ＧＬＰ−１類似体医薬組成物
本発明は、液体；式［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のペプチド類似体、二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに、酢酸塩及び／又は酢酸を含む制御放出液体医薬組成物に関する。本発明は又、医薬組成物及び製造方法医薬組成物を含む容器に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカゴン様ペプチド−１のペプチド類似体及び／又はその医薬的に許容される塩を含む組成物の改良、医薬組成物、その組成物の製造方法並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１）は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され（Varndell, J. M.ら, J. Histochem Cytochem, 1985:33:1080-6）、食事に応答して体循環中へ放出される。ＧＬＰ−１の血漿濃度は、絶食レベルの約１５pmol/Lから食後ピークレベルの４０pmol/Lへ上昇する。血漿グルコース濃度における所定の上昇に対し、血漿インスリンの増加は、グルコースを経口で投与するとき、静脈内と比較して約３倍高いことが示されている（Kreymann, B.ら, Lancet 1987:2, 1300-4）。このインスリン放出の食事性の亢進は、インクレチン（incretin）効果として知られ、主として体液性であり、ＧＬＰ−１は、ヒトにおいて最も強力な生理学的インクレチンであると考えられている。抗インスリン効果に加えて、ＧＬＰ−１は、グルカゴン分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ（Wettergren A.ら, Dig Dis Sci 1993:38:665-73）、末梢のグルコース処理を高める可能性がある（D'Alessio, D. A.ら, J. Clin Invest 1994:93:2293-6）。
【０００３】
１９９４年に、ＧＬＰ−１の単回皮下（ｓ／ｃ）投与によってインスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の患者の食後血糖値が完全に正常化され得るという観察に従い、ＧＬＰ−１の治療の潜在的能力が示唆された（Gutniak, M. K.ら, 糖尿病 Care 1994:17:1039-44）。この効果は、インスリン放出の増加とグルカゴン分泌の低下の両方により仲介されると考えられた。更に、ＧＬＰ−１の静脈内注入は、ＮＩＤＤＭの患者において食後の胃空洞化を遅らせることが示された（Williams, B.ら, J. Clin Endo Metab 1996:81:327-32）。スルホニル尿素と異なり、ＧＬＰ−１の抗インスリン作用は、血漿グルコース濃度に依存する（Holz, G. G. 4thら, Nature 1993: 361: 362-5）。従って、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ−１仲介性インスリン放出がないために、重篤な低血糖症に対して保護される。この作用の組合せは、ＮＩＤＤＭを治療するために今日使用されている他の薬剤に優る独自の潜在的な治療上の利点をＧＬＰ−１に与える。
【０００４】
数多くの研究により、ＧＬＰ−１を健常被検体へ与えると、ＧＬＰ−１はインスリン及びグルカゴンの濃度だけでなく、血糖値にも強力に影響を及ぼし(Orskov, C, Diabetologia 35:701-711, 1992; Holst, J.J.ら,「糖尿病管理におけるGLP-1の可能性、グルカゴン III」, Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, Springer Verlag, 1996, p. 311-326)、この効果がグルコース依存性である(Kreymann, B.ら, Lancet ii: 1300-1304, 1987; Weir, G.C.ら, Diabetes 38:338-342, 1989)ことが示された。更に、これは、糖尿病の患者にも有効であり(Gutniak, M., N. Engl J Med 226:1316-1322, 1992; Nathan, D.M.ら, Diabetes Care 15:270-276, 1992)、II型糖尿病の被検体の血糖値を正常化し(Nauck, M.A.ら, Diabetologia 36:741-744, 1993)、I型患者の血糖コントロールを改善し(Creutzfeldt, W.O.ら, Diabetes Care 19:580-586, 1996)、とりわけ、インスリン感受性を高める／インスリン抵抗性を抑えるその能力を実証している。
【０００５】
ＧＬＰ−１とそのアゴニストは、インスリン非依存型糖尿病を発症するリスクのある被検体における使用（ＷＯ００／０７６１７を参照）、並びに妊娠性糖尿病の治療（米国特許公開公報番号：２００４０２６６６７０）のために挙げられている。
【０００６】
上記に加えて、哺乳動物（例えば、ヒト）においてＧＬＰ−１とそのアゴニストが提示されている数多くの臨床使用があり、例えば、限定されるものではないが下記が挙げられる：学習を向上させること、神経保護を高めること、及び／又は中枢神経系の疾患又は障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神性の症候群）の症状を、例えば、神経組織発生の調節を介して緩和すること（米国特許公開公報番号：２００５０００９７４２及び２００２０１１５６０５）；肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換すること（ＷＯ０３／０３３６９７）；β細胞の悪化（米国特許公開公報番号：２００４００５３８１９及び２００３０２２０２５１）及びβ細胞増殖の刺激（米国特許公開公報番号：２００３０２２４９８３）を防ぐこと；肥満を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４００１８９７５；ＷＯ９８／１９６９８）；食欲を抑制して満腹感を誘発すること（米国特許公開公報番号：２００３０２３２７５４）；過敏性腸症候群を治療すること（ＷＯ９９／６４０６０）；心筋梗塞（米国特許公開公報番号：２００４０１６２２４１、ＷＯ９８／０８５３１）及び卒中（ＷＯ００／１６７９７を参照）に関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること；Ｑ波心筋梗塞の非存在を特徴とする急性冠症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０００２４５４）；術後の異化変化を弱めること（米国特許第６，００６，７５３号）；冬眠心筋又は糖尿病性心筋症を治療すること（米国特許公開公報番号：２００５００９６２７６）；ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制すること（米国特許公開公報番号：２００５００９６２７６）；尿ナトリウム排出を増加させ、尿カリウム濃度を減少させること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；有毒な血液量過多症に関連した状態又は障害（例えば、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；変力応答を誘発して、心収縮を増加させること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；多房性卵巣症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２６６６７８及び２００４００２９７８４）；呼吸窮迫を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２３５７２６）；非消化管経路を介した、即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入を介した栄養摂取を改善すること（米国特許公開公報番号：２００４０２０９８１４）；腎障害を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２０９８０３）；左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４００９７４１１）；例えば、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群等の胃腸障害の治療又は予防のために、そして内視鏡手技の前投薬として十二指腸洞の運動を阻害すること（米国特許公開公報番号：２００３０２１６２９２）；重症疾患多発ニューロパシー（ＣＩＰＮ）及び全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００３０１９９４４５）；トリグリセリドレベルを調節して、異常脂質血症を治療すること（米国特許公開公報番号：２００３００３６５０４及び２００３０１４３１８３）；虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷を治療すること（米国特許公開公報番号：２００２０１４７１３１）；冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００２００４５６３６）、その他。
【０００７】
しかしながら、ＧＬＰ−１は、代謝的に不安定であり、ｉｎ ｖｉｖｏでは１〜２分の血漿半減期（ｔ1/2）しか有さない。外因的に投与したＧＬＰ−１も又、速やかに分解される(Deacon, C.F.ら, Diabetes, 44:1126-1131, 1995)。この代謝不安定性により、天然ＧＬＰ−１の治療ポテンシャルは制限される。
【０００８】
ＧＬＰ−１とその類似体の治療ポテンシャルを配合物における改善を通して改善するために、多くの試みがなされてきた。例えば、国際特許公開公報番号ＷＯ０１／５７０８４は、結晶と医薬的に許容されるキャリアを含んでなる、注射可能な医薬品等の医薬組成物の調製に有用であるとされるＧＬＰ−１類似体の結晶を調製する方法を記載する。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの不均質な微結晶性クラスターを生理食塩水溶液から成長させて、亜鉛及び／又はｍ−クレゾールでの結晶浸漬処理の後で試験した（Kim及びHaren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)）。針状結晶と非結晶性の沈殿を含有するＧＬＰ（７−３６）ＮＨ2の粗結晶懸濁液が亜鉛又はプロタミンを含有するリン酸溶液より調製された（Pridalら, International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996))。欧州特許公開公報番号ＥＰ０６１９３２２Ａ２は、塩類と低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある種の組合せを含むｐＨ７〜８．５の緩衝液において上記タンパク質の溶液を混合することによる、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの微結晶型の調製を記載する。米国特許第６，５６６，４９０号は、精製ペプチド生成物の生成に役立つ、ＧＬＰ−１の種となる微結晶について特に記載している。米国特許第６，５５５，５２１（ＵＳ’５２１）号は、改善された純度を有して、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す、正方晶系の平棒又は板状の形を有するＧＬＰ−１結晶を開示する。ＵＳ’５２１号は、その結晶が、先行技術の、急速に固化し、共に凝集又は密集し、シリンジ針を詰まらせ、予測不能な投薬を概して悪化させる、結晶性クラスターや無定形の結晶性懸濁液よりも相対的に均質であり、より長い時間、懸濁状態を維持することを教示する。
【０００９】
生物分解性トリブロックコポリマーのポリ［（ｄｌ−ラクチド−コグリコリド）−β−エチレングリコール−β−（−ラクチド−コグリコリド）］を、ＧＬＰ−１の制御放出配合物において使用することも提案された。しかしながら、他のポリマー系と同じように、トリブロックコポリマーの製造には、複雑なプロトコールと一貫性のない微粒子形成が伴う。
【００１０】
同様に、生物分解性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）も、ペプチドの持続送達配合物における使用を示唆された。しかしながら、これら生物分解性ポリマーの使用は、一般に、これらのポリマーが水への溶解度が低く、水と混和不能の有機溶媒（例えば、塩化メチレン）及び／又は製造中に厳しい調製条件を必要とするので、当該技術分野では好ましくない。それらの有機溶媒及び／又は厳しい調製条件は、目的のペプチド又はタンパク質のコンホメーション変化を誘発するリスクを高めて、構造の完全性の減少と生物学的活性の低下をもたらすと考えられている（Choiら, Pharm. Research, Vol. 21, No. 5, (2004)）。ポロキサマーも同様の問題があるとされている（同上）。
【００１１】
上記参考文献に記載されたＧＬＰ−１組成物は、不純物を捕捉する傾向があり、及び／又は、他にも、再現可能的に製造して投与することが難しいので、ＧＬＰの医薬配合物を調製するのに理想的とは言えない。又、ＧＬＰ類似体は、高い濃度で嘔吐を誘発することが知られているので、初期の血漿濃度が低くて持続的な医薬効果を提供する必要がある。(Ritzelら, Diabetologia, 38: 720-725 (1995); Gutniakら, Diabetes Care, 17(9): 1039-1044 (1994); Deaconら, Diabetes, 44: 1126-1131 (1995).)
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際特許公開公報番号ＷＯ０１／５７０８４
【特許文献２】欧州特許公開公報番号ＥＰ０６１９３２２Ａ２
【特許文献３】米国特許第６，５６６，４９０号
【特許文献４】米国特許第６，５５５，５２１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Kim及びHaren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)
【非特許文献２】Pridalら, International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996)
【非特許文献３】Choiら, Pharm. Research, Vol. 21, No. 5, (2004)
【非特許文献４】Ritzelら, Diabetologia, 38: 720-725 (1995)
【非特許文献５】Gutniakら, Diabetes Care, 17(9): 1039-1044 (1994)
【非特許文献６】Deaconら, Diabetes, 44: 1126-1131 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、より容易にかつ安定的に製造され、より容易かつ再現可能的に患者へ投与され、低い初期血漿濃度を提供して望まれない副作用を低下又は消失させるＧＬＰ−１配合物へのニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概略
本発明は、以下のパラグラフ、並びに特許請求の範囲において要約することができる。
１つの態様において、本発明は、下記を含む制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
下記式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに、
酢酸塩及び／又は酢酸。
別の態様では本発明は、上記医薬組成物を含む容器を提供する。
更に別の態様において、本発明は、下記ステップを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
Ａ：液体、酢酸塩及び／又は酢酸、並びにペプチド類似体を組み合わせるステップ、及び
Ｂ：二価の金属及び／又は二価の金属塩を添加し溶解するステップ。
更に別の態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病治療用の医薬組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】イヌへ約１ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。それぞれのケースでペプチドは、約１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチドを含み、ペプチド：Ｚｎモル比約１．５である水性亜鉛組成物として投与された。黒四角及び白四角は、ｐＨをここに記載するとおりＮａＯＨで調整した組成物を示す。黒三角は、ｐＨをＮａＯＨで調整されない組成物を示す。黒円は、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ−で緩衝された組成物を示す。
【図２】イヌへ約１５ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。それぞれのケースでペプチドは、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチドを含み、ペプチド：Ｚｎモル比約１．５である水性亜鉛組成物として投与された。黒四角及び白四角は、ｐＨをここに記載するとおりＮａＯＨで調整した組成物を示す。黒三角は、ｐＨをＮａＯＨで調整されない組成物を示す。黒円は、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ−で緩衝された組成物を示す。
【図３】イヌへ約１ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。それぞれのケースでペプチドは、下記半固体（ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ）水性亜鉛組成物として投与された。黒円：約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ｐＨ調整せず；白円：約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ｐＨ調整せず；白四角：約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ＮａＯＨでｐＨ調整；黒四角：約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約４：１、ＮａＯＨでｐＨ調整。
【図４】本発明のある配合物を調製するのに有用な様々な装置の概略図を提供する。
【図５】イヌへ約１ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。ペプチドは、ペプチド濃度約２％でペプチド：Ｚｎモル比約１．５：１である水性亜鉛組成物として投与された。
【図６】イヌへ約１５ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。ペプチドは、ペプチド濃度約２５％でペプチド：Ｚｎモル比約４：１である半固体亜鉛組成物として投与された。
【図７】イヌへ約１５ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。ペプチドは、ペプチド濃度約２３％でペプチド：Ｚｎモル比約１．５：１である半固体亜鉛組成物として投与された。
【図８】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）のＧＬＰ−１類似体ＨＣｌ塩試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。（１）ＣｕＣｌ2との（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2ＨＣｌ塩：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＣｕＣｌ2のモル比は１．５：１である。ペプチド濃度は水（ｗ／ｗ）中１０％（３０ｍＭ）で約ｐＨ５．５である。（２）ＺｎＣｌ2との（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2ＨＣｌ塩：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は１．５：１である。ペプチド濃度は水（ｗ／ｗ）中１０％（３０ｍＭ）であり、約ｐＨ５．５である。
【図９】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）のＧＬＰ−１類似体酢酸塩試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。ＺｎＣｌ2との（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は１．５：１である。ペプチド濃度は水（ｗ／ｗ）中１０％（３０ｍＭ）であり約ｐＨ５．５である。
【図１０】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）の図８に示す試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。
【図１１】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）の図９に示す試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。
【図１２】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）の図８に示す３種の試験配合物を単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に、注射部位に残っている（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の推定百分率を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、ＧＬＰ−１類似体を含む医薬組成物を提供する。特に好ましくは、式（Ｉ）のＧＬＰ−１類似体：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（Ｉ）又はその医薬的に許容される塩であり、上記組成物の配合物は、優れた製造、投与、薬物動態、及び薬力学特性を提供するだけでなく、負の副作用を弱める効果を提供する。好ましくは、本発明の医薬の組成物は、ｐＨ４を有し、上記［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2が濃度４ｍｇ／ｍｌで存在し、上記ＺｎＣｌ2が濃度０．５ｍｇ／ｍｌで存在する澄明な水性ＺｎＣｌ2溶液からなるものではない。
【００１８】
好ましい態様では、本発明は、好ましくは初期バーストが抑制された、改善された薬物放出プロファイルを有する医薬組成物を提供する。
本発明は又、延長された作用時間を有する、式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、以下のパラグラフ、並びに特許請求の範囲において要約することができる。
１つの態様において、本発明は、下記を含む制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；及びに
酢酸塩及び／又は酢酸。
好ましくは、本発明は、下記を含む制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに
酢酸塩及び／又は酢酸；
但し、二価の金属及び／又は二価の金属塩は、亜鉛及び／又は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは４〜５の範囲内であり；
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約１：１〜６：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約６：１〜１：１である。
【００２０】
好ましくは、ペプチド類似体の一部及び酢酸塩の一部は、ペプチド類似体の塩として存在する。
好ましくは、医薬的組成物の最終ｐＨは３．５〜６の範囲内である。更に好ましくは、医薬的組成物の最終ｐＨは４〜５の範囲内である。より更に好ましくは医薬的組成物の最終ｐＨは４．５±０．１である。組成物の最終ｐＨとは、投与可能である時点での組成物のｐＨである。
【００２１】
好ましくは、酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約０．５：１〜約１０：１である。更に、酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲が約１：１〜約６：１である医薬組成物が好ましい。より更に、酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲が約３．２：１（３．２±０．３２）である医薬組成物が好ましい。
【００２２】
好ましくは、二価の金属及び／又は二価の金属塩は、亜鉛及び／又は塩化亜鉛である。更に好ましくは、二価の金属及び／又は二価の金属塩は、塩化亜鉛である。
【００２３】
好ましくは、ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約６：１〜約１：１．更に好ましくは、ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比は約１．５：１（１．５±０．１５）である。
【００２４】
好ましくは、本発明は、下記を含む上記制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに酢酸塩及び／又は酢酸；
但し、二価の金属及び／又は二価の金属塩は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１の範囲内であり；
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約３．２：１（３．２±０．３２）であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約１．５：１（１．５±０．１５）である。
【００２５】
好ましくは、ペプチド類似体の濃度は、約１０重量／容量％（ｍｇ／ｍｌ）である。
好ましくは、亜鉛範囲の濃度は、０．２６重量／容量％〜２．３５重量／容量％（ｍｇ／ｍｌ）である。
【００２６】
好ましくは、組成物は、式（Ｉ）のペプチド類似体が被検体内で少なくとも約１週間放出されるように配合される。
好ましくは、組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体内で少なくとも約１週間、好ましくは２週間放出されるように配合される。
【００２７】
好ましくは、組成物は液体（又は希釈剤）を更に含む。この液体（又は希釈剤）は、溶媒又は懸濁液のビヒクルとして使用される。
好ましくは、液体は無菌水又はＮａＣｌ等の等張剤を含む無菌水から選ばれる。
【００２８】
好ましくは、医薬組成物は非経口的投与に適する。更に好ましくは、医薬組成物は注射による投与に適する。
好ましくは、医薬組成物は、温度５℃で少なくとも１年間の間使用可能状態での使用前貯蔵に適する。
好ましくは、医薬組成物は、全成分を、好ましくは全て一緒に混合して凍結乾燥無しに調製される。
【００２９】
別の態様では本発明は、上記医薬組成物を含む容器を提供する。好ましくは、容器はプレフィルドシリンジである。
【００３０】
好ましくは、本発明は、上記医薬組成物をプレフィルドしたシリンジを提供する。但し、この医薬組成物は下記を含む：
液体として水（ｑｓ２１０μｌ）；
２１ｍｇの式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属塩として０．５７１ｍｇの塩化亜鉛；及び
酢酸；
但し、上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１であり；
酢酸のペプチド類似体に対するモル比は約３．２：１（３．２±０．３２）であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比は約１．５：１（１．５±０．１５）である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、下記ステップを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
Ａ：液体、酢酸塩及び／又は酢酸、並びにペプチド類似体を組み合わせるステップ、並びに
Ｂ：二価の金属及び／又は二価の金属塩を添加し溶解するステップ。
【００３２】
好ましくは、上記方法は更に下記ステップを含む。
Ｃ：ステップＢから得られる組成物を無菌ろ過するステップ、及び
Ｄ：容器へ組成物を充填するステップ。
【００３３】
好ましくは、ステップＡの前に、酢酸及び無菌水を組み合わせる。
更に好ましくは、上記方法は、更に無菌水を溶液に加える最終ステップを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病治療用の医薬組成物の使用を提供する。．
好ましい態様では、本発明は又、制御放出医薬プロファイルのために、ｉｎ ｖｉｖｏの生理学的なｐＨで沈殿して、その場で沈殿物（ｄｅｐｏｓｉｔ）を生成する医薬組成物を提供する。
【００３５】
本発明の更なる態様は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩と医薬的に許容されるキャリア又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、上記キャリア又は希釈剤は、水を含む。
【００３６】
好ましい態様では、本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドの塩で、又はペプチドとその塩の混合物で製造される化合物又はＧＬＰ−１ペプチド類似体を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
好ましくは、上記医薬組成物中のＧＬＰ−１ペプチド類似体の塩は、酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、クエン酸、メタンスルホン酸、又はトルエンスルホン酸等の、有機酸の塩の医薬的に許容される塩、又は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、又はリン酸等の、無機酸の塩の医薬的に許容される塩のリストより選択される。塩酸等の強酸の医薬的に許容される塩が特に好ましい。強酸は、４．５未満のｐＫＡを有する酸として定義される。上記医薬組成物中の、追加的好ましいペプチド塩は、酢酸又はトリフルオロ酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、又はクエン酸の塩等の有機酸の塩である。
【００３８】
１つの好ましい態様では、塩型ＧＬＰ−１類似体の非塩型ＧＬＰ−１類似体に対するモル比を調整することによって、医薬組成物の溶解性、ｐＨ、及び放出プロファイルを調節して、放出プロファイルを延長させて、ＧＬＰ−１類似体濃度の初期スパイクを抑えることができる。
【００３９】
好ましい態様において、医薬組成物は、二価金属を更に含み、該組成物の水溶性を低下させて、それにより放出プロファイルを延長させると同時に、血漿濃度における初期のバースト又はスパイクを抑えることができる。好ましい二価金属には、亜鉛と銅が含まれる。二価金属の塩型が特に好ましく、限定するものではないが、二価金属の塩化物及び酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ）が含まれる。ＣｕＡｃ2、ＣｕＣｌ2、ＺｎＡｃ2、及び／又はＺｎＣｌ2が最も好ましい。好ましくは、上記医薬組成物中の二価金属及び／又は二価金属塩は、約０．０００５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。更に好ましくは、上記医薬組成物中の二価金属及び／又は二価金属塩は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。より好ましくは、上記医薬組成物は希釈剤を含み、ここで上記希釈剤は、医薬的に許容される水溶液を含む。希釈剤は、滅菌水又は等張剤としてＮａＣｌ等の塩の無菌水溶液を含む。
【００４０】
文言「等張剤」は本明細書では、血液と同一の浸透圧を維持する、溶液中の塩又は賦形剤を意味する。
文言「医薬的に許容される」は本明細書では、哺乳類又はヒトにより生理学的に許容されることを意味する。
【００４１】
更なる態様において、上記医薬組成物は、二価金属及び／又は二価金属塩を更に含み、ここで上記医薬組成物における上記ＧＬＰ−１類似体の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比範囲は、約６：１〜約１：１である。好ましくは、上記比範囲は、約５．５：１〜約１：１である。より好ましくは、上記比範囲は、約５．４：１〜約１．５：１である。更により好ましくは、上記比範囲は、約５．４：１、４．０：１、又は１．５：１である。最も好ましくは、上記比範囲は、約１．５：１である。ＧＬＰ−１類似体の、二価の金属及び／又は二価の金属塩に対するモル比は、医薬組成物中のペプチド類似体のモル割合の、二価の金属及び／又は二価の金属塩のモル割合に対する比を意味する。ペプチド類似体のモル割合は、ペプチド類似体塩の形で存在する全てのペプチドを含む。本発明でこの場合、「約」が意味するのは、１．５：１±１０％の各目標値の比であるので、期待される比には、例えば、１．３５〜１．６５：０．８５〜１．１５を包含する比が含まれる。
