説明

ＨＣＶ特異的なＴ細胞の活性化

ＨＣＶ特異的なＴ細胞を活性化する方法について記載する。該方法は、ＨＣＶタンパク質組成物の１回以上の投与と、続く第１組成物中に存在する少なくとも１つのＨＣＶエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターの１回以上の投与とを利用する。タンパク質組成物は、免疫刺激性核酸および／または他のアジュバントならびに免疫刺激化合物をさらに含みうる。本発明は、部分的には、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質ワクチンを使用した免疫応答のプライミングと、欠損アルファウイルス粒子で送達されたＨＣＶ Ｅ１Ｅ２核酸構築物を用いたブーストは、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激する、という驚くべき発見に基づいている。それゆえこのような組み合せの使用は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２免疫原に対する細胞性および／または体液性免疫応答を刺激する効果的な手法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、特許法§１１９（ｅ）（１）の下、２００６年１月４日に出願された米国仮出願第６０／７５６，３５４号；２００６年８月２５日に出願された米国仮出願第６０／８４０，０８２号（これらの出願は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）特異的なＴ細胞の活性化に関するものである。さらに詳細には、本発明は、体液および細胞媒介免疫応答を刺激して、例えばＨＣＶ特異的なＴ細胞を活性化して、ＨＣＶウイルスの感染性を中和する抗体を誘発するために、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を含むＨＣＶタンパク質組成物および／またはＨＣＶ非構造性遺伝子を含むタンパク質を使用して対象を免疫化することと、続いてＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体および／またはＨＣＶ非構造性遺伝子をコードする核酸組成物を含むウイルスベクターを使用して免疫応答をブーストすることとに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は１０年以上前に同定され、現在では非Ａおよび非Ｂ型肝炎の主な原因であることが既知である（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２０００）３１：７７７）。ＨＣＶは、世界の人口の約３％、推定２億人に感染している（Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８５：２６）。米国では毎年、約３０，０００件の新たに獲得したＨＣＶ感染が発生している。加えて、発展途上国ではＨＣＶ感染の発生率が高い。免疫応答はＨＣＶ感染を除去できるが、大半の感染は慢性となる。最も急性の感染は無症候性のままであり、長年に亘る慢性感染の後に突然肝疾患が通常発生する。
【０００４】
ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、配列を得る方法として既知である。例えば国際公開番号：ＷＯ ８９／０４６６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照。ＨＣＶは、９．５ｋｂプラスセンス１本鎖ＲＮＡゲノムを有し、ウイルスのＦｌａｖｉｒｉｄａｅファミリの一員である。少なくとも６個の別個であるが、関連のあるＨＣＶの遺伝子型が系統発生解析に基づいて同定されている（Ｓｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９）。ウイルスは約３０００個のアミノ酸残基を有する単一のポリタンパク質をコードする（Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５；Ｈａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：１７１１−１７１５）。
【０００５】
特に図１に示すように、複数のタンパク質がＨＣＶゲノムによってコードされる。ＨＣＶポリタンパク質の開裂生成物の順序および命名法は次の通りである：ＮＨ２−Ｃ−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨ。別のタンパク質（Ｆ）も同定され、Ｃ遺伝子内の翻訳フレームシフトから生じる。Ｂｒａｎｃｈら、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．（２００５）２５：１０５−１１７。ポリタンパク質の初期開裂は、３個の構造タンパク質、Ｎ末端ヌクレオカプシドタンパク質（□ｃｏｒｅ□と呼ばれる）および２個のエンベロープ糖タンパク質、ｇｐＥ１（Ｅとしても既知）およびｇｐＥ２（Ｅ２／ＮＳ１としても既知）はもちろんのこと、ウイルス酵素および他の活性をコードする非構造（ＮＳ）タンパク質も遊離する、宿主プロテアーゼによって触媒される。ＮＳ領域は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４およびＮＳ５と呼ばれる。ＮＳ２は、タンパク質分解活性を備えた内在性膜タンパク質であり、ＮＳ３と組み合されてＮＳ２−ＮＳ３接合部を開裂させる。ＮＳ３プロテアーゼは、そのＮＳ４ａ補因子と共に、残存するポリタンパク質の処理を行う。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補因子（ＮＳ４ａ）、２個のタンパク質（ＮＳ４ｂおよびＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＳ５ｂ）を遊離する。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒された、ＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部にて自己触媒開裂によって開始される。
【０００６】
Ｅ１は、３２〜３５ｋＤａ糖タンパク質種として検出され、エンドグリコシダーゼＨによって適切な１８ｋＤａ種に変換される。対照的にＥ２糖タンパク質は、複数の種の産生と一致する、免疫沈降時の複雑なパターンを示す（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）。ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質Ｅ１およびＥ２は、免疫共沈降性である安定した複合体を形成する（Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｌａｎｆｏｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７：２２５−２３５；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６２：６７５３−６７６１）。
【０００７】
全長Ｅ１およびＥ２は、細胞の小胞体内に保持され、安定に／または過渡的なワクシニアウイルス系にて発現されたときに複合糖質が不足している（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３−６７６１）。Ｅ１およびＥ２タンパク質はこれらの発現系において通常は膜結合されているため、タンパク質の精製を促進するために分泌された切断形が産生されてきた。例えば、特許文献１を参照。加えて、Ｈｅｌａ細胞におけるＥ１Ｅ２の細胞内産生が説明されてきた。例えば、特許文献２を参照。
【０００８】
ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２糖タンパク質は、それらが霊長類試験におけるウイルス攻撃に対して保護性であることが示されているので、かなり興味深い。（Ｃｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：１２９４−１２９８；Ｈｏｕｇｈｔｏｎ，Ｍ．およびＡｂｒｉｇｎａｎｉ，Ｓ．、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３６：９６１−９６６）。Ｍｅｕｎｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００５）１０２：５６０−４５６５は、無傷のＥ１およびＥ２糖タンパク質を提示するレトロウイルス偽粒子を使用して、ＨＣＶ−１感染中に産生されたウイルス中和抗体もＨＣＶ遺伝子型４、５および６を中和できるが、ＨＣＶ遺伝子型２および３に対しては制限された中和性を示すだけであることを見出した。
【０００９】
現在、ＨＣＶに唯一利用できる療法は、ＩＦＮ−αおよびリバビリンである。残念ながら、これらの薬剤は治療を受ける患者の半分未満に対し有効である（Ｐｏｙｎａｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ（１９９８）３５２：１４２６；ＭｃＨｕｔｃｈｉｓｏｎら、Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９８）３３９：１４８５）。したがってＨＣＶ感染を防止するためだけでなく、既存の療法に代わる、または既存の療法と併せて使用される免疫療法のためにも、有効なワクチンの開発が緊急に必要とされている。
【００１０】
ＨＣＶに対するＴ細胞免疫性は、ＨＣＶ感染および疾患の結果を決定しうる（Ｍｉｓｓａｌｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９６）９８：７０６；Ｃｏｏｐｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）１０：４３９；およびＬｅｃｈｎｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０００）１９１：１４９９）。ウイルス特異的なＴ細胞応答は、急性ＨＣＶ感染を消散させるのに重要な役割を果たすことが示されてきた（Ｓｈｏｕｋｒｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００４）５８：３９１−４２４）。１つの研究は、支配的なＴｈ０／Ｔｈ１ ＣＤ４＋Ｔヘルパー応答を示す個体はそのＨＣＶ感染から回復したが、Ｔｈ２型応答の個体は慢性に進行する傾向があると結論付けた（Ｔｓａｉら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９７）２５：４４９−４５８）。加えて、ＨＣＶ特異性細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の頻度とウイルス量との間に逆相関があることが示されている（Ｎｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）１５８：１４７３）チンパンジーにおけるＨＣＶの制御は、Ｔｈ１ Ｔ細胞応答と関連付けられていることが示された（Ｍａｊｏｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００２）７６：６５８６−６５９５）。チンパンジーモデルでは、強い多重特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答がＨＣＶの自発的制御に関連付けられており、エスケープミュータントの発生はウイルス存続の発生と関連付けられている（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：２７５５−２７５９）。したがってＨＣＶ特異的なＴ細胞応答は、ＨＣＶ感染を制御する上で重要な役割を果たすように見える。
【００１１】
ＨＩＶなど、特定のウイルスに対する医薬品の開発が広範に進歩しているにもかかわらず、急性および慢性ＨＣＶ感染の制御は、限定された範囲内での成功に止まっている。（非特許文献１）。上で説明したように、強い細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の発生はＨＣＶ感染の制御および根絶にとって重要でありうる。それゆえ当分野ではＨＣＶに対し強いＣＴＬ応答を誘発する有効な方法が求められている。
【特許文献１】米国特許第６，１２１，０２０号明細書
【特許文献２】国際公開第９８／５０５５６号パンフレット
【非特許文献１】Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ ａｎｄ ｄｉ Ｂｉｓｃｅｇｌｉｅ（１９９７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３６：３４７−３５６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の目的は、ＨＣＶに対する免疫応答を刺激または強化する試薬および方法を提供することである。前記免疫応答は、ＨＣＶによる感染に対して保護または治療効果を与えうる。前記免疫応答は、体液性および／または細胞性応答、例えばＩｇがＨＣＶポリペプチドの１個以上のエピトープを認識する免疫グロブリン（Ｉｇ）応答を誘発するおよび／またはＨＣＶポリペプチドの１個以上のエピトープを認識するＴ細胞を活性化することでありうる。本発明のこの目的および他の目的は、後述する実施形態の１つ以上によって与えられる。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、前記第１ＨＣＶ抗原に対する免疫応答を刺激または誘発する方法を提供し、そこでは対象がＨＣＶタンパク質抗原に曝露され、次に前記第１ＨＣＶ抗原からの少なくとも１個のエピトープをコードするＤＮＡを含むウイルスベクターに曝露される。該方法は、タンパク質プライムとしての抗原と、続いてタンパク質抗原からのエピトープをコードするウイルスベクターによって送達されたブーストを用いて、プライミングおよびブーストすることを含む。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、対象が先に曝露された第１タンパク質抗原に対する免疫応答をブーストする方法を提供し、該方法は、ベクターが対象に投与されたときに第１抗原からの少なくとも１個のエピトープをコードおよび発現するＤＮＡをコードするウイルスベクターを投与することによって第１抗原に対する免疫応答をブーストする工程を含む。
【００１５】
Ｅ１／Ｅ２ ＨＣＶヘテロダイマーによる免疫化は、ＨＣＶに対する中和抗体を誘発することができ、ＣｐＧはＥ１／Ｅ２に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答を強化しうる。本発明は、ＨＣＶに対する中和抗体応答およびＴ細胞応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＴＬ）の両方を与える改良型併用プライムブースト方法を提供する。
【００１６】
ＨＣＶ ＮＳ３４５タンパク質による免疫化は、ＨＣＶに対するＴ細胞応答を誘発することができ、ＣｐＧは該応答を強化しうる。本発明は、ＨＣＶに対する中和抗体応答およびＴ細胞応答（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＴＬ）の両方を与える改良型併用プライムブースト方法を提供する。
【００１７】
特に本発明は、ＨＣＶタンパク質および１個以上のＨＣＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドの組み合せを使用して、免疫応答を刺激する方法を提供する。一実施形態において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドはウイルスベクター粒子の一部として送達される。一実施形態において、ウイルスベクター粒子はアルファウイルスであり、好ましい実施形態においては、欠損アルファウイルス粒子にパッケージされたキメラアルファウイルスレプリコンである。一実施形態において、免疫応答はＨＣＶ特異的なＴ細胞の活性化を含む。本発明は、部分的には、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質ワクチンを使用した免疫応答のプライミングと、欠損アルファウイルス粒子で送達されたＨＣＶ Ｅ１Ｅ２核酸構築物を用いたブーストは、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激する、という驚くべき発見に基づいている。それゆえこのような組み合せの使用は、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２免疫原に対する細胞性および／または体液性免疫応答を刺激する効果的な手法を提供する。
【００１８】
加えてＨＣＶポリタンパク質またはＨＣＶ融合タンパク質を用いたプライミングならびに同じポリタンパク質または融合タンパク質の少なくとも一部をコードするアルファウイルスを用いたブーストも、ＨＣＶに対する免疫応答の上昇を与えうる。
【００１９】
一実施形態において、本発明は、対象におけるＨＣＶに対する免疫応答を誘発または上昇させるために、いわゆる「プライムブースト」免疫化療法を提供する。好ましい一実施形態において、プライミング免疫化工程は、対象を１個以上のタンパク質によって免疫化することを含み、続くブースト工程は、前記タンパク質の１個以上をコードするウイルスベクターによって対象を免疫化することを含む。ある実施形態において、ウイルスベクターはアルファウイルスである。ある実施形態において、タンパク質はＨＣＶタンパク質である。ある実施形態において、対象は脊椎動物対象である。ある実施形態において、脊椎動物対象はヒトである。好ましい実施形態において、タンパク質はＨＣＶタンパク質であり、ウイルスベクターはアルファウイルスベクターであり、対象は脊椎動物または脊椎動物対象である。ある実施形態において、脊椎動物または脊椎動物対象はヒトである。
【００２０】
ある実施形態において、本明細書に記載する免疫原性組成物は哺乳類対象に、一部の実施形態において、対象はヒトである。プライミングは、本明細書で使用するように、本明細書に記載した免疫原性タンパク質組成物による第１免疫化が抗原刺激工程において投与されたのと同じ（複数の）抗原の少なくとも１個を含む本明細書に記載したウイルスレプリコン粒子による第２または続いての免疫化（ブースト）時に、標的抗原に対する免疫応答の産生を可能にするいずれかの方法を意味し、第２免疫応答は、第１免疫化が供給されない場合または投与された第１免疫化が第２免疫化で投与されたのと同じ（複数の）抗原を含まない場合のどちらかに達成された免疫応答よりも大きい。抗原刺激は、毎時、毎日、毎週、毎月または毎年投与される単回用量または複数回投薬量を含む療法を含む。詳細な実施形態において、プライミング（またはプライミング免疫化）は、（１回分以上の用量または投薬量を含む）少なくとも２回の投与を含む。例えば詳細な実施形態によって、本明細書に記載した１個以上の免疫原性組成物の投与によるプライミングは、（複数の）免疫原性組成物の（１回分以上の用量または投薬量を含む）少なくとも２回（例えば２、３、４、５、６、７回以上）の投与を必要とする。投与間の時間間隔は、時間、日、週、月または年である。さらにある実施形態において、同じまたは異なる免疫原性組成物を使用して反復工程が実施されうる。
【００２１】
一部の実施形態において、本明細書に記載する免疫原性組成物は、対象のプライミング後に達成される免疫応答をブーストするためのブースターとして投与される。好ましい一実施形態において、アルファウイルスレプリコン粒子はプライミング後のある時点でブースターとして投与される。ブースターとして投与されるウイルスレプリコン粒子は、少なくとも１つのプライミング工程によって投与される少なくとも１個の同じ抗原でコードされる核酸を含む。詳細な実施形態において、ブースト（またはブースト免疫化）は、プライミング（またはプライミング免疫化）の２〜２７週後である。ブーストは、毎時、毎日、毎週、毎月または毎年投与される単回用量または複数回投薬量を含む療法を含む。ある実施形態において、ブースト（またはブースト免疫化）は、少なくとも１回の投与を含む。他の実施形態において、ブースト（またはブースト免疫化）は、（１回分以上の用量または投薬量を含む）少なくとも２回の投与を含む。例えばこのような例では、詳細な実施形態において、１個以上のウイルスレプリコンの投与によるブーストは、（複数の）ウイルスレプリコン粒子の（１回分以上の用量または投薬量を含む）少なくとも２回（例えば２、３、４、５、６、７回以上）の投与を必要とする。投与間の時間間隔は、時間、日、週、月または年である。さらにある実施形態において、同じまたは異なるウイルスレプリコン粒子または免疫原性組成物を使用して反復工程が実施されうる。
【００２２】
プライミングまたはブースト免疫化は、筋肉内、粘膜または全身免疫経路の１つ以上の組み合せでありうる。
【００２３】
好ましい一実施形態において、本発明は、ＨＣＶタンパク質抗原を用いたプライミング免疫化と、続くプライミング工程のＨＣＶ抗原の少なくとも１個のエピトープをコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いたブースト免疫化とを含む、免疫化の方法を提供する。ＨＣＶ抗原は、１個以上の異なるＨＣＶ抗原を含みうる。
【００２４】
好ましい一実施形態において、本発明は、免疫化方法で使用される薬剤の調製のための本明細書に記載した組成物の使用を提供し、該薬剤は、ＨＣＶタンパク質抗原を含むプライミング組成物または対象がすでにプライミングされたＨＣＶ抗原をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を含むブースト組成物の少なくとも一方を含む。
【００２５】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、対象をＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマーおよび一実施形態においてＭＦ５９であるアジュバントを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー複合体をコードするアルファウイルスを投与する工程を含む対象を免疫化する方法を提供し、該方法では前記対象はＨＣＶ感染後にＥ１／Ｅ２タンパク質にすでに曝露されており、それにより対象でのＥ１／Ｅ２に対する細胞免疫応答は上昇する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー複合体をコードするアルファウイルスを投与する工程を含む脊椎動物対象を免疫化する方法を提供し、該方法では前記対象はＨＣＶ感染後にＥ１／Ｅ２タンパク質にすでに曝露されており、それにより対象でのＥ１／Ｅ２に対する細胞免疫応答は上昇する。
【００２８】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２へテロダイマー、ＭＦ５９およびＣｐＧを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。
【００２９】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、脊椎動物対象をＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー、ＭＦ５９およびＣｐＧを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。
【００３０】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、対象をＨＣＶポリタンパク質および一実施形態においてＩＳＣＯＭであるアジュバントを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、ポリタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。ＨＣＶポリタンパク質は、一実施形態においてＣｐＧ免疫刺激分子である免疫刺激分子を含む組成物中でさらに投与されうる。
【００３１】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、脊椎動物対象をＨＣＶポリタンパク質および一実施形態においてＩＳＣＯＭであるアジュバントを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、ポリタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。ＨＣＶポリタンパク質は、一実施形態においてＣｐＧ免疫刺激分子である免疫刺激分子を含む組成物中でさらに投与されうる。
【００３２】
別の実施形態において、本発明は、ＨＣＶポリタンパク質をコードするアルファウイルスを投与する工程を含む対象を免疫化する方法を提供し、該方法では前記対象はＨＣＶ感染後にＨＣＶポリタンパク質にすでに曝露されており、それにより対象でのＨＣＶポリタンパク質に対する細胞免疫応答は上昇する。
【００３３】
別の実施形態において、本発明は、ＨＣＶポリタンパク質をコードするアルファウイルスを投与する工程を含む脊椎動物を免疫化する方法を提供し、該方法では前記対象はＨＣＶ感染後にＨＣＶポリタンパク質にすでに曝露されており、それにより対象でのＨＣＶポリタンパク質に対する細胞免疫応答は上昇する。
【００３４】
タンパク質の投与を含む本発明の免疫化工程、本発明のキットおよび組成物はすべて、ＣｐＧまたは他の免疫刺激分子および／またはアジュバントの投与または包含をさらに含みうる。
【００３５】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、対象をＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー、ＭＦ５９およびＣｐＧを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。
【００３６】
一実施形態において、（複数の）プライミング工程は、脊椎動物対象をＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２ヘテロダイマー、ＭＦ５９およびＣｐＧを用いて免疫化することを含み、続いてのブースト工程は、Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードする核酸を含むアルファウイルスレプリコン粒子を用いた免疫化を含む。
【００３７】
ポリペプチドおよび前記ポリペプチドをコードするヌクレオチドは、広範囲のＨＣＶ遺伝子型に対して保護向上を与えるために、同じＨＣＶ単離物から、または異なる株および各種のＨＣＶ遺伝子型のいずれかを有する単離物を含む単離物から得られる。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、ＨＣＶ感染にすでに曝露された対象（即ち１個以上のＨＣＶ抗原への曝露によってすでにプライミングされた脊椎動物対象）を、脊椎動物対象におけるＨＣＶに対する免疫応答を強化するためにアルファウイルスブースト療法によって治療する方法を提供する。脊椎動物対象がすでにＨＣＶに感染している、またはＨＣＶに曝露されている他の実施形態において、治療方法は１回以上のプライミング工程を、１回以上のブースト工程と共に含みうる。
【００３９】
一実施形態において、本発明は、ＨＣＶ感染にすでに曝露された脊椎動物対象（即ち１個以上のＨＣＶ抗原への曝露によってすでにプライミングされた脊椎動物対象）を、脊椎動物対象におけるＨＣＶに対する免疫応答を強化するためにアルファウイルスブースト療法によって治療する方法を提供する。脊椎動物対象がすでにＨＣＶに感染している、またはＨＣＶに曝露されている他の実施形態において、治療方法は１回以上のプライミング工程を、１回以上のブースト工程と共に含みうる。
【００４０】
他の実施形態において、本発明は、タンパク質の少なくとも１回の投与と、それに続くアルファウイルス粒子の少なくとも１回の投与による、対象におけるＨＣＶに対する免疫応答を生成するための薬剤の製造におけるＨＣＶタンパク質またはＨＣＶタンパク質をコードするアルファウイルス粒子を含む組成物の使用を提供する。
【００４１】
他の実施形態において、本発明は、タンパク質の少なくとも１回の投与と、それに続くアルファウイルス粒子の少なくとも１回の投与による、個体におけるＨＣＶに対する免疫応答を生成するための薬剤の製造におけるＨＣＶタンパク質またはＨＣＶタンパク質をコードするアルファウイルス粒子を含む組成物の使用を提供する。
【００４２】
本発明は、哺乳類などの対象において免疫応答を誘発または生成するキットも提供する。キットは（ｉ）ＨＣＶタンパク質およびアジュバントを含む第１組成物と；（ｉｉ）第１組成物のＨＣＶタンパク質の少なくとも一部をコードするウイルスベクターを含む第２組成物とを含む。好ましい一実施形態において、アジュバントは、ＭＦ５９でありうる水中油型エマルジョンである。一実施形態において、前記キット中の第１組成物はＭＦ５９をアジュバントとして含む。別の実施形態において、Ｅ１／Ｅ２タンパク質およびＭＦ５９を含む第１組成物は、ＣｐＧをさらに含む。
【００４３】
一部の実施形態において、キットは（ｉ）Ｅ１／Ｅ２タンパク質複合体およびアジュバントを含む第１組成物と；（ｉｉ）Ｅ１／Ｅ２タンパク質複合体をコードするウイルスベクターを含む第２組成物と；を含む。好ましい一実施形態において、アジュバントは、ＭＦ５９でありうる水中油型エマルジョンである。一実施形態において、前記キット中の第１組成物はＭＦ５９をアジュバントとして含む。別の実施形態において、Ｅ１／Ｅ２タンパク質およびＭＦ５９を含む第１組成物は、ＣｐＧをさらに含む。好ましい一実施形態において、ウイルスベクターは欠損アルファウイルス粒子である。
【００４４】
キットは、第１組成物の、第２組成物の、または第１および第２組成物両方の１回または複数回用量を含みうる。それゆえ詳細な実施形態において、反復投与を容易にするために、キットは一方または両方の組成物のための複数のバイアルを含み、各バイアルは各投与時に対象に投与される用量を含む。該キットは、キットの使用説明書をさらに含む。他の実施形態において、キットは哺乳類に、第１組成物を投与するためのアプリケータおよび／または第２組成物を投与するためのアプリケータも含みうる。
【００４５】
本発明のキットは、キットの組成物を単独で、または他の組成物と共に使用するための説明書をさらに含みうる。
【００４６】
一実施形態において、本発明は対象または脊椎動物対象における免疫応答を刺激する方法であって：
ＨＣＶタンパク質複合体を含む第１組成物を前記対象または脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に前記対象または脊椎動物対象にすでに投与された前記ＨＣＶタンパク質の少なくとも一部をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２の組成物を少なくとも１回投与して、それによりＨＣＶタンパク質をコードする核酸を対象の１個以上の細胞において発現させて、ＨＣＶタンパク質を産生させる工程と；を含む。免疫応答は、細胞性および／または体液性免疫応答であってもよい。細胞性または体液性免疫応答は、本明細書に記載した各種の第１のタンパク質組成物および第２のウイルスベクター組成物のいずれかを使用して刺激されうる。
【００４７】
対象または脊椎動物対象はすでにＨＣＶに曝露されているか、ＨＣＶに感染しており、ウイルスへの曝露に関しては未処置である。
【００４８】
一実施形態において、本発明は対象または脊椎動物対象における免疫応答を刺激する方法であって：
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を含む第１組成物を前記対象または脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に前記対象または脊椎動物対象にＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２の組成物を少なくとも１回投与し、それによりＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を対象の１個以上の細胞において発現させて、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を産生させる工程と；
を含む。免疫応答は、細胞性および／または体液性免疫応答であってもよい。細胞性または体液性免疫応答は、本明細書に記載した各種の第１のタンパク質組成物および第２のウイルスベクター組成物のいずれかを使用して刺激されうる。
【００４９】
Ｅ１／Ｅ２タンパク質複合体および／または前記Ｅ１／Ｅ２複合体をコードするアルファウイルスは、本明細書でさらに述べる部分または完全タンパク質（またはウイルスベクターの場合はタンパク質コード）配列でありうる。その上タンパク質免疫化組成物として使用される正確な配列が、タンパク質配列をコードする核酸中に含まれることは必要でない。タンパク質アミノ酸配列またはタンパク質配列をコードする核酸のどちらかが、ＨＣＶゲノムに関して部分的または完全でありうる。
【００５０】
第１および第２組成物は、例えばタンパク質を含む第１組成物の１、２、３、４、または５回以上の連続投与と、続くウイルスベクターを含む第２組成物の１、２、３、４または５回以上の連続投与などの、いずれの多種多様の組み合せでも１回以上投与されうる。さらに第２組成物の投与は、第２または次の第１組成物の投与前に行われうる。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は対象または脊椎動物対象のＴ細胞であって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドのエピトープを認識するＴ細胞を活性化する方法を提供し、該方法は：
