ＨＣＶ遺伝子型タイピングおよび表現型タイピング
本発明は、ＨＣＶの遺伝子型タイピングおよび表現型タイピングの方法を含む。一つの実施形態において、本発明の方法は、ＨＣＶ単離物が抗ウイルス剤に対して耐性であるか否かを決定するために用いられ得る。本発明はまた、ＨＣＶ ＮＳ３領域を増幅するためのプライマーおよびキットを含む。一実施形態において、プライマーの集団が提供され、この集団は、第一および第二ラウンドプライマーを含むことができる。一つの実施形態において、各プライマーはＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓをコードする核酸配列を含んでいる。別の実施形態において、各プライマーの相補体はＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含んでいる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００７年１０月３０日に出願された米国仮出願６０／９８３，８５４号および２００８年４月７日に出願された米国仮出願６１／０４３，０２０号に対し優先権を主張し、そのいずれも、全容が本明細書において援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明はＨＣＶ遺伝子型タイピングおよび表現型タイピングのアッセイに関連する。本発明は、例えば、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメイン増幅の為の組成物およびプライマーを含む。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はフラビウイルス科のエンベロープをもったプラス鎖のＲＮＡウイルスである。一本鎖ＨＣＶ ＲＮＡゲノムはプラスのポラリティをもち、約９６００塩基長の単一のオープンリーディングフレームを含む。そしてこれは約３，０１０アミノ酸のポリプロテインをコードしている。感染した細胞において、ポリプロテインは宿主とウイルスのプロテアーゼによって複数の部位で切断され、ウイルスの構造および非構造（ＮＳ）タンパク質が生産される。
【０００４】
構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１）はヌクレオカプシドタンパク質および１つまたは２つの膜結合グリコプロテインを構成する。非構造タンパク質（Ｎ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）はＨＣＶ ＲＮＡゲノムの複製を触媒および制御する酵素またはアクセサリー因子である。ＮＳ３はタンパク質切断酵素であり、かつ、複製のためにウイルスゲノムの巻き戻しを促進するヘリカーゼでもある。ＮＳ５ｂはウイルスの複製に必要なＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼである。
【０００５】
ＨＣＶは世界の人口の約３％（１億７０００万人）に感染し、世界的な保健伝染病として世界保健機関によって宣言されている。ＨＣＶに感染した人々の約５０％から８０％はウイルス残留を伴なった慢性肝炎を発症する。慢性肝炎の罹患者は肝硬変および肝細胞ガン発症に対し、高リスクである。ＨＣＶによって引き起こされる最終段階の肝臓病が、肝臓移植の約３０％から４０％を占めている。
【０００６】
ＨＣＶ治療の現代の優れた標準的治療は、広範囲のスペクトルをもつ抗ウイルス剤であるリバビリンとペグ化αーインターフェロンの併用である。しかしながらその投与は長期化する上、耐容性が十分ではない。さらに遺伝子型１ＨＣＶの感染者の約半数しか、この治療に対する継続した反応を示さない。
【０００７】
有効かつ安全なインターフェロンに替わる治療法、またはインターフェロンを含むレジメンにおいて使用され得る治療法に対し、大きな要望がある。いくつかのＨＣＶ抗ウイルス治療は臨床試験の段階にある。例えば、これらの治療としては、ウイルスプロテアーゼインヒビターおよびポリメラーゼインヒビターが挙げられる。ＨＣＶプロテアーゼのＮＳ３インヒビターはすでに開発されており、これらは高い活性と選択性をもっている。この理由から、これらの化合物は、次世代の抗ＨＣＶ治療になる可能性をもっている。（例としては、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照のこと。これらはそれぞれ、本明細書においてその全容が援用される）。
【０００８】
ＨＣＶ感染患者のための新たな治療の選択の開発においてもたらされた進歩にも関わらず、薬剤耐性は主要な懸案事項である。ＨＣＶはＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの修復活性に欠損があるため高い遺伝的多様性を示す。ＨＣＶポリメラーゼの低い正確性のため、ＨＣＶ薬剤耐性変異は、特異的なＨＣＶ抗ウイルス治療（例えばプロテアーゼインヒビターおよびポリメラーゼインヒビター）を用いて治療された患者において起こりやすい。これはＨＩＶ抗ウイルス治療が行われた患者において同様に観察される。ＨＣＶを特異的に標的とする抗ウイルス治療に対する耐性の発現に加えて、このウイルスはインターフェロンのような非特異的な抗ウイルス治療に対しても耐性を発現することができる。
【０００９】
プロテアーゼインヒビターに対する薬剤耐性は特段の懸案事項である。インビトロでの研究は、ＨＣＶプロテアーゼ中の変異がプロテアーゼインヒビターに対する耐性を与えることができることを示している。この発見はＨＩＶプロテアーゼでの発見に類似している。例えば、ＨＩＶにおいて、ＨＩＶプロテアーゼ中の特定の変異が、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに対する感受性を低下する表現型をもたらすことが発見されている。
【００１０】
本発明はＨＣＶ遺伝子型およびＨＣＶ表現型を決定するために用いることができるプライマー、キット、および方法を提供する。例えば、本発明の方法は、あるＨＣＶ治療に対する患者の応答を予測すること、および、ＨＣＶ薬剤耐性（例えば、プロテアーゼ薬剤耐性）の決定に対して有用であり得る。本発明の方法はまた、活性に対する潜在的なプロテアーゼインヒビターをスクリーニングするための前臨床薬開発においても有効であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第００／０９５４３号
【特許文献２】国際公開第００／０９５５８号
【特許文献３】国際公開第００／５９９２９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のサブタイプを同定するために有用なプライマーの発見およびＨＣＶの遺伝子型タイピングならびに表現型タイピングのための方法の発見を、一部基礎としている。それ故本発明は、プライマー、プライマーを含むキット、遺伝子型１ＨＣＶのようなあるＨＣＶの特異的な領域を増幅するための方法、遺伝子型１ａまたは１ｂのようなあるＨＣＶの遺伝子型および表現型を決定するための方法、などを提供する。本発明はまた、薬剤耐性ＨＣＶの存在を決定するための方法も含む。
【００１３】
本発明はプライマーの集団を提供する。このプライマーの集団は、第一および第二ラウンドプライマーを含むことができる。一つの実施形態において、各プライマーはＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓをコードする核酸配列を含んでいる。別の実施形態において、各プライマーの相補体はＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含んでいる。
【００１４】
また別の実施形態において、各プライマーはＡｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒをコードする核酸配列を含んでいる。さらに別の実施形態において、各プライマーの相補体はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐをコードする核酸配列を含んでいる。
【００１５】
別の実施形態において、本発明のプライマーを含むキットが、提供される。
【００１６】
本発明は、ＮＳ３ ＨＣＶプロテアーゼドメインをコードする核酸を増幅する方法を、提供する。本発明の方法は、例えば、ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部分、ＮＳ３ドメインまたはその一部分（例えば、ＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ３ヘリカーゼの両方、またはＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ３ヘリカーゼの一部分の両方）、ＮＳ２／ＮＳ３ドメインまたはその一部分、あるいは、ＮＳ２／ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部分を、コードする核酸の増幅を含む。
【００１７】
本発明は、プライマーの第一および／または第二ラウンドを用いてＨＣＶプロテアーゼドメインを増幅することを含む。本発明の一つの実施形態において、プライマーの第二ラウンド（つまり第二セット）は、プライマーの第一セットを用いて増幅された核酸領域の内側に配置される。例えば、本発明はＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／ＬｙｓおよびＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含むプライマーの第一ラウンドを用いて、プロテアーゼドメインをコードするＨＣＶ核酸を増幅することを含む。プライマーの第二ラウンドはＡｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−ＴｈｒおよびＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐをコードする核酸配列を含むことができる。
【００１８】
本発明は、本発明のプライマーを用いて、ＨＣＶに感染した患者または感染が疑われる患者のサンプルからの核酸サンプルを増幅する方法を含む。本発明の一つの局面において、ＨＣＶプロテアーゼドメインは、遺伝子型非特異的縮重プライマーを用いて増幅される。本発明の別の局面において、ＨＣＶプロテアーゼドメインは遺伝子型特異的非縮重プライマーを用いて増幅される。本発明のさらに別の局面において、ＨＣＶプロテアーゼドメインは固定された核酸配列プライマーを用いて増幅される。
【００１９】
ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸配列内の変化にのみ基づいたＨＣＶの遺伝子型決定に、本発明のプライマーを用いることが可能である。本発明は、本発明のプライマーを用いて当業者に公知の方法（例えば、ＰＣＲ増幅法、配列決定法、ハイブリダイゼーション法）に基づいた核酸によってＨＣＶの遺伝子型タイピングを行うことを含む。
【００２０】
本発明の一つの実施形態において、ＨＣＶ遺伝子型は、ＮＳ３プロテアーゼドメインの増幅および／または配列決定によって決定される。例えば、本発明はＨＣＶのプロテアーゼドメイン中の核酸断片の増幅方法、およびその断片の配列に基づいたＨＣＶの遺伝子型決定方法を含む。本発明の一つの局面において、ＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型非特異的縮重プライマーを用いたＨＣＶプロテアーゼドメインの増幅およびその増幅された核酸産物の配列決定によって決定される。本発明の別の局面において、ＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型特異的非縮重プライマーを用いたＨＣＶプロテアーゼドメインの増幅およびその増幅された核酸産物の配列決定によって決定される。例えば、本発明の方法を用いて、ＨＣＶ遺伝子型は、標的配列と１ａおよび／または１ｂ ＨＣＶのような公知の遺伝子型の配列とを比較することによって決定され得る。
【００２１】
本発明は、例えば遺伝子型１ ＨＣＶをもつ患者において、薬剤耐性ＨＣＶの存在を決定する方法も提供する。一つの実施形態において、薬剤耐性ＨＣＶの存在は、ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸断片の増幅およびその断片内の薬剤耐性に関連する変異の存在の決定によって、決定される。この変異の存在は、薬剤耐性ＨＣＶの指標である。一つの実施形態において、増幅された核酸は、位置Ｄ１６８に、例えば、Ｄ１６８ＡおよびＤ１６８Ｖのような変異をコードしている。この核酸は、薬剤耐性を与えるような更なる変異をコードしてもよい。この変異としてはＮＳ３位置Ａ１５６（例えばＡ１５６ＴおよびＡ１５６Ｓ）ならびにＦ４３（例えばＦ４３Ｓ）が挙げられるが、これに限定されない。一つの実施例において、実施例２に記述されているプライマーＵ３４２０およびＵ４０３８は、これらの薬剤耐性関連変異を同定するために使用され得る。
【００２２】
本発明はＨＣＶの表現型（例えばプロテアーゼ活性）を決定する方法をさらに提供する。この方法は、１つまたはそれ以上のＨＣＶ膜結合タンパク質および分泌可能なレポーター（例えば分泌可能なルシフェラーゼレポーター）をコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニングベクターに、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインをクローン化することを含む。一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、このベクター中に許容されるＨＣＶ膜結合タンパク質の最大数、例えば、４Ａ、４Ｂ、５Ａ（例えば、非特異的バックグラウンドノイズシグナルを最小化または少なくするため）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。他の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）、および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。また別の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ（例えば、４Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。さらに別の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ（例えば、５Ａの最初の６アミノ酸）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。
【００２３】
このスクリーニングベクターはＮＳ３プロテアーゼドメイン、１つまたはそれ以上のさらなるＨＣＶ ＮＳドメイン（例えば、ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ）および分泌可能なレポーターをコードするポリヌクレオチドを発現し、ここで、ＮＳ３プロテアーゼドメイン、一つまたはそれ以上のＨＣＶ ＮＳドメイン、および分泌可能なレポーターは、作動可能に連結されている。もしＮＳ３プロテアーゼドメインが機能できるならば、すなわちポリプロテインを切断することができるならば、そのレポーター（例えばルシフェラーゼ）は切断され、分泌される。分泌されたレポーター由来のシグナルは、適切な基質（例えばルシフェラーゼ基質）の存在下で細胞の外で検出され得る。もしこのＮＳ３プロテアーゼドメインが機能できないならば、この分泌されたレポーターは切断されず、それゆえ分泌されない（すなわち細胞外のシグナルを生産することができない）。
【００２４】
本発明の一つの実施形態において、ＨＣＶは単離され、プロテアーゼインヒビターのようなＨＣＶアンチウイルス治療に対する感受性についてスクリーニングされる。この方法は、単離されたＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインを、本明細書に記載されるスクリーニングベクター（例えば、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターをコードするポリヌクレオチドを含んでいるスクリーニングベクター）にクローン化する工程を含む。トランスフェクトされた細胞はプロテアーゼインヒビターのような候補治療と接触させられる。もしＨＣＶがこの治療に対し感受性があるならば、ＮＳ３プロテアーゼは分泌可能なルシフェラーゼレポーターを切断せず、よってその分泌可能なルシフェラーゼレポーターは分泌されない。そのような方法は、例えば、抗ウイルス活性についての化合物の前臨床スクリーニング、ある患者がある抗ウイルス治療に対し応答するか否かを決定すること、およびある患者が特定の抗ウイルス治療に対し耐性であるか否かを決定するために有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、患者から得られたＨＣＶの耐性の決定の方法の例示的なステップを示しているフローチャートを示す。
【図２】図２は、例示的なレポーターシステムを示す。
【図３】図３は、９６ウェルミニプレップから得られたＤＮＡを用いた表現型タイピングアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、９６ウェルプレート内での表現型タイピングアッセイシグナルの変動を示す。
【図５】図５は、表現型タイピングシステムを用いた同じＮＳ３配列のＥＣ５０変動を示す。
【図６】図６は、細胞ベースのレポーターアッセイのための自動化プロトコールの例示的なステップを示しているフローチャートを示す。
【図７】図７は、本発明の例示的プライマーを用いたＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインの遺伝子型タイピングおよび表現型タイピングを示す。
【図８】図８は、上流側プライマーＵ３２７６内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図９】図９は、下流側プライマーＤ４２２１内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図１０】図１０は、上流側プライマーＵ３４２０内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図１１】図１１は、下流側プライマーＤ４０３８内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図１２】図１２は、遺伝子型１ａ／ｂ非特異的重合プライマーを用いた遺伝子型タイピングアッセイの結果を示す。
【図１３】図１３は、患者ＮＳ３クローンの表現型タイピングの結果を示す。
【図１４】図１４は、１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーの配列を示す。
【図１５】図１５は、遺伝子型１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーを用いて得られた結果を示す。
【図１６】図１６は、本発明の表現型タイピングアッセイの再現性を示す。
【図１７】図１７は、臨床サンプルを用いた擬似種（ｑｕａｓｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）解析を示す。
【図１８】図１８は、集団表現型タイピングおよびクローン表現型タイピング間の比較を示す。
【図１９】図１９は、この表現型タイピングアッセイがインビトロでの耐性研究で同定された改変体に対する有効性を報告することを示す。
【図２０】図２０は、混合された集団の解析において表現型タイピングアッセイを用いてインビトロで同定された置換の特徴づけを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（一般的記述）
本発明は、一つまたはそれ以上のＮＳ３ドメインをコードするＨＣＶ核酸にアニールすることが可能なＨＣＶプライマーを含む。本発明はまた、一つまたはそれ以上のＮＳ３ドメインをコードする核酸の増幅の方法、ＨＣＶのサブ遺伝子型タイピングのような遺伝子型タイピングの方法、薬剤耐性変異を検出する方法およびＨＣＶ表現型タイピングの方法も含む。本発明の組成物および方法は、一つまたはそれ以上のＮＳ３ドメインをコードしているウイルス核酸内の遺伝的変動を単独で（すなわちＮＳ３プロテアーゼ部分以外の改変の知識なしで）用いることにより、ＨＣＶの遺伝子型、抗ウイルス治療に対するＨＣＶの感受性および抗ウイルス治療（すなわち薬剤）に対するＨＣＶの耐性を決定することができるという発見を、一部基礎としている。
【００２７】
異なる定義がなされない限り、本明細書で用いられている全ての技術および科学的用語は、本発明が属する当業者によって普通に理解されることと同じ意味をもつ。本明細書で記述されていることと類似または等価であるあらゆる方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および物質が記述されている。
【００２８】
（定義）
本明細書で用いられる場合、用語“ＥＣ５０”または最大半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）有効濃度とは、ベースラインおよび最大値間の中間の反応を誘導する薬剤の濃度をいう。ＥＣ５０はインビボで最大効果の５０％を得るために必要とされる薬剤の血漿濃度をいう。用語“ＩＣ５０”または最大半量阻害濃度は、インビトロで５０％阻害に必要とされる薬剤またはインヒビターの濃度を表す。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、用語“遺伝子”とは、生物学的機能に関連したＤＮＡの任意の部分をいう。したがって、遺伝子としては、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる制御配列が挙げられるが、これに限定されない。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成するような非発現ＤＮＡ部分も含み得る。遺伝子は様々な供給源から取得され得（目的の供給源からのクローン化、または、既知のもしくは予想されている配列情報からの合成が挙げられる）、そして、望ましいパラメーターをもつようデザインされた配列を含み得る。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、“遺伝子型タイピング”または“遺伝子型タイピングアッセイ”とは、ある生物、ある生物の一部、遺伝子または遺伝子の一部の、遺伝子配列の決定をいう。そのようなアッセイは、ある罹患者が特定の治療に対し順調に反応するであろう可能性を決定するために、ＨＣＶのようなウイルス中で行われ得る。そのようなアッセイはまた、薬剤耐性に関連した変異が存在するか否かを決定するためにも行われ得る。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、用語“ＨＣＶカセット”とは、患者（すなわち、臨床的ＨＣＶ単離物）からのＨＣＶ ＮＳ３核酸配列をいう。ＨＣＶカセットは、更なるＮＳドメインをコードしている核酸を必要に応じて含んでもよい。例えば、このＨＣＶカセットはＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメインの全てまたは一部、および／あるいはＮＳ４Ａの全てまたは一部を、含んでもよい。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、用語“単離された”とは、臨床的検体（例えば血液、血清）および／または他のウイルス組成物（例えば、他のタンパク質または核酸）から分離された目的のウイルス核酸またはタンパク質をいう。本明細書で用いられる場合、“単離された”核酸配列とは、他の核酸配列を本質的に含まない核酸配列をいう。例えば、少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは約６０％純粋、さらにより好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、さらに最も好ましくは約９５％純粋である。単離された核酸の純度は、例えばアガロースゲルゲル電気泳動によって決定され得る。単離された核酸配列は、その天然の場所から再生産される異なる部位へと移すために、遺伝子工学において用いられている標準的クローン化手順によって取得され得る。クローン化手順としては、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む望ましい核酸配列断片の除去および単離、ベクター分子へのその断片の挿入、および核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製される場所である宿主細胞への組換えベクターの組み込みが、挙げられ得る。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、用語“核酸”、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”および“プライマー”とは、一本鎖形態もしくは二本鎖形態いずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。そして、ポリヌクレオチドに含まれるとき、最も一般的に天然に存在しているコードヌクレオチドは、以下のように省略される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）。さらに文字ＲおよびＹは、それぞれ、プリン（ＡまたはＧ）およびピリミジン（ＣまたはＴ）を表す。文字ＫはＧまたはＴ；文字ＳはＧまたはＣ；および文字ＶはＡ、ＧまたはＣを表す。さらに、ヌクレオチド後の上付き文字“Ｍ”は、その核酸が修飾されていることを示す。例えば、ＡＭ、ＧＭ、ＣＭおよびＴＭは、修飾されたアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをそれぞれ示している。修飾されたヌクレオチドの例は、固定された核酸（ＬＮＡ）を含むが、これに限定されない。異なる明記がなされない限り、一本鎖核酸配列は、５’から３’方向において一連の一文字省略形として示される。
【００３４】
異なる表示がなされない限り、ある特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列と同様に、それらの保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）およびその相補的配列も、黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換体は、配列を作製することによって得られる得る。この配列の作製では、一つもしくはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目位置が混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８）。用語の核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと、互換可能に使用される。
【００３５】
上流側プライマーは、増幅される核酸上の領域に対して、核酸分子の５’末端に近い領域に一般的に結合する。一方、下流側プライマーは、増幅される核酸上の領域に対して、核酸分子の３’末端に近い領域に一般的に結合する。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、あるＤＮＡ部分が、他のＤＮＡ部分と機能的な関係にあるように配置されているとき、あるＤＮＡは“作動可能に連結されている”といわれる。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡが、本発明の融合タンパク質の分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、シグナル配列のためのＤＮＡは本発明の融合タンパク質をコードしているＤＮＡに作動可能に連結されている；あるプロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写を刺激するならば、あるプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は、隣接しており、そして、読み取られる状況にある。同様に、あるポリペプチド配列が、別のポリペプチド配列と機能的な関係にあるように配置されているとき、あるポリペプチド配列は“作動可能に連結されている”。すなわち、ある実施形態において、あるプロテアーゼ配列は、別のペプチド配列と作動可能に連結され、その結果、そのプロテアーゼ配列は、機能的ならば、ぺプチド配列に連結されている少なくとも一つのペプチド結合をタンパク分解することが可能である。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、“表現型タイピング”または“表現型アッセイ”とは、ＨＣＶウイルスの表現型特徴（例えば、ある抗ウイルス剤に対する感受性および／または抗ウイルス治療への耐性など）の決定方法をいう。そのようなアッセイは、薬剤耐性に関連したある変異がＨＣＶ検体の中に存在するか否かを証明するために行われ得る。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、用語“ポリペプチド”とは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の単一の鎖に作り上げられた化合物をいう。アミノ酸残基の通常の３文字または１文字コードは、本明細書の中で用いられ、アラニンはａｌａまたはＡ；アルギニンはａｒｇまたはＲ；アスパラギンはａｓｎまたはＮ；アスパラギン酸はａｓｐまたはＤ；システインはｃｙｃまたはＣ；グルタミン酸はｇｌｕまたはＥ；グルタミンはｇｌｎまたはＱ；グリシンはｇｌｙまたはＧ；ヒスチジンはｈｉｓまたはＨ；イソロイシンはｉｌｅまたはＩ；ロイシンはｌｅｕまたはＬ；リジンはｌｙｓまたはＫ；メチオニンはｍｅｔまたはＭ；フェニルアラニンはｐｈｅまたはＦ；プロリンはｐｒｏまたはＰ；セリンはｓｅｒまたはＳ；スレオニンはｔｈｒまたはＴ；トリプトファンはｔｒｐまたはＷ；チロシンはｔｙｒまたはＹそしてバリンはｖａｌまたはＶである。