【００４２】
好ましくは、上記医薬組成物は、水性混合物、懸濁液、又は溶液を含み、ＧＬＰ−１の上記類似体、式（Ｉ）の化合物、又はその塩は、約０．５％〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。より好ましくは、上記ＧＬＰ−１類似体及び／又はその塩の上記水性混合物、懸濁液、又は溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％，又は３０％（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、上記ＧＬＰ−１類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１４％、１５％、１６％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２９％，又は３０％（ｗ／ｗ）である。なおより好ましくは、ＧＬＰ−１の上記類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、９％、１０％、１１％、２２％、２３％、２４％、２５％，又は２６％（ｗ／ｗ）である。更により好ましくは、ＧＬＰ−１の上記類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、２２％、２３％、２４％、２５％，又は２６％（ｗ／ｗ）である。なおより好ましくは、ＧＬＰ−１の上記類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、５％、１０％、２３％又は２５％（ｗ／ｗ）である。「約」は、以下のことを意味する：約０．５％〜約４％の濃度では、目標値の±０．５％が目的とする範囲である（例えば、０．５％〜１．５％は、約１％である）；約５％以上の標的濃度では、目標値の２０％が目的とする範囲である（例えば、８％〜１２％は、約１０％である）。
【００４３】
好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2、ＧＬＰ−１の類似体又はその塩の医薬組成物中の濃度は、約１％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。より好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記医薬組成物中の濃度は、約２％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。
なおより好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記医薬組成物中の濃度は、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。最も好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記医薬組成物中の濃度は、約２３％又は約２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。
【００４４】
好ましい態様において、ＧＬＰ−１の類似体、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の医薬組成物中の濃度は、約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、該ペプチドの二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約５．４：１である。より好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記組成物中の濃度は、約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、上記比は、約４．０：１である。なおより好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記組成物中の濃度は、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、上記比は、約５．４：１である。なお更に好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記組成物中の濃度は、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、上記比は、約４．０：１である。
【００４５】
好ましくは、上記二価金属及び／又は二価金属塩は、塩化亜鉛又は酢酸亜鉛として提供される。より好ましくは、上記酢酸亜鉛は、ＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏとして提供される。
代わりの態様において、上記二価金属及び／又は二価金属塩は、塩化銅又は酢酸銅として提供される。
【００４６】
１つの態様において、上記医薬組成物のｐＨは、塩基を使用して上方へ調整される。より好ましくは、上記ｐＨ調整は、ＮａＯＨを使用してなされる。なおより好ましくは、上記医薬組成物のｐＨは、０．９％ＮａＣｌを使用して約１／２の初期濃度へ希釈する場合、直接電位差定量法を使用して約５．０〜５．５のｐＨ値が得られるように、ＮａＯＨで調整する。
【００４７】
本発明の好ましい態様は、医薬組成物又は制御放出配合物を提供し、この組成物は、ＧＬＰ−１のペプチド類似体又はその塩、例えば、式（Ｉ）の化合物又はその塩が、それが必要な被検体、例えば哺乳動物、好ましくはヒトの体内で、延長された期間の間放出されるように配合される。好ましくは、上記化合物の放出は、少なくとも１時間にわたり、より好ましくは、少なくとも４、６、１２、又は２４時間にわたる。なおより好ましくは、上記組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体の体内で少なくとも３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間の間放出されるように配合される。なおより好ましくは、上記組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体の体内で少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間放出されるように配合される。なおより好ましくは、上記組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体の体内で少なくとも約２、３又は４週間放出されるように配合される。
【００４８】
文言「制御放出」は本明細書では、少なくとも１週間、更に好ましくは少なくとも２週間、生物学的に活性なＧＬＰ−１類似体の測定可能な血中濃度を生じる放出を意味する。
【００４９】
本発明の１つの態様において、ＧＬＰ−１ペプチド類似体の上記医薬組成物中の塩含量の調節は、ＧＬＰ−１ペプチド類似体の医薬組成物内での溶解性及び安定性を改善して、更に、初期バーストを減少させることによって、ｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルに改善を提供する。
【００５０】
上記明細書の文言「調節（調整）」は、塩型ＧＬＰ−１類似体の、非塩型ＧＬＰ−１類似体に対するモル比を調節することにより、塩含有量を調節（調整）することを意味する。
【００５１】
なおより好ましくは、上記医薬組成物中のペプチド塩は、塩酸又は酢酸の塩、又は式（Ｉ）の上記ペプチドの塩化物又は酢酸塩である。上記医薬組成物において、酢酸塩又は塩化物は、酢酸塩又は塩化物の式（Ｉ）の上記化合物に対する最終モル比として、約０．５：１〜約１０：１の範囲で存在する。より好ましくは、上記比は、約０．８：１〜約９：１である。なおより好ましくは、上記比は、約１：１〜約６：１である。最も好ましくは、上記比は、約３．０：１、特に３．２：１である。
【００５２】
本発明のこの態様において、酢酸塩又は塩化物のペプチドに対するモル比は、医薬組成物中のペプチドのモル割合に対する、医薬組成物中の酢酸塩（ＣＨ3ＣＯＯ-）又は塩化物（Ｃｌ-）のモル割合を意味する。医薬組成物中３：１のモル比の例において、酢酸塩は、割合においてペプチドのモル含量の３倍である。これは、ある化合物の他の化合物に比較した化学量論比である。
【００５３】
酢酸塩のモル割合及びペプチドのモル割合は、ペプチド類似体の塩として存在する全ての酢酸塩及びペプチドを含む。最初に調製されたペプチド中の酢酸塩濃度は、ペプチド調製に使用された方法に応じて変動する。従って、配合物へ添加される酢酸塩の量は、ペプチドの酢酸塩に対する適切な最終割合が得られるように調節される必要がある。
【００５４】
別の態様では、本発明は哺乳類を治療するために上記組成物を使用する方法に関する。
【００５５】
文言「約」は、この好ましい態様では、１．５：１±１０％の各目標値の比を意味するので、期待される比には、例えば、１．３５〜１．６５：０．８５〜１．１５を包含する比が含まれる。
【００５６】
本発明の追加的好ましい態様において、医薬組成物のｐＨは、組成物の酢酸塩含量の調節によって調整される。好ましくは、上記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ３〜ｐＨ６である。より好ましくは、上記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ３．５〜５．５である。最も好ましくは、上記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ４．２〜ｐＨ４．６である。
【００５７】
好ましくは、医薬組成物を酸性化するために、酢酸塩含量を、酢酸を加えることによって増加できる。
【００５８】
１つの態様において、上記医薬組成物のｐＨは、低い酢酸塩含有量又は酢酸塩を含まないＧＬＰ−１の類似体のペプチド塩より始めて、酢酸塩含量の調節により高めることができる。
【００５９】
好ましい態様において、酢酸塩又は塩化物の含量の調節による、最終医薬組成物におけるｐＨの調整は、初期バーストを減少させることによって、ペプチド濃度、亜鉛濃度、化学安定性、物理安定性、及びｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイル等の変数の調節を可能にする。
【００６０】
本発明の１つの側面では、Ｚｎ又はＣｕ含量を固定して、酢酸塩含量を調節することによってｐＨを制御する。酢酸塩の含量を増加させると、溶解性や物理安定性の改善が示され、酢酸塩の含量を減少させると、ｐＨに対しては増加効果を、Ｃmaxに対しては減少効果を示す。
【００６１】
好ましい態様において、上記医薬組成物は、水性混合物、懸濁液、又は溶液を含む。
【００６２】
本発明は又、ＧＬＰ−１アゴニスト効果を引き起こす方法を提供し、この方法は、GLP-1(7-36)NH2リガンドの受容体をＧＬＰ−１類似体又はその塩と直接的又は間接的に接触させるステップを含む。
【００６３】
上記方法において、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2リガンドの上記受容体は、動物被検体、好ましくは霊長動物、より好ましくはヒトに存在している。従って、この態様において、本発明は、それを必要とする被検体内でＧＬＰ−１受容体よりアゴニスト効果を引き起こす方法を提供し、該方法は、本発明の組成物を上記被検体へ投与するステップを含み、ここで上記組成物は、ＧＬＰ−１類似体又はその医薬的に許容される塩の有効量を含む。
【００６４】
上記方法の好ましい態様において、上記被検体は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、肥満、食欲過多、満腹感の不足、及び代謝障害からなる群より選択される疾患又は症状に罹患しているか又はそれらを発症するリスクのあるヒトである。好ましくは、上記疾患は、Ｉ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病である。
【００６５】
上記方法の別のより好ましい態様において、上記被検体は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、及び摂食の抑制が所望される障害、中枢神経系の疾患又は障害（例えば、神経組織発生の変調による、及び、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神系の症候群）、過敏性腸管症候群、心筋梗塞（例えば、それに関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること）、卒中、急性冠症候群（例えば、Ｑ波の非存在を特徴とする）心筋梗塞、術後の異化変化、冬眠心筋又は糖尿病性心筋症、不充分な尿ナトリウム排出、過度の尿カリウム濃度、有害な血液量過多症に関連した状態又は障害（例、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）、多房性卵巣症候群、呼吸窮迫、腎障害、左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群等の胃腸障害（即ち、十二指腸洞の運動の阻害による）、重症疾患多発ニューロパシー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、異常脂質血症、虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷、及び冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているか又はそれらを発症するリスクのあるヒトである。
【００６６】
本発明の追加の態様において、本発明は、その必要な被検体において、肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換する、β細胞の悪化を防いでβ細胞増殖を刺激する、ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制する、変力応答を誘発して心収縮を増加させる、非消化管経路を介した（即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入経路を介した）栄養摂取を改善する、内視鏡手技を受ける被検体に前処置する、並びにトリグリセリドレベルを調節する方法を特徴とし、上記方法は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩の有効量を含んでなる本発明の配合物を上記被検体へ投与することを含んでなる。好ましくは、上記被検体は、哺乳動物、より好ましくは霊長動物、なおより好ましくはヒトである。
【００６７】
本発明のペプチド塩として利用する好ましいＧＬＰ−１ペプチドは、ここで例えば、以下の形式：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2で示され、天然の配列を置換したアミノ酸を最初の組括弧の間に置く（例えば、Ａｉｂ8,35は、ｈＧＬＰ−１中のＡｌａ8及びＧｌｙ35がＡｉｂで置換されていることを示す）。Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸の略語である。略語ＧＬＰ−１は、グルカゴン様ペプチド−１を意味し；ｈＧＬＰ−１は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１を意味する。二番目の組括弧の間にある数字は、ペプチド中に存在するアミノ酸の番号を意味する（例えば、ｈＧＬＰ−１（７−３６）は、ヒトＧＬＰ−１のペプチド配列のアミノ酸７〜３６を意味する）。ｈＧＬＰ−１（７−３７）の配列は、Ｍｏｊｓｏｖ，Ｓ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，．４０，１９９２，ｐｐ．３３３−３４２に収載されている。ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2中の表記：「ＮＨ2」は、このペプチドのＣ末端がアミド化していることを示す。ｈＧＬＰ−１（７−３６）は、Ｃ末端が遊離酸であることを意味する。ｈＧＬＰ−１（７−３８）中、３７位と３８位の残基は、特記無い場合はそれぞれＧｌｙとＡｒｇである。
【００６８】
本発明に使用される特に好ましいＧＬＰ−１ペプチド類似体は、医薬的に許容される塩の形態である。それらの塩の例として、限定されるものではないが、有機酸（例、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トリエンスルホン酸、又はパモ酸）、無機酸（例、塩酸、硫酸、又はリン酸）、及びポリマー酸（例、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ乳酸−グリコール酸の共重合体）とともに生成されるものが挙げられる。
本発明のペプチドの塩を調製する典型的な方法は当該技術分野で公知であり、塩交換の標準的方法によって達成できる。従って、本発明のペプチドのＴＦＡ塩（このＴＦＡ塩は、ＴＦＡ含有緩衝溶液で溶出させる分取用ＨＰＬＣを使用してペプチドを精製することにより生じる）は、該ペプチドを少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液に溶かすことによって、酢酸塩等の別の塩へ変換できる。得られた溶液をsemi-prep HPLCカラム(商品名Zorbax、300SB、C-8)へ適用する。このカラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）流速４ｍｌ／分（３０分間で２０％〜１００％の溶液Ｂ）での線形勾配（溶液Ａは、０．２５Ｎ酢酸水溶液であり；溶液Ｂは、アセトニトリル／水（８０：２０）中０．２５Ｎ酢酸である）で溶出させる。該ペプチドを含有する分画を採取して、凍結乾燥させる。
【００６９】
当業者に公知のとおり、ＧＬＰ−１の既知の使用と潜在的な使用は多様であり、多数ある（Todd, J. F.ら, Clinical Science, 1998, 95, pp. 325-329; 及び Todd, J. F.ら, European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, pp. 533-536 を参照）。従って、アゴニスト効果を引き起こす目的のために本発明の化合物を投与すると、ＧＬＰ−１それ自体と同じ効果及び用途を有し得る。これらのＧＬＰ−１の多様な使用は、以下のように要約できる：Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、代謝障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、摂食の抑制が所望される障害、並びに、本明細書で検討されるに様々な他の症状及び障害の治療。従って、本発明には、その範囲内に、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含んでなる、本明細書記載の医薬組成物が含まれる。
【００７０】
本発明の配合物中の有効成分の投与量は、変動してよいが、有効成分の量は、好適な投与量が得られるものであることが必要である。選択される投与量は、目的とする治療効果、投与経路、及び治療期間に依存し、通常は担当医が決定する。一般に、本発明の活性に有効な投与量は、１×１０-7〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１×１０-4〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあり、これは、単回用量として投与しても、複数回の投与量で分割投与してもよい。
【００７１】
本発明の配合物は、好ましくは、非経口的に、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下等へ投与する。
【００７２】
本発明による非経口投与用の調製物には、目的とするｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルが達成されるのならば、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液、ゲル、又はエマルジョンが含まれる。非水溶媒又はビヒクルの例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油又はトウモロコシ油等の植物油、ゼラチン、及び、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。それらの剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等のアジュバントを含有してもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターに通すろ過によって、滅菌剤を組成物へ配合することによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって無菌化できる。それらは又、無菌水や他の注射可能な無菌媒体中に、使用直前に溶かすことのできる無菌の固形組成物の形態で製造できる。
【実施例】
【００７３】
ペプチドの合成：
本発明を実施するのに有用なペプチドは、標準の固相ペプチド合成によって製造可能であり、それにより製造した。例えば、Stewart, J. M.ら,Solid Phase Synthesis（ピアス・ケミカル社、第２版、1984年）を参照。
【００７４】
下記実施例には、それにより本発明を有利に実施できるペプチドを作製するために使用可能であり、それを使用した合成法について記載するが、この合成法は、当業者に公知である。他の方法も当業者に知られている。実施例は、例示の目的のために提供するのであって、本発明の範囲をいかなるやり方でも限定するものではない。
【００７５】
ＧＬＰ−１類似体等の上記ペプチドは、当業者に公知の異なる合成法で入手可能であり、その方法はペプチドの最終沈殿、凍結乾燥法、真空乾燥、又は当分野で公知の他の乾燥法を含むこともできる。イオン交換クロマトグラフィー、緩衝液の浸透圧交換、及びダイフィルトレーション（difiltration）は、本発明において、異なる塩型の該ペプチドを精製又は選択するのに適した方法であり得る。
【００７６】
Ｂｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、及びＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）は、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。Ｂｏｃ−Ａｕｎ−ＯＨは、Ｂａｃｈｅｍ社（ペンシルヴェニア州キング・オブ・プルシア）より購入した。Ｂｏｃ−Ａｖａ−ＯＨ及びＢｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（イリノイ州ウッドデール）より購入した。Ｂｏｃ−２Ｎａl−ＯＨは、Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．社（オレゴン州オールバニー）より購入した。
【００７７】
本明細書に使用する他の略語の完全名は、以下の通りである：Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル、ＨＦはフッ化水素、Ｆｍはホルミル、Ｘａｎはキサンチル、Ｂｚｌはベンジル、Ｔｏｓはトシル、ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニル、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸塩、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミン、ＨＯＡｃは酢酸、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、２ＣｌＺは２−クロロベンジルオキシカルボニル、２ＢｒＺは２−ブロモベンジルオキシカルボニル、ＯｃＨｅｘはＯ−シクロヘキシル、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＨＯＢｔはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＰＡＭ樹脂は４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、そしてＢｉｓ−Ｔｒｉｓはビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（即ち、２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）を表す。用語「ハロ」又は「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。
【００７８】
他に定義のない限り、本明細書に使用するすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。又、本明細書で言及された出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、いずれも参照により組み込まれる。
【００７９】
実施例１；（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の詳細な合成手順は、その内容がその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許公開公報番号ＷＯ００／３４３３１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０９６６０）で提供されている。簡潔には、該化合物は、加速Ｂｏｃ化学固相ペプチド合成を行うように変更したアプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）商品名モデル４３０Ａペプチド合成機で合成した。Schnolzerら, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180 (1992) を参照。０．９１ｍｍｏｌ／ｇの置換された４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ社，カリフォルニア州ベルモント）を使用した。Ｂｏｃアミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ社，カリフォルニア州トーランス；Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社，カリフォルニア州ラホヤ）を側鎖保護を以下のとおり行って使用した：Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、及びＢｏｃ−Ｔｒｐ（Ｆｍ）−ＯＨ。
Ｂｏｃ基は、１００％ ＴＦＡ、２×１分間の処理により外した。Ｂｏｃアミノ酸（２．５ｍｍｏｌ）は、４ｍＬのＤＭＦ中のＨＢＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．０ｍＬ）で予め活性化して、ペプチド−樹脂ＴＦＡ塩の中和に先立つことなくカップリングさせた。カップリング時間は５分であった。但し、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ残基と以下の残基：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）−ＯＨではカップリング時間は２時間であった。
【００８０】
ペプチド鎖の組立ての最後に、樹脂を２０％メルカプトエタノール／１０％ ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液で２×３０分間処理して、Ｈｉｓ側鎖上のＤＮＰ基を外した。次いで、１００％ ＴＦＡで２×２分間の処理によりＮ末端Ｂｏｃ基を外した。ＤＭＦ中１０％ ＤＩＥＡでのペプチド−樹脂の中和（１×１分）の後で、１５％エタノールアミン／１５％水／７０％ ＤＭＦの溶液で２×３０分間の処理により、Ｔｒｐの側鎖上のホルミル基を外した。このペプチド−樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄し、減圧下乾燥させた。１ｍＬのアニソール及びジチオスレイトール（２４ｍｇ）を含有する１０ｍＬのＨＦ中で、ペプチド−樹脂を０℃で７５分間撹拌することによって、最終の開裂を行った。窒素流によってＨＦを除去した。残渣をエーテル（６×１０ｍＬ）で洗浄し、４Ｎ ＨＯＡｃ（６×１０ｍＬ）で抽出した。
【００８１】
水性抽出液中のペプチド混合物を、逆相ＶＹＤＡＣ（登録商標）Ｃ18カラム（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ社，マサチューセッツ州サウスバラ）を使用する逆相分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。１０ｍｌ／分の流速の線形勾配（１０５分にわたり２０％〜５０％のＢ溶液）（Ａ溶液＝０．１％ ＴＦＡを含有する水；Ｂ溶液＝０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル）でカラムを溶出させた。分画を採取して、分析用ＨＰＬＣで確認した。純粋な生成物を含有する分画を合わせて、凍結乾燥させた。この化合物の合成の１例では、１３５ｍｇの白色固形物を得た。純度は、分析用ＨＰＬＣ分析に基づけば９８．６％であった。エレクトロスプレー質量分光計（ＭＳ（ＥＳ））Ｓ分析によると、分子量は３３３９．７であった（３３３９．７の計算分子量と一致）。
【００８２】
実施例２
配合手順Ｉ
２．１；材料、ストック溶液、計算：
Ａ）材料：ＺｎＣｌ2、ＮａＯＨペレット、及び塩酸（３５％）をＰａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ社（スペイン、バルセロナ）より入手した。ＷＦＩ（注射／灌注用無菌水：sterile water for injection/irrigation）をＢ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社（スペイン、バルセロナ）より入手した。
【００８３】
Ｂ）ストック溶液：
（ｉ）ＺｎＣｌ2，ｐＨ＝３：
１．撹拌しながら、３５％ ＨＣｌをＷＦＩへ加えて、ｐＨ＝３とする。
２．容量フラスコに、秤量した量のＺｎＣｌ2を移す。撹拌しながら、ｐＨ＝３ ＨＣｌを加えて、約１〜４ｍｇ ＺｎＣｌ2／ｍｌの最終濃度とする。
【００８４】
（ｉｉ）ＺｎＣｌ2，ｐＨ＝２：
１．撹拌しながら、３５％ＨＣｌをＷＦＩへ加えて、ｐＨ＝２とする。
２．容量フラスコに、秤量した量のＺｎＣｌ2を移す。撹拌しながら、ｐＨ＝２のＨＣｌを加えて、約４〜１２ｍｇ ＺｎＣｌ2／ｍｌの最終濃度とする。
【００８５】
（ｉｉｉ）ＮａＯＨ，０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ：
１．容量フラスコに、秤量した量のＮａＯＨを移す。撹拌しながら、ＷＦＩＩを加えて、約０．１〜１０ｍｇ ＮａＯＨ／ｍｌの最終濃度とする。
【００８６】
（ｉｖ）凍結乾燥２０ｍｇアリコート（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／バイアル：
１．酢酸及びＷＦＩの０．０４％（ｖ／ｖ）希釈液を調製する。
２．容量フラスコに、秤量した量の（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（酢酸塩）を移す。撹拌しながら、充分な０．０４％酢酸を加えて、最終濃度を２０ｍｇ（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ｍｌとする。０．４５ミクロンフィルターを使用するろ過滅菌に続いて、この溶液の１ｍｌアリコートを凍結乾燥バイアルへ移し、凍結乾燥させて、乾燥生成物を−２２℃で保存する。
【００８７】
（ｖ）凍結乾燥５０ｍｇアリコート（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／バイアル：
１．酢酸及びＷＦＩの０．１％（ｖ／ｖ）希釈液を調製する。
２．容量フラスコに、秤量した量の（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（酢酸塩）を移す。撹拌しながら、充分な０．１％酢酸を加えて、最終濃度を５０ｍｇ（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ｍｌとする。ろ過滅菌に続いて、この溶液の１ｍｌアリコートを凍結乾燥バイアルへ移して、凍結乾燥させる。
【００８８】
Ｃ）計算：
（ｉ）組成物の全重量／賦形剤の容量（Ｅ）を決定するには下記式を使用する：
Ｅ＝（Ａ×１００／Ｔ）−（Ａ／Ｐ）
ここで：
Ｅ＝賦形剤（ｍｇ）
Ａ＝純粋なペプチドの含量（ｍｇ）；
Ｔ＝組成物の標的濃度；例えば、標的が２％であるならば、２；及び
Ｐ＝純粋なペプチドの濃度（ｍｇペプチド／１００ｍｇ配合物）。
賦形剤の全容量に関しては、１ｍｌ＝１ｇという前提を適用する。
【００８９】
（ｉｉ）組成物溶液の各ｍｌ又はｇへ加えるべきＺｎＣｌ2の容量／重量（Ｗ）を決定するには：
ａ）ｐＨ調整をしない組成物では、Ｗ＝１００％ Ｅ；
ｂ）ペプチドが約１％又は約２％又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する液体配合物では、Ｗ＝８０％ Ｅ；