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を含む第１組成物を前記対象または脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に前記対象または脊椎動物対象にＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２の組成物を少なくとも１回投与し、それによりＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を対象の１個以上の細胞において発現させ、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を産生させる工程と、を含み；
それによりＴ細胞は前記対象において活性化され、前記活性化Ｔ細胞はＥ１、Ｅ２またはＥ１Ｅ２複合体のエピトープを認識する。ウイルスベクターは、アルファウイルスベクターなどの哺乳類ウイルスベクターであり、一実施形態において、アルファウイルスベクターはキメラアルファウイルス不完全レプリコン粒子でありうる欠損アルファウイルスベクター粒子である。
【００５２】
対象または脊椎動物対象は、前記第１および第２組成物の１個以上の投与前にＨＣＶにすでに感染しているか、または投与前に感染していないかのどちらかである。それゆえ該方法は、予防および治療効果を提供しうる。
【００５３】
好ましい実施形態において、該方法はＣＤ８＋Ｔ細胞を含むＴ細胞の活性化を刺激し、活性化はガンマインターフェロンを産生するＣＤ８＋Ｔ細胞の数の増加を含む。別の実施形態において、該方法はＣＤ４＋Ｔ細胞を含むＴ細胞の活性化を刺激し、活性化はガンマインターフェロンを産生するＣＤ４＋Ｔ細胞の数の増加を含む。
【００５４】
別の実施形態において、該方法はＢ細胞の活性化を刺激して、活性化はＨＣＶに対する治療効果の保護を有する抗体の数の増加を含む。
【００５５】
第１タンパク質組成物は、少なくとも１個のアジュバントをさらに含み、１個を超えるアジュバントまたは１個のアジュバントおよび別の免疫刺激組成物を含みうる。１個の好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油型エマルジョンである。一実施形態において、タンパク質組成物に添加されるサブミクロン水中油型エマルジョンは、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％ソルビタントリオレアート、および場合により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む。一実施形態において、サブミクロン水中油型エマルジョンはＭＦ５９である。１個の好ましい免疫刺激組成物は、１個の好ましい組成物ではＣｐＧ免疫刺激核酸である免疫刺激核酸である。
【００５６】
好ましい実施形態において、Ｅ１Ｅ２タンパク質を含む第１組成物は、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生されうる。
【００５７】
別の好ましい実施形態において、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２組成物は、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜７４６に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
【００５８】
アジュバントおよび（複数の）タンパク質抗原は、同時に、連続的にまたは個別に投与されうる。アジュバントは、（複数の）抗原の投与前に対象をプライミングするために、または（複数の）抗原の投与後にその抗原に対する免疫応答をブーストするために投与されうる。アジュバントおよび（複数の）タンパク質抗原は好ましくは、混合物で投与される。
【００５９】
（複数の）タンパク質抗原およびウイルスベクターは、同時に、連続的にまたは個別に投与されうる。タンパク質組成物は、ウイルスベクターの投与前に対象をプライミングするために投与されうる。（複数の）タンパク質抗原およびウイルスベクターは好ましくは、ウイルスベクターが投与される前に少なくとも１回投与されたタンパク質抗原と連続的に投与される。本発明は、患者における免疫応答を上昇させるための薬剤の製造において少なくとも１個の抗原の使用をも提供し、薬剤はアジュバントと共に投与される。同様に本発明は、患者における免疫応答を上昇させるための薬剤の製造におけるアジュバントの使用を提供し、薬剤は少なくとも１個の抗原と共に投与される。薬剤の製造におけるウイルスベクターの使用も提供される。本発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示を考慮すれば、当業者が容易に思いつくであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
本発明の常法は、別途指摘しない限り、当分野の技術の範囲内で化学、生化学、組み換えＤＮＡ技法および免疫学の在来の方法を利用するであろう。このような技法は文献で十分に説明されている。例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（編者：Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ＶｏＩｓ．Ｉ−ＩＶ（編者：Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎおよびその仲間、１９９３年）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（編者：Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照。
【００６１】
本明細書で引用したすべての公報、特許および特許出願は、前述または後述にかかわらず、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【００６２】
次のアミノ酸省略形は本文全般を通じて使用される。
アラニン：Ａｌａ（Ａ） アルギニン：Ａｒｇ（Ｒ）
アスパラギン：Ａｓｎ（Ｎ） アスパラギン酸：Ａｓｐ（Ｄ）
システイン：Ｃｙｓ（Ｃ） グルタミン：Ｇｌｎ（Ｑ）
グルタミン酸：Ｇｌｕ（Ｅ） グリシン：ＧＩｙ（Ｇ）
ヒスチジン：Ｈｉｓ（Ｈ） イソロイシン：Ｉｌｅ（Ｉ）
ロイシン：Ｌｅｕ（Ｌ） リジン：Ｌｙｓ（Ｋ）
メチオニン：Ｍｅｔ（Ｍ） フェニルアラニン：Ｐｈｅ（Ｆ）
プロリン：Ｐｒｏ（Ｐ） セリン：Ｓｅｒ（Ｓ）
トレオニン：Ｔｈｒ（Ｔ） トリプトファン：Ｔｒｐ（Ｗ）
チロシン：Ｔｙｒ（Ｙ） バリン：Ｖａｌ（Ｖ）。
【００６３】
１．定義
本発明を説明するにあたり、次の用語が使用され、以下に示すように定義されるものとする。
【００６４】
本明細書および添付実施形態で使用するように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は文脈が明確に別途指示しない限り、複数対象物を含むことに注目すべきである。それゆえたとえば例えば「Ｅ１Ｅ２複合体」への言及は、２個以上のそのような複合体の混合物などを含む。
【００６５】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指し、生成物の最小長に制限されない。それゆえペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは定義に含まれる。全長タンパク質およびその断片は定義によって含まれる。該用語はポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、ホスホリル化なども含む。さらに本発明の目的では、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持している限り、ナイーブ配列に対する修飾、例えば欠失、付加および置換（一般に本質的に保存的である）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、まるで部位特異的突然変異誘発のように意図的でありうるか、あるいはタンパク質を産生する宿主の突然変異またはＰＣＲ増幅によるエラーであるかのように偶発的でありうる。
【００６６】
「Ｅ１ポリペプチド」とは、ＨＣＶ Ｅ１領域に由来する分子を意味する。ＨＣＶ−１の成熟Ｅ１領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた、ポリタンパク質の約アミノ酸１９２で開始し、約アミノ酸３８３まで継続する。（図１および２Ａ〜２Ｃを参照。図２Ａ〜２Ｃのアミノ酸１９２−３８３は、配列番号：２のアミノ酸位置２０−２１１に一致する）。１７３付近から約１９１までのアミノ酸（配列番号：２のアミノ酸１−１９）は、Ｅ１のシグナル配列として作用する。それゆえ「Ｅ１ポリペプチド」とは、シグナル配列を含む前駆Ｅ１タンパク質、またはこの配列の欠けた成熟Ｅ１ポリペプチドのどちらか、または異種シグナル配列を持つＥ１ポリペプチドすら意味する。Ｅ１ポリペプチドは、約アミノ酸位置３６０−３８３で発生するＣ末端膜アンカー配列を含む（１９９６年２月１５日に公開された国際公開番号：ＷＯ ９６／０４３０１を参照）。Ｅ１ポリペプチドは、本明細書で定義するように、Ｃ末端アンカー配列またはその部分を含んでも、含まなくてもよい。
【００６７】
「Ｅ２ポリペプチド」とは、ＨＣＶ Ｅ２領域に由来する分子を意味する。ＨＣＶ−１の成熟Ｅ２領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、約アミノ酸３８３〜３８５にて開始する。（図１および２Ａ〜２Ｃを参照。図２Ａ〜２Ｃのアミノ酸３８３〜３８５は、配列番号：２のアミノ酸位置２１１〜２１３に一致する）。シグナルペプチドは、ポリタンパク質の約アミノ酸３６４にて開始する。それゆえ「Ｅ２ポリペプチド」とは、シグナル配列を含む前駆Ｅ２タンパク質、またはこの配列の欠けた成熟Ｅ２ポリペプチドのどちらか、または異種シグナル配列を持つＥ２ポリペプチドすら意味する。Ｅ２ポリペプチドは、約アミノ酸位置７１５−７３０で発生するＣ末端膜アンカー配列を含み、約アミノ酸残基７４６までも延伸しうる（例えばＬｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：５０６３−５０７３）。Ｅ２ポリペプチドは、本明細書で定義するように、Ｃ末端アンカー配列またはその部分を含んでも、含まなくてもよい。その上、Ｅ２ポリペプチドは、Ｅ２のＣ末端にすぐ隣接して発生するｐ７領域の全部または一部も含みうる。図１および２Ａ〜２Ｃに示すように、ｐ７領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、位置７４７〜８０９（配列番号：２のアミノ酸位置５７５−６３７）にて見出される。加えて、ＨＣＶ Ｅ２の複数の種が存在することが既知である（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）。したがって、本発明の目的では、「Ｅ２」という用語は、制限なく、Ｅ２のＮ末端からの１〜２０個またはそれ以上のアミノ酸の欠失、例えば１、２、３、４、５．．．１０．．．１５、１６、１７、１８、１９．．．個などのアミノ酸の欠失を有する種を含む、Ｅ２のこのような種のいずれかを含む。このようなＥ２種は、アミノ酸３８７、アミノ酸４０２、アミノ酸４０３などにて開始する種を含む。
【００６８】
ＨＣＶ−１からの代表的なＥ１およびＥ２領域を図２Ａ〜２Ｃおよび配列番号：２に示す。本発明の目的では、Ｅ１およびＥ２領域は、ＨＣＶ−１のゲノムによってコードされたポリタンパク質のアミノ酸数に関して定義され、イニシエータメチオニンは位置１と示される。例えばＣｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照。しかしながら「Ｅ１ポリペプチド」または「Ｅ２ポリペプチド」という用語は本明細書で使用するように、ＨＣＶ−１配列に限定されないことに注目すべきである。この点で、他のＨＣＶ単離物における対応するＥ１またはＥ２領域は、配列を最大アラインメントにするような方法で単離物からの配列を比較することによって容易に決定されうる。これはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ａｔｔｎ：Ｄｒ．Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ）より入手できるＡＬＩＧＮ １．０などの多数のコンピュータソフトウェアパッケージのいずれによっても実施されうる。Ｐｅａｒｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５−２４４４−２４４８を参照。
【００６９】
さらに本明細書で定義した「Ｅ１ポリペプチド」または「Ｅ２ポリペプチド」は、図に示す正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際にＨＣＶゲノムは生体内では一定流束の状態であり、単離物間で比較的高度の可変性を示す複数の可変ドメインを含有する。多数の保存および可変領域がこれらの株間で既知であり、一般にこれらの領域に由来するエピトープのアミノ酸配列は、２つの配列を比較したときに、高度の配列相同性、例えば３０％を超える、好ましくは４０％を超える、６０％を超えるアミノ酸配列相同性、なお８０〜９０％の相同性を有するであろう。該用語が各種のＨＣＶ株およびＳｉｍｍｏｎｄｓら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）７４：２３９１−２３９９（例えば株１、２、３、４など）に記載されたＨＣＶの６個の遺伝子型のいずれかを有する単離物はもちろんのこと、新たに同定された単離物、およびこれらの単離物のサブタイプ、例えばＨＣＶ１ａ、ＨＣＶ１ｂなども含む単離物のいずれかからのＥ１およびＥ２ポリペプチドも含むことが容易に明らかとなる。
【００７０】
それゆえ例えば「Ｅ１」または「Ｅ２」ポリペプチドという用語は、各種のＨＣＶ株のいずれかからのナイーブＥ１またはＥ２配列はもちろんのこと、下でさらに定義するような類似体、ムテインおよび免疫原性断片も指す。これらの株の多くの完全遺伝子型が既知である。例えば米国特許番号：６，１５０，０８７ならびにＧｅｎＢａｎｋアクセス番号：ＡＪ２３８８００およびＡＪ２３８７９９を参照。
【００７１】
加えて「Ｅ１ポリペプチド」および「Ｅ２ポリペプチド」という用語は、ナイーブ配列に対する修飾、例えば内部欠失、付加および置換（一般に本質的に保存的である）を含むタンパク質、例えば親配列と実質的に相同であるタンパク質を含む。これらの修飾は、まるで部位特異的突然変異誘発のように意図的でありうるか、天然発生型突然変異イベントであるかのように偶発的でありうる。これらの修飾すべては、修飾されたＥ１およびＥ２ポリペプチドがその所期の目的のために機能する限り、本発明に含まれる。それゆえ例えばＥ１および／またはＥ２ポリペプチドがワクチン組成物で使用される場合、修飾は免疫活性（即ちポリペプチドに対して体液性または細胞性免疫応答を誘発する能力）が消失しないようでなければならない。一般にここで、本発明の目的では、細胞性免疫応答がポリペプチドの送達される対象で産生されうるように、ポリペプチドは少なくとも１個のＴ細胞エピトープを保持するであろう。
【００７２】
「Ｅ１Ｅ２」またはＥ１Ｅ２タンパク質複合体とは、上記のような少なくとも１個のＥ１ポリペプチドおよび少なくとも１個のＥ２ポリペプチドを含有するタンパク質を意味する。このような複合体は、Ｅ２のＣ末端にすぐ隣接して発生するｐ７領域の全部または一部も含みうる。図１および２Ａ〜２Ｃに示すように、ｐ７領域は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けられた、位置７４７−８０９（配列番号：２のアミノ酸位置５７５−６３７）にて見出される。ｐ７タンパク質を含む代表的なＥ１Ｅ２複合体は本明細書では、「Ｅ１Ｅ２８０９」と呼ばれる。本発明の常法に有用なＥ１Ｅ２タンパク質複合体を含む組成物は、さらに１個以上のアジュバントを含みうる。
【００７３】
Ｅ１およびＥ２複合体におけるＥ１およびＥ２の結合方式は重要でない。Ｅ１およびＥ２ポリペプチドは、非共有結合相互作用を通じて、例えば静電力を通じて、または共有結合によって結合されうる。例えば本発明のＥ１Ｅ２ポリペプチドは、上で定義したような免疫原性Ｅ１ポリペプチドおよび免疫原性Ｅ２ポリペプチドを含む融合タンパク質の形でありうる。融合物はＥ１Ｅ２キメラをコードするポリヌクレオチドから発現されうる。あるいはＥ１Ｅ２複合体は、別個に産生されたＥ１およびＥ２タンパク質を単に混合することによって自発的に形成しうる。同様に同時発現され、培地中に分泌されたときに、Ｅ１およびＥ２タンパク質は複合体を自発的に形成しうる。それゆえ該用語は、Ｅ１および／またはＥ２の精製時に自発的に形成されるＥ１Ｅ２複合体（凝集体とも呼ばれる）を含む。このような凝集体は、１個以上のＥ２モノマーと結合した１個以上のＥ１モノマーを含みうる。存在するＥ１およびＥ２モノマーの数は、少なくとも１個のＥ１モノマーおよび１個のＥ２モノマーが存在する限り、同じである必要はない。Ｅ１Ｅ２複合体の存在の検出は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの標準タンパク質検出技法および免疫沈降などの免疫技法を使用して容易に決定される。
【００７４】
「類似体」および「ムテイン」という用語は、所望の活性、例えば本明細書に記載するアッセイにおける免疫反応性を保持する、基準分子の生物活性誘導体、例えばＥ１Ｅ２８０９、またはこのような誘導体の断片を指す。一般に「類似体」という用語は、修飾が免疫原性活性を破壊しない限り、ナイーブ分子に対して１個以上のアミノ酸付加、置換（一般に本質的に保存的である）および／または欠失を持つナイーブポリペプチド配列および構造を指す。「ムテイン」という用語は、１個以上のペプチドミミック（「ペプトイド」）を有するペプチドを指す。好ましくは類似体またはムテインは、ナイーブ分子と少なくとも同じ免疫反応性を有する。ポリペプチド類似体およびムテインを作製する方法は当分野で既知であり、下でさらに記載する。
【００７５】
特に好ましい類似体は、本質的に保存的である置換、即ちその側鎖にて関連するアミノ酸のファミリ内で起こる置換を含む。特に、アミノ酸は一般に４つのファミリ：（１）酸性−アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは場合により芳香族アミノ酸として分類される。例えばロイシンのイソロイシンまたはバリンによる、アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩による、トレオニンのセリンによる単離置換、あるいはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による同様の保存的置換が生物活性に大きな影響を持たないことは、合理的に予測されうる。例えば興味のあるポリペプチド、例えばＥ１Ｅ２ポリペプチドは、分子の所望の機能が損なわれない限り、約５〜１０個までの保存的または非保存的アミノ酸置換、あるいは約１５〜２０または５０個までの保存的または非保存的アミノ酸置換、あるいは５〜５０のいずれかの整数を含みうる。当業者は、当分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットへの参照により、変化に耐えうる興味のある分子の領域を容易に決定しうる。
【００７６】
「断片」とは、無処置の全長ポリペプチド配列および構造の一部のみから成るポリペプチドを意味する。断片は、Ｃ末端欠失およびＮ末端欠失、および／またはナイーブポリペプチドの内部欠失を含みうる。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性断片」は一般に、問題の断片が本明細書で定義する免疫応答を誘発する能力を保持するという条件で、エピトープ、または５アミノ酸と全長配列との間の任意の整数を定義する、全長分子の少なくとも約５〜１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは全長分子の少なくとも約１５〜２５個の連続アミノ酸残基、および最も好ましくは、全長分子の少なくとも約２０〜５０個以上の連続アミノ酸残基を含む。ＨＣＶ Ｅ１およびＥ２の既知の免疫原性断片の説明については、例えばＣｈｉｅｎら、国際公開番号：ＷＯ ９３／００３６５を参照。
【００７７】
「エピトープ」という用語は本明細書で使用するように、少なくとも約３〜５個の、好ましくは約５〜１０個または１５個の、そして約５００個を超えないアミノ酸（またはその間のいずれかの整数）の配列を指し、単独でまたはより大きい配列の一部として、それが投与される対象において免疫応答を誘発する配列を定義する。エピトープは、このような配列に対する応答で生成された抗体に結合することが多い。断片の長さには決定的な上限がなく、タンパク質配列のほぼ全長、またはＨＣＶポリタンパク質からの２個以上のエピトープを含む融合タンパク質さえ含みうる。本発明で使用するエピトープは、それが由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際にウイルスゲノムは一定流束の状態であり、単離物間で比較的高度の可変性を示す複数の可変ドメインを含有する。それゆえ「エピトープ」という用語は、ナイーブ配列と同一の配列はもちろんのこと、ナイーブ配列への修飾、例えば欠失、付加および置換（一般に本質的に保存的である）も含む。
【００７８】
エピトープを含む所与のポリペプチドの領域は、当分野で周知のエピトープマッピング技法をいくつでも使用して同定されうる。例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６（編者：Ｇｌｅｎｎ Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ、１９９６年）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙを参照。例えば直鎖エピトープは固体支持体上でタンパク質分子の一部に相当する多数のペプチドを同時に合成することと、ペプチドをなお支持体に結合させたままペプチドに抗体を反応させることとによって決定できる。このような技法は当分野で既知であり、例えば米国特許番号：４，７０８，８７１；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８Ｊ．：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら（ｌ９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５に記載されている。このような技法を使用して、ＨＣＶの多数のエピトープが同定されている。例えばＣｈｉｅｎら、Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓｅａｓｅ（１９９４）ｐｐ．３２０−３２４、そしてさらに下を参照。同様に、高次構造エピトープは、例えばＸ線結晶学および２次元核磁気共鳴によって、アミノ酸の空間高次構造を決定することによって容易に同定される。例えば上のエピトープマッピングプロトコルを参照。タンパク質の抗原領域も、標準抗原性およびヒドロパシープロット、例えばＯｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐより入手できるＯｍｉｇａ ｖｅｒｓｉｏｎ １．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されたものを使用して同定されうる。本コンピュータプログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにはＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ ｍｅｔｈｏｄ、Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４−３８２８を、ヒドロパシープロットにはＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５−１３２を利用する。
【００７９】
本明細書で使用するように、「高次構造エピトープ」は、全長天然タンパク質内でエピトープをコードするアミノ酸配列にとってナイーブの構造特徴を有する、全長タンパク質の一部、あるいはその類似体またはムテインを指す。ナイーブの構造特徴としては、これに限定されないが、グリコシル化および３次元構造を含む。配列を定義するエピトープの長さは、これらのエピトープが抗原の３次元形状（例えば折り畳み）によって形成されると考えられているので、幅広い変化を受けることがある。それゆえエピトープを定義するアミノ酸は、比較的数が少ないが、分子の長さに沿って広範に（あるいはダイマーなどの場合には異なる分子にすら）分散して、折り畳みによって正しいエピトープ高次構造に至らせる。エピトープを定義する残基間の抗原の部分は、エピトープの高次構造にとっては重要ではないことがある。例えばこれらの介在配列の欠失または置換は、エピトープ高次構造にとって重要な配列が維持される（例えばジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位など）という条件で、高次構造エピトープに影響しないことがある。
【００８０】
高次構造エピトープは上述の方法を使用して容易に同定される。その上、所与のポリペプチドにおける高次構造エピトープの存在または非存在は、興味のある抗原を抗体（高次構造エピトープに対するポリクローナル血清またはモノクローナル）によってスクリーニングすることと、その反応性を、（もしあれば）直鎖エピトープのみを保持する抗原の変性体の反応性を比較することとによって、容易に決定されうる。ポリクローナル抗体を使用するこのようなスクリーニングにおいて、変性抗原を用いてポリクローナル血清を最初に吸収して、それが興味のある抗原に対する抗体を保持するかどうかを確認することが好都合でありうる。Ｅ１およびＥ２領域に由来する高次構造エピトープは例えば、国際公開番号：ＷＯ ９４／０１７７８に記載されている。
【００８１】
本明細書で使用するように、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、ペプチド構造または関連ハプテンに対してＴ細胞免疫性を誘発できるペプチド構造の特徴を指す。Ｔ細胞エピトープは一般に、ＭＨＣ分子のペプチド結合間隙内で拡張高次構造を取る直鎖ペプチド決定基を含む（Ｕｎａｎｕｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）２３６：５５１−５５７）。ポリペプチドのＭＨＣクラスＩＩ関連直鎖ペプチド決定基（一般に長さ５〜１４アミノ酸）への変換は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって実施される「抗原処理」と呼ばれる。さらに詳細には、Ｔ細胞エピトープは、短いペプチド構造の局所的な特徴、例えば電荷および疎水性を含む１次アミノ酸配列特性、およびポリペプチド全体の折り畳みに依存しないらせん性などのある種類の２次構造によって定義される。さらにヘルパーＴ細胞による認識が可能である短いペプチドは一般に、疎水性側（ＭＨＣ分子との相互作用のため）および親水性側（Ｔ細胞受容体との相互作用のため）を含む、両親媒性構造であることと（Ｍａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ、Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ、編者：Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら（１９９０）ｐｐ．１０９−１１６）、さらに両親媒性構造がα−らせん配置を有することが考えられる（例えばＳｐｏｕｇｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３８：２０４−２１２；Ｂｅｒｋｏｗｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３６：２４９８−２５０３）。
【００８２】
それゆえＴ細胞エピトープを含むタンパク質のセグメントは、多数のコンピュータプログラムを使用して容易に予測されうる。（例えばＭａｒｇａｌｉｔら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ，Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｍａｒｃｅｌ−Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｅｄ．Ｇ．Ｃ．Ｗｏｏｄｒｏｗら（１９９０）ｐｐ．１０９−１１６）。このようなプログラムは一般に、ペプチドのアミノ酸配列を、Ｔ細胞応答を誘発することが既知の配列と比較して、Ｔ細胞エピトープに必要と考えられるアミノ酸のパターンを検索する。
【００８３】
ＨＣＶ抗原または組成物に対する「免疫応答」は、興味のある組成物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性免疫応答の対象における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は抗体分子によって媒介される免疫応答を指し、これに対して「細胞性免疫応答」はＴ−リンパ球および／または他の白血球によって媒介される免疫応答である。細胞免疫性の１つの重要な態様は、細胞溶解性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」による抗原特異性応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と関連して提示され、細胞表面にて発現されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊、またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を誘発および促進するのを助ける。細胞免疫性の１つの重要な態様は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異性応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、機能の刺激を促すように作用して、ＭＨＣ細胞とその表面で結合したペプチド抗原を提示する細胞に対して非特異性エフェクタ細胞の活性を集中させる。「細胞性免疫応答」は、サイトカイン、ケモカインならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する分子を含めて、活性化されたＴ細胞および／または他の白血球によって産生された他のそのような分子の産生も指す。細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ細胞と結合した抗原の提示によって脊椎動物対象を感作させるように作用しうる。細胞媒介免疫応答は、その表面で細胞提示抗原またはその付近に向けられている。加えて抗原特異性Ｔ−リンパ球は、免疫化宿主の将来の保護を可能にするために生成されうる。特定の抗原が細胞媒介免疫応答を刺激する能力は、多数のアッセイによって、例えばリンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ；ＣＴＬ細胞毒性細胞アッセイによって、あるいは感作された対象において抗原に対して特異的なＴ−リンパ球をアッセイすることによって決定されうる。このようなアッセイは当分野で周知である。例えばＥｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９−４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９−２３７６を参照。
【００８４】
それゆえ免疫応答は本明細書で使用するように、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激する免疫応答でありうる。興味のある抗原は、例えば結合（ＮＯＢ）抗体の中和を含む抗体媒介免疫応答も誘発しうる。ＮＯＢ抗体応答の存在は、例えばＲｏｓａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９６）９３：１７５９に記載された技法によって容易に決定される。それゆえ免疫応答は、次の効果：Ｂ細胞による抗体の産生および／または興味のある組成物またはワクチン中に存在する１個または複数の抗原に対して特異的に作られたサプレッサＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化の１つ以上を含みうる。これらの応答は、免疫化された宿主に対する保護または緩和を提供するために、感染性を中和する、ならびにあるいは抗原−補体、または抗原依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するように作用しうる。このような応答は、当分野で周知である標準イムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定されうる。
【００８５】
「単離された」とは、ポリペプチドを指すときに、示された分子が、該分子が天然で見出される、または同じ種類の他の生体巨大分子の実質的な非存在下で存在する生物全体から隔離および分離されていることを意味する。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、天然で通常それと結合されている配列；または天然に存在するが、それと結合した異種配列を有する配列；または染色体から解離した分子の、全体または一部を含まない核酸分子である。
【００８６】
「同等の抗原決定基」は、ＨＣＶの異なる亜種または株からの、例えば抗原決定基が配列変異のために必ずしも同一でないが、問題のＨＣＶ配列における同等の位置に発生するＨＣＶの株１、２、３などからの、抗原決定基である。一般に同等の抗原決定基のアミノ酸配列は、２個の配列が比較されたときに、高度の配列相同性、例えば３０％を超える、通例４０％を超える、例えば６０％を超えるアミノ酸配列相同性、さらには８０〜９０％を超える相同性を有するであろう。
【００８７】