【００３９】
異なる指示がなされない限り、ポリペプチド配列が一連の１文字および／または３文字省略形として表されるとき、一般的慣習に従い、その配列はＮからＣ方向に表される。省略形の後の数は、Ｎ末端からのアミノ酸の位置を示す（例えば、Ｍｅｔ−１は、位置１にあるメチオニンを表す）。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、用語“組換え体”とは、遺伝子またはＤＮＡの新たな組み合わせを用いた形質転換を受けた、細胞、組織または生物をいう。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語“被験体”とは、人間、哺乳類、または動物であり得る。治療されている罹患者は、治療が必要または治療が必要である可能性がある患者である。“被験体”および“患者”は本明細書では互換可能に用いられる。
【００４２】
プライマーに関連して、用語“実質的に相補的”とは、プライマーが指定されたアニーリング条件下で核酸配列に選択的にハイブリダイズするために十分に相補的であり、その結果、アニールされたプライマーがポリメラーゼによって伸長され、核酸配列の相補的コピーを形成し得ることを意味するために、本明細書中で用いられる。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、用語“形質転換”は、細胞内に核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）を移送することをいう。本明細書で用いられる場合、用語“遺伝的形質転換”とは、細胞内への、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移送および取り込みをいう。本明細書で用いられる場合“形質転換”はトランスフェクションを含む。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、用語“形質転換体”とは、形質転換またはトランスフェクションを受けた細胞、組織または生物をいう。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、用語“ベクター”とは、外来性の核酸をコードするプラスミド、ファージミドまたはウイルスのいずれかを広くいう。この用語はまた、ビリオンまたは細胞内への核酸の移行を容易にするような非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物（例えば、ポリリジン化合物など）を含むと解釈される。ベクターは、細胞内に核酸、またはその変異体を送達するための送達ビヒクルとして適しているウイルス性のベクターでもよい。または、ベクターは同じ目的のために適している非ウイルス性のベクターでもよい。細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルス性および非ウイルス性のベクターの例は、当該分野で周知であり、例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６）に記述されている。ウイルス性ベクターの例としては、組換えサイトメガロウイルス、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換えトリポックスウイルス、など（Ｃｒａｎａｇｅ ｅｔ ａｌ．、１９８６、ＥＭＢＯ Ｊ．５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日に公開された国際公開公第ＷＯ９４／１７８１０号；１９９４年１０月２７日に公開された国際公開公第ＷＯ９４／２３７４４号）が挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルス性ベクターの例としては、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体、などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、用語“野生型”とは、天然に存在しているポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をいう。
【００４７】
（ＨＣＶプライマー）
本発明は、少なくとも１、２、３、４、または５つのプライマーを含むプライマーの集団を提供する。一つの実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＨＣＶゲノムの領域にアニーリング（すなわちハイブリダイズ）することが可能である。一つの実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＨＣＶプロテアーゼをコードする核酸にアニーリングすることが可能である。別の実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸にアニーリングすることが可能である。さらに別の実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部をコードする核酸にアニーリングすることが可能である。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示された、一つまたはそれ以上のプライマーは、核酸増幅に必要な条件下でＨＣＶゲノムの領域を増幅することが可能である。ある場合において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＨＣＶプロテアーゼをコードする核酸を増幅することが可能である。ある場合において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３プロテアーゼドメインまたはその一部をコードする核酸を増幅することが可能である。さらに別の場合において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部をコードする核酸を増幅することが可能である。
【００４９】
このプライマーは、遺伝子型特異的または縮重プライマーであり得る。また、このプライマーは上流側プライマーまたは下流側プライマーであり得る。さらに増幅の第一ラウンド、第二ラウンド、またはその後のいずれのラウンドの間に、用いられ得る。このプライマーは、あらゆる公知の増幅方法に用いられ得る。公知の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（“ＲＴ−ＰＣＲ”）、リガーゼ連鎖反応（“ＬＣＲ”）、自己持続配列複製（“３ＳＲ”）これは核酸配列に基づいた増幅（“ＮＡＳＢＡ”）としても知られている、Ｑ−Ｂ−レプリカーゼ増幅、ローリングサークル増幅（“ＲＣＡ”）、転写媒介増幅（“ＴＭＡ”）、リンカー補助ＤＮＡ増幅（“ＬＡＤＡ”）、多重置換増幅（“ＭＤＡ”）、インベーダーおよび鎖置換増幅（“ＳＤＡ”）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５０】
一つの実施形態において、この集団の各プライマーは、アミノ酸配列：Ｍｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓ（配列番号１）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５１】
配列番号１のプライマーは、上流側プライマーまたは下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。一つの実施形態において、配列番号１のプライマーは上流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第一ラウンドの間に用いられる。
【００５２】
配列番号１のアミノ酸配列のＭｅｔ−１、Ｇｌｕ−２、Ｔｈｒ−３、Ｉｌｅ−６、Ｔｈｒ−７、およびＴｒｐ−８のパーセンテージは、約９５％から約９９．９％の範囲であり。対応して、Ｌｙｓ−１、Ｇｌｙ−２、Ｉｌｅ−３、Ａｌａ−６、Ｇｌｎ−７およびＬｙｓ−８のパーセンテージは、約５％から約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ−１、Ｇｌｕ−２、Ｔｈｒ−３、Ｉｌｅ−６、Ｔｈｒ−７、またはＴｒｐ−８のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。Ｌｙｓ−１、Ｇｌｙ−２、Ｉｌｅ−３、Ａｌａ−６、Ｇｌｎ−７およびＬｙｓ−８のパーセンテージは、それ応じて変化する。そして、各アミノ酸位置の２つのパーセンテージの合計は、１００％である。
【００５３】
配列番号１のアミノ酸配列のＩｌｅ−５、Ｖａｌ−５およびＬｅｕ−５のパーセンテージは、それぞれ約６７％から約７２％、約１４％から約１８％、約１２％から約１７％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｉｌｅ−５のパーセンテージは、約６７％、６８％、６９％、６９．１％、６９．２％、６９．３％、６９．４％、６９．５％、７０％、７１％または７２％である；Ｖａｌ−５のパーセンテージは、約１４％、１５％、１５．９％、１６％、１６．１％、１６．２％、１６．３％、１７％または１８％である；Ｌｅｕ−５のパーセンテージは、約１２％、１３％、１４％、１４．４％、１４．５％、１４．６％、１４．７％、１４．８％、１５％、１６％または１７％である。これらの、各アミノ酸のパーセンテージの合計は、１００％である。
【００５４】
一つの例示的な実施形態において、プライマーの集団は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ｍｅｔ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）−Ｇｌｕ（９９．５％）／Ｇｌｙ（０．５％）−Ｔｈｒ（９６．５％）／Ｉｌｅ（３．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｉｌｅ（６９．３％）／Ｖａｌ（１６．１％）／Ｌｅｕ（１４．６％）−Ｉｌｅ（９９．５％）／Ａｌａ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９．５％）／Ｇｌｎ（０．５％）−Ｔｒｐ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）
他の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＡＧＶＴＹＡＴＹＡＣＳＴＧＧＧ（配列番号２）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。配列番号２において、いずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としては、固定された核酸（ＬＮＡ）が挙げられるが、これに限定されない。本発明のプライマーは、修飾された塩基（例えばＬＮＡを有するプライマー）をいくつでも含み得るが、いくつかの実施形態においては、プライマーは約４または約８のＬＮＡを含む。一般に、ＡｓおよびＴｓでの修飾は、ＧｓおよびＣｓでの修飾より一般的である。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＳＴＧＧＧ、またはＡＭＴＧＭＧＭＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＭＳＴＧＧＧ。
【００５５】
別の実施形態において、集団中の各プライマーの相補体は、アミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５６】
配列番号３のプライマーは、上流側または下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。いくつかの実施形態において、配列番号３のプライマーは下流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第一ラウンドの間に用いられる。配列番号３のアミノ酸配列のＧｌｙ−４のパーセンテージは、約９５％から約９９％の範囲である。対応して、Ｃｙｓ−４のパーセンテージは、約５％から約１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−４のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。対応して、Ｃｙｓ−４のパーセンテージは、５％、４％、３％、２％または１％である。
【００５７】
ある例示的な実施形態において、集団中のプライマーの相補体は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ｓｅｒ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９７．０％）／Ｃｙｓ（３．０％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｐｈｅ（１００％）−Ｌｅｕ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ａｓｐ（１００％）−Ｇｌｙ（１００％）。
【００５８】
別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＡＣＴＴＧＣＣＲＴＡＧＧＴＧＧＡ（配列番号４）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。配列番号４において、いずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としてはＬＮＡが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＭＡＣＴＴＭＧＣＣＲＴＭＡＧＧＴＭＧＧＡ、またはＣＣＧＴＭＣＧＧＣＡＡＭＧＲＡＭＡＣＴＭＴＭＧＣＣＲＴＭＡＭＧＧＴＭＧＧＡ。
【００５９】
また別の実施形態において、この集団中の各プライマーは、アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号５）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００６０】
配列番号５のプライマーは、上流側または下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。いくつかの実施形態において、配列番号５のプライマーは上流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第二ラウンドの間に用いられる。
【００６１】
配列番号５のアミノ酸配列のＰｒｏ−２、およびＧｌｎ−８のパーセンテージは、約９５％から約９９．９％の範囲である。対応して、Ｈｉｓ−２、およびＡｒｇ−８のパーセンテージは、約５％から約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｐｒｏ−２またはＧｌｎ−８のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。Ｈｉｓ−２およびＡｒｇ−８のパーセンテージは、それに応じて変化する。そして、各アミノ酸位置の２つのパーセンテージの合計は、１００％である。
【００６２】
配列番号５のアミノ酸配列のＳｅｒ−７およびＡｌａ−７のパーセンテージは、それぞれ約６４％から約６８％、および約３２％から約３６％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｓｅｒ−７のパーセンテージは、約６４％、６５％、６６％、６７％、または６８％である；また、Ａｌａ−７のパーセンテージは、約３２％、３３％、３４％、３５％または３６％である。これらの、各アミノ酸のパーセンテージの合計は、１００％である。
【００６３】
ある例示的な実施形態において、プライマーの集団は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ａｌａ（１００％）−Ｐｒｏ（９９．５％）／Ｈｉｓ（０．５％）−Ｉｌｅ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｓｅｒ（６６％）／Ａｌａ（３４％）−Ｇｌｎ（９９％）／Ａｒｇ（１％）−Ｇｌｎ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）。
【００６４】
別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣ（配列番号６）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。配列番号６において、いずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としてはＬＮＡが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＭＣＴＭＡＭＹＫＣＣＣＭＡＲＣＭＡＭＲＡＣ、またはＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＣＴＡＭＹＫＣＣＣＡＲＣＡＭＲＡＣ。
【００６５】
さらに別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣ（配列番号７）、またはＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣ（配列番号８）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。ここで、核酸配列、配列番号７または８のいずれのヌクレオチドも修飾され得る。
【００６６】
例示的なプライマーは、次の核酸配列：ＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＣＴＡＭＹＫＣＣＣＡＲＣＡＭＲＡＣ、またはＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＭＣＴＭＡＭＹＫＣＣＣＭＡＲＣＭＡＭＲＡＣを含むプライマーを、さらに包含する。
【００６７】
なお別の実施形態において、この集団中の各プライマーの相補体は、アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐ（配列番号９）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。配列番号９のプライマーは、上流側または下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。いくつかの実施形態において、配列番号９のプライマーは下流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第二ラウンドの間に用いられる。
【００６８】
配列番号９のアミノ酸配列のＧｌｙ−３、Ｓｅｒ−５、Ｔｈｒ−６、Ａｌａ−１０、およびＡｌａ−１１のパーセンテージは、約９５％から約９９．９％の範囲である。対応して、Ａｒｇ−３、Ｔｈｒ−５、Ａｓｎ−６、Ｖａｌ−１０、およびＡｓｐ−１１のパーセンテージは、約５％から約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−３、Ｓｅｒ−５、Ｔｈｒ−６、Ａｌａ−１０、またはＡｌａ−１１のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。Ａｒｇ−３、Ｔｈｒ−５、Ａｓｎ−６、Ｖａｌ−１０およびＡｓｐ−１１のパーセンテージは、それに応じて変化する。そして、各アミノ酸位置の２つのパーセンテージの合計は、１００％である。
【００６９】
配列番号９のアミノ酸配列のＬｙｓ−７およびＡｒｇ−７のパーセンテージは、それぞれ約９０％から約９５％および約１０％から約５％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｌｙｓ−７のパーセンテージは、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％である；対応して、Ａｒｇ−７のパーセンテージは、約１０％、９％、８％、７％、６％または５％である。
【００７０】
ある例示的な実施形態において、集団中のプライマーの相補体は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ｇｌｙ（１００％）−Ｓｅｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９９．５％）／Ａｒｇ（０．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｓｅｒ（９９．５％）／Ｔｈｒ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９％）／Ａｓｎ（１％）−Ｌｙｓ（９３％）／Ａｒｇ（７％）−Ｖａｌ（１００％）−Ｐｒｏ（１００％）−Ａｌａ（９９％）／Ｖａｌ（１％）−Ａｌａ（９９％）／Ａｓｐ（１％）。
【００７１】
別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣ（配列番号１０）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。ここで、配列番号１０のいずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としてはＬＮＡが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＭＣＹＴＴＭＲＧＴＭＧＣＴＭＹＴＭＴＭＲＣＭＣＧＣＴＭＲＣＣ、またはＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＭＲＧＴＧＣＴＭＹＴＴＭＲＣＣＧＣＴＭＲＣＣ。また別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣ（配列番号１１）、またはＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣ（配列番号１２）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。ここで、配列番号１１または１２のいずれの核酸配列のヌクレオチドも修飾され得る。
【００７２】
例示的なプライマーは、次の核酸配列：ＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＭＲＧＴＧＣＴＭＹＴＴＭＲＣＣＧＣＴＭＲＣＣ、またはＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＭＣＹＴＴＭＲＧＴＭＧＣＴＭＹＴＭＴＭＲＣＭＣＧＣＴＭＲＣＣを含むプライマーを、さらに包含する。
【００７３】
別の例示的な実施形態において、非縮重プライマーまたは特定の遺伝子型もしくはサブ遺伝子型に特異的なプライマーが、提供される。ＨＣＶ遺伝子型１ａのための例示的なプライマーとしては、
【００７４】
【化１】
が挙げられる。ＨＣＶ遺伝子型１ｂへの例示的なプライマーとしては、
【００７５】
【化２】
が挙げられる。
【００７６】
（キット）
本発明は、本発明のプライマーもしくはその相補体の一つ以上を含むキットを包含する。このキットは、本発明のプライマーのあらゆる組み合わせも含み得る。一つの実施形態において、このキットは、配列番号１および／または配列番号３あるいはそれらの相補体のポリペプチド配列をコードする、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。別の実施形態において、このキットは、配列番号５および／または配列番号９あるいはそれらの相補体のポリペプチド配列をコードする、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。さらに別の実施形態において、このキットは、配列番号２および／または配列番号４あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。なお別の実施形態において、このキットは、配列番号６、７および／または８あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。なお別の実施形態において、このキットは、配列番号１０、１１および／または１２あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。なお別の実施形態において、このキットは、配列番号６、７および／または８あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマー、ならびに配列番号１０、１１および／または１２あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。
【００７７】
なお別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶの領域を増幅する工程、ＨＣＶの遺伝子型または表現型を決定する工程、または薬剤耐性ＨＣＶの存在を決定する工程のための指示書をさらに含む。例えば、あるキットは、治療に対するＨＣＶの感受性を決定するための指示書を含み得る。そのようなキットは、抗ウイルス効果に対する候補治療薬をスクリーニングするために用いられ得る。
【００７８】
さらに別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶ核酸を増幅するための一つまたはそれ以上の酵素あるいは試薬を、さらに含む。例えば、一つの実施形態において、このキットは一つまたはそれ以上のプライマーおよびポリメラーゼ（例えば、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼなどの好熱性ポリメラーゼまたは中温性ポリメラーゼ）を含む。さらに別の実施形態において、このキットはｄＮＴＰｓを含む。このキットは必要に応じて、増幅バッファーを含んでもよい。
【００７９】
本発明のキットは、ラベルされた容器またはラベルされた複数の容器中の、一つまたはそれ以上のプライマーを含み得る。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶ核酸をクローン化するためのベクターを含む。例えば、本発明は、ＣＭＶプロモーターを有するベクターを含むキットを包含する。本発明は、レポーター部分（例えば、ルシフェラーゼ部分）をコードするベクターを含んでいるキットを包含する。本発明の一つの実施形態において、このキットはルシフェリンなどのルシフェラーゼの基質を含む。本発明のさらに別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶ核酸をクローニングするための一つまたはそれ以上のプライマーおよびベクターを含む。
【００８１】
（ＨＣＶの増幅）
本発明は、ＨＣＶ核酸を増幅するための方法を含む。本発明の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するために用いられ得る。この分子は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得る（好ましくは、二本鎖である）。出発物質としての核酸が二本鎖である場合、二本の鎖を一本鎖または部分的に一本鎖の形態にすることが好ましい。二本鎖を分離するための公知の方法としては、加熱処理、アルカリ処理、ホルムアミド処理、尿素処理、グリコサル（ｇｌｙｃｏｘａｌ）処理、酵素法（例えば、ヘリカーゼ作用）および結合タンパク質などが挙げられるが、これらに制限されない。例として、二本鎖の分離は、８０℃から１０５℃の範囲の温度で加熱することにより果たされ得る。この処理を行うための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）によって提供される。
【００８２】
一つの実施形態において、この方法は、本発明のプライマーを用いてＨＣＶサンプルからの核酸を増幅することを含む。ＨＣＶサンプルは、例えば、ＨＣＶに感染したまたは感染が疑われる患者からの臨床的検体であり得る。ＨＣＶを含む臨床的検体は、例えば、静脈穿刺または生検（例えば、血液および肝臓のサンプル）から得られ得る。ウイルス核酸は、検体から直接（すなわち、増幅前に単離および／または精製の段階が無い）増幅され得る。または、ウイルス核酸は、増幅前に当該分野で公知の方法によって単離および精製され得る。
【００８３】
本発明の方法は、ＨＣＶのプロテアーゼ領域を増幅するために用いられ得る。例えば、本発明は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインを増幅する方法を含む。本発明のプライマーの一つまたはそれ以上（例えば配列番号１−１２）は、ＨＣＶの領域を増幅するために用いられ得る。このプライマーは、一つまたはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。一つの例示的な実施形態において、配列番号１および配列番号３のプライマー、または配列番号５および配列番号９のプライマー、またはこれらの組み合わせが、用いられる。別の例示的な実施形態において、配列番号２および配列番号４のプライマー、または配列番号６、７もしくは８および配列番号１０、１１もしくは１２のプライマー、またはこれらの組み合わせが、ウイルスの核酸を増幅するために用いられる。
