ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための発現システム及びその使用
本発明は、インターロイキン１５／Ｆｃ（ＩＬ−１５／Ｆｃ）融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸、少なくとも１つのプロモーター、ＣＤ５リーダーに対する少なくとも１つの核酸、及び必要に応じて選択可能マーカー遺伝子に対する少なくとも１つの核酸を含む、１以上の核酸を含有する発現システム；発現システムの成分を含む核酸、及び発現システム又は核酸を含有する宿主細胞に関する。更に、本発明は、発現システムを用いたＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の調製方法、及び宿主細胞において発現させるための発現システム、核酸、宿主細胞、又はＣＤ５リーダーの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１５／Ｆｃ（ＩＬ−１５／Ｆｃ）融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸を含む発現システムに関するものであり、これによりＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製することができる。更に、本発明は、この発現システムを用いたＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の調製方法、及び宿主細胞においてタンパク質を発現させるための発現システム、核酸、宿主細胞、又はＣＤ５リーダーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物における免疫イベントは、免疫ネットワークのように作用する、非常に多数の複雑な細胞性及び無細胞性相互作用に基づいている。この複雑なネットワーク内の多くのメカニズムの機能は、近年になって解明されつつある。１９９４年に記載されたインターロイキン１５因子（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５−９６８）を含めたサイトカインは、免疫ネットワーク内の可溶性メッセンジャーとして主要な役割を果たしている。インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、免疫モジュレーター、成長因子、ケモカイン、及び生存因子として、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、ＮＫ細胞、及び組織の他のＩＬ−１５感受性細胞、例えばケラチノサイトその他のような免疫系細胞の増殖、分化、活性化、及び生存に対して影響を及ぼす。免疫モジュレーターとしての機能の他に、ＩＬ−１５は、筋組織及び脂肪組織の代謝調節にも役割を果たす。
【０００３】
典型的には、ＩＬ−１５は、ヘテロ３量体インターロイキン１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）を介してエフェクター細胞に結合する。ＩＬ−１５Ｒは、ＩＬ−１５に特異的に結合するβ−サブユニット、同様にＩＬ−２によって認識されるα−サブユニット、及び同様にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５などのインターロイキンファミリーの更なるメンバーによって認識されるγ−サブユニットから成る。
【０００４】
ＩＬ−１５は、例えば関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全腸炎、肺サルコイドーシス、又は全身性エリテマトーデスなどの非常に多数の自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患、並びに移植臓器、組織、及び細胞の拒絶反応において役割を果たす。ＩＬ−１５は、リンパ性白血病においても役割を果たす。
【０００５】
インターロイキン１５は、がん患者及び免疫不全疾患の場合にはリンパ球の割合を増やすためにアゴニスト原理により、免疫系の病的活性化を伴う疾患の場合にはＩＬ−１５の作用をブロックする物質を用いることによるアンタゴニスト原理により、治療的に用いられる。これらの物質は、可溶性ＩＬ−１５受容体ポリペプチド、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５受容体に対する抗体、あるいは例えばＩＬ−１５成分と免疫グロブリン成分とを含有する融合タンパク質のようなＩＬ−１５部分を有する融合タンパク質（概説はＦｅｈｎｉｎｇｅｒ及びＣａｌｉｇｉｕｒｉ、２００１、Ｂｌｏｏｄ ９７（１）：１４−３２）であり得る。インターロイキン−免疫グロブリン融合タンパク質は有益であることが証明されている。
【０００６】