ｃ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝５０％ Ｅ；
ｄ）ペプチドが約２５％であり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝６６．６６％ Ｅ；
ｅ）ペプチドを凍結乾燥調製品より復元して、塩基を使用してｐＨを調整する配合物では、Ｗ＝９０％ Ｅ。
【００９０】
（ｉｉｉ）組成物溶液の各ｍｌ又はｇへ加えるべきＮａＯＨの容量／重量（Ｗ）を決定するには：
ａ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する配合物では、Ｗ＝２０％ Ｅ；
ｂ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝５０％ Ｅ；
ｃ）ペプチドが約２５％であり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝３３．３３％ Ｅ；
ｄ）ペプチドを凍結乾燥調製品より復元して、塩基を使用してｐＨを調整する配合物では、Ｗ＝１０％ Ｅ。
【００９１】
（ｉｖ）各組成物において使用すべきＺｎＣｌ2の濃度（ｍｇ／ｍｌ又はｍｇ／ｇ）を決定するには：
［ＺｎＣｌ2］＝（１３６．２９×Ａ）／（Ｗ×３３３９．７６×Ｒ）
ここで：
Ａ＝純粋なペプチドの含量（ｍｇ）；
Ｒ＝ペプチド／Ｚｎのモル比
ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％、又は約２３％までである配合物では、Ｒ＝１．５；
ペプチドが約２５％である配合物では、Ｒ＝４．０；及び、
Ｗ＝組成物溶液の各ｇ又はｍｌへ加えるべきＺｎＣｌ2溶液の重量（ｇ）又は容量（ｍｌ）。
【００９２】
２．２；１〜１０％の凍結乾燥ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整なしの組成物の調製：
本明細書に使用される、ある割合のペプチドを含む配合物は、組成物の全重量に対しある重量のペプチドを含む配合物を記載するものであり、例えば、１％ペプチドは、１００ｇの全組成物につき１ｇのペプチドを含む配合物を記載する。約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む配合物は、以下のように調製した。上記のように製造した（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の凍結乾燥試料を、１００％の全賦形剤容量と［ペプチド：Ｚｎ］＝１．５：１でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と完全に混合した。
【００９３】
Ａ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を２ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（０．２７２ｍｇ／ｍｌ；上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１％組成物を調製する。
【００９４】
Ｂ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を１ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（０．５４４ｍｇ／ｍｌ；上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して２％組成物を調製する。
【００９５】
Ｃ）５０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｖ）を参照）を０．４５ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（３．０２３ｍｇ／ｍｌ；上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１０％組成物を調製する。
【００９６】
凍結乾燥ペプチドと溶液をそのまま室温まで平衡化した。凍結乾燥ペプチドを含有するバイアルへ指定容量のＺｎＣｌ2溶液を注入して、１％又は２％ペプチド組成物では約２分間、１０％ペプチド組成物では約６０分間、又はすべての凍結乾燥ペプチドが完全に水和して溶液にペプチドの塊がなくなるまで、水和を進行させた。水和に続き、復元したペプチドを約１分間振り混ぜる。
【００９７】
溶かしたペプチドの適正量を投薬のために取り出すことができる。例えば、上記Ａで調製した１％ペプチド溶液の１００μｌは、１ｍｇ用量に相当し、上記Ｂで調製した２％ペプチド溶液の５０μｌは、１ｍｇ用量に相当し、上記Ｃで調製した１０％ペプチド溶液の１５０μｌは、１５ｍｇ用量に相当する。
【００９８】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチドとＺｎＣｌ2の量を変動させて、下記に詳述する１％、２％、及び１０％組成物以外の組成物、並びに目的とする投与量とすることができる。
【００９９】
２．３；１〜１０％の凍結乾燥ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整有りの組成物の調製：
約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む配合物は、以下のように調製した。上記のように製造した（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の凍結乾燥試料を全賦形剤容量の９０％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と完全に混合した。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の目的とするｐＨとする。
【０１００】
Ａ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を１．８ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１％組成物を調製する。
Ｂ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を０．９ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して２％組成物を調製する。
Ｃ）５０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｖ）を参照）を０．４０ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１０％組成物を調製する。
【０１０１】
希釈ＮａＯＨ溶液の必要量（全賦形剤容量の１０％）を上記溶液へ加えて、標的濃度及びｐＨそれぞれとする。例えば：
１％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．２ｍｌを加え、
２％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．１ｍｌを加え、
１０％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．０５ｍｌを加える。
【０１０２】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、下記１％、２％、及び１０％組成物以外の組成物とすることができる。
【０１０３】
２．４；１〜１０％のペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整なしの液体組成物の調製：
約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む液体配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量し、ＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と混合して、１％、２％、１０％までのペプチドの標的濃度とした。混合に続き、組成物をろ過滅菌して、使用まで保存する。
【０１０４】
２．５；１〜１０％ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整有りの液体組成物の調製：
約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む液体配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量し、全賦形剤容量の８０％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と完全に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ2でもＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏでもよい。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の目的とするｐＨとする。この方法を使用して、調製物：Ｃ５〜Ｃ１３を調製した。
【０１０５】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、本明細書に記載する１％、２％、及び１０％以外の組成物とすることができる。
【０１０６】
２．６；２５％ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整なしの半固体／ゲル組成物の調製：
約２５％のペプチドを含む半固体又はゲルの配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量して、全賦形剤容量の６６．６６％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ２）と完全に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ2でもＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏでもよい。この方法を使用して、調製物：Ｃ１及びＣ２を調製した。
【０１０７】
より具体的には、この半固体又はゲル組成物は、「プッシュ−プル」混合法を使用して調製した：
ａ）所望量のペプチドを、特殊な双方向手動バルブ「ＨＶ」（内径＝０．５ｍｍ）を予め取り付けた使い捨てシリンジ「Ｓ１」の筒へ秤量して、シリンジルアーホール（Luer hole）の内側に管（tubing）を入れた；
ｂ）シリンジプランジャーをステンレススチールロッド「ＳＲ」で留めた；
ｃ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を真空源へ連結して、「ＨＶ」を開いた。１０分後、ＨＶを閉じた；
ｄ）第二の使い捨てシリンジ「Ｓ２」の筒へ亜鉛溶液を正確に秤量した；
ｅ）次いで、「Ｓ２」を「ＨＶ」の開放部分へ連結した；
ｆ）「ＨＶ」を開いて、ペプチド粉末を含有する筒「Ｓ１」へ真空によって溶媒を引き入れた；
ｇ）「ＨＶ」を閉じて、溶媒シリンジ「Ｓ２」を外し、それにより「Ｓ１」中のペプチド粉末を水和させた；
ｈ）「ＳＲ」を外して、シリンジプランジャーをゆっくり解放した；
ｉ）「ＨＶ」を開けずにシリンジプランジャーを動かし（押して引く）、粉末の塊が溶媒に完全に浸るようにする；
ｊ）双方向ステンレスコネクタ「ＳＣ」（内径＝１．０ｍｍ）を、管がシリンジルアーホールの内側に入ったシリンジ「Ｓ２」に入れて、そのプランジャーを先端まで押した；
ｋ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を開いて真空を換気しててから、「ＨＶ」を外した。シリンジプランジャーを動かして、シリンジ筒中の空気を最少化した；並びに
ｌ）「Ｓ１」及び「Ｓ２」を「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して「Ｓ１」から「Ｓ２」へ混練した。
【０１０８】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、本明細書に記載する２５％以外の組成物とすることができる。
【０１０９】
２．７；２５％ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整有りの半固体／ゲル組成物の調製：
約２５％のペプチドを含む半固体又はゲルの配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量して、全賦形剤容量の６６．６６％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ２）と完全に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ2でもＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏでもよい。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の目的とするｐＨとする。この実施例では、該粉末へ加える液体の全容量を亜鉛溶液とＮａＯＨ溶液の間で分割しなければならない。従って、亜鉛溶液の濃度を調整して、必要とされる亜鉛溶液の全容量を、ペプチド粉末へ加える全液体容量の５０％へ減少させた（工程ｄ）。ペプチド粉末へ加える全液体容量の残りの５０％は、下記に詳述するように、ＮａＯＨ溶液として加えた。この方法を使用して、調製物：Ｃ３及びＣ４を調製した。
【０１１０】
このｐＨ調整した半固体又はゲル組成物は、「プッシュ−プル」混合法を使用して調製した：
ａ）所望量のペプチドを、特殊な双方向手動バルブ「ＨＶ」（内径＝０．５ｍｍ）を予め取り付けた使い捨てシリンジ「Ｓ１」の筒へ秤量して、シリンジルアーホールの内側に管を入れた；
ｂ）シリンジプランジャーをステンレススチールロッド「ＳＲ」で留めた；
ｃ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を真空源へ連結して、「ＨＶ」を開いた。１０分後、ＨＶを閉じた；
ｄ）第二の使い捨てシリンジ「Ｓ２」の筒へ亜鉛溶液を正確に秤量した；
ｅ）次いで、「Ｓ２」を「ＨＶ」の開放部分へ連結した；
ｆ）「ＨＶ」を開いて、ペプチド粉末を含有する筒「Ｓ１」へ真空によって溶媒を引き入れた；
ｇ）「ＨＶ」を閉じて、溶媒シリンジ「Ｓ２」を外し、それにより「Ｓ１」中のペプチド粉末を水和させた；
ｈ）「ＳＲ」を外して、シリンジプランジャーをゆっくり解放した；
ｉ）「ＨＶ」を開けずにシリンジプランジャーを動かし（押して引く）、粉末の塊が溶媒に完全に浸るようにする；
ｊ）双方向ステンレスコネクタ「ＳＣ」（内径＝１．０ｍｍ）を、管がシリンジルアーホールの内側に入ったシリンジ「Ｓ２」に入れて、そのプランジャーを先端まで押した；
ｋ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を開いて真空を換気してから、「ＨＶ」を外した。シリンジプランジャーを動かして、シリンジ筒中の空気を最少化した；
ｌ）「Ｓ１」及び「Ｓ２」を「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して「Ｓ１」から「Ｓ２」へ混練した；
ｍ）ホモジェナイゼーションの後で、混合した生成物のアリコートを取り出して、ペプチドの濃度を定量した；
ｎ）残りの中間バルク生成物を正確に秤量して、目的とするｐＨに達するために必要とされるＮａＯＨ溶液の量を計算した；
ｏ）第三の使い捨てシリンジ「Ｓ３」へＮａＯＨ溶液を正確に秤量した；及び
ｐ）シリンジプランジャーをゆっくり圧縮して、シリンジチャンバ中の空気を最少化した。両方のシリンジを「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して練り込んだ。
【０１１１】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、本明細書に記載する２５％以外の組成物とすることができる。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
３．０．；ＧＬＰ−１受容体アフィニティーの定量：
本発明を実施するのに有用な化合物について、以下の手順を使用して、ＧＬＰ−１受容体へ結合するその能力を試験することができる。
【０１１４】
細胞培養：
ＧＬＰ−１受容体を発現しているＲＩＮ ５Ｆラットインスリノーマ細胞（ＡＴＣＣ−＃ＣＲＬ−２０５８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，バージニア州マナッサス）を、１０％胎仔ウシ血清を含有するダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で培養して、５％ ＣＯ2／９５％空気の加湿雰囲気中に約３７℃で維持した。
【０１１５】
放射リガンド結合：
商品名Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（ニューヨーク州ウェストベリー）（設定６、１５秒）により、２０ｍｌの氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおけるＲＩＮ細胞のホモジェナイゼーションによって、放射リガンド結合試験用の膜を調製した。このホモジェネートを遠心分離（３９，０００ｇ／１０分）によって２回洗浄して、最終ペレットを、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１ｍｇ／ｍｌ商品名バシトラシン（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）、及び０．１％ ＢＳＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁させた。分析のために、０．０５ｍｌの非標識競合試験ペプチドを含めて、及び含めずに、アリコート（０．４ｍｌ）を０．０５ｎＭ（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）（約２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社，マサチューセッツ州ボストン）とともにインキュベートした。１００分のインキュベーション（２５℃）の後、結合した（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）を、０．５％ポリエチレンイミンに浸しておいた商品名ＧＦ／Ｃフィルター（Ｂｒａｎｄｅｌ社，メリーランド州ゲイサースブルグ）を通す急速ろ過によって、遊離型から分離した。次いで、このフィルターを、氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの５ｍｌアリコートで３回洗浄して、フィルター上に捕捉された結合放射活性をγ線スペクトロメトリー（Ｗａｌｌａｃ ＬＫＢ社，メリーランド州ゲイサースブルグ）によって計数した。特異的結合は、「結合した（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）全量」から「１０００ｎＭ ＧＬＰ−１（７−３６）（Ｂａｃｈｅｍ社，カリフォルニア州トーレンス）の存在下に結合した（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）量」を引いたものとして定義した。
【０１１６】
４．；ｐＨに対する溶解度の定量：
４．１．リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でのｐＨに対する化合物溶解度の定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、ＰＢＳ中のその溶解度を異なるｐＨ及び温度で測定することができる。
１パケットのプレミックス粉末（シグマ社製、製品番号：Ｐ−３８１３）を１リットルの脱イオン水に溶かしてストックＰＢＳ緩衝化溶液を作製して、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨ７．４である１０ｍＭリン酸緩衝食塩水を得た。このストック溶液のｐＨをリン酸及び／又は水酸化ナトリウムで調整することによって、異なるｐＨ値のＰＢＳ緩衝液を作製した。
【０１１７】
試験する化合物の２ｍｇ試料、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇをガラスバイアルへ秤量した。各バイアルへある一定のｐＨでＰＢＳ緩衝液の５０μｌアリコートを加えた。この溶液を激しく撹拌して、澄明になるまで、必要ならば音波処理した。試験する各ｐＨについて、２ｍｇの化合物を溶かすのに必要とした緩衝液の全容量記録して、溶解度を計算した。
室温（２０〜２５℃）で澄明であるペプチド溶液を冷蔵庫（４℃）に一晩入れてから、該ペプチドの４℃での溶解度を測定した。
【０１１８】
４．２．生理食塩水におけるｐＨに対する化合物溶解度の定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、生理食塩水中のその溶解度を、異なるｐＨ値及び温度で定量することができる。
９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによってストック生理食塩水溶液を調製する。このストック溶液のｐＨを、ＨＣｌ及び／又はＮａＯＨで調整することによって、異なるｐＨ値の生理食塩水溶液を作製する。
【０１１９】
試験する化合物の２ｍｇ試料、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇをガラスバイアル内へ秤量する。各バイアルへある一定のｐＨで生理食塩水溶液の５０μｌアリコートを加える。このバイアルを激しく撹拌して、澄明になるまで、必要ならば音波処理する。試験する各ｐＨについて、２ｍｇの化合物を溶かすのに必要とする緩衝液の全容量を記録して、溶解度を計算する。
室温（２０〜２５℃）で澄明溶液を冷蔵庫（４℃）に一晩入れてから、４℃での溶解度を測定する。
【０１２０】
４．３．生理食塩水中の化合物溶解度のｐＨ７．０での定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、ｐＨ＝７を有する生理食塩水中、室温での溶解度を定量することができる。
９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによって生理食塩水溶液を調製する。試験する化合物、例えば実施例１の化合物、の２ｍｇ試料をガラスバイアル内へ秤量して、激しい撹拌と音波処理を伴いながら、生理食塩水の１ｍｌアリコートを、澄明になるまで加える。２ｍｇのペプチドを溶かすのに必要とする生理食塩水の全容量を記録して、室温での溶解度を計算する。
【０１２１】
４．４．生理食塩水中の化合物溶解度の様々なｐＨでの定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、様々なｐＨ値を有する生理食塩水中の、室温での溶解度を定量することができる。
９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによってストック生理食塩水溶液を調製する。このストック生理食塩水溶液のアリコートをＨＣｌ及びＮａＯＨで処理することによって、様々なｐＨ値を有する生理食塩水溶液を入手する。
試験する化合物、例えば実施例１の化合物の、２ｍｇ試料をガラスバイアル内へ秤量する。生理食塩水緩衝液の５０μｌのアリコートを、ある一定のｐＨで加える。この溶液を、澄明になるまで激しく撹拌して音波処理する。２ｍｇのペプチドを溶かすのに使用する緩衝液の全容量を記録して、溶解度を計算する。
【０１２２】
５．亜鉛濃度に対する化合物の水溶解度の定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、ｐＨ７の水中のその溶解度を異なる亜鉛濃度で定量することができる。
ＺｎＣｌ2を脱イオン水に１００ｍｇ／ｍｌの濃度へ溶かして、ＨＣｌを使用してｐＨを２．７へ調整することによって、ストック亜鉛溶液を調製した。このストック溶液の滴正な希釈液を作製することによって、様々なＺｎＣｌ2濃度を有する溶液（「Ｚｎ試験溶液」）を調製した。
【０１２３】
試験する化合物の１ｍｇ、例えば、実施例１の化合物の１ｍｇを２５０μｌの各Ｚｎ試験溶液に溶かして、４ｍｇ／ｍｌの化合物を有する溶液を得る。次いで、０．２Ｎ ＮａＯＨを使用して、白色沈殿の形成が観察されるまでこの溶液のｐＨを調整した。この沈殿溶液を遠心分離して、ＨＰＬＣを使用して母液を分析した。試験化合物ピークのＵＶ吸収領域を測定して、試験化合物の母液中の濃度を較正曲線との比較により定量した。
本発明を実施するために使用できる化合物の代表例として、実施例１の化合物について直前に記載した分析方法で試験して、以下の結果を入手した（水性、ｐＨ７．０、室温）：
【０１２４】
【表２】
【０１２５】
６．ＩＥＦゲルを使用する、等電点（ｐＩ）の決定：
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の商品名Ｎｏｖｅｘ ＩＥＦ ｐＨ３−１０ゲルを使用して、ＧＬＰ−１ペプチド、例えば実施例１の化合物のｐＩを測定した。試験するペプチジル化合物を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度まで水に溶解した。それぞれの化合物について、得られた溶液の５μｌを５μｌのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２Ｘ（２０ｍＭアルギニン遊離基、２０ｍＭリジン遊離基、及び１５％グリセロールを含む）と混合して、生じる１０μｌ試料溶液をタンパク質標準試料とともにこのゲル上へロードした。
【０１２６】
ランニング緩衝液もＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手して、製造業者の製品説明書に従って、概ね以下のようにゲルを泳動した：１００Ｖ一定１時間、続いて２００Ｖ一定１時間、続いて５００Ｖ一定３０分間。
次いで、このゲルを、３．５％スルホサリチル酸を含有する１２％ ＴＣＡ中に３０分間固定してから、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｋｉｔ用製品説明書に従って、コロイド状クマッシーブルーで２時間染色してから、水中で一晩脱染色した。
【０１２７】
ゲルを走査して、プログラム：商品名Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ １．２によって分析した。１０．７、９．５、８．３、８．０、７．８、７．４、６．９、６．０、５．３、５．２、４．５、４．２及び３．５のｐＩ値を有する標準化合物のｐＩと比較して、未知ペプチドのｐＩを計算した。
実施例１の化合物の測定ｐＩは、７．６０であった。
【０１２８】
７．ラットでのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：
本発明の組成物について、以下のアッセイを使用して試験して、効果をｉｎ ｖｉｖｏで促進及び強化する能力を判定することができる。
【０１２９】
７．１．実験手順：
実験の前日、約３００〜３５０ｇの重量を有する成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ社，ニューヨーク州ジャーマンタウン）にクロロヒドレート麻酔下で右心房頚静脈カニューレを移植した。次いで、このラットを１８時間絶食させた後で、適正な試験組成物又はビヒクル対照を時点０で注射した。ラットは、実験全体を通して絶食状態であった。
１００ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2の溶液のｐＨ２．７を有するＨＣｌ水溶液での希釈によって、０．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2溶液を調製した。この溶液の２５０μｌに式（Ｉ）の化合物（（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2）の１ｍｇを溶かして、該化合物４ｍｇ／ｍｌ及びＺｎ０．５ｍｇ／ｍｌをｐＨ４で有する澄明溶液を得た。
【０１３０】
時点０で、（ａ）（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2）の直前の（immediately forgoing）溶液又はビヒクル対照のいずれかをラットに皮下（ｓｃ）注射した。両方の場合で注射容量はごく少なく（４〜６μＬ）、被検体へ投与したＧＬＰ−１化合物の用量は、７５μｇ／ｋｇであった。ｓｃ注射後の適正な時間に、５００μｌの血液試料を静脈内（ｉｖ）カニューレより吸引して、ラットにｉｖグルコースチャレンジを与えて、亢進したインスリン分泌の存在を試験した。グルコースチャレンジの時間は、化合物注射後０．２５、１、６、１２、及び２４時間であった。最初の血液試料を吸引採取した後で、グルコース（１ｇ／ｋｇ）をｉｖ注射して、５００μｌヘパリン添加生理食塩水（１０Ｕ／ｍｌ）を流した（flushed in）。その後、グルコース注射後２．５、５、１０、及び２０分で５００μｌの血液試料を吸引採取した。これらのいずれの後も、カニューレを介した５００μｌヘパリン添加生理食塩水（１０Ｕ／ｍｌ）のｉｖ注射を直ぐに行った。血液試料は遠心分離させ、各試料より血漿を採取して、インスリン含量をアッセイするまで、その試料を−２０℃に保存した。ラットインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ニューハンプシャー州ウィンダム）を使用して、各試料中のインスリンの量を定量した。
【０１３１】
７．１．１．結果：
グルコース注射によって誘導される、持続されたインスリン亢進活性が本実験の全２４時間にわたり観測された。
【０１３２】
８．イヌでのiｎ ｖｉｖｏアッセイ：
当業者が、活性化合物のｉｎ ｖｉｖｏ延長放出を促進する組成物の能力を定量可能とする、多くのｉｎ ｖｉｖｏアッセイが当分野で公知である。
【０１３３】
８．１．；１％ペプチド組成物：
例えば、１％（ｗ／ｗ）の式（Ｉ）の化合物をＺｎＣｌ2の緩衝化溶液に含んでなる（ペプチド：Ｚｎ比＝１．５：１．０）水性試験配合物を調製した。
全６頭の雄ビーグル犬（４２〜７８月齢で、体重１４〜２１ｋｇ）を、水及び１日１回の食餌（約４００ｇの乾燥標準食（ＳＡＦＥ １２５）への自由摂取で維持した。これらイヌは、試験組成物の投与前１８時間絶食させた。
試験組成物は、皮下経路によって、肩甲骨間の領域付近で投与した。投与の容量（各動物につき約２０μｌ）は、０．３３〜１２ｍｍの０．３ｍｌテルモ社シリンジ（ＢＳ＝３０Ｍ２９１３）によって作製した。このようにして、約０．２ｍｇペプチドの理論用量を達成した。
【０１３４】
血液試料を周期的に、投与後約０、８、１５、３０及び４５分、１、２、４、８及び１２時間、並びに１、２、３、４、５及び６日の時点で採取した。サンプリング後から遠心分離までの間、血液を速やかに冷却し、血漿をデカントして、継続中のアッセイまでは速やかに凍結させた。ペプチド血漿濃度の定量は、オフライン固相抽出の後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを備えたオンライン相抽出により行い、得られたデータは、商品名Ａｎａｌｙｓｔ ｖ１．２ソフトウェアによって管理処理した。
上記組成物は、活性ペプチドの少なくとも２日間の持続放出を示した。
【０１３５】
８．２．；１％（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2溶液：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された期間の間放出するその能力を検証した。以下の４種の組成物のそれぞれで、ペプチドの濃度は、約１％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、約１ｍｇであった。
溶液８．２．Ａ：（ｉ）９０％ ＺｎＣｌ2（０．２９８ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）１０％ ＮａＯＨ（０．９７５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．２．Ｂ：ＺｎＣｌ2の溶液（０．２８６ｍｇ／ｍｌ）中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．２．Ｃ：溶液８．２．Ｂに実質的に類似して、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ-を使用して緩衝化されている；
溶液８．２．Ｄ：溶液８．２．Ａに実質的に類似。
【０１３６】
これらの組成物は、図１に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１３７】
８．３．；１％（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2溶液：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。以下の組成物では、ペプチドの濃度は、約２％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、約１ｍｇであった。
溶液８．３：（ｉ）８０％ ＺｎＣｌ2（０．６９５ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）２０％ ＮａＯＨ（１．７５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
【０１３８】