【００８４】
本発明は、全長ＮＳ３／４Ａプライマーを用いて、ＮＳ３をコードする核酸を増幅する方法を含む。一つの実施形態において、プライマーは、ＨＣＶに感染したまたは感染が疑われる患者に特異的な、全長ＮＳ３／４Ａプライマーである。別の実施形態において、プライマーは、ＮＳ３／４Ａまたはその一部分、ＮＳ３（ＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ３ヘリカーゼ）またはその一部分、ＮＳ２／ＮＳ３またはその一部分、あるいはＮＳ２／ＮＳ３／ＮＳ４Ａまたはその一部分をコードする核酸に、アニールする。別の実施形態において、プライマーはＨＣＶプロテアーゼドメインをコードする。
【００８５】
一つまたはそれ以上のプライマーは、特定のＨＣＶ配列に特異的であり得る（例えば、遺伝子型特異的）。本発明の一つの実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、縮重プライマーである。
【００８６】
異なったプライマーは、ＨＣＶの所望の領域を増幅するために、同時にまたは連続的に用いられ得る。本発明の一つの実施形態において、プライマーの二つまたはそれ以上のセットが用いられる。この実施形態において、プライマーの第二セットは、プライマーの第一セットで増幅された産物中の領域を、増幅するために用いられ得る（すなわち、プライマーの少なくとも一つのセットは内側に配置される）。
【００８７】
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当該分野で公知の方法によって、本発明のプライマーを用いて増幅され得る。ＰＣＲにおいて、本発明のプライマーのセットは、後のプライマーの伸長および変性を許容する条件下で、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓの存在下で、一本鎖ＨＣＶ核酸鋳型にアニールされる。例としては、米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，７６６，８８９号を参照のこと。これらはそれぞれ、本明細書においてその全体が援用される。当業者によって理解され得るように、様々な増幅方法が、本発明のプライマーを用いてＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸を増幅するために、用いられ得る。増幅法には、当該分野において公知の方法が用いられ、これには、非ポリメラーゼ連鎖反応法および好熱性ポリメラーゼの使用に頼らない方法（例えば、ｐｈｉ２９のような中温性ポリメラーゼ）が含まれる。増幅は、本明細書に記載されている方法を含む現在公知の増幅法または今後発見されるいずれかの増幅法を用いて行われ得るが、これらに制限されない。
【００８８】
（ＨＣＶ遺伝子型タイピングの方法）
本発明は、ＨＣＶの遺伝子型を決定する方法をさらに提供する。具体的には、本発明は、ＨＣＶゲノム全体の配列決定をせずにＨＣＶの遺伝子型を決定することを可能にする。むしろ、本発明は、当業者がＨＣＶプロテアーゼ（例えば、ＮＳ３、ＮＳ３／４ＡまたはＮＳ３およびＮＳ４Ａの一部分）の配列のみに基づいたＨＣＶ遺伝子型の決定をすることを、可能にする。
【００８９】
一つの実施形態において、この方法は、すでに記載されたように、プロテアーゼドメインをコードする核酸を増幅する工程（例えば、遺伝子型特異的プライマーまたは縮重プライマーを使用する）および、上述のプロテアーゼをコードする核酸断片の配列に基づいてＨＣＶの遺伝子型を決定する工程を含む。一つの実施形態において、この断片は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインの中である。
【００９０】
本発明はまた、非増幅法（例えば、配列決定技術またはハイブリダイゼーション技術）によって、ＨＣＶの遺伝子型を決定する方法も提供する。一つの実施形態において、ＨＣＶの遺伝子型は、ＮＳ３遺伝子型特異的なプライマーまたはプライマーのセットがＨＣＶ核酸にハイブリダイズすることが可能か否かを決定することによって、決定される。
【００９１】
本発明の遺伝子型タイピング方法は、ＨＣＶ単離物がＨＣＶ抗ウイルス治療に対し感受性であるか否かを決定するために用いられ得る。例えば、本発明の遺伝子型タイピング方法は、ＨＣＶ単離物のＮＳ３配列が抗ウイルス治療に対する耐性と関連があるか否かを決定するために用いられ得る。特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明の発明者らは、ＮＳ３プロテアーゼ領域中の単一アミノ酸置換が抗ウイルス治療に対する耐性を与え得る一方で、ヘリカーゼドメインおよびＮＳ４Ａ中のアミノ酸置換が例えばプロテアーゼインヒビターに対する耐性に影響することはないことを見出した。
【００９２】
本発明のさらに別の実施形態において、ＨＣＶ単離物の臨床的遺伝子型およびサブタイプが決定され得る。ＨＣＶの主要な臨床的遺伝子型は１１こ存在する。これらは、（ａ、ｂ、ｃ、その他と指定された）サブタイプによってさらに特徴づけがなされる。特定の臨床的遺伝子型は、他の遺伝子型よりも、現代の治療を用いてより治療しやすいことが示されている。例えば、遺伝子型１は、遺伝子型２および３と比較して、インターフェロン単独に対しては弱く反応する。それゆえ、本発明の方法は、ＨＣＶに感染した患者に対し、最も適切な（すなわち最も効果的かつ安全な）治療を選択する上で、医師を助けることに用いられ得る。このことは、例えば、ＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂを含むＨＣＶ遺伝子型１であるというように、ＨＣＶの遺伝子型またはサブタイプを決定する事によって行われる。
【００９３】
患者からのＨＣＶの遺伝子型決定のため、ウイルスを含む臨床的検体は、患者から得られなければならない。一つの実施形態において、検体は生検、例えば肝臓生検から得られる。別の実施形態において、検体は血液である。
【００９４】
ウイルスＲＮＡは、臨床的検体から単離され、増幅のための鋳型として用いられる。一つの実施形態において、核酸鋳型は、プロテアーゼ（例えば、ＮＳ３またはＮＳ３／４Ａ）をコードするウイルス核酸にアニールすることが可能な遺伝子型特異的プライマーを用いて増幅される。他の実施形態において、この核酸鋳型は、プロテアーゼ（例えば、ＮＳ３またはＮＳ３／４Ａ）をコードするウイルス核酸を増幅することが可能な縮重プライマーを用いて増幅される。本発明は、配列番号１および配列番号３（またはこれらの相補体）ならびに／あるいは配列番号５および配列番号９（またはこれらの相補体）のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いた遺伝子型タイピングの方法を含む。本発明は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１１または１２あるいはこれらの相補体に対応する一つまたはそれ以上のプライマーを用いた遺伝子型タイピングの方法もまた含む。本発明の一つの実施形態において、複数のプライマーセットは、遺伝子型解析のための多重アンプリコンを作製する目的で、ＮＳ３核酸を増幅するために用いられる。
【００９５】
増幅されたプロテアーゼ核酸は、その後、例えばサンガー配列決定法などの当該分野で公知の方法を用いて、配列決定される。ある実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、集団として配列決定される（例えば、被験体から単離されたＨＣＶの集団に対し、ＮＳ３プロテアーゼの配列を決定するため）。別の実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、個々に配列決定される（例えば、被験体から単離された個々のＨＣＶに対し、ＮＳ３プロテアーゼの配列を決定するため）。一つの実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、当該分野で公知の方法（ショットガン配列決定などが挙げられるが、これに限定されない）によって配列決定される前に、クローン化される。一つの実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、始めにクローン化されること無く、配列決定される。
【００９６】
一つの実施形態において、配列決定されたプロテアーゼ核酸の遺伝子型は、その配列と一つまたはそれ以上の公知の遺伝子型のプロテアーゼ配列とをアライメントする工程、および配列決定されたプロテアーゼ核酸と相同である公知の遺伝子型のプロテアーゼ配列を同定する工程によって決定され得る。この解析はコンピューターソフトウェア（例えば、ブラスト（Ｂｌａｓｔ））および当該分野で公知のコンピューターで読み取り可能なメディア上のデータベースを用いて行われ得る。
【００９７】
別の実施形態において、配列決定されたプロテアーゼ核酸の遺伝子型は、配列決定されたプロテアーゼ核酸の重要なヌクレオチド（または配列決定されたヌクレオチドにコードされるアミノ酸）と、公知の遺伝子型のコントロールとを比較することによって、決定され得る。
【００９８】
好ましい実施形態において、ウイルスＲＮＡは血清サンプルから単離される。このサンプルは、遺伝子型に関わらずＮＳ３プロテアーゼを増幅するように設計された縮重プライマーを用いて増幅される。増幅された核酸はその後、配列決定される。
【００９９】
当業者によって理解されているように、本発明の範囲は、上述の遺伝子型タイピング方法の変化形を含む。例えば、ＨＣＶは、ウイルス検体から始めにＲＮＡを単離することなく、増幅され得る。また、プライマーは、プロテアーゼ領域をコードするウイルス核酸にアニールすることが可能なプライマーである限り、改変され得る。例えば、増幅された領域は、ＮＳ３に加えて、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ４Ａ、および／またはＮＳ４Ｂ、あるいはそれらの一部などの、周囲のタンパク質ドメインをコードする核酸を、さらに含み得る。さらに、増幅された核酸は、配列決定の前にクローン化され得る。
【０１００】
（ＨＣＶ表現型タイピングの方法）
本発明は、ＨＣＶ表現型を決定する方法もさらに含む。一つの実施形態において、目的の表現型は、プロテアーゼ機能（例えば、ＮＳ３プロテアーゼ活性のレベル）である。別の実施形態において、目的の表現型は、抗ウイルス治療に対するＨＣＶの感受性である。例えば、本発明は、あるプロテアーゼインヒビターに対するＨＣＶの感受性を決定する方法を含む。本発明の別の実施形態において、目的の表現型は、抗ウイルス治療への耐性である。
【０１０１】
患者からのＨＣＶの表現型決定のため、ＨＣＶの臨床サンプルは、既に記載している被験者から得られる。例えば、ＨＣＶは、患者の血清から得られ得る。ＨＣＶのプロテアーゼドメインは、増幅され、そしてアンプリコン（すなわち、ＨＣＶカセット）は、スクリーニングベクター中にクローン化され得る。患者のＨＣＶカセットを含むこのスクリーニングベクターは、宿主細胞のトランスフェクションの前に、当該分野で公知の方法（例えば、マキシプレップ（ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ））によって精製され得る。
【０１０２】
本発明の表現型タイピング方法は、患者のＨＣＶカセットを必要とする。既に論じたように、ＨＣＶ核酸は、患者から得られ、そして増幅される。ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸は、この出願を通じて開示された方法によって、増幅され得る。例えば、ＨＣＶ核酸は、遺伝子型特異的プライマーを用いて増幅され得る。別の実施形態において、ＨＣＶ核酸は、縮重プライマーを用いて増幅される。本発明は、配列番号１および配列番号３（またはこれらの相補体）ならびに／あるいは配列番号５および配列番号９（またはこれらの相補体）のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いた、表現型タイピングの方法を含む。本発明は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１１、または１２あるいはこれらの相補体に対応する、一つまたはそれ以上のプライマーを用いて表現型タイピングする方法を、さらに含む。
【０１０３】
本発明の表現型タイピングレポーターシステムは、分泌可能なレポーター部分などの、レポーター部分をコードする核酸を含むスクリーニングベクターに依存している。一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、一つまたはそれ以上のＨＣＶ膜結合タンパク質および分泌可能レポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、このスクリーニングベクターは、ベクター中に許容されるＨＣＶ膜結合タンパク質の最大数、例えば、４Ａ、４Ｂ、および５Ａ（例えば、非特異的バックグラウンドノイズシグナルを最小化または少なくするため）および分泌可能なレポーターを含む。他の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なレポーターを含む。さらに別の実施形態において、このスクリーニングベクターは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ（例えば、４Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なレポーターを含む。なお別の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ（例えば、５Ａの最初の６アミノ酸）および分泌可能なレポーターを含む。
【０１０４】
一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌されるレポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。この実施形態において、ＮＳ３ドメインカセットは、このスクリーニングベクター中にクローン化される。ＮＳ３ドメインカセットは、例えばＮＳ３プロテアーゼドメイン、または、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびヘリカーゼドメインの一部をコードする核酸を、含み得る。本発明の一つの実施形態において、このカセットは、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびヘリカーゼドメイン一部（例えば、ヘリカーゼドメインの約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上）をコードする核酸を含む。
【０１０５】
一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌されるレポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。この実施形態において、ＮＳ３／４Ａドメインカセットは、このスクリーニングベクター中にクローン化される。本発明の別の実施形態において、このカセットは、ＮＳ３ドメイン（すなわち、ＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼドメイン）ならびにＮＳ４Ａドメインの一部（例えば、ＮＳ４Ａドメインの約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上）をコードする核酸を含む。
【０１０６】
既に論じたように、ＨＣＶカセットは、レポーター（例えば、分泌可能レポーター）をコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニングベクター中にクローン化される。ＮＳ３プロテアーゼドメインまたは全長プロテアーゼ（例えば、ＮＳ３ ＰｒｏまたはＮＳ３／４Ａ）をコードするＨＣＶカセット、ＮＳ部分（例えば、ＮＳ４Ｂおよび５Ｂ）をコードするベクター核酸、ならびに分泌されるレポーターをコードするべクター核酸は、作動可能に連結されている。そのため、分泌されたレポーターからのシグナルの検出は、機能的に所望のドメインの存在を示している。本発明の一つの実施形態において、このベクターはＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【０１０７】
本発明のスクリーニングベクターは、多数の細胞株に一過的にトランスフェクトされ得る。一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、２９３細胞株（例えば、２９３−ＦＳ細胞）にトランスフェクトされ得る。このシステムが、Ｈｕｈ−７細胞株または“治療された”レプリコン細胞株に制限されないことに注意することは、重要である。表現型タイピングアッセイに用いられ得る例示的なＨＣＶプロモーターシステムを、図２に示す。図２に記載されているように、ＮＳ３活性はレポーター活性（例えば、分泌されるルシフェラーゼ活性）に結び付けられる。図２のシステムは、ＤＮＡの容易かつ一貫性あるトランスフェクションを提供し、そして、ＲＮＡのトランスフェクションに関連した問題を回避する。
【０１０８】
本発明のレポーターシステムは、ＮＳ３カセットが機能的なプロテアーゼをコードするか否かを検出することが可能なレポーター部分を分泌することによって、機能する。具体的には、ポリペプチド内の機能的なプロテアーゼドメインは、翻訳されたポリペプチドからのレポーターを切断する。このプロテアーゼドメインが機能的でないならば、レポーター部分は切断されない。そのため、分泌されたシグナルの検出は、機能的なプロテアーゼドメインの存在を示し、一方、分泌されたシグナルの不存在は、機能的なプロテアーゼドメインの不存在を示す。特定の実施形態において、弱いシグナルは、非効率的なプロテアーゼの指標である。
【０１０９】
分泌可能なレポーターは、当該分野で公知のいずれのレポーター部分でもあり得る。一つの実施形態において、分泌可能なレポーターは、自らで分泌可能な検出可能部分、または分泌シグナルペプチドに作動可能に連結された後に分泌可能である検出可能部分である。別の実施形態において、分泌可能なレポーターは分泌可能ルシフェラーゼである。ルシフェラーゼが検出可能なシグナルを提供するためには、ルシフェラーゼの基質は利用可能でなければならない。本発明の一つの実施形態において、本発明のベクターを含む宿主細胞は、ルシフェラーゼの基質と接触させられる。一つの実施形態において、ルシフェリンなどのレポーター基質は細胞に添加され、その結果のシグナルが読まれる。一つの実施形態において、シグナルは蛍光シグナルである。一つの実施形態において、このシグナルは、例えばルミノメーターを用いる、当該分野で公知の方法によって読まれる。当業者によって理解されるように、別の状況で、レポーター部分がこのアッセイを行うために用いられる細胞中に他に存在していないならば、更なる分泌可能レポーター部分も、このシステムに用いられ得る。他の適切なレポーター部分としては、ＳＥＡＰが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１０】
一つの実施形態において、本発明の表現型アッセイは、ＨＣＶ単離物が抗ウイルス処置（例えば、プロテアーゼインヒビター治療）に対して感受性であるか否かを決定するために用いられ得る。この実施形態において、スクリーニングベクターを含む宿主細胞は、薬剤に接触させられる。この薬剤は、段階的に希釈され得る。もしこの薬剤がレポーターの分泌を阻止または低下させるのであれば、この薬剤はウイルスプロテアーゼ阻害において効果的である。この薬剤がレポーターの分泌を阻止または減少させるのか否かを決定するために、レポーター基質は添加され得る。例えば、もしレポーターがルシフェラーゼであるならば、ルシフェラーゼ基質が添加され得る。そしてシグナル強度は、決定され得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明の表現型アッセイは、ＨＣＶの集団（例えば、被験者から単離されたのＨＣＶの集団）が、抗ウイルス治療（例えば、プロテアーゼインヒビター治療）に対し感受性であるか否かを決定するために用いられ得る。この実施形態において、スクリーングベクターを含む宿主細胞は、薬剤と接触させられる。ここで、個々のスクリーニングベクターはＨＣＶの集団からの異なったＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸を含み得る。上述および本明細書の他の部分で記載されているように、薬剤は段階的に希釈され得、レポーター基質が添加され得、そしてレポーター活性が決定され得る。
【０１１２】
別の実施形態において、目的の薬剤に対する薬剤耐性は、患者のＨＣＶカセットを含むスクリーニングベクターを用いて一過的にトランスフェクトされた宿主細胞を、目的の薬剤と接触することによって、決定される。一つの実施形態において、目的の薬剤は、プロテアーゼインヒビターである。例えば、目的の薬剤はＩＴＭＮ−１９１であり得る。本発明の一つの実施形態において、目的の薬剤は段階的に希釈される（例えば、段階的に希釈されたＩＴＭＮ−１９１）。薬剤耐性は、レポーターの分泌によって示される。一つの実施形態において、分泌可能ルシフェラーゼは、レポーターであり、そしてルシフェラーゼ基質が添加される。分泌可能ルシフェラーゼ基質の添加の後、シグナル（すなわち蛍光）は、読まれる。シグナルの存在および強度に基づいて、解析が、薬剤耐性を決定するために行われ得る。一つの実施形態において、ＥＣ５０値は、薬剤濃度に対するレポーターシグナルをプロットすることによって、決定され得る。表現型タイピングアッセイでのＥＣ５０値のあらゆる上昇は、患者のＨＣＶ中の薬剤耐性の指標である。
【０１１３】
本発明の表現型タイピングの方法は、ハイスループットフォーマット中で、行われ得る。この分泌されるレポーターは、測定が容易であり、そして表現型タイピングシステムは、ロボティクスに修正することが可能である。一つの実施形態において、自動化は、一日あたり約９６、１４４、１９２、２４０または２８８個のサンプルへの１２点のＥＣ５０決定を可能にする。
【０１１４】
（核酸）
本発明はまた、ＨＣＶ ＮＳポリプロテインのＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする単離された核酸分子を提供する。例えば、本発明はＮＳ３プロテアーゼドメインならびに必要に応じてＮＳ２ドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン、ＮＳ４Ａドメイン、ＮＳ４Ｂドメインおよび／またはＮＳ５Ａドメイン、あるいはあらゆるこれらのドメインの一部をコードする単離された核酸分子を含む。一つの実施形態において、単離された核酸分子は、およそアミノ酸１７０から開始しているＮＳ２の一部をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびＮＳポリプロテインのＮＳ３ヘリカーゼドメインの少なくとも一部をコードする。例えば、本発明はＮＳ３プロテアーゼドメインおよびＮＳ３ヘリカーゼドメインの約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上をコードする単離された核酸分子を含む。本発明の一つの実施形態において、単離された核酸分子は、ＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン、およびＮＳ４Ａドメインをコードする。例えば、本発明は、ＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン、およびＮＳ４Ａドメインの少なくとも約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上をコードする単離された核酸分子を含む。
【０１１５】
一つの実施形態において、ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする単離された核酸分子は、本発明のプライマーを用いて取得される。例えば、単離された核酸分子は、ＮＳ３遺伝子型特異的プライマーを用いて取得され得る。別の実施形態において、単離された核酸分子は、遺伝子型に拘らずＮＳ３領域を増幅するために設計された縮重プライマーを用いて取得される。本発明は、配列番号１および配列番号３（またはこれらの相補体）ならびに／あるいは配列番号５および配列番号９（またはこれらの相補体）のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いて取得された、単離された核酸を含む。本発明は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１１または１２あるいはそれらの相補体に対応する一つまたはそれ以上のプライマーを用いて取得された、単離された核酸もまた、含む。
【０１１６】
本発明の単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖（例えば、二本鎖ＤＮＡ）であり得る。本発明は修飾されたヌクレオチドを含む核酸分子を包含する。例えば、本発明の核酸分子は、対応するＨＣＶ ＮＳ３ヌクレオチド配列に配列への一つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製され得る。その結果、一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失は、コードされたプロテイン中に導入される。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、長さにおいて、少なくとも約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチドであり、少なくとも一つのＮＳ３ヌクレオチド配列を含む核酸分子に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１１８】
核酸分子を複製するための、ならびに、ポリペプチドを発現するための宿主細胞およびベクターもまた、提供される。あらゆるベクターおよび宿主細胞が、用いられ得る（例えば、原核細胞または真核細胞）。多くのベクターおよび宿主細胞が、そのような目的のために、当該分野において公知である。当業者は、所望の適用のために適切なセットを選択することを容易になし得る。一つの実施形態において、ベクターはｐｃＤＮＡ３であり、また宿主細胞は２９３−ＦＳ細胞である。
【０１１９】
プローブに基づいた方法を用いてＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸配列を単離するための技術は、通常の技術であり、そして当業者に周知である。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）によって開示されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が、用いられ得る。これらは本明細書において援用される。そのような核酸配列を単離するためのプローブは、公表された核酸またはタンパク質の配列に基づき得る。
【０１２０】
単離されたＮＳ３核酸（または、ポリペプチド）の配列は、（核酸が単離された）ＨＣＶの遺伝子型を決定するために、コントロールＮＳ３配列と比較され得る。当該分野で公知のように、２つのポリヌクレオチド間、または２つのポリペプチド間の類似性は、一つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列およびその保存されたヌクレオチド置換またはアミノ酸の置換を、第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定される。また、当該分野でさらに公知であることは、“同一性”である。同一性とは、２つの配列間の一致を同定することによって決定される、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性および類似性は、容易に計算され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ I、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１２１】
２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定するための多数の方法が存在するが、用語“同一性”および“類似性”は、当業者に周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９９８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般的に用いられる方法は、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、ならびに、Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９９８）の中で開示されているものを含むが、これに限定されない。
【０１２２】
同一性を決定するための好ましい方法は、検査される２つの配列間で、最も大きな一致を生み出すように設計されている。同一性および類似性を決定するため方法は、コンピュータープログラムにコーディングされている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））を含むが、これに限定されない。上に記載した類似性または同一性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として決定される。また、これは、しばしば第二配列と第一配列との差異を示す。２つの核酸配列間の同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））中に提供されているＧＡＰなどの、当該分野で公知のコンピュータープログラム手段によって決定され得る。本発明のために２つの核酸配列間の同一性の程度を決定する目的のために、ＧＡＰは以下のセッティングを伴なって用いられ得る：５．０のＧＡＰ挿入ペナルティおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティ。