インターロイキンと免疫グロブリンとの組換え融合タンパク質は、原核細胞発現システムで調製することができる。これらの発現システムの実質的な不利益は、原核細胞で産生されたタンパク質のグリコシル化がないことであり、これは、発現産物の機能性及び安定性を損ない、したがって、発現産物の医学的有用性を制限するかもしれない。逆に、通常正しいグリコシル化を保証する、例えば哺乳動物細胞などの代替発現システムにおけるインターロイキンと免疫グロブリンとの組換え融合タンパク質の産生には、発現効率が比較的低いという問題がある（Ｚｈｅｎｇら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４０４１−４０４８）。したがって、大量の組換えＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を十分な純度で調製可能な真核生物の発現システムを提供する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、この種の改良された発現システムを提供することである。
この目的は、１以上の核酸を含有する、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための発現システムを提供することによって達成され、これは、
ａ）ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸、
ｂ）少なくとも１つのプロモーター、及び
ｃ）ＣＤ５リーダーに対する少なくとも１つの核酸、
を含み、プロモーター及びＣＤ５リーダーに対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸に機能的に連結されている。
【０００８】
本発明の発現システムにより、例えば真核生物における組換えＤＮＡ技術によって、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を大規模で調製することが可能である。したがって、本発明は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を商業目的で調製することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
組換えＤＮＡ技術は、通常、遺伝情報を例えばベクターへ移送するための技術を意味する。これらのベクターは、例えば宿主への導入により遺伝情報が更に処理されることを可能にし、遺伝情報を新たな環境で増加させ、発現させる。遺伝情報は、通常、１以上の所望の遺伝子産物に対する情報を暗号化形態で含有する核酸の形態、例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの形態で存在する。ベクターとして作用し得るものの例は、例えばｃＤＮＡなどの核酸が組み込まれ得るプラスミドであり、宿主細胞において増加させ、必要に応じて、例えばプロモーター、エンハンサー、又はサイレンサーなどの転写調節配列の制御下で発現させる。プラスミドは、宿主細胞における所望の発現産物の合成並びに後者の安定性及び局在に影響を及ぼす配列、又は用いるプラスミド若しくは発現産物の選択を可能にする配列を更に含有することができる。
【００１０】
発現システムという用語は、本発明によれば、必要に応じて例えばリボソーム、アミノ酸、及び／又はｔＲＮＡなどの転写に必要であり得る更なる配列と組み合わせた、１以上の核酸を表し、発現システムは、好適な条件下、例えば好適な宿主細胞でＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の発現を引き起こすことが可能である。
【００１１】
好ましい態様によれば、発現システムは１以上の核酸から成る。
宿主細胞における発現を可能にするには、発現システムの核酸は、組換えＤＮＡ技術法によって調製できる１以上のベクターの部分であることができ、これは当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編集）、１９８９、分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク）。当業者は、本発明に関して使用できる非常に多数のベクターについて知っている。真核細胞における発現に好適なのは、例えば酵母ベクターｐＹＥＳ（サッカロミセス・セレビシエで発現；インビトロジェン）及びｐＩＣＺ（ピキア・パストリスで発現；インビトロジェン）である。ｐＢａｃＰＡＫ９（昆虫細胞で発現；クローンテック）などのバキュロウイルスベクターや、発現すべき核酸配列に加えて好適な転写調節配列を挿入できる、Ｒｃ／ＣＭＶ、Ｒｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ、及び他のＳＶ４０由来ベクターなどの、哺乳動物細胞における異種発現に用いられる多くのベクターも使用できる。
【００１２】
選択した宿主においてプラスミド複製を介在する複製起点に加えて、好適なベクターは、通常、選択可能マーカー遺伝子、及び核酸断片を挿入できる制限酵素の認識部位を含有することが好ましい。ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、制限酵素の好適な認識部位を介してベクターに導入することができる。
【００１３】
本発明の発現システムに同様に好適なウイルスベクターシステムは、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクター若しくはパピローマウイルスベクターを含む。
【００１４】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡであり、特に好ましくはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はその組み合わせである。
