Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体
【課題】 Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる抗体を提供する。
【解決手段】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されることを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【解決手段】 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されることを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができるモノクローナル抗体、およびかかる抗体を用いた、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、核タンパク質（ＮＰ）と膜タンパク質（Ｍ）の抗原性の違いによりＡ型、Ｂ型、およびＣ型に分類され、特にＡ型インフルエンザウイルスは、さらに、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）のアミノ酸配列または抗原性の違いにより、複数の亜型に分類される。
【０００３】
Ａ型インフルエンザウイルスとしては、ヒトのインフルエンザである季節性インフルエンザウイルス、および鳥類のインフルエンザである鳥インフルエンザウイルスが挙げられる。鳥インフルエンザウイルスには、いくつかの亜型が存在する。このうちＨ５亜型のインフルエンザウイルスは、「高病原性インフルエンザウイルス」と呼ばれる亜型であり、ヒトでの感染の拡大が危惧されている。
【０００４】
現在、臨床で行われているインフルエンザの免疫学的診断方法は、Ａ型の亜型全てを検出するものである（非特許文献１〜１２）。そのため、ヒトがインフルエンザの徴候を示した場合、それが高病原性鳥インフルエンザウイルスによるものであるか、あるいは季節性インフルエンザウイルスによるものであるかを免疫学的診断方法によって区別することは不可能であり、時間と手間のかかる遺伝子検査によって両者を区別している。したがって、高病原性鳥インフルエンザウイルスを迅速に型別診断する方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】池松秀之 他：感染症学雑誌．７３：１１５３−１１５８，１９９９
【非特許文献２】後藤郁男 他：臨床とウイルス．２８：２４８−２５２，２０００
【非特許文献３】山崎雅彦 他：感染症学雑誌．７３：１０６４−１０６８，１９９９
【非特許文献４】三田村敬子 他：感染症学雑誌．７３：１０６９−１０７３，１９９９
【非特許文献５】渡邊寿美 他：感染症学雑誌．７３：１１９９−１２０４，１９９９
【非特許文献６】山崎雅彦 他：感染症学雑誌．７４：１０３２−１０３７，１９９９
【非特許文献７】清水英明 他：感染症学雑誌．７４：１０３８−１０４３，１９９９
【非特許文献８】三田村敬子 他：感染症学雑誌．７４：１２−１６，２０００
【非特許文献９】川上千春 他：感染症学雑誌．７５：７９２−７９９，２００１
【非特許文献１０】山崎雅彦 他：感染症学雑誌．７５： １０４７−１０５３，２００１
【非特許文献１１】三田村敬子 他：インフルエンザ．３：１０５−１０９，２００２
【非特許文献１２】奥野良信 他：医学と薬学．４８：８９５−９０４，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みて創案されたものであり、その目的は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる抗体を得ること、およびかかる抗体を利用した、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの特異的、迅速かつ簡便な検出方法およびそのためのキットを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる抗ＨＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）の構成を有する。
（１）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されることを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
（２）試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出が、（１）に記載の抗体を使用することによって行われることを特徴とする方法。
（３）方法が、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体のうちの少なくとも一方を、請求項１に記載の抗体を使用して調製し、試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させて、一次抗体と二次抗体の間に試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスが狭持されかつ一次抗体が担体固定要素を介して担体に固定された構造を形成させ、次にこの構造中の二次抗体の標識を検出することを含むことを特徴とする（２）に記載の方法。
（４）一次抗体および二次抗体のいずれか一方が、（１）に記載の抗体を使用して調製され、他方が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して調製されることを特徴とする（３）に記載の方法。
（５）一次抗体が、（１）に記載の抗体を使用して調製され、二次抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体を使用して調製されることを特徴とする（３）に記載の方法。
（６）一次抗体および二次抗体の両方が、（１）に記載の抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
（７）（１）に記載の抗体を有効成分として含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出試薬。
（８）（７）に記載の検出試薬を含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる。従って、本発明によれば、インフルエンザの徴候を示したヒトが高病原性鳥インフルエンザにかかっているのか、それとも季節性インフルエンザにかかっているのかを容易に区別することができる。特に、本発明の方法は免疫学的測定に基づいているので、従来の遺伝子検査方法と比較して迅速かつ簡便であり、実用上極めて有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例６で使用した容器を示す。図１中、（ａ）はこの容器の斜視図であり、（ｂ）はこの容器の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されるものであり、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができるという特徴を有する。Ａ型インフルエンザウイルスが有するヘマグルチニン（ＨＡ）には、構造の異なる少なくとも１５種類のものが存在し、その違いにより、Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１〜Ｈ１５の亜型に分類される。本発明の抗体は、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスが有するＨＡに対するものであるので、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる。
【００１２】