【０１２３】
本発明は、表現型スクリーニングベクター中にクローン化されたＨＣＶカセットを用いて、本発明の翻訳されたポリペプチドを生産するための方法をさらに含む。一般的用語において、タンパク質の組換え体の生産は、典型的には、以下の工程を含む。
【０１２４】
核酸分子は始めに取得される。この核酸分子は、ＮＳ３プロテアーゼドメインならびに必要に応じてＮＳ３ヘリカーゼおよび／またはＮＳ４Ａドメインをコードする。この核酸分子は、次に、適切な制御配列、ならびに、ＮＳポリプロテイン（例えば、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ）の一部または全てをコードする核酸、および、レポーター分子に作動可能に連結されて、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。この発現単位は、適切な宿主を形質転換（例えば、トランスフェクト）するために用いられ、そしてこの形質転換された宿主は、組換えポリペプチドの生産を許容する条件下で培養される。ポリペプチドの生産において、もしそのポリペプチドのプロテアーゼ部分が機能的であるならば、リポーター分子はポリペプチドから切断され、そして、細胞から分泌される。
【０１２５】
前述の工程の各々は、様々な方法で完遂され得る。例えば、様々な宿主で作動可能である発現ベクターの構築は、上述の適切なレプリコンおよび制御配列を用いて、完遂される。制御配列、発現ベクター、および形質転換法は、遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞のタイプに依存し、上記に詳しく議論されているか、そうでなければ、当業者に公知である。適切な制限部位をもし普通に利用できないのであれば、適切な制限部位をコード配列の末端に添加して、切除可能な遺伝子を提供して、ベクター中に挿入し得る。当業者は、当該分野で公知の任意の宿主／発現システムを、本発明の核酸分子との使用に容易に適合させて、所望の組換えポリペプチドを生産し得る。
【０１２６】
酵母システム、細菌システム、動物システム、植物システム、原核細胞システムおよび真核細胞システムを含む、様々な発現システムが、利用され得る。いくつかの実施形態において、哺乳類の細胞培養システムが、好まれる。
【０１２７】
（ベクター）
本発明中で用いるための発現単位には、５’から３’方向に作動可能に連結された以下の要素が一般的に含まれる：哺乳類の細胞で作動可能な転写プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、患者からのＨＣＶカセット（すなわち、ＮＳ３／４Ａをコードする核酸またはＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸）、少なくとも一つの更なるＮＳドメイン（例えば、必要に応じて５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）をコードしているＤＮＡ配列に連結されている、ＮＳ３ヘリカーゼ／４Ａ／４Ｂ／５Ａ（ＮＳ３プロテアーゼを含むカセットを使用しているとき）またはＮＳ４Ｂ／５Ａ（ＮＳ３／４Ａを含むカセットを使用しているとき））をコードするＤＮＡ配列、および、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）をコードするＤＮＡ配列。上で議論したように、ＨＣＶ ＮＳポリプロテイン部分をコードする核酸に対しまたは核酸中に融合されたＨＣＶカセットおよびレポーターの任意の他の配置は、本発明のベクター中で用いられ得る。適切なプロモーターの選択は、選択された宿主細胞によって決定される。また、このことは当業者にとって明白であり、より具体的に以下で議論される。
【０１２８】
本発明を実行する上で用いる哺乳類発現ベクターは、融合タンパク質の転写を指示することが可能なプロモーターを含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス２由来の主要な後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９９、１９８２）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４、１９８１）が挙げられる。細胞性プロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４、１９８３）およびマウスＶカッパー（米国特許第６，２９１，２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４６９、１９８７）が挙げられる。特に好ましいプロモーターは、マウスＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．、同書）である。
【０１２９】
（形質転換）
本発明の表現型スクリーニングベクターおよびＨＣＶカセットは、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）によって培養哺乳動物細胞中に導入され得る。電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、またはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などの、哺乳動物細胞へのクローン化されたＤＮＡ配列の導入のための他の方法もまた、用いられ得る。
【０１３０】
クローン化されたＤＮＡが組み込まれた細胞を同定するために、選択可能マーカーは、目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞中に導入され得る。培養される哺乳動物細胞中で用いるための選択可能マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬剤に対し耐性を与える遺伝子が挙げられる。選択可能マーカーは、増幅可能な選択可能マーカーであり得る。増幅可能な選択可能マーカーとしては、ＤＨＦＲ遺伝子（米国特許第６，２９１，２１２号を参照のこと）が挙げられる。選択可能マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓ．）によって概説されており、選択可能マーカーの選択は、十分に当業者のレベル内である。
【０１３１】
（宿主細胞）
本発明はまた、本発明の組換えポリペプチド（すなわち、ＮＳ３／４Ａ／４Ｂ／５Ａ／レポーター）を発現するために形質転換された（すなわち、トランスフェクトされた）細胞、好ましくは哺乳動物細胞を含む。形質転換された宿主細胞それ自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくは単一クローンの（クローン的に均質な）培養物、または単一クローン培養物由来の培養物もまた含む。もしレポーターペプチドが分泌されるのであれば、この培地はレポーターペプチドを細胞と共に含む。もしも、細胞がろ過されるか、または遠心分離機にかけられて除かれるのであれば、この培地は細胞を含まずにレポーターペプチドを含む。
【０１３２】
本発明の実施に用いるための宿主細胞としては、培養された哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞および細菌細胞のような、外因性のＤＮＡによって形質転換またはトランスフェクトされることおよび培地中で生育することが可能な、真核細胞およびいくつかのケースの原核細胞が挙げられる。
【０１３３】
本発明のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞は、適切な増殖培地の中で育てられる。本明細書で用いらる場合、用語“適切な増殖培地”とは、細胞の増殖に必要とされる栄養物を含む培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養物には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子が挙げられる。増殖培地は、例えば、薬剤選択によって、あるいは、ＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーまたはＤＮＡ構築物と共にトランスフェクトされる選択可能マーカーによって相補される必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築物を含む細胞を、一般的に選択する。
【０１３４】
培養される哺乳動物細胞は、市販の血清含有培地または血清非含有培地中で、通常の場合、増殖させられる。用いられる特定の細胞株に対して適切な培地を選択することは、当業者のレベル内である。トランスフェクトされた哺乳動物細胞は、目的のＤＮＡ配列の発現を開始するため、一定の期間、通常１−２日間増殖することが許される。次に、薬剤選択が、安定的に選択可能マーカーを発現している細胞の増殖を選択するために、行われる。増幅可能な選択可能マーカーを用いてトランスフェクトされた細胞に対し、薬剤濃度を段階的な様式で上昇させ、クローン化された配列のコピー数の増加について選択して、これによって発現レベルを上昇させ得る。
【０１３５】
上記の例を参照して本発明を詳細に記載してきたが、発明の本質から乖離することなく種々の改変がなされ得ることが、理解される。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。この出願に引用された全ての引用特許、特許出願および特許公報は、本明細書においてその全体が援用される。
【実施例】
【０１３６】
（実施例）
以下の実施例は、明示的または暗示的に、あらゆる様式、形態、または、型において本発明を説明することを意図しているが、限定することは意図していない。これらは、用いられるであろうものの典型であるが、一方で、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術を、代替的に用いることができる。
【０１３７】
（実施例１：ＨＣＶ ＮＳ３ドメイン縮重プライマーの設計）
好ましくはＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂの両方にアニーリング可能なプライマーを、ＨＣＶ ＮＳ３領域を増幅するために設計した。これらのプライマーを設計するために、公表されたＨＣＶ遺伝子型１（大部分は１ａおよび１ｂ）配列を集め、アラインメントして、高程度のホモロジーをもつ領域を見つけた。ホモロジー領域内での各核酸の出現頻度を計算した。カットオフ頻度パーセンテージを、許容可能な範囲内で、設計したプライマーの縮重を保つように割り当てた。縮重プライマーを設計する上で他に考慮している要素は、最も３’末端に位置する５塩基に縮重を含まないようにすることである。
【０１３８】
（実施例２：ＨＣＶ ＮＳ３ドメインの増幅）
ウイルスＲＮＡを臨床サンプルから単離し、そして、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインを第一、および第二ラウンド縮重プライマーを用いて増幅した。増幅されたＨＣＶの領域を、図７に示す。図７は、理にかなったホモロジーが同定された領域を表示している。示してあるように、“Ｕ”は上流側プライマーを表しており、“Ｄ”は下流側プライマーを表しており、それぞれ相同性領域の５’末端について、Ｃｏｎ−１位置に対応する番号を伴なっている。第二ラウンドのプライマーであるＵ３４２０およびＤ４０３８は、表現型タイピングベクター中にカセットクローニングをするための制限サイトを保持している。Ｕ３４２０はタンパク質翻訳のための開始コドンおよびコザック配列を持っている。図８−１１は、プライマーＵ３２７６、Ｄ４２２１、Ｕ３４２０、およびＤ４０３８それぞれの中における、遺伝子型１単離物におけるアミノ酸保存を示す。
【０１３９】
（実施例３：臨床サンプルを用いたＨＣＶ遺伝子型検査）
臨床単離物を、病院、臨床的研究室、および商業的団体を含む複数のソースより入手した。
【０１４０】
患者ＮＳ３クローンの表現型タイピングの結果を図１３に示す。図１２に示されている３つの増幅された臨床サンプルを、表現型タイピングベクターにクローン化し、そして表現型タイピングアッセイによって特徴づけた。
【０１４１】
図１４は遺伝子型１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーの配列を示す。図１５は遺伝子型１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーを用いたＰＣＲ増幅の結果の産物を示す。ＰＣＲ産物を精製し、そしてその集団を配列決定した。配列決定の結果は、これらがＨＣＶ １ａまたは１ｂ配列であることを明らかにした。
【０１４２】
（実施例４：ＨＣＶ表現型タイピングアッセイ）
図３は９６ウェルミニプレップで得られたＤＮＡを用いた表現型タイピングアッセイを示す。
【０１４３】
図４はハイスループットロボティックシステム中の９６ウェルプレート内でのシグナル変動を示す。
【０１４４】
図５は同じ表現型タイピングベクターを用いた同一日内、および複数日間のＥＣ５０変動を示す。
【０１４５】
図１９はインビトロＨＣＶレプリコン耐性研究で同定されたＮＳ３改変体の表現型タイピングＥＣ５０を示す。各改変体の個々のＥＣ５０値および異なる改変体のＥＣ５０ランクの順番は、レプリコントランジエントトランスフェクションデータと良い相関がある。
【０１４６】
（実施例５：ＨＣＶ表現型タイピングアッセイの自動化）
細胞ベースの表現型タイピングアッセイにハイスループットシステム（ＨＴＳ）を適用することができる。例えば、このアッセイを用いて、４０人の患者の５つの時点での少なくとも９６配列をスクリーニングすることが可能である。つまり１９，２００の対象を１０ヶ月以内に特徴付けることが可能である。
【０１４７】
図６は細胞ベースのレポーターアッセイのための自動化プロトコールの例示的なステップを示しているフローチャートを示す。実施例１に記載されている９６ウェルミニプレップから得られたＤＮＡを、このアッセイに用いることができる。このＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、その後、その細胞を、段階的に希釈したＩＴＭＮ−１９１などのＮＳ３／４Ａプロテアーゼ活性インヒビターで処理することが可能である。レポーターによって分泌されるルシフェラーゼの基質を添加し、分泌ルシフェラーゼの活性を決定する。分泌ルシフェラーゼ活性はプロテアーゼ活性の指標であり、つまりこれはＨＣＶ表現型の指標となる。
【０１４８】
現在のところ、好ましい実施形態を参照して本発明を記述してきたが、当業者に明らかなように、本発明の本質から乖離することなく種々の変更や改変をなし得るということを理解すべきである。それ故、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００７年１０月３０日に出願された米国仮出願６０／９８３，８５４号および２００８年４月７日に出願された米国仮出願６１／０４３，０２０号に対し優先権を主張し、そのいずれも、全容が本明細書において援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明はＨＣＶ遺伝子型タイピングおよび表現型タイピングのアッセイに関連する。本発明は、例えば、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメイン増幅の為の組成物およびプライマーを含む。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）はフラビウイルス科のエンベロープをもったプラス鎖のＲＮＡウイルスである。一本鎖ＨＣＶ ＲＮＡゲノムはプラスのポラリティをもち、約９６００塩基長の単一のオープンリーディングフレームを含む。そしてこれは約３，０１０アミノ酸のポリプロテインをコードしている。感染した細胞において、ポリプロテインは宿主とウイルスのプロテアーゼによって複数の部位で切断され、ウイルスの構造および非構造（ＮＳ）タンパク質が生産される。
【０００４】
構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２／ＮＳ１）はヌクレオカプシドタンパク質および１つまたは２つの膜結合グリコプロテインを構成する。非構造タンパク質（Ｎ２、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ）はＨＣＶ ＲＮＡゲノムの複製を触媒および制御する酵素またはアクセサリー因子である。ＮＳ３はタンパク質切断酵素であり、かつ、複製のためにウイルスゲノムの巻き戻しを促進するヘリカーゼでもある。ＮＳ５ｂはウイルスの複製に必要なＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼである。
【０００５】
ＨＣＶは世界の人口の約３％（１億７０００万人）に感染し、世界的な保健伝染病として世界保健機関によって宣言されている。ＨＣＶに感染した人々の約５０％から８０％はウイルス残留を伴なった慢性肝炎を発症する。慢性肝炎の罹患者は肝硬変および肝細胞ガン発症に対し、高リスクである。ＨＣＶによって引き起こされる最終段階の肝臓病が、肝臓移植の約３０％から４０％を占めている。
【０００６】
ＨＣＶ治療の現代の優れた標準的治療は、広範囲のスペクトルをもつ抗ウイルス剤であるリバビリンとペグ化αーインターフェロンの併用である。しかしながらその投与は長期化する上、耐容性が十分ではない。さらに遺伝子型１ＨＣＶの感染者の約半数しか、この治療に対する継続した反応を示さない。
【０００７】
有効かつ安全なインターフェロンに替わる治療法、またはインターフェロンを含むレジメンにおいて使用され得る治療法に対し、大きな要望がある。いくつかのＨＣＶ抗ウイルス治療は臨床試験の段階にある。例えば、これらの治療としては、ウイルスプロテアーゼインヒビターおよびポリメラーゼインヒビターが挙げられる。ＨＣＶプロテアーゼのＮＳ３インヒビターはすでに開発されており、これらは高い活性と選択性をもっている。この理由から、これらの化合物は、次世代の抗ＨＣＶ治療になる可能性をもっている。（例としては、特許文献１、特許文献２、特許文献３を参照のこと。これらはそれぞれ、本明細書においてその全容が援用される）。
【０００８】
ＨＣＶ感染患者のための新たな治療の選択の開発においてもたらされた進歩にも関わらず、薬剤耐性は主要な懸案事項である。ＨＣＶはＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼの修復活性に欠損があるため高い遺伝的多様性を示す。ＨＣＶポリメラーゼの低い正確性のため、ＨＣＶ薬剤耐性変異は、特異的なＨＣＶ抗ウイルス治療（例えばプロテアーゼインヒビターおよびポリメラーゼインヒビター）を用いて治療された患者において起こりやすい。これはＨＩＶ抗ウイルス治療が行われた患者において同様に観察される。ＨＣＶを特異的に標的とする抗ウイルス治療に対する耐性の発現に加えて、このウイルスはインターフェロンのような非特異的な抗ウイルス治療に対しても耐性を発現することができる。
【０００９】
プロテアーゼインヒビターに対する薬剤耐性は特段の懸案事項である。インビトロでの研究は、ＨＣＶプロテアーゼ中の変異がプロテアーゼインヒビターに対する耐性を与えることができることを示している。この発見はＨＩＶプロテアーゼでの発見に類似している。例えば、ＨＩＶにおいて、ＨＩＶプロテアーゼ中の特定の変異が、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターに対する感受性を低下する表現型をもたらすことが発見されている。
【００１０】
本発明はＨＣＶ遺伝子型およびＨＣＶ表現型を決定するために用いることができるプライマー、キット、および方法を提供する。例えば、本発明の方法は、あるＨＣＶ治療に対する患者の応答を予測すること、および、ＨＣＶ薬剤耐性（例えば、プロテアーゼ薬剤耐性）の決定に対して有用であり得る。本発明の方法はまた、活性に対する潜在的なプロテアーゼインヒビターをスクリーニングするための前臨床薬開発においても有効であり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第００／０９５４３号
【特許文献２】国際公開第００／０９５５８号
【特許文献３】国際公開第００／５９９２９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のサブタイプを同定するために有用なプライマーの発見およびＨＣＶの遺伝子型タイピングならびに表現型タイピングのための方法の発見を、一部基礎としている。それ故本発明は、プライマー、プライマーを含むキット、遺伝子型１ＨＣＶのようなあるＨＣＶの特異的な領域を増幅するための方法、遺伝子型１ａまたは１ｂのようなあるＨＣＶの遺伝子型および表現型を決定するための方法、などを提供する。本発明はまた、薬剤耐性ＨＣＶの存在を決定するための方法も含む。
【００１３】
本発明はプライマーの集団を提供する。このプライマーの集団は、第一および第二ラウンドプライマーを含むことができる。一つの実施形態において、各プライマーはＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓをコードする核酸配列を含んでいる。別の実施形態において、各プライマーの相補体はＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含んでいる。
【００１４】
また別の実施形態において、各プライマーはＡｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒをコードする核酸配列を含んでいる。さらに別の実施形態において、各プライマーの相補体はＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐをコードする核酸配列を含んでいる。
【００１５】
別の実施形態において、本発明のプライマーを含むキットが、提供される。
【００１６】
本発明は、ＮＳ３ ＨＣＶプロテアーゼドメインをコードする核酸を増幅する方法を、提供する。本発明の方法は、例えば、ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部分、ＮＳ３ドメインまたはその一部分（例えば、ＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ３ヘリカーゼの両方、またはＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ３ヘリカーゼの一部分の両方）、ＮＳ２／ＮＳ３ドメインまたはその一部分、あるいは、ＮＳ２／ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部分を、コードする核酸の増幅を含む。
【００１７】
本発明は、プライマーの第一および／または第二ラウンドを用いてＨＣＶプロテアーゼドメインを増幅することを含む。本発明の一つの実施形態において、プライマーの第二ラウンド（つまり第二セット）は、プライマーの第一セットを用いて増幅された核酸領域の内側に配置される。例えば、本発明はＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／ＬｙｓおよびＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含むプライマーの第一ラウンドを用いて、プロテアーゼドメインをコードするＨＣＶ核酸を増幅することを含む。プライマーの第二ラウンドはＡｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−ＴｈｒおよびＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐをコードする核酸配列を含むことができる。
【００１８】
本発明は、本発明のプライマーを用いて、ＨＣＶに感染した患者または感染が疑われる患者のサンプルからの核酸サンプルを増幅する方法を含む。本発明の一つの局面において、ＨＣＶプロテアーゼドメインは、遺伝子型非特異的縮重プライマーを用いて増幅される。本発明の別の局面において、ＨＣＶプロテアーゼドメインは遺伝子型特異的非縮重プライマーを用いて増幅される。本発明のさらに別の局面において、ＨＣＶプロテアーゼドメインは固定された核酸配列プライマーを用いて増幅される。
【００１９】
ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸配列内の変化にのみ基づいたＨＣＶの遺伝子型決定に、本発明のプライマーを用いることが可能である。本発明は、本発明のプライマーを用いて当業者に公知の方法（例えば、ＰＣＲ増幅法、配列決定法、ハイブリダイゼーション法）に基づいた核酸によってＨＣＶの遺伝子型タイピングを行うことを含む。
【００２０】
本発明の一つの実施形態において、ＨＣＶ遺伝子型は、ＮＳ３プロテアーゼドメインの増幅および／または配列決定によって決定される。例えば、本発明はＨＣＶのプロテアーゼドメイン中の核酸断片の増幅方法、およびその断片の配列に基づいたＨＣＶの遺伝子型決定方法を含む。本発明の一つの局面において、ＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型非特異的縮重プライマーを用いたＨＣＶプロテアーゼドメインの増幅およびその増幅された核酸産物の配列決定によって決定される。本発明の別の局面において、ＨＣＶの遺伝子型は、遺伝子型特異的非縮重プライマーを用いたＨＣＶプロテアーゼドメインの増幅およびその増幅された核酸産物の配列決定によって決定される。例えば、本発明の方法を用いて、ＨＣＶ遺伝子型は、標的配列と１ａおよび／または１ｂ ＨＣＶのような公知の遺伝子型の配列とを比較することによって決定され得る。
【００２１】
本発明は、例えば遺伝子型１ ＨＣＶをもつ患者において、薬剤耐性ＨＣＶの存在を決定する方法も提供する。一つの実施形態において、薬剤耐性ＨＣＶの存在は、ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸断片の増幅およびその断片内の薬剤耐性に関連する変異の存在の決定によって、決定される。この変異の存在は、薬剤耐性ＨＣＶの指標である。一つの実施形態において、増幅された核酸は、位置Ｄ１６８に、例えば、Ｄ１６８ＡおよびＤ１６８Ｖのような変異をコードしている。この核酸は、薬剤耐性を与えるような更なる変異をコードしてもよい。この変異としてはＮＳ３位置Ａ１５６（例えばＡ１５６ＴおよびＡ１５６Ｓ）ならびにＦ４３（例えばＦ４３Ｓ）が挙げられるが、これに限定されない。一つの実施例において、実施例２に記述されているプライマーＵ３４２０およびＵ４０３８は、これらの薬剤耐性関連変異を同定するために使用され得る。
【００２２】
本発明はＨＣＶの表現型（例えばプロテアーゼ活性）を決定する方法をさらに提供する。この方法は、１つまたはそれ以上のＨＣＶ膜結合タンパク質および分泌可能なレポーター（例えば分泌可能なルシフェラーゼレポーター）をコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニングベクターに、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインをクローン化することを含む。一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、このベクター中に許容されるＨＣＶ膜結合タンパク質の最大数、例えば、４Ａ、４Ｂ、５Ａ（例えば、非特異的バックグラウンドノイズシグナルを最小化または少なくするため）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。他の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）、および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。また別の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ（例えば、４Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。さらに別の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ（例えば、５Ａの最初の６アミノ酸）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターを含む。
【００２３】
このスクリーニングベクターはＮＳ３プロテアーゼドメイン、１つまたはそれ以上のさらなるＨＣＶ ＮＳドメイン（例えば、ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ）および分泌可能なレポーターをコードするポリヌクレオチドを発現し、ここで、ＮＳ３プロテアーゼドメイン、一つまたはそれ以上のＨＣＶ ＮＳドメイン、および分泌可能なレポーターは、作動可能に連結されている。もしＮＳ３プロテアーゼドメインが機能できるならば、すなわちポリプロテインを切断することができるならば、そのレポーター（例えばルシフェラーゼ）は切断され、分泌される。分泌されたレポーター由来のシグナルは、適切な基質（例えばルシフェラーゼ基質）の存在下で細胞の外で検出され得る。もしこのＮＳ３プロテアーゼドメインが機能できないならば、この分泌されたレポーターは切断されず、それゆえ分泌されない（すなわち細胞外のシグナルを生産することができない）。
【００２４】