この組成物は、図５に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１３９】
８．４．；１０％ペプチド溶液：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。以下の４種の組成物のそれぞれで、ペプチドの濃度は、約１０％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、約１５ｍｇであった。
溶液８．４．Ａ：（ｉ）９０％ ＺｎＣｌ2（３．３６７ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）１０％ ＮａＯＨ（５．０１ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．４．Ｂ：ＺｎＣｌ2の溶液（２．９９３ｍｇ／ｍｌ）中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．４．Ｃ：溶液８．４．Ｂに実質的に類似して、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ-を使用して緩衝化されている；
溶液８．４．Ｄ：溶液８．４．Ａに実質的に類似。
【０１４０】
これらの組成物は、図２に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４１】
８．５．；半固体組成物：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。組成物８．５．Ａでは、ペプチドの濃度は約５％であり、組成物８．５．Ｂ、８．４．Ｃ、及び８．５．Ｄでは、ペプチドの濃度は、約１０％（重量／重量）であった。ペプチドの亜鉛に対する比は、組成物８．５．Ａ、８．５．Ｂ、及び８．５．Ｃで約５．４：１であり、組成物８．５．Ｄでは、その比は約４．０：１であった。４種の組成物すべてで、投与したペプチドの用量は、約１ｍｇであった。
【０１４２】
組成物８．５．Ａ：ＷＦＩ中のＺｎＣｌ2（０．４０ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固体組成物中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
組成物８．５．Ｂ：組成物８．５．Ａに実質的に類似するが、ＺｎＣｌ2濃度を上方へ調整して、ペプチド：Ｚｎ比を約５．４：１に維持した。
組成物８．５．Ｃ：（ｉ）５０％ ＺｎＣｌ2（１．６９ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）５０％ ＮａＯＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固形物中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
組成物８．５．Ｄ：（ｉ）５０％ ＺｎＣｌ2（２．２８ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）５０％ ＮａＯＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固形物中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2。
【０１４３】
これらの組成物は、図３に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４４】
８．６．；半固体組成物：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。この組成物は、５．２２ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2溶液をｐＨ＝２．０で使用して配合した。充分なペプチドを提供して、ペプチドの亜鉛に対する比約４：１を有する２５％ペプチド半固体組成物を得た。この組成物のｐＨを、１０ｍｇ／ｍｌ ＮａＯＨを使用して本明細書記載のとおり調整した。投与したペプチドの用量は、約１５ｍｇであった。
【０１４５】
組成物８．６は、図６に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４６】
８．７．；半固体組成物：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。この組成物は、８．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2溶液をｐＨ＝２．０で使用して配合した。充分なペプチドを提供して、ペプチドの亜鉛に対する比約１．５：１を有する２３％ペプチド半固体組成物を得た。上記２．６節に詳述した方法に従って、この組成物を配合した。投与したペプチドの用量は、約１５ｍｇ（組成物の約６５μｌに相当する）であった。
【０１４７】
組成物８．６は、図７に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４８】
開示した配合物の様々な置換物（permutations）を用いた更なるアッセイを同様にｉｎ ｖｉｖｏアッセイへ適用して、本発明の組成物が式（Ｉ）の化合物に有用な医薬送達プラットフォームを提供することが確かめられ。本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド、ＺｎＣｌ2の量及びｐＨを変動させて、本明細書に記載の本発明の組成物を調製することができる。
【０１４９】
実施例９：
１．：１０％ペプチド溶液中の酢酸塩含量によるＰＫプロファイル調節
本実施例は、雄ビーグル犬における（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の薬物動態試験を開示し、それは１０％（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2及び塩化亜鉛を含有する２種の即時調合組成物［（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2：Ｚｎ＝１．５：１］の１５ｍｇ／イヌの用量レベルでの単回皮下投与の後に行われた。
このｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行う方法は、パラグラフ８．１で開示したものと同じである。
【０１５０】
本実施例は、医薬組成物中の酢酸塩含量によるＰＫプロファイル調節、従って、医薬組成物中の［酢酸塩／ペプチド］比のｐＨに対する影響を明らかにする。
このｐＨ調節は、酢酸塩含量の調節により制御されて、酢酸塩含量の減少は、ｐＨの増加効果を示す。
酢酸塩の変動は又、Ｃmaxに対する効果を示す。一般に、酢酸塩含量の減少は、Ｃmax値を減少させる。
酢酸塩含量の増加は、溶解性と物理安定性の改善を示す。
【０１５１】
選択した配合物によれば、酢酸塩／ペプチド比の調節による溶解性又は安定性に対する改善は、ペプチド／Ｚｎ比の例えばＣmaxに対する調節によって補償される。このことは、安定性、溶解性、ｐＨ又はＣｍａｘを調整する３つの可能な変数のシステムとして理解できる。
【０１５２】
本実施例では、略語「ＳＤ」は、標準偏差を意味する。「ＡＵＣ」は、血漿濃度−時間曲線下のアルテミシニン（Artemisinin）面積を意味する。
略語「ＭＲＴ」の意味は、平均滞留時間（ＭＲＴ）であり、ピーク薬物濃度の時間であるｔｍａｘとＭＲＴを比較してバイオアベイラビリティ率を推定するための変数である。時点０より最終サンプリング時間までのデータを使用して、ＭＲＴを計算した。
【０１５３】
表３には、異なる［酢酸塩／ペプチド］比を有する１０％ペプチド組成物バッチとビーグル犬における皮下投与の結果をまとめてある。血中薬物濃度のピーク値、（Ｃmax）は、［３．７：１］の［酢酸塩／ペプチド］モル比では８．１０ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ＝１．８０ｎｇ／ｍｌ）であり、一方、より低い比［３．２：１］を有するバッチは、５．６５ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ＝２．６１ｎｇ／ｍｌ）のＣmax値をもたらした。
【０１５４】
【表３】
【０１５５】
１０．；ＧＬＰ−１ペプチド塩／二価金属配合物：
１０．１．方法：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 １ｍｇ／ｍＬ水の溶液とＰＢＳ溶液を調製して、ｐＨを７．０へ調整した。ＣａＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＭｇＣｌ2、及びＺｎＣｌ2の１０ｍｇ／ｍＬストック水溶液を調製した．ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、及びＺｎＣｌ2溶液のｐＨは、７．０へ調整した。ＣｕＣｌ2溶液のｐＨは、Ｃｕが析出したので、塩基性にすることができなかった。従って、ｐＨ４．４のＣｕＣｌ2溶液を使用した。
【０１５６】
２００μＬの（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（１ｍｇ／ｍＬ）溶液へ４μＬの金属イオン水溶液又はＰＢＳ溶液を加えて、２００μｇ／ｍＬの最終金属イオン濃度とした。得られた溶液を混合して、沈殿を確認した。沈殿が生成したならば、懸濁液を遠心分離させた。上清中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2濃度をＨＰＬＣによって定量した。
【０１５７】
１０．２．結果：
表４．二価金属イオンの存在下での（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の溶解度
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
１０．３．；（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／二価金属（ｐＨ５．５）澄明溶液配合物の薬物動態試験：
以下の手順を使用することによって、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の３種の異なる配合物を調製した。
（１）ＣｕＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩
（２）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩
（３）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩
【０１６０】
ＧＬＰ−１類似体のＴＦＡ塩（このＴＦＡ塩は、分取用ＨＰＬＣを使用してＴＦＡ含有緩衝溶液で溶出させるペプチドの精製により生じる）は、該ペプチドを少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液に溶解させることによって、酢酸塩等の別の塩へ変換することができる。得られた溶液をsemi-prepＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ社，３００ＳＢ，Ｃ−８）へ適用する。このカラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）４ｍｌ／分の流速の線形勾配（３０分にわたり２０％〜１００％の溶液Ｂ）（溶液Ａは、０．２５Ｎ酢酸水溶液であり；溶液Ｂは、アセトニトリル／水（８０：２０）中０．２５Ｎ酢酸である）で溶出させる。該ペプチドを含有する分画を採取して、凍結乾燥させる。
【０１６１】
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩は、凍結乾燥法によって製造した。２０ｍｇの（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩を４ｍＬの２０ｍＭ ＨＣｌ水溶液に溶かして、室温で１０分間インキュベートした。この試料を凍結させて、一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥を更に２回実施して、最終生成物の塩化物含量を定量した。定量され塩化物含量は、５．３８％であった。
【０１６２】
（１）ＣｕＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ（５．３ｍｇ；ペプチド含量は９５％）を５０μＬの２０ｍＭ ＣｕＣｌ2水溶液に溶かした。ｐＨを約２μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＣｕＣｌ2のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、約５．５のｐＨであった。
【０１６３】
（２）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ（５．３ｍｇ；ペプチド含量は９５％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＺｎＣｌ2水溶液に溶かした。ｐＨを約２μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、約５．５のｐＨであった。
【０１６４】
（３）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩（５．５ｍｇ；ペプチド含量は９２％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＺｎＣｌ2水溶液に溶かした。得られた溶液を一晩凍結乾燥させて、５０μＬの水に再び溶かした。ｐＨを約１μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、約５．５のｐＨであった。
【０１６５】
１０．４．投薬と血液試料採取：
ラットに上記３種の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2配合物を０．３ｍｇ／ラット（１０％溶液の３μＬ）で皮下投与した。５、１０、１５、３０分、１、２、４、８時間、及び１、２、３、４、７、１０日目に血液試料を採取した。この血液から遠心分離により血漿を採取して、−８０℃で保存した。注射部位での組織も採取し、５×メタノール中でホモジェナイズして、−８０℃で保存した。
２匹のラットを５、１０、１５、３０分と１、２、４、８時間のデータ点のために使用した。１匹のラットを１、２、３、４、７、１０日のデータ点のために使用した。
【０１６６】
１０．５．；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ試料調製：
血漿（２００μＬ）を１０μＬのギ酸で酸性化して、６００μＬのアセトニトリルで沈殿させた。遠心分離により上清を採取して、真空で濃縮乾固させた。残渣を１５０μＬの３０％アセトニトリル水溶液に溶かして、遠心分離した。５０μＬの上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に注入した。
組織メタノール抽出物（１０μＬ）を１ｍＬの３０％アセトニトリル水溶液へ希釈して、５０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に注入した。
【０１６７】
１０．６．；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、商品名Ｔｕｒｂｏイオンスプレープローブを取り付けたＡＰＩ４０００質量分析計システムで行った。分子イオン検出のＭＲＭモードを、６６８．９及び１３６．１のイオン対で使用した。
ＨＰＬＣ分離は、０．３０ｍＬ／分の流速で１０分間、１０％ Ｂ〜９０％ Ｂへ勾配をかけてＬｕｎａ Ｃ８（２） ２×３０ｍｍ ３μカラムで実施した。緩衝液Ａは、１％ギ酸水溶液であり、緩衝液Ｂは、１％ギ酸アセトニトリル溶液である。
ＬＯＱは、０．５ｎｇ／ｍＬであった。
【０１６８】
１０．７．結果と要約：
ペプチドの血漿濃度は、その標準較正プロットを用いて計算した。０．０６ｍｇ／ｍＬの（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（５ｍＬメタノール抽出物中０．３ｍｇ／ラット）を１００％として使用して、注射部位に残った割合を計算した。
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のＨＣｌ塩配合物の薬物動態プロファイルの全体経時変化プロットを図８に示す。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のＨＣｌ塩配合物の薬物動態プロファイルの初期経時変化プロットを図９に示す。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の酢酸塩配合物の薬物動態プロファイルの全体経時変化プロットを図１０に示す。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の酢酸塩配合物の薬物動態プロファイルの初期経時変化プロットを図１１に示す。
【０１７１】
【表６】
【０１７２】
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の注射部位での組織蓄積プロファイルを図１２に更に示す。
【０１７３】
【表７】
【０１７４】
上記結果は、ＧＬＰ−１類似体塩型の、特に二価金属塩との組み合わせが、初期血漿濃度が抑えられ、即ち、望まれない副作用を抑制又は消失させる可能性がある、許容される持続放出配合物を提供することを示す。
上記データは、ＧＬＰ−１類似体の強酸塩、例えばＨＣｌ塩が、初期血漿濃度において更なる低下を示すことを示す。本発明は下記理論に制限されるものではないが、ＧＬＰ−１類似体のＨＣｌ塩の初期血漿濃度における優れた低下は、ｉｎ ｖｉｖｏでの中和プロセスに関連すると考えられている。上記組成物（１）及び（２）では、ｐＨ５．５で酸の１００％が塩化物の形であり、遊離酸は存在しない。従って、皮下注射後に、体液はこの溶液剤をより速やかに中和して、この溶液剤を更に急速に沈殿させることができる。中和時間におけるこれらの減少は、より少なく、より顕著でない初期血漿濃度又はスパイクをもたらす。
【０１７５】
実施例１１；１０％ペプチド類似体（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2、酢酸及び塩化亜鉛を含む液体組成物の調製：
【０１７６】
【表８】
【０１７７】
ＷＦＩ（又は注射用水）は、無菌水又はＮａＣｌ等の等張剤を含む無菌水を示す。
シリンジを１０μｌで完全充填した。実施例１１．１では、バイアルは０．３ｍｌの１０％ペプチド類似体溶液を含む。実施例１１．２では、シリンジは０．１１ｍｌの１０％ペプチド類似体溶液を含む。実施例１１．３では、シリンジは０．２１ｍｌの１０％ペプチド類似体溶液を含む。ペプチド類似体の量は医薬物質の分析に基づき調整された。酢酸塩のペプチドに対する割合を３．２：１ｍｏｌ当量とするのに充分な、酢酸を添加した。ペプチド類似体の塩化亜鉛に対する割合を１．５：１ｍｏｌ当量とするのに充分な、塩化亜鉛を添加した。溶液中のペプチド類似体の重量割合を１０％とするのに充分な、注入用の水を添加した。
【０１７８】
方法：
酢酸をＷＦＩの約９０％に添加した。
ペプチド類似体を添加した。
得られた組成物を完全に溶解するまで攪拌した。
塩化亜鉛を添加した。
ＷＦＩの必要量を添加した。
得られた組成物を完全に溶解するまで攪拌した。
溶解された溶液を、０．２２μｍ（商品名ＭＩＬＬＩＰＡＫ２０）で２回滅菌ろ過した。
ろ過した溶液を、０．３ｍｌ／バイアル＝０．３１０ｇ／バイアル（密度＝１．０３３）バイアル内、又はデッドボリューム１０μｌのシリンジ内に充填した。
【０１７９】
上記に引用した出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の追加の態様は前述の開示から明らかであり、それらは、本明細書に充分記載され、下記特許請求の範囲で特定される本発明に含まれることを意図される。
【符号の説明】
【０１８０】
ＨＶ：双方向手動バルブ
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３：シリンジ
ＳＲ：ロッド
ＳＣ：双方向コネクタ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルカゴン様ペプチド−１のペプチド類似体及び／又はその医薬的に許容される塩を含む組成物の改良、医薬組成物、その組成物の製造方法並びにそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴン様ペプチド−１（７−３６）アミド（ＧＬＰ−１）は、グルカゴン前駆体のプレプログルカゴンの組織特異的な翻訳後プロセシングにより腸のＬ細胞において合成され（Varndell, J. M.ら, J. Histochem Cytochem, 1985:33:1080-6）、食事に応答して体循環中へ放出される。ＧＬＰ−１の血漿濃度は、絶食レベルの約１５pmol/Lから食後ピークレベルの４０pmol/Lへ上昇する。血漿グルコース濃度における所定の上昇に対し、血漿インスリンの増加は、グルコースを経口で投与するとき、静脈内と比較して約３倍高いことが示されている（Kreymann, B.ら, Lancet 1987:2, 1300-4）。このインスリン放出の食事性の亢進は、インクレチン（incretin）効果として知られ、主として体液性であり、ＧＬＰ−１は、ヒトにおいて最も強力な生理学的インクレチンであると考えられている。抗インスリン効果に加えて、ＧＬＰ−１は、グルカゴン分泌を抑制し、胃の空洞化を遅らせ（Wettergren A.ら, Dig Dis Sci 1993:38:665-73）、末梢のグルコース処理を高める可能性がある（D'Alessio, D. A.ら, J. Clin Invest 1994:93:2293-6）。
【０００３】
１９９４年に、ＧＬＰ−１の単回皮下（ｓ／ｃ）投与によってインスリン非依存型真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の患者の食後血糖値が完全に正常化され得るという観察に従い、ＧＬＰ−１の治療の潜在的能力が示唆された（Gutniak, M. K.ら, 糖尿病 Care 1994:17:1039-44）。この効果は、インスリン放出の増加とグルカゴン分泌の低下の両方により仲介されると考えられた。更に、ＧＬＰ−１の静脈内注入は、ＮＩＤＤＭの患者において食後の胃空洞化を遅らせることが示された（Williams, B.ら, J. Clin Endo Metab 1996:81:327-32）。スルホニル尿素と異なり、ＧＬＰ−１の抗インスリン作用は、血漿グルコース濃度に依存する（Holz, G. G. 4thら, Nature 1993: 361: 362-5）。従って、低い血漿グルコース濃度ではＧＬＰ−１仲介性インスリン放出がないために、重篤な低血糖症に対して保護される。この作用の組合せは、ＮＩＤＤＭを治療するために今日使用されている他の薬剤に優る独自の潜在的な治療上の利点をＧＬＰ−１に与える。
【０００４】
数多くの研究により、ＧＬＰ−１を健常被検体へ与えると、ＧＬＰ−１はインスリン及びグルカゴンの濃度だけでなく、血糖値にも強力に影響を及ぼし(Orskov, C, Diabetologia 35:701-711, 1992; Holst, J.J.ら,「糖尿病管理におけるGLP-1の可能性、グルカゴン III」, Handbook of Experimental Pharmacology, Lefevbre PJ, Ed. Berlin, Springer Verlag, 1996, p. 311-326)、この効果がグルコース依存性である(Kreymann, B.ら, Lancet ii: 1300-1304, 1987; Weir, G.C.ら, Diabetes 38:338-342, 1989)ことが示された。更に、これは、糖尿病の患者にも有効であり(Gutniak, M., N. Engl J Med 226:1316-1322, 1992; Nathan, D.M.ら, Diabetes Care 15:270-276, 1992)、II型糖尿病の被検体の血糖値を正常化し(Nauck, M.A.ら, Diabetologia 36:741-744, 1993)、I型患者の血糖コントロールを改善し(Creutzfeldt, W.O.ら, Diabetes Care 19:580-586, 1996)、とりわけ、インスリン感受性を高める／インスリン抵抗性を抑えるその能力を実証している。
【０００５】
ＧＬＰ−１とそのアゴニストは、インスリン非依存型糖尿病を発症するリスクのある被検体における使用（ＷＯ００／０７６１７を参照）、並びに妊娠性糖尿病の治療（米国特許公開公報番号：２００４０２６６６７０）のために挙げられている。
【０００６】
上記に加えて、哺乳動物（例えば、ヒト）においてＧＬＰ−１とそのアゴニストが提示されている数多くの臨床使用があり、例えば、限定されるものではないが下記が挙げられる：学習を向上させること、神経保護を高めること、及び／又は中枢神経系の疾患又は障害（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神性の症候群）の症状を、例えば、神経組織発生の調節を介して緩和すること（米国特許公開公報番号：２００５０００９７４２及び２００２０１１５６０５）；肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換すること（ＷＯ０３／０３３６９７）；β細胞の悪化（米国特許公開公報番号：２００４００５３８１９及び２００３０２２０２５１）及びβ細胞増殖の刺激（米国特許公開公報番号：２００３０２２４９８３）を防ぐこと；肥満を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４００１８９７５；ＷＯ９８／１９６９８）；食欲を抑制して満腹感を誘発すること（米国特許公開公報番号：２００３０２３２７５４）；過敏性腸症候群を治療すること（ＷＯ９９／６４０６０）；心筋梗塞（米国特許公開公報番号：２００４０１６２２４１、ＷＯ９８／０８５３１）及び卒中（ＷＯ００／１６７９７を参照）に関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること；Ｑ波心筋梗塞の非存在を特徴とする急性冠症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０００２４５４）；術後の異化変化を弱めること（米国特許第６，００６，７５３号）；冬眠心筋又は糖尿病性心筋症を治療すること（米国特許公開公報番号：２００５００９６２７６）；ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制すること（米国特許公開公報番号：２００５００９６２７６）；尿ナトリウム排出を増加させ、尿カリウム濃度を減少させること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；有毒な血液量過多症に関連した状態又は障害（例えば、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；変力応答を誘発して、心収縮を増加させること（米国特許公開公報番号：２００５００３７９５８）；多房性卵巣症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２６６６７８及び２００４００２９７８４）；呼吸窮迫を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２３５７２６）；非消化管経路を介した、即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入を介した栄養摂取を改善すること（米国特許公開公報番号：２００４０２０９８１４）；腎障害を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４０２０９８０３）；左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００４００９７４１１）；例えば、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群等の胃腸障害の治療又は予防のために、そして内視鏡手技の前投薬として十二指腸洞の運動を阻害すること（米国特許公開公報番号：２００３０２１６２９２）；重症疾患多発ニューロパシー（ＣＩＰＮ）及び全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）を治療すること（米国特許公開公報番号：２００３０１９９４４５）；トリグリセリドレベルを調節して、異常脂質血症を治療すること（米国特許公開公報番号：２００３００３６５０４及び２００３０１４３１８３）；虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷を治療すること（米国特許公開公報番号：２００２０１４７１３１）；冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群を治療すること（米国特許公開公報番号：２００２００４５６３６）、その他。
【０００７】
しかしながら、ＧＬＰ−１は、代謝的に不安定であり、ｉｎ ｖｉｖｏでは１〜２分の血漿半減期（ｔ1/2）しか有さない。外因的に投与したＧＬＰ−１も又、速やかに分解される(Deacon, C.F.ら, Diabetes, 44:1126-1131, 1995)。この代謝不安定性により、天然ＧＬＰ−１の治療ポテンシャルは制限される。
【０００８】
ＧＬＰ−１とその類似体の治療ポテンシャルを配合物における改善を通して改善するために、多くの試みがなされてきた。例えば、国際特許公開公報番号ＷＯ０１／５７０８４は、結晶と医薬的に許容されるキャリアを含んでなる、注射可能な医薬品等の医薬組成物の調製に有用であるとされるＧＬＰ−１類似体の結晶を調製する方法を記載する。ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの不均質な微結晶性クラスターを生理食塩水溶液から成長させて、亜鉛及び／又はｍ−クレゾールでの結晶浸漬処理の後で試験した（Kim及びHaren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)）。針状結晶と非結晶性の沈殿を含有するＧＬＰ（７−３６）ＮＨ2の粗結晶懸濁液が亜鉛又はプロタミンを含有するリン酸溶液より調製された（Pridalら, International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996))。欧州特許公開公報番号ＥＰ０６１９３２２Ａ２は、塩類と低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のある種の組合せを含むｐＨ７〜８．５の緩衝液において上記タンパク質の溶液を混合することによる、ＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨの微結晶型の調製を記載する。米国特許第６，５６６，４９０号は、精製ペプチド生成物の生成に役立つ、ＧＬＰ−１の種となる微結晶について特に記載している。米国特許第６，５５５，５２１（ＵＳ’５２１）号は、改善された純度を有して、延長されたｉｎ ｖｉｖｏ活性を示す、正方晶系の平棒又は板状の形を有するＧＬＰ−１結晶を開示する。ＵＳ’５２１号は、その結晶が、先行技術の、急速に固化し、共に凝集又は密集し、シリンジ針を詰まらせ、予測不能な投薬を概して悪化させる、結晶性クラスターや無定形の結晶性懸濁液よりも相対的に均質であり、より長い時間、懸濁状態を維持することを教示する。
【０００９】
生物分解性トリブロックコポリマーのポリ［（ｄｌ−ラクチド−コグリコリド）−β−エチレングリコール−β−（−ラクチド−コグリコリド）］を、ＧＬＰ−１の制御放出配合物において使用することも提案された。しかしながら、他のポリマー系と同じように、トリブロックコポリマーの製造には、複雑なプロトコールと一貫性のない微粒子形成が伴う。
【００１０】
同様に、生物分解性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸−コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）も、ペプチドの持続送達配合物における使用を示唆された。しかしながら、これら生物分解性ポリマーの使用は、一般に、これらのポリマーが水への溶解度が低く、水と混和不能の有機溶媒（例えば、塩化メチレン）及び／又は製造中に厳しい調製条件を必要とするので、当該技術分野では好ましくない。それらの有機溶媒及び／又は厳しい調製条件は、目的のペプチド又はタンパク質のコンホメーション変化を誘発するリスクを高めて、構造の完全性の減少と生物学的活性の低下をもたらすと考えられている（Choiら, Pharm. Research, Vol. 21, No. 5, (2004)）。ポロキサマーも同様の問題があるとされている（同上）。
【００１１】
上記参考文献に記載されたＧＬＰ−１組成物は、不純物を捕捉する傾向があり、及び／又は、他にも、再現可能的に製造して投与することが難しいので、ＧＬＰの医薬配合物を調製するのに理想的とは言えない。又、ＧＬＰ類似体は、高い濃度で嘔吐を誘発することが知られているので、初期の血漿濃度が低くて持続的な医薬効果を提供する必要がある。(Ritzelら, Diabetologia, 38: 720-725 (1995); Gutniakら, Diabetes Care, 17(9): 1039-1044 (1994); Deaconら, Diabetes, 44: 1126-1131 (1995).)