本発明の抗体は、ヒトから分離されたＨ５亜型インフルエンザウイルスを抗原として、マウスに免疫し、免疫したマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞由来株を融合させて作成された二つのハイブリドーマ（ハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＯＭ−ｂ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９）およびＡＹ−２Ｃ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０））により産生されるものである。ハイブリドーマＯＭ−ｂおよびＡＹ−２Ｃ２は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。具体的には、本発明の抗体は、これらのハイブリドーマを、１０％胎児血清を含む培地中でまたは無血清培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養し、産生されたＯＭ−ｂとＡＹ−２Ｃ２抗体を公知の方法によって回収・精製することにより、製造することができる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、その酵素処理されたフラグメント、および組換えペプチド、そのキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体も含む。これらのフラグメント、改変抗体または変異抗体もまた、元の抗体と同様のＨ５亜型インフルエンザウイルスに対する特異性を有するものである。これらは、当業者に公知の手段・方法により製造されることができる。
【００１４】
本発明によれば、試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出が、本発明の抗体を使用することによって行われることを特徴とする方法も提供される。試料としては、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、ウイルス培養物、糞、便、種々の組織・器官などが挙げられる。本発明の方法を用いて、かかる試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出することで、この試料が由来する対象がＨ５亜型インフルエンザウイルスによる感染症に罹患しているかどうかを迅速、容易かつ確実に診断できる。
【００１５】
本発明の検出方法は、本発明の抗体と検出したい試料をインキュベーションし、抗原・抗体の複合体を形成させ、次に複合体を検出することにより行なうことができる。固相サンドイッチ免疫学的測定に基づいてかかる検出を行う場合、具体的には、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体のうちの少なくとも一方を、本発明の抗体を使用して調製し、試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させて、一次抗体と二次抗体の間に試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスが狭持されかつ一次抗体が担体固定要素を介して担体に固定された構造を形成させ、次にこの構造中の二次抗体の標識を検出すればよい。試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させる順序は、特に限定されず、試料を一次抗体および二次抗体とまず接触させて一次抗体と二次抗体と試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスとの複合体を形成させ、次にこの複合体を担体と接触させて複合体中の一次抗体を担体に固定してもよいし、一次抗体のみを先に試料と接触させ、次にそれを担体と接触させて一次抗体を担体に固定し、その後で二次抗体を接触させてもよい。担体としては、ポリスチレン粒子、ポリスチレンプレート、シリカメンブレン、ガラスフィルター、シリカ磁性粒子などの公知のものを使用することができ、担体固定要素としては、ビオチンを使用することができる。また、標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質などの公知のものを使用することができる。
【００１６】
本発明の方法では、一次抗体および二次抗体の両方が本発明の抗体を使用して調製されることもできるが、一次抗体および二次抗体のいずれか一方のみが、本発明の記載の抗体を使用して調製され、他方が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して調製されることもできる。このハイブリドーマは、出願人の一人が以前に作成して独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託したものであり、このハイブリドーマから産生される抗体は、本発明の抗体と同様にＡ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することが知られている。かかる特定の二種の抗体の組合せにより、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出感度を一層向上させることができる。
【００１７】
また、上記組合せの代わりに、一次抗体が、本発明の抗体を使用して調製され、二次抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体（つまり、一般的なＡ型インフルエンザウイルス検出抗体）を使用して調製されることもできる。Ａ型インフルエンザウイルス検出抗体は、効率的な産生方法が既に確立されており、安価に入手することができる。また、二次抗体をＡ型インフルエンザ検出抗体にすると、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出感度は若干低下するものの、実用上は問題ないレベルである。従って、本発明の抗体とＡ型インフルエンザウイルス検出抗体との組合せにより、コストを抑えた実用的な検出方法とすることができる。
【００１８】
本発明によれば、本発明の抗体を有効成分として含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出試薬、およびかかる検出試薬を含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出キットも提供される。固相サンドイッチ免疫学的測定に基づいて検出を行う場合、本発明の検出試薬は、具体的には、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体を含み、一次抗体および／又は二次抗体が本発明の抗体を使用して調製されているものであることができる。また、本発明の検出キットは、かかる検出試薬に加えて、担体や、標識を検出するために必要な反応試薬などを含むものである。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例により本発明の効果を示すが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【００２０】
実施例１
Ａ．Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ベトナム人Ｈ５Ｎ１インフルエンザ感染者から分離されたインフルエンザウイルス（Ｎ．Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００５）株のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子とニューラミニダーゼ（Ｎ１）遺伝子を既存のワクチン株に組み換えて作製されたＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）株を抗原とし、Ｂａｌｂ／ｃマウスをこの抗原で２回免疫した。３日後、免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾細胞１×１０８個に対してマウス骨髄腫細胞由来株ＳＰ−２／０ｘｘｘ細胞３×１０７個を混合した。遠心後、上清を吸引し、５０％ポリエチレングリコール溶液１ｍｌを１分かけて３７℃で添加した。次に、ＲＰＭＩ １６４０培地５０ｍｌを１０分かけて添加した。遠心後、１０％ 牛胎児血清を含むＲＭＰＩ １６４０培地を添加し、９６ウェルマイクロプレートに分注した。