「相同性」は、２個のポリヌクレオチドまたは２個のポリペプチド部分の間の同一性パーセントを指す。２個のＤＮＡ、または２個のポリペプチド配列は、配列が分子の定義された長さに対して少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも７５％の、さらに好ましくは少なくとも約８０％〜８５％の、好ましくは少なくとも約９０％の、最も好ましくは少なくとも約９５％〜９８％の配列同一性を示すときに、相互に対して「実質的に相同性」である。本明細書で使用するように、実質的相同性は、規定したＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列も指す。
【００８８】
一般に「同一性」は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの、正確なヌクレオチド‐ヌクレオチドまたはアミノ酸−アミノ酸の対応を指す。同一性パーセントは、配列を比較することと、２個の比較された配列間の正確な一致数をカウントすることと、より短い配列の長さによって割ることと、結果に１００を掛けることによって、２個の分子間の配列情報の直接比較によって決定されうる。容易に入手可能なコンピュータプログラム、例えばペプチド解析のためにＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９、１９８１年の局所相同性アルゴリズムを採用する、Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５ Ｓｕｐｐｌ．３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣのＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．を使用して解析を補助できる。ヌクレオチド配列同一性を決定するプログラム、例えばまたＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムに依存するＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手できる）で利用できる。これらのプログラムは、メーカーが推奨する、そして上で言及したＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅに記載されているデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば特定のヌクレオチド配列の基準配列に対する同一性パーセントは、デフォルトのスコアリングテーブルおよび６個のヌクレオチド位置のギャップペナルティを用いて、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定されうる。
【００８９】
本発明の文脈で同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが著作権を有し、Ｊｏｈｎ Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋが開発して、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配布されたプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを使用することである。この１組のパッケージから、デフォルトパラメータ（例えばギャップオープンペナルティ１２、ギャップ拡張ペナルティ１、およびギャップ６）がスコアリングテーブルに使用されるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが利用されうる。生成されたデータから、「Ｍａｔｃｈ」値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または類似性パーセントを計算するための他の適切なプログラムは一般に当分野で既知であり、例えば別の配列比較プログラムはデフォルトパラメータと共に使用されるＢＬＡＳＴである。例えばＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、次のデフォルトパラメータを用いて使用されうる：遺伝暗号＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長性、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓ ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は当分野で周知である。
【００９０】
あるいは相同性は、相同性領域間に安定な２本鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションと、続く（複数の）１本鎖特異性ヌクレアーゼによる消化、および消化された断片のサイズ決定によって決定されうる。実質的に相同性であるＤＮＡ配列は、例えば特定の系について定義されるような厳密性条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で同定されうる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当分野の技術の範囲内である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、同上；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、同上；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，同上を参照。
【００９１】
「縮重変異体」という用語は、縮重変異体が由来するポリヌクレオチドによってコードされたポリヌクレオチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、その核酸配列に変化を含有するポリヌクレオチドを意味する。それゆえＥ１Ｅ２８０９ ＤＮＡの縮重変異体は、分子が由来するが、同じＥ１Ｅ２８０９アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列の１個以上の塩基の相違を持つ分子である。
【００９２】
「コード配列」即ち選択したポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の管理下に配置されたときに、試験管内または生体内に転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置しうる。Ｅ１／Ｅ２では、ポリタンパク質には停止開始コドンは当然発生しない。当業者に既知の各種の技法および本明細書に与えた実施例を使用して、開始コドンと、場合により分泌またはリーダー配列とをさらに含むＥ１／Ｅ２融合タンパク質を含む、合成タンパク質発現構築物が作製されうる。
【００９３】
「核酸」分子または「ポリヌクレオチド」は２本鎖および１本鎖配列の両方を含むことができ、これに限定されないが、ウイルス、原核または真核ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ウイルス（例えばＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列を指す。用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列も取り込む。
【００９４】
「ＨＣＶポリヌクレオチド」は、上で定義したようなＨＣＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００９５】
「操作可能に連結された」は、そのように記載された成分がその所望の機能を実施するように構成されている要素の配置を指す。それゆえコード配列に操作可能に連結された所与のプロモータは、例えば適正な転写因子が存在するときにコード配列の発現に影響を及ぼすことができる。プロモータは、その発現を指示するように機能する限り、コード配列と隣接する必要はない。それゆえ例えば、介在する未翻訳であるが転写された配列は、転写イントロンが可能であるようにプロモータ配列とコード配列との間に存在可能であり、プロモータ配列はコード配列になお「操作可能に連結される」と見なされうる。
【００９６】
「組み換えの」は、核酸分子を説明するために本明細書で使用するように、その起源または操作のためにそれが自然界で結合されているポリヌクレオチドの全体または一部と結合していない、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス性、半合成または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。「組み換えの」という用語は、タンパク質またはポリペプチドに関して使用するように、組み換えポリヌクレオチドの発現によって産生されたポリペプチドを意味する。一般に、下でさらに説明されるように、興味のある遺伝子はクローニングされ、次に形質転換された生物内で発現される。宿主生物は、発現条件下で外来遺伝子を発現して、タンパク質を産生する。
【００９７】
「調節要素」は、それが連結されるコード配列の発現を補助するポリヌクレオチド配列を指す。用語はプロモータ、転写終結配列、上流制御ドメイン、ポリアデニル化シグナル、５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む未翻訳領域、適切な場合には、宿主細胞内のコード配列の転写および翻訳を集合的に供給するリーダー配列およびエンハンサを含む。
【００９８】
「プロモータ」は本明細書で使用するように、宿主細胞内でＲＮＡポリメラーゼを結合して、それに操作可能に連結された下流（３’方向）コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ制御領域である。本発明の目的では、プロモータ配列は、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで興味のある遺伝子の転写を開始するのに必要な最低限の数の塩基および要素を含む。プロモータ配列内には、転写開始部位はもちろんのこと、ＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）もある。真核プロモータは、必ずではないが、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。
【００９９】
調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモータ配列に結合して、コード配列をｍＲＮＡ内に転写するときに、細胞におけるコード配列の「転写を指示して」、次にｍＲＮＡがコード配列によってコードされたポリペプチド内に翻訳される。
【０１００】
「発現カセット」または「発現構築物」は、興味のある（複数の）配列または（複数の）遺伝子の発現を指示できるアセンブリを指す。発現カセットは、上記のような調節要素、例えば興味のある（複数の）配列または（複数の）遺伝子に（その転写を指示するために）操作可能に連結され、ポリアデニル化配列も含むことが多い。本発明の範囲内で、本明細書に記載する発現カセットはプラスミド構築物内に含有されうる。発現カセットの構成要素に加えて、プラスミド構築物は１個以上の選択可能なマーカー、プラスミド構築物を１本鎖ＤＮＡとして存在させるシグナル（例えばＭ１３複製起点）、少なくとも１個の多重クローニング部位、および「哺乳類」複製起点（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス複製起点）も含みうる。
【０１０１】
「形質転換」は本明細書で使用するように、挿入に使用する方法とは無関係に、外来性ポリヌクレオチドの宿主細胞内への挿入：例えば直接摂取による形質転換、形質移入、感染などを指す。形質転換の詳細な方法については、さらに下を参照。外来性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、例えばエピソームとして維持されうるか、あるいは宿主ゲノム内に組み込まれうる。
【０１０２】
「核酸免疫化」とは、免疫原の生体内発現のために、１個以上の選択した免疫原、例えばＥ１Ｅ２複合体を宿主細胞内にコードする核酸分子の導入を意味する。核酸分子は、例えば注射、吸入、経口、経鼻および粘膜投与などによってレシピエント対象に直接導入されうるか、または宿主から取り出された細胞内へ生体外で導入されうる。後者の場合、形質転換細胞は対象内に再導入されて、そこで免疫応答を核酸分子によってコードされた免疫原に対して開始させることができる。
【０１０３】
「アルファウイルス」という用語は、当分野でその在来の意味を有し、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、エバーグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、南アフリカアルボウイルスＮｏ．８６（Ｓ．Ａ．ＡＲ８６）、ガードウッドＳ．Ａ．ウイルス、オッケルボーウイルス、セムリキフォレストウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニヤウイルス、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマフォレストウイルス、ゲタウイルス、サグリヤマ（Ｓａｇｌｙａｍａ）ウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、Ｋｙｚｌａｇａｃｈウイルス、ハイランズＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌヅム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、バギークリークウイルス、および国際ウイルス命名委員会（ＩＣＴＶ）によってアルファウイルスとして分類された他の任意のウイルスを含む。本発明で使用するための好ましいアルファウイルスは、ＳＩＮ株、ＶＥＥ株、オッケルボーウイルス、およびそのキメラウイルスである。
【０１０４】
「ウイルスベクター」は、興味のある核酸分子、例えばＥ１Ｅ２複合体をコードするポリヌクレチドを運搬する、そしてある実施形態においては、その発現を指示することができる核酸構築物を指す。ウイルスベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組み換えレプリコン粒子を含む、複数の形式で利用されうる。それゆえ本明細書で使用するように、ウイルスベクターという用語は、ウイルス粒子の形で与えられる核酸、例えば不完全キメラアルファウイルス粒子を含む。
【０１０５】
「アルファウイルスベクター」は、興味のある核酸分子、例えばＥ１Ｅ２複合体をコードするポリヌクレチドを運搬する、そしてある実施形態においては、その発現を指示することができる核酸構築物を指す。アルファウイルスベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組み換えレプリコン粒子を含む、複数の形式で利用されうる。 このようなレプリコンベクターは、例えばシンドビスウイルス、セムリキフォレストウイルス、および／またはベネズエラウマ脳炎ウイルスを含むアルファウイルスに由来している。例えばその全体が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許番号：５，７８９，２４５；５，８１４，４８２；および６，３７６，２３５ならびにＷＯ ０２／０９９０３５を参照。
【０１０６】
「アルファウイルスＲＮＡレプリコンベクター」、「ＲＮＡレプリコンベクター」、「レプリコンベクター」または「レプリコン」という用語は、標的細胞内でそれ自体の増幅または生体内自己複製を指示できるＲＮＡ分子を指す。それ自体の増幅を指示するために、ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ増幅を触媒するのに必要な（複数の）ポリメラーゼ（例えばアルファウイルス非構造タンパク質、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードして、コードされた（複数の）ポリメラーゼによって認識および利用される、増幅に必要なｃｉｓＲＮＡ配列も含有すべきである。アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは通例、次の順序付けられた要素を含有する：非構造タンパク質媒介増幅に必要な５’ウイルスまたは細胞配列（５’ＣＳＥ、または５’ｃｉｓ複製配列、または増幅のためにｃｉｓで必要とされる５’ウイルス配列、またはアルファウイルスの転写を開始できる５’配列とも呼ばれうる）、発現されたときに、生物活性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする配列（例えばｎｓＰｌ、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）、および非構造タンパク質媒介増幅に必要な３’ウイルスまたは細胞配列（３’ＣＳＥ、または増幅のためにｃｉｓで必要とされる３’ウイルス配列、またはアルファウイルスＲＮＡポリメラーゼ認識配列とも呼ばれうる）。アルファウイルスＲＮＡベクターレプリコンは、１個以上の異種配列、例えばある実施形態において、サブゲノム断片のウイルス転写を増加または減少させるために、あるいは不完全ヘルパーまたは構造タンパク質発現カセットとの相同性を低下させるために修飾されうるＩＲＥＳまたはウイルス（例えばアルファウイルス）サブゲノムプロモータ（例えば結合領域プロモータ）、および１個以上の発現される異種配列を発現させる手段も含有すべきである。 ベクターとして使用される場合、レプリコンは追加の配列、例えば１個以上のポリペプチド（例えばタンパク質コード遺伝子または３’近位遺伝子）および／またはポリアデニレートトラクトをコードする１個以上の異種配列も含有するであろう。
【０１０７】
本明細書で使用するように、「キメラアルファウイルス粒子」および「キメラアルファウイルスレプリコン粒子」という用語は、特に（例えば他のウイルスからの）カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質が由来するアルファウイルス以外のアルファウイルスに由来する核酸を含有するように修飾または組み換えられた、キメラまたはキメラ粒子、例えばウイルス、あるいはウイルス様粒子を指す。このような粒子において、アルファウイルスに由来する核酸は、これに限定されないが、ゲノム長（非構造および構造タンパク質をコードする）およびレプリコン長（１個以上の構造タンパク質が削除された）を含む、いくつもの異なる長さのうち１つを含むＲＮＡ分子である。例えば、そして制限としてではないが、キメラレプリコン粒子としては、ＶＥＥ糖タンパク質エンベロープによって包囲された、シンドビスウイルスＲＮＡ結合ドメインおよびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）エンベロープ糖タンパク質相互作用ドメインを有するカプシド内のシンドビスウイルス（ＳＩＮ）レプリコンＲＮＡおよび／またはｎｓＰ３の欠失、ｎｓＰ３の欠失内に挿入されたＳＩＮパッケージングシグナルならびにＳＩＮに由来するカプシドおよびエンベロープタンパク質を有するＶＥＥレプリコンＲＮＡが挙げられる。キメラアルファウイルスベクターは例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許公報：２００３０２３２３２４および２００３０１４８２６２に記載されている。
【０１０８】
好ましい実施形態において、本発明はキメラである欠損アルファウイルス粒子を利用する。本明細書で使用するように、「欠損アルファウイルス粒子」という用語は、細胞内での感染時にそのＲＮＡのコピーを生成することができ、それによりアルファウイルスでコードされたいずれの外来性遺伝子も発現するが、ウイルスが感染後に新たなウイルス粒子の産生に必要な１つ以上の機能を欠いている、ウイルス粒子を指す。通例、このような欠損アルファウイルス粒子には、新たな粒子の生成に必要な１個以上の構造遺伝子が不足している。（例えばＷＯ／６１７７２を参照）。
【０１０９】
免疫原性組成物の「有効量」または「製薬的有効量」という用語は、本明細書で与えるように、組成物の非毒性であるが、所望の応答、例えば免疫応答、および場合により対応する治療効果を与えるのに十分な量を指す。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、治療される状態の重症度、興味のある特定の巨大分子、投与様式などによって、対象間で変化するであろう。いずれの個体においても適切な「有効」量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定されうる。
【０１１０】
「脊椎動物対象」とは、制限なく、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えばチンパンジーおよび他の類人猿およびサル種を含む他の霊長類；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマなどの農場動物；イヌおよびネコなどの家畜化哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットなどのげっ歯類を含む実験用動物；ニワトリ、シチメンチョウおよび他の家禽鳥、アヒル、ガチョウなどの飼育鳥、野生鳥および猟鳥を含む鳥類；を含む多数の脊索動物亜門を意味する。該用語は特定の年齢を示さない。それゆえ成人および新生個体の両方が含まれるものとする。本明細書に記載する本発明は、これらの脊椎動物すべての免疫系が同様に作用するので、上の脊椎動物のいずれにおいても使用されるものとする。
【０１１１】
「治療」という用語は本明細書で使用するように、（１）感染または再感染の防止（予防）、あるいは（２）興味のある疾患の症状の低減または除去（治療）のどちらかを指す。
【０１１２】
２．本発明を実施する様式
本発明を詳細に説明する前に、本発明が、それ自体がもちろん変化しうる、特定の調合物またはプロセスパラメータに限定されないことが理解されるべきである。本明細書で使用する用語は本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的としており、制限するものではないことは理解されるべきである。
【０１１３】
本明細書に記載するのと同様または同等の多数の方法および材料が本発明の常法で使用されうるが、好ましい材料および方法が明細書に記載される。
【０１１４】
本発明の中核を成すのは、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体の１回以上の初期投与と、続くＨＣＶ Ｅ１Ｅ２をコードする核酸構築物を含むウイルスベクターによるブーストを使用した免疫化方法が高度のＨＣＶ ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じるという発見である。それゆえさらに詳細に後述するように、対象は１回以上の免疫化において、最初にＥ１Ｅ２複合体、例えばＥ１Ｅ２８０９ＤＮＡを使用して発現された複合体を投与される。Ｅ１Ｅ２複合体を含む組成物は、アジュバント、例えば詳細に後述するサブミクロン水中油型エマルジョンも含有しうる。対象は次に、Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸構築物を含むウイルスベクター組成物、例えばＥ１Ｅ２複合体をコードするアルファウイルスレプリコン粒子を含有するウイルスベクター組成物によってブーストされる。核酸構築物によってコードされたＥ１Ｅ２複合体は、最初に使用したのと同じＥ１Ｅ２複合体でありうるか、または免疫応答が生成される限り、さらに後述するような他のＥ１Ｅ２タンパク質をコードしうるかのどちらかである。それゆえ例えばＥ１Ｅ２８０９ＤＮＡに由来する複合体を使用して免疫応答をプライミングする場合、対象はＥ１Ｅ２８０９をコードする核酸、または別のＥ１Ｅ２タンパク質、例えばＥ１Ｅ２７４６をコードする核酸を含む組成物によってブーストされうる。好ましい実施形態において、本明細書に記載するようなウイルスベクターは、キメラアルファウイルス粒子でありうる、欠損アルファウイルス粒子である。
【０１１５】
加えて上の組成物は、単独で、あるいは他の組成物、例えば他のＨＣＶタンパク質を含む組成物、他のＨＣＶタンパク質をコードするＤＮＡを含む組成物はもちろんのこと、補助物質、例えば免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびケモカイン、これに限定されないが、サイトカイン、例えばＩＬ−１、１Ｌ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２などを含むケモカイン（例えば国際公開番号：ＷＯ ９９／４４６３６）、修飾ＩＬ−２（ｃｙｓ１２５→ｓｅｒ１２５）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンおよびペグ化インターフェロン、例えばγ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰＩβ、ＦＬＰ−３、リバビリン、ＲＡＮＴＥＳ、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、プロテアーゼ、グリコシル化、メタロプロテアーゼ、および／またはＩＲＥＳの阻害薬を含む組成物で使用されうる。それゆえ本発明は、ＨＣＶ感染を治療するための他の治療計画によって使用されうる。他の組成物と組み合せて使用する場合、このような組成物はＥ１Ｅ２組成物の前に、Ｅ１Ｅ２組成物と同時に、またはＥ１Ｅ２組成物の次に投与されうる。
【０１１６】
本発明をさらに理解するために、以下Ｅ１Ｅ２タンパク質および核酸組成物、ならびに本方法で使用する追加の組成物に関してより詳細に考察する。
【０１１７】
Ｅ１Ｅ２ポリペプチド
上で説明したように、本発明の方法において、対象における免疫応答は、Ｅ１Ｅ２複合体を含む組成物の１回以上の投与を使用してプライミングされる。対象は次にＥ１Ｅ２核酸構築物を使用してブーストされる。Ｅ１、Ｅ２およびｐ７は、ヒトＴ細胞エピトープ（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）を含有することが既知である。Ｅ１Ｅ２複合体は、非共有結合または共有結合相互作用のどちらかによって結合された１個以上のＴ細胞エピトープを含むＥ１およびＥ２ポリペプチドを含む。その上、特異性保存Ｔ細胞エピトープの複数のコピー、例えば異なる遺伝子型からのエピトープの合成物は、Ｅ１Ｅ２複合体で使用されうる。
【０１１８】
ＨＣＶ Ｅ１ポリペプチドは糖タンパク質であり、約アミノ酸１９２からアミノ酸３８３（ＨＣＶ−１のポリタンパク質に対して番号付けられた）まで延伸する。例えばＣｈｏｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２４５１−２４５５を参照。１７３付近から約１９９までのアミノ酸は、Ｅ１のシグナル配列を表す。ＨＣＶ Ｅ２ポリペプチドも糖タンパク質であり、約アミノ酸３８３または３８４からアミノ酸７４６まで延伸する。Ｅ２のシグナルペプチドは、ポリタンパク質の約アミノ酸３６４にて開始する。それゆえ「全長」Ｅ１または「切断されていない」Ｅ１という用語は本明細書で使用するように、ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸１９２〜３８３（ＨＣＶ−１に対して番号付けられた）を含むポリペプチドを指す。Ｅ２に関して、「全長」または「切断されていない」という用語は本明細書で使用するように、ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸３８３または３８４からアミノ酸７４６（ＨＣＶ−１に対して番号付けられた）を含むポリペプチドを指す。本開示から明らかとなるように、本発明で使用するＥ１Ｅ２ポリペプチドは、ｐ７領域からの追加のアミノ酸、例えばアミノ酸７４７−８０９を含みうる。
【０１１９】
Ｅ２は複数の種として存在し（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌ．（１９９２）１８８：８１９−８３０；Ｓｅｌｂｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５１７７−５１８２；Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；Ｔｏｍｅｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：４０１７−４０２６）、Ｅ１およびＥ２ポリペプチドのＮおよびＣ末端でクリッピングおよびタンパク質分解が発生しうる。それゆえＥ１Ｅ２複合体で見出されたようなＥ２ポリペプチドは、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に対して番号付けされた、ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸４０５−６６１、例えば４００、４０１、４０２．．．６６１、例えば３８３または３８４−６６１、３８３または３８４−７１５、３８３または３８４−７４６、３８３または３８４−７４９あるいは３８３または３８４−８０９、あるいは３８３または３８４から６６１−８０９間のいずれかのＣ末端までを含みうる。同様に、本明細書で使用するための好ましいＥ１ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２−３２６、１９２−３３０、１９２−３３３、１９２−３６０、１９２−３６３、１９２−３８３、または１９２から３２６−３８３間のいずれかのＣ末端を含みうる。
【０１２０】
Ｅ１Ｅ２複合体はまた、エピトープ、好ましくはＴ細胞エピトープを含むＥ１およびＥ２の免疫原性断片より成りうる。例えばＥ１ポリペプチドの断片は、約５から分子のほぼ全長まで、例えばＥ１ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、１８５以上のアミノ酸、または示された数字の間のいずれかの整数を含みうる。同様にＥ２ポリペプチドの断片は、Ｅ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、または３５０アミノ酸、あるいは示された数字の間のいずれかの整数を含みうる。Ｅ１およびＥ２ポリペプチドは、同じまたは異なるＨＣＶ株からでありうる。
【０１２１】
例えばＥ２の超可変領域、例えばアミノ酸３８４−４１０または３９０−４１０に及ぶ領域に由来するエピトープがＥ２ポリペプチドに含まれうる。Ｅ２配列中に包含するために特に有効なＥ２エピトープは、この領域に由来するコンセンサス配列、例えばＨＣＶタイプ１ゲノムのアミノ酸３９０〜４１０のコンセンサス配列に相当する、コンセンサス配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ（配列番号：３）を含むＥ２エピトープである。Ｅ１およびＥ２の追加のエピトープは既知であり、例えばＣｈｉｅｎら、国際公開番号：ＷＯ ９３／００３６５に記載されている。
【０１２２】
その上、複合体のＥ１およびＥ２ポリペプチドは、膜貫通ドメインの全部または一部が不足している。膜アンカー配列は、ポリペプチドを小胞体に結合するように機能する。通常、そのようなポリペプチドは、タンパク質を発現する生物が培養される成長培地中への分泌が可能である。しかしながら国際公開番号：ＷＯ ９８／５０５５６に記載されているように、このようなポリペプチドも細胞内に回収されうる。成長培地中への分泌は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などを含む多数の検出技法、および例えば１９９６年２月１５日に公開された国際公開番号：ＷＯ ９６／０４３０１に記載されたような免疫沈降アッセイなどの免疫技法を使用して容易に決定される。Ｅ１では、一般に約アミノ酸位置３７０以上（ＨＣＶ−１ Ｅ１の番号付けに基づいて）で終結するポリペプチドはＥＲによって保持され、それゆえ成長培地中には分泌されないであろう。Ｅ２では、一般に約アミノ酸位置７３１以上（またＨＣＶ−１ Ｅ２配列の番号付けに基づいて）で終結するポリペプチドはＥＲによって保持され、成長培地中には分泌されないであろう。（例えば１９９６年２月１５日に公開された国際公開番号：ＷＯ ９６／０４３０１を参照）。これらのアミノ酸位置が絶対でなく、ある程度まで変化しうることに注目すべきである。それゆえ本発明は、膜貫通結合ドメインを保持するＥ１およびＥ２ポリペプチドの使用はもちろんのこと、約アミノ酸３６９以下で終結するＥ１ポリペプチド、および約アミノ酸７３０以下で終結するＥ２ポリペプチドを含む、膜貫通結合ドメインの全部または一部を欠いたポリペプチドの使用も、本発明に取り入れられるものとすることを考慮する。さらにＣ末端切断は、膜貫通ドメインを超えてＮ末端まで延伸しうる。それゆえ、例えば３６０未満の位置で発生するＥ１切断および例えば７１５未満の位置で発生するＥ２切断も本発明に含まれる。必要なのは切断Ｅ１およびＥ２ポリペプチドがその所期の目的について機能性を維持していることだけである。しかしながら特に好ましい切断Ｅ１構築物は、約アミノ酸３００を超えて延伸しない切断Ｅ１構築物である。最も好ましいのは、位置３６０で終結するものである。好ましい切断Ｅ２構築物は、約アミノ酸位置７１５を超えて延伸しないＣ末端切断のある切断Ｅ２構築物である。特に好ましいＥ２切断は、アミノ酸７１５−７３０のいずれか、例えば７２５の後に切断された分子である。切断分子が使用される場合、どちらも切断されたＥ１およびＥ２分子を使用することが好ましい。
【０１２３】
Ｅ１およびＥ２ポリペプチドおよびその複合体もアシアロ糖タンパク質として存在しうる。このようなアシアロ糖タンパク質は、当分野で既知の用法によって、例えば末端グリコシル化が遮断される細胞を使用することによって産生される。これらのタンパク質がこのような細胞内で発現され、ＧＮＡレクチンアフィニティクロマトグラフィーによって分離されるとき、Ｅ１およびＥ２タンパク質は自発的に凝集する。これらのＥ１Ｅ２凝集体を産生する詳細な方法は、米国特許番号：６，０７４，８５２に記載されている。
