図１９）。図１８は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮ−γ発現量を示したグラフである。図１９は、アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の、血清中のアレルゲン特異抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ）の生成量を示したグラフである。
【０１３９】
図１８および図１９に見られるように、気管支肺胞洗浄液中でＩＦＮ−γが３倍以上増加し、血液中のＩｇＧ１とＩｇＧ２の増加も確認された。前記結果から、卵アルブミン抗原とｄｓＲＮＡによって誘発された喘息は、ＩＦＮ−γおよび抗原特異的ＩｇＧ２ａによるものであり、Ｔｈ２喘息で現われることが知られたＩｇＥとは関連がないことが確認された。
【０１４０】
（２）ＣＯＰＤの特性確認
続いて、前記マウスでのＣＯＰＤの誘発の有無を確認するために肺の大きさ、容積およびコラーゲン量を測定した（図２８、図２９および図３０）。図２８は、前記作製されたマウスにおける肺の大きさを示し、図２９は、前記作製されたマウスにおける肺の容積変化を示したグラフである。図３０は、前記作製されたマウスにおける肺線維化の程度を示したグラフである。
【０１４１】
図２８、図２９および図３０に見られるように、Ｔｈ１喘息モデルマウスでそれぞれ肺の大きさ、容積およびコラーゲンの量が顕著に増加しており、ＣＯＰＤの特性を兼ね備えていることを確認した。このような肺の大きさ、容積、コラーゲン量の増加は、肺の組織損傷、肺胞破壊、肺気腫を伴うもので、典型的なＣＯＰＤの特性であり、それは図３１によって確認される。
【０１４２】
図３１のＡは、Ｔｈ１喘息モデルマウスで肺実質組織の破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。図３１に見られるように、ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスの肺は、典型的なＣＯＰＤ患者で観察される肺実質細胞の死滅による肺胞面積拡大を確認することができた。
【０１４３】
前記肺の大きさおよび容積増加、肺胞の破壊とともに、コラーゲン量の増加からして、深刻な線維化が招来されたことを確認することができた。
【０１４４】
前記結果から、Ｔｈ１喘息モデルマウスがまた、ＣＯＰＤの病因機序を示すことができるモデルであることを確認することができた。
【０１４５】
例６−２：ＦＧＦ２の投与によるＴｈ１喘息の抑制
ＩＦＮ−γによるＴｈ１喘息においてＦＧＦ２タンパク質による具体的な喘息抑制活性を測定するため下記の実験を遂行した。前記例６−１によって作製されたマウスを、Ｔｈ１喘息実験マウス群と命名した。例６−１で作製されたＴｈ１喘息実験マウスおよび正常マウスに例５と同じ方法でｒＦＧＦ２を投与した。続いて、前記マウスで、メタコリンに対する気道過敏性を例１−２に記載した方法によって測定した。
【０１４６】
図２７は、Ｔｈ１喘息実験マウス群と正常マウス群にｒＦＧＦ２を投与後の、メタコリン濃度に応じた気道過敏性を示したグラフである。
【０１４７】
図２７に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ１喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスにおいて、メタコリンに対する気道過敏性が低いことを確認した。
【０１４８】
図２８は、Ｔｈ１喘息が誘発されたマウスにおいてＦＧＦ２処置をした、およびしていないマウスによる肺の大きさを示した写真である。
【０１４９】
図２８に見られるように、ｒＦＧＦ２で処置していないＴｈ１喘息が誘発されたマウスと比較して、ｒＦＧＦ２で処置したマウスにおいて肺の大きさが減少することを確認した。
【０１５０】
前記結果は、ＦＧＦ２が、ＩＦＮ−γトランスジェニックマウスの喘息症状を低減することにより、ＩＦＮ−γによって誘導された喘息の治療に有用に使用できることを示す。
【０１５１】
例６−３：ＦＧＦ２の投与によるＣＯＰＤ抑制
ＦＧＦ２タンパク質のＣＯＰＤ抑制活性を測定するため、下記の実験を遂行した。例６−１で作製されたマウスおよび正常マウスに例５と同じ方法でｒＦＧＦ２を投与した。続いて前記マウスでＣＯＰＤの特徴である肺の大きさ、容積およびコラーゲン量を測定した（図２８、図２９および図３０）。図２８Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ正常肺およびＣＯＰＤマウスモデルでｒＦＧＦを投与した、および投与していない肺を示す。図２９は、図２８の肺の容積を測定したグラフである。図３０Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、それぞれ正常肺およびＣＯＰＤマウスモデルでｒＦＧＦを投与した、および投与していない肺の線維化の程度を示したグラフである。図３１は、ＣＯＰＤ喘息モデルマウスでｒＦＧＦ投与前後の肺実質組織の破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。
【０１５２】
図２８のＣおよびＤそして図２９のＣおよびＤに見られるように、ｒＦＧＦ２の投与で、肺の容積が投与する前と比較して著しく減少することが分かる。図３０のＣおよびＤに見られるように、ｒＦＧＦ２投与後のＣＯＰＤマウスでコラーゲンの量が顕著に減少することを確認した。このような肺の大きさ、容積、コラーゲン量の減少は、ｒＦＧＦ２がＣＯＰＤの治療に効果的に使用できることを示すものであり、これは図３１によって確認される。
【０１５３】
図３１は、ＣＯＰＤマウスで肺実質組織の破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。図３１のＡに見られるように、処置していない肺（Ｂ）の場合、処置したもの（Ａ）と比較して、典型的なＣＯＰＤ患者で観察される肺実質細胞の死滅による肺胞面積拡大を確認することができ、ｒＦＧＦ２の投与がＣＯＰＤの治療に効果的であることが分かる。
【０１５４】
前記結果は、ＣＯＰＤマウスでは、肺の大きさおよび容積増加と肺胞の破壊とともにコラーゲン量が深刻な線維化が招来され、それがＦＧＦ２で治療できることを示すものである。
【０１５５】
例７：ヒトの喘息でのＩＦＮ−γの過剰発現の有無