翌日、ＨＡＴ選択培地を加えて約１０日間培養した後、上清中の特異的抗体の有無を不活化ウイルス粒子を用いた酵素抗体法でスクリーニングした。酵素抗体法の手順は以下の通りである。９６ウェルマイクロプレートに不活化Ｈ５亜型インフルエンザウイルス粒子またはＨ１亜型インフルエンザウイルスをコートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで一晩ブロッキングした。次に、ハイブリドーマの上清を加えて１時間室温にてインキュベーションした。インキュベーション後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＯＰＤ（オルソフェニレンジアミン）溶液を添加して抗マウス免疫グロブリン抗体を視覚化した。Ｈ５亜型インフルエンザウイルスに反応するがＨ１亜型インフルエンザウイルスに反応しない二種類の抗体産生ハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＯＭ−ｂ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９）およびＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＹ−２Ｃ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０））を得た。
【００２１】
Ｂ．Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体の認識部位の同定
ＯＭ−ｂとＡＹ２Ｃ２抗体は、ほとんどのクレードのＨ５亜型インフルエンザウイルス粒子（クレード１、クレード２．２，２．３）に反応すること、およびＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスに対する交差反応性がないことを確認した。これらの結果を表１および２に示す。また、クレード１の組換えＨＡ（Ｈ５ＨＡ ＮＩＢＲＧ１４ ｒｅｃＨＡ）をバキュロウイルスで作製し、それを抗原とする酵素抗体法（上記と同様）を用いたところ、ＨＡに特異的に反応することが確認できた。これらの結果から、得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の認識部位が、クレード共通Ｈ５ＨＡエピトープであると決定した。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
Ｃ．Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを認識するモノクローナル抗体の精製
得られたハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２を、ＩＬ−６（０．２ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清培地（インビトロゲン、１２０４５−０８４）中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で５日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清をプロテインＡカラムを用いて精製し、抗ＨＡモノクローナル抗体ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２（以下、それぞれＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ２Ｃ２抗体と称する）を得た。
【００２５】
実施例２
ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２抗体を用いたＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出（１）
ＯＭ−ｂまたはＡＹ２Ｃ２抗体を一次抗体とし、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体（抗インフルエンザＡ型ＨＡ抗体）を二次抗体として、以下の手順でＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出を行った。
ＯＭ−ｂまたはＡＹ−２Ｃ２抗体をＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）により標識し、一次抗体を調製した。この一次抗体をＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）または陰性コントロールとしての生理食塩水と混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、抗ビオチン抗体結合ガラス繊維フィルター上に滴下し、３７℃で５分間インキュベートした。そこに抗インフルエンザＡ型ＨＡ抗体をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）により標識して調製した二次抗体２５μｌを添加して、３７℃で５分間インキュベートし、２００μｌの洗浄液（１０ｍＭ ＰＢＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加した後、発光基質ＣＤＰＳｔａｒを添加して、一定時間後に発光量を測定した。ブランクの変動４ＳＤを超える値をカットオフ値とし、その数値を超えた試料を陽性と判定した。ＯＭ−ｂ抗体を一次抗体とした場合の結果を表３に、ＡＹ２Ｃ２抗体を一次抗体とした場合の結果を表４に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
表３および表４からわかるように、ＯＭ−ｂ抗体、ＡＹ２Ｃ２抗体のいずれを一次抗体とした場合も、陽性の結果が得られ、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを検出することができた。
【００２９】
実施例３
ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２抗体を用いたＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出（２）
ＯＭ−ｂ抗体を一次抗体とし、ＡＹ−２Ｃ２抗体を二次抗体とした以外は実施例２と同様にして、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出を行った。その結果を表５に示す。
【００３０】
【表５】
【００３１】
表５からわかるように、ＯＭ−ｂ抗体とＡＹ２Ｃ２抗体を組み合わせることにより、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを検出することができた。
【００３２】
実施例４
感度の評価
Ｈ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）を段階希釈したものを用いて、実施例３と同様の方法でそれぞれの最小検出ウイルス価を決定し、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ−２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法の感度を評価した。陰性コントロールとして蒸留水（ＤＷ）を用いた。その結果、最小検出ウイルス価は、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ２Ｃ２抗体のいずれについても５×１０４ＦＦＵ／ｍｌ（１ＦＦＵ（Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）は、１感染性粒子を意味する）であり、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ−２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法が十分な感度を有していることがわかった。
【００３３】
実施例５
特異性の評価