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際特許公開公報番号ＷＯ０１／５７０８４
【特許文献２】欧州特許公開公報番号ＥＰ０６１９３２２Ａ２
【特許文献３】米国特許第６，５６６，４９０号
【特許文献４】米国特許第６，５５５，５２１号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Kim及びHaren, Pharma. Res. Vol. 12 No. 11 (1995)
【非特許文献２】Pridalら, International Journal of Pharmaceutics Vol. 136, pp. 53-59 (1996)
【非特許文献３】Choiら, Pharm. Research, Vol. 21, No. 5, (2004)
【非特許文献４】Ritzelら, Diabetologia, 38: 720-725 (1995)
【非特許文献５】Gutniakら, Diabetes Care, 17(9): 1039-1044 (1994)
【非特許文献６】Deaconら, Diabetes, 44: 1126-1131 (1995)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、より容易にかつ安定的に製造され、より容易かつ再現可能的に患者へ投与され、低い初期血漿濃度を提供して望まれない副作用を低下又は消失させるＧＬＰ−１配合物へのニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概略
本発明は、以下のパラグラフ、並びに特許請求の範囲において要約することができる。
１つの態様において、本発明は、下記を含む制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
下記式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに、
酢酸塩及び／又は酢酸。
別の態様では本発明は、上記医薬組成物を含む容器を提供する。
更に別の態様において、本発明は、下記ステップを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
Ａ：液体、酢酸塩及び／又は酢酸、並びにペプチド類似体を組み合わせるステップ、及び
Ｂ：二価の金属及び／又は二価の金属塩を添加し溶解するステップ。
更に別の態様において、本発明は、ＩＩ型糖尿病治療用の医薬組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】イヌへ約１ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。それぞれのケースでペプチドは、約１％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチドを含み、ペプチド：Ｚｎモル比約１．５である水性亜鉛組成物として投与された。黒四角及び白四角は、ｐＨをここに記載するとおりＮａＯＨで調整した組成物を示す。黒三角は、ｐＨをＮａＯＨで調整されない組成物を示す。黒円は、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ−で緩衝された組成物を示す。
【図２】イヌへ約１５ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。それぞれのケースでペプチドは、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチドを含み、ペプチド：Ｚｎモル比約１．５である水性亜鉛組成物として投与された。黒四角及び白四角は、ｐＨをここに記載するとおりＮａＯＨで調整した組成物を示す。黒三角は、ｐＨをＮａＯＨで調整されない組成物を示す。黒円は、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ−で緩衝された組成物を示す。
【図３】イヌへ約１ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。それぞれのケースでペプチドは、下記半固体（ｓｅｍｉｓｏｌｉｄ）水性亜鉛組成物として投与された。黒円：約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ｐＨ調整せず；白円：約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ｐＨ調整せず；白四角：約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約５．４：１、ＮａＯＨでｐＨ調整；黒四角：約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）ペプチド、ペプチド：Ｚｎモル比＝約４：１、ＮａＯＨでｐＨ調整。
【図４】本発明のある配合物を調製するのに有用な様々な装置の概略図を提供する。
【図５】イヌへ約１ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。ペプチドは、ペプチド濃度約２％でペプチド：Ｚｎモル比約１．５：１である水性亜鉛組成物として投与された。
【図６】イヌへ約１５ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。ペプチドは、ペプチド濃度約２５％でペプチド：Ｚｎモル比約４：１である半固体亜鉛組成物として投与された。
【図７】イヌへ約１５ｍｇの［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）を図示する。ペプチドは、ペプチド濃度約２３％でペプチド：Ｚｎモル比約１．５：１である半固体亜鉛組成物として投与された。
【図８】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）のＧＬＰ−１類似体ＨＣｌ塩試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。（１）ＣｕＣｌ2との（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2ＨＣｌ塩：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＣｕＣｌ2のモル比は１．５：１である。ペプチド濃度は水（ｗ／ｗ）中１０％（３０ｍＭ）で約ｐＨ５．５である。（２）ＺｎＣｌ2との（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2ＨＣｌ塩：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は１．５：１である。ペプチド濃度は水（ｗ／ｗ）中１０％（３０ｍＭ）であり、約ｐＨ５．５である。
【図９】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）のＧＬＰ−１類似体酢酸塩試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。ＺｎＣｌ2との（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は１．５：１である。ペプチド濃度は水（ｗ／ｗ）中１０％（３０ｍＭ）であり約ｐＨ５．５である。
【図１０】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）の図８に示す試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。
【図１１】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）の図９に示す試験配合物単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に得られた血漿プロファイル（メジアン値）の全体経時変化を図示する。
【図１２】ラットへ０．３ｍｇ（３μＬの１０％溶液）の図８に示す３種の試験配合物を単回皮下（ｓ．ｃ．）投与した後に、注射部位に残っている（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の推定百分率を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本発明は、ＧＬＰ−１類似体を含む医薬組成物を提供する。特に好ましくは、式（Ｉ）のＧＬＰ−１類似体：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（Ｉ）又はその医薬的に許容される塩であり、上記組成物の配合物は、優れた製造、投与、薬物動態、及び薬力学特性を提供するだけでなく、負の副作用を弱める効果を提供する。好ましくは、本発明の医薬の組成物は、ｐＨ４を有し、上記［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2が濃度４ｍｇ／ｍｌで存在し、上記ＺｎＣｌ2が濃度０．５ｍｇ／ｍｌで存在する澄明な水性ＺｎＣｌ2溶液からなるものではない。
【００１８】
好ましい態様では、本発明は、好ましくは初期バーストが抑制された、改善された薬物放出プロファイルを有する医薬組成物を提供する。
本発明は又、延長された作用時間を有する、式（Ｉ）の化合物を含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、以下のパラグラフ、並びに特許請求の範囲において要約することができる。
１つの態様において、本発明は、下記を含む制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；及びに
酢酸塩及び／又は酢酸。
好ましくは、本発明は、下記を含む制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに
酢酸塩及び／又は酢酸；
但し、二価の金属及び／又は二価の金属塩は、亜鉛及び／又は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは４〜５の範囲内であり；
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約１：１〜６：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約６：１〜１：１である。
【００２０】
好ましくは、ペプチド類似体の一部及び酢酸塩の一部は、ペプチド類似体の塩として存在する。
好ましくは、医薬的組成物の最終ｐＨは３．５〜６の範囲内である。更に好ましくは、医薬的組成物の最終ｐＨは４〜５の範囲内である。より更に好ましくは医薬的組成物の最終ｐＨは４．５±０．１である。組成物の最終ｐＨとは、投与可能である時点での組成物のｐＨである。
【００２１】
好ましくは、酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約０．５：１〜約１０：１である。更に、酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲が約１：１〜約６：１である医薬組成物が好ましい。より更に、酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲が約３．２：１（３．２±０．３２）である医薬組成物が好ましい。
【００２２】
好ましくは、二価の金属及び／又は二価の金属塩は、亜鉛及び／又は塩化亜鉛である。更に好ましくは、二価の金属及び／又は二価の金属塩は、塩化亜鉛である。
【００２３】
好ましくは、ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約６：１〜約１：１．更に好ましくは、ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比は約１．５：１（１．５±０．１５）である。
【００２４】
好ましくは、本発明は、下記を含む上記制御放出液体医薬組成物を提供する：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに酢酸塩及び／又は酢酸；
但し、二価の金属及び／又は二価の金属塩は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１の範囲内であり；
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約３．２：１（３．２±０．３２）であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約１．５：１（１．５±０．１５）である。
【００２５】
好ましくは、ペプチド類似体の濃度は、約１０重量／容量％（ｍｇ／ｍｌ）である。
好ましくは、亜鉛範囲の濃度は、０．２６重量／容量％〜２．３５重量／容量％（ｍｇ／ｍｌ）である。
【００２６】
好ましくは、組成物は、式（Ｉ）のペプチド類似体が被検体内で少なくとも約１週間放出されるように配合される。
好ましくは、組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体内で少なくとも約１週間、好ましくは２週間放出されるように配合される。
【００２７】
好ましくは、組成物は液体（又は希釈剤）を更に含む。この液体（又は希釈剤）は、溶媒又は懸濁液のビヒクルとして使用される。
好ましくは、液体は無菌水又はＮａＣｌ等の等張剤を含む無菌水から選ばれる。
【００２８】
好ましくは、医薬組成物は非経口的投与に適する。更に好ましくは、医薬組成物は注射による投与に適する。
好ましくは、医薬組成物は、温度５℃で少なくとも１年間の間使用可能状態での使用前貯蔵に適する。
好ましくは、医薬組成物は、全成分を、好ましくは全て一緒に混合して凍結乾燥無しに調製される。
【００２９】
別の態様では本発明は、上記医薬組成物を含む容器を提供する。好ましくは、容器はプレフィルドシリンジである。
【００３０】
好ましくは、本発明は、上記医薬組成物をプレフィルドしたシリンジを提供する。但し、この医薬組成物は下記を含む：
液体として水（ｑｓ２１０μｌ）；
２１ｍｇの式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属塩として０．５７１ｍｇの塩化亜鉛；及び
酢酸；
但し、上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１であり；
酢酸のペプチド類似体に対するモル比は約３．２：１（３．２±０．３２）であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比は約１．５：１（１．５±０．１５）である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、下記ステップを含む医薬組成物の製造方法を提供する。
Ａ：液体、酢酸塩及び／又は酢酸、並びにペプチド類似体を組み合わせるステップ、並びに
Ｂ：二価の金属及び／又は二価の金属塩を添加し溶解するステップ。
【００３２】
好ましくは、上記方法は更に下記ステップを含む。
Ｃ：ステップＢから得られる組成物を無菌ろ過するステップ、及び
Ｄ：容器へ組成物を充填するステップ。
【００３３】
好ましくは、ステップＡの前に、酢酸及び無菌水を組み合わせる。
更に好ましくは、上記方法は、更に無菌水を溶液に加える最終ステップを含む。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＩＩ型糖尿病治療用の医薬組成物の使用を提供する。．
好ましい態様では、本発明は又、制御放出医薬プロファイルのために、ｉｎ ｖｉｖｏの生理学的なｐＨで沈殿して、その場で沈殿物（ｄｅｐｏｓｉｔ）を生成する医薬組成物を提供する。
【００３５】
本発明の更なる態様は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩と医薬的に許容されるキャリア又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。好ましくは、上記キャリア又は希釈剤は、水を含む。
【００３６】
好ましい態様では、本発明は、ＧＬＰ−１ペプチドの塩で、又はペプチドとその塩の混合物で製造される化合物又はＧＬＰ−１ペプチド類似体を含む医薬組成物を提供する。
【００３７】
好ましくは、上記医薬組成物中のＧＬＰ−１ペプチド類似体の塩は、酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、クエン酸、メタンスルホン酸、又はトルエンスルホン酸等の、有機酸の塩の医薬的に許容される塩、又は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、又はリン酸等の、無機酸の塩の医薬的に許容される塩のリストより選択される。塩酸等の強酸の医薬的に許容される塩が特に好ましい。強酸は、４．５未満のｐＫＡを有する酸として定義される。上記医薬組成物中の、追加的好ましいペプチド塩は、酢酸又はトリフルオロ酢酸、乳酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、又はクエン酸の塩等の有機酸の塩である。
【００３８】
１つの好ましい態様では、塩型ＧＬＰ−１類似体の非塩型ＧＬＰ−１類似体に対するモル比を調整することによって、医薬組成物の溶解性、ｐＨ、及び放出プロファイルを調節して、放出プロファイルを延長させて、ＧＬＰ−１類似体濃度の初期スパイクを抑えることができる。
【００３９】
好ましい態様において、医薬組成物は、二価金属を更に含み、該組成物の水溶性を低下させて、それにより放出プロファイルを延長させると同時に、血漿濃度における初期のバースト又はスパイクを抑えることができる。好ましい二価金属には、亜鉛と銅が含まれる。二価金属の塩型が特に好ましく、限定するものではないが、二価金属の塩化物及び酢酸塩（ａｃｅｔａｔｅ）が含まれる。ＣｕＡｃ2、ＣｕＣｌ2、ＺｎＡｃ2、及び／又はＺｎＣｌ2が最も好ましい。好ましくは、上記医薬組成物中の二価金属及び／又は二価金属塩は、約０．０００５ｍｇ／ｍｌ〜約５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。更に好ましくは、上記医薬組成物中の二価金属及び／又は二価金属塩は、約０．０１ｍｇ／ｍｌ〜約０．５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。より好ましくは、上記医薬組成物は希釈剤を含み、ここで上記希釈剤は、医薬的に許容される水溶液を含む。希釈剤は、滅菌水又は等張剤としてＮａＣｌ等の塩の無菌水溶液を含む。
【００４０】
文言「等張剤」は本明細書では、血液と同一の浸透圧を維持する、溶液中の塩又は賦形剤を意味する。
文言「医薬的に許容される」は本明細書では、哺乳類又はヒトにより生理学的に許容されることを意味する。
【００４１】
更なる態様において、上記医薬組成物は、二価金属及び／又は二価金属塩を更に含み、ここで上記医薬組成物における上記ＧＬＰ−１類似体の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比範囲は、約６：１〜約１：１である。好ましくは、上記比範囲は、約５．５：１〜約１：１である。より好ましくは、上記比範囲は、約５．４：１〜約１．５：１である。更により好ましくは、上記比範囲は、約５．４：１、４．０：１、又は１．５：１である。最も好ましくは、上記比範囲は、約１．５：１である。ＧＬＰ−１類似体の、二価の金属及び／又は二価の金属塩に対するモル比は、医薬組成物中のペプチド類似体のモル割合の、二価の金属及び／又は二価の金属塩のモル割合に対する比を意味する。ペプチド類似体のモル割合は、ペプチド類似体塩の形で存在する全てのペプチドを含む。本発明でこの場合、「約」が意味するのは、１．５：１±１０％の各目標値の比であるので、期待される比には、例えば、１．３５〜１．６５：０．８５〜１．１５を包含する比が含まれる。
【００４２】
好ましくは、上記医薬組成物は、水性混合物、懸濁液、又は溶液を含み、ＧＬＰ−１の上記類似体、式（Ｉ）の化合物、又はその塩は、約０．５％〜３０％（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。より好ましくは、上記ＧＬＰ−１類似体及び／又はその塩の上記水性混合物、懸濁液、又は溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％，又は３０％（ｗ／ｗ）である。より好ましくは、上記ＧＬＰ−１類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１４％、１５％、１６％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２９％，又は３０％（ｗ／ｗ）である。なおより好ましくは、ＧＬＰ−１の上記類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、９％、１０％、１１％、２２％、２３％、２４％、２５％，又は２６％（ｗ／ｗ）である。更により好ましくは、ＧＬＰ−１の上記類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、１０％、２２％、２３％、２４％、２５％，又は２６％（ｗ／ｗ）である。なおより好ましくは、ＧＬＰ−１の上記類似体及び／又はその塩の上記水溶液中の濃度は、約１％、２％、５％、１０％、２３％又は２５％（ｗ／ｗ）である。「約」は、以下のことを意味する：約０．５％〜約４％の濃度では、目標値の±０．５％が目的とする範囲である（例えば、０．５％〜１．５％は、約１％である）；約５％以上の標的濃度では、目標値の２０％が目的とする範囲である（例えば、８％〜１２％は、約１０％である）。
【００４３】
好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2、ＧＬＰ−１の類似体又はその塩の医薬組成物中の濃度は、約１％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。より好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記医薬組成物中の濃度は、約２％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。
なおより好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記医薬組成物中の濃度は、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。最も好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記医薬組成物中の濃度は、約２３％又は約２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約１．５：１である。
【００４４】
好ましい態様において、ＧＬＰ−１の類似体、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の医薬組成物中の濃度は、約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、該ペプチドの二価金属及び／又は二価金属塩に対するモル比は、約５．４：１である。より好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記組成物中の濃度は、約５％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、上記比は、約４．０：１である。なおより好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記組成物中の濃度は、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、上記比は、約５．４：１である。なお更に好ましくは、［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2又はその塩の上記組成物中の濃度は、約１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）であり、上記比は、約４．０：１である。
【００４５】
好ましくは、上記二価金属及び／又は二価金属塩は、塩化亜鉛又は酢酸亜鉛として提供される。より好ましくは、上記酢酸亜鉛は、ＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏとして提供される。
代わりの態様において、上記二価金属及び／又は二価金属塩は、塩化銅又は酢酸銅として提供される。
【００４６】
１つの態様において、上記医薬組成物のｐＨは、塩基を使用して上方へ調整される。より好ましくは、上記ｐＨ調整は、ＮａＯＨを使用してなされる。なおより好ましくは、上記医薬組成物のｐＨは、０．９％ＮａＣｌを使用して約１／２の初期濃度へ希釈する場合、直接電位差定量法を使用して約５．０〜５．５のｐＨ値が得られるように、ＮａＯＨで調整する。
【００４７】
本発明の好ましい態様は、医薬組成物又は制御放出配合物を提供し、この組成物は、ＧＬＰ−１のペプチド類似体又はその塩、例えば、式（Ｉ）の化合物又はその塩が、それが必要な被検体、例えば哺乳動物、好ましくはヒトの体内で、延長された期間の間放出されるように配合される。好ましくは、上記化合物の放出は、少なくとも１時間にわたり、より好ましくは、少なくとも４、６、１２、又は２４時間にわたる。なおより好ましくは、上記組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体の体内で少なくとも３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間の間放出されるように配合される。なおより好ましくは、上記組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体の体内で少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４日の間放出されるように配合される。なおより好ましくは、上記組成物は、式（Ｉ）の化合物が被検体の体内で少なくとも約２、３又は４週間放出されるように配合される。
【００４８】
文言「制御放出」は本明細書では、少なくとも１週間、更に好ましくは少なくとも２週間、生物学的に活性なＧＬＰ−１類似体の測定可能な血中濃度を生じる放出を意味する。
【００４９】
本発明の１つの態様において、ＧＬＰ−１ペプチド類似体の上記医薬組成物中の塩含量の調節は、ＧＬＰ−１ペプチド類似体の医薬組成物内での溶解性及び安定性を改善して、更に、初期バーストを減少させることによって、ｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルに改善を提供する。
【００５０】
上記明細書の文言「調節（調整）」は、塩型ＧＬＰ−１類似体の、非塩型ＧＬＰ−１類似体に対するモル比を調節することにより、塩含有量を調節（調整）することを意味する。
【００５１】
なおより好ましくは、上記医薬組成物中のペプチド塩は、塩酸又は酢酸の塩、又は式（Ｉ）の上記ペプチドの塩化物又は酢酸塩である。上記医薬組成物において、酢酸塩又は塩化物は、酢酸塩又は塩化物の式（Ｉ）の上記化合物に対する最終モル比として、約０．５：１〜約１０：１の範囲で存在する。より好ましくは、上記比は、約０．８：１〜約９：１である。なおより好ましくは、上記比は、約１：１〜約６：１である。最も好ましくは、上記比は、約３．０：１、特に３．２：１である。
【００５２】
本発明のこの態様において、酢酸塩又は塩化物のペプチドに対するモル比は、医薬組成物中のペプチドのモル割合に対する、医薬組成物中の酢酸塩（ＣＨ3ＣＯＯ-）又は塩化物（Ｃｌ-）のモル割合を意味する。医薬組成物中３：１のモル比の例において、酢酸塩は、割合においてペプチドのモル含量の３倍である。これは、ある化合物の他の化合物に比較した化学量論比である。
【００５３】
酢酸塩のモル割合及びペプチドのモル割合は、ペプチド類似体の塩として存在する全ての酢酸塩及びペプチドを含む。最初に調製されたペプチド中の酢酸塩濃度は、ペプチド調製に使用された方法に応じて変動する。従って、配合物へ添加される酢酸塩の量は、ペプチドの酢酸塩に対する適切な最終割合が得られるように調節される必要がある。
【００５４】
別の態様では、本発明は哺乳類を治療するために上記組成物を使用する方法に関する。
【００５５】
文言「約」は、この好ましい態様では、１．５：１±１０％の各目標値の比を意味するので、期待される比には、例えば、１．３５〜１．６５：０．８５〜１．１５を包含する比が含まれる。
【００５６】
本発明の追加的好ましい態様において、医薬組成物のｐＨは、組成物の酢酸塩含量の調節によって調整される。好ましくは、上記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ３〜ｐＨ６である。より好ましくは、上記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ３．５〜５．５である。最も好ましくは、上記医薬組成物のｐＨ範囲は、ｐＨ４．２〜ｐＨ４．６である。
【００５７】
好ましくは、医薬組成物を酸性化するために、酢酸塩含量を、酢酸を加えることによって増加できる。