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする。本発明によるＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質は、２つの融合部分、即ちＩＬ−１５成分とＦｃ成分とを含有する融合タンパク質である。機能性タンパク質に加えて免疫グロブリンの融合部分を含有する組換えタンパク質は、例えばＣａｐｏｎら（ＵＳ５，４２８，１３０号）に記載されている。
【００１５】
Ｎ端の改変又は未改変ＩＬ−１５部分とＣ端のＦｃ部分とから成る融合タンパク質が好ましい。そのようなタンパク質は、例えばＷＯ９７／４１２３２号及びＫｉｍら（１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５７４２−５７４８）に開示されている。
【００１６】
融合タンパク質のＩＬ−１５部分は、例えば活性化Ｔ細胞に発現するＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）への選択的結合を介在する。したがって、ＩＬ−１５部分は天然ＩＬ−１５でもその変異体でもよい。
【００１７】
より好ましい態様では、ＩＬ−１５成分は野生型ＩＬ−１５である。これに関連して、ＩＬ−１５は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、又はサル、好ましくはヒトなどのあらゆる種のＩＬ−１５であり得る。さまざまなスプライス変異体及び天然変異体も含まれる。哺乳動物の核酸、特にヒト又はマウス型の核酸が特に好ましい。
【００１８】
ＩＬ−１５変異体には、天然ＩＬ−１５と比較して、例えば１以上の欠失、挿入、又は置換、又はそれらの組み合わせなどの変異を有するＩＬ−１５成分が含まれる。しかしながら、用いるＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質によるＩＬ−１５Ｒへの結合を可能にする必要がある。これは、例えば、標識ＩＬ−１５、及びＩＬ−１５受容体を有する膜又は細胞を用いた放射性リガンド結合アッセイで確認することができるであろう（Ｃａｒｓｏｎ ＷＥら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０（４）：１３９５−１４０３）。
【００１９】
好ましい態様では、変異体はＩＬ−１５のような作用を有することができ（アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分）、その活性レベルは、ＩＬ−１５と比較して、同一でも、低下しても、増加していてもよい。アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に使用できる試験系は、ＩＬ−１５成分によるマウスＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激である。
【００２０】
成分が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは１００％、更により好ましくは１５０％、最も好ましくは少なくとも２００％の活性を有する場合は、本発明によれば、ＩＬ−１５成分はアゴニスト作用を有する。アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の活性は、野生型ＩＬ−１５による刺激と比較した（野生型ＩＬ−１５は１００％活性に相当する）、ＩＬ−１５成分による反応の刺激の割合を意味する。試験では、ＩＬ−１５成分単独でも融合タンパク質でも使用可能である。
【００２１】
アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の場合、残基を同様の特性を有する他の残基に置換する保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸群内、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群内、酸性ラジカルを有するアミノ酸群内、アミド誘導体を有するアミノ酸群内、塩基性ラジカルを有するアミノ酸群内、又は芳香族ラジカルを有するアミノ酸内の置換である。典型的な保存的及び半保存的置換は以下の通りである。
【００２２】
【表１】
【００２３】
本発明の他の態様では、アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を使用する。この種の成分は、ＩＬ−１５の作用、又はＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒへの結合を阻害し、完全に又は部分的にのみ阻害することが可能である。アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に使用できる試験系は、ＷＯ９７／４１２３２号に記載の試験系である（ＢＡＦ−ＢＯ３細胞増殖アッセイ）。成分がＩＬ−１５介在作用又はＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒへの結合を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９５％阻害する場合は、本発明によればＩＬ−１５成分はアンタゴニスト作用を有する。試験には、ＩＬ−１５成分単独でも融合タンパク質でも使用可能である。