インフルエンザウイルス以外のウイルス（ウイルス価 １×１０６ＴＣＩＤ５０ｍｌ以上）を用いて、実施例３と同様の方法でＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ−２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法の特異性を評価した。コントロールとしてＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）を用いた。その結果を表６に示す。
【００３４】
【表６】
【００３５】
表６からわかるように、インフルエンザウイルス以外のウイルス全てについての結果は陰性であり、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法は、高い特異性を有していた。
【００３６】
実施例６
ＯＭ−ｂ抗体および受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を用いたＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出
ＯＭ−ｂ抗体を一次抗体として、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体（以下、１Ｃ１０抗体と称する）を二次抗体としてＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出を行った。
Ａ．担体の調製
ガラス繊維濾紙（アドバンテック東洋社製）を円形にくりぬき、吸収プラグに積層し、図１に示すようなポリエチレン製の液体不透過性容器内に収納し、容器の開口部より、（ａ）１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０を１００μｌ、（ｂ）ヤギ抗ビオチンポリクローナル抗体４７μｇ／ｍＬ（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０）を５０μｌ、（ｃ）５％グリセロール・１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を１００μｌ、それぞれ直前に供給された液が吸引されるのを待って順次供給した後、凍結乾燥した。
【００３７】
Ｂ．試薬の調製
（１）一次抗体液の調製
ＯＭ−ｂ抗体とビオチンアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２５℃で４時間反応させ、ＮＡＰ−５（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて分画し、１０．０μｇ／ｍＬになるように調製し、一次抗体液とした。
【００３８】
（２）二次抗体液の調製
１Ｃ１０抗体と牛小腸由来アルカリホスファターゼを用い、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて標識し、２．０μｇ／ｍＬになるように調製し、二次抗体液とした。
【００３９】
Ｃ．検出
試料として、３種類のＨ５亜型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＮＩＢＲＧ−１４）（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／２００５（ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ ＲＧ−５）（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（ＮＩＢＲＧ−２３）（Ｈ５Ｎ１））を使用した。試料５０μｌと一次抗体液２０μｌ、二次抗体液２０μｌを混和し反応溶液を調製し、４０℃で１０分間インキュベーションした。Ａで作製した反応容器に５０μｌの生理食塩水を添加し、５分後に反応溶液７０μｌを添加し４０℃でインキュベーションした。２分後に、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水を１００μｌずつ２回添加し、さらに２分後、発光基質としてＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）を３０μｌ添加した。発光基質添加の１分後に、光電子増倍管（浜松ホトニクス製）で発光量を読み取り、陰性検体の母集団の平均＋４ＳＤを陰性と陽性のカットオフと設定して、特異性および感度の評価を行った。その結果を表７に示す。
【００４０】
【表７】
【００４１】
表７からわかるように、本方法は、インフルエンザＨ５Ｎ１の３つのクレードのいずれも検出できることが確認された。
【００４２】
実施例７
実施例６の方法により、実施例５と同様の手順で、インフルエンザウイルスの他の亜型との反応性を評価した。その結果を表８に示す。
【００４３】
【表８】
【００４４】
表８の結果からわかるように、本方法は、他のインフルエンザ亜型を検出しないことを確認できた。
【００４５】
実施例８
実施例６の方法により、実施例５と同様の手順で、インフルエンザウイルス以外の他のウイルスおよび細菌との反応性を評価した。その結果を表９および１０に示す。
【００４６】
【表９】
【００４７】
【表１０】
【００４８】
表９および１０の結果からわかるように、本方法は、インフルエンザウイルス以外の他のウイルスおよび細菌を検出しないことを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができるので、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを迅速かつ簡便に診断するために極めて有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができるモノクローナル抗体、およびかかる抗体を用いた、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出方法およびそのためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、核タンパク質（ＮＰ）と膜タンパク質（Ｍ）の抗原性の違いによりＡ型、Ｂ型、およびＣ型に分類され、特にＡ型インフルエンザウイルスは、さらに、ヘマグルチニン（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）のアミノ酸配列または抗原性の違いにより、複数の亜型に分類される。
【０００３】
Ａ型インフルエンザウイルスとしては、ヒトのインフルエンザである季節性インフルエンザウイルス、および鳥類のインフルエンザである鳥インフルエンザウイルスが挙げられる。鳥インフルエンザウイルスには、いくつかの亜型が存在する。このうちＨ５亜型のインフルエンザウイルスは、「高病原性インフルエンザウイルス」と呼ばれる亜型であり、ヒトでの感染の拡大が危惧されている。
【０００４】
現在、臨床で行われているインフルエンザの免疫学的診断方法は、Ａ型の亜型全てを検出するものである（非特許文献１〜１２）。そのため、ヒトがインフルエンザの徴候を示した場合、それが高病原性鳥インフルエンザウイルスによるものであるか、あるいは季節性インフルエンザウイルスによるものであるかを免疫学的診断方法によって区別することは不可能であり、時間と手間のかかる遺伝子検査によって両者を区別している。したがって、高病原性鳥インフルエンザウイルスを迅速に型別診断する方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】池松秀之 他：感染症学雑誌．７３：１１５３−１１５８，１９９９
【非特許文献２】後藤郁男 他：臨床とウイルス．２８：２４８−２５２，２０００
【非特許文献３】山崎雅彦 他：感染症学雑誌．７３：１０６４−１０６８，１９９９
【非特許文献４】三田村敬子 他：感染症学雑誌．７３：１０６９−１０７３，１９９９
【非特許文献５】渡邊寿美 他：感染症学雑誌．７３：１１９９−１２０４，１９９９
【非特許文献６】山崎雅彦 他：感染症学雑誌．７４：１０３２−１０３７，１９９９
【非特許文献７】清水英明 他：感染症学雑誌．７４：１０３８−１０４３，１９９９
【非特許文献８】三田村敬子 他：感染症学雑誌．７４：１２−１６，２０００
【非特許文献９】川上千春 他：感染症学雑誌．７５：７９２−７９９，２００１