ヒトの喘息でのＩＦＮ−γの過剰発現の有無と、それが非好酸球性細胞によるものであるかどうかを確認するために下記の実験を遂行した。２１５人の可逆的な気道閉塞を示す成人喘息患者から初日喀痰を分離して、公知の方法によって肺活量測定機(sprimetry)を使用して肺活量を測定した。メタコリン誘発検査(methacholin bronchial challenge)を遂行して肺機能検査を遂行した（図２４）。図２４は、重症喘息患者における、誘発喀痰中の好酸球が陽性の群(Eosinophilic)および陰性の群(Non-eosinophilic)の割合を示したグラフである。図２４に見られるように、成人喘息患者の半分以上は好酸球性というよりは非好酸球性の臨床所見であることを確認した。
【０１５６】
このような喘息を媒介する因子を確認するために、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ遺伝子の量を調査した（図２５）。図２５は、喘息患者の重症度による誘発喀痰中のＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現量を示したグラフである。
【０１５７】
図２５に見られるように、重症喘息患者でＴｈ１喘息と関連があるＩＦＮ−γの発現量が増加したが、Ｔｈ２喘息と関連があるＩＬ−４は変化がないことを確認した。前記結果からヒト、特に重度の喘息を持つ患者でＩＦＮ−γ経路による非好酸球性Ｔｈ１喘息が発生し得ることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本発明によるＦＧＦ２を有効成分として含む治療剤は、気道線維化、気道炎症、気道過敏性、気道リモデリング、喘息およびＣＯＰＤの治療または予防に有用に使用することができる。また、卵アルブミンおよび二重鎖ＲＮＡを使用して開発された喘息およびＣＯＰＤ動物モデルは、喘息およびＣＯＰＤ治療剤の開発に有用に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５９】
【図１】Ａは、ＩＬ−４過剰発現トランスジェニックマウス群での気道過敏性を示したグラフである。Ｂは、IL-9(-)/IL-13(+/+)、IL-9(-)/IL-13(-/-)、IL-9(+)/IL-13(+/+)およびIL-9(+)/IL-13(-/-)トランスジェニックマウス群での気道過敏性を示したグラフである。
【図２】ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【図３】ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群の気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦおよびＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。
【図４】ＩＬ−１３過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群における、ＶＥＧＦ受容体２の抑制剤であるＳＵ１４９８の投与による気道過敏性を示したグラフである。
【図５】ＦＧＦ２欠損マウス群および正常マウス群の気管支肺胞洗浄液中の血管内皮増殖因子およびＴＧＦ−β１の発現量を示したグラフである。
【図６】ＦＧＦ２またはＦＧＦ２およびＶＥＧＦノックアウトマウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【図７】ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【０１６０】
【図８】ＴＧＦ−β１過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【図９】正常マウスまたはＦＧＦ２欠損マウスにおける、ＴＧＦ−β１投与後の時間による気道過敏性を示したグラフである。
【図１０】ＦＧＦ２欠損マウス群と正常マウス群の肺組織中のコラーゲン量を示したグラフである。
【図１１】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気道過敏性を示したグラフである。
【図１２】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＩＰ−１０の発現様相を示したグラフである。
【図１３】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群と正常マウス群の肺組織中のＦＧＦ２の発現を示したアガロースゲル写真である。
【図１４】Ａは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群の気管支肺胞洗浄液中の全細胞（Ｔｏｔａｌ）、マクロファージ（Ｍ）、リンパ球（Ｌ）、好中球（Ｎ）、好酸球（Ｅ）の細胞数を示したグラフである。Ｂは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群のメタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。Ｃは、IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群の気管支肺胞洗浄液中のＶＥＧＦ、ＴＧＦ−β１およびＩＰ−１０の発現量を示したグラフである。
【０１６１】
【図１５】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時のメタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。
【図１６】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の気管支肺胞洗浄液中の全細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。
【図１７】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン(ＶＥＧＦ、ＩＬ−５、ＩＬ−１３およびＩＰ−１０)の発現量を示したグラフである。
【図１８】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与した時の気管支肺胞洗浄液中のＩＦＮ−γの発現量を示したグラフである。
【図１９】アレルゲン（ＯＡ）およびｄｓＲＮＡを単独または一緒に投与された時の血清中アレルゲン特異抗体(ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ)生成量を示したグラフである。