【００２４】
アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の場合、残基を異なる特性を有する他の残基に置換する非保存的アミノ酸置換が好ましい。これらの置換は、ＩＬ−１５Ｒとの相互作用又はシグナル伝達に関与する分子の領域内で起こることが更に好ましい。
【００２５】
好ましい態様では、使用するアンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分は、ＷＯ９７／４１２３２号に記載のＩＬ−１５変異体、又は５６位のアミノ酸（アスパラギン酸；ＡＡＡ２１５５１）に変異を有するＩＬ−１５成分である。インターロイキン１５の１４９位及び／又は１５６位のアミノ酸に点突然変異が導入されている、特にグルタミンをアスパラギン酸に置換した（ＷＯ９７／４１２３２号を参照されたい）変異体が最も好ましい。１つの態様では、記載の変異を組み合わせることも可能である。
【００２６】
１つの態様では、融合タンパク質の改変ＩＬ−１５部分は、野生型ＩＬ−１５、好ましくはヒト野生型ＩＬ−１５（例えば全米バイオテクノロジー情報センターのデータベースの受託番号ＡＡＡ２１５５１）と、又は他の天然変異体（例えば全米バイオテクノロジー情報センターのデータベースの受託番号ＣＡＡ６３９１４及びＣＡＡ７１０４４を有する変異体）と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００２７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の第２の機能単位は、Ｆｃ成分である。Ｆｃ部分は、パパイン切断で調製でき、そのアミノ酸配列は高度に保存されている、免疫グロブリンの定常（ｃ＝定常）断片を意味する。Ｆｃ断片は、通常抗原に結合しない抗体断片である。本発明によるＦｃ部分は、ヒンジ領域の他に、定常領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む、上で定義した通りの免疫グロブリン断片も意味することが好ましい。
【００２８】
Ｆｃ成分は、抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＭ又はＩｇＧのＦｃ部分に由来し、より好ましくはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ部分に由来する。
【００２９】
本発明の具体的態様では、融合タンパク質のＦｃ部分は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ断片であり、ＩｇＧの軽鎖及び重鎖の可変領域を欠失している。使用できるＩｇＧの例は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。ヒト又はマウスのＩｇＧ１が好ましい。
【００３０】
抗体のＦｃ部分全体又はその一部を本発明に使用可能である。しかしながら、Ｆｃ部分の一部は、好ましくは、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質が免疫グロブリン成分のないＩＬ−１５成分よりも血中循環半減期が長くなるようにデザインされる必要がある。これは、１以上の実験動物に融合タンパク質とＩＬ−１５成分を投与、例えば血流に注入し、血中循環半減期を比較することによって試験することができる。より長い半減期は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも１００％の半減期の増加によって示される。
【００３１】
Ｆｃ部分は、少なくとも１つの変異を有するＦｃ部分でもよい。変異体Ｆｃは、ＩＬ−１５部分に関して上に記載したように、変異され得る。
１つの態様では、融合タンパク質の変異体Ｆｃ部分は、マウス又はヒトの野生型免疫グロブリン、好ましくはヒトＩｇＧ１−Ｆｃ又は天然変異体のＦｃ部分と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、融合タンパク質のＦｃ部分は天然型であるか又は保存的アミノ酸置換を有し、完全なＦｃＲ結合部位及び／又は補体結合部位を含有する。融合タンパク質のＦｃ部分は、補体系の活性化及びＦｃ受容体発現細胞への結合を介在することができ、したがって、融合タンパク質のＩＬ−１５部分によって認識される細胞の枯渇を生ずる。補体活性化及びＦｃ受容体結合を介在するアミノ酸位置における変異の導入、特に非保存的アミノ酸置換は、これらの機能のスイッチを切ることを可能にする。これらの変異の例は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合部位又は補体結合部位（天然ヒトＩｇＧ１の２１４位、３５６位、３５８位、及び／又は４３５位のアミノ酸、あるいは天然マウスＩｇＧ２ＡのＬｅｕ２３５、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及び／又はＬｙｓ３２２）のものである。これらの位置のアミノ酸置換は、通常、Ｆｃ部分の溶解機能及び補体活性化機能（ＷＯ９７／４１２３２号）を欠失させる。
【００３３】
例えば発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の分子間結合、そして凝集を妨げるには、ヒトＦｃ部分のヒンジ領域の４位のアミノ酸システイン、より好ましくはヒトＩｇＧ１のアミノ酸（ヒトＩｇＧ１の１６７位）がアラニンに置換されている態様が更に好ましい。