【非特許文献１０】山崎雅彦 他：感染症学雑誌．７５： １０４７−１０５３，２００１
【非特許文献１１】三田村敬子 他：インフルエンザ．３：１０５−１０９，２００２
【非特許文献１２】奥野良信 他：医学と薬学．４８：８９５−９０４，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑みて創案されたものであり、その目的は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる抗体を得ること、およびかかる抗体を利用した、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの特異的、迅速かつ簡便な検出方法およびそのためのキットを開発することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意研究を重ねた結果、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる抗ＨＡモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製に成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（６）の構成を有する。
（１）受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されることを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
（２）試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出が、（１）に記載の抗体を使用することによって行われることを特徴とする方法。
（３）方法が、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体のうちの少なくとも一方を、請求項１に記載の抗体を使用して調製し、試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させて、一次抗体と二次抗体の間に試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスが狭持されかつ一次抗体が担体固定要素を介して担体に固定された構造を形成させ、次にこの構造中の二次抗体の標識を検出することを含むことを特徴とする（２）に記載の方法。
（４）一次抗体および二次抗体のいずれか一方が、（１）に記載の抗体を使用して調製され、他方が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して調製されることを特徴とする（３）に記載の方法。
（５）一次抗体が、（１）に記載の抗体を使用して調製され、二次抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体を使用して調製されることを特徴とする（３）に記載の方法。
（６）一次抗体および二次抗体の両方が、（１）に記載の抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
（７）（１）に記載の抗体を有効成分として含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出試薬。
（８）（７）に記載の検出試薬を含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出キット。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる。従って、本発明によれば、インフルエンザの徴候を示したヒトが高病原性鳥インフルエンザにかかっているのか、それとも季節性インフルエンザにかかっているのかを容易に区別することができる。特に、本発明の方法は免疫学的測定に基づいているので、従来の遺伝子検査方法と比較して迅速かつ簡便であり、実用上極めて有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、実施例６で使用した容器を示す。図１中、（ａ）はこの容器の斜視図であり、（ｂ）はこの容器の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のモノクローナル抗体は、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されるものであり、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができるという特徴を有する。Ａ型インフルエンザウイルスが有するヘマグルチニン（ＨＡ）には、構造の異なる少なくとも１５種類のものが存在し、その違いにより、Ａ型インフルエンザウイルスはＨ１〜Ｈ１５の亜型に分類される。本発明の抗体は、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスが有するＨＡに対するものであるので、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができる。
【００１２】
本発明の抗体は、ヒトから分離されたＨ５亜型インフルエンザウイルスを抗原として、マウスに免疫し、免疫したマウスの脾細胞と、マウスの骨髄腫細胞由来株を融合させて作成された二つのハイブリドーマ（ハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＯＭ−ｂ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９）およびＡＹ−２Ｃ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０））により産生されるものである。ハイブリドーマＯＭ−ｂおよびＡＹ−２Ｃ２は、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託されている。具体的には、本発明の抗体は、これらのハイブリドーマを、１０％胎児血清を含む培地中でまたは無血清培地中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で培養し、産生されたＯＭ−ｂとＡＹ−２Ｃ２抗体を公知の方法によって回収・精製することにより、製造することができる。
【００１３】
本発明のモノクローナル抗体は、その酵素処理されたフラグメント、および組換えペプチド、そのキメラ抗体およびヒト化抗体などの改変抗体ならびに変異抗体も含む。これらのフラグメント、改変抗体または変異抗体もまた、元の抗体と同様のＨ５亜型インフルエンザウイルスに対する特異性を有するものである。これらは、当業者に公知の手段・方法により製造されることができる。
【００１４】
本発明によれば、試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出が、本発明の抗体を使用することによって行われることを特徴とする方法も提供される。試料としては、咽頭ぬぐい液、鼻腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、ウイルス培養物、糞、便、種々の組織・器官などが挙げられる。本発明の方法を用いて、かかる試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出することで、この試料が由来する対象がＨ５亜型インフルエンザウイルスによる感染症に罹患しているかどうかを迅速、容易かつ確実に診断できる。
【００１５】