【図２０】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）を投与後の、メタコリン濃度による気道過敏性を示したグラフである。
【図２１】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２(rＦＧＦ２)投与した後の、気管支肺胞洗浄液中の全細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。
【図２２】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群に組換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）投与した後の、気管支肺胞洗浄液中のサイトカイン（ＶＥＧＦ、ＩＬ−１３、ＩＬ−５およびＩＰ−１０）の量を示したグラフである。
【図２３】Ｔｈ２喘息実験マウス群と正常マウス群の、組換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）投与の有無による肺組織の病理写真である。
【図２４】重症の喘息患者における、誘発喀痰中に好酸球が陽性の群および陰性の群の割合を示したグラフである。
【図２５】喘息患者の重症度による誘発喀痰中のＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現量を示したグラフである。
【０１６２】
【図２６】条件的ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウス群および正常マウス群における、過剰発現誘導物質ドキシサイクリン投与の有無による気管支肺胞洗浄液中の全細胞、マクロファージ、リンパ球、好中球、好酸球の細胞数を示したグラフである。
【図２７】IFN-γ(-)/FGF2(+/+)、IFN-γ(-)/FGF2(-/-)、IFN-γ(+)/FGF2(+/+)またはIFN-γ(+)/FGF2(-/-)トランスジェニックマウス群のメタコリン量に応じた気道過敏性を示したグラフである。
【図２８】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺の大きさを示した写真である。
【図２９】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺容積の変化を示したグラフである。
【図３０】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺の線維化の程度を示したグラフである。
【図３１】ＩＦＮ−γ過剰発現トランスジェニックマウスにおけるＦＧＦ２の有無による肺実質組織破壊の程度を示した肺組織の病理写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、喘息の予防または治療剤。
【請求項２】
喘息がＩＬ−１３の過剰発現によって誘発されることを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項３】
喘息がＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項４】
ＦＧＦ２が、ＩＬ−１３の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項５】
ＦＧＦ２が、血管内皮増殖因子の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項６】
ＦＧＦ２が、ＴＧＦ−β１の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項７】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
【請求項８】
慢性閉塞性肺疾患が、ＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする、請求項７に記載の慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
【請求項９】
卵アルブミンを含むアレルゲンおよび二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与することを含む、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１０】
動物がマウスである、請求項９に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１１】
下記の工程、
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５〜１５μｇの二重鎖ＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸および５０〜１００μｇの卵アルブミンを４回鼻腔に投与して感作する工程、および
（２）１０日後に２５〜７５μｇの卵アルブミンを鼻腔に感作する工程
を含む、請求項９または請求項１０に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１２】
工程（１）の感作する二重鎖ＲＮＡが１０μｇで使用される、請求項１１に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１３】
工程（１）の感作する卵アルブミンが、７５μｇの卵アルブミンであり、工程（２）の１０日後に５０μｇの卵アルブミンを使用する、請求項１１に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１４】
喘息が、非好酸球性であることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれかに記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれかに記載の方法によって製造された、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデル。
【請求項１６】
動物がマウスである、請求項１５に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデル。