【００３４】
他の好ましい態様では、Ｆｃ部分は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１又はマウス免疫グロブリンＩｇＧ２ＡのＦｃ部分であり、ヒンジ領域に加えて、重鎖領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【００３５】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質では、ＩＬ−１５成分は、免疫グロブリン成分に直接又はリンカーを介して融合している。リンカーは、好ましくは２５アミノ酸以下、より好ましくは１５アミノ酸以下、更により好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは１、２、３、４、又は５アミノ酸から成る。
【００３６】
更に他の好ましい態様では、インターロイキンをコードするヒト核酸は、Ｆｃをコードするヒト核酸、又は例えばマウス若しくはラットなどの他の種のＦｃをコードする核酸と同様に組み合わされる。例えば、ＩＬ−１５をコードするヒト核酸は、ＩｇＧ１をコードするヒト核酸、ＩｇＧ２Ａをコードするマウス核酸、又はラット由来ＩｇＧ２Ｂをコードする核酸と同様に組み合わせることができる。核酸の更に可能な組み合わせは、当業者によって認識されるであろう。
【００３７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する最も好ましい核酸は、配列番号１の９７９〜２０１４位の配列、配列番号２若しくは配列番号３の１９８５〜３０２０位の配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸である。ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸を含む最も好ましいベクターは、配列番号１又は配列番号２のベクターである。
【００３８】
しかしながら、「ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸」という用語は、その配列が、配列番号３に示した塩基配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする塩基配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一の核酸も含み、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中循環半減期が上昇している（試験系に関しては上記を参照されたい）。
【００３９】
「ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸を含むベクター」という用語は、その配列が、配列番号１及び配列番号２に示した塩基配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一である核酸も含み、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００４０】
発現システムはプロモーターを更に含む。プロモーターとその機能は当業者に公知である。プロモーターは、例えばウイルス、細菌、又は真核生物由来であることができる。プロモーターは、発現すべき遺伝子の転写を構成的に制御しても、又は誘導性であってもよく、したがって遺伝子発現の特異的調節を可能にする。プロモーターは、更に細胞又は組織特異的であることができる。即ち、遺伝子産物の発現を特定細胞種に限定することができる。これらの特性を有するプロモーターは当業者に公知である。宿主細胞において発現を制御するのに特に好適なプロモーターは、例えば、酵母で発現させるためのＡＤＨ２プロモーター、又は昆虫細胞で発現させるためのポリヘドリンプロモーターである。哺乳動物細胞において遺伝子産物の強力な発現を介在するプロモーターは、例えば、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）プロモーター、及びＣＭＶｉ／ｅ（サイトメガロウイルス極初期ポリペプチド）プロモーターなどのウイルス遺伝子のウイルスプロモーターである。本発明に関し、ＣＭＶプロモーターが好ましい。ＣＭＶプロモーターには変異も含まれ、変異配列は、天然ＣＭＶプロモーター（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１（１）：４７−５８）と好ましくは９５％、より好ましくは９９％相同であり、及び／又は変異体の活性は、野生型プロモーターと比較して好ましくは９０〜１１０％、より好ましくは９５〜１０５％である。
【００４１】