本発明の検出方法は、本発明の抗体と検出したい試料をインキュベーションし、抗原・抗体の複合体を形成させ、次に複合体を検出することにより行なうことができる。固相サンドイッチ免疫学的測定に基づいてかかる検出を行う場合、具体的には、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体のうちの少なくとも一方を、本発明の抗体を使用して調製し、試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させて、一次抗体と二次抗体の間に試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスが狭持されかつ一次抗体が担体固定要素を介して担体に固定された構造を形成させ、次にこの構造中の二次抗体の標識を検出すればよい。試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させる順序は、特に限定されず、試料を一次抗体および二次抗体とまず接触させて一次抗体と二次抗体と試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスとの複合体を形成させ、次にこの複合体を担体と接触させて複合体中の一次抗体を担体に固定してもよいし、一次抗体のみを先に試料と接触させ、次にそれを担体と接触させて一次抗体を担体に固定し、その後で二次抗体を接触させてもよい。担体としては、ポリスチレン粒子、ポリスチレンプレート、シリカメンブレン、ガラスフィルター、シリカ磁性粒子などの公知のものを使用することができ、担体固定要素としては、ビオチンを使用することができる。また、標識としては、蛍光化学物質、発光団、酵素、蛍光蛋白質、発光蛋白質、磁性体、導電性物質などの公知のものを使用することができる。
【００１６】
本発明の方法では、一次抗体および二次抗体の両方が本発明の抗体を使用して調製されることもできるが、一次抗体および二次抗体のいずれか一方のみが、本発明の記載の抗体を使用して調製され、他方が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して調製されることもできる。このハイブリドーマは、出願人の一人が以前に作成して独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に寄託したものであり、このハイブリドーマから産生される抗体は、本発明の抗体と同様にＡ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することが知られている。かかる特定の二種の抗体の組合せにより、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出感度を一層向上させることができる。
【００１７】
また、上記組合せの代わりに、一次抗体が、本発明の抗体を使用して調製され、二次抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体（つまり、一般的なＡ型インフルエンザウイルス検出抗体）を使用して調製されることもできる。Ａ型インフルエンザウイルス検出抗体は、効率的な産生方法が既に確立されており、安価に入手することができる。また、二次抗体をＡ型インフルエンザ検出抗体にすると、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出感度は若干低下するものの、実用上は問題ないレベルである。従って、本発明の抗体とＡ型インフルエンザウイルス検出抗体との組合せにより、コストを抑えた実用的な検出方法とすることができる。
【００１８】
本発明によれば、本発明の抗体を有効成分として含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出試薬、およびかかる検出試薬を含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出キットも提供される。固相サンドイッチ免疫学的測定に基づいて検出を行う場合、本発明の検出試薬は、具体的には、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体を含み、一次抗体および／又は二次抗体が本発明の抗体を使用して調製されているものであることができる。また、本発明の検出キットは、かかる検出試薬に加えて、担体や、標識を検出するために必要な反応試薬などを含むものである。
【実施例】
【００１９】
以下に実施例により本発明の効果を示すが、これらの実施例は本発明を何ら限定するものではない。
【００２０】
実施例１
Ａ．Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
ベトナム人Ｈ５Ｎ１インフルエンザ感染者から分離されたインフルエンザウイルス（Ｎ．Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００５）株のヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子とニューラミニダーゼ（Ｎ１）遺伝子を既存のワクチン株に組み換えて作製されたＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）株を抗原とし、Ｂａｌｂ／ｃマウスをこの抗原で２回免疫した。３日後、免疫したマウスの脾臓を摘出し、脾細胞１×１０８個に対してマウス骨髄腫細胞由来株ＳＰ−２／０ｘｘｘ細胞３×１０７個を混合した。遠心後、上清を吸引し、５０％ポリエチレングリコール溶液１ｍｌを１分かけて３７℃で添加した。次に、ＲＰＭＩ １６４０培地５０ｍｌを１０分かけて添加した。遠心後、１０％ 牛胎児血清を含むＲＭＰＩ １６４０培地を添加し、９６ウェルマイクロプレートに分注した。翌日、ＨＡＴ選択培地を加えて約１０日間培養した後、上清中の特異的抗体の有無を不活化ウイルス粒子を用いた酵素抗体法でスクリーニングした。酵素抗体法の手順は以下の通りである。９６ウェルマイクロプレートに不活化Ｈ５亜型インフルエンザウイルス粒子またはＨ１亜型インフルエンザウイルスをコートし、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで一晩ブロッキングした。次に、ハイブリドーマの上清を加えて１時間室温にてインキュベーションした。インキュベーション後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、次に、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体を１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、ＯＰＤ（オルソフェニレンジアミン）溶液を添加して抗マウス免疫グロブリン抗体を視覚化した。Ｈ５亜型インフルエンザウイルスに反応するがＨ１亜型インフルエンザウイルスに反応しない二種類の抗体産生ハイブリドーマ（Ｍｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＯＭ−ｂ（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９）およびＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＡＹ−２Ｃ２（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０））を得た。
【００２１】
Ｂ．Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体の認識部位の同定
ＯＭ−ｂとＡＹ２Ｃ２抗体は、ほとんどのクレードのＨ５亜型インフルエンザウイルス粒子（クレード１、クレード２．２，２．３）に反応すること、およびＨ５亜型以外のインフルエンザウイルスに対する交差反応性がないことを確認した。これらの結果を表１および２に示す。また、クレード１の組換えＨＡ（Ｈ５ＨＡ ＮＩＢＲＧ１４ ｒｅｃＨＡ）をバキュロウイルスで作製し、それを抗原とする酵素抗体法（上記と同様）を用いたところ、ＨＡに特異的に反応することが確認できた。これらの結果から、得られたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体の認識部位が、クレード共通Ｈ５ＨＡエピトープであると決定した。
【００２２】
【表１】
【００２３】
【表２】
【００２４】
Ｃ．Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを認識するモノクローナル抗体の精製