【０１２４】
その上、Ｅ１Ｅ２複合体は、上記のようにクリッピングおよびタンパク質分解開裂のために、分子の異質混合物を含みうる。それゆえＥ１Ｅ２複合体を含む組成物は、Ｅ１Ｅ２の複数の種、例えばアミノ酸７４６で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２７４６），アミノ酸８０９で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２８０９）、または上記の他の各種のＥ１およびＥ２分子のいずれか、例えば１〜２０個のアミノ酸のＮ末端切断のあるＥ２分子、例えばアミノ酸３８７、アミノ酸４０２、アミノ酸４０３にて開始Ｅ２種などを含みうる。
【０１２５】
便宜上、Ｅ１およびＥ２領域は一般にＣｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２４５１に記載されたようなＨＣＶ−１ａに対するアミノ酸数に関して定義されることに注目すべきであり、イニシエータメチオニンは位置１と示される。しかしながら本発明で使用するポリペプチドは、ＨＣＶ−１ａに由来するポリペプチドに限定されない。ＨＣＶのいずれの株または単離物も、本発明で使用するための免疫原性配列を供給するための基本として作用しうる。この点で、別のＨＣＶ単離物における対応する領域は、配列を最大アラインメントにするような方法で２個の単離物からの配列を比較することによって容易に決定されうる。
【０１２６】
ＨＣＶの各種の株および単離物は当分野で既知であり、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化によって相互に異なっている。例えば単離物ＨＣＶ Ｊｌ．１は、Ｋｕｂｏら（１９８９）Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：１０３６７−１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：２８７−２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７−３０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載されている。２個の独立単離物ＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全コード配列は、Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５２４−９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５−１１１３によってそれぞれ記載されている。ＨＣＶ−１単離物は、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ ４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１７１１−１７１５によって記載されている。ＨＣＶ単離物ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６０：１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ単離物ＨＣＴ １８、ＨＣＴ ２３、Ｔｈ、ＨＣＴ ２７、ＥＣｌおよびＥＣ１０は、 Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載されている。ＨＣＶ単離物Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１およびＨＣＶ−Ｋ２は、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１−１０２５に記載されている。ＨＣＶ単離物Ａ、Ｃ、Ｄ＆Ｅは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ ５：２４３−２５４に記載されている。本発明の組成物および方法に使用するためのＨＣＶ Ｅ１Ｅ２ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ＨＣＶの上で引用した株のいずれかから、または感染患者の組織または体液から単離した新たに発見された単離物から得られる。
【０１２７】
Ｅ１Ｅ２複合体は、融合タンパク質として、または例えば宿主細胞と、興味のあるＥ１およびＥ２ポリペプチドをコードする構築物によって宿主細胞を同時形質移入することのどちらかによって、組み換えにより容易に産生されうる。同時形質移入は、トランスまたはシスのどちらかで、即ち別個のベクターを使用することによって、またはＥ１およびＥ２遺伝子の両方を持つ単一ベクターを使用することによってのどちらかにより達成されうる。単一のベクターを使用して実施した場合、どちらの遺伝子も単一のセットの調節要素によって駆動されうるか、あるいは遺伝子は個々の発現カセット内のベクターに存在して、個々の調節要素によって駆動されうる。発現の後に、Ｅ１およびＥ２タンパク質は自発的に結合するであろう。あるいは複合体は、精製形または半精製形のどちらかで別個に産生された個々のタンパク質を共に混合することによって、あるいはタンパク質が分泌される場合、タンパク質を発現する宿主細胞が培養された培地を混合することによって形成されうる。最後に、本発明で使用するためのＥ１Ｅ２複合体は、Ｅ１の所望の部分がＥ２の所望の部分に融合された融合タンパク質として発現されうる。
【０１２８】
培地中に分泌される全長、切断Ｅ１およびＥ２タンパク質からはもちろんのこと、細胞内産生切断タンパク質からもＥ１Ｅ２複合体を産生する方法は、当分野で既知である。例えばこのような複合体は、米国特許番号：６，１２１，０２０；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３−６７６１，Ｇｒａｋｏｕｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：１３８５−１３９５；およびＬａｎｆｏｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９３）１９７：２２５−２３５に記載されているように組み換えによって産生されうる。
【０１２９】
Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸構築物
Ｅ１、Ｅ２およびＥ１Ｅ２タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＨＣＶゲノム全体よりも少なく含有し、ＲＮＡあるいは１本鎖または２本鎖ＤＮＡでありうる。好ましくは、ポリヌクレオチドは他の成分、例えばタンパク質および脂質を含まずに単離される。ポリヌクレオチドは、上記のようにＥ１およびＥ２ポリペプチドおよびその複合体をコードして、それゆえそのコード配列を含む。本発明のポリヌクレオチドは、他の非ＨＣＶヌクレオチド配列、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼおよびブドウ球菌タンパク質Ａなどのタンパク質精製に有用なリンカ、シグナル配列またはリガンドをコードする配列も含みうる。
【０１３０】
各種のＨＣＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＨＣＶ感染個体の例えば血漿、血清、または肝臓ホモジネートに存在する核酸配列に由来するゲノムライブラリから単離されうるか、あるいは例えば自動合成装置を使用して実験室で合成されうる。ＰＣＲなどの増幅方法を使用して、ＨＣＶゲノムＤＮＡまたはそれをコードするｃＤＮＡのどちらかからポリヌクレオチドを増幅できる。
【０１３１】
ポリヌクレオチドは、自然に発生するこれらのポリペプチドのコード配列を含みうるか、または自然に発生しない人工配列を含みうる。例えばＥ１Ｅ２タンパク質はより大きな融合タンパク質の一部であるため、Ｅ１Ｅ２タンパク質のメチオニン開始コドンおよびリーダー配列を供給することが有用でありうる。これらのポリヌクレオチドは標準分子生物学技法を使用して結合され、Ｅ１Ｅ２複合体のコード配列を形成しうる。所望ならば、本発明の融合タンパク質を細胞培養物中で発現させ、細胞培養物から単離するために、ポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングし、例えば細菌、酵母、昆虫、または哺乳類細胞に形質転換することができる。
【０１３２】
Ｅ１Ｅ２タンパク質をコードする本発明の発現構築物、またはＥ１およびＥ２をコードする配列を含む個々の発現構築物は、ＨＣＶ Ｅ１／Ｅ２タンパク質をコードおよび発現するウイルスベクターを使用して免疫応答、例えば細胞免疫応答をブーストおよび刺激するために、核酸免疫化に使用されうる。好ましい実施形態において、ウイルスベクターはキメラアルファウイルス粒子である欠損アルファウイルス粒子である。
【０１３３】
本発明で使用するためのリポソーム調製物は、カチオン性（正に帯電）、アニオン性（負に帯電）および中性調製物を含み、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは容易に入手できる。例えばＮ［１−２，３−ジオレイルオキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹから商標リポフェクチンで入手できる（例えばＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６も参照）。他の市販の脂質としては、トランスフェクテース（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当分野で周知の技法を使用して、容易に入手できる物質から調製されうる。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイロキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の説明については、例えばＳｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ公開番号：ＷＯ ９０／１１０９２を参照。各種のリポソーム−核酸複合体は、当分野で既知の方法を使用して調製される。例えばＳｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３）、Ｖｏｌ．１０１、ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９：Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照。
【０１３４】
多数のウイルスベース系が哺乳類細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えばレトロウイルスは、遺伝子送達系に好都合なプラットフォーム、例えばマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスを供給する。選択した遺伝子は当分野で既知の技法を使用して、ベクター内に挿入されて、レトロウイルス粒子内にパッケージされる。組み換えウイルスは次に単離されて、生体内または生体外のどちらかで対象の細胞内に送達されうる。多数のレトロウイルス系が記載されている（米国特許番号：５，２１９，７４０；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９。簡潔には、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えばＢ、Ｃ、およびＤ型レトロウィルスはもちろんのこと、スプマウイルスおよびレンティウイルス、例えばＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶも含む、広範囲のレトロウイルスから容易に構築されうる（ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５年を参照）。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１ １０−２２０９）などの寄託機関またはコレクションから容易に入手されうるか、または一般に利用可能な技法を使用して既知の供給源から単離されうる。
【０１３５】
多数のアデノウイルスベクター、例えばアデノウイルスタイプ２およびタイプ５ベクターなども記載されている。宿主ゲノムに組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは染色体外に残存するので、それゆえ挿入突然変異と関連するリスクを最小限に抑える（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｌｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【０１３６】
分子コンジュゲートベクター、例えばＭｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載されているアデノウイルスキメラベクターも遺伝子送達に使用されうる。
【０１３７】
アルファウイルス属のメンバー、例えばこれに限定されないが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）およびセムリキフォレストウイルスに由来するベクターは、興味のある遺伝子を送達するためのウイルスベクターとして用途を見出すであろう。アルファウイルス属の複数のメンバーが、ワクチンおよび治療薬として使用するための「レプリコン」発現ベクターとして開発されうる。レプリコンベクターは、レプリコンベクターを含有する組み換えウイルス様粒子（レプリコン粒子）を作製するために、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む複数の形式で利用されうる。このようなレプリコンベクターは、上記のアルファウイルス、例えばＳＩＮ（Ｘｉｏｎｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：１１８８−１１９１；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：５０８−５１９；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９５０−９５８；Ｐｏｌｏら（１９９９）ＰＮＡＳ ９６：４５９８−４６０３）、セムリキフォレストウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐ：１３５６−１３６１；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５６２−５６５）、およびＶＥＥ（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３９：３８９−４０１）のいずれかから由来しうる。その全体が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許番号：５，７８９，２４５；５，８１４，４８２；および６，３７６，２３５ならびにＷＯ ０２／０９９０３５も参照。
【０１３８】
アルファウイルスベース発現ベクターの構築の一般的な方法は、ウイルス構造タンパク質遺伝子を興味のある異種遺伝子で置換する工程と、高活性サブゲノムＲＮＡプロモータによって転写調節を維持する工程とを含む。この配置のベクターはＲＮＡ「レプリコン」と呼ばれ、バクテリオファージプロモータを使用してｃＤＮＡから試験管内で転写されうるか、または真核プロモータに結合されているときにはＤＮＡから直接生体内で産生されうる。アルファウイルスレプリコンＲＮＡは一般に、試験管内で転写された不完全ヘルパーＲＮＡとの過渡同時形質移入によって、または構造タンパク質発現カセットを有する安定パッケージング細胞株を使用することによって、組み換えベクター粒子内にパッケージされる。ベクターパッケージングに使用される（複数の）構造タンパク質発現カセットは、それらがそれら自体で複製できないときに「不完全ヘルパー」構築物とも呼ばれ、成熟Ｃ、Ｅ２およびＥ１へ翻訳後処理される無傷の「ナイーブ」アルファウイルス構造ポリタンパク質；またはＣまたはＥ２／Ｅ１のどちらかをコードする別個のカセットに分割されたアルファウイルス構造タンパク質のどちらかをコードする。例えばすべてその全体が参照により本明細書に組み入れられている、米国特許番号：６，４６５，６３４；６，４２６，１９６；６，３７６，２３６；６，３４２，３７２；６，３２９，２０１；６，０１５，６８６；５，８４３，７２３；および国際公開番号：ＷＯ ９５／０７９９５およびＷＯ ９６／１７０７２；Ｐｏｌｏら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：４５９８−４６０３；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０（ｌ）：５０８−５１９；Ｆｒｏｌｏｖら（１９９６）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．９３（２１）：１１３７１−１１３７７）を参照。
【０１３９】
Ｅ１Ｅ２ブーストの送達に使用するのが特に好ましいのは、キメラアルファウイルスベクター、例えばＳＩＮおよびＶＥＥのレプリコン粒子キメラである。キメラアルファウイルスベクターは例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられている米国特許公報：２００３０２３２３２４および２００３０１４８２６２、ならびにＰｅｒｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（２００３）７７：１０３９４−１０４０３に記載されている。例えばＳＩＮエンベロープ糖タンパク質内にパッケージされたＶＥＥ−Ｅ１Ｅ２レプリコンＲＮＡまたはＶＥＥエンベロープ糖タンパク質内のＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２レプリコンＲＮＡは、本方法で用途を見出すであろう。下の例で示すように、ＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子は、Ｅ１Ｅ２タンパク質ワクチンを用いたプライミング後に投与したときに、マウスモデルでのＨＣＶ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発した。
【０１４０】
これに限定されないが、シミアンウイルス４０およびサイトメガロウイルスを含む他のベクターも使用されうる。細菌ベクター、例えばサルモネラ亜種、エルシニアエンテロコリチカ、赤痢菌亜種、コレラ菌、マイコバクテリウム株ＢＣＧ、およびリステリアモノサイトゲネスが使用されうる。微小染色体、例えばＭＣおよびＭＣ１、バクテリオファージ、コスミド（ファージラムダｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド）およびレプリコン（細胞内でそれ自体の制御下で複製が可能である遺伝子要素）も使用されうる。
【０１４１】
発現構築物はまた、特定の担体によってカプセル化、吸着、または結合されうる。このような担体は、選択した分子の複数のコピーを免疫系に提示して、局所リンパ節への分子の捕捉および保持を促進する。粒子はマクロファージによって貪食され、サイトカイン放出によって抗原提示を強化しうる。微粒子担体の例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーに由来するものはもちろんのこと、ＰＬＧとして既知のポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に由来する微粒子も挙げられる。例えばＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照。
【０１４２】
巨大分子を調製した微粒子に吸着させる１つの好ましい方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、国際公開番号：ＷＯ ００／０５０００６に記載されている。簡潔には、微粒子は再水和され、透析可能なアニオン性またはカチオン性洗浄剤を使用して微粒子の本質的にモノマー性の懸濁物へ分散させる。有用な洗浄剤としては、これに限定されないが、各種のＮ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡとして既知）、例えばヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−７）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−８）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（ＭＥＧＡ−９）、およびデカノイル−Ｎ−メチル−グルカミド（ＭＥＧＡ−１０）；コール酸；コール酸ナトリウム；デオキシコール酸；デオキシコール酸ナトリウム；タウロコール酸；タウロコール酸ナトリウム；タウロデオキシコール酸；タウロデオキシコール酸ナトリウム；３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパン−スルホナート（ＣＨＡＰＳ）；３−［（３−コルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）；−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルホナート（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２）；Ｎ，Ｎ−ビス−（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）−ジオキシコルアミド（ＤＥＯＸＹ−ＢＩＧＣＨＡＰ）；−オクチルグリコシド；モノラウリン酸スクロース；グリココール酸／グリココール酸ナトリウム；ラウロサルコシン（ナトリウム塩）；グリコデオキシコール酸／グリコデオキシコール酸ナトリウム；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；３−（トリメチルシリル）−１−プロパンスルホン酸（ＤＳＳ）；セトリミド（ＣＴＡＢ、その主成分はヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド）；ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ヘキサデシルトリメチル−アンモニウムブロミド；テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチルドデシルアンモニウムブロミド；ベンジルジメチル−ヘキサデシルアンモニウムクロライド；およびベンジルジメチルテトラ−デシルアンモニウムブロミドのいずれかが挙げられる。上の洗浄剤は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから市販されている。当分野で既知の各種のカチオン性脂質も洗浄剤として使用されうる。Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら、１９９６年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１６３−７２およびＧａｏ，Ｘ．、およびＬ．Ｈｕａｎｇ．１９９５年、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２：７１１０−７２２を参照。
【０１４３】
多種多様の他の方法を使用して、発現構築物を細胞に送達しうる。このような方法は、ＤＥＡＥデキストラン介在形質移入、リン酸カルシウム沈降、ポリリジンまたはポリオルニチン介在形質移入、または他の不溶性無機塩、例えばリン酸ストロンチウム、ベントナイトおよびカオリンを含むケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクを使用する沈降などを含む。形質移入の他の有用な方法としては、電気穿孔、超音波穿孔、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、または微量注入が挙げられる。例えば興味のある細胞の形質転換技法の議論については、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、同上；および遺伝子移入に有用な送達系の総説については、Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照。電気穿孔を使用するＤＮＡの送達方法は例えば米国特許番号：６，１３２，４１９；６，４５１，００、，６，４１８，３４１、６２３３，４８３、米国特許公報番号：２００２／０１４６８３１；および国際公開番号：ＷＯ／００４５８２３に記載されており、そのすべてはその全体が参照により本明細書に組み入れられている。
【０１４４】
その上、ＨＣＶポリヌクレオチドは、ＩＳＣＯＭに吸着、またはＩＳＣＯＭ内に捕捉されうる。古典的なＩＳＣＯＭは、コレステロール、サポニン、リン脂質、および免疫原、例えばウイルスエンベロープタンパク質の組み合せによって形成される。一般にＨＣＶ分子（通常は疎水性領域による）は洗浄剤に可溶化されて、反応混合物に添加され、それによりＩＳＣＯＭは中に包含されたＨＣＶ分子によって形成される。ＩＳＣＯＭは、本明細書ではＩＭＸとも呼ばれる。ＩＳＣＯＭマトリクス組成物は同様に、しかしウイルスタンパク質なしで生成される。高い陽電荷を持つタンパク質は、疎水性力によってではなく、ＩＳＣＯＭ粒子に静電的に結合されうる。サポニンおよびＩＳＣＯＭのさらに詳細な一般的議論、ならびにＩＳＣＯＭを調合する方法については、全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｂａｒｒら（１９９８）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ３２：２４７−２７１（１９９８）；米国特許番号：４，９８１，６８４、５，１７８，８６０、５，６７９，３５４および６，０２７，７３２；欧州公開番号：ＥＰＡ １０９，９４２；１８０，５６４および２３１，０３９；ならびにＣｏｕｌｔｅｒら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２４３を参照。
【０１４５】
加えて、金およびタングステンなどの微粒子担体を利用する遺伝子銃送達系は、本発明の発現構築物を送達するのに特に有用である。微粒子は送達される構築物によってコーティングされ、「遺伝子銃」からの火薬放出を使用して、一般に減圧下で高い速度まで加速される。このような技法、およびそのための有用な装置の説明については、例えば米国特許番号：４，９４５，０５０；５，０３６，００６；５，１００，７９２；５，１７９，０２２；５，３７１，０１５；および５，４７８，７４４を参照。
【０１４６】
他のＨＣＶポリペプチドおよびポリヌクレオチド
上で説明したように、本発明の方法は、ＨＣＶ免疫原またはこのような免疫原をコードするＤＮＡを含む他の組成物を利用しうる。このような組成物は、免疫応答をブーストするためのＥ１Ｅ２核酸組成物の前に、次に、または同時にと同様に、Ｅ１Ｅ２組成物の前に、Ｅ１Ｅ２組成物の次に、またはＥ１Ｅ２組成物と同時に送達されうる。
【０１４７】
本発明の方法は、ＨＣＶに対する免疫応答をプライミングおよびブーストするための抗原として、Ｅ１／Ｅ２の代わりに他のＨＣＶタンパク質も利用しうる。一部の実施形態において、本発明は、Ｅ１、Ｅ２および／またはコアタンパク質などのＨＣＶの１個以上の構造タンパク質に融合されたＨＣＶからの非構造（ＮＳ）タンパク質を利用しうる。一実施形態において、本発明は、本質的にＥ２より成るＨＣＶ融合タンパク質を含むプライミングタンパク質組成物を提供する。
【０１４８】
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムは通例、約９，６００ヌクレオチドの単一の読み取り枠を含有し、これがポリタンパク質内に転写される。ポリタンパク質の全長配列は、欧州公開番号：３８８，２３２および米国特許番号：６，１５０，０８７に開示されている。表１および図１に示すように、ＨＣＶポリタンパク質は開裂時に、少なくとも１０個の別個の生成物をＮＨ２−コア−Ｅｌ−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で産生する。コアポリペプチドは、ＨＣＶ−１に対して番号付けられた位置１−１９１で発生する（例えばＨＣＶ−１ゲノムについては、Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照）。このポリペプチドはさらに処理されて、約アミノ酸１−１７３を持つＨＣＶポリペプチドを産生する。エンベロープポリペプチドＥ１およびＥ２は、約位置１９２−３８３および３８４−７４６にそれぞれ発生する。Ｐ７ドメインは約位置７４７−８０９に見出される。ＮＳ２はタンパク質分解活性を持つ内在性膜タンパク質であり、ポリタンパク質の約位置８１０−１０２６で見出される。ＮＳ２は、単独で、またはＮＳ３（約位置１０２７−１６５７で見出される）と組み合せてのどちらかで、ＮＳ２−ＮＳ３シスル結合を開裂して、次にＮＳ３Ｎ末端を生成して、セリンプロテアーゼおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を含む大型のポリペプチドを放出する。約位置１０２７−１２０７に見出されるＮＳ３プロテアーゼは、残存するポリタンパク質を処理するように作用する。ヘリカーゼ活性は約位置１１９３−１６５７に見出される。ポリタンパク質成熟の完了は、ＮＳ３セリンプロテアーゼによって触媒された、ＮＳ３−ＮＳ４ａ接合部にて自己触媒開裂によって開始される。次のＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３介在開裂は、別のポリペプチドのＮＳ３分子によるポリタンパク質開裂接合部の認識を含むように思われる。これらの反応において、ＮＳ３は、ＮＳ３補助因子（ＮＳ４ａ、約位置１６５８−１７１１に見出される）、２個のタンパク質（約位置１７１２−１９７２に見出されたＮＳ４ｂおよび位置１９７３−２４２０に見出されたＮＳ５ａ）、およびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（約位置２４２１−３０１１に見出されたＮＳ５ｂ）を遊離する。
【０１４９】
【表１】

＊ＨＣＶ−１に対して番号付け。例えばＣｈｏｏら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２４５１−２４５５を参照。別途指摘しない限り、ＨＣＶ構築物のすべてのアミノ酸番号付けはＨＣＶ−１に対してである。
【０１５０】
上のＨＣＶポリタンパク質生成物、それをコードするＤＮＡおよびそれに由来する免疫原性ポリペプチドの配列は既知である（例えば米国特許番号：５，３５０，６７１を参照）。例えばＨＣＶポリタンパク質に由来する多数の一般および特異性免疫原性ポリペプチドが記載されている。例えばＨｏｕｇｈｔｏｎら、欧州公開番号：３１８，２１６および３８８，２３２；Ｃｈｏｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３５９−３６２；Ｋｕｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３６２−３６４；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号：ＷＯ ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号：ＷＯ ９４／０１７７８を参照。これらの刊行物は、一般的なＨＣＶに関してはもちろんのこと、ＨＣＶポリペプチド免疫学的試薬の製造および使用に関する広範囲の背景も提供する。
【０１５１】
いずれの所望の免疫原性ＨＣＶポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡも、本発明によって利用されうる。例えばコア領域に由来するＨＣＶポリペプチド、例えばアミノ酸１−１９１；アミノ酸１０−５３；アミノ酸１０−４５；アミノ酸６７−８８；アミノ酸８６−１００；８１−１３０；アミノ酸１２１−１３５；アミノ酸１２０−１３０；アミノ酸１２１−１７０の間で見出された領域に由来するポリペプチド；および例えばＨｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許番号：５，３５０，６７１；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号：ＷＯ ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号：ＷＯ ９４／０１７７８；および米国特許番号：６，１５０，０８７に明示されたコアエピトープのいずれも、本方法で用途を見出すであろう。
【０１５２】
加えて、ウイルスの非構造領域に由来するポリペプチドも本明細書で用途を見出すであろう。Ｙａｏら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（１９９９年１１月）７：１３５３−１３６３には、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３／４ａ領域について記載され、タンパク質のアミノ酸配列および全体の構造が開示されている。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許番号：５，８４３，７５２も参照。上で説明したように、ナイーブ配列または免疫原性類似体のどちらかが本調合物で使用されうる。Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、米国特許番号：５，８４３，７５２およびＺｈａｎｇら、米国特許番号：５，９９０，２７６はどちらも、ＮＳ３／４ａの類似体およびその作製方法について記載している。
【０１５３】