更に、転写調節領域は、特にＣＭＶプロモーターを用いる場合は、１以上のイントロン、好ましくはイントロンＡ（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１４）：３９７９−３９８６）を含有することができる。この態様は、例えば転写因子に対する好適な結合部位を提示することにより、特に高いＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質量を達成することが可能であるという利点を有する。イントロンＡには変異も含まれ、変異配列は、天然イントロン、特にイントロンＡ（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１４）：３９７９−３９８６）と好ましくは８０％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％相同であり、及び／又は変異体の活性は、野生型イントロン、特にイントロンＡと比較して、好ましくは９０〜１１０％、より好ましくは９５〜１０５％である。
【００４２】
本発明による発現システムの他の要素は、ＣＤ５リーダー、即ち、ＣＤ５リンパ球抗原の分泌シグナル配列（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２３（６０８６）：３４６−３４９）に対する核酸である。この分泌シグナル配列は、発現産物の宿主細胞培地への分泌を介在する。ＣＤ５リーダーに対する核酸とＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸は、リーダーが融合タンパク質の分泌を介在できるように発現システム中に配置されている。転写及び翻訳後、ＣＤ５リーダーは、発現産物において融合タンパク質のカルボキシ末端に局在することが好ましいが、融合タンパク質のアミノ末端に局在することも等しく好ましいかもしれない。
【００４３】
驚くべきことに、ＣＤ５リーダーは、ＣＨＯ細胞において、匹敵するシグナル配列よりも２００〜３００倍高い発現産物の細胞培地への分泌を介在することが示された（実施例２、図８を参照されたい）。ＣＤ５リーダーには変異も含まれ、変異配列は、天然ＣＤ５リーダー（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２３（６０８６）：３４６−３４９）と、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％相同であり、及び／又は変異体の活性は、野生型ＣＤ５リーダーと比較して、好ましくは８０〜１２０％、より好ましくは９０〜１１０％、更により好ましくは９５〜１０５％である。
【００４４】
発現システムでは、プロモーター、及びＣＤ５リーダーに対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸に機能的に連結されている。機能的に連結されているとは、融合タンパク質に対する核酸に関し、その機能を発揮できるように、プロモーター、及びリーダーに対する核酸が配置されていることを意味する。プロモーターの機能は、融合タンパク質の発現を調節することである。１つの核酸上に両者が局在する場合は、プロモーターは通常融合タンパク質の５’、又は３’である。リーダーの機能は、融合タンパク質の分泌を介在することである。リーダーに対する核酸及び融合タンパク質が１つの核酸上に局在する場合は、リーダーは、通常融合タンパク質に隣接する。「機能的に連結されている」とは、プロモーター及びＣＤ５リーダーが、融合タンパク質に関して、プロモーターが融合タンパク質の発現を調節し、ＣＤ５リーダーが融合タンパク質の分泌を引き起こすように配置されていることを意味することが好ましい。
【００４５】
好ましい態様では、発現システムは、例えば発現システムでトランスフェクションされた宿主細胞がトランスフェクションされていない細胞に対して選択されることを可能にする選択可能マーカー遺伝子に対する少なくとも１つの核酸を更に含有する。マーカー遺伝子の例は、抗生物質と組み合わせて使用される耐性介在遺伝子である。マーカー遺伝子は例えば発現ベクター中に挿入され、適切にトランスフェクションされた宿主細胞に適用される抗生物質と共に使用される。真核生物宿主細胞を選択するために使用される抗生物質の公知の例は、アンピシリン、カナマイシン、ゼオシンであり、本発明の好ましい態様では、ネオマイシンであり、これらの全ては、宿主細胞が対応の耐性介在遺伝子の発現によって選択されることを可能にする。他のマーカー遺伝子は当業者に公知であり、例えば選択的遺伝子ｔｋ又はＤＨＦＲは、ＨＡＴ又はアミノプテリン及びメトトレキセートなどの対応の選択剤の適用と組み合わされる。例えばオワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質遺伝子及びその変異体のような他の好適な選択可能マーカー遺伝子は、発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を選択剤で処理することなく光学的に選択することを可能にする。
【００４６】
選択可能マーカー遺伝子としてトリプトファン合成酵素をコードする遺伝子を使用することが好ましく、対応の発現プラスミドは、選択及び発現のために、トリプトファン合成酵素欠損宿主細胞に導入される。
【００４７】
更に好ましい態様では、発現システムは、通常、転写を終了させる他に、ＲＮＡ転写物の安定性にも影響を及ぼすポリアデニル化シグナルの少なくとも１つの核酸も含む。その例は、ＳＶ４０由来、β−グロブリン遺伝子由来、又は好ましい態様ではウシ成長ホルモン遺伝子ＢＧＨ（ＥＰ１７３５５２号）由来のポリアデニル化配列である。ポリアデニル化シグナルの核酸は、融合タンパク質の発現又はその安定性を改善可能な方法における発現システムの部分である。通常、転写産物がＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸とポリアデニル化シグナルとを含むように融合タンパク質に対する核酸に連結されている。