得られたハイブリドーマＭｏｕｓｅ−Ｍｏｕｓｅ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２を、ＩＬ−６（０．２ｎｇ／ｍｌ）を含む無血清培地（インビトロゲン、１２０４５−０８４）中で、３７℃、５％ ＣＯ２の条件で５日間培養した後、培養上清を回収した。回収した培養上清をプロテインＡカラムを用いて精製し、抗ＨＡモノクローナル抗体ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２（以下、それぞれＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ２Ｃ２抗体と称する）を得た。
【００２５】
実施例２
ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２抗体を用いたＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出（１）
ＯＭ−ｂまたはＡＹ２Ｃ２抗体を一次抗体とし、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体（抗インフルエンザＡ型ＨＡ抗体）を二次抗体として、以下の手順でＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出を行った。
ＯＭ−ｂまたはＡＹ−２Ｃ２抗体をＢｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）により標識し、一次抗体を調製した。この一次抗体をＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）または陰性コントロールとしての生理食塩水と混合し、３７℃で１５分間インキュベートし、抗ビオチン抗体結合ガラス繊維フィルター上に滴下し、３７℃で５分間インキュベートした。そこに抗インフルエンザＡ型ＨＡ抗体をＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＮＨ２（同仁化学）により標識して調製した二次抗体２５μｌを添加して、３７℃で５分間インキュベートし、２００μｌの洗浄液（１０ｍＭ ＰＢＳ １５０ｍＭ ＮａＣｌ ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加した後、発光基質ＣＤＰＳｔａｒを添加して、一定時間後に発光量を測定した。ブランクの変動４ＳＤを超える値をカットオフ値とし、その数値を超えた試料を陽性と判定した。ＯＭ−ｂ抗体を一次抗体とした場合の結果を表３に、ＡＹ２Ｃ２抗体を一次抗体とした場合の結果を表４に示す。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
表３および表４からわかるように、ＯＭ−ｂ抗体、ＡＹ２Ｃ２抗体のいずれを一次抗体とした場合も、陽性の結果が得られ、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを検出することができた。
【００２９】
実施例３
ＯＭ−ｂおよびＡＹ２Ｃ２抗体を用いたＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出（２）
ＯＭ−ｂ抗体を一次抗体とし、ＡＹ−２Ｃ２抗体を二次抗体とした以外は実施例２と同様にして、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出を行った。その結果を表５に示す。
【００３０】
【表５】
【００３１】
表５からわかるように、ＯＭ−ｂ抗体とＡＹ２Ｃ２抗体を組み合わせることにより、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを検出することができた。
【００３２】
実施例４
感度の評価
Ｈ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）を段階希釈したものを用いて、実施例３と同様の方法でそれぞれの最小検出ウイルス価を決定し、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ−２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法の感度を評価した。陰性コントロールとして蒸留水（ＤＷ）を用いた。その結果、最小検出ウイルス価は、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ２Ｃ２抗体のいずれについても５×１０４ＦＦＵ／ｍｌ（１ＦＦＵ（Ｆｏｃｕｓ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）は、１感染性粒子を意味する）であり、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ−２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法が十分な感度を有していることがわかった。
【００３３】
実施例５
特異性の評価
インフルエンザウイルス以外のウイルス（ウイルス価 １×１０６ＴＣＩＤ５０ｍｌ以上）を用いて、実施例３と同様の方法でＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ−２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法の特異性を評価した。コントロールとしてＨ５Ｎ１インフルエンザワクチン（ＮＩＢＲＧ−１４）を用いた。その結果を表６に示す。
【００３４】
【表６】
【００３５】
表６からわかるように、インフルエンザウイルス以外のウイルス全てについての結果は陰性であり、ＯＭ−ｂ抗体およびＡＹ２Ｃ２抗体を用いた化学発光検出法は、高い特異性を有していた。
【００３６】
実施例６
ＯＭ−ｂ抗体および受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を用いたＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出
ＯＭ−ｂ抗体を一次抗体として、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体（以下、１Ｃ１０抗体と称する）を二次抗体としてＨ５亜型インフルエンザウイルスの検出を行った。
Ａ．担体の調製
ガラス繊維濾紙（アドバンテック東洋社製）を円形にくりぬき、吸収プラグに積層し、図１に示すようなポリエチレン製の液体不透過性容器内に収納し、容器の開口部より、（ａ）１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０を１００μｌ、（ｂ）ヤギ抗ビオチンポリクローナル抗体４７μｇ／ｍＬ（１００ｍＭクエン酸緩衝液：ｐＨ３．０）を５０μｌ、（ｃ）５％グリセロール・１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液（１０ｍＭリン酸塩−生理食塩水緩衝液：ｐＨ７．４）を１００μｌ、それぞれ直前に供給された液が吸引されるのを待って順次供給した後、凍結乾燥した。
【００３７】
Ｂ．試薬の調製
（１）一次抗体液の調製
ＯＭ−ｂ抗体とビオチンアミドカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを２５℃で４時間反応させ、ＮＡＰ−５（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて分画し、１０．０μｇ／ｍＬになるように調製し、一次抗体液とした。
【００３８】
（２）二次抗体液の調製
１Ｃ１０抗体と牛小腸由来アルカリホスファターゼを用い、ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｋｉｔ（ＰＩＥＲＣＥ社）を用いて標識し、２．０μｇ／ｍＬになるように調製し、二次抗体液とした。
【００３９】
Ｃ．検出