その上、本組成物および方法で使用するためのポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のＮＳ３領域に由来しうる。これに限定されないが、ｃ３３およびｃ１００領域に由来するポリペプチドを含む多数のこのようなポリペプチドはもちろんのこと、ｃ２５などのＮＳ３エピトープを含む融合タンパク質も既知である。これらおよび他のＮＳ３ポリペプチドは、本方法で有用であり、当分野で既知であり、例えばＨｏｕｇｈｔｏｎら、米国特許番号：５，３５０，６７１；Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１−１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３−３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号：ＷＯ ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号：ＷＯ ９４／０１７７８；および米国特許番号：６，１５０，０８７に記載されている。
【０１５４】
加えて、米国特許番号：６，５１４，７３１および６，４２８，７９２に記載されているような複数のエピトープ融合抗原（「ＭＥＦＡ」と呼ばれる）は、本発明で使用されうる。このようなＭＥＦＡは、各種のウイルス領域の２つ以上に由来する複数のエピトープを含む。エピトープは好ましくは、１個を超えるＨＣＶ株からであり、それゆえ単一のワクチンでＨＣＶの複数の株から保護する追加の能力を供給する。
【０１５５】
上で説明したように、便宜上、各種のＨＣＶ領域は一般にＣｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２４５１に記載されたようなＨＣＶ−１ａに対するアミノ酸数に関して定義されており、イニシエータメチオニンは位置１と示される。しかしながら本発明での使用を目的としたＨＣＶポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＨＣＶ−１ａに由来するものに限定されず、ＨＣＶのいずれの株および単離物も、上で詳細に説明したように、本発明で使用するための抗原配列を供給するための基礎として作用しうる。
【０１５６】
上のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、Ｅ１Ｅ２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドについて上述した組み換え産生の方法を使用して得られる。
【０１５７】
免疫原性組成物
ひとたび産生されると、Ｅ１Ｅ２ポリヌクレオチド複合体または他の免疫原は免疫原性組成物中に、例えば予防（即ち感染を防止するための）または治療（感染後にＨＣＶを治療するための）ワクチン組成物中に供給されうる。組成物は一般に、１個以上の「製薬的に許容される賦形剤またはビヒクル」、例えば水、食塩水、グリセロール、エタノールなどを含む。加えて補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などがそのようなビヒクル中に存在しうる。
【０１５８】
担体は場合により、例えばＥ１Ｅ２に対する免疫応答をプライミングするために使用されるタンパク質組成物中に存在する。担体は、それ自体は組成物を摂取する個体に有害な抗体の産生を誘発しない分子である。
【０１５９】
適切な担体分子は通例、大型であり、低速で代謝される巨大分子、例えばタンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体（例えば油液滴またはリポソーム）、および不活性ウイルス粒子である。このような担体は当業者に周知である。その上、免疫原性ポリペプチドは、細菌トキソイド、例えばジフテリア、破傷風、コレラなどからのトキソイドにコンジュゲートされうる。
【０１６０】
アジュバントも、免疫応答を強化するために組成物中に存在しうる。本発明で使用するためのアジュバントは、これに限定されないが、下で述べる１つ以上を含む：
Ａ．無機物含有組成物
本発明のアジュバントとして使用するのに適した無機物含有組成物としては、無機塩、例えばアルミニウム塩およびカルシウム塩が挙げられる。本発明は無機塩、例えば水酸化物（例えばオキシ水酸化物）、リン酸塩（例えばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩など（例えばＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ．．．（１９９５）編者：ＰｏｗｅｌｌおとびＮｅｗｍａｎ、ＩＳＢＮ：０３０６４４８６７Ｘ．Ｐｌｅｎｕｍの第８章および第９章を参照）、または異なる無機化合物の混合物（例えばリン酸塩および水酸化物アジュバントの、場合によりリン酸塩過多の混合物）を含み、化合物はいずれかの適切な形（例えばゲル、結晶、アモルファスなど）を取り、（複数の）塩への吸着が好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子としても調合されうる（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１６１】
アルミニウム塩は、本発明のワクチン中にＡｌ３＋の用量が投薬当たり０．２〜１．０ｍｇであるようにワクチン中に含まれうる。一実施形態において、本発明で使用するためのアルミニウムベースアジュバントはアルム（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）、またはアルム誘導体、例えばリン酸緩衝液中の抗原をアルムと混合することと、続いての水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基を用いた滴定および沈殿によって所定の位置に生成されたアルム誘導体である。
【０１６２】
本発明のワクチン調合物で使用するための別のアルミニウムベースアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）または約５００ｍ２／ｇの表面積を有する、優れた吸着剤である、結晶性オキシ水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）である。あるいは水酸化アルミニウムアジュバントのヒドロキシル基の一部または全部の代わりにリン酸基を含有するリン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムが提供される。本明細書で提供される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントはアモルファスであり、酸性、塩基性および中性溶媒に可溶性である。
【０１６３】
別の実施形態において、本発明のアジュバントは、リン酸アルミニウムおよび水酸化アルミニウムの両方を含む。そのさらに詳細な実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムの水酸化アルミニウムに対する重量比で２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１またはそれ以上などの、水酸化アルミニウムよりも大量のリン酸アルミニウムを有する。なおさらに詳細には、ワクチン中のアルミニウム塩は、ワクチン用量当たり０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン用量当たり０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン用量当たり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン用量当たり約０．６ｍｇで存在する。
【０１６４】
一般に好ましい（複数の）アルミニウムベースアジュバント、または複数のアルミニウムベースアジュバントの比、例えばリン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムは、抗原が所望のｐＨでのアジュバントと反対の電荷を持つように、分子間の静電気引力の最適化によって選択される。例えばリン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）はｐＨ７．４にてリソザイムを吸着するが、アルブミンは吸着しない。アルブミンが標的であるならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択される（ｉｅｐ＝１１．４）。あるいは水酸化アルミニウムのリン酸塩による前処理は、その等電点を低下させて、それをより塩基性の抗原にとって好ましいアジュバントにする。
【０１６５】
Ｂ．油型エマルジョン
本発明のアジュバントとして使用するのに適切な油型エマルジョン組成物は、スクアレン−水エマルジョン、例えばＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％ Ｔｗｅｅｎ ８０、および０．５％ Ｓｐａｎ ８５、マイクロフルダイザを使用してサブミクロン粒子に調合した）である。その全体が参照により本明細書に組み入れられている、ＷＯ９０／１４８３７；ならびに米国特許番号：６，２９９，８８４および６，４５１，３２５を参照。Ｐｏｄｄａ、「Ｔｈｅ ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ：ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２６７３−２６８０；Ｆｒｅｙら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ，ｔｏｌｅｒａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ＭＦ５９−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎ ｎｏｎ−ｅｌｄｅｒｌｙ ａｄｕｌｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：４２３４−４２３７も参照。ＭＦ５９は、ＦＬＵＤＡ（商標）インフルエンザウイルス３価サブユニットワクチン中のアジュバントとして使用される。
【０１６６】
組成物に使用するのに特に好ましいアジュバントは、サブミクロン水中油型エマルジョンである。本明細書で使用するための好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンは、場合によりＭＴＰ−ＰＥの可変量を含有するスクアレン／水エマルジョン、例えば４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）、および／または０．２５〜１．０％ Ｓｐａｎ ８５（商標）（ソルビタントリオレアート）、および場合により、例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロン水中油型エマルジョン、例えば“ＭＦ５９”として既知の水中油型エマルジョンである（国際公開番号：ＷＯ９０／１４８３７；米国特許番号：６，２９９，８８４および６，４５１，３２５、ならびにＯｔｔら、「ＭＦ５９−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（編者：Ｐｏｗｅｌｌ、Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，ＭＪ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、ｐｐ．２７７−２９６）。ＭＦ５９は、４〜５％ｗ／ｖスクアレン（例えば４．３％）、０．２５〜０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）、および０．５％ ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５（商標）を含有し、場合により各種の量のＭＴＰ−ＰＥを含有して、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙマイクロフルダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）などのマイクロフルダイザを使用してサブミクロン粒子に調合される。例えばＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、さらに好ましくは０〜２５０μｇ／用量、および最も好ましくは０〜１００μｇ／用量の量で存在しうる。本明細書で使用するように、「ＭＦ５９−０」という用語は、ＭＴＰ−ＰＥを含まない上のサブミクロン水中油型エマルジョンを指し、これに対してＭＦ５９−ＭＴＰをいう用語はＭＴＰ−ＰＥを含有する調合物を示す。例えば「ＭＦ５９−１００」は、投薬当たりＭＴＰ−ＰＥ １００μｇを含有するなどである。本明細書で使用するための別のサブミクロン水中油型エマルジョンＭＦ６９は、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）、および０．７５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ ８５（商標）および場合によりＭＴＰ−ＰＥを含有する。なお別のサブミクロン水中油型エマルジョンはＳＡＦとしても既知であるＭＦ７５であり、１０％スクアレン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０（商標）、５％プルロニック封止ポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有して、またサブミクロンエマルジョンへとマイクロフルダイズされる。ＭＦ７５−ＭＴＰは、ＭＴＰを例えば投薬当たりＭＴＰ−ＰＥ １００〜４００μｇを含むＭＦ７５調合物である。
【０１６７】
本発明の組成物で使用するためのサブミクロン水中油型エマルジョン、その作製方法および免疫刺激剤、例えばムラミルペプチドは、国際公開番号：ＷＯ９０／１４８３７および米国特許番号：６，２９９，８８４および６，４５１，３２５に詳細に記載されている。
【０１６８】
完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も本発明でアジュバントとして使用されうる。
【０１６９】
Ｃ．サポニン調合物
サポニン調合物も本発明でアジュバントとして使用されうる。サポニンは、広範囲の植物種の樹皮、葉、幹、根および花にすら見いだされるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種基である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａ木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして幅広く研究されてきた。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ）、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（宿根カスミソウ）、およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（カスミソウ）からも商業的に入手可能である。サポニンアジュバント調合物は、ＱＳ２１などの精製調合物はもちろんのこと、ＩＳＣＯＭなどの脂質調合物も含む。
【０１７０】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む、これらの技法を使用して特に精製された画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の産生方法は、米国特許番号：５，０５７，５４０に開示されている。サポニン調合物は、コレステロールなどのステロールも含みうる（ＷＯ９６／３３７３９を参照）。
【０１７１】
サポニンおよびコレステロールの組み合せを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独自の粒子を形成できる。ＩＳＣＯＭは通例、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。いずれの既知のサポニンもＩＳＣＯＭで使用されうる。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌ Ａ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭはさらに、ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１およびＷＯ９６／３３７３９に記載されている。場合により、ＩＳＣＯＭは追加の（複数の）洗浄剤を含まなくてもよい。ＷＯ００／０７６２１を参照。
【０１７２】
サポニンベースアジュバントの開発の総説は、Ｂａｒｒら、「ＩＳＣＯＭｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓａｐｏｎｉｎ ｂａｓｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：２４７−２７１に見いだされる。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら、「Ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｏｒａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｓａｐｏｎｉｎ ａｎｄ ＩＳＣＯＭ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９８）３２：３２１−３３８も参照。
【０１７３】
Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）も本発明でアジュバントとして使用されうる。これらの構造は一般に、場合によりリン脂質と組み合された、または調合されたウイルスからの１個以上のタンパク質を含有する。それらは一般に、非病原性で非複製的であり、一般にナイーブウイルスゲノムを一切含有しない。ウイルスタンパク質は、組み換え産生されうるか、または全ウイルスから単離されうる。ビロソームまたはＶＬＰで使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス（例えばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばコアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、はしかウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、手足口病ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えばコートタンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（例えばレトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質が挙げられる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０、ＷＯ０３／０２４４８１、およびＮｉｉｋｕｒａら、「Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｅ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｓ ａｎ Ｏｒａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｖｅｈｉｃｌｅ Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ Ｅｐｉｔｏｐｅｓ」、 Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００２）２９３：２７３−２８０；Ｌｅｎｚら、「Ｐａｐｉｌｌｏｍａｒｉｖｕｒｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ｉｎｄｕｃｅ Ａｃｕｔｅ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００１）５２４６−５３５５；Ｐｉｎｔｏら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）−１６ Ｌｌ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ Ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｗｉｔｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＨＰＶ− １６ Ｌｌ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）１８８：３２７−３３８；ならびにＧｅｒｂｅｒら「Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｒｉｓｕ Ｖｉｒｕｓ−Ｌｉｋｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ Ａｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ ｗｈｅｎ Ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｔｏｘｉｎ Ｍｕｔａｎｔ Ｒ１９２Ｇ ｏｒ ＣｐＧ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００１）７５（１０）：４７５２−４７６０でさらに議論されている。ビロソームはさらに例えばＧｌｕｃｋら、「Ｎｅｗ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００２）２０：Ｂ１０−Ｂ１６で議論されている。免疫増強再構成インフルエンザビロソーム（ＩＲＩＶ）は、経鼻３価ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品（Ｍｉｓｃｈｌｅｒ ＆ Ｍｅｔｃａｌｆｅ（２００２）Ｖａｃｃｉｎｅ ２０ Ｓｕｐｐｌ ５：Ｂ１７−２３）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ ＰＬＵＳ（商標）製品でサブユニット抗原送達システムとして使用される。
【０１７４】
Ｅ．細菌または微生物誘導体
本発明で使用するのに適したアジュバントは、次のような細菌または微生物誘導体を含む：
（１）腸内細菌リポサッカライド（ＬＰＳ）の非毒性誘導体
このような誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５または６アシル化鎖との混合物である。３Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａの好ましい「小型粒子」形は、ＥＰ ０６８９４５４に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小型粒子」は、０．２２ミクロン膜で滅菌濾過されるのに十分な小ささである（ＥＰ ０６８９４５４を参照）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリル脂質Ａ模倣薬、例えばアミノアルキルグルコサミドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９が挙げられる。Ｊｏｈｎｓｏｎら、（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ ９：２２７３−２２７８を参照。
【０１７５】
（２）脂質Ａ誘導体
脂質Ａ誘導体としては、ＯＭ−１７４などの大腸菌からの脂質Ａの誘導体が挙げられる。ＯＭ−１７４は例えば、Ｍｅｒａｌｄｉら、「ＯＭ−１７４，ａ Ｎｅｗ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｗｉｔｈ ａ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｕｓｅ，Ｉｎｄｕｃｅｓ ａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｗｉｔｈ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ２４２−３１０ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２Ｊ．：２４８５−２４９１；およびＰａｊａｋら、「Ｔｈｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ ＯＭ−１７４ ｉｎｄｕｃｅｓ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００３）２１：８３６−８４２に記載されている。
【０１７６】
（３）免疫刺激オリゴヌクレオチド
本発明でアジュバントとして使用するのに適した免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフを含有するヌクレオチド配列（非メチル化シトシンと、続くグアノシンを含有し、リン酸結合によって連結された配列）が挙げられる。パリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含有する細菌２本鎖ＲＮＡおよびオリゴヌクレオチドも免疫刺激性であることが示されている。
【０１７７】
ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／類似体を含み、２本鎖または１本鎖でありうる。場合により、グアノシンは２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどの類似体によって置換されうる。考えられる類似体置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ：ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｇｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）３１．（９）：２３９３−２４００；ＷＯ０２／２６７５７およびＷＯ９９／６２９２３を参照。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ、「ＣｐＧ ｍｏｔｉｆｓ：ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｘｔｒａｃｔｓ？」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２００３）９（７）：８３１−８３５； ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ａｎｄ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ＣｐＧ ＤＮＡ」、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）３２：１７９−１８５；ＷＯ９８／４０１００；米国特許番号：６，２０７，６４６；米国特許番号：６，２３９，１１６および米国特許番号：６，４２９，１９９にさらに記載されている。
【０１７８】
ＣｐＧ配列はＴＬＲ９、例えばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴに対して作られうる。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＣｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ ３）：６５４−６５８を参照。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮなどのようにＴｈ１免疫応答を誘発することに特異性でありうるか、ＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮなどのＢ細胞応答を誘発することに特異性でありうる。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら、「ＣｐＧ−Ａ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ＩＦＮ−ｇａｍｍａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１０ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｓ Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｄｅｒｉｖｅｄ ＩＦＮ−ａｌｐｈａ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００３）１７０（８）：４０６１−４０６８；Ｋｒｉｅｇ、「Ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ ｏｎ ＣｐＧ」、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２）２３（２）：６４−６５およびＷＯ０１／９５９３５に記載されている。
【０１７９】
好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、レセプタ認識のために５’末端にアクセスできるように構築される。場合により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列がその３’末端に結合されて「イムノマー」を形成しうる。例えばＫａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ＣｐＧ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｆｆｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、ＢＢＲＣ（２００３）３０６：９４８−９５３；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら、「Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ９：ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｎｏｖｅｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＧｐＧ ＤＮＡｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ（２００３）３１（ｐａｒｔ ３）：６６４−６５８；Ｂｈａｇａｔら、「ＣｐＧ ｐｅｎｔａ−ａｎｄ ｈｅｘａｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ」ＢＢＲＣ（２００３）３００：８５３−８６１およびＷＯ０３／０３５８３６を参照。
【０１８０】
（４）ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体