本発明の一つの実施形態において、ＨＣＶは単離され、プロテアーゼインヒビターのようなＨＣＶアンチウイルス治療に対する感受性についてスクリーニングされる。この方法は、単離されたＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインを、本明細書に記載されるスクリーニングベクター（例えば、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なルシフェラーゼレポーターをコードするポリヌクレオチドを含んでいるスクリーニングベクター）にクローン化する工程を含む。トランスフェクトされた細胞はプロテアーゼインヒビターのような候補治療と接触させられる。もしＨＣＶがこの治療に対し感受性があるならば、ＮＳ３プロテアーゼは分泌可能なルシフェラーゼレポーターを切断せず、よってその分泌可能なルシフェラーゼレポーターは分泌されない。そのような方法は、例えば、抗ウイルス活性についての化合物の前臨床スクリーニング、ある患者がある抗ウイルス治療に対し応答するか否かを決定すること、およびある患者が特定の抗ウイルス治療に対し耐性であるか否かを決定するために有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、患者から得られたＨＣＶの耐性の決定の方法の例示的なステップを示しているフローチャートを示す。
【図２】図２は、例示的なレポーターシステムを示す。
【図３】図３は、９６ウェルミニプレップから得られたＤＮＡを用いた表現型タイピングアッセイの結果を示す。
【図４】図４は、９６ウェルプレート内での表現型タイピングアッセイシグナルの変動を示す。
【図５】図５は、表現型タイピングシステムを用いた同じＮＳ３配列のＥＣ５０変動を示す。
【図６】図６は、細胞ベースのレポーターアッセイのための自動化プロトコールの例示的なステップを示しているフローチャートを示す。
【図７】図７は、本発明の例示的プライマーを用いたＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインの遺伝子型タイピングおよび表現型タイピングを示す。
【図８】図８は、上流側プライマーＵ３２７６内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図９】図９は、下流側プライマーＤ４２２１内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図１０】図１０は、上流側プライマーＵ３４２０内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図１１】図１１は、下流側プライマーＤ４０３８内の遺伝子型１単離物間でのアミノ酸保存を示す。
【図１２】図１２は、遺伝子型１ａ／ｂ非特異的重合プライマーを用いた遺伝子型タイピングアッセイの結果を示す。
【図１３】図１３は、患者ＮＳ３クローンの表現型タイピングの結果を示す。
【図１４】図１４は、１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーの配列を示す。
【図１５】図１５は、遺伝子型１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーを用いて得られた結果を示す。
【図１６】図１６は、本発明の表現型タイピングアッセイの再現性を示す。
【図１７】図１７は、臨床サンプルを用いた擬似種（ｑｕａｓｉ−ｓｐｅｃｉｅｓ）解析を示す。
【図１８】図１８は、集団表現型タイピングおよびクローン表現型タイピング間の比較を示す。
【図１９】図１９は、この表現型タイピングアッセイがインビトロでの耐性研究で同定された改変体に対する有効性を報告することを示す。
【図２０】図２０は、混合された集団の解析において表現型タイピングアッセイを用いてインビトロで同定された置換の特徴づけを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（一般的記述）
本発明は、一つまたはそれ以上のＮＳ３ドメインをコードするＨＣＶ核酸にアニールすることが可能なＨＣＶプライマーを含む。本発明はまた、一つまたはそれ以上のＮＳ３ドメインをコードする核酸の増幅の方法、ＨＣＶのサブ遺伝子型タイピングのような遺伝子型タイピングの方法、薬剤耐性変異を検出する方法およびＨＣＶ表現型タイピングの方法も含む。本発明の組成物および方法は、一つまたはそれ以上のＮＳ３ドメインをコードしているウイルス核酸内の遺伝的変動を単独で（すなわちＮＳ３プロテアーゼ部分以外の改変の知識なしで）用いることにより、ＨＣＶの遺伝子型、抗ウイルス治療に対するＨＣＶの感受性および抗ウイルス治療（すなわち薬剤）に対するＨＣＶの耐性を決定することができるという発見を、一部基礎としている。
【００２７】
異なる定義がなされない限り、本明細書で用いられている全ての技術および科学的用語は、本発明が属する当業者によって普通に理解されることと同じ意味をもつ。本明細書で記述されていることと類似または等価であるあらゆる方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および物質が記述されている。
【００２８】
（定義）
本明細書で用いられる場合、用語“ＥＣ５０”または最大半量（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）有効濃度とは、ベースラインおよび最大値間の中間の反応を誘導する薬剤の濃度をいう。ＥＣ５０はインビボで最大効果の５０％を得るために必要とされる薬剤の血漿濃度をいう。用語“ＩＣ５０”または最大半量阻害濃度は、インビトロで５０％阻害に必要とされる薬剤またはインヒビターの濃度を表す。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、用語“遺伝子”とは、生物学的機能に関連したＤＮＡの任意の部分をいう。したがって、遺伝子としては、コード配列および／またはそれらの発現に必要とされる制御配列が挙げられるが、これに限定されない。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成するような非発現ＤＮＡ部分も含み得る。遺伝子は様々な供給源から取得され得（目的の供給源からのクローン化、または、既知のもしくは予想されている配列情報からの合成が挙げられる）、そして、望ましいパラメーターをもつようデザインされた配列を含み得る。
【００３０】
本明細書で用いられる場合、“遺伝子型タイピング”または“遺伝子型タイピングアッセイ”とは、ある生物、ある生物の一部、遺伝子または遺伝子の一部の、遺伝子配列の決定をいう。そのようなアッセイは、ある罹患者が特定の治療に対し順調に反応するであろう可能性を決定するために、ＨＣＶのようなウイルス中で行われ得る。そのようなアッセイはまた、薬剤耐性に関連した変異が存在するか否かを決定するためにも行われ得る。
【００３１】
本明細書で用いられる場合、用語“ＨＣＶカセット”とは、患者（すなわち、臨床的ＨＣＶ単離物）からのＨＣＶ ＮＳ３核酸配列をいう。ＨＣＶカセットは、更なるＮＳドメインをコードしている核酸を必要に応じて含んでもよい。例えば、このＨＣＶカセットはＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメインの全てまたは一部、および／あるいはＮＳ４Ａの全てまたは一部を、含んでもよい。
【００３２】
本明細書で用いられる場合、用語“単離された”とは、臨床的検体（例えば血液、血清）および／または他のウイルス組成物（例えば、他のタンパク質または核酸）から分離された目的のウイルス核酸またはタンパク質をいう。本明細書で用いられる場合、“単離された”核酸配列とは、他の核酸配列を本質的に含まない核酸配列をいう。例えば、少なくとも約２０％純粋、好ましくは少なくとも約４０％純粋、より好ましくは約６０％純粋、さらにより好ましくは約８０％純粋、最も好ましくは約９０％純粋、さらに最も好ましくは約９５％純粋である。単離された核酸の純度は、例えばアガロースゲルゲル電気泳動によって決定され得る。単離された核酸配列は、その天然の場所から再生産される異なる部位へと移すために、遺伝子工学において用いられている標準的クローン化手順によって取得され得る。クローン化手順としては、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む望ましい核酸配列断片の除去および単離、ベクター分子へのその断片の挿入、および核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製される場所である宿主細胞への組換えベクターの組み込みが、挙げられ得る。
【００３３】
本明細書で用いられる場合、用語“核酸”、“ポリヌクレオチド”、“オリゴヌクレオチド”および“プライマー”とは、一本鎖形態もしくは二本鎖形態いずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。そして、ポリヌクレオチドに含まれるとき、最も一般的に天然に存在しているコードヌクレオチドは、以下のように省略される：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）。さらに文字ＲおよびＹは、それぞれ、プリン（ＡまたはＧ）およびピリミジン（ＣまたはＴ）を表す。文字ＫはＧまたはＴ；文字ＳはＧまたはＣ；および文字ＶはＡ、ＧまたはＣを表す。さらに、ヌクレオチド後の上付き文字“Ｍ”は、その核酸が修飾されていることを示す。例えば、ＡＭ、ＧＭ、ＣＭおよびＴＭは、修飾されたアデニン、グアニン、シトシンおよびチミンをそれぞれ示している。修飾されたヌクレオチドの例は、固定された核酸（ＬＮＡ）を含むが、これに限定されない。異なる明記がなされない限り、一本鎖核酸配列は、５’から３’方向において一連の一文字省略形として示される。
【００３４】
異なる表示がなされない限り、ある特定の核酸配列はまた、明示的に示されている配列と同様に、それらの保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）およびその相補的配列も、黙示的に包含する。特に、縮重コドン置換体は、配列を作製することによって得られる得る。この配列の作製では、一つもしくはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目位置が混合された塩基および／またはデオキシイノシン残基によって置換されている（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８；Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１−９８）。用語の核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと、互換可能に使用される。
【００３５】
上流側プライマーは、増幅される核酸上の領域に対して、核酸分子の５’末端に近い領域に一般的に結合する。一方、下流側プライマーは、増幅される核酸上の領域に対して、核酸分子の３’末端に近い領域に一般的に結合する。
【００３６】
本明細書で用いられる場合、あるＤＮＡ部分が、他のＤＮＡ部分と機能的な関係にあるように配置されているとき、あるＤＮＡは“作動可能に連結されている”といわれる。例えば、シグナル配列のためのＤＮＡが、本発明の融合タンパク質の分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、シグナル配列のためのＤＮＡは本発明の融合タンパク質をコードしているＤＮＡに作動可能に連結されている；あるプロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写を刺激するならば、あるプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されているＤＮＡ配列は、隣接しており、そして、読み取られる状況にある。同様に、あるポリペプチド配列が、別のポリペプチド配列と機能的な関係にあるように配置されているとき、あるポリペプチド配列は“作動可能に連結されている”。すなわち、ある実施形態において、あるプロテアーゼ配列は、別のペプチド配列と作動可能に連結され、その結果、そのプロテアーゼ配列は、機能的ならば、ぺプチド配列に連結されている少なくとも一つのペプチド結合をタンパク分解することが可能である。
【００３７】
本明細書で用いられる場合、“表現型タイピング”または“表現型アッセイ”とは、ＨＣＶウイルスの表現型特徴（例えば、ある抗ウイルス剤に対する感受性および／または抗ウイルス治療への耐性など）の決定方法をいう。そのようなアッセイは、薬剤耐性に関連したある変異がＨＣＶ検体の中に存在するか否かを証明するために行われ得る。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、用語“ポリペプチド”とは、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の単一の鎖に作り上げられた化合物をいう。アミノ酸残基の通常の３文字または１文字コードは、本明細書の中で用いられ、アラニンはａｌａまたはＡ；アルギニンはａｒｇまたはＲ；アスパラギンはａｓｎまたはＮ；アスパラギン酸はａｓｐまたはＤ；システインはｃｙｃまたはＣ；グルタミン酸はｇｌｕまたはＥ；グルタミンはｇｌｎまたはＱ；グリシンはｇｌｙまたはＧ；ヒスチジンはｈｉｓまたはＨ；イソロイシンはｉｌｅまたはＩ；ロイシンはｌｅｕまたはＬ；リジンはｌｙｓまたはＫ；メチオニンはｍｅｔまたはＭ；フェニルアラニンはｐｈｅまたはＦ；プロリンはｐｒｏまたはＰ；セリンはｓｅｒまたはＳ；スレオニンはｔｈｒまたはＴ；トリプトファンはｔｒｐまたはＷ；チロシンはｔｙｒまたはＹそしてバリンはｖａｌまたはＶである。
【００３９】
異なる指示がなされない限り、ポリペプチド配列が一連の１文字および／または３文字省略形として表されるとき、一般的慣習に従い、その配列はＮからＣ方向に表される。省略形の後の数は、Ｎ末端からのアミノ酸の位置を示す（例えば、Ｍｅｔ−１は、位置１にあるメチオニンを表す）。
【００４０】
本明細書で用いられる場合、用語“組換え体”とは、遺伝子またはＤＮＡの新たな組み合わせを用いた形質転換を受けた、細胞、組織または生物をいう。
【００４１】
本明細書で用いられる場合、用語“被験体”とは、人間、哺乳類、または動物であり得る。治療されている罹患者は、治療が必要または治療が必要である可能性がある患者である。“被験体”および“患者”は本明細書では互換可能に用いられる。
【００４２】
プライマーに関連して、用語“実質的に相補的”とは、プライマーが指定されたアニーリング条件下で核酸配列に選択的にハイブリダイズするために十分に相補的であり、その結果、アニールされたプライマーがポリメラーゼによって伸長され、核酸配列の相補的コピーを形成し得ることを意味するために、本明細書中で用いられる。
【００４３】
本明細書で用いられる場合、用語“形質転換”は、細胞内に核酸（すなわちヌクレオチドポリマー）を移送することをいう。本明細書で用いられる場合、用語“遺伝的形質転換”とは、細胞内への、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移送および取り込みをいう。本明細書で用いられる場合“形質転換”はトランスフェクションを含む。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、用語“形質転換体”とは、形質転換またはトランスフェクションを受けた細胞、組織または生物をいう。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、用語“ベクター”とは、外来性の核酸をコードするプラスミド、ファージミドまたはウイルスのいずれかを広くいう。この用語はまた、ビリオンまたは細胞内への核酸の移行を容易にするような非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物（例えば、ポリリジン化合物など）を含むと解釈される。ベクターは、細胞内に核酸、またはその変異体を送達するための送達ビヒクルとして適しているウイルス性のベクターでもよい。または、ベクターは同じ目的のために適している非ウイルス性のベクターでもよい。細胞および組織へのＤＮＡの送達のためのウイルス性および非ウイルス性のベクターの例は、当該分野で周知であり、例えば、Ｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４−１２７４６）に記述されている。ウイルス性ベクターの例としては、組換えサイトメガロウイルス、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ関連ウイルス、組換えトリポックスウイルス、など（Ｃｒａｎａｇｅ ｅｔ ａｌ．、１９８６、ＥＭＢＯ Ｊ．５：３０５７−３０６３；１９９４年８月１８日に公開された国際公開公第ＷＯ９４／１７８１０号；１９９４年１０月２７日に公開された国際公開公第ＷＯ９４／２３７４４号）が挙げられるがこれらに限定されない。非ウイルス性ベクターの例としては、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体、などが挙げられるが、これらに制限されない。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、用語“野生型”とは、天然に存在しているポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列をいう。
【００４７】
（ＨＣＶプライマー）
本発明は、少なくとも１、２、３、４、または５つのプライマーを含むプライマーの集団を提供する。一つの実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＨＣＶゲノムの領域にアニーリング（すなわちハイブリダイズ）することが可能である。一つの実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＨＣＶプロテアーゼをコードする核酸にアニーリングすることが可能である。別の実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸にアニーリングすることが可能である。さらに別の実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部をコードする核酸にアニーリングすることが可能である。
【００４８】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に開示された、一つまたはそれ以上のプライマーは、核酸増幅に必要な条件下でＨＣＶゲノムの領域を増幅することが可能である。ある場合において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＨＣＶプロテアーゼをコードする核酸を増幅することが可能である。ある場合において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３プロテアーゼドメインまたはその一部をコードする核酸を増幅することが可能である。さらに別の場合において、一つまたはそれ以上のプライマーは、ＮＳ３／４Ａドメインまたはその一部をコードする核酸を増幅することが可能である。
【００４９】
このプライマーは、遺伝子型特異的または縮重プライマーであり得る。また、このプライマーは上流側プライマーまたは下流側プライマーであり得る。さらに増幅の第一ラウンド、第二ラウンド、またはその後のいずれのラウンドの間に、用いられ得る。このプライマーは、あらゆる公知の増幅方法に用いられ得る。公知の増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（“ＰＣＲ”）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（“ＲＴ−ＰＣＲ”）、リガーゼ連鎖反応（“ＬＣＲ”）、自己持続配列複製（“３ＳＲ”）これは核酸配列に基づいた増幅（“ＮＡＳＢＡ”）としても知られている、Ｑ−Ｂ−レプリカーゼ増幅、ローリングサークル増幅（“ＲＣＡ”）、転写媒介増幅（“ＴＭＡ”）、リンカー補助ＤＮＡ増幅（“ＬＡＤＡ”）、多重置換増幅（“ＭＤＡ”）、インベーダーおよび鎖置換増幅（“ＳＤＡ”）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５０】
一つの実施形態において、この集団の各プライマーは、アミノ酸配列：Ｍｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓ（配列番号１）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５１】
配列番号１のプライマーは、上流側プライマーまたは下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。一つの実施形態において、配列番号１のプライマーは上流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第一ラウンドの間に用いられる。
【００５２】
配列番号１のアミノ酸配列のＭｅｔ−１、Ｇｌｕ−２、Ｔｈｒ−３、Ｉｌｅ−６、Ｔｈｒ−７、およびＴｒｐ−８のパーセンテージは、約９５％から約９９．９％の範囲であり。対応して、Ｌｙｓ−１、Ｇｌｙ−２、Ｉｌｅ−３、Ａｌａ−６、Ｇｌｎ−７およびＬｙｓ−８のパーセンテージは、約５％から約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｍｅｔ−１、Ｇｌｕ−２、Ｔｈｒ−３、Ｉｌｅ−６、Ｔｈｒ−７、またはＴｒｐ−８のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。Ｌｙｓ−１、Ｇｌｙ−２、Ｉｌｅ−３、Ａｌａ−６、Ｇｌｎ−７およびＬｙｓ−８のパーセンテージは、それ応じて変化する。そして、各アミノ酸位置の２つのパーセンテージの合計は、１００％である。
【００５３】
配列番号１のアミノ酸配列のＩｌｅ−５、Ｖａｌ−５およびＬｅｕ−５のパーセンテージは、それぞれ約６７％から約７２％、約１４％から約１８％、約１２％から約１７％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｉｌｅ−５のパーセンテージは、約６７％、６８％、６９％、６９．１％、６９．２％、６９．３％、６９．４％、６９．５％、７０％、７１％または７２％である；Ｖａｌ−５のパーセンテージは、約１４％、１５％、１５．９％、１６％、１６．１％、１６．２％、１６．３％、１７％または１８％である；Ｌｅｕ−５のパーセンテージは、約１２％、１３％、１４％、１４．４％、１４．５％、１４．６％、１４．７％、１４．８％、１５％、１６％または１７％である。これらの、各アミノ酸のパーセンテージの合計は、１００％である。
【００５４】
一つの例示的な実施形態において、プライマーの集団は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ｍｅｔ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）−Ｇｌｕ（９９．５％）／Ｇｌｙ（０．５％）−Ｔｈｒ（９６．５％）／Ｉｌｅ（３．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｉｌｅ（６９．３％）／Ｖａｌ（１６．１％）／Ｌｅｕ（１４．６％）−Ｉｌｅ（９９．５％）／Ａｌａ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９．５％）／Ｇｌｎ（０．５％）−Ｔｒｐ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）
他の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＡＧＶＴＹＡＴＹＡＣＳＴＧＧＧ（配列番号２）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。配列番号２において、いずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としては、固定された核酸（ＬＮＡ）が挙げられるが、これに限定されない。本発明のプライマーは、修飾された塩基（例えばＬＮＡを有するプライマー）をいくつでも含み得るが、いくつかの実施形態においては、プライマーは約４または約８のＬＮＡを含む。一般に、ＡｓおよびＴｓでの修飾は、ＧｓおよびＣｓでの修飾より一般的である。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＳＴＧＧＧ、またはＡＭＴＧＭＧＭＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＭＳＴＧＧＧ。
【００５５】
別の実施形態において、集団中の各プライマーの相補体は、アミノ酸配列：Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ（配列番号３）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００５６】
配列番号３のプライマーは、上流側または下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。いくつかの実施形態において、配列番号３のプライマーは下流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第一ラウンドの間に用いられる。配列番号３のアミノ酸配列のＧｌｙ−４のパーセンテージは、約９５％から約９９％の範囲である。対応して、Ｃｙｓ−４のパーセンテージは、約５％から約１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−４のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。対応して、Ｃｙｓ−４のパーセンテージは、５％、４％、３％、２％または１％である。
【００５７】
ある例示的な実施形態において、集団中のプライマーの相補体は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ｓｅｒ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９７．０％）／Ｃｙｓ（３．０％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｐｈｅ（１００％）−Ｌｅｕ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ａｓｐ（１００％）−Ｇｌｙ（１００％）。
【００５８】
別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＡＣＴＴＧＣＣＲＴＡＧＧＴＧＧＡ（配列番号４）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。配列番号４において、いずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としてはＬＮＡが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＭＡＣＴＴＭＧＣＣＲＴＭＡＧＧＴＭＧＧＡ、またはＣＣＧＴＭＣＧＧＣＡＡＭＧＲＡＭＡＣＴＭＴＭＧＣＣＲＴＭＡＭＧＧＴＭＧＧＡ。
【００５９】
また別の実施形態において、この集団中の各プライマーは、アミノ酸配列：Ａｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ（配列番号５）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００６０】
配列番号５のプライマーは、上流側または下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。いくつかの実施形態において、配列番号５のプライマーは上流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第二ラウンドの間に用いられる。
【００６１】
配列番号５のアミノ酸配列のＰｒｏ−２、およびＧｌｎ−８のパーセンテージは、約９５％から約９９．９％の範囲である。対応して、Ｈｉｓ−２、およびＡｒｇ−８のパーセンテージは、約５％から約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｐｒｏ−２またはＧｌｎ−８のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。Ｈｉｓ−２およびＡｒｇ−８のパーセンテージは、それに応じて変化する。そして、各アミノ酸位置の２つのパーセンテージの合計は、１００％である。
【００６２】
配列番号５のアミノ酸配列のＳｅｒ−７およびＡｌａ−７のパーセンテージは、それぞれ約６４％から約６８％、および約３２％から約３６％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｓｅｒ−７のパーセンテージは、約６４％、６５％、６６％、６７％、または６８％である；また、Ａｌａ−７のパーセンテージは、約３２％、３３％、３４％、３５％または３６％である。これらの、各アミノ酸のパーセンテージの合計は、１００％である。
【００６３】
ある例示的な実施形態において、プライマーの集団は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ａｌａ（１００％）−Ｐｒｏ（９９．５％）／Ｈｉｓ（０．５％）−Ｉｌｅ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｓｅｒ（６６％）／Ａｌａ（３４％）−Ｇｌｎ（９９％）／Ａｒｇ（１％）−Ｇｌｎ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）。
【００６４】