試料として、３種類のＨ５亜型インフルエンザウイルス（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１１９４／２００４（ＮＩＢＲＧ−１４）（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／Ａｎｈｕｉ／０１／２００５（ＰＲ８−ＩＢＣＤＣ ＲＧ−５）（Ｈ５Ｎ１）、Ａ／ｔｕｒｋｅｙ／１／２００５（ＮＩＢＲＧ−２３）（Ｈ５Ｎ１））を使用した。試料５０μｌと一次抗体液２０μｌ、二次抗体液２０μｌを混和し反応溶液を調製し、４０℃で１０分間インキュベーションした。Ａで作製した反応容器に５０μｌの生理食塩水を添加し、５分後に反応溶液７０μｌを添加し４０℃でインキュベーションした。２分後に、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水を１００μｌずつ２回添加し、さらに２分後、発光基質としてＡＰＳ−５（Ｌｕｍｉｇｅｎ社）を３０μｌ添加した。発光基質添加の１分後に、光電子増倍管（浜松ホトニクス製）で発光量を読み取り、陰性検体の母集団の平均＋４ＳＤを陰性と陽性のカットオフと設定して、特異性および感度の評価を行った。その結果を表７に示す。
【００４０】
【表７】
【００４１】
表７からわかるように、本方法は、インフルエンザＨ５Ｎ１の３つのクレードのいずれも検出できることが確認された。
【００４２】
実施例７
実施例６の方法により、実施例５と同様の手順で、インフルエンザウイルスの他の亜型との反応性を評価した。その結果を表８に示す。
【００４３】
【表８】
【００４４】
表８の結果からわかるように、本方法は、他のインフルエンザ亜型を検出しないことを確認できた。
【００４５】
実施例８
実施例６の方法により、実施例５と同様の手順で、インフルエンザウイルス以外の他のウイルスおよび細菌との反応性を評価した。その結果を表９および１０に示す。
【００４６】
【表９】
【００４７】
【表１０】
【００４８】
表９および１０の結果からわかるように、本方法は、インフルエンザウイルス以外の他のウイルスおよび細菌を検出しないことを確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４９】
本発明の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識することができるので、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスを迅速かつ簡便に診断するために極めて有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されることを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出が、請求項１に記載の抗体を使用することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項３】
方法が、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体のうちの少なくとも一方を、請求項１に記載の抗体を使用して調製し、試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させて、一次抗体と二次抗体の間に試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスが狭持されかつ一次抗体が担体固定要素を介して担体に固定された構造を形成させ、次にこの構造中の二次抗体の標識を検出することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一次抗体および二次抗体のいずれか一方が、請求項１に記載の抗体を使用して調製され、他方が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
一次抗体が、請求項１に記載の抗体を使用して調製され、二次抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
一次抗体および二次抗体の両方が、請求項１に記載の抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体を有効成分として含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出試薬。
【請求項８】
請求項７に記載の検出試薬を含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出キット。
【請求項１】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２２９として寄託されたハイブリドーマ、または受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２３０として寄託されたハイブリドーマから産生されることを特徴とする、Ａ型インフルエンザウイルスのうちＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項２】
試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスを検出する方法であって、Ｈ５亜型インフルエンザウイルスの検出が、請求項１に記載の抗体を使用することによって行われることを特徴とする方法。
【請求項３】
方法が、担体固定要素に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス一次抗体、および標識に結合された抗Ｈ５亜型インフルエンザウイルス二次抗体のうちの少なくとも一方を、請求項１に記載の抗体を使用して調製し、試料を一次抗体、二次抗体および担体と接触させて、一次抗体と二次抗体の間に試料中のＨ５亜型インフルエンザウイルスが狭持されかつ一次抗体が担体固定要素を介して担体に固定された構造を形成させ、次にこの構造中の二次抗体の標識を検出することを含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一次抗体および二次抗体のいずれか一方が、請求項１に記載の抗体を使用して調製され、他方が受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９０３として寄託されたハイブリドーマから産生される抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
一次抗体が、請求項１に記載の抗体を使用して調製され、二次抗体が、Ａ型インフルエンザウイルスを認識できるがＨ５亜型インフルエンザウイルスを特異的に認識できない抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
一次抗体および二次抗体の両方が、請求項１に記載の抗体を使用して調製されることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の抗体を有効成分として含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出試薬。
【請求項８】
請求項７に記載の検出試薬を含むことを特徴とするＨ５亜型インフルエンザウイルス検出キット。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−８７０６９（Ｐ２０１３−８７０６９Ａ）
【公開日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２２７７４８（Ｐ２０１１−２２７７４８）
【出願日】平成２３年１０月１７日（２０１１．１０．１７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【出願人】（０００２０５６２７）大阪府 (238)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年５月１３日（２０１３．５．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年１０月１７日（２０１１．１０．１７）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡株式会社 (3,622)
【出願人】（５９１２２２２４５）国立感染症研究所長 (48)
【出願人】（０００２０５６２７）大阪府 (238)
【Ｆターム（参考）】
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