細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体は、本発明でアジュバントとして使用されうる。好ましくは、タンパク質は大腸菌（即ち大腸菌易熱性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒ＡＤＰ−リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用はＷＯ９５／１７２１１に、非経口アジュバントとしてはＷＯ９８／４２３７５に記載されている。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１ ９２Ｇなどの解毒ＬＴミュータントである。ＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、次の参考文献に見出されうる：Ｂｅｉｇｎｏｎら、「Ｔｈｅ ＬＴＲ７２ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ Ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ Ｅｌｉｃｉｔ ＣＤ４＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｓｅｃｒｅｔｅ Ｇａｍｍａ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｆｔｅｒ Ｃｏ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｂａｒｅ Ｓｋｉｎ」、 Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）７０（６）：３０１２−３０１９；Ｐｉｚｚａら、「Ｍｕｃｏｓａｌ ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｎｏｎ ｔｏｘｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ＬＴ ａｎｄ ＣＴ ａｓ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ（２００１）１９：２５３４−２５４１；Ｐｉｚｚａら、「ＬＴＫ６３ ａｎｄ ＬＴＲ７２，ｔｗｏ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２０００）２９０（４−５）：４５５−４６１；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら、「Ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｅｘｏｔｏｘｉｎｓ，Ｓｕｂｕｎｉｔｓ ａｎｄ Ｕｎｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０００）６８（９）：５３０６−５３１３；Ｒｙａｎら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｈｅａｔ−Ｌａｂｉｌｅ Ｔｏｘｉｎ Ａｃｔ ａｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｕｃｏｓａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ Ｎａｓａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａｎ Ａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ Ｖａｃｃｉｎｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｎｔｏｘｉｃ ＡＢ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ Ｔｈ１ ａｎｄ Ｔｈ２ Ｃｅｌｌｓ」Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）６７（１２）：６２７０−６２８０；Ｐａｒｔｉｄｏｓら、「Ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｎｔ ＬＴＫ６３ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｃｏ−ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）６７（３）：２０９−２１６；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら、「Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ａｓ ｓａｆｅ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅｓ（２００３）２（２）：２８５−２９３；およびＰｉｎｅら、（２００２）「Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａ ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｈｅａｔ ｌａｂｉｌｅ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（ＬＴＫ６３）」Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ（２００２）８５（１−３）：２６３−２７０。アミノ酸置換基の参照番号は、好ましくは、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（１９９５）１５（６）：１１６５−１１６７で述べられたＡＤＰ−リボシル化毒素ＡおよびＢサブユニットの配列比較に基づいている。
【０１８１】
Ｆ．生体接着剤および粘膜接着剤
生体接着剤および粘膜接着剤も本発明でアジュバントとして使用されうる。適切な生体接着剤は、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら（２００１）Ｊ．Ｃｏｎｔ．Ｒｅｌｅ．７０：２６７−２７６）またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカライドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体などの粘膜接着剤を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明でアジュバントとして使用されうる。例えばＷＯ９９／２７９６０。
【０１８２】
Ｇ．微小粒子
微小粒子も本発明でアジュバントとして使用されうる。生分解性および非毒性である物質（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）とポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）から形成された微小粒子（即ち直径〜１００ｎｍ〜１５０μｍの、さらに好ましくは直径〜２００ｎｍ〜３０μｍの、最も好ましくは直径〜５００ｎｍ〜１０μｍの）が好ましく、場合により負に帯電した表面（例えばＳＤＳによって）または正に帯電した表面（例えばカチオン性洗浄剤、例えばＣＴＡＢによって）を有するように処理される。
【０１８３】
Ｈ．リポソーム
アジュバントとしての使用に適したリポソーム調合物の例は、米国特許番号：６，０９０，４０６、米国特許番号：５，９１６，５８８、およびＥＰ ０ ６２６ １６９に記載されている。
【０１８４】
Ｉ．ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステル調合物
本発明での使用に適したアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる。ＷＯ９９／５２５４９。このような調合物は、オクトオキシノールと組み合せたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）はもちろんのこと、オクトオキシノールなどの少なくとも１個の追加の非イオン性界面活性剤と組み合せたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤をさらに含む（ＷＯ０１／２１１５２）。
【０１８５】
好ましいポリオキシエチレンエーテルは、次の群：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ ９）、ポリオキシエチレン−９−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステロイルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテルより選択される。
【０１８６】
Ｊ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）
ＰＣＰＰ調合物は例えば、Ａｎｄｒｉａｎｏｖら、「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ ｂｙ ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｐｏｌｙｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）１９（ｌ−３）：１０９−ｌ１５およびＰａｙｎｅら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ Ｍａｔｒｉｃｅｓ」、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗ（１９９８）３１．（３）：１８５−１９６に記載されている。
【０１８７】
Ｋ．ムラミルペプチド
本発明でアジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−１−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１８８】
Ｌ．イミダゾキノリン化合物
本発明でアジュバントとしての使用に適したイミダゾキノリン化合物の例としては、Ｓｔａｎｌｅｙ、「Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ： ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｄｅｒｍａｔｏｌ（２００２）２７（７）：５７１−５７７；Ｊｏｎｅｓ、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ ３Ｍ」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ（２００３）４（２）：２１４−２１８；ならびに米国特許番号：４，６８９，３３８、５，３８９，６４０、５，２６８，３７６、４，９２９，６２４、５，２６６，５７５、５，３５２，７８４、５，４９４，９１６、５，４８２，９３６、５，３４６，９０５、５，３９５，９３７、５，２３８，９４４、および５，５２５，６１２でさらに記載されている、Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄおよびその類似体が挙げられる。
【０１８９】
Ｍ．チオセミカルバゾン化合物
チオセミカルバゾン化合物の例はもちろんのこと、本発明でのアジュバントとしての使用に適した化合物すべての調合、製造およびスクリーニング方法としては、ＷＯ０４／６０３０８に記載されているものが挙げられる。チオセミカルバゾンは、サイトカイン、例えばＴＮＦ−αの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１９０】
Ｎ．トリプタントリン化合物
トリプタントリン化合物の例はもちろんのこと、本発明でのアジュバントとしての使用に適した化合物すべての調合、製造およびスクリーニング方法としては、ＷＯ０４／６４７５９に記載されているものが挙げられる。トリプタントリン化合物は、サイトカイン、例えばＴＮＦ−αの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１９１】
本発明は、上に明示したアジュバントの１個以上の態様の組み合せも含みうる。例えば次のアジュバント組成物が本発明で使用されうる：
（１）サポニンおよび水中油型エマルジョン（ＷＯ９９／１１２４１）；
（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）（ＷＯ９４／００１５３を参照）；
（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；
（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（場合により＋ステロール）（ＷＯ９８／５７６５９）；
（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合せ（欧州特許出願番号：０８３５３１８、０７３５８９８および０７６１２３１を参照）。
【０１９２】
（６）サブミクロンエマルジョンにマイクロフルダイズされたか、またはより大きい粒経のエマルジョンを生成するためにボルテックスされた、１０％スクアラン、０．４％ Ｔｗｅｅｎ ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ。
【０１９３】
（７）２％スクアレン、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ８０、およびモノホスホリピッドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））から成る群からの１個以上の細菌細胞壁成分を含有する、Ｒｉｂｉ（商標）アジュバントシステム（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；
（８）１個以上の無機塩（例えばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば３ｄＰＭＬ）。
【０１９４】
（９）１個以上の無機塩（例えばアルミニウム塩）＋免疫刺激オリゴヌクレオチド（例えばＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列）。
【０１９５】
Ｏ．ヒト免疫調節物質
本発明でのアジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節物質としては、サイトカイン、例えばインターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子が挙げられる。
【０１９６】
アルミニウム塩およびＭＦ５９は、注射用インフルエンザワクチンによる使用のための好ましいアジュバントである。細菌毒素および生体接着剤は、粘膜送達ワクチン、例えば経鼻ワクチンによる使用のための好ましいアジュバントである。上で引用した特許、特許出願および雑誌記事すべての内容は、本明細書で完全に述べられたかのように参照により組み入れられている。
【０１９７】
本発明での使用のための組成物は、Ｅ１Ｅ２複合体をコードするＤＮＡの治療的有効量（またはタンパク質の治療的有効量）および上記の成分の他のいずれかを必要に応じて含むであろう。「治療的有効量」とは、それが投与される個体において免疫応答、好ましくは保護免疫応答を誘発するであろうタンパク質またはそれをコードするＤＮＡの量を意味する。このような応答は一般に、対象において組成物に対する抗体介在および／あるいは分泌または細胞免疫応答の発生を引き起こすであろう。通常、このような応答は、これに限定されないが、次の効果の１つ以上；免疫クラスのいずれかからの抗体、例えば免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭの産生；ＢおよびＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、成長および分化シグナルの供給；ヘルパーＴ細胞、サプレッサＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞および／またはγδＴ細胞個体群の増殖；を含む。
【０１９８】
Ｅ１Ｅ２タンパク質組成物は、例えば１個を超えるウイルス単離物に由来するＥ１Ｅ２複合体などのＥ１Ｅ２複合体の１個以上の混合物はもちろんのこと、追加のＨＣＶ抗体も含みうる。その上、上で説明したように、Ｅ１Ｅ２複合体は、クリッピングおよびタンパク質分解開裂のために分子の異種混合物として存在しうる。それゆえＥ１Ｅ２複合体を含む組成物は、Ｅ１Ｅ２の複数の種、例えばアミノ酸７４６で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２７４６），アミノ酸８０９で終結するＥ１Ｅ２（Ｅ１Ｅ２８０９）、または上記の他の各種のＥ１およびＥ２分子のいずれか、例えば１〜２０アミノ酸のＮ末端切断のあるＥ２分子、例えばアミノ酸３８７、アミノ酸４０２、アミノ酸４０３にて開始するＥ２種などを含みうる。
【０１９９】
上で説明したように、組成物（ＤＮＡおよびタンパク質の両方）が、他の抗原および免疫調節剤、例えば免疫グロブリン、サイトカイン、リンホカイン、およびこれに限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など（例えば国際公開番号：ＷＯ ９９／４４６３６を参照）、修飾ＩＬ−２（ｃｙｓｌ２５→ｓｅｒｌ２５）などのケモカインを含むケモカイン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンおよびペグ化インターフェロン、例えばγ−インターフェロン、ＩＰ−１０、ＭＩＰｌβ、ＦＬＰ−３、リバビリン、ＲＡＮＴＥＳ、ＳｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリメラーゼのインヒビタ、ヘリカーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、プロテアーゼ、グリコシル化、メタロプロテアーゼ、および／またはＩＲＥＳと併せて投与されうる。それゆえ本発明は、ＨＣＶ感染を治療するための他の治療計画によって使用されうる。他の組成物と組み合せて使用する場合、このような組成物はＥ１Ｅ２組成物の前に、Ｅ１Ｅ２組成物と同時に、Ｅ１Ｅ２組成物の次に投与されうる。
【０２００】
ＨＣＶ特異的なＴ細胞
生体内または試験管内で発現された上記のＥ１Ｅ２複合体によって活性化されるＴＣＶ特異的なＴ細胞は好ましくは、Ｅ１および／またはＥ２ポリペプチドなどのＨＣＶポリペプチドのエピトープ、あるいはＥ１Ｅ２複合体を認識する。ＨＣＶ特異的なＴ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋でありうる。
【０２０１】
ＨＣＶ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は好ましくは、ＭＨＣクラスＩ分子によって複合体化されたＥ１および／Ｅ２エピトープを提示するＨＣＶ感染細胞を死滅させうる細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。ＨＣＶ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）も発現しうる。ＨＣＶ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば５１Ｃｒ放出アッセイによって検出されうる（実施例を参照）。５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞がＥ１、Ｅ２またはＥ１Ｅ２エピトープを提示する標的細胞を溶解させる能力を測定する。ＩＦＮ−γを発現するＨＣＶ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、免疫学的方法によって、好ましくはＥ１、Ｅ２またはＥ１Ｅ２ポリペプチドを用いた試験管内刺激後のＩＦＮ−γの細胞内染色によっても検出されうる（実施例を参照）。
【０２０２】
生体内または試験管内で発現された、上記のＥ１Ｅ２複合体によって活性化されたＨＣＶ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、好ましくは、ＨＣＶ感染細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合された、Ｅ１Ｅ２複合体のエピトープを含むＥ１および／またはＥ２ポリペプチドのエピトープを認識して、Ｅ１Ｅ２複合体を用いた刺激に応答して増殖する。
【０２０３】
ＨＣＶ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、リンパ球増殖アッセイによって検出されうる（実施例を参照）。リンパ球増殖アッセイは、ＨＣＶ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞がＥ１、Ｅ２および／またはＥ１Ｅ２エピトープに対して応答して増殖する能力を測定する。
【０２０４】
ＨＣＶ特異的なＴ細胞を活性化する方法
Ｅ１Ｅ２タンパク質またはポリヌクレオチドは、例えば試験管内または生体内のどちらかでＨＣＶ特異的なＴ細胞を活性化するために、免疫応答を刺激するために使用されうる。ＨＣＶ特異的なＴ細胞の活性化は、特にＨＣＶに対するＣＴＬ応答を最適化するためのモデル系を提供するために、そしてＨＣＶ感染に対する予防または治療処置を提供するために使用されうる。試験管内活性化では、タンパク質は好ましくは、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば上記のようなアルファウイルスベクターを介してＴ細胞に供給される。
【０２０５】
Ｔ細胞のポリクローナル個体群は、ＨＣＶに感染した哺乳類の、血液に、好ましくは末梢リンパ器官、例えばリンパ節、脾臓、または胸腺に由来しうる。好ましい哺乳類としては、マウス、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトが挙げられる。ＨＣＶは、哺乳類における活性化ＨＣＶ特異的なＴ細胞の数を増加させるように作用する。哺乳類に由来するＨＣＶ特異的なＴ細胞は次に、試験管内でＨＣＶ Ｅ１Ｅ２をＴ細胞に添加することによって再刺激されうる。ＨＣＶ特異的なＴ細胞は次に、特に増殖、ＩＮＦ−γの産生、および試験管内でＥ１Ｅ２エピトープを提示する標的細胞を溶解させる能力について試験されうる。
【０２０６】
リンパ球増殖アッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｅ１Ｅ２エピトープペプチドを用いて培養したときには増殖するが、エピトープペプチドの非存在下では増殖しない。それゆえＨＣＶ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識される詳細なＥ１およびＥ２エピトープまたは他のＨＣＶ抗原は、リンパ球増殖アッセイを使用して同定されうる。
【０２０７】
同様に、上記のＨＣＶタンパク質を用いた試験管内刺激後のＨＣＶ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γの検出は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激してＩＦＮ−γを産生させるのに特に有効であるＥ１、Ｅ２、およびＥ１Ｅ２エピトープまたは他のＨＣＶ抗原を同定するのに使用されうる（実施例を参照）。
【０２０８】
さらに５１Ｃｒ放出アッセイは、ＨＣＶに対するＣＴＬ応答のレベルを判定するのに有用である。Ｃｏｏｐｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：４３９−４４９を参照。例えばＨＣＶ活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＨＣＶ感染哺乳類の肝臓に由来しうる。これらのＴ細胞は、５１Ｃｒ放出アッセイで例えばＥ１Ｅ２エピトープを提示する標的細胞に対して試験されうる。各標的細胞個体群がＥ１Ｅ２の異なるエピトープを提示するために、異なるＥ１Ｅ２エピトープを発現する複数の標的細胞個体群が構築されうる。ＨＣＶ特異性ＣＤ８＋細胞は、これらの標的細胞個体群のそれぞれに対してアッセイされうる。５１Ｃｒ放出アッセイの結果を使用して、ＨＣＶに対して最強のＣＴＬ応答を担うＥ１Ｅ２のエピトープを決定することができる。最強のＣＴＬ応答を担うエピトープを含有するＥ１Ｅ２複合体は次に、５１Ｃｒ放出アッセイに由来する情報を使用して構築されうる。
【０２０９】
投与
通例、免疫原性組成物（ＤＮＡおよびタンパク質の両方）は、液体液剤または懸濁剤のどちらかとしての注射用剤として調製される；注射前に液体ビヒクルへの溶解または懸濁に適した固体形も調製されうる。それゆえいったん調合されると、組成物は例えば皮下または筋肉内に注射によって非経口的に好都合に投与される。他の投与様式に適した追加の調合物としては、経口および肺調合物、坐剤、および経皮施用が挙げられる。
【０２１０】
投薬治療は単回プライミング投薬および単回ブーストでありうるか、または複数回用量スケジュールでありうる。投薬間（プライミングおよびブースト）の間隔は、患者の年齢および組成物の性質などの因子に従って変化し、これらの因子は医師によって評価されうる。初回プライミングおよびブースト用量の投与は一般に、少なくとも２週間、通例は４週間の間隔を置く。本発明の方法は、１回を超えるプライミング投薬および／または１回を超えるブースト投薬、例えば２回以上のプライミング投薬と、続く２回以上のブースター投薬を含みうる。「メモリ」ブーストという用語は、初回ブースト後に与えられるいずれかのブースト投薬を指す。「メモリ」ブーストが投与される時間は、初回ブーストから数時間（例えば１〜７２時間またはその間のいずれかの時点）または数日（例えば１〜９０日またはその間のいずれかの時点）から数か月（例えば１〜３６か月またはその間のいずれかの時点）または数年すら変化しうる。１回を超えるメモリブーストは、相互に対して同じまたは異なる時間間隔で投与されうる。同じまたは異なる免疫原性組成物が各プライミング投薬に使用されうる。プライミングおよびブースト投薬はしたがって、それらのタイミングではなくて、投与経路によって区別されうる。
【０２１１】
好ましくは、投与された量は疾患症状の治療または予防を引き起こすのに十分である。正確な必要量は他の因子の中で特に、治療される患者；治療される個体の年齢および全身状態；免疫応答に関与する個体の免疫系の能力；所望の保護度；治療される状態の重症度；選択された特定の巨大分子およびその投与様式によって変化するであろう。適切な有効量は、当業者によって容易に決定されうる。「治療的有効量」は、当分野で既知の試験管内および生体内モデルを使用した日常的な試験によって決定されうる比較的広範な範囲に当てはまるであろう。下の実施例で使用するＥ１Ｅ２核酸およびポリペプチドの量は、例えば生体内でＨＣＶ特異的なＴ細胞を活性化するために、ＨＣＶ特異性細胞免疫応答の誘発を最適化するのに使用されうる一般的な指針を与える。
【０２１２】
例えば免疫原は好ましくは、霊長類などの大型哺乳類、例えばヒヒ、チンパンジー、またはヒトに筋肉内注射される。Ｅ１Ｅ２タンパク質の送達では、投薬当たり免疫原０．１μｇ〜約５．０ｍｇ、または示した範囲の任意の量、例えば投薬当たり５μｇ〜約１０ｍｇ、１μｇ〜約２ｍｇ、２．５μｇ〜約２５０μｇ、４μｇ〜約２００μｇ、例えば４、５、６、７、８、９、１０．．．２０．．．３０．．．４０．．．５０．．．６０．．．７０．．．８０．．．９０．．．１００μｇなどが送達されるであろう。ブースター投与では、送達されるＥ１Ｅ２核酸構築物の量は、使用される場合はベクターに依存するであろう。例えばＥ１Ｅ２ ＤＮＡがウイルスベクターなしで送達される場合、ＤＮＡ約１μｇ〜５００ｍｇ、例えばＤＮＡ５μｇ〜１００ｍｇ、例えばＤＮＡ １０μｇ〜５０ｍｇ、または１０μｇ〜５ｍｇ、例えば２０．．．３０．．．４０．．．５０．．．６０．．．１００．．．２００μｇなど〜５００μｇ、および示した範囲の任意の整数は、本方法で用途を見出すであろう。アルファウイルスレプリコンなどのウイルスベクターを送達に使用する場合、一般に有効量はウイルスベクターの約１０５〜１０２０感染単位、さらに好ましくはウイルスベクターの１０８〜１０１５の、なおさらに好ましくは約１０１０〜１０１３感染単位、またはこれらの範囲内の任意の値を含むであろう。
【０２１３】
本発明のＥ１Ｅ２核酸構築物は、標準遺伝子送達プロトコルを使用して投与される。遺伝子送達の方法は当分野で既知である。例えば米国特許番号：５，３９９，３４６、５，５８０，８５９、５，５８９，４６６を参照。Ｅ１Ｅ２核酸構築物は、脊椎動物対象に直接送達されるか、あるいは生体外で対象に由来する細胞に送達されて、細胞が対象に再植え込みされるかのどちらかである。
【０２１４】
Ｅ１Ｅ２ポリペプチドおよび核酸の投与は、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上続く、細胞免疫応答、および／または抗Ｅ１、抗Ｅ２および／または抗Ｅ１Ｅ２抗体力価を哺乳類にて誘発しうる。上で説明したように、Ｅ１Ｅ２核酸はメモリ応答を提供するためにも投与されうる。このような応答が達成されると、抗体力価または細胞免疫応答は経時的に低下しうるが、しかしながらＨＣＶウイルスまたは免疫原への曝露は、例えばわずか２、３日以内で抗体および／または細胞免疫応答の迅速な誘発を引き起こす。場合により、このような応答は哺乳類において、上で説明したようなＥ１Ｅ２核酸構築物の１回以上のブースター注射を初回注射の２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年またはそれ以上後に供給することによって維持されうる。
【０２１５】
本発明の方法による使用のための組成物は、例えば特に５１Ｃｒ放出アッセイ、リンパ球増殖アッセイによって、またはＩＦＮ−γの細胞内染色によって測定されたようにＨＣＶ特異的なＴ細胞を活性化するために、使用した特定の組成物に適合する方法で、そして免疫応答を刺激するのに有効な量で投与される。タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＨＣＶに感染していない哺乳類に投与されうるか、またはＨＣＶ感染哺乳類に投与されうるかのどちらかである。本発明の組成物の有効量は、日常的な実験のみを使用して容易に決定されうる。上記の試験管内および生体内モデルは、適切な用量を識別するために使用されうる。後述する実施例で使用したタンパク質およびポリヌクレオチドの量は、ＨＣＶ特異的なＴ細胞の生体内または試験管内どちらかでの活性化を最適化するために使用されうる一般的指針を提供する。
【実施例】
【０２１６】
下は、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は例示的目的のためだけに与えられ、本発明の範囲を決して制限するものではない。
【０２１７】
使用した数字（例えば量、温度など）に関して正確を期するための努力が払われたが、一部の実験誤差および偏差はもちろん許容されるべきである。
【０２１８】
物質および方法
酵素は市販供給元から購入して、製造者の指示に従って使用した。
【０２１９】
ＤＮＡ断片の単離では、記載した場合を除いて、すべてのＤＮＡ操作は標準手順に従って実施した。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上を参照。制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、クレノウ断片、および他の生物試薬は市販の供給者から購入して、標準手順に従って実施した。２本鎖ＤＮＡ断片をアガロースゲル上で分離した。
【０２２０】
化学試薬の供給源は一般に、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ；Ａｌｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ；Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮを含む。
【０２２１】
Ｅ１Ｅ２８０９タンパク質の産生
プラスミドｐＣＭＶｔｐａＥｌＥ２ｐ７（６２７５ｂｐ）は、アミノ酸１９２から８０９をコードするＨＣＶ−１を上流組織プラスミノゲン活性化物質（ｔｐａ）シグナル配列によってｐｎｅｗＣＭＶ−ＩＩ発現ベクター内へクローニングすることによって構築した。ｐｎｅｗＣＭＶベクターは、次の要素：ｐＵＣ１９ベースクローニングベクターである：ＳＶ４０複製起点、ヒトＣＭＶエンハンサ／プロモータ、ヒトＣＭＶイントロン、ヒト組織プラスミノゲン活性化物質（ｔＰＡ）リーダー、ウシ成長ホルモンポリＡターミネータおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０２２２】
Ｅ１Ｅ２８０９は、先に記載されているように組み換えＣＨＯ細胞から発現された（Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９−８３０）。Ｅ１Ｅ２複合体は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００洗浄剤を用いてＣＨＯ細胞内から抽出した。Ｅ１Ｅ２複合体は、スノードロップレクチンアガロース（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆ．）クロマトグラフィーおよび高速流Ｓ−セファロースカチオン交換クロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して精製した。
【０２２３】
Ｅ１Ｅ２８０９ポリヌクレオチドを発現することによって産生されたＥ１Ｅ２複合体２μｇは、サブミクロン水中油型エマルジョンＭＦ５９によって乳化させた。ＭＦ５９はＣｈｉｒｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍａｒｂｕｒｇにて製造され、先に詳細に記載されている（Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（編者：Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，ＭＪ．）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９５年、ｐｐ．２７７−２９６）。
【０２２４】
Ｅ１Ｅ２８０９をコードするアルファウイルス
複製欠損アルファウイルス粒子は、外来抗原の高レベル発現、ヒトにおける既存の免疫性、樹状細胞のターゲッティング、および生得の免疫性の強力な刺激のために、効率的なワクチン送達プラットフォームである。特に、選択した所望の品質のシンドビスウイルス（ＳＩＮ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）を組み合せるＶＥＥ／ＳＩＮレプリコン粒子キメラが使用された。このようなキメラは、その全体が参照により本明細書に組み入れられている、Ｐｅｒｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２００３）７７：１０３９４−１０４０３ならびに特許公報番号：２００３０２３２３２４および２００３０１４８２６２に記載されている。
【０２２５】
細胞株の増殖および感染
ＢＨＫ−２１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１０ｍＭピルビン酸ナトリウム、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）中で３７℃、５％ＣＯ２下で維持した。約８０％コンフルエントの細胞単層をレプリコン粒子によって、１％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で３７℃にて１時間感染させて、次に１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で一晩インキュベートした。
【０２２６】
レプリコンベクターおよび不完全ヘルパー構築物
ＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１はＶＣＲ（Ｐｅｒｒｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３年、７７：１０３９４−４０３）から、（ｉ）ＰＣＲ増幅シンドビスウイルス（ＳＩＮ）パッケージング配列（ＳｌＮゲノムのｎｔ９４５−１０７６）をｎｔ５４９３および５５９５のＸｈｏｌ部位間のベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）非構造タンパク質遺伝子３（ｎｓＰ３）遺伝子内にインフレーム融合として挿入することと、（ｉｉ）ＶＥＥ ３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）を、先に公開されたＳＩＮ由来レプリコンベクター、ＳＩＮＣＲからのＳＩＮ ３’ＵＴＲによって置換することと（Ｐｅｒｒｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３年、７７：１０３９４−４０３）によって得た。キメラベクター内への挿入のためのＥ１Ｅ２（７４６）およびＥ１Ｅ２ｐ７（８０９）遺伝子断片は、ｐＣＭＶｔｐａＥ１Ｅ２ｐ７のＰＣＲ増幅によって生成し、次にｃＤＮＡをＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１レプリコンベクター内に挿入すると、構築物ＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ １Ｅ２７４６およびＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２８０９が生じた。
【０２２７】
ＨＣＶタンパク質を発現するアルファウイルスレプリコン粒子の産生
ＳＩＮからカプシドまたはエンベロープ糖タンパク質のどちらかをコードする配列を、ＶＥＥベース不完全ヘルパー主鎖（ＶＣＲ−ＤＨ）内に挿入した（Ｐｅｒｒｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３年、７７：１０３９４−４０３）。
【０２２８】
キメラレプリコン粒子は、先に記載されているように、レプリコンおよび一方がカプシドタンパク質を発現して、他方がエンベロープ糖タンパク質を発現する２個の不完全ヘルパー試験管内転写ＲＮＡの同時電気穿孔によって生成した（Ｐｅｒｒｉら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３年、７７：１０３９４−４０３）。
【０２２９】
ＨＣＶ−Ｅ１Ｅ２７４６またはＥ１Ｅ２８０９を発現するレプリコン粒子を電気穿孔の２４時間後に培養上清として回収して、濾過によって浄化し、カチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レプリコン粒子力価は、粒子の連続希釈物によるＢＨＫ−２１細胞の一晩の感染後に、発現されたＥ１およびＥ２の細胞内染色によって決定した。感染細胞はＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して透過処理および固定して、次にＨＣＶ Ｅ１またはＥ２抗原に対するフルオレセインイソチオシアナートコンジュゲート抗体によって染色した。フローサイトメトリー分析を使用して、Ｅ１またはＥ２陽性細胞を決定して、力価を計算するのに使用した。汚染複製可能ウイルスの非存在は、ナイーブＢＨＫ−２１細胞の５回の連続感染および力価の決定によって決定した。最後に、エンドトキシンレベルをすべてのレプリコン粒子サンプルについて測定して、＜０．５エンドトキシン単位／ｍｌであることが示された。
【０２３０】
ＮＳポリタンパク質
ＨＣＶ活性化Ｔ細胞のＴ細胞受容体によって認識されたエピトープも例えば、５Ｃｒ放出アッセイによって、またはリンパ球増殖アッセイによって同定されうる（実施例を参照）。５Ｃｒ放出アッセイでは、エピトープをコードするポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングして、発現ベクターを標的細胞内へ形質転換することによって、興味のあるエピトープを提示する標的細胞が構築されうる。ＨＣＶ３０特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えばＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープを提示する標的細胞を溶解させて、このようなエピトープを提示しない細胞を溶解させないであろう。リンパ球増殖アッセイにおいて、ＨＣＶ活性化ＣＤＥ４＋Ｔ細胞は、例えばＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂ、ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａ、またはＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ａＮＳ５ｂエピトープペプチドによって培養されたときに増殖するが、ＨＣＶエピトープペプチドの非存在下では増殖しない。
【０２３１】
Ｅ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドは、融合タンパク質においていずれの順序ででも発生しうる。所望ならば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０以上の、１個以上のポリペプチドが融合タンパク質において発生する。ＨＣＶの多重ウイルス株が発生し、これらの株のいずれのＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、およびＮＳ５ｂポリペプチドも融合タンパク質において使用されうる。本発明での使用のための代表的な融合タンパク質を図７に示し、アミノ酸番号付けはＨＣＶ−１ポリタンパク質に対してである。
【０２３２】
ＮＳ３４５ポリタンパク質を発現するアルファウイルス
レプリコンベクターおよび不完全ヘルパー構築物
ＮＳ３４５をコードする核酸はＮＳ３−ＮＳ５のＰＣＲ増幅によって生成して、次にｃＤＮＡ（ａａ１０２７−３０１２）をＶＣＲ−Ｃｈｉｍ２．１（Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００３年、７７：１０３９４−４０３）レプリコンベクターに挿入して、構築物ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＮＳ３４５を生じさせた。
【０２３３】
アルファウイルスレプリコン粒子の産生
ＨＣＶ−ＮＳ３４５を発現するレプリコン粒子を電気穿孔の２４時間後に培養上清として回収して、濾過によって浄化し、カチオン交換クロマトグラフィーによって精製した。レプリコン粒子力価は、粒子の連続希釈物によるＢＨＫ−２１細胞の一晩の感染後に、発現されたＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂの細胞内染色によって決定した。感染細胞はＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して透過処理および固定して、ＨＣＶ ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂに対する抗体およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８−コンジュゲート抗マウスＩｇＧによって染色した。フローサイトメトリー分析を使用して、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂ陽性細胞を決定して、力価を計算するのに使用した。汚染複製可能ウイルスの非存在は、ナイーブＢＨＫ−２１細胞の５回の連続感染および力価の決定によって決定した。最後に、エンドトキシンレベルをすべてのレプリコン粒子サンプルについて測定して、＜０．０３エンドトキシン単位／ｍｌであることが示された。
【０２３４】
グループ当たり１０匹のｂａｌｂ／ｃマウスに指示した物質を０、３および６週に筋肉内注射した。プライム−ブースト実験では、マウスを０および３週にプライミングして、６週にブーストした。我々は注射に、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ＣＳＬ）５μｇと混合した、ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＮＳ３４５の５Ｅ６複製粒子およびポリタンパク質（ＮＳ３４５ｃｏｒｅ）５０μｇを使用した。マウスを８週に殺処分して、脾臓を回収してＣＤ４およびＣＤ８応答を検出した。
【０２３５】
細胞内染色（ＩＣＳ）
脾臓細胞（１Ｅ×６）を抗ＣＤ２８（ｌμｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の存在下で指示したペプチド１０μｇ／ｍｌによって３７℃にて６時間刺激して、次にＣＤ８の抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって染色した。細胞を次にＩＦＮ−γ染色（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のために固定および透過処理した。染色後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＮＦ−γおよびＣＤ８二重陽性個体群を表す。
ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａまたはＮＳ５ｂプール：ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａまたはＮＳ５ｂ領域をカバーする２０ｍｅｒ重複ペプチド。
ＮＳ３−１ ｐｅｐ：ＬＶＡＬＧＩＮＡＶＡＹＹＲＧＬ（配列番号：６）（Ｓｉｍｏｎ、Ｃｏｒｎｅｌｌら、２００３年）
ＮＳ３−２ ｐｅｐ：ＴＴＶＲＬＲＡＹＭＮＴＰＧＬＰ（配列番号：７）（Ｓｉｍｏｎ、Ｃｏｒｎｅｌｌら、２００３年）
ＮＳ３−３ ｐｅｐ：ＳＳＰＰＶＶＰＱＳＦ（配列番号：８）（Ａｒｒｉｂｉｌｌａｇａ、ｄｅ Ｃｅｒｉｏら、２００２年；Ａｒｒｉｂｉｌｌａｇａ、Ｓａｒｏｂｅら、２００５年）。
ＮＳ５ｂ ｐｅｐ：ＭＳＹＳＷＴＧＡＬＶＴＰＣＡＡＥ（配列番号：９）（Ｕｎｏ−Ｆｕｒｕｔａ，Ｍａｔｓｕｏら、２００３年）
ＳＯＤ−Ｃ１００：酵母から精製した組み換えＮＳ４タンパク質
ＳＯＤ−ＮＳ５：酵母から精製した組み換えＮＳ５Ａ／Ｂタンパク質。
【０２３６】
インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の細胞内染色
ＩＦＮ−γの細胞内染色を使用して、下に示すように、Ｅ１またはＥ２プールペプチドによる試験管内刺激後にＩＦＮ−γを分泌するＣＤ８＋Ｔ細胞、あるいは個々のＣＤ４ Ｅ２またはＣＤ８ Ｅ２ペプチドを同定した。詳細には、脾臓細胞１ｘ１０６個を、抗ＣＤ２８（ｌμｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）およびＢｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）の存在下で図４に示したＥ１またはＥ２ペプチド１０μｇ／ｍｌによって３７℃にて６時間刺激して、次にＣＤ８の抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって染色した。細胞を次にＩＦＮ−γ染色ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のために固定および透過処理した。染色後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【０２３７】
データは、ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＮＦ−γおよびＣＤ８二重陽性個体群を表す。
【０２３８】
Ｅ１プール：Ｅ１領域をカバーする２０ｍｅｒ重複ペプチド。
【０２３９】
Ｅ２プール：Ｅ２領域をカバーする２０ｍｅｒ重複ペプチド。
【０２４０】
ＣＤ４ Ｅ２ ｐｅｐ：ＱＴＨＴＴＧＧＱＡＧＨＱＡＨＳＬＴＧＬＦＳＰＧＡＫＱＮ（配列番号：４）（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：１１５９８−１１６０７）。
【０２４１】
ＣＤ８ Ｅ２ ｐｅｐ：ＤＡＴＹＳＲＣＧＳＧＰＷＩＴＰＲＣＬＶＤ（配列番号：５）（Ｚｕｃｃｈｅｌｌｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：１１５９８−１１６０７）。
【０２４２】
本明細書に記載したＮＳタンパク質および融合タンパク質のエピトープは複数の方法によって同定されうる。例えば上のいずれかの組み合せを含むＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、ＮＳ５ｂポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えばポリペプチドまたはタンパク質のモノクローナル抗体免疫親和性精製によって単離されうる。単離タンパク質配列は次に、精製タンパク質のタンパク質分解開裂によって、共にタンパク質配列全体に及ぶ一連の２０個の短いペプチドを調製することによってスクリーニングされうる。例えば１００ｍｅｒポリペプチドで開始することによって、各ポリペプチドはＨＣＶ活性化Ｔ細胞のＴ細胞受容体によって認識されたエピトープの存在について試験することが可能であり、次に同定された１００ｍｅｒからの徐々に小さくなる重複断片が試験されて興味のあるエピトープをマッピングできる。
【０２４３】
（実施例１）
Ｅ１Ｅ２またはＥ１Ｅ２Ｐ７レプリコンを使用するマウスの免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＰＢＳ（ｎａｉｖｅ）、ＶＥＥ／ＳＩＮキメラアルファウイルスレプリコン（Ｖ／Ｓ−Ｅ１Ｅ２およびＶ／Ｓ−Ｅ１Ｅ２Ｐ７の４Ｅ＋６または４Ｅ＋５複製粒子）、Ｅ１Ｅ２Ｐ７タンパク質プラスＭＦ５９、およびＥ１Ｅ２Ｐ７タンパク質プラスＭＦ５９およびＣｐＧによって３回免疫化した。マウスを０および３、および６週に免疫化して、次に脾臓を８週に回収した。脾臓細胞を１０ｕｇ／ｍｌのＨＣＶペプチドプール（Ｅ１プールおよびＥ２プール）または個々のペプチド（ＣＤ４ Ｅ２ ｐｅｐおよびＣＤ８ Ｅ２ ｐｅｐ）で刺激して、次にフローサイトメトリー分析のためにＣＤ８およびＩＦＮ−γの抗体によって染色した。データは、免疫化後のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ陽性個体群のパーセンテージを示す。赤色矢印で示すように、Ｖ／Ｓ−Ｅ１Ｅ２またはＶ／Ｓ−Ｅ１Ｅ２Ｐ７を用いたプライムは、ＩＦＮ−γ産生のために非常に良好なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激しうる。
【０２４４】
結果を図３に示す。見てわかるように、ＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２およびＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ １Ｅ２Ｐ７レプリコンはどちらも、Ｅ１タンパク質に対する強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激したが、ＨＣＶ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は刺激しなかった（図５ａ）。これらの結果は、ｐ７なしでＥ１Ｅ２抗原をコードするポリヌクレオチドが、Ｅ１Ｅ２Ｐ７／ＭＦ５９タンパク質プライムを先に行わずに欠損アルファウイルス粒子によって送達されるときに、Ｅ１抗原に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答が強化されることを証明した。
【０２４５】
（実施例２）
Ｅ１Ｅ２Ｐ７タンパク質ワクチンと、続いてのＥ１Ｅ２またはＥ１Ｅ２Ｐ７キメラレプリコン粒子ブーストとを使用するマウスの免疫化
次の試験は、Ｅ１Ｅ２Ｐ７一次免疫化と、続くＥ１Ｅ２レプリコンブーストのＨＣＶ特異的なＴ細胞応答に対する効果を決定するために実施した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（グループ当たりマウス１０匹）に０、３、および６週に指示した物質（図４）を筋肉内（ｉｍ）注射して、血清を２、５、および８週に収集した。プライム−ブースト実験では、マウスを０および３週にＥ１Ｅ２Ｐ７タンパク質＋ＭＦ５９を用いてプライミングして、指示したキメラレプリコン粒子によって６週にブーストした。ＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２およびＶＥＥ／ＳＩＮ−ＥｌＥ２８０９（Ｅ１Ｅ２Ｐ７とも呼ばれる）の複製粒子４×１０６個を使用して、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体（物質および方法、「Ｅ１Ｅ２８０９タンパク質」で上述したＥ１Ｅ２８０９構築物の発現に由来するＥ１Ｅ２８０９）２μｇを注射用にＭＦ５９によって乳化した。Ｅ１Ｅ２／ＭＦ５９タンパク質産生は例えばＷＯ０３／００２０６５に記載されている。マウスを８週に殺処分して、脾臓を回収してＣＤ４およびＣＤ８応答を検出した。
【０２４６】
結果を図４に示す。見てわかるように、ＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２は、強いＣＤ８＋Ｔ細胞応答を刺激したが、ＨＣＶ特異性ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は刺激しなかった（図５ａ）。図４に示すように、Ｅ１Ｅ２８０９／ＭＦ５９によるプライミングと、続いての「ＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２」および「ＶＥＥ／ＳＩＮ−ＥｌＥ２８０９」（Ｅ１Ｅ２Ｐ７とも呼ばれる）によるブーストは、ＩＦＮ−γ産生のために非常に良好なＣＤ８Ｔ細胞応答を刺激した。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の最終プライミングは、Ｅ１Ｅ２８０９／ＭＦ５９による最初のプライミングと、続いてのＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２によるブーストによって得た。これらの結果は、上記のプライム−ブースト療法がＨＣＶ Ｅ２特異性ＣＤ＋８応答の上昇を生じたため、この療法がＨＣＶに対する予防および治療ワクチン手法において有益でありうることを証明した。
【０２４７】
（実施例３）
Ｅ１Ｅ２Ｐ７プラスＣｐＧタンパク質ワクチンと、続いてのＥ１Ｅ２Ｐ７キメラレプリコン粒子ブーストを使用したマウスの免疫化
実施例２のような免疫化を実施したが、本実施例ではＣｐＧをＥ１／Ｅ２タンパク質プライム免疫原性組成物に添加した。すべての方法は上の通りであり、Ｅ１／Ｅ２タンパク質を５０ｕｌ中２ｕｇまで希釈した。このタンパク質５０ｕｌをＭＦ５９ ５０ｕｌに添加して、これにＣｐＧ １ｕｌ（濃度１０μｇ／ｕｌ）を添加した。上の通りのタンパク質プライミングの後に、Ｅ１／Ｅ２をコードするキメラアルファウイルス（即ちＶＥＥ／ＳＩＮ−Ｅ１Ｅ２）を免疫化をブーストするために使用した。
【０２４８】
ＣｐＧをＥ１／Ｅ２ ＭＦ５９プライミング療法に加えた結果を図５ａおよび５ｂに示す。
【０２４９】
各種の免疫化方法の後にＩｇＧアイソタイプ応答の決定を実施した。結果を図６に示す。ここで図６を参照すると、Ｅ１Ｅ２／ＭＦ５９およびＥ１Ｅ２／ＭＦ５９／ＣｐＧ免疫化が同等のＡｂ応答を誘発したが、ＩｇＧ１／２ａ比は異なっていた。またＣｐＧを含まないプライム／ブースト療法は、Ｅ１／Ｅ２をコードするアルファウイルス単独よりも高いが、タンパク質単独よりも低い抗体Ａｂ応答を誘発した。
【０２５０】
これらの実験で使用したＣｐＧ配列「７９０９」は、５’−３’方向で、ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号：１０）であった。（例えば米国特許番号：６，２３９，１１６を参照）。ＣｐＧ７９０９は、２４ｍｅｒ ＢクラスＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（Ｖａｃｃｉｎｅ．２００４年８月１３日；２２（２３−２４）：３１３６−４３）。
【０２５１】
（実施例５）
Ｅ１およびＥ２に対する抗体力価も、Ｅ１／Ｅ２療法によるプライムブーストの後に検査した。Ｅ１／Ｅ２またはＥ１／Ｅ２Ｐ７をコードするアルファウイルス単独では著しい抗Ｅ１またはＥ２応答を誘発しなかったが、Ｅ１／Ｅ２タンパク質によるプライミングおよびＥ１／Ｅ２をコードするアルファウイルスによるブーストの一部として投与されたときに、Ｅ１およびＥ２に対する抗体が産生された。Ｅ１／Ｅ２のプライム−ブースト療法に対するアイソタイプ応答を、タンパク質プライミング工程の一部としてＣｐＧを含む、および含まないタンパク質プライム間で比較した。図６に示すように、ＣｐＧがタンパク質プライミングと共に投与されたときに、免疫応答はＴＨ１応答と似ていたが（ＩｇＧ２Ａが上昇）、ＣｐＧを含まないと、ＴＨ２様応答が誘発された（ＩｇＧ１が上昇）。
【０２５２】
（実施例６）
結合抗体の中和：ブロッキングＥ１Ｅ２のＣＤ８１に対する抗体力価
定量的サイトフルオロメトリーアッセイを使用して、Ｃ型肝炎エンベロープ糖タンパク質のヒト細胞への結合を評価した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ Ｖｏｌ．９３、ｐｐ．１７５９−１７６３、１９９６年；Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｖｏｌ．２８２、ｐｐ．９３８−９４１、１９９８年）。本アッセイは、チンパンジー保護抗体力価とこれらの抗体が組み換えＥ２タンパク質を標的細胞に結合するのを防止する能力との間の正の相関を証明した。テトラスパニンスーパーファミリーの一員であるヒトＣＤ８１は、組み換えＥ２タンパク質を、最も重要なことにはエンベロープ結合ＨＣＶ ＲＮＡを結合する。ＨＣＶ Ｅ２結合部位は、ヒトおよびチンパンジーの両方で保存されているＣＤ８１（ＥＣ２）の主要な細胞外ループにマッピングされた。チオレドキシンのＣ末端に融合されたヒトＣＤ８１の大型細胞外ループを含有する組み換え融合分子をクローニング、発現および精製した。我々のアッセイデータは、Ｅ１／Ｅ２ワクチンによって免疫化されたチンパンジーに由来するＨＣＶ保護抗体は、Ｅ１／Ｅ２およびＥ２タンパク質の両方のＣＤ８１への結合を阻害しうることを示唆している。ＣＤ８１組み換え受容体タンパク質を９６ウェルプレートにコーティングする。ユウロピウム標識された抗Ｅ２特異性モノクローナル抗体を検出に使用する。
【０２５３】
ホウ酸ナトリウム緩衝液中のＣＤ８１組み換え受容体２５０ｎｇ／アッセイを９６ウェル培地結合Ｃｏｓｔｅｒプレート（プレートＡ）に一晩コーティングした。抗原ＣＨＯ Ｅ１／Ｅ２（５ｕｇ／ｍｌ）およびＭｏａｂ ５Ｅ５／Ｈ７＊Ｅｕ３＋（０．３３ｕｇ／ｍｌを作用試薬で別々に希釈した。希釈プレート（プレートＢ）において、希釈ＣＨＯ Ｅ１／Ｅ２ ５５ｕｌを、作用試薬中の５Ｅ５／Ｈ７−Ｅｕ３＋Ｍｏａｂ ５５ｕｌを各ウェルに添加した。プレートを４０℃にて１５分間振とうした。次にプレートＢの各ウェルに、ＰＢＳ／ＢＳＡ緩衝液で２倍希釈した希釈血清サンプル１１０ｕｌを添加して、４０℃にて４５分間振とうした。プレートＢの各ウェルからの内容２００ｕｌをＣＤ８１コーティングプレート（プレートＡ）に適宜に移した。プレートを４０℃にて４５分間振とうした。プレートを洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０）によって５回洗浄して、ウェル当たり２００ｕｌのＥｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｌｌａｃ）を各ウェルに添加して、室温にて５分間振とうした。プレートをＷａｌｌａｃ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒに置き、プロトコル「ユウロピウム」で読み取った。
【０２５４】
希釈係数を掛けた５０％阻害を使用して、ＣＤ８１力価を概算した。アッセイ希釈１：１０における所与の対照の免疫化前出血を負の対照として使用した。阻害パーセントは、次の式を使用することによって各免疫化後出血日について概算した：
％阻害＝（負の対照のシグナル−サンプルのシグナル）／負の対照のシグナル×１００。
【０２５５】
本明細書に記載する各種のワクチン療法によって生成された中和抗体の結果（即ちＣＤ８１に対するブロッキングＥ１Ｅ２の抗体力価）を図１２に与える。これらの結果は、Ｅ１Ｅ２ポリタンパク質プラスＭＦ５９および場合によりＣｐＧが最高の中和抗体力価を産生したが、Ｅ１／Ｅ２ ＭＦ５９プラスＣｐＧによるプライミングと、続いてのＥ１Ｅ２をコードする欠損アルファウイルスの療法も結合抗体の著しい中和を産生したことを証明した。ＭＦ５９を含み、ＣｐＧを含まないＥ１Ｅ２糖タンパク質は、最高の中和（即ち抗ＣＤ８１）抗体力価を産生したが、Ｅ１／Ｅ２ ＭＦ５９プラスＣｐＧによるプライミングと、続いてのＥ１Ｅ２をコードする欠損アルファウイルスによるブーストおよびＥ１Ｅ２糖タンパク質プラスＭＦ５９およびＣｐＧによる免疫化の療法を用いた免疫化も、結合抗体の著しい中和を産生した（抗ＣＤ８１）。
【０２５６】
（実施例７）
Ｅ２ＮＳ３４５ｃｏｒｅｌ２１タンパク質プラスＩＳＣＯＭＳを使用するマウスの免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＰＢＳ（ナイーブ）、緑色蛍光タンパク質をコードするＶＥＥ／ＳＩＮキメラアルファウイルスレプリコンまたはＮＳ３４５（５Ｅ＋５または５Ｅ＋６）によって３回免疫化した。マウスを０および３、および６週に免疫化して、次に脾臓を８週に回収した。脾臓細胞をＨＣＶペプチドプール１０ｕｇ／ｍｌで刺激して、次にフローサイトメトリー分析のためにＣＤ４（図８）またはＣＤ８（図９）の抗体、およびＩＦＮ−γによって染色した。データは、免疫化後のＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ陽性個体群のパーセンテージを示す。結果を図８および９に示す。見て分かる通り、ＶＥＥ／Ｓ１Ｎ−ＮＳ３４５レプリコンは、幅広いＨＣＶ特異性ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答、特にＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発した。
【０２５７】
（実施例８）
ＮＳ３４５ｃｏｒｅ／ＩＳＣＯＭタンパク質ワクチンプライムと、続いての粒子ブーストのために上記のようにＮＳ３４５タンパク質領域をコードするアルファウイルスキメラレプリコを使用するマウスの免疫化
アミノ−カルボキシ配列において、Ｅ２のアミノ酸３８４−７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８−１０２６、ＮＳのアミノ酸１０２７−１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８−１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３−２９９０およびコアのアミノ酸１−１２１の配列より成るＨＣＶ融合タンパク質をコードする合成ＨＣＶ １ａ核酸であって、ＮＳ３配列の位置１１６５におけるセリンがアラニンによって置換され、コア配列のアミノ酸９がリジンであり、コア配列のアミノ酸１１がアルギニンである合成ＨＣＶ １ａ核酸を構築した。本配列を図７に図式的に示し、アミノ酸番号付けはＨＣＶ−１配列に対してである。
【０２５８】
一実施形態において、本発明は、プロテアーゼ活性を不活性化するＮＳ３に突然変異を有するＨＣＶ ＮＳポリタンパク質を含む。このような突然変異は、ＷＯ２００４／００５４７３に記載されているような融合タンパク質の発現を可能にする。加えて、一実施形態において、本発明は、融合タンパク質中のＨＣＶからの１個以上の構造タンパク質配列をさらに含むＨＣＶ ＮＳポリタンパク質を含み、また好ましい。
【０２５９】
その中でコードされた融合タンパク質は、酵母カッカロミセスセレビシエ内で発現させた。融合タンパク質は、標準組み換えクローニング技法および特にＵＳ２００６−００８８８１９Ａ１、ＷＯ０１／３８３６０およびＷＯ２００４／００５４７３で先に記載された方法を利用して、クローニングされて、さらに融合タンパク質挿入ＤＮＡを含有するプラスミドｐＢＳ２４．１から発現させた。上の融合タンパク質は、「ｅ２ｎｓ３ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１」または「Ｅ２ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ１２１」と呼ばれる。
【０２６０】

ｅ２ｎｓ３ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１ポリタンパク質は、酵母発現ベクターｐＢＳ２４．１を使用してカッカロミセスセレビシエにおける発現のために遺伝子組み換えした（米国特許番号：６，４５８，５２７ ｓｅｃｔｉｏｎ ４．２．４．２および米国特許番号：５，６３５，３７４）。ベクターは酵母における自己複製のための２μ配列および選択可能なマーカーとしての酵母遺伝子ｌｅｕ２ｄおよびＵＲＡ３を含有する。細菌におけるプラスミド複製に必要なα因子ターミネータ、βラクタマーゼ遺伝子およびＣｏｌＥ１複製起点も本発現ベクター内に存在する。
【０２６１】
次の工程は、ｅ２ｎｓ３ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１ポリタンパク質の発現カセットを構築するために行った。
【０２６２】
最初に、Ｎ末端領域を構築するために、８１９ｂｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｃＩＩ断片をｐＧＥＭ７．ｄ．Ｅ２（ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｈｏｌ）サブクローン＃３から単離した。５’ＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位には、イニシエータＡＴＧの配列ＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡと、ａａ３８４で開始してａａ６５０のＡｃＩＩ制限部位まで続くＨＣＶ−１ Ｅ２外部ドメインのコドンが続く。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｃＩＩ断片およびＥ２外部ドメインのａａ６５１−ａａ６６２に相当する３４ｂｐ ＡｃＩＩ／ＣｅｌＩＩキナーゼ合成断片を、ＨＣＶ−１ Ｅ２外部ドメイン配列のａａ６６２−ａａ７１５をコードする２２８ｂｐ ＣｅｌＩＩ／ＢｌｎＩ断片と、続いてのＨＣＶ−１ ＮＳ２およびＮＳ３のａａ１０１８−ａａ１０３９のコドンを含有するｐＴ７Ｂｌｕｅ２ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｅｌＩＩベクター内に結合させた。結合混合物をＨＢ１０１コンピテント細胞に形質転換させて、ルリア−アンピシリン寒天プレートにプレーティングした（１００μｇ／ｍｌ）。ｍｉｎｉｐｒｅｐＤＮＡ分析、所望のクローンの同定および配列確認の後、ｐＴ７Ｂｌｕｅ２．Ｅ２／ｎｓ２．３＃２３をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化して、１０８１ｂｐ断片を単離した。
【０２６３】
第２に、Ｓｅｒ１１６５−Ａｌａ突然変異をＮＳ３ドメインに導入するために、７０３ｂｐのＢｌｎＩ／ＣｌａＩ断片をｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ．ｎｓ３ｍｕｔ １１６５＃１５からゲル単離した。この７０３ｂｐ断片は、Ｓｅｒ１１６５が部位特異的突然変異誘発によってＡｌａに突然変異されたＨＣＶ−１ゲノムのａａ１０４０−ａａ１２７４をコードする。
【０２６４】
第３に、ｅ２．ｎｓ３ｍ−ｎｓ５ｃｏｒｅｌ２１発現カセットのクローニングを促進するために、１０８１ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｌｎＩ断片および７０３ｂｐ Ｂｌｎ／ＣｌａＩ断片をｐＳＰ７２ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩベクター内に結合した。結合混合物を上のように形質転換して、ＤＮＡ分析の後に得られたクローンをｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａｅ２．ｎｓ３ｍ＃１と名付けた。
【０２６５】
第４に、１７８４ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ断片を上記のｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｃｌａｅ２ｎｓ３ｍ＃１からゲル精製した。ＨＣＶ−１のＮＳ３−ＮＳ５ａからａａｌ２７４−ａａ２２０２をコードするＣｌａＩ／ＮｈｅＩ ２７８７ｂｐ断片を、全長ＨＣＶ−１クローン、ｐＵＣ．ＨＣＶ３から単離した。２７３２ｂｐ Ｎｈｅ／ＳａｌＩ断片をｐＳＰ７２．ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ．ｎｓ５ａｂ．２９９０．ｃｏｒｅｌ２１＃２７サブクローンからゲル単離した。Ｎｈｅ／Ｓａｌ断片は、ＮＳ５ａおよびＮＳ５ｂのａａ２２０３−２９９０と、続くコアドメインのａａ１−１２１に相当する。ＨＣＶ−１コア配列内では、コンセンサスａａが位置９（Ｌｙｓ）および１１（Ａｒｇ）に包含されていた。
【０２６６】
最後に、米国特許番号：６，１８３，９８５に記載された１３６６ｂｐ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータ断片を１７８４ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ／ＣｌａＩ断片、２７８７ｂｐ Ｃｌａ／ＮｈｅＩ断片、および ２７３２ｂｐ ＮｈｅＩ／ＳａＩＩ断片とｐＢＳ２４．１ ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ酵母発現ベクター内へ結合させて、それによりプラスミドｐｄ．ｅ２ｎｓ３ｍｎｓ５ｔｒ．ｃｌ２１を作製した。
【０２６７】