別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣ（配列番号６）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。配列番号６において、いずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としてはＬＮＡが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＭＣＴＭＡＭＹＫＣＣＣＭＡＲＣＭＡＭＲＡＣ、またはＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＣＴＡＭＹＫＣＣＣＡＲＣＡＭＲＡＣ。
【００６５】
さらに別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣ（配列番号７）、またはＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣ（配列番号８）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。ここで、核酸配列、配列番号７または８のいずれのヌクレオチドも修飾され得る。
【００６６】
例示的なプライマーは、次の核酸配列：ＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＣＴＡＭＹＫＣＣＣＡＲＣＡＭＲＡＣ、またはＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＭＣＴＭＡＭＹＫＣＣＣＭＡＲＣＭＡＭＲＡＣを含むプライマーを、さらに包含する。
【００６７】
なお別の実施形態において、この集団中の各プライマーの相補体は、アミノ酸配列：Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐ（配列番号９）を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む。配列番号９のプライマーは、上流側または下流側プライマーであり得、そして、増幅の第一またはその後のラウンドの間に用いられ得る。いくつかの実施形態において、配列番号９のプライマーは下流側プライマーである。別の実施形態において、このプライマーは増幅の第二ラウンドの間に用いられる。
【００６８】
配列番号９のアミノ酸配列のＧｌｙ−３、Ｓｅｒ−５、Ｔｈｒ−６、Ａｌａ−１０、およびＡｌａ−１１のパーセンテージは、約９５％から約９９．９％の範囲である。対応して、Ａｒｇ−３、Ｔｈｒ−５、Ａｓｎ−６、Ｖａｌ−１０、およびＡｓｐ−１１のパーセンテージは、約５％から約０．１％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｇｌｙ−３、Ｓｅｒ−５、Ｔｈｒ−６、Ａｌａ−１０、またはＡｌａ−１１のパーセンテージは、約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％である。Ａｒｇ−３、Ｔｈｒ−５、Ａｓｎ−６、Ｖａｌ−１０およびＡｓｐ−１１のパーセンテージは、それに応じて変化する。そして、各アミノ酸位置の２つのパーセンテージの合計は、１００％である。
【００６９】
配列番号９のアミノ酸配列のＬｙｓ−７およびＡｒｇ−７のパーセンテージは、それぞれ約９０％から約９５％および約１０％から約５％の範囲である。いくつかの実施形態において、Ｌｙｓ−７のパーセンテージは、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％である；対応して、Ａｒｇ−７のパーセンテージは、約１０％、９％、８％、７％、６％または５％である。
【００７０】
ある例示的な実施形態において、集団中のプライマーの相補体は、次のアミノ酸配列の集団（各アミノ酸に関して、以下のような配分になっている）をコードする核酸配列を含む：Ｇｌｙ（１００％）−Ｓｅｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９９．５％）／Ａｒｇ（０．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｓｅｒ（９９．５％）／Ｔｈｒ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９％）／Ａｓｎ（１％）−Ｌｙｓ（９３％）／Ａｒｇ（７％）−Ｖａｌ（１００％）−Ｐｒｏ（１００％）−Ａｌａ（９９％）／Ｖａｌ（１％）−Ａｌａ（９９％）／Ａｓｐ（１％）。
【００７１】
別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣ（配列番号１０）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。ここで、配列番号１０のいずれのヌクレオチドも修飾され得る。修飾されたヌクレオチドの例としてはＬＮＡが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、各プライマーは次の核酸配列を含む：ＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＭＣＹＴＴＭＲＧＴＭＧＣＴＭＹＴＭＴＭＲＣＭＣＧＣＴＭＲＣＣ、またはＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＭＲＧＴＧＣＴＭＹＴＴＭＲＣＣＧＣＴＭＲＣＣ。また別の例示的な実施形態において、各プライマーは、核酸配列：ＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣ（配列番号１１）、またはＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣ（配列番号１２）に対して８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％相同である核酸配列を含む。ここで、配列番号１１または１２のいずれの核酸配列のヌクレオチドも修飾され得る。
【００７２】
例示的なプライマーは、次の核酸配列：ＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＭＲＧＴＧＣＴＭＹＴＴＭＲＣＣＧＣＴＭＲＣＣ、またはＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＭＣＹＴＴＭＲＧＴＭＧＣＴＭＹＴＭＴＭＲＣＭＣＧＣＴＭＲＣＣを含むプライマーを、さらに包含する。
【００７３】
別の例示的な実施形態において、非縮重プライマーまたは特定の遺伝子型もしくはサブ遺伝子型に特異的なプライマーが、提供される。ＨＣＶ遺伝子型１ａのための例示的なプライマーとしては、
【００７４】
【化１】
が挙げられる。ＨＣＶ遺伝子型１ｂへの例示的なプライマーとしては、
【００７５】
【化２】
が挙げられる。
【００７６】
（キット）
本発明は、本発明のプライマーもしくはその相補体の一つ以上を含むキットを包含する。このキットは、本発明のプライマーのあらゆる組み合わせも含み得る。一つの実施形態において、このキットは、配列番号１および／または配列番号３あるいはそれらの相補体のポリペプチド配列をコードする、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。別の実施形態において、このキットは、配列番号５および／または配列番号９あるいはそれらの相補体のポリペプチド配列をコードする、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。さらに別の実施形態において、このキットは、配列番号２および／または配列番号４あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。なお別の実施形態において、このキットは、配列番号６、７および／または８あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。なお別の実施形態において、このキットは、配列番号１０、１１および／または１２あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。なお別の実施形態において、このキットは、配列番号６、７および／または８あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマー、ならびに配列番号１０、１１および／または１２あるいはそれらの相補体の、一つまたはそれ以上のプライマーを含む。
【００７７】
なお別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶの領域を増幅する工程、ＨＣＶの遺伝子型または表現型を決定する工程、または薬剤耐性ＨＣＶの存在を決定する工程のための指示書をさらに含む。例えば、あるキットは、治療に対するＨＣＶの感受性を決定するための指示書を含み得る。そのようなキットは、抗ウイルス効果に対する候補治療薬をスクリーニングするために用いられ得る。
【００７８】
さらに別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶ核酸を増幅するための一つまたはそれ以上の酵素あるいは試薬を、さらに含む。例えば、一つの実施形態において、このキットは一つまたはそれ以上のプライマーおよびポリメラーゼ（例えば、タック（Ｔａｑ）ポリメラーゼなどの好熱性ポリメラーゼまたは中温性ポリメラーゼ）を含む。さらに別の実施形態において、このキットはｄＮＴＰｓを含む。このキットは必要に応じて、増幅バッファーを含んでもよい。
【００７９】
本発明のキットは、ラベルされた容器またはラベルされた複数の容器中の、一つまたはそれ以上のプライマーを含み得る。
【００８０】
本発明の別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶ核酸をクローン化するためのベクターを含む。例えば、本発明は、ＣＭＶプロモーターを有するベクターを含むキットを包含する。本発明は、レポーター部分（例えば、ルシフェラーゼ部分）をコードするベクターを含んでいるキットを包含する。本発明の一つの実施形態において、このキットはルシフェリンなどのルシフェラーゼの基質を含む。本発明のさらに別の実施形態において、このキットは、ＨＣＶ核酸をクローニングするための一つまたはそれ以上のプライマーおよびベクターを含む。
【００８１】
（ＨＣＶの増幅）
本発明は、ＨＣＶ核酸を増幅するための方法を含む。本発明の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅するために用いられ得る。この分子は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり得る（好ましくは、二本鎖である）。出発物質としての核酸が二本鎖である場合、二本の鎖を一本鎖または部分的に一本鎖の形態にすることが好ましい。二本鎖を分離するための公知の方法としては、加熱処理、アルカリ処理、ホルムアミド処理、尿素処理、グリコサル（ｇｌｙｃｏｘａｌ）処理、酵素法（例えば、ヘリカーゼ作用）および結合タンパク質などが挙げられるが、これらに制限されない。例として、二本鎖の分離は、８０℃から１０５℃の範囲の温度で加熱することにより果たされ得る。この処理を行うための一般的な方法は、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１）によって提供される。
【００８２】
一つの実施形態において、この方法は、本発明のプライマーを用いてＨＣＶサンプルからの核酸を増幅することを含む。ＨＣＶサンプルは、例えば、ＨＣＶに感染したまたは感染が疑われる患者からの臨床的検体であり得る。ＨＣＶを含む臨床的検体は、例えば、静脈穿刺または生検（例えば、血液および肝臓のサンプル）から得られ得る。ウイルス核酸は、検体から直接（すなわち、増幅前に単離および／または精製の段階が無い）増幅され得る。または、ウイルス核酸は、増幅前に当該分野で公知の方法によって単離および精製され得る。
【００８３】
本発明の方法は、ＨＣＶのプロテアーゼ領域を増幅するために用いられ得る。例えば、本発明は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインを増幅する方法を含む。本発明のプライマーの一つまたはそれ以上（例えば配列番号１−１２）は、ＨＣＶの領域を増幅するために用いられ得る。このプライマーは、一つまたはそれ以上の修飾されたヌクレオチドを含み得る。一つの例示的な実施形態において、配列番号１および配列番号３のプライマー、または配列番号５および配列番号９のプライマー、またはこれらの組み合わせが、用いられる。別の例示的な実施形態において、配列番号２および配列番号４のプライマー、または配列番号６、７もしくは８および配列番号１０、１１もしくは１２のプライマー、またはこれらの組み合わせが、ウイルスの核酸を増幅するために用いられる。
【００８４】
本発明は、全長ＮＳ３／４Ａプライマーを用いて、ＮＳ３をコードする核酸を増幅する方法を含む。一つの実施形態において、プライマーは、ＨＣＶに感染したまたは感染が疑われる患者に特異的な、全長ＮＳ３／４Ａプライマーである。別の実施形態において、プライマーは、ＮＳ３／４Ａまたはその一部分、ＮＳ３（ＮＳ３プロテアーゼおよびＮＳ３ヘリカーゼ）またはその一部分、ＮＳ２／ＮＳ３またはその一部分、あるいはＮＳ２／ＮＳ３／ＮＳ４Ａまたはその一部分をコードする核酸に、アニールする。別の実施形態において、プライマーはＨＣＶプロテアーゼドメインをコードする。
【００８５】
一つまたはそれ以上のプライマーは、特定のＨＣＶ配列に特異的であり得る（例えば、遺伝子型特異的）。本発明の一つの実施形態において、一つまたはそれ以上のプライマーは、縮重プライマーである。
【００８６】
異なったプライマーは、ＨＣＶの所望の領域を増幅するために、同時にまたは連続的に用いられ得る。本発明の一つの実施形態において、プライマーの二つまたはそれ以上のセットが用いられる。この実施形態において、プライマーの第二セットは、プライマーの第一セットで増幅された産物中の領域を、増幅するために用いられ得る（すなわち、プライマーの少なくとも一つのセットは内側に配置される）。
【００８７】
核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの当該分野で公知の方法によって、本発明のプライマーを用いて増幅され得る。ＰＣＲにおいて、本発明のプライマーのセットは、後のプライマーの伸長および変性を許容する条件下で、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓの存在下で、一本鎖ＨＣＶ核酸鋳型にアニールされる。例としては、米国特許第４，６８３，２０２号および同第５，７６６，８８９号を参照のこと。これらはそれぞれ、本明細書においてその全体が援用される。当業者によって理解され得るように、様々な増幅方法が、本発明のプライマーを用いてＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸を増幅するために、用いられ得る。増幅法には、当該分野において公知の方法が用いられ、これには、非ポリメラーゼ連鎖反応法および好熱性ポリメラーゼの使用に頼らない方法（例えば、ｐｈｉ２９のような中温性ポリメラーゼ）が含まれる。増幅は、本明細書に記載されている方法を含む現在公知の増幅法または今後発見されるいずれかの増幅法を用いて行われ得るが、これらに制限されない。
【００８８】
（ＨＣＶ遺伝子型タイピングの方法）
本発明は、ＨＣＶの遺伝子型を決定する方法をさらに提供する。具体的には、本発明は、ＨＣＶゲノム全体の配列決定をせずにＨＣＶの遺伝子型を決定することを可能にする。むしろ、本発明は、当業者がＨＣＶプロテアーゼ（例えば、ＮＳ３、ＮＳ３／４ＡまたはＮＳ３およびＮＳ４Ａの一部分）の配列のみに基づいたＨＣＶ遺伝子型の決定をすることを、可能にする。
【００８９】
一つの実施形態において、この方法は、すでに記載されたように、プロテアーゼドメインをコードする核酸を増幅する工程（例えば、遺伝子型特異的プライマーまたは縮重プライマーを使用する）および、上述のプロテアーゼをコードする核酸断片の配列に基づいてＨＣＶの遺伝子型を決定する工程を含む。一つの実施形態において、この断片は、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼドメインの中である。
【００９０】
本発明はまた、非増幅法（例えば、配列決定技術またはハイブリダイゼーション技術）によって、ＨＣＶの遺伝子型を決定する方法も提供する。一つの実施形態において、ＨＣＶの遺伝子型は、ＮＳ３遺伝子型特異的なプライマーまたはプライマーのセットがＨＣＶ核酸にハイブリダイズすることが可能か否かを決定することによって、決定される。
【００９１】
本発明の遺伝子型タイピング方法は、ＨＣＶ単離物がＨＣＶ抗ウイルス治療に対し感受性であるか否かを決定するために用いられ得る。例えば、本発明の遺伝子型タイピング方法は、ＨＣＶ単離物のＮＳ３配列が抗ウイルス治療に対する耐性と関連があるか否かを決定するために用いられ得る。特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明の発明者らは、ＮＳ３プロテアーゼ領域中の単一アミノ酸置換が抗ウイルス治療に対する耐性を与え得る一方で、ヘリカーゼドメインおよびＮＳ４Ａ中のアミノ酸置換が例えばプロテアーゼインヒビターに対する耐性に影響することはないことを見出した。
【００９２】
本発明のさらに別の実施形態において、ＨＣＶ単離物の臨床的遺伝子型およびサブタイプが決定され得る。ＨＣＶの主要な臨床的遺伝子型は１１こ存在する。これらは、（ａ、ｂ、ｃ、その他と指定された）サブタイプによってさらに特徴づけがなされる。特定の臨床的遺伝子型は、他の遺伝子型よりも、現代の治療を用いてより治療しやすいことが示されている。例えば、遺伝子型１は、遺伝子型２および３と比較して、インターフェロン単独に対しては弱く反応する。それゆえ、本発明の方法は、ＨＣＶに感染した患者に対し、最も適切な（すなわち最も効果的かつ安全な）治療を選択する上で、医師を助けることに用いられ得る。このことは、例えば、ＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂを含むＨＣＶ遺伝子型１であるというように、ＨＣＶの遺伝子型またはサブタイプを決定する事によって行われる。
【００９３】
患者からのＨＣＶの遺伝子型決定のため、ウイルスを含む臨床的検体は、患者から得られなければならない。一つの実施形態において、検体は生検、例えば肝臓生検から得られる。別の実施形態において、検体は血液である。
【００９４】
ウイルスＲＮＡは、臨床的検体から単離され、増幅のための鋳型として用いられる。一つの実施形態において、核酸鋳型は、プロテアーゼ（例えば、ＮＳ３またはＮＳ３／４Ａ）をコードするウイルス核酸にアニールすることが可能な遺伝子型特異的プライマーを用いて増幅される。他の実施形態において、この核酸鋳型は、プロテアーゼ（例えば、ＮＳ３またはＮＳ３／４Ａ）をコードするウイルス核酸を増幅することが可能な縮重プライマーを用いて増幅される。本発明は、配列番号１および配列番号３（またはこれらの相補体）ならびに／あるいは配列番号５および配列番号９（またはこれらの相補体）のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いた遺伝子型タイピングの方法を含む。本発明は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１１または１２あるいはこれらの相補体に対応する一つまたはそれ以上のプライマーを用いた遺伝子型タイピングの方法もまた含む。本発明の一つの実施形態において、複数のプライマーセットは、遺伝子型解析のための多重アンプリコンを作製する目的で、ＮＳ３核酸を増幅するために用いられる。
【００９５】
増幅されたプロテアーゼ核酸は、その後、例えばサンガー配列決定法などの当該分野で公知の方法を用いて、配列決定される。ある実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、集団として配列決定される（例えば、被験体から単離されたＨＣＶの集団に対し、ＮＳ３プロテアーゼの配列を決定するため）。別の実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、個々に配列決定される（例えば、被験体から単離された個々のＨＣＶに対し、ＮＳ３プロテアーゼの配列を決定するため）。一つの実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、当該分野で公知の方法（ショットガン配列決定などが挙げられるが、これに限定されない）によって配列決定される前に、クローン化される。一つの実施形態において、増幅されたプロテアーゼ核酸は、始めにクローン化されること無く、配列決定される。
【００９６】
一つの実施形態において、配列決定されたプロテアーゼ核酸の遺伝子型は、その配列と一つまたはそれ以上の公知の遺伝子型のプロテアーゼ配列とをアライメントする工程、および配列決定されたプロテアーゼ核酸と相同である公知の遺伝子型のプロテアーゼ配列を同定する工程によって決定され得る。この解析はコンピューターソフトウェア（例えば、ブラスト（Ｂｌａｓｔ））および当該分野で公知のコンピューターで読み取り可能なメディア上のデータベースを用いて行われ得る。
【００９７】
別の実施形態において、配列決定されたプロテアーゼ核酸の遺伝子型は、配列決定されたプロテアーゼ核酸の重要なヌクレオチド（または配列決定されたヌクレオチドにコードされるアミノ酸）と、公知の遺伝子型のコントロールとを比較することによって、決定され得る。
【００９８】
好ましい実施形態において、ウイルスＲＮＡは血清サンプルから単離される。このサンプルは、遺伝子型に関わらずＮＳ３プロテアーゼを増幅するように設計された縮重プライマーを用いて増幅される。増幅された核酸はその後、配列決定される。
【００９９】
当業者によって理解されているように、本発明の範囲は、上述の遺伝子型タイピング方法の変化形を含む。例えば、ＨＣＶは、ウイルス検体から始めにＲＮＡを単離することなく、増幅され得る。また、プライマーは、プロテアーゼ領域をコードするウイルス核酸にアニールすることが可能なプライマーである限り、改変され得る。例えば、増幅された領域は、ＮＳ３に加えて、ｐ７、ＮＳ２、ＮＳ４Ａ、および／またはＮＳ４Ｂ、あるいはそれらの一部などの、周囲のタンパク質ドメインをコードする核酸を、さらに含み得る。さらに、増幅された核酸は、配列決定の前にクローン化され得る。
【０１００】
（ＨＣＶ表現型タイピングの方法）
本発明は、ＨＣＶ表現型を決定する方法もさらに含む。一つの実施形態において、目的の表現型は、プロテアーゼ機能（例えば、ＮＳ３プロテアーゼ活性のレベル）である。別の実施形態において、目的の表現型は、抗ウイルス治療に対するＨＣＶの感受性である。例えば、本発明は、あるプロテアーゼインヒビターに対するＨＣＶの感受性を決定する方法を含む。本発明の別の実施形態において、目的の表現型は、抗ウイルス治療への耐性である。
【０１０１】
患者からのＨＣＶの表現型決定のため、ＨＣＶの臨床サンプルは、既に記載している被験者から得られる。例えば、ＨＣＶは、患者の血清から得られ得る。ＨＣＶのプロテアーゼドメインは、増幅され、そしてアンプリコン（すなわち、ＨＣＶカセット）は、スクリーニングベクター中にクローン化され得る。患者のＨＣＶカセットを含むこのスクリーニングベクターは、宿主細胞のトランスフェクションの前に、当該分野で公知の方法（例えば、マキシプレップ（ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ））によって精製され得る。
【０１０２】
本発明の表現型タイピング方法は、患者のＨＣＶカセットを必要とする。既に論じたように、ＨＣＶ核酸は、患者から得られ、そして増幅される。ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸は、この出願を通じて開示された方法によって、増幅され得る。例えば、ＨＣＶ核酸は、遺伝子型特異的プライマーを用いて増幅され得る。別の実施形態において、ＨＣＶ核酸は、縮重プライマーを用いて増幅される。本発明は、配列番号１および配列番号３（またはこれらの相補体）ならびに／あるいは配列番号５および配列番号９（またはこれらの相補体）のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いた、表現型タイピングの方法を含む。本発明は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１１、または１２あるいはこれらの相補体に対応する、一つまたはそれ以上のプライマーを用いて表現型タイピングする方法を、さらに含む。
【０１０３】
本発明の表現型タイピングレポーターシステムは、分泌可能なレポーター部分などの、レポーター部分をコードする核酸を含むスクリーニングベクターに依存している。一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、一つまたはそれ以上のＨＣＶ膜結合タンパク質および分泌可能レポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、このスクリーニングベクターは、ベクター中に許容されるＨＣＶ膜結合タンパク質の最大数、例えば、４Ａ、４Ｂ、および５Ａ（例えば、非特異的バックグラウンドノイズシグナルを最小化または少なくするため）および分泌可能なレポーターを含む。他の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なレポーターを含む。さらに別の実施形態において、このスクリーニングベクターは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ（例えば、４Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌可能なレポーターを含む。なお別の実施形態において、このスクリーニングベクターはＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ（例えば、５Ａの最初の６アミノ酸）および分泌可能なレポーターを含む。
【０１０４】
一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌されるレポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。この実施形態において、ＮＳ３ドメインカセットは、このスクリーニングベクター中にクローン化される。ＮＳ３ドメインカセットは、例えばＮＳ３プロテアーゼドメイン、または、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびヘリカーゼドメインの一部をコードする核酸を、含み得る。本発明の一つの実施形態において、このカセットは、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびヘリカーゼドメイン一部（例えば、ヘリカーゼドメインの約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上）をコードする核酸を含む。
【０１０５】
一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、ＨＣＶ ＮＳ４Ｂ、５Ａ、５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）および分泌されるレポーターをコードするポリヌクレオチドを含む。この実施形態において、ＮＳ３／４Ａドメインカセットは、このスクリーニングベクター中にクローン化される。本発明の別の実施形態において、このカセットは、ＮＳ３ドメイン（すなわち、ＮＳ３プロテアーゼおよびヘリカーゼドメイン）ならびにＮＳ４Ａドメインの一部（例えば、ＮＳ４Ａドメインの約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上）をコードする核酸を含む。
【０１０６】
既に論じたように、ＨＣＶカセットは、レポーター（例えば、分泌可能レポーター）をコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニングベクター中にクローン化される。ＮＳ３プロテアーゼドメインまたは全長プロテアーゼ（例えば、ＮＳ３ ＰｒｏまたはＮＳ３／４Ａ）をコードするＨＣＶカセット、ＮＳ部分（例えば、ＮＳ４Ｂおよび５Ｂ）をコードするベクター核酸、ならびに分泌されるレポーターをコードするべクター核酸は、作動可能に連結されている。そのため、分泌されたレポーターからのシグナルの検出は、機能的に所望のドメインの存在を示している。本発明の一つの実施形態において、このベクターはＣＭＶプロモーターの制御下にある。
【０１０７】
本発明のスクリーニングベクターは、多数の細胞株に一過的にトランスフェクトされ得る。一つの実施形態において、このスクリーニングベクターは、２９３細胞株（例えば、２９３−ＦＳ細胞）にトランスフェクトされ得る。このシステムが、Ｈｕｈ−７細胞株または“治療された”レプリコン細胞株に制限されないことに注意することは、重要である。表現型タイピングアッセイに用いられ得る例示的なＨＣＶプロモーターシステムを、図２に示す。図２に記載されているように、ＮＳ３活性はレポーター活性（例えば、分泌されるルシフェラーゼ活性）に結び付けられる。図２のシステムは、ＤＮＡの容易かつ一貫性あるトランスフェクションを提供し、そして、ＲＮＡのトランスフェクションに関連した問題を回避する。
【０１０８】
本発明のレポーターシステムは、ＮＳ３カセットが機能的なプロテアーゼをコードするか否かを検出することが可能なレポーター部分を分泌することによって、機能する。具体的には、ポリペプチド内の機能的なプロテアーゼドメインは、翻訳されたポリペプチドからのレポーターを切断する。このプロテアーゼドメインが機能的でないならば、レポーター部分は切断されない。そのため、分泌されたシグナルの検出は、機能的なプロテアーゼドメインの存在を示し、一方、分泌されたシグナルの不存在は、機能的なプロテアーゼドメインの不存在を示す。特定の実施形態において、弱いシグナルは、非効率的なプロテアーゼの指標である。