【００５８】
１つの態様において、上記医薬組成物のｐＨは、低い酢酸塩含有量又は酢酸塩を含まないＧＬＰ−１の類似体のペプチド塩より始めて、酢酸塩含量の調節により高めることができる。
【００５９】
好ましい態様において、酢酸塩又は塩化物の含量の調節による、最終医薬組成物におけるｐＨの調整は、初期バーストを減少させることによって、ペプチド濃度、亜鉛濃度、化学安定性、物理安定性、及びｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイル等の変数の調節を可能にする。
【００６０】
本発明の１つの側面では、Ｚｎ又はＣｕ含量を固定して、酢酸塩含量を調節することによってｐＨを制御する。酢酸塩の含量を増加させると、溶解性や物理安定性の改善が示され、酢酸塩の含量を減少させると、ｐＨに対しては増加効果を、Ｃmaxに対しては減少効果を示す。
【００６１】
好ましい態様において、上記医薬組成物は、水性混合物、懸濁液、又は溶液を含む。
【００６２】
本発明は又、ＧＬＰ−１アゴニスト効果を引き起こす方法を提供し、この方法は、GLP-1(7-36)NH2リガンドの受容体をＧＬＰ−１類似体又はその塩と直接的又は間接的に接触させるステップを含む。
【００６３】
上記方法において、ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2リガンドの上記受容体は、動物被検体、好ましくは霊長動物、より好ましくはヒトに存在している。従って、この態様において、本発明は、それを必要とする被検体内でＧＬＰ−１受容体よりアゴニスト効果を引き起こす方法を提供し、該方法は、本発明の組成物を上記被検体へ投与するステップを含み、ここで上記組成物は、ＧＬＰ−１類似体又はその医薬的に許容される塩の有効量を含む。
【００６４】
上記方法の好ましい態様において、上記被検体は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、妊娠性糖尿病、肥満、食欲過多、満腹感の不足、及び代謝障害からなる群より選択される疾患又は症状に罹患しているか又はそれらを発症するリスクのあるヒトである。好ましくは、上記疾患は、Ｉ型糖尿病又はＩＩ型糖尿病である。
【００６５】
上記方法の別のより好ましい態様において、上記被検体は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、及び摂食の抑制が所望される障害、中枢神経系の疾患又は障害（例えば、神経組織発生の変調による、及び、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、卒中、ＡＤＤ、及び神経精神系の症候群）、過敏性腸管症候群、心筋梗塞（例えば、それに関連した罹病率及び／又は死亡率を低下させること）、卒中、急性冠症候群（例えば、Ｑ波の非存在を特徴とする）心筋梗塞、術後の異化変化、冬眠心筋又は糖尿病性心筋症、不充分な尿ナトリウム排出、過度の尿カリウム濃度、有害な血液量過多症に関連した状態又は障害（例、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、及び高血圧症）、多房性卵巣症候群、呼吸窮迫、腎障害、左心室収縮機能不全（例えば、異常な左心室駆出率を伴う）、下痢、術後ダンピング症候群、及び過敏性腸管症候群等の胃腸障害（即ち、十二指腸洞の運動の阻害による）、重症疾患多発ニューロパシー（ＣＩＰＮ）、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、異常脂質血症、虚血後の血流の再灌流によって引き起こされる臓器組織損傷、及び冠動脈性心疾患危険因子（ＣＨＤＲＦ）症候群からなる群より選択される疾患に罹患しているか又はそれらを発症するリスクのあるヒトである。
【００６６】
本発明の追加の態様において、本発明は、その必要な被検体において、肝臓の幹／始原細胞を機能的な膵臓細胞へ変換する、β細胞の悪化を防いでβ細胞増殖を刺激する、ノルエピネフリンの血漿レベルを抑制する、変力応答を誘発して心収縮を増加させる、非消化管経路を介した（即ち、静脈内、皮下、筋肉内、腹膜、又は他の注射又は注入経路を介した）栄養摂取を改善する、内視鏡手技を受ける被検体に前処置する、並びにトリグリセリドレベルを調節する方法を特徴とし、上記方法は、式（Ｉ）の化合物又はその医薬的に許容される塩の有効量を含んでなる本発明の配合物を上記被検体へ投与することを含んでなる。好ましくは、上記被検体は、哺乳動物、より好ましくは霊長動物、なおより好ましくはヒトである。
【００６７】
本発明のペプチド塩として利用する好ましいＧＬＰ−１ペプチドは、ここで例えば、以下の形式：（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2で示され、天然の配列を置換したアミノ酸を最初の組括弧の間に置く（例えば、Ａｉｂ8,35は、ｈＧＬＰ−１中のＡｌａ8及びＧｌｙ35がＡｉｂで置換されていることを示す）。Ａｉｂは、α−アミノイソ酪酸の略語である。略語ＧＬＰ−１は、グルカゴン様ペプチド−１を意味し；ｈＧＬＰ−１は、ヒトグルカゴン様ペプチド−１を意味する。二番目の組括弧の間にある数字は、ペプチド中に存在するアミノ酸の番号を意味する（例えば、ｈＧＬＰ−１（７−３６）は、ヒトＧＬＰ−１のペプチド配列のアミノ酸７〜３６を意味する）。ｈＧＬＰ−１（７−３７）の配列は、Ｍｏｊｓｏｖ，Ｓ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，．４０，１９９２，ｐｐ．３３３−３４２に収載されている。ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2中の表記：「ＮＨ2」は、このペプチドのＣ末端がアミド化していることを示す。ｈＧＬＰ−１（７−３６）は、Ｃ末端が遊離酸であることを意味する。ｈＧＬＰ−１（７−３８）中、３７位と３８位の残基は、特記無い場合はそれぞれＧｌｙとＡｒｇである。
【００６８】
本発明に使用される特に好ましいＧＬＰ−１ペプチド類似体は、医薬的に許容される塩の形態である。それらの塩の例として、限定されるものではないが、有機酸（例、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、メタンスルホン酸、トリエンスルホン酸、又はパモ酸）、無機酸（例、塩酸、硫酸、又はリン酸）、及びポリマー酸（例、タンニン酸、カルボキシメチルセルロース、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、又はポリ乳酸−グリコール酸の共重合体）とともに生成されるものが挙げられる。
本発明のペプチドの塩を調製する典型的な方法は当該技術分野で公知であり、塩交換の標準的方法によって達成できる。従って、本発明のペプチドのＴＦＡ塩（このＴＦＡ塩は、ＴＦＡ含有緩衝溶液で溶出させる分取用ＨＰＬＣを使用してペプチドを精製することにより生じる）は、該ペプチドを少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液に溶かすことによって、酢酸塩等の別の塩へ変換できる。得られた溶液をsemi-prep HPLCカラム(商品名Zorbax、300SB、C-8)へ適用する。このカラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）流速４ｍｌ／分（３０分間で２０％〜１００％の溶液Ｂ）での線形勾配（溶液Ａは、０．２５Ｎ酢酸水溶液であり；溶液Ｂは、アセトニトリル／水（８０：２０）中０．２５Ｎ酢酸である）で溶出させる。該ペプチドを含有する分画を採取して、凍結乾燥させる。
【００６９】
当業者に公知のとおり、ＧＬＰ−１の既知の使用と潜在的な使用は多様であり、多数ある（Todd, J. F.ら, Clinical Science, 1998, 95, pp. 325-329; 及び Todd, J. F.ら, European Journal of Clinical Investigation, 1997, 27, pp. 533-536 を参照）。従って、アゴニスト効果を引き起こす目的のために本発明の化合物を投与すると、ＧＬＰ−１それ自体と同じ効果及び用途を有し得る。これらのＧＬＰ−１の多様な使用は、以下のように要約できる：Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、肥満、グルカゴノーマ、気道の分泌障害、代謝障害、関節炎、骨粗鬆症、中枢神経系疾患、再狭窄、神経変性疾患、腎不全、鬱血性心不全、ネフローゼ症候群、肝硬変、肺水腫、高血圧症、摂食の抑制が所望される障害、並びに、本明細書で検討されるに様々な他の症状及び障害の治療。従って、本発明には、その範囲内に、式（Ｉ）の化合物を有効成分として含んでなる、本明細書記載の医薬組成物が含まれる。
【００７０】
本発明の配合物中の有効成分の投与量は、変動してよいが、有効成分の量は、好適な投与量が得られるものであることが必要である。選択される投与量は、目的とする治療効果、投与経路、及び治療期間に依存し、通常は担当医が決定する。一般に、本発明の活性に有効な投与量は、１×１０-7〜２００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは１×１０-4〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲にあり、これは、単回用量として投与しても、複数回の投与量で分割投与してもよい。
【００７１】
本発明の配合物は、好ましくは、非経口的に、例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下等へ投与する。
【００７２】
本発明による非経口投与用の調製物には、目的とするｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルが達成されるのならば、無菌の水溶液又は非水溶液、懸濁液、ゲル、又はエマルジョンが含まれる。非水溶媒又はビヒクルの例として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油又はトウモロコシ油等の植物油、ゼラチン、及び、オレイン酸エチル等の注射可能な有機エステルが挙げられる。それらの剤形は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤等のアジュバントを含有してもよい。それらは、例えば、細菌保持フィルターに通すろ過によって、滅菌剤を組成物へ配合することによって、組成物に照射することによって、又は組成物を加熱することによって無菌化できる。それらは又、無菌水や他の注射可能な無菌媒体中に、使用直前に溶かすことのできる無菌の固形組成物の形態で製造できる。
【実施例】
【００７３】
ペプチドの合成：
本発明を実施するのに有用なペプチドは、標準の固相ペプチド合成によって製造可能であり、それにより製造した。例えば、Stewart, J. M.ら,Solid Phase Synthesis（ピアス・ケミカル社、第２版、1984年）を参照。
【００７４】
下記実施例には、それにより本発明を有利に実施できるペプチドを作製するために使用可能であり、それを使用した合成法について記載するが、この合成法は、当業者に公知である。他の方法も当業者に知られている。実施例は、例示の目的のために提供するのであって、本発明の範囲をいかなるやり方でも限定するものではない。
【００７５】
ＧＬＰ−１類似体等の上記ペプチドは、当業者に公知の異なる合成法で入手可能であり、その方法はペプチドの最終沈殿、凍結乾燥法、真空乾燥、又は当分野で公知の他の乾燥法を含むこともできる。イオン交換クロマトグラフィー、緩衝液の浸透圧交換、及びダイフィルトレーション（difiltration）は、本発明において、異なる塩型の該ペプチドを精製又は選択するのに適した方法であり得る。
【００７６】
Ｂｏｃ−βＡｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、及びＢｏｃ−Ｄ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）は、Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社（カリフォルニア州サンディエゴ）より購入した。Ｂｏｃ−Ａｕｎ−ＯＨは、Ｂａｃｈｅｍ社（ペンシルヴェニア州キング・オブ・プルシア）より購入した。Ｂｏｃ−Ａｖａ−ＯＨ及びＢｏｃ−Ａｄｏ−ＯＨは、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社（イリノイ州ウッドデール）より購入した。Ｂｏｃ−２Ｎａl−ＯＨは、Ｓｙｎｔｈｅｔｅｃｈ Ｉｎｃ．社（オレゴン州オールバニー）より購入した。
【００７７】
本明細書に使用する他の略語の完全名は、以下の通りである：Ｂｏｃはｔ−ブチルオキシカルボニル、ＨＦはフッ化水素、Ｆｍはホルミル、Ｘａｎはキサンチル、Ｂｚｌはベンジル、Ｔｏｓはトシル、ＤＮＰは２，４−ジニトロフェニル、ＤＭＦはジメチルホルムアミド、ＤＣＭはジクロロメタン、ＨＢＴＵは２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸塩、ＤＩＥＡはジイソプロピルエチルアミン、ＨＯＡｃは酢酸、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸、２ＣｌＺは２−クロロベンジルオキシカルボニル、２ＢｒＺは２−ブロモベンジルオキシカルボニル、ＯｃＨｅｘはＯ−シクロヘキシル、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメトキシカルボニル、ＨＯＢｔはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＰＡＭ樹脂は４−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、そしてＢｉｓ−Ｔｒｉｓはビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−トリス（ヒドロキシメチル）メタン（即ち、２−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）を表す。用語「ハロ」又は「ハロゲン」には、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードが含まれる。
【００７８】
他に定義のない限り、本明細書に使用するすべての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。又、本明細書で言及された出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、いずれも参照により組み込まれる。
【００７９】
実施例１；（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の詳細な合成手順は、その内容がその全体において本明細書に組み込まれる、国際特許公開公報番号ＷＯ００／３４３３１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０９６６０）で提供されている。簡潔には、該化合物は、加速Ｂｏｃ化学固相ペプチド合成を行うように変更したアプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）商品名モデル４３０Ａペプチド合成機で合成した。Schnolzerら, Int. J. Peptide Protein Res., 40:180 (1992) を参照。０．９１ｍｍｏｌ／ｇの置換された４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ社，カリフォルニア州ベルモント）を使用した。Ｂｏｃアミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ社，カリフォルニア州トーランス；Ｎｏｖａ Ｂｉｏｃｈｅｍ社，カリフォルニア州ラホヤ）を側鎖保護を以下のとおり行って使用した：Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、及びＢｏｃ−Ｔｒｐ（Ｆｍ）−ＯＨ。
Ｂｏｃ基は、１００％ ＴＦＡ、２×１分間の処理により外した。Ｂｏｃアミノ酸（２．５ｍｍｏｌ）は、４ｍＬのＤＭＦ中のＨＢＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（１．０ｍＬ）で予め活性化して、ペプチド−樹脂ＴＦＡ塩の中和に先立つことなくカップリングさせた。カップリング時間は５分であった。但し、Ｂｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ残基と以下の残基：Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２ＣＩＺ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ｈｉｓ（ＤＮＰ）−ＯＨではカップリング時間は２時間であった。
【００８０】
ペプチド鎖の組立ての最後に、樹脂を２０％メルカプトエタノール／１０％ ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液で２×３０分間処理して、Ｈｉｓ側鎖上のＤＮＰ基を外した。次いで、１００％ ＴＦＡで２×２分間の処理によりＮ末端Ｂｏｃ基を外した。ＤＭＦ中１０％ ＤＩＥＡでのペプチド−樹脂の中和（１×１分）の後で、１５％エタノールアミン／１５％水／７０％ ＤＭＦの溶液で２×３０分間の処理により、Ｔｒｐの側鎖上のホルミル基を外した。このペプチド−樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄し、減圧下乾燥させた。１ｍＬのアニソール及びジチオスレイトール（２４ｍｇ）を含有する１０ｍＬのＨＦ中で、ペプチド−樹脂を０℃で７５分間撹拌することによって、最終の開裂を行った。窒素流によってＨＦを除去した。残渣をエーテル（６×１０ｍＬ）で洗浄し、４Ｎ ＨＯＡｃ（６×１０ｍＬ）で抽出した。
【００８１】
水性抽出液中のペプチド混合物を、逆相ＶＹＤＡＣ（登録商標）Ｃ18カラム（Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ社，マサチューセッツ州サウスバラ）を使用する逆相分取用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。１０ｍｌ／分の流速の線形勾配（１０５分にわたり２０％〜５０％のＢ溶液）（Ａ溶液＝０．１％ ＴＦＡを含有する水；Ｂ溶液＝０．１％のＴＦＡを含有するアセトニトリル）でカラムを溶出させた。分画を採取して、分析用ＨＰＬＣで確認した。純粋な生成物を含有する分画を合わせて、凍結乾燥させた。この化合物の合成の１例では、１３５ｍｇの白色固形物を得た。純度は、分析用ＨＰＬＣ分析に基づけば９８．６％であった。エレクトロスプレー質量分光計（ＭＳ（ＥＳ））Ｓ分析によると、分子量は３３３９．７であった（３３３９．７の計算分子量と一致）。
【００８２】
実施例２
配合手順Ｉ
２．１；材料、ストック溶液、計算：
Ａ）材料：ＺｎＣｌ2、ＮａＯＨペレット、及び塩酸（３５％）をＰａｎｒｅａｃ Ｑｕｉｍｉｃａ社（スペイン、バルセロナ）より入手した。ＷＦＩ（注射／灌注用無菌水：sterile water for injection/irrigation）をＢ．Ｂｒａｕｎ Ｍｅｄｉｃａｌ社（スペイン、バルセロナ）より入手した。
【００８３】
Ｂ）ストック溶液：
（ｉ）ＺｎＣｌ2，ｐＨ＝３：
１．撹拌しながら、３５％ ＨＣｌをＷＦＩへ加えて、ｐＨ＝３とする。
２．容量フラスコに、秤量した量のＺｎＣｌ2を移す。撹拌しながら、ｐＨ＝３ ＨＣｌを加えて、約１〜４ｍｇ ＺｎＣｌ2／ｍｌの最終濃度とする。
【００８４】
（ｉｉ）ＺｎＣｌ2，ｐＨ＝２：
１．撹拌しながら、３５％ＨＣｌをＷＦＩへ加えて、ｐＨ＝２とする。
２．容量フラスコに、秤量した量のＺｎＣｌ2を移す。撹拌しながら、ｐＨ＝２のＨＣｌを加えて、約４〜１２ｍｇ ＺｎＣｌ2／ｍｌの最終濃度とする。
【００８５】
（ｉｉｉ）ＮａＯＨ，０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ：
１．容量フラスコに、秤量した量のＮａＯＨを移す。撹拌しながら、ＷＦＩＩを加えて、約０．１〜１０ｍｇ ＮａＯＨ／ｍｌの最終濃度とする。
【００８６】
（ｉｖ）凍結乾燥２０ｍｇアリコート（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／バイアル：
１．酢酸及びＷＦＩの０．０４％（ｖ／ｖ）希釈液を調製する。
２．容量フラスコに、秤量した量の（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（酢酸塩）を移す。撹拌しながら、充分な０．０４％酢酸を加えて、最終濃度を２０ｍｇ（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ｍｌとする。０．４５ミクロンフィルターを使用するろ過滅菌に続いて、この溶液の１ｍｌアリコートを凍結乾燥バイアルへ移し、凍結乾燥させて、乾燥生成物を−２２℃で保存する。
【００８７】
（ｖ）凍結乾燥５０ｍｇアリコート（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／バイアル：
１．酢酸及びＷＦＩの０．１％（ｖ／ｖ）希釈液を調製する。
２．容量フラスコに、秤量した量の（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（酢酸塩）を移す。撹拌しながら、充分な０．１％酢酸を加えて、最終濃度を５０ｍｇ（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ｍｌとする。ろ過滅菌に続いて、この溶液の１ｍｌアリコートを凍結乾燥バイアルへ移して、凍結乾燥させる。
【００８８】
Ｃ）計算：
（ｉ）組成物の全重量／賦形剤の容量（Ｅ）を決定するには下記式を使用する：
Ｅ＝（Ａ×１００／Ｔ）−（Ａ／Ｐ）
ここで：
Ｅ＝賦形剤（ｍｇ）
Ａ＝純粋なペプチドの含量（ｍｇ）；
Ｔ＝組成物の標的濃度；例えば、標的が２％であるならば、２；及び
Ｐ＝純粋なペプチドの濃度（ｍｇペプチド／１００ｍｇ配合物）。
賦形剤の全容量に関しては、１ｍｌ＝１ｇという前提を適用する。
【００８９】
（ｉｉ）組成物溶液の各ｍｌ又はｇへ加えるべきＺｎＣｌ2の容量／重量（Ｗ）を決定するには：
ａ）ｐＨ調整をしない組成物では、Ｗ＝１００％ Ｅ；
ｂ）ペプチドが約１％又は約２％又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する液体配合物では、Ｗ＝８０％ Ｅ；
ｃ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝５０％ Ｅ；
ｄ）ペプチドが約２５％であり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝６６．６６％ Ｅ；
ｅ）ペプチドを凍結乾燥調製品より復元して、塩基を使用してｐＨを調整する配合物では、Ｗ＝９０％ Ｅ。
【００９０】
（ｉｉｉ）組成物溶液の各ｍｌ又はｇへ加えるべきＮａＯＨの容量／重量（Ｗ）を決定するには：
ａ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する配合物では、Ｗ＝２０％ Ｅ；
ｂ）ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％までであり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝５０％ Ｅ；
ｃ）ペプチドが約２５％であり、塩基を使用してｐＨを調整する半固体又はゲル配合物では、Ｗ＝３３．３３％ Ｅ；
ｄ）ペプチドを凍結乾燥調製品より復元して、塩基を使用してｐＨを調整する配合物では、Ｗ＝１０％ Ｅ。
【００９１】
（ｉｖ）各組成物において使用すべきＺｎＣｌ2の濃度（ｍｇ／ｍｌ又はｍｇ／ｇ）を決定するには：
［ＺｎＣｌ2］＝（１３６．２９×Ａ）／（Ｗ×３３３９．７６×Ｒ）
ここで：
Ａ＝純粋なペプチドの含量（ｍｇ）；
Ｒ＝ペプチド／Ｚｎのモル比
ペプチドが約１％又は約２％、又は約１０％、又は約２３％までである配合物では、Ｒ＝１．５；
ペプチドが約２５％である配合物では、Ｒ＝４．０；及び、
Ｗ＝組成物溶液の各ｇ又はｍｌへ加えるべきＺｎＣｌ2溶液の重量（ｇ）又は容量（ｍｌ）。
【００９２】
２．２；１〜１０％の凍結乾燥ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整なしの組成物の調製：
本明細書に使用される、ある割合のペプチドを含む配合物は、組成物の全重量に対しある重量のペプチドを含む配合物を記載するものであり、例えば、１％ペプチドは、１００ｇの全組成物につき１ｇのペプチドを含む配合物を記載する。約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む配合物は、以下のように調製した。上記のように製造した（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の凍結乾燥試料を、１００％の全賦形剤容量と［ペプチド：Ｚｎ］＝１．５：１でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と完全に混合した。
【００９３】
Ａ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を２ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（０．２７２ｍｇ／ｍｌ；上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１％組成物を調製する。
【００９４】
Ｂ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を１ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（０．５４４ｍｇ／ｍｌ；上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して２％組成物を調製する。
【００９５】
Ｃ）５０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｖ）を参照）を０．４５ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（３．０２３ｍｇ／ｍｌ；上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１０％組成物を調製する。
【００９６】
凍結乾燥ペプチドと溶液をそのまま室温まで平衡化した。凍結乾燥ペプチドを含有するバイアルへ指定容量のＺｎＣｌ2溶液を注入して、１％又は２％ペプチド組成物では約２分間、１０％ペプチド組成物では約６０分間、又はすべての凍結乾燥ペプチドが完全に水和して溶液にペプチドの塊がなくなるまで、水和を進行させた。水和に続き、復元したペプチドを約１分間振り混ぜる。
【００９７】
溶かしたペプチドの適正量を投薬のために取り出すことができる。例えば、上記Ａで調製した１％ペプチド溶液の１００μｌは、１ｍｇ用量に相当し、上記Ｂで調製した２％ペプチド溶液の５０μｌは、１ｍｇ用量に相当し、上記Ｃで調製した１０％ペプチド溶液の１５０μｌは、１５ｍｇ用量に相当する。
【００９８】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチドとＺｎＣｌ2の量を変動させて、下記に詳述する１％、２％、及び１０％組成物以外の組成物、並びに目的とする投与量とすることができる。
【００９９】
２．３；１〜１０％の凍結乾燥ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整有りの組成物の調製：
約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む配合物は、以下のように調製した。上記のように製造した（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の凍結乾燥試料を全賦形剤容量の９０％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と完全に混合した。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の目的とするｐＨとする。
【０１００】
Ａ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を１．８ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１％組成物を調製する。
Ｂ）２０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｉｖ）を参照）を０．９ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して２％組成物を調製する。