Ｓ．セレビシエ株ＡＤ３＊遺伝子型（ｍａｔα、ｌｅｕ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３−５２、ｐｒｂ−１１２２、ｐｅｐ４−３、ｐｒｃｌ−４０７、ｃｉｒ°、ｔｒｐ＋、：ＤＭ１５［ＧＡＰ／ＡＤＲ］をｐｄ．ｅ２ｎｓ３ｍｎｓ５ｔｒ．ｃ１２１酵母発現プラスミドによって形質転換して、酢酸リチウムプロトコルを使用して酵母細胞を発現プラスミドによって形質転換した。Ｕｒａ形質転換体は単一コロニーのために画線して、ｌｅｕ−／８％グルコースプレートにパッチしてプラスミドコピー数を増加させた。Ｌｅｕスターター培養物を３０℃で２４時間培養して、次にＹＥＰＤ（酵母抽出バクトペプトン２％グルコース）培地で１：２０に希釈した。細胞を３０℃にて４８時間培養して、培地中のグルコース消耗後に回収した。ｅ２ｎｓ３ｍｎｓ５ｔｒ．ｃｌ２１組み換え抗原の発現を試験するために、細胞の一定分量を溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＤＴＴ）中でガラスビーズによって溶解させた。溶解液を高速での遠心分離によって浄化した。可溶性および不溶性画分の一定分量をＳＤＳサンプル緩衝液ｐＨ１２＋５０ｍＭ ＤＴＴ中で煮沸して、４〜２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲルを通して、クマシーブルーによって染色した。ガラスビーズ溶解後に不溶性画分中で組み換えタンパク質を検出した。
【０２６８】
Ｓ．セレビシエ株ＡＤ３＊は本来、米国特許番号：６，４５８，５２７、２．４．４２節」に記載されている株ＢＪ２１６８に由来していた。
【０２６９】
Ｅ２ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ１２１融合タンパク質は、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモータを使用して酵母プラスミドから発現させた。Ｅ２ＮＳ３４５ｔｃｏｒｅ１２１融合タンパク質は、アミノ−カルボキシ末端アミノ酸３８４−７１５（Ｅ２）−１０１８−１０２６（ＮＳ２）−１０２７−１９７２（ＮＳ３ＮＳ４）−１９７３−２９９０（ＮＳ５ｔ）−ｌ−１２１（Ｃｏｒｅ）を含む。アミノ酸番号付けは全長ＨＣＶポリタンパク質に対してであり、ＮＳ３およびコアは上で示したように修飾される。
【０２７０】
上記のように産生されたＥ２ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ１２１タンパク質を使用して、ＨＣＶ融合−ＩＳＣＯＭを次のように産生した。融合−ＩＳＣＯＭ調合物は、融合タンパク質とアジュバントとの間の結合を最大化するためにイオン相互作用を利用して、融合タンパク質をあらかじめ生成されたＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（空のＩＳＣＯＭ）と混合することによって調製した。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸは本質的にＣｏｕｌｔｅｒら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１２４３に記載されているように調製する。ＨＣＶポリタンパク質プラスＩＳＣＯＭ、融合−ＩＳＣＯＭ調合物のさらなる産生方法は、本明細書では「ＩＭＸ／ポリ」とも呼ぶ。
【０２７１】
次の試験は、ＧｐＧ一次免疫化を含む、または含まないＥ２ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ１２１／ＩＳＣＯＭＳと、続いてのＮＳ３４５レプリコンブースとのＨＣＶ特異的なＴ細胞応答に対する効果を決定するために実施した。あるいは免疫化を反対にして、ＮＳ３４５をコードするアルファウイルスを融合−ＩＳＣＯＭ調合物の前に投与した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（グループ当たりマウス１０匹）に０、３、および６週に指示した物質（図１０および１１）を筋肉内（ｉｍ）注射して、血清を２、５、および８週に収集した。
【０２７２】
（実施例９）
Ｈｕｈ７細胞へのＪＦＨ１−ＨＣＶｃｃ（ＨＣＶ−２ａ）感染を遮断する交差中和抗体
本明細書に記載した各種のプライムブースト療法からの免疫血清を、ＨＣＶ組織培養アッセイにおける異種ＨＣＶ株の感染性を中和する能力について分析した。ＪＨ１ゲノムを持つモノシストロニック配置で供給されたルシフェラーゼリポーター遺伝子によってタイプ２ａ ＨＣＶ株をコードするＨＣＶゲノム構築物が生成され、ＪＦＨ１ ２ａ ＨＣＶｃｃと呼ばれた。本アッセイでは、ＪＦＨ１ルシフェラーゼの複製は、相対光単位（ＲＬＵ）としてルシフェラーゼ活性を観察することによって検出され、これを次に対照（ＰＢＳと共に注射）の％として図１３に示す。感染粒子にパッケージされたＪＦＨ−１ルシフェラーゼ構築物を使用して、肝細胞を感染させた。ウイルス粒子がを３７℃にて１時間処理して、次にＨｕＨ７細胞を感染させるために使用された後に、感染を発生させた。感染細胞を３日間インキュベートして、次にルシフェラーゼ活性をアッセイした。
【０２７３】
マウスを用いた本実施例の結果は、Ｅ１／Ｅ２ ＭＦ５９／ＣｐＧによるプライムブーストと、続いてのＨＣＶ１ａからＥ１Ｅ２をコードするアルファウイルスが、異種２ａ ＨＣＶタイプ、ＪＦＨ１ ２ａ ＨＣＶｃｃの感染を中和した中和抗体を生成したことを証明した（図１３）。先の実施例は、この特定のプライムブーストの組み合せが著しいＴ細胞応答も誘発させることを証明した。
【０２７４】
図１４は、Ｅ１Ｅ２ ＭＦ５９および精製ＣＤ８１タンパク質によって免疫化されたチンパンジーからの免疫血清が、本実施例でマウス血清に使用した条件下でルシフェラーゼ活性の低下を引き起こすことを証明している。本対照は、中和を検出するためのアッセイの有用性を証明する。
【０２７５】
本発明の好ましい実施形態を多少詳細に説明したが、請求項によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱せずに明白な変更が実施されうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【０２７６】
【図１】ＨＣＶポリタンパク質の各種の領域を示した、ＨＣＶゲノムの図式表現である。
【図２Ａ】（配列番号：１および２、各列上のアミノ酸配列：および各列下の２本鎖核酸トリプレットコドン配列）ＨＣＶ−１ Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。図に示した番号は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連している。Ｅ１、Ｅ２およびｐ７領域を示す。
【図２Ｂ】（配列番号：１および２、各列上のアミノ酸配列：および各列下の２本鎖核酸トリプレットコドン配列）ＨＣＶ−１ Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。図に示した番号は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連している。Ｅ１、Ｅ２およびｐ７領域を示す。
【図２Ｃ】（配列番号：１および２、各列上のアミノ酸配列：および各列下の２本鎖核酸トリプレットコドン配列）ＨＣＶ−１ Ｅ１／Ｅ２／ｐ７領域のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す。図に示した番号は、全長ＨＣＶ−１ポリタンパク質に関連している。Ｅ１、Ｅ２およびｐ７領域を示す。
【図３】凡例および実施例で記載したようなワクチン接種マウスにおけるＨＣＶ特異性ＣＤ８＋およびＩＦＮ−γ発現を示す。
【図４】実施例で記載したようなワクチン接種マウスにおけるＨＣＶ特異性ＣＤ８＋およびＩＦＮ−γ発現を示す。
【図５ａ】凡例および実施例で記載したようなワクチン接種マウスにおけるＨＣＶ特異性ＣＤ４＋およびＩＦＮ−γ発現を示す。
【図５ｂ】実施例で記載したようなワクチン接種マウスにおけるＨＣＶ特異性ＣＤ８＋およびＩＦＮ−γ発現を示す。
【図６】実施例で記載したような抗体産生の判定のためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図７】実施例で記載したようなＥ２ＮＳ３＊ＮＳ４ＮＳ５ｔｃｏｒｅ１２１融合タンパク質の図を示す。
【図８】実施例で記載したような各種のＮＳアルファウイルス構築物を用いた免疫化の後に生成されたＣＤ４ ＨＣＶ特異的なＴ細胞の結果をグラフで示す。
【図９】実施例で記載したような各種のＮＳアルファウイルス構築物を用いた免疫化の後に生成されたＣＤ８ ＨＣＶ特異的なＴ細胞の結果をグラフで示す。
【図１０】実施例で記載したような各種のＮＳアルファウイルスおよび／またはＮＳポリペプチド構築物を用いた免疫化の後に生成されたＣＤ８ ＨＣＶ特異的なＴ細胞の結果をグラフで示す。
【図１１】実施例で記載したような各種のＮＳアルファウイルスおよび／またはＮＳポリペプチドを用いた免疫化の後に生成されたＣＤ４ ＨＣＶ特異的なＴ細胞の結果をグラフで示す。
【図１２】実施例で記載したようなＥ１Ｅ２のプライムブースト療法を用いて免疫化したマウスにおいて産生された中和抗体力価（即ちＣＤ８１へのＥ１Ｅ２結合を遮断する抗体力価）の結果をグラフで示す。
【図１３】ＨＣＶ細胞培養／ルシフェラーゼアッセイ（即ちＨＣＶｃｃ中和アッセイ）におけるプライムブースト血清による感染性防止の結果をグラフで示す。
【図１４】ＨＣＶ細胞培養／ルシフェラーゼアッセイ、特にＨＣＶｃｃ中和アッセイでの感染性防止をグラフで示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドの少なくとも１個のエピトープに対する免疫応答を生成する方法であって：
該対象にＨＣＶエピトープを含むＨＣＶタンパク質またはペプチドを含む少なくとも１個の第１組成物を投与する工程と；
次に該第１組成物の該少なくとも１個のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２組成物を少なくとも１回投与する工程であって、それにより該第２組成物の核酸が対象の１個以上の細胞で発現されて、該第１組成物のタンパク質の少なくとも一部が産生される、工程と；
を含む方法。
【請求項２】
前記ウイルスベクターが哺乳類ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウイルスベクターがアルファウイルスベクターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アルファウイルスベクターが欠損アルファウイルス粒子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２組成物の１個以上の投与前に前記対象がＨＣＶに感染している、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２組成物の１個以上の投与前に前記対象がＨＣＶに感染していない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記免疫応答がＴ細胞応答を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記免疫応答が抗体応答を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記Ｔ細胞応答がＣＤ８Ｔ細胞応答を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞応答がＣＤ４Ｔ細胞応答を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体応答がＨＣＶ感染性を中和する中和抗体応答を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記中和抗体応答が１個を超えるＨＣＶ株またはタイプの感染性を中和する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記中和抗体応答がＨＣＶ１ａおよびＨＣＶ２ａの感染性を中和する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＣＶポリタンパク質を含む前記第１組成物がアジュバントをさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記アジュバントがサブミクロン水中油型エマルジョンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サブミクロン水中油型エマルジョンが、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％ソルビタントリオレアート、ならびに場合により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サブミクロン水中油型エマルジョンがＭＦ５９である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントがＩＳＣＯＭを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１組成物が免疫刺激配列をさらに含む、請求項１〜１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫刺激配列がＣｐＧ配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが５’−３’方向で５ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３（配列番号：１０）を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドのエピトープを認識する、脊椎動物対象のＴ細胞を活性化する方法であって：
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を含む第１組成物を該脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に該脊椎動物対象にＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２の組成物を少なくとも１回投与して、それによりＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする該核酸を該対象の１個以上の細胞において発現させて、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を産生させる工程と、を含み；
それによりＴ細胞は該対象において活性化され、該活性化Ｔ細胞はＥ１、Ｅ２または該Ｅ１Ｅ２複合体のエピトープを認識する；
方法。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターが哺乳類ウイルスベクターである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターがアルファウイルスベクターである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アルファウイルスベクターが欠損アルファウイルス粒子である、請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１および第２組成物の１個以上の投与前に前記対象がＨＣＶに感染している、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記第１および第２組成物の１個以上の投与前に前記対象がＨＣＶに感染していない、請求項２２〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項２２〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＤ８＋Ｔ細胞がインターフェロン−γを発現する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体を含む前記第１組成物がアジュバントをさらに含む、請求項２２〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記アジュバントがサブミクロン水中油型エマルジョンである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サブミクロン水中油型エマルジョンが、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％ソルビタントリオレアート、ならびに場合により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サブミクロン水中油型エマルジョンがＭＦ５９である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記タンパク質組成物中の前記Ｅ１Ｅ２複合体が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生される、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記タンパク質組成物中の前記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体が図２Ａ〜Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸の配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２〜７４６に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−７４６に示したアミノ酸配列をコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項２２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸配列をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、キメラ欠損アルファウイルスレプリコン粒子である、請求項２２〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１組成物中の前記ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体が図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸の配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−７４６に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含む前記ウイルスベクターが、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−７４６に示したアミノ酸配列をコードする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする前記核酸が、図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸組成物中の前記核酸構築物が図２Ａ〜２Ｃの位置１９２−８０９に示したアミノ酸配列をコードする、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
脊椎動物対象における免疫応答を刺激する方法であって：
ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を含む第１組成物を該脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に該脊椎動物対象にＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２の組成物を少なくとも１回投与して、それによりＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする該核酸を該対象の１個以上の細胞において発現させて、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を産生させる工程と；
を含む方法。
【請求項４７】
前記免疫応答が細胞免疫応答を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記免疫応答が体液性免疫応答を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
請求項４６にしたがって、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドのエピトープを認識する、脊椎動物対象のＴ細胞を活性化する方法であって、該方法は、
ＨＣＶタンパク質を含む第１組成物を該脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に該脊椎動物対象に該ＨＣＶタンパク質由来の少なくとも１個のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２の組成物を少なくとも１回投与して、それにより該ＨＣＶタンパク質をコードする該核酸を該対象の１個以上の細胞において発現させて、該ＨＣＶタンパク質を産生させる工程と、を含み；
それによりＴ細胞が該対象において活性化され、該活性化Ｔ細胞が該ＨＣＶタンパク質のエピトープを認識する、
方法。
【請求項５０】
前記第１組成物がＣｐＧオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２２〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記ＣｐＧオリゴヌクレオチドが５’−３’方向で５ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ−３（配列番号：１０）を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記体液性免疫応答が、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質のＣＤ８１タンパク質への結合を中和する抗体を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記体液性免疫応答が１個を超えるＨＣＶタイプを中和する抗体を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が少なくともＨＣＶタイプ１ａおよびＨＣＶタイプ２ａの感染性を中和する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドのエピトープを認識する、脊椎動物対象のＴ細胞を活性化する方法であって：
ＨＣＶポリタンパク質複合体を含む第１組成物を該脊椎動物対象に少なくとも１回投与する工程と；
次に該脊椎動物対象に該ＨＣＶポリタンパク質複合体由来の少なくとも１個の抗原をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２組成物を少なくとも１回投与して、それによりＨＣＶポリタンパク質複合体をコードする該核酸を該対象の１個以上の細胞において発現させて、ポリタンパク質複合体を産生させる工程と、を含み；
それによりＴ細胞が該対象において活性化され、該活性化Ｔ細胞が該ポリタンパク質複合体のエピトープを認識する；
方法。
【請求項５６】
前記ウイルスベクターが哺乳類ウイルスベクターである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ウイルスベクターがアルファウイルスベクターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記アルファウイルスベクターが欠損アルファウイルス粒子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１および第２組成物の１個以上の投与前に前記対象がＨＣＶに感染している、請求項５５〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記第１および第２組成物の１個以上の投与前に前記対象がＨＣＶに感染していない、請求項５５〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｔ細胞が、前記ＨＣＶポリタンパク質に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項５５〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔ細胞が、前記ＨＣＶポリタンパク質に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項５５〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記ＨＣＶポリタンパク質特異的なＴ細胞がインターフェロン−γを発現する、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＨＣＶポリタンパク質複合体を含む前記第１組成物がアジュバントをさらに含む、請求項５５〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記アジュバントがサブミクロン水中油型エマルジョンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記サブミクロン水中油型エマルジョンが、４〜５％ｗ／ｖスクアレン、０．２５〜１．０％ｗ／ｖポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、および／または０．２５〜１．０％ソルビタントリオレアート、ならびに場合により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記サブミクロン水中油型エマルジョンがＭＦ５９である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記タンパク質組成物中の前記ポリタンパク質複合体がアミノ−カルボキシ配列において、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４−７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８−１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７−１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８−１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３−２９９０およびコアのアミノ酸１−１２１をコードするアミノ酸の配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生され、該ＮＳ３配列の位置１１６５におけるセリンがアラニンによって置換され、該コア配列のアミノ酸９がリジンであり、該コア配列のアミノ酸１１がアルギニンである、請求項５５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記タンパク質組成物中の前記ポリタンパク質複合体が、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４−７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８−１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７−１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８−１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３−２９９０およびコアのアミノ酸１−１２１より成るＨＣＶ融合ポリタンパク質を含み、該ＮＳ３配列の位置１１６５におけるセリンがアラニンによって置換され、該コア配列のアミノ酸９がリジンであり、該コア配列のアミノ酸１１がアルギニンである、請求項５５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記タンパク質組成物中の前記ＨＣＶポリタンパク質複合体が、アミノ−カルボキシ配列において、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４−７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８−１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７−１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８−１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３−２９９０およびコアのアミノ酸１−１２１より成るＨＣＶ融合ポリタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現によって産生され、該ＮＳ３配列の位置１１６５におけるセリンがアラニンによって置換され、該コア配列のアミノ酸９がリジンであり、該コア配列のアミノ酸１１がアルギニンである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
アミノ−カルボキシ配列において、メチオニン、Ｅ２のアミノ酸３８４−７１５、ＮＳ２のアミノ酸１０１８−１０２６、ＮＳ３のアミノ酸１０２７−１６５７、ＮＳ４のアミノ酸１６５８−１９７２、ＮＳ５のアミノ酸１９７３−２９９０およびコアのアミノ酸１−１２１の配列より成るＨＣＶ融合ポリタンパク質を含む免疫原組成物であって、該ＮＳ３配列の位置１１６５におけるセリンがアラニンによって置換され、該コア配列のアミノ酸９がリジンであり、該コア配列のアミノ酸１１がアルギニンである、免疫原組成物。
【請求項７２】
対象においてＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドの少なくとも１個のエピトープに対する免疫応答を生成するための薬剤の製造における、ＨＣＶエピトープを含むＨＣＶタンパク質またはペプチドを含む第１組成物と、該第１組成物の該少なくとも１個のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２組成物との使用であって、それにより該第２組成物の該核酸が対象の１個以上の細胞で発現され、該第１組成物の該タンパク質の少なくとも一部が産生される、使用。
【請求項７３】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ポリペプチドのエピトープを認識する脊椎動物対象のＴ細胞を活性化させるための薬剤の製造における、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を含む第１組成物と、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を含むウイルスベクターを含む第２組成物との使用であって、それによりＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする該核酸を対象の１個以上の細胞において発現させ、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を産生させる、使用。
【請求項７４】
脊椎動物対象における免疫応答を刺激するための薬剤の製造における、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を含む第１組成物と、ＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする該核酸を含むウイルスベクターを含む第２組成物との使用であって、それによりＨＣＶ Ｅ１Ｅ２複合体をコードする核酸を対象の１個以上の細胞において発現させ、Ｅ１Ｅ２タンパク質複合体を産生させる、使用。
【請求項７５】
ＨＣＶエピトープを含むＨＣＶタンパク質またはペプチドを含む第１組成物によってプライミングされた対象における免疫応答を生成するための薬剤の製造における、該ＨＣＶタンパク質またはペプチドの少なくとも１個のエピトープをコードする核酸を含むウイルスベクターを含む組成物の使用であって、それにより該組成物の該核酸が対象の１個以上の細胞において発現される、使用。
【請求項７６】
対象における免疫応答を誘発または生成するためのキットであって：
（ｉ）ＨＣＶタンパク質およびアジュバントを含む第１組成物と；
（ｉｉ）該第１組成物の該ＨＣＶタンパク質の少なくとも一部をコードするウイルスベクターを含む第２組成物と；
を含むキット。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【公表番号】特表２００９−５２２３６８（Ｐ２００９−５２２３６８Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４９５８３（Ｐ２００８−５４９５８３）
【出願日】平成１９年１月４日（２００７．１．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０００３６２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０８１８４８
【国際公開日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【出願人】（５０６３６１１００）ノバルティス　ヴァクシンズ　アンド　ダイアグノスティクス，　インコーポレイテッド (44)
【Ｆターム（参考）】

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