【０１０９】
分泌可能なレポーターは、当該分野で公知のいずれのレポーター部分でもあり得る。一つの実施形態において、分泌可能なレポーターは、自らで分泌可能な検出可能部分、または分泌シグナルペプチドに作動可能に連結された後に分泌可能である検出可能部分である。別の実施形態において、分泌可能なレポーターは分泌可能ルシフェラーゼである。ルシフェラーゼが検出可能なシグナルを提供するためには、ルシフェラーゼの基質は利用可能でなければならない。本発明の一つの実施形態において、本発明のベクターを含む宿主細胞は、ルシフェラーゼの基質と接触させられる。一つの実施形態において、ルシフェリンなどのレポーター基質は細胞に添加され、その結果のシグナルが読まれる。一つの実施形態において、シグナルは蛍光シグナルである。一つの実施形態において、このシグナルは、例えばルミノメーターを用いる、当該分野で公知の方法によって読まれる。当業者によって理解されるように、別の状況で、レポーター部分がこのアッセイを行うために用いられる細胞中に他に存在していないならば、更なる分泌可能レポーター部分も、このシステムに用いられ得る。他の適切なレポーター部分としては、ＳＥＡＰが挙げられるが、これに限定されない。
【０１１０】
一つの実施形態において、本発明の表現型アッセイは、ＨＣＶ単離物が抗ウイルス処置（例えば、プロテアーゼインヒビター治療）に対して感受性であるか否かを決定するために用いられ得る。この実施形態において、スクリーニングベクターを含む宿主細胞は、薬剤に接触させられる。この薬剤は、段階的に希釈され得る。もしこの薬剤がレポーターの分泌を阻止または低下させるのであれば、この薬剤はウイルスプロテアーゼ阻害において効果的である。この薬剤がレポーターの分泌を阻止または減少させるのか否かを決定するために、レポーター基質は添加され得る。例えば、もしレポーターがルシフェラーゼであるならば、ルシフェラーゼ基質が添加され得る。そしてシグナル強度は、決定され得る。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明の表現型アッセイは、ＨＣＶの集団（例えば、被験者から単離されたのＨＣＶの集団）が、抗ウイルス治療（例えば、プロテアーゼインヒビター治療）に対し感受性であるか否かを決定するために用いられ得る。この実施形態において、スクリーングベクターを含む宿主細胞は、薬剤と接触させられる。ここで、個々のスクリーニングベクターはＨＣＶの集団からの異なったＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸を含み得る。上述および本明細書の他の部分で記載されているように、薬剤は段階的に希釈され得、レポーター基質が添加され得、そしてレポーター活性が決定され得る。
【０１１２】
別の実施形態において、目的の薬剤に対する薬剤耐性は、患者のＨＣＶカセットを含むスクリーニングベクターを用いて一過的にトランスフェクトされた宿主細胞を、目的の薬剤と接触することによって、決定される。一つの実施形態において、目的の薬剤は、プロテアーゼインヒビターである。例えば、目的の薬剤はＩＴＭＮ−１９１であり得る。本発明の一つの実施形態において、目的の薬剤は段階的に希釈される（例えば、段階的に希釈されたＩＴＭＮ−１９１）。薬剤耐性は、レポーターの分泌によって示される。一つの実施形態において、分泌可能ルシフェラーゼは、レポーターであり、そしてルシフェラーゼ基質が添加される。分泌可能ルシフェラーゼ基質の添加の後、シグナル（すなわち蛍光）は、読まれる。シグナルの存在および強度に基づいて、解析が、薬剤耐性を決定するために行われ得る。一つの実施形態において、ＥＣ５０値は、薬剤濃度に対するレポーターシグナルをプロットすることによって、決定され得る。表現型タイピングアッセイでのＥＣ５０値のあらゆる上昇は、患者のＨＣＶ中の薬剤耐性の指標である。
【０１１３】
本発明の表現型タイピングの方法は、ハイスループットフォーマット中で、行われ得る。この分泌されるレポーターは、測定が容易であり、そして表現型タイピングシステムは、ロボティクスに修正することが可能である。一つの実施形態において、自動化は、一日あたり約９６、１４４、１９２、２４０または２８８個のサンプルへの１２点のＥＣ５０決定を可能にする。
【０１１４】
（核酸）
本発明はまた、ＨＣＶ ＮＳポリプロテインのＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする単離された核酸分子を提供する。例えば、本発明はＮＳ３プロテアーゼドメインならびに必要に応じてＮＳ２ドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン、ＮＳ４Ａドメイン、ＮＳ４Ｂドメインおよび／またはＮＳ５Ａドメイン、あるいはあらゆるこれらのドメインの一部をコードする単離された核酸分子を含む。一つの実施形態において、単離された核酸分子は、およそアミノ酸１７０から開始しているＮＳ２の一部をコードする。別の実施形態において、核酸分子は、ＮＳ３プロテアーゼドメインおよびＮＳポリプロテインのＮＳ３ヘリカーゼドメインの少なくとも一部をコードする。例えば、本発明はＮＳ３プロテアーゼドメインおよびＮＳ３ヘリカーゼドメインの約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上をコードする単離された核酸分子を含む。本発明の一つの実施形態において、単離された核酸分子は、ＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン、およびＮＳ４Ａドメインをコードする。例えば、本発明は、ＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼドメイン、およびＮＳ４Ａドメインの少なくとも約４アミノ酸、約５アミノ酸、約６アミノ酸、約７アミノ酸、約８アミノ酸、約９アミノ酸、または約１０アミノ酸またはそれ以上をコードする単離された核酸分子を含む。
【０１１５】
一つの実施形態において、ＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする単離された核酸分子は、本発明のプライマーを用いて取得される。例えば、単離された核酸分子は、ＮＳ３遺伝子型特異的プライマーを用いて取得され得る。別の実施形態において、単離された核酸分子は、遺伝子型に拘らずＮＳ３領域を増幅するために設計された縮重プライマーを用いて取得される。本発明は、配列番号１および配列番号３（またはこれらの相補体）ならびに／あるいは配列番号５および配列番号９（またはこれらの相補体）のアミノ酸配列をコードするプライマーを用いて取得された、単離された核酸を含む。本発明は、配列番号２、４、６、７、８、１０、１１または１２あるいはそれらの相補体に対応する一つまたはそれ以上のプライマーを用いて取得された、単離された核酸もまた、含む。
【０１１６】
本発明の単離された核酸分子は、一本鎖または二本鎖（例えば、二本鎖ＤＮＡ）であり得る。本発明は修飾されたヌクレオチドを含む核酸分子を包含する。例えば、本発明の核酸分子は、対応するＨＣＶ ＮＳ３ヌクレオチド配列に配列への一つまたはそれ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作製され得る。その結果、一つまたはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失は、コードされたプロテイン中に導入される。
【０１１７】
別の実施形態において、本発明の単離された核酸分子は、長さにおいて、少なくとも約１０ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１８ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、または約２５ヌクレオチドであり、少なくとも一つのＮＳ３ヌクレオチド配列を含む核酸分子に対し、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１１８】
核酸分子を複製するための、ならびに、ポリペプチドを発現するための宿主細胞およびベクターもまた、提供される。あらゆるベクターおよび宿主細胞が、用いられ得る（例えば、原核細胞または真核細胞）。多くのベクターおよび宿主細胞が、そのような目的のために、当該分野において公知である。当業者は、所望の適用のために適切なセットを選択することを容易になし得る。一つの実施形態において、ベクターはｐｃＤＮＡ３であり、また宿主細胞は２９３−ＦＳ細胞である。
【０１１９】
プローブに基づいた方法を用いてＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸配列を単離するための技術は、通常の技術であり、そして当業者に周知である。例えば、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）によって開示されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法が、用いられ得る。これらは本明細書において援用される。そのような核酸配列を単離するためのプローブは、公表された核酸またはタンパク質の配列に基づき得る。
【０１２０】
単離されたＮＳ３核酸（または、ポリペプチド）の配列は、（核酸が単離された）ＨＣＶの遺伝子型を決定するために、コントロールＮＳ３配列と比較され得る。当該分野で公知のように、２つのポリヌクレオチド間、または２つのポリペプチド間の類似性は、一つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列およびその保存されたヌクレオチド置換またはアミノ酸の置換を、第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定される。また、当該分野でさらに公知であることは、“同一性”である。同一性とは、２つの配列間の一致を同定することによって決定される、２つのポリペプチドまたは２つのポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味する。同一性および類似性は、容易に計算され得る（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ、Ａ．Ｍ．、ｅｄ．、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｗ．、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ、Ｐａｒｔ I、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ、Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１）。
【０１２１】
２つのポリヌクレオチド配列間または２つのポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定するための多数の方法が存在するが、用語“同一性”および“類似性”は、当業者に周知である（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ、Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ、Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ、Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．、４８：１０７３（１９９８））。２つの配列間の同一性または類似性を決定するために一般的に用いられる方法は、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ、Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９４、ならびに、Ｃａｒｉｌｌｏ、Ｈ．、およびＬｉｐｍａｎ、Ｄ．、ＳＩＡＭ Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９９８）の中で開示されているものを含むが、これに限定されない。
【０１２２】
同一性を決定するための好ましい方法は、検査される２つの配列間で、最も大きな一致を生み出すように設計されている。同一性および類似性を決定するため方法は、コンピュータープログラムにコーディングされている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するためのコンピュータープログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ、ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））を含むが、これに限定されない。上に記載した類似性または同一性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として決定される。また、これは、しばしば第二配列と第一配列との差異を示す。２つの核酸配列間の同一性の程度は、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））中に提供されているＧＡＰなどの、当該分野で公知のコンピュータープログラム手段によって決定され得る。本発明のために２つの核酸配列間の同一性の程度を決定する目的のために、ＧＡＰは以下のセッティングを伴なって用いられ得る：５．０のＧＡＰ挿入ペナルティおよび０．３のＧＡＰ伸長ペナルティ。
【０１２３】
本発明は、表現型スクリーニングベクター中にクローン化されたＨＣＶカセットを用いて、本発明の翻訳されたポリペプチドを生産するための方法をさらに含む。一般的用語において、タンパク質の組換え体の生産は、典型的には、以下の工程を含む。
【０１２４】
核酸分子は始めに取得される。この核酸分子は、ＮＳ３プロテアーゼドメインならびに必要に応じてＮＳ３ヘリカーゼおよび／またはＮＳ４Ａドメインをコードする。この核酸分子は、次に、適切な制御配列、ならびに、ＮＳポリプロテイン（例えば、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ）の一部または全てをコードする核酸、および、レポーター分子に作動可能に連結されて、タンパク質オープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。この発現単位は、適切な宿主を形質転換（例えば、トランスフェクト）するために用いられ、そしてこの形質転換された宿主は、組換えポリペプチドの生産を許容する条件下で培養される。ポリペプチドの生産において、もしそのポリペプチドのプロテアーゼ部分が機能的であるならば、リポーター分子はポリペプチドから切断され、そして、細胞から分泌される。
【０１２５】
前述の工程の各々は、様々な方法で完遂され得る。例えば、様々な宿主で作動可能である発現ベクターの構築は、上述の適切なレプリコンおよび制御配列を用いて、完遂される。制御配列、発現ベクター、および形質転換法は、遺伝子を発現するために用いられる宿主細胞のタイプに依存し、上記に詳しく議論されているか、そうでなければ、当業者に公知である。適切な制限部位をもし普通に利用できないのであれば、適切な制限部位をコード配列の末端に添加して、切除可能な遺伝子を提供して、ベクター中に挿入し得る。当業者は、当該分野で公知の任意の宿主／発現システムを、本発明の核酸分子との使用に容易に適合させて、所望の組換えポリペプチドを生産し得る。
【０１２６】
酵母システム、細菌システム、動物システム、植物システム、原核細胞システムおよび真核細胞システムを含む、様々な発現システムが、利用され得る。いくつかの実施形態において、哺乳類の細胞培養システムが、好まれる。
【０１２７】
（ベクター）
本発明中で用いるための発現単位には、５’から３’方向に作動可能に連結された以下の要素が一般的に含まれる：哺乳類の細胞で作動可能な転写プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、患者からのＨＣＶカセット（すなわち、ＮＳ３／４Ａをコードする核酸またはＮＳ３プロテアーゼドメインをコードする核酸）、少なくとも一つの更なるＮＳドメイン（例えば、必要に応じて５Ｂ（例えば、５Ｂの最初の６アミノ酸）をコードしているＤＮＡ配列に連結されている、ＮＳ３ヘリカーゼ／４Ａ／４Ｂ／５Ａ（ＮＳ３プロテアーゼを含むカセットを使用しているとき）またはＮＳ４Ｂ／５Ａ（ＮＳ３／４Ａを含むカセットを使用しているとき））をコードするＤＮＡ配列、および、レポーター（例えば、ルシフェラーゼ）をコードするＤＮＡ配列。上で議論したように、ＨＣＶ ＮＳポリプロテイン部分をコードする核酸に対しまたは核酸中に融合されたＨＣＶカセットおよびレポーターの任意の他の配置は、本発明のベクター中で用いられ得る。適切なプロモーターの選択は、選択された宿主細胞によって決定される。また、このことは当業者にとって明白であり、より具体的に以下で議論される。
【０１２８】
本発明を実行する上で用いる哺乳類発現ベクターは、融合タンパク質の転写を指示することが可能なプロモーターを含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。ウイルスプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス２由来の主要な後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４−１３１９９、１９８２）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４、１９８１）が挙げられる。細胞性プロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２２：８０９−８１４、１９８３）およびマウスＶカッパー（米国特許第６，２９１，２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｇｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：５４６９、１９８７）が挙げられる。特に好ましいプロモーターは、マウスＶＨ（米国特許第６，２９１，２１２号を参照のこと）プロモーター（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．、同書）である。
【０１２９】
（形質転換）
本発明の表現型スクリーニングベクターおよびＨＣＶカセットは、例えば、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ １４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３、１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６、１９７３）によって培養哺乳動物細胞中に導入され得る。電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．１：８４１−８４５、１９８２）、またはリポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）などの、哺乳動物細胞へのクローン化されたＤＮＡ配列の導入のための他の方法もまた、用いられ得る。
【０１３０】
クローン化されたＤＮＡが組み込まれた細胞を同定するために、選択可能マーカーは、目的の遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞中に導入され得る。培養される哺乳動物細胞中で用いるための選択可能マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬剤に対し耐性を与える遺伝子が挙げられる。選択可能マーカーは、増幅可能な選択可能マーカーであり得る。増幅可能な選択可能マーカーとしては、ＤＨＦＲ遺伝子（米国特許第６，２９１，２１２号を参照のこと）が挙げられる。選択可能マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ、Ｍａｓｓ．）によって概説されており、選択可能マーカーの選択は、十分に当業者のレベル内である。
【０１３１】
（宿主細胞）
本発明はまた、本発明の組換えポリペプチド（すなわち、ＮＳ３／４Ａ／４Ｂ／５Ａ／レポーター）を発現するために形質転換された（すなわち、トランスフェクトされた）細胞、好ましくは哺乳動物細胞を含む。形質転換された宿主細胞それ自体に加えて、本発明はまた、栄養培地中のそれらの細胞の培養物、好ましくは単一クローンの（クローン的に均質な）培養物、または単一クローン培養物由来の培養物もまた含む。もしレポーターペプチドが分泌されるのであれば、この培地はレポーターペプチドを細胞と共に含む。もしも、細胞がろ過されるか、または遠心分離機にかけられて除かれるのであれば、この培地は細胞を含まずにレポーターペプチドを含む。
【０１３２】
本発明の実施に用いるための宿主細胞としては、培養された哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞および細菌細胞のような、外因性のＤＮＡによって形質転換またはトランスフェクトされることおよび培地中で生育することが可能な、真核細胞およびいくつかのケースの原核細胞が挙げられる。
【０１３３】
本発明のＤＮＡ構築物を含む宿主細胞は、適切な増殖培地の中で育てられる。本明細書で用いらる場合、用語“適切な増殖培地”とは、細胞の増殖に必要とされる栄養物を含む培地を意味する。細胞増殖に必要とされる栄養物には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミネラルおよび増殖因子が挙げられる。増殖培地は、例えば、薬剤選択によって、あるいは、ＤＮＡ構築物上の選択可能マーカーまたはＤＮＡ構築物と共にトランスフェクトされる選択可能マーカーによって相補される必須栄養素の欠乏によって、ＤＮＡ構築物を含む細胞を、一般的に選択する。
【０１３４】
培養される哺乳動物細胞は、市販の血清含有培地または血清非含有培地中で、通常の場合、増殖させられる。用いられる特定の細胞株に対して適切な培地を選択することは、当業者のレベル内である。トランスフェクトされた哺乳動物細胞は、目的のＤＮＡ配列の発現を開始するため、一定の期間、通常１−２日間増殖することが許される。次に、薬剤選択が、安定的に選択可能マーカーを発現している細胞の増殖を選択するために、行われる。増幅可能な選択可能マーカーを用いてトランスフェクトされた細胞に対し、薬剤濃度を段階的な様式で上昇させ、クローン化された配列のコピー数の増加について選択して、これによって発現レベルを上昇させ得る。
【０１３５】
上記の例を参照して本発明を詳細に記載してきたが、発明の本質から乖離することなく種々の改変がなされ得ることが、理解される。したがって、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。この出願に引用された全ての引用特許、特許出願および特許公報は、本明細書においてその全体が援用される。
【実施例】
【０１３６】
（実施例）
以下の実施例は、明示的または暗示的に、あらゆる様式、形態、または、型において本発明を説明することを意図しているが、限定することは意図していない。これらは、用いられるであろうものの典型であるが、一方で、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術を、代替的に用いることができる。
【０１３７】
（実施例１：ＨＣＶ ＮＳ３ドメイン縮重プライマーの設計）
好ましくはＨＣＶ遺伝子型１ａおよび１ｂの両方にアニーリング可能なプライマーを、ＨＣＶ ＮＳ３領域を増幅するために設計した。これらのプライマーを設計するために、公表されたＨＣＶ遺伝子型１（大部分は１ａおよび１ｂ）配列を集め、アラインメントして、高程度のホモロジーをもつ領域を見つけた。ホモロジー領域内での各核酸の出現頻度を計算した。カットオフ頻度パーセンテージを、許容可能な範囲内で、設計したプライマーの縮重を保つように割り当てた。縮重プライマーを設計する上で他に考慮している要素は、最も３’末端に位置する５塩基に縮重を含まないようにすることである。
【０１３８】
（実施例２：ＨＣＶ ＮＳ３ドメインの増幅）
ウイルスＲＮＡを臨床サンプルから単離し、そして、ＨＣＶ ＮＳ３ドメインを第一、および第二ラウンド縮重プライマーを用いて増幅した。増幅されたＨＣＶの領域を、図７に示す。図７は、理にかなったホモロジーが同定された領域を表示している。示してあるように、“Ｕ”は上流側プライマーを表しており、“Ｄ”は下流側プライマーを表しており、それぞれ相同性領域の５’末端について、Ｃｏｎ−１位置に対応する番号を伴なっている。第二ラウンドのプライマーであるＵ３４２０およびＤ４０３８は、表現型タイピングベクター中にカセットクローニングをするための制限サイトを保持している。Ｕ３４２０はタンパク質翻訳のための開始コドンおよびコザック配列を持っている。図８−１１は、プライマーＵ３２７６、Ｄ４２２１、Ｕ３４２０、およびＤ４０３８それぞれの中における、遺伝子型１単離物におけるアミノ酸保存を示す。
【０１３９】
（実施例３：臨床サンプルを用いたＨＣＶ遺伝子型検査）
臨床単離物を、病院、臨床的研究室、および商業的団体を含む複数のソースより入手した。
【０１４０】
患者ＮＳ３クローンの表現型タイピングの結果を図１３に示す。図１２に示されている３つの増幅された臨床サンプルを、表現型タイピングベクターにクローン化し、そして表現型タイピングアッセイによって特徴づけた。
【０１４１】
図１４は遺伝子型１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーの配列を示す。図１５は遺伝子型１ａ／ｂ特異的非縮重プライマーを用いたＰＣＲ増幅の結果の産物を示す。ＰＣＲ産物を精製し、そしてその集団を配列決定した。配列決定の結果は、これらがＨＣＶ １ａまたは１ｂ配列であることを明らかにした。
【０１４２】
（実施例４：ＨＣＶ表現型タイピングアッセイ）
図３は９６ウェルミニプレップで得られたＤＮＡを用いた表現型タイピングアッセイを示す。
【０１４３】
図４はハイスループットロボティックシステム中の９６ウェルプレート内でのシグナル変動を示す。
【０１４４】
図５は同じ表現型タイピングベクターを用いた同一日内、および複数日間のＥＣ５０変動を示す。
【０１４５】
図１９はインビトロＨＣＶレプリコン耐性研究で同定されたＮＳ３改変体の表現型タイピングＥＣ５０を示す。各改変体の個々のＥＣ５０値および異なる改変体のＥＣ５０ランクの順番は、レプリコントランジエントトランスフェクションデータと良い相関がある。
【０１４６】
（実施例５：ＨＣＶ表現型タイピングアッセイの自動化）
細胞ベースの表現型タイピングアッセイにハイスループットシステム（ＨＴＳ）を適用することができる。例えば、このアッセイを用いて、４０人の患者の５つの時点での少なくとも９６配列をスクリーニングすることが可能である。つまり１９，２００の対象を１０ヶ月以内に特徴付けることが可能である。
【０１４７】
図６は細胞ベースのレポーターアッセイのための自動化プロトコールの例示的なステップを示しているフローチャートを示す。実施例１に記載されている９６ウェルミニプレップから得られたＤＮＡを、このアッセイに用いることができる。このＤＮＡを細胞にトランスフェクションし、その後、その細胞を、段階的に希釈したＩＴＭＮ−１９１などのＮＳ３／４Ａプロテアーゼ活性インヒビターで処理することが可能である。レポーターによって分泌されるルシフェラーゼの基質を添加し、分泌ルシフェラーゼの活性を決定する。分泌ルシフェラーゼ活性はプロテアーゼ活性の指標であり、つまりこれはＨＣＶ表現型の指標となる。
【０１４８】
現在のところ、好ましい実施形態を参照して本発明を記述してきたが、当業者に明らかなように、本発明の本質から乖離することなく種々の変更や改変をなし得るということを理解すべきである。それ故、本発明は以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各プライマーがＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓをコードする核酸配列を含む、第一ラウンド上流側プライマーの集団。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ｍｅｔ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）−Ｇｌｕ（９９．５％）／Ｇｌｙ（０．５％）−Ｔｈｒ（９６．５％）／Ｉｌｅ（３．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｉｌｅ（６９．３％）／Ｖａｌ（１６．１％）／Ｌｅｕ（１４．６％）−Ｉｌｅ（９９．５％）／Ａｌａ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９．５％）／Ｇｌｎ（０．５％）−Ｔｒｐ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＡＧＶＴＹＡＴＹＡＣＳＴＧＧＧの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＶがＡまたはＧまたはＣ、およびＳがＧまたはＣである、プライマーの集団。