Ｃ）５０ｍｇの凍結乾燥（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（上記２．１Ｂ（ｖ）を参照）を０．４０ｍｌのＺｎＣｌ2溶液（上記２．１Ｂ（ｉ）を参照）と混合して１０％組成物を調製する。
【０１０１】
希釈ＮａＯＨ溶液の必要量（全賦形剤容量の１０％）を上記溶液へ加えて、標的濃度及びｐＨそれぞれとする。例えば：
１％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．２ｍｌを加え、
２％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．１ｍｌを加え、
１０％組成物へは：適正濃度のＮａＯＨ溶液の０．０５ｍｌを加える。
【０１０２】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、下記１％、２％、及び１０％組成物以外の組成物とすることができる。
【０１０３】
２．４；１〜１０％のペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整なしの液体組成物の調製：
約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む液体配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量し、ＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と混合して、１％、２％、１０％までのペプチドの標的濃度とした。混合に続き、組成物をろ過滅菌して、使用まで保存する。
【０１０４】
２．５；１〜１０％ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整有りの液体組成物の調製：
約１％、又は約２％、約１０％までのペプチドを含む液体配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量し、全賦形剤容量の８０％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ３）と完全に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ2でもＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏでもよい。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の目的とするｐＨとする。この方法を使用して、調製物：Ｃ５〜Ｃ１３を調製した。
【０１０５】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、本明細書に記載する１％、２％、及び１０％以外の組成物とすることができる。
【０１０６】
２．６；２５％ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整なしの半固体／ゲル組成物の調製：
約２５％のペプチドを含む半固体又はゲルの配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量して、全賦形剤容量の６６．６６％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ２）と完全に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ2でもＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏでもよい。この方法を使用して、調製物：Ｃ１及びＣ２を調製した。
【０１０７】
より具体的には、この半固体又はゲル組成物は、「プッシュ−プル」混合法を使用して調製した：
ａ）所望量のペプチドを、特殊な双方向手動バルブ「ＨＶ」（内径＝０．５ｍｍ）を予め取り付けた使い捨てシリンジ「Ｓ１」の筒へ秤量して、シリンジルアーホール（Luer hole）の内側に管（tubing）を入れた；
ｂ）シリンジプランジャーをステンレススチールロッド「ＳＲ」で留めた；
ｃ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を真空源へ連結して、「ＨＶ」を開いた。１０分後、ＨＶを閉じた；
ｄ）第二の使い捨てシリンジ「Ｓ２」の筒へ亜鉛溶液を正確に秤量した；
ｅ）次いで、「Ｓ２」を「ＨＶ」の開放部分へ連結した；
ｆ）「ＨＶ」を開いて、ペプチド粉末を含有する筒「Ｓ１」へ真空によって溶媒を引き入れた；
ｇ）「ＨＶ」を閉じて、溶媒シリンジ「Ｓ２」を外し、それにより「Ｓ１」中のペプチド粉末を水和させた；
ｈ）「ＳＲ」を外して、シリンジプランジャーをゆっくり解放した；
ｉ）「ＨＶ」を開けずにシリンジプランジャーを動かし（押して引く）、粉末の塊が溶媒に完全に浸るようにする；
ｊ）双方向ステンレスコネクタ「ＳＣ」（内径＝１．０ｍｍ）を、管がシリンジルアーホールの内側に入ったシリンジ「Ｓ２」に入れて、そのプランジャーを先端まで押した；
ｋ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を開いて真空を換気しててから、「ＨＶ」を外した。シリンジプランジャーを動かして、シリンジ筒中の空気を最少化した；並びに
ｌ）「Ｓ１」及び「Ｓ２」を「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して「Ｓ１」から「Ｓ２」へ混練した。
【０１０８】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、本明細書に記載する２５％以外の組成物とすることができる。
【０１０９】
２．７；２５％ペプチド及びＺｎＣｌ2を含む、ｐＨ調整有りの半固体／ゲル組成物の調製：
約２５％のペプチドを含む半固体又はゲルの配合物は、以下のように調製した。（Ａｉｂ8,35）ＨＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の試料を秤量して、全賦形剤容量の６６．６６％でＺｎＣｌ2ストック溶液（ｐＨ２）と完全に混合した。この亜鉛溶液は、ＺｎＣｌ2でもＺｎＡｃ2・２Ｈ2Ｏでもよい。希釈ＮａＯＨ溶液の添加によって、溶液の目的とするｐＨとする。この実施例では、該粉末へ加える液体の全容量を亜鉛溶液とＮａＯＨ溶液の間で分割しなければならない。従って、亜鉛溶液の濃度を調整して、必要とされる亜鉛溶液の全容量を、ペプチド粉末へ加える全液体容量の５０％へ減少させた（工程ｄ）。ペプチド粉末へ加える全液体容量の残りの５０％は、下記に詳述するように、ＮａＯＨ溶液として加えた。この方法を使用して、調製物：Ｃ３及びＣ４を調製した。
【０１１０】
このｐＨ調整した半固体又はゲル組成物は、「プッシュ−プル」混合法を使用して調製した：
ａ）所望量のペプチドを、特殊な双方向手動バルブ「ＨＶ」（内径＝０．５ｍｍ）を予め取り付けた使い捨てシリンジ「Ｓ１」の筒へ秤量して、シリンジルアーホールの内側に管を入れた；
ｂ）シリンジプランジャーをステンレススチールロッド「ＳＲ」で留めた；
ｃ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を真空源へ連結して、「ＨＶ」を開いた。１０分後、ＨＶを閉じた；
ｄ）第二の使い捨てシリンジ「Ｓ２」の筒へ亜鉛溶液を正確に秤量した；
ｅ）次いで、「Ｓ２」を「ＨＶ」の開放部分へ連結した；
ｆ）「ＨＶ」を開いて、ペプチド粉末を含有する筒「Ｓ１」へ真空によって溶媒を引き入れた；
ｇ）「ＨＶ」を閉じて、溶媒シリンジ「Ｓ２」を外し、それにより「Ｓ１」中のペプチド粉末を水和させた；
ｈ）「ＳＲ」を外して、シリンジプランジャーをゆっくり解放した；
ｉ）「ＨＶ」を開けずにシリンジプランジャーを動かし（押して引く）、粉末の塊が溶媒に完全に浸るようにする；
ｊ）双方向ステンレスコネクタ「ＳＣ」（内径＝１．０ｍｍ）を、管がシリンジルアーホールの内側に入ったシリンジ「Ｓ２」に入れて、そのプランジャーを先端まで押した；
ｋ）「Ｓ１」中の「ＨＶ」を開いて真空を換気してから、「ＨＶ」を外した。シリンジプランジャーを動かして、シリンジ筒中の空気を最少化した；
ｌ）「Ｓ１」及び「Ｓ２」を「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して「Ｓ１」から「Ｓ２」へ混練した；
ｍ）ホモジェナイゼーションの後で、混合した生成物のアリコートを取り出して、ペプチドの濃度を定量した；
ｎ）残りの中間バルク生成物を正確に秤量して、目的とするｐＨに達するために必要とされるＮａＯＨ溶液の量を計算した；
ｏ）第三の使い捨てシリンジ「Ｓ３」へＮａＯＨ溶液を正確に秤量した；及び
ｐ）シリンジプランジャーをゆっくり圧縮して、シリンジチャンバ中の空気を最少化した。両方のシリンジを「ＳＣ」により連結して、組成物を、「ＳＣ」を通して練り込んだ。
【０１１１】
本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド及びＺｎＣｌ2の量を変動させて、本明細書に記載する２５％以外の組成物とすることができる。
【０１１２】
【表１】
【０１１３】
３．０．；ＧＬＰ−１受容体アフィニティーの定量：
本発明を実施するのに有用な化合物について、以下の手順を使用して、ＧＬＰ−１受容体へ結合するその能力を試験することができる。
【０１１４】
細胞培養：
ＧＬＰ−１受容体を発現しているＲＩＮ ５Ｆラットインスリノーマ細胞（ＡＴＣＣ−＃ＣＲＬ−２０５８，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，バージニア州マナッサス）を、１０％胎仔ウシ血清を含有するダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）内で培養して、５％ ＣＯ2／９５％空気の加湿雰囲気中に約３７℃で維持した。
【０１１５】
放射リガンド結合：
商品名Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（ニューヨーク州ウェストベリー）（設定６、１５秒）により、２０ｍｌの氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌにおけるＲＩＮ細胞のホモジェナイゼーションによって、放射リガンド結合試験用の膜を調製した。このホモジェネートを遠心分離（３９，０００ｇ／１０分）によって２回洗浄して、最終ペレットを、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2，０．１ｍｇ／ｍｌ商品名バシトラシン（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）、及び０．１％ ＢＳＡを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに再懸濁させた。分析のために、０．０５ｍｌの非標識競合試験ペプチドを含めて、及び含めずに、アリコート（０．４ｍｌ）を０．０５ｎＭ（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）（約２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ社，マサチューセッツ州ボストン）とともにインキュベートした。１００分のインキュベーション（２５℃）の後、結合した（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）を、０．５％ポリエチレンイミンに浸しておいた商品名ＧＦ／Ｃフィルター（Ｂｒａｎｄｅｌ社，メリーランド州ゲイサースブルグ）を通す急速ろ過によって、遊離型から分離した。次いで、このフィルターを、氷冷５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの５ｍｌアリコートで３回洗浄して、フィルター上に捕捉された結合放射活性をγ線スペクトロメトリー（Ｗａｌｌａｃ ＬＫＢ社，メリーランド州ゲイサースブルグ）によって計数した。特異的結合は、「結合した（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）全量」から「１０００ｎＭ ＧＬＰ−１（７−３６）（Ｂａｃｈｅｍ社，カリフォルニア州トーレンス）の存在下に結合した（125Ｉ）ＧＬＰ−１（７−３６）量」を引いたものとして定義した。
【０１１６】
４．；ｐＨに対する溶解度の定量：
４．１．リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）でのｐＨに対する化合物溶解度の定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、ＰＢＳ中のその溶解度を異なるｐＨ及び温度で測定することができる。
１パケットのプレミックス粉末（シグマ社製、製品番号：Ｐ−３８１３）を１リットルの脱イオン水に溶かしてストックＰＢＳ緩衝化溶液を作製して、１３８ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨ７．４である１０ｍＭリン酸緩衝食塩水を得た。このストック溶液のｐＨをリン酸及び／又は水酸化ナトリウムで調整することによって、異なるｐＨ値のＰＢＳ緩衝液を作製した。
【０１１７】
試験する化合物の２ｍｇ試料、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇをガラスバイアルへ秤量した。各バイアルへある一定のｐＨでＰＢＳ緩衝液の５０μｌアリコートを加えた。この溶液を激しく撹拌して、澄明になるまで、必要ならば音波処理した。試験する各ｐＨについて、２ｍｇの化合物を溶かすのに必要とした緩衝液の全容量記録して、溶解度を計算した。
室温（２０〜２５℃）で澄明であるペプチド溶液を冷蔵庫（４℃）に一晩入れてから、該ペプチドの４℃での溶解度を測定した。
【０１１８】
４．２．生理食塩水におけるｐＨに対する化合物溶解度の定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、生理食塩水中のその溶解度を、異なるｐＨ値及び温度で定量することができる。
９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによってストック生理食塩水溶液を調製する。このストック溶液のｐＨを、ＨＣｌ及び／又はＮａＯＨで調整することによって、異なるｐＨ値の生理食塩水溶液を作製する。
【０１１９】
試験する化合物の２ｍｇ試料、例えば、実施例１の化合物の２ｍｇをガラスバイアル内へ秤量する。各バイアルへある一定のｐＨで生理食塩水溶液の５０μｌアリコートを加える。このバイアルを激しく撹拌して、澄明になるまで、必要ならば音波処理する。試験する各ｐＨについて、２ｍｇの化合物を溶かすのに必要とする緩衝液の全容量を記録して、溶解度を計算する。
室温（２０〜２５℃）で澄明溶液を冷蔵庫（４℃）に一晩入れてから、４℃での溶解度を測定する。
【０１２０】
４．３．生理食塩水中の化合物溶解度のｐＨ７．０での定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、ｐＨ＝７を有する生理食塩水中、室温での溶解度を定量することができる。
９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによって生理食塩水溶液を調製する。試験する化合物、例えば実施例１の化合物、の２ｍｇ試料をガラスバイアル内へ秤量して、激しい撹拌と音波処理を伴いながら、生理食塩水の１ｍｌアリコートを、澄明になるまで加える。２ｍｇのペプチドを溶かすのに必要とする生理食塩水の全容量を記録して、室温での溶解度を計算する。
【０１２１】
４．４．生理食塩水中の化合物溶解度の様々なｐＨでの定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、様々なｐＨ値を有する生理食塩水中の、室温での溶解度を定量することができる。
９グラムのＮａＣｌを１リットルの脱イオン水に溶かすことによってストック生理食塩水溶液を調製する。このストック生理食塩水溶液のアリコートをＨＣｌ及びＮａＯＨで処理することによって、様々なｐＨ値を有する生理食塩水溶液を入手する。
試験する化合物、例えば実施例１の化合物の、２ｍｇ試料をガラスバイアル内へ秤量する。生理食塩水緩衝液の５０μｌのアリコートを、ある一定のｐＨで加える。この溶液を、澄明になるまで激しく撹拌して音波処理する。２ｍｇのペプチドを溶かすのに使用する緩衝液の全容量を記録して、溶解度を計算する。
【０１２２】
５．亜鉛濃度に対する化合物の水溶解度の定量：
本発明を実施するのに有利に使用できる化合物について、以下の手順を使用して試験して、ｐＨ７の水中のその溶解度を異なる亜鉛濃度で定量することができる。
ＺｎＣｌ2を脱イオン水に１００ｍｇ／ｍｌの濃度へ溶かして、ＨＣｌを使用してｐＨを２．７へ調整することによって、ストック亜鉛溶液を調製した。このストック溶液の滴正な希釈液を作製することによって、様々なＺｎＣｌ2濃度を有する溶液（「Ｚｎ試験溶液」）を調製した。
【０１２３】
試験する化合物の１ｍｇ、例えば、実施例１の化合物の１ｍｇを２５０μｌの各Ｚｎ試験溶液に溶かして、４ｍｇ／ｍｌの化合物を有する溶液を得る。次いで、０．２Ｎ ＮａＯＨを使用して、白色沈殿の形成が観察されるまでこの溶液のｐＨを調整した。この沈殿溶液を遠心分離して、ＨＰＬＣを使用して母液を分析した。試験化合物ピークのＵＶ吸収領域を測定して、試験化合物の母液中の濃度を較正曲線との比較により定量した。
本発明を実施するために使用できる化合物の代表例として、実施例１の化合物について直前に記載した分析方法で試験して、以下の結果を入手した（水性、ｐＨ７．０、室温）：
【０１２４】
【表２】
【０１２５】
６．ＩＥＦゲルを使用する、等電点（ｐＩ）の決定：
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の商品名Ｎｏｖｅｘ ＩＥＦ ｐＨ３−１０ゲルを使用して、ＧＬＰ−１ペプチド、例えば実施例１の化合物のｐＩを測定した。試験するペプチジル化合物を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度まで水に溶解した。それぞれの化合物について、得られた溶液の５μｌを５μｌのＮｏｖｅｘ（登録商標）Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ ２Ｘ（２０ｍＭアルギニン遊離基、２０ｍＭリジン遊離基、及び１５％グリセロールを含む）と混合して、生じる１０μｌ試料溶液をタンパク質標準試料とともにこのゲル上へロードした。
【０１２６】
ランニング緩衝液もＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より入手して、製造業者の製品説明書に従って、概ね以下のようにゲルを泳動した：１００Ｖ一定１時間、続いて２００Ｖ一定１時間、続いて５００Ｖ一定３０分間。
次いで、このゲルを、３．５％スルホサリチル酸を含有する１２％ ＴＣＡ中に３０分間固定してから、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｋｉｔ用製品説明書に従って、コロイド状クマッシーブルーで２時間染色してから、水中で一晩脱染色した。
【０１２７】
ゲルを走査して、プログラム：商品名Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ａｎａｌｙｓｉｓ １．２によって分析した。１０．７、９．５、８．３、８．０、７．８、７．４、６．９、６．０、５．３、５．２、４．５、４．２及び３．５のｐＩ値を有する標準化合物のｐＩと比較して、未知ペプチドのｐＩを計算した。
実施例１の化合物の測定ｐＩは、７．６０であった。
【０１２８】
７．ラットでのｉｎ ｖｉｖｏアッセイ：
本発明の組成物について、以下のアッセイを使用して試験して、効果をｉｎ ｖｉｖｏで促進及び強化する能力を判定することができる。
【０１２９】
７．１．実験手順：
実験の前日、約３００〜３５０ｇの重量を有する成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｔａｃｏｎｉｃ社，ニューヨーク州ジャーマンタウン）にクロロヒドレート麻酔下で右心房頚静脈カニューレを移植した。次いで、このラットを１８時間絶食させた後で、適正な試験組成物又はビヒクル対照を時点０で注射した。ラットは、実験全体を通して絶食状態であった。
１００ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2の溶液のｐＨ２．７を有するＨＣｌ水溶液での希釈によって、０．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2溶液を調製した。この溶液の２５０μｌに式（Ｉ）の化合物（（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2）の１ｍｇを溶かして、該化合物４ｍｇ／ｍｌ及びＺｎ０．５ｍｇ／ｍｌをｐＨ４で有する澄明溶液を得た。
【０１３０】
時点０で、（ａ）（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2）の直前の（immediately forgoing）溶液又はビヒクル対照のいずれかをラットに皮下（ｓｃ）注射した。両方の場合で注射容量はごく少なく（４〜６μＬ）、被検体へ投与したＧＬＰ−１化合物の用量は、７５μｇ／ｋｇであった。ｓｃ注射後の適正な時間に、５００μｌの血液試料を静脈内（ｉｖ）カニューレより吸引して、ラットにｉｖグルコースチャレンジを与えて、亢進したインスリン分泌の存在を試験した。グルコースチャレンジの時間は、化合物注射後０．２５、１、６、１２、及び２４時間であった。最初の血液試料を吸引採取した後で、グルコース（１ｇ／ｋｇ）をｉｖ注射して、５００μｌヘパリン添加生理食塩水（１０Ｕ／ｍｌ）を流した（flushed in）。その後、グルコース注射後２．５、５、１０、及び２０分で５００μｌの血液試料を吸引採取した。これらのいずれの後も、カニューレを介した５００μｌヘパリン添加生理食塩水（１０Ｕ／ｍｌ）のｉｖ注射を直ぐに行った。血液試料は遠心分離させ、各試料より血漿を採取して、インスリン含量をアッセイするまで、その試料を−２０℃に保存した。ラットインスリン酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キット（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ニューハンプシャー州ウィンダム）を使用して、各試料中のインスリンの量を定量した。
【０１３１】
７．１．１．結果：
グルコース注射によって誘導される、持続されたインスリン亢進活性が本実験の全２４時間にわたり観測された。
【０１３２】
８．イヌでのiｎ ｖｉｖｏアッセイ：
当業者が、活性化合物のｉｎ ｖｉｖｏ延長放出を促進する組成物の能力を定量可能とする、多くのｉｎ ｖｉｖｏアッセイが当分野で公知である。
【０１３３】
８．１．；１％ペプチド組成物：
例えば、１％（ｗ／ｗ）の式（Ｉ）の化合物をＺｎＣｌ2の緩衝化溶液に含んでなる（ペプチド：Ｚｎ比＝１．５：１．０）水性試験配合物を調製した。
全６頭の雄ビーグル犬（４２〜７８月齢で、体重１４〜２１ｋｇ）を、水及び１日１回の食餌（約４００ｇの乾燥標準食（ＳＡＦＥ １２５）への自由摂取で維持した。これらイヌは、試験組成物の投与前１８時間絶食させた。
試験組成物は、皮下経路によって、肩甲骨間の領域付近で投与した。投与の容量（各動物につき約２０μｌ）は、０．３３〜１２ｍｍの０．３ｍｌテルモ社シリンジ（ＢＳ＝３０Ｍ２９１３）によって作製した。このようにして、約０．２ｍｇペプチドの理論用量を達成した。
【０１３４】
血液試料を周期的に、投与後約０、８、１５、３０及び４５分、１、２、４、８及び１２時間、並びに１、２、３、４、５及び６日の時点で採取した。サンプリング後から遠心分離までの間、血液を速やかに冷却し、血漿をデカントして、継続中のアッセイまでは速やかに凍結させた。ペプチド血漿濃度の定量は、オフライン固相抽出の後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを備えたオンライン相抽出により行い、得られたデータは、商品名Ａｎａｌｙｓｔ ｖ１．２ソフトウェアによって管理処理した。
上記組成物は、活性ペプチドの少なくとも２日間の持続放出を示した。
【０１３５】
８．２．；１％（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2溶液：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された期間の間放出するその能力を検証した。以下の４種の組成物のそれぞれで、ペプチドの濃度は、約１％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、約１ｍｇであった。
溶液８．２．Ａ：（ｉ）９０％ ＺｎＣｌ2（０．２９８ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）１０％ ＮａＯＨ（０．９７５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．２．Ｂ：ＺｎＣｌ2の溶液（０．２８６ｍｇ／ｍｌ）中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．２．Ｃ：溶液８．２．Ｂに実質的に類似して、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ-を使用して緩衝化されている；
溶液８．２．Ｄ：溶液８．２．Ａに実質的に類似。
【０１３６】
これらの組成物は、図１に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１３７】
８．３．；１％（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2溶液：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。以下の組成物では、ペプチドの濃度は、約２％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、約１ｍｇであった。
溶液８．３：（ｉ）８０％ ＺｎＣｌ2（０．６９５ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）２０％ ＮａＯＨ（１．７５ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
【０１３８】
この組成物は、図５に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１３９】
８．４．；１０％ペプチド溶液：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。以下の４種の組成物のそれぞれで、ペプチドの濃度は、約１０％（重量／重量）であり、ペプチドの亜鉛に対する比は約１．５：１であり、投与したペプチドの用量は、約１５ｍｇであった。
溶液８．４．Ａ：（ｉ）９０％ ＺｎＣｌ2（３．３６７ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）１０％ ＮａＯＨ（５．０１ｍｇ／ｍｌ）を含有する溶液中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．４．Ｂ：ＺｎＣｌ2の溶液（２．９９３ｍｇ／ｍｌ）中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
溶液８．４．Ｃ：溶液８．４．Ｂに実質的に類似して、ＡｃＯＨ／ＡｃＯ-を使用して緩衝化されている；
溶液８．４．Ｄ：溶液８．４．Ａに実質的に類似。
【０１４０】
これらの組成物は、図２に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４１】
８．５．；半固体組成物：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。組成物８．５．Ａでは、ペプチドの濃度は約５％であり、組成物８．５．Ｂ、８．４．Ｃ、及び８．５．Ｄでは、ペプチドの濃度は、約１０％（重量／重量）であった。ペプチドの亜鉛に対する比は、組成物８．５．Ａ、８．５．Ｂ、及び８．５．Ｃで約５．４：１であり、組成物８．５．Ｄでは、その比は約４．０：１であった。４種の組成物すべてで、投与したペプチドの用量は、約１ｍｇであった。
【０１４２】
組成物８．５．Ａ：ＷＦＩ中のＺｎＣｌ2（０．４０ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固体組成物中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
組成物８．５．Ｂ：組成物８．５．Ａに実質的に類似するが、ＺｎＣｌ2濃度を上方へ調整して、ペプチド：Ｚｎ比を約５．４：１に維持した。
組成物８．５．Ｃ：（ｉ）５０％ ＺｎＣｌ2（１．６９ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）５０％ ＮａＯＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固形物中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