【００４８】
更に他の態様では、例えば無細胞系における転写及び／又は翻訳の場合、発現システムは上記成分に加えて発現に必要な成分を含有する。この種の可能な成分の例は、転写因子、酵素（例えばペプチジルトランスフェラーゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ）、及び他の細胞内タンパク質（例えばｅＩＦ４Ｅ、ｅＦＥ１、及びｅＥＦ２）、並びに更なる補助物質（ＡＴＰ、ＧＴＰ、及びマグネシウムイオン）、好ましくはｔＲＮＡ、アミノ酸、及び／又はリボソームである。
【００４９】
本発明の好ましい態様では、発現システムは、成分ａ）〜ｃ）、及び必要に応じてｄ）を含有する唯一の核酸を含み、それらの全ては上で定義されている通りである。
本発明の非常に好ましい態様では、発現システムは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の配列のいずれかの核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する。しかしながら、その配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示した塩基配列のうちの１つ、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする塩基配列と、少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一な核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては上記を参照されたい）。
【００５０】
最も好ましい態様では、発現システムは、以下の成分が５’から３’へ配置されている核酸を含む：必要に応じてイントロンＡを伴うＣＭＶプロモーター、ＣＤ５リーダー、特にＩＬ−１５のアミノ酸１４９位及び／又は１５６位に点突然変異を有し、グルタミンがアスパラギン酸に置換されているＩＬ−１５から成るＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質（ＷＯ９７／４１２３２号を参照されたい）、ヒンジ領域の４位のアミノ酸システインがアラニンに置換されているヒトＩｇＧ１のＦｃ部分、必要に応じてポリアデニル化シグナル、及び必要に応じて少なくとも１つのマーカー遺伝子。マーカー遺伝子は、特に第２の核酸に配置されていてもよい。したがって、そのような核酸も（マーカー遺伝子を伴うものも伴わないものも）本発明による核酸の好ましい態様である。
【００５１】
更に、本発明は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質、プロモーター、ＣＤ５リーダー、必要に応じて選択可能マーカー遺伝子、及び必要に応じてポリアデニル化シグナルを含む核酸に関するものであり、全ての成分は上に記載されている。好ましい態様では、核酸は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する。しかしながら、その配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示した塩基配列のうちの１つ、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする塩基配列と、少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一である核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００５２】
更に、本発明は、本発明による発現システム又は本発明による核酸を含有する宿主細胞に関するものである。
使用できる宿主細胞は、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス）、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、又は哺乳動物細胞のような真核細胞である。この種の哺乳動物細胞の例は、ヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ−２９３、チャイニーズハムスターの卵巣細胞から調製したＣＨＯ細胞株、及び例えばＣＨＯ−Ｋ１やＣＨＯ−ＤＨＦＲのようなその誘導体、細胞株ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、及びＮＳ．１である。宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＣＨＯ細胞又はその誘導体であり、最も好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。
【００５３】
好ましい態様では、宿主細胞は、発現システムの核酸で安定にトランスフェクションされた細胞である。安定にトランスフェクションされた細胞の場合、発現システムは標的細胞のゲノムに組み込まれ、ゲノム中に安定に保持される。一過性トランスフェクションとは対照的に、移入遺伝子は、分解されないだけでなく、それぞれの細胞分裂で倍加し、娘細胞に継代される。したがって、後者は所望のタンパク質を調製