【請求項４】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＳＴＧＧＧの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＶがＡまたはＧまたはＣ、およびＳがＧまたはＣであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンである、プライマーの集団。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＭＴＧＭＧＭＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＭＳＴＧＧＧの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＶがＡまたはＧまたはＣ、およびＳがＧまたはＣであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＧＭが修飾されたグアノシンである、プライマーの集団。
【請求項６】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーの集団。
【請求項７】
各プライマーの相補体がＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含む、第一ラウンド下流側プライマーの集団。
【請求項８】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーの相補体がアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ｓｅｒ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９７．０％）／Ｃｙｓ（３．０％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｐｈｅ（１００％）−Ｌｅｕ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ａｓｐ（１００％）−Ｇｌｙ（１００％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項９】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＡＣＴＴＧＣＣＲＴＡＧＧＴＧＧＡの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項１０】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＭＡＣＴＴＭＧＣＣＲＴＭＡＧＧＴＭＧＧＡの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１１】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＣＧＴＭＣＧＧＣＡＡＭＧＲＡＭＡＣＴＭＴＭＧＣＣＲＴＭＡＭＧＧＴＭＧＧＡの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１２】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項７に記載のプライマーの集団。
【請求項１３】
各プライマーがＡｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒをコードする核酸配列を含む、第二ラウンド上流側プライマーの集団。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ａｌａ（１００％）−Ｐｒｏ（９９．５％）／Ｈｉｓ（０．５％）−Ｉｌｅ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｓｅｒ（６６％）／Ａｌａ（３４％）−Ｇｌｎ（９９％）／Ａｒｇ（１％）−Ｇｌｎ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項１６】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＭＣＴＭＡＭＹＫＣＣＣＭＡＲＣＭＡＭＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＣＭが修飾されたシチジンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１７】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＣＴＡＭＹＫＣＣＣＡＲＣＡＭＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１８】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項１９】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２０】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項１３に記載のプライマーの集団。
【請求項２１】
各プライマーの相補体がＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐをコードする核酸配列を含む、第二ラウンド下流側プライマーの集団。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーの相補体がアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ｇｌｙ（１００％）−Ｓｅｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９９．５％）／Ａｒｇ（０．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｓｅｒ（９９．５％）／Ｔｈｒ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９％）／Ａｓｎ（１％）−Ｌｙｓ（９３％）／Ａｒｇ（７％）−Ｖａｌ（１００％）−Ｐｒｏ（１００％）−Ａｌａ（９９％）／Ｖａｌ（１％）−Ａｌａ（９９％）／Ａｓｐ（１％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項２３】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２４】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＭＣＹＴＴＭＲＧＴＭＧＣＴＭＹＴＭＴＭＲＣＭＣＧＣＴＭＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンであり、そして、ＣＭが修飾されたシチジンである、プライマーの集団。
【請求項２５】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＭＲＧＴＧＣＴＭＹＴＴＭＲＣＣＧＣＴＭＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項２６】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２７】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２８】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項２１に記載のプライマーの集団。
【請求項２９】
請求項１および請求項７のプライマーを含む、キット。
【請求項３０】
請求項１３および請求項２１のプライマーを含む、キット。
【請求項３１】
請求項１および請求項７のプライマーまたは請求項１３および請求項２１のプライマーまたはこれらの組合せのプライマーを用いて、ＨＣＶに感染した患者または感染が疑われる患者のサンプル由来の核酸サンプルを増幅する工程を包含する、該サンプルからＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインを増幅する方法。
【請求項３２】
ＨＣＶウイルスのプロテアーゼドメイン内の断片を増幅する工程、および、該断片の遺伝子型に基づいて該ＨＣＶウイルスの遺伝子型を決定する工程を包含する、ＨＣＶウイルスの遺伝子型を決定する方法。
【請求項３３】
前記断片が請求項１および請求項７のプライマーまたは請求項１３および請求項２１のプライマーまたはこれらの組合せのプライマーを用いて増幅される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＨＣＶサンプル由来のＨＣＶのプロテアーゼドメイン内の断片の増幅を実施する工程、該断片内の薬剤耐性に関連した変異の存在を決定する工程を包含する、薬剤耐性ＨＣＶウイルスの存在を決定する方法であって、ここで該変異の存在は薬剤耐性ＨＣＶの存在の指標となる、方法。
【請求項３５】
増幅が請求項１および請求項７のプライマーまたは請求項１３および請求項２１のプライマーまたはこれらの組合せのプライマーを用いて実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、および分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニングベクター中にＨＣＶウイルスのＮＳ３プロテアーゼドメインをクローン化する工程を包含する、ＨＣＶウイルスの表現型を決定する方法であって、ここで、機能的なＮＳ３プロテアーゼドメインの存在が該分泌されるルシフェラーゼレポーターの分泌によって示されるように該ＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａおよび該分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードする該ポリヌクレオチドが作動可能に連結されている、方法。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドがＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂの最初の６アミノ酸および分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
スクリーニングベクター中への機能的なＮＳ３プロテアーゼドメインの挿入が分泌されるルシフェラーゼレポーターの分泌によって示されるように作動可能に連結されたＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、および該分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードするポリヌクレオチドを包む、該スクリーニングベクター。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドがＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂの最初の６アミノ酸および分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードする、請求項３８に記載のスクリーニングベクター。
【請求項４０】
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧおよびＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＧからなる群から選択された配列を含む上流側プライマー、ならびにＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＡＧＧＴＧＧＡおよびＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧＴＡからなる群から選択された配列を含む下流側プライマーを含む、プライマーのセット。
【請求項４１】
ＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣおよびＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＴＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣからなる群から選択された配列を含む上流側プライマー、ならびにＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣおよびＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣからなる群から選択された配列を含む下流側プライマーを含む、プライマーのセット。
【請求項４２】
【化３】
からなる群から選択された配列を含む、プライマー。
【請求項１】
各プライマーがＭｅｔ／Ｌｙｓ−Ｇｌｕ／Ｇｌｙ−Ｔｈｒ／Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ／Ｖａｌ／Ｌｅｕ−Ｉｌｅ／Ａｌａ−Ｔｈｒ／Ｇｌｎ−Ｔｒｐ／Ｌｙｓをコードする核酸配列を含む、第一ラウンド上流側プライマーの集団。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ｍｅｔ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）−Ｇｌｕ（９９．５％）／Ｇｌｙ（０．５％）−Ｔｈｒ（９６．５％）／Ｉｌｅ（３．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｉｌｅ（６９．３％）／Ｖａｌ（１６．１％）／Ｌｅｕ（１４．６％）−Ｉｌｅ（９９．５％）／Ａｌａ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９．５％）／Ｇｌｎ（０．５％）−Ｔｒｐ（９９．５％）／Ｌｙｓ（０．５％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＡＧＶＴＹＡＴＹＡＣＳＴＧＧＧの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＶがＡまたはＧまたはＣ、およびＳがＧまたはＣである、プライマーの集団。
【請求項４】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＴＧＧＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＳＴＧＧＧの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＶがＡまたはＧまたはＣ、およびＳがＧまたはＣであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンである、プライマーの集団。
【請求項５】
請求項１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＭＴＧＭＧＭＡＧＡＣＹＡＭＡＭＧＶＴＹＡＭＴＹＡＭＣＭＳＴＧＧＧの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＶがＡまたはＧまたはＣ、およびＳがＧまたはＣであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＧＭが修飾されたグアノシンである、プライマーの集団。
【請求項６】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項１に記載のプライマーの集団。
【請求項７】
各プライマーの相補体がＳｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ／Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙをコードする核酸配列を含む、第一ラウンド下流側プライマーの集団。
【請求項８】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーの相補体がアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ｓｅｒ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９７．０％）／Ｃｙｓ（３．０％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｐｈｅ（１００％）−Ｌｅｕ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ａｓｐ（１００％）−Ｇｌｙ（１００％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項９】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＡＣＴＴＧＣＣＲＴＡＧＧＴＧＧＡの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項１０】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＲＡＭＡＣＴＴＭＧＣＣＲＴＭＡＧＧＴＭＧＧＡの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１１】
請求項７に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＣＧＴＭＣＧＧＣＡＡＭＧＲＡＭＡＣＴＭＴＭＧＣＣＲＴＭＡＭＧＧＴＭＧＧＡの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１２】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項７に記載のプライマーの集団。
【請求項１３】
各プライマーがＡｌａ−Ｐｒｏ／Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｇｌｎ／Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒをコードする核酸配列を含む、第二ラウンド上流側プライマーの集団。
【請求項１４】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ａｌａ（１００％）−Ｐｒｏ（９９．５％）／Ｈｉｓ（０．５％）−Ｉｌｅ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）−Ａｌａ（１００％）−Ｔｙｒ（１００％）−Ｓｅｒ（６６％）／Ａｌａ（３４％）−Ｇｌｎ（９９％）／Ａｒｇ（１％）−Ｇｌｎ（１００％）−Ｔｈｒ（１００％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項１５】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項１６】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＭＣＴＭＡＭＹＫＣＣＣＭＡＲＣＭＡＭＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＣＭが修飾されたシチジンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１７】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＧＣＣＹＡＭＴＭＹＡＣＧＧＣＣＴＡＭＹＫＣＣＣＡＲＣＡＭＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項１８】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項１９】
請求項１３に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＡＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＹＡＴＹＡＣＧＧＣＣＴＡＹＫＣＣＣＡＲＣＡＲＡＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、ＫがＧまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２０】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項１３に記載のプライマーの集団。
【請求項２１】
各プライマーの相補体がＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ／Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｈｒ／Ａｓｎ−Ｌｙｓ／Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ／Ｖａｌ−Ａｌａ／Ａｓｐをコードする核酸配列を含む、第二ラウンド下流側プライマーの集団。
【請求項２２】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーの相補体がアミノ酸配列をコードしており、そしてここで、該アミノ酸配列の集団が各アミノ酸に関して以下の配分：
Ｇｌｙ（１００％）−Ｓｅｒ（１００％）−Ｇｌｙ（９９．５％）／Ａｒｇ（０．５％）−Ｌｙｓ（１００％）−Ｓｅｒ（９９．５％）／Ｔｈｒ（０．５％）−Ｔｈｒ（９９％）／Ａｓｎ（１％）−Ｌｙｓ（９３％）／Ａｒｇ（７％）−Ｖａｌ（１００％）−Ｐｒｏ（１００％）−Ａｌａ（９９％）／Ｖａｌ（１％）−Ａｌａ（９９％）／Ａｓｐ（１％）
を有する、プライマーの集団。
【請求項２３】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２４】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＭＣＹＴＴＭＲＧＴＭＧＣＴＭＹＴＭＴＭＲＣＭＣＧＣＴＭＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＡＭが修飾されたアデノシンでありＴＭが修飾されたチミジンであり、そして、ＣＭが修飾されたシチジンである、プライマーの集団。
【請求項２５】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＭＲＧＴＧＣＴＭＹＴＴＭＲＣＣＧＣＴＭＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧであり、さらにここで、ＴＭが修飾されたチミジンである、プライマーの集団。
【請求項２６】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２７】
請求項２１に記載のプライマーの集団であって、ここで、各プライマーがＣＴＴＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＹＴＴＲＧＴＧＣＴＹＴＴＲＣＣＧＣＴＲＣＣの核酸配列を含んでおり、そしてここで、ＹがＣまたはＴ、そして、ＲがＡまたはＧである、プライマーの集団。
【請求項２８】
前記集団が少なくとも１つのプライマーを含む、請求項２１に記載のプライマーの集団。
【請求項２９】
請求項１および請求項７のプライマーを含む、キット。
【請求項３０】
請求項１３および請求項２１のプライマーを含む、キット。
【請求項３１】
請求項１および請求項７のプライマーまたは請求項１３および請求項２１のプライマーまたはこれらの組合せのプライマーを用いて、ＨＣＶに感染した患者または感染が疑われる患者のサンプル由来の核酸サンプルを増幅する工程を包含する、該サンプルからＨＣＶ ＮＳ３プロテアーゼドメインを増幅する方法。
【請求項３２】
ＨＣＶウイルスのプロテアーゼドメイン内の断片を増幅する工程、および、該断片の遺伝子型に基づいて該ＨＣＶウイルスの遺伝子型を決定する工程を包含する、ＨＣＶウイルスの遺伝子型を決定する方法。
【請求項３３】
前記断片が請求項１および請求項７のプライマーまたは請求項１３および請求項２１のプライマーまたはこれらの組合せのプライマーを用いて増幅される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＨＣＶサンプル由来のＨＣＶのプロテアーゼドメイン内の断片の増幅を実施する工程、該断片内の薬剤耐性に関連した変異の存在を決定する工程を包含する、薬剤耐性ＨＣＶウイルスの存在を決定する方法であって、ここで該変異の存在は薬剤耐性ＨＣＶの存在の指標となる、方法。
【請求項３５】
増幅が請求項１および請求項７のプライマーまたは請求項１３および請求項２１のプライマーまたはこれらの組合せのプライマーを用いて実施される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、および分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードするポリヌクレオチドを含むスクリーニングベクター中にＨＣＶウイルスのＮＳ３プロテアーゼドメインをクローン化する工程を包含する、ＨＣＶウイルスの表現型を決定する方法であって、ここで、機能的なＮＳ３プロテアーゼドメインの存在が該分泌されるルシフェラーゼレポーターの分泌によって示されるように該ＮＳ３プロテアーゼドメイン、ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａおよび該分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードする該ポリヌクレオチドが作動可能に連結されている、方法。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドがＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂの最初の６アミノ酸および分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
スクリーニングベクター中への機能的なＮＳ３プロテアーゼドメインの挿入が分泌されるルシフェラーゼレポーターの分泌によって示されるように作動可能に連結されたＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、および該分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードするポリヌクレオチドを包む、該スクリーニングベクター。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチドがＨＣＶ ＮＳ３ヘリカーゼ、４Ａ、４Ｂ、５Ａ、５Ｂの最初の６アミノ酸および分泌されるルシフェラーゼレポーターをコードする、請求項３８に記載のスクリーニングベクター。
【請求項４０】
ＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＴＧＧＧおよびＡＴＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣＡＣＧＴＧＧＧからなる群から選択された配列を含む上流側プライマー、ならびにＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＡＴＡＧＧＴＧＧＡおよびＡＣＣＣＧＣＣＧＴＣＧＧＣＡＡＧＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧＴＡからなる群から選択された配列を含む下流側プライマーを含む、プライマーのセット。
【請求項４１】
ＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＣＴＡＣＴＣＣＣＡＡＣＡＧＡＣおよびＡＧＧＧＣＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＴＣＡＣＧＧＣＧＴＡＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣからなる群から選択された配列を含む上流側プライマー、ならびにＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＣＣおよびＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＣＣＧＧＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＣからなる群から選択された配列を含む下流側プライマーを含む、プライマーのセット。
【請求項４２】
【化３】
からなる群から選択された配列を含む、プライマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１１−５０１９５３（Ｐ２０１１−５０１９５３Ａ）
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１３３７（Ｐ２０１０−５３１３３７）
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９０２１
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０２１９１６１９）インターミューン インコーポレイテッド (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月２０日（２０１１．１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０８１８１６
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５９０２１
【国際公開日】平成２１年５月７日（２００９．５．７）
【出願人】（５０２１９１６１９）インターミューン インコーポレイテッド (25)
【Ｆターム（参考）】
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