組成物８．５．Ｄ：（ｉ）５０％ ＺｎＣｌ2（２．２８ｍｇ／ｍｌ）及び（ｉｉ）５０％ ＮａＯＨ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する半固形物中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2。
【０１４３】
これらの組成物は、図３に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４４】
８．６．；半固体組成物：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。この組成物は、５．２２ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2溶液をｐＨ＝２．０で使用して配合した。充分なペプチドを提供して、ペプチドの亜鉛に対する比約４：１を有する２５％ペプチド半固体組成物を得た。この組成物のｐＨを、１０ｍｇ／ｍｌ ＮａＯＨを使用して本明細書記載のとおり調整した。投与したペプチドの用量は、約１５ｍｇであった。
【０１４５】
組成物８．６は、図６に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４６】
８．７．；半固体組成物：
上記８．１節の記載と実質的に同じｉｎ ｖｉｖｏアッセイ手順を使用して、以下の半固体組成物について、主題のペプチドを延長された期間にわたり放出する能力を検証した。この組成物は、８．５ｍｇ／ｍｌ ＺｎＣｌ2溶液をｐＨ＝２．０で使用して配合した。充分なペプチドを提供して、ペプチドの亜鉛に対する比約１．５：１を有する２３％ペプチド半固体組成物を得た。上記２．６節に詳述した方法に従って、この組成物を配合した。投与したペプチドの用量は、約１５ｍｇ（組成物の約６５μｌに相当する）であった。
【０１４７】
組成物８．６は、図７に図示するように、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の持続放出をもたらした。
【０１４８】
開示した配合物の様々な置換物（permutations）を用いた更なるアッセイを同様にｉｎ ｖｉｖｏアッセイへ適用して、本発明の組成物が式（Ｉ）の化合物に有用な医薬送達プラットフォームを提供することが確かめられ。本出願の教示を使用すれば、当業者は、ペプチド、ＺｎＣｌ2の量及びｐＨを変動させて、本明細書に記載の本発明の組成物を調製することができる。
【０１４９】
実施例９：
１．：１０％ペプチド溶液中の酢酸塩含量によるＰＫプロファイル調節
本実施例は、雄ビーグル犬における（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の薬物動態試験を開示し、それは１０％（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2及び塩化亜鉛を含有する２種の即時調合組成物［（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2：Ｚｎ＝１．５：１］の１５ｍｇ／イヌの用量レベルでの単回皮下投与の後に行われた。
このｉｎ ｖｉｖｏアッセイを行う方法は、パラグラフ８．１で開示したものと同じである。
【０１５０】
本実施例は、医薬組成物中の酢酸塩含量によるＰＫプロファイル調節、従って、医薬組成物中の［酢酸塩／ペプチド］比のｐＨに対する影響を明らかにする。
このｐＨ調節は、酢酸塩含量の調節により制御されて、酢酸塩含量の減少は、ｐＨの増加効果を示す。
酢酸塩の変動は又、Ｃmaxに対する効果を示す。一般に、酢酸塩含量の減少は、Ｃmax値を減少させる。
酢酸塩含量の増加は、溶解性と物理安定性の改善を示す。
【０１５１】
選択した配合物によれば、酢酸塩／ペプチド比の調節による溶解性又は安定性に対する改善は、ペプチド／Ｚｎ比の例えばＣmaxに対する調節によって補償される。このことは、安定性、溶解性、ｐＨ又はＣｍａｘを調整する３つの可能な変数のシステムとして理解できる。
【０１５２】
本実施例では、略語「ＳＤ」は、標準偏差を意味する。「ＡＵＣ」は、血漿濃度−時間曲線下のアルテミシニン（Artemisinin）面積を意味する。
略語「ＭＲＴ」の意味は、平均滞留時間（ＭＲＴ）であり、ピーク薬物濃度の時間であるｔｍａｘとＭＲＴを比較してバイオアベイラビリティ率を推定するための変数である。時点０より最終サンプリング時間までのデータを使用して、ＭＲＴを計算した。
【０１５３】
表３には、異なる［酢酸塩／ペプチド］比を有する１０％ペプチド組成物バッチとビーグル犬における皮下投与の結果をまとめてある。血中薬物濃度のピーク値、（Ｃmax）は、［３．７：１］の［酢酸塩／ペプチド］モル比では８．１０ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ＝１．８０ｎｇ／ｍｌ）であり、一方、より低い比［３．２：１］を有するバッチは、５．６５ｎｇ／ｍｌ（ＳＤ＝２．６１ｎｇ／ｍｌ）のＣmax値をもたらした。
【０１５４】
【表３】
【０１５５】
１０．；ＧＬＰ−１ペプチド塩／二価金属配合物：
１０．１．方法：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2 １ｍｇ／ｍＬ水の溶液とＰＢＳ溶液を調製して、ｐＨを７．０へ調整した。ＣａＣｌ2、ＣｕＣｌ2、ＭｇＣｌ2、及びＺｎＣｌ2の１０ｍｇ／ｍＬストック水溶液を調製した．ＣａＣｌ2、ＭｇＣｌ2、及びＺｎＣｌ2溶液のｐＨは、７．０へ調整した。ＣｕＣｌ2溶液のｐＨは、Ｃｕが析出したので、塩基性にすることができなかった。従って、ｐＨ４．４のＣｕＣｌ2溶液を使用した。
【０１５６】
２００μＬの（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（１ｍｇ／ｍＬ）溶液へ４μＬの金属イオン水溶液又はＰＢＳ溶液を加えて、２００μｇ／ｍＬの最終金属イオン濃度とした。得られた溶液を混合して、沈殿を確認した。沈殿が生成したならば、懸濁液を遠心分離させた。上清中の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2濃度をＨＰＬＣによって定量した。
【０１５７】
１０．２．結果：
表４．二価金属イオンの存在下での（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の溶解度
【０１５８】
【表４】
【０１５９】
１０．３．；（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／二価金属（ｐＨ５．５）澄明溶液配合物の薬物動態試験：
以下の手順を使用することによって、（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の３種の異なる配合物を調製した。
（１）ＣｕＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩
（２）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩
（３）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩
【０１６０】
ＧＬＰ−１類似体のＴＦＡ塩（このＴＦＡ塩は、分取用ＨＰＬＣを使用してＴＦＡ含有緩衝溶液で溶出させるペプチドの精製により生じる）は、該ペプチドを少量の０．２５Ｎ酢酸水溶液に溶解させることによって、酢酸塩等の別の塩へ変換することができる。得られた溶液をsemi-prepＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ社，３００ＳＢ，Ｃ−８）へ適用する。このカラムを（１）０．１Ｎ酢酸アンモニウム水溶液で０．５時間、（２）０．２５Ｎ酢酸水溶液で０．５時間、そして（３）４ｍｌ／分の流速の線形勾配（３０分にわたり２０％〜１００％の溶液Ｂ）（溶液Ａは、０．２５Ｎ酢酸水溶液であり；溶液Ｂは、アセトニトリル／水（８０：２０）中０．２５Ｎ酢酸である）で溶出させる。該ペプチドを含有する分画を採取して、凍結乾燥させる。
【０１６１】
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩は、凍結乾燥法によって製造した。２０ｍｇの（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩を４ｍＬの２０ｍＭ ＨＣｌ水溶液に溶かして、室温で１０分間インキュベートした。この試料を凍結させて、一晩凍結乾燥させた。凍結乾燥を更に２回実施して、最終生成物の塩化物含量を定量した。定量され塩化物含量は、５．３８％であった。
【０１６２】
（１）ＣｕＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ（５．３ｍｇ；ペプチド含量は９５％）を５０μＬの２０ｍＭ ＣｕＣｌ2水溶液に溶かした。ｐＨを約２μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＣｕＣｌ2のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、約５．５のｐＨであった。
【０１６３】
（２）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ塩：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2・ＨＣｌ（５．３ｍｇ；ペプチド含量は９５％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＺｎＣｌ2水溶液に溶かした。ｐＨを約２μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、約５．５のｐＨであった。
【０１６４】
（３）ＺｎＣｌ2及び（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩：
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2酢酸塩（５．５ｍｇ；ペプチド含量は９２％である）を５０μＬの２０ｍＭ ＺｎＣｌ2水溶液に溶かした。得られた溶液を一晩凍結乾燥させて、５０μＬの水に再び溶かした。ｐＨを約１μＬの１Ｎ ＮａＯＨで約５．５へ調整した。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2／ＺｎＣｌ2のモル比は、１．５：１であった。ペプチド濃度は、水中１０％（ｗ／ｗ）（３０ｍＭ）で、約５．５のｐＨであった。
【０１６５】
１０．４．投薬と血液試料採取：
ラットに上記３種の（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2配合物を０．３ｍｇ／ラット（１０％溶液の３μＬ）で皮下投与した。５、１０、１５、３０分、１、２、４、８時間、及び１、２、３、４、７、１０日目に血液試料を採取した。この血液から遠心分離により血漿を採取して、−８０℃で保存した。注射部位での組織も採取し、５×メタノール中でホモジェナイズして、−８０℃で保存した。
２匹のラットを５、１０、１５、３０分と１、２、４、８時間のデータ点のために使用した。１匹のラットを１、２、３、４、７、１０日のデータ点のために使用した。
【０１６６】
１０．５．；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ試料調製：
血漿（２００μＬ）を１０μＬのギ酸で酸性化して、６００μＬのアセトニトリルで沈殿させた。遠心分離により上清を採取して、真空で濃縮乾固させた。残渣を１５０μＬの３０％アセトニトリル水溶液に溶かして、遠心分離した。５０μＬの上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に注入した。
組織メタノール抽出物（１０μＬ）を１ｍＬの３０％アセトニトリル水溶液へ希釈して、５０μＬをＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用に注入した。
【０１６７】
１０．６．；ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、商品名Ｔｕｒｂｏイオンスプレープローブを取り付けたＡＰＩ４０００質量分析計システムで行った。分子イオン検出のＭＲＭモードを、６６８．９及び１３６．１のイオン対で使用した。
ＨＰＬＣ分離は、０．３０ｍＬ／分の流速で１０分間、１０％ Ｂ〜９０％ Ｂへ勾配をかけてＬｕｎａ Ｃ８（２） ２×３０ｍｍ ３μカラムで実施した。緩衝液Ａは、１％ギ酸水溶液であり、緩衝液Ｂは、１％ギ酸アセトニトリル溶液である。
ＬＯＱは、０．５ｎｇ／ｍＬであった。
【０１６８】
１０．７．結果と要約：
ペプチドの血漿濃度は、その標準較正プロットを用いて計算した。０．０６ｍｇ／ｍＬの（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2（５ｍＬメタノール抽出物中０．３ｍｇ／ラット）を１００％として使用して、注射部位に残った割合を計算した。
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のＨＣｌ塩配合物の薬物動態プロファイルの全体経時変化プロットを図８に示す。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2のＨＣｌ塩配合物の薬物動態プロファイルの初期経時変化プロットを図９に示す。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の酢酸塩配合物の薬物動態プロファイルの全体経時変化プロットを図１０に示す。（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の酢酸塩配合物の薬物動態プロファイルの初期経時変化プロットを図１１に示す。
【０１７１】
【表６】
【０１７２】
（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2の注射部位での組織蓄積プロファイルを図１２に更に示す。
【０１７３】
【表７】
【０１７４】
上記結果は、ＧＬＰ−１類似体塩型の、特に二価金属塩との組み合わせが、初期血漿濃度が抑えられ、即ち、望まれない副作用を抑制又は消失させる可能性がある、許容される持続放出配合物を提供することを示す。
上記データは、ＧＬＰ−１類似体の強酸塩、例えばＨＣｌ塩が、初期血漿濃度において更なる低下を示すことを示す。本発明は下記理論に制限されるものではないが、ＧＬＰ−１類似体のＨＣｌ塩の初期血漿濃度における優れた低下は、ｉｎ ｖｉｖｏでの中和プロセスに関連すると考えられている。上記組成物（１）及び（２）では、ｐＨ５．５で酸の１００％が塩化物の形であり、遊離酸は存在しない。従って、皮下注射後に、体液はこの溶液剤をより速やかに中和して、この溶液剤を更に急速に沈殿させることができる。中和時間におけるこれらの減少は、より少なく、より顕著でない初期血漿濃度又はスパイクをもたらす。
【０１７５】
実施例１１；１０％ペプチド類似体（Ａｉｂ8,35）ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2、酢酸及び塩化亜鉛を含む液体組成物の調製：
【０１７６】
【表８】
【０１７７】
ＷＦＩ（又は注射用水）は、無菌水又はＮａＣｌ等の等張剤を含む無菌水を示す。
シリンジを１０μｌで完全充填した。実施例１１．１では、バイアルは０．３ｍｌの１０％ペプチド類似体溶液を含む。実施例１１．２では、シリンジは０．１１ｍｌの１０％ペプチド類似体溶液を含む。実施例１１．３では、シリンジは０．２１ｍｌの１０％ペプチド類似体溶液を含む。ペプチド類似体の量は医薬物質の分析に基づき調整された。酢酸塩のペプチドに対する割合を３．２：１ｍｏｌ当量とするのに充分な、酢酸を添加した。ペプチド類似体の塩化亜鉛に対する割合を１．５：１ｍｏｌ当量とするのに充分な、塩化亜鉛を添加した。溶液中のペプチド類似体の重量割合を１０％とするのに充分な、注入用の水を添加した。
【０１７８】
方法：
酢酸をＷＦＩの約９０％に添加した。
ペプチド類似体を添加した。
得られた組成物を完全に溶解するまで攪拌した。
塩化亜鉛を添加した。
ＷＦＩの必要量を添加した。
得られた組成物を完全に溶解するまで攪拌した。
溶解された溶液を、０．２２μｍ（商品名ＭＩＬＬＩＰＡＫ２０）で２回滅菌ろ過した。
ろ過した溶液を、０．３ｍｌ／バイアル＝０．３１０ｇ／バイアル（密度＝１．０３３）バイアル内、又はデッドボリューム１０μｌのシリンジ内に充填した。
【０１７９】
上記に引用した出版物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の追加の態様は前述の開示から明らかであり、それらは、本明細書に充分記載され、下記特許請求の範囲で特定される本発明に含まれることを意図される。
【符号の説明】
【０１８０】
ＨＶ：双方向手動バルブ
Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３：シリンジ
ＳＲ：ロッド
ＳＣ：双方向コネクタ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む制御放出液体医薬組成物であって：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに
酢酸塩及び／又は酢酸；
下記により特徴付けられる医薬組成物；
上記二価の金属及び／又は二価の金属塩は亜鉛及び／又は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは、４〜５の範囲であり；
上記酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約１：１〜６：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約６：１〜１：１である。
【請求項２】
ペプチド類似体の一部及び酢酸塩の一部は、ペプチド類似体の塩として存在する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬的組成物の最終ｐＨは４．５±０．１である請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
液体は無菌水又は、ＮａＣｌ等の等張剤を含む無菌水から選ばれる請求項１〜３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比は約３．２：１である請求項１〜４いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項６】
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約１．５〜１である請求項１〜５いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
二価の金属及び／又は二価の金属塩は塩化亜鉛である請求項１〜６いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
二価の金属及び／又は二価の金属塩は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１の範囲であり；
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約３．２：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約１．５：１である請求項１〜７いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
ペプチドの濃度は１０重量／容量％である請求項１〜８いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
亜鉛の濃度範囲は０．２６重量／容量％〜２．３５重量／容量％である請求項１〜９いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
組成物は温度５℃で少なくとも１年間安定である請求項１〜１０いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が被検体内で少なくとも約１週間、好ましくは２週間放出されるように上記組成物が配合されている請求項１〜１１いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物は、全成分の凍結乾燥無しに、好ましくは全て一緒に混合して調製された請求項１〜１２いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１４】
容器、好ましくはプレフィルドシリンジ内に保存されている請求項１〜１３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
下記ステップを含む請求項１〜１４いずれか１項記載の医薬組成物の製造方法：
Ａ：液体、酢酸塩及び／又は酢酸、並びにペプチド類似体を組み合わせるステップ、及び
Ｂ：二価の金属及び／又は二価の金属塩を添加し溶解するステップ。
【請求項１６】
更に下記ステップを含む請求項１５記載の医薬組成物の製造方法：
Ｃ：ステップＢから得られる組成物を無菌ろ過するステップ、及び
Ｄ：容器へ組成物を充填するステップ。
【請求項１７】
請求項１〜９いずれか１項記載の医薬組成物でプレフィルドされたシリンジであって：上記組成物は下記を含むシリンジ：
液体としての水（ｑｓ２１０μｌ）；
２１ｍｇの式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属塩としての０．５７１ｍｇの塩化亜鉛；及び
酢酸；
但し、上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１であり；
酢酸のペプチド類似体に対するモル比は約３．２：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比は約１．５：１である。
【請求項１】
下記を含む制御放出液体医薬組成物であって：
液体；
式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属及び／又は二価の金属塩；並びに
酢酸塩及び／又は酢酸；
下記により特徴付けられる医薬組成物；
上記二価の金属及び／又は二価の金属塩は亜鉛及び／又は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは、４〜５の範囲であり；
上記酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約１：１〜６：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約６：１〜１：１である。
【請求項２】
ペプチド類似体の一部及び酢酸塩の一部は、ペプチド類似体の塩として存在する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
医薬的組成物の最終ｐＨは４．５±０．１である請求項１又は２記載の医薬組成物。
【請求項４】
液体は無菌水又は、ＮａＣｌ等の等張剤を含む無菌水から選ばれる請求項１〜３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項５】
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比は約３．２：１である請求項１〜４いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項６】
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約１．５〜１である請求項１〜５いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項７】
二価の金属及び／又は二価の金属塩は塩化亜鉛である請求項１〜６いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項８】
二価の金属及び／又は二価の金属塩は塩化亜鉛であり；
上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１の範囲であり；
酢酸塩及び／又は酢酸の、ペプチド類似体に対するモル比範囲は約３．２：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比範囲は約１．５：１である請求項１〜７いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
ペプチドの濃度は１０重量／容量％である請求項１〜８いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１０】
亜鉛の濃度範囲は０．２６重量／容量％〜２．３５重量／容量％である請求項１〜９いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１１】
組成物は温度５℃で少なくとも１年間安定である請求項１〜１０いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１２】
式（Ｉ）の化合物が被検体内で少なくとも約１週間、好ましくは２週間放出されるように上記組成物が配合されている請求項１〜１１いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１３】
医薬組成物は、全成分の凍結乾燥無しに、好ましくは全て一緒に混合して調製された請求項１〜１２いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１４】
容器、好ましくはプレフィルドシリンジ内に保存されている請求項１〜１３いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項１５】
下記ステップを含む請求項１〜１４いずれか１項記載の医薬組成物の製造方法：
Ａ：液体、酢酸塩及び／又は酢酸、並びにペプチド類似体を組み合わせるステップ、及び
Ｂ：二価の金属及び／又は二価の金属塩を添加し溶解するステップ。
【請求項１６】
更に下記ステップを含む請求項１５記載の医薬組成物の製造方法：
Ｃ：ステップＢから得られる組成物を無菌ろ過するステップ、及び
Ｄ：容器へ組成物を充填するステップ。
【請求項１７】
請求項１〜９いずれか１項記載の医薬組成物でプレフィルドされたシリンジであって：上記組成物は下記を含むシリンジ：
液体としての水（ｑｓ２１０μｌ）；
２１ｍｇの式（Ｉ）のペプチド類似体：［Ａｉｂ8,35］ｈＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ2；
二価の金属塩としての０．５７１ｍｇの塩化亜鉛；及び
酢酸；
但し、上記医薬的配合物の最終ｐＨは４．５±０．１であり；
酢酸のペプチド類似体に対するモル比は約３．２：１であり；
ペプチド類似体の亜鉛に対するモル比は約１．５：１である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２０１２−５１７４１９（Ｐ２０１２−５１７４１９Ａ）
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８８０９（Ｐ２０１１−５４８８０９）
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００４２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９６７２
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５０９１２０４６９）イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ (51)
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【住所又は居所原語表記】６５ Ｑｕａｉ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｇｏｒｓｅ，Ｆ−９２１００ Ｂｏｕｌｏｇｎｅ Ｂｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月８日（２０１０．２．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０００４２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８９６７２
【国際公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【出願人】（５０９１２０４６９）イプセン ファルマ ソシエテ パール アクシオン サンプリフィエ (51)
【氏名又は名称原語表記】ＩＰＳＥＮ ＰＨＡＲＭＡ Ｓ．Ａ．Ｓ．
【住所又は居所原語表記】６５ Ｑｕａｉ Ｇｅｏｒｇｅｓ Ｇｏｒｓｅ，Ｆ−９２１００ Ｂｏｕｌｏｇｎｅ Ｂｉｌｌａｎｃｏｕｒｔ ＦＲＡＮＣＥ
【Ｆターム（参考）】
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