【請求項１７】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、ＩＬ−１３活性抑制剤。
【請求項１８】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、ＶＥＧＦ活性抑制剤。
【請求項１９】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、ＴＧＦ−β１活性抑制剤。
【請求項２０】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、気道線維化、気道炎症、気道過敏性または気道リモデリング抑制剤。
【請求項１】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、喘息の予防または治療剤。
【請求項２】
喘息がＩＬ−１３の過剰発現によって誘発されることを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項３】
喘息がＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項４】
ＦＧＦ２が、ＩＬ−１３の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項５】
ＦＧＦ２が、血管内皮増殖因子の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項６】
ＦＧＦ２が、ＴＧＦ−β１の活性を抑制することを特徴とする、請求項１に記載の喘息の予防または治療剤。
【請求項７】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
【請求項８】
慢性閉塞性肺疾患が、ＩＦＮ−γの過剰発現によって誘発されることを特徴とする、請求項７に記載の慢性閉塞性肺疾患の予防または治療剤。
【請求項９】
卵アルブミンを含むアレルゲンおよび二重鎖ＲＮＡを気道内に直接投与することを含む、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１０】
動物がマウスである、請求項９に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１１】
下記の工程、
（１）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５〜１５μｇの二重鎖ＲＮＡであるポリイノシンポリシチジン酸および５０〜１００μｇの卵アルブミンを４回鼻腔に投与して感作する工程、および
（２）１０日後に２５〜７５μｇの卵アルブミンを鼻腔に感作する工程
を含む、請求項９または請求項１０に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１２】
工程（１）の感作する二重鎖ＲＮＡが１０μｇで使用される、請求項１１に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１３】
工程（１）の感作する卵アルブミンが、７５μｇの卵アルブミンであり、工程（２）の１０日後に５０μｇの卵アルブミンを使用する、請求項１１に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１４】
喘息が、非好酸球性であることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれかに記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデルの製造方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれかに記載の方法によって製造された、Ｔｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデル。
【請求項１６】
動物がマウスである、請求項１５に記載のＴｈ１喘息または慢性閉塞性肺疾患動物モデル。
【請求項１７】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、ＩＬ−１３活性抑制剤。
【請求項１８】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、ＶＥＧＦ活性抑制剤。
【請求項１９】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、ＴＧＦ−β１活性抑制剤。
【請求項２０】
ＦＧＦ２を有効成分として含む、気道線維化、気道炎症、気道過敏性または気道リモデリング抑制剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【公表番号】特表２００７−５３７２４５（Ｐ２００７−５３７２４５Ａ）
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１３０６７（Ｐ２００７−５１３０６７）
【出願日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１３９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７９４
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０１１８７８４８）ドン・ア・ファーム・カンパニー・リミテッド (20)
【出願人】（５０６３７７２２６）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月２０日（２００７．１２．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年５月１２日（２００５．５．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００５／００１３９０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１０７７９４
【国際公開日】平成１７年１１月１７日（２００５．１１．１７）
【出願人】（５０１１８７８４８）ドン・ア・ファーム・カンパニー・リミテッド (20)
【出願人】（５０６３７７２２６）
【Ｆターム（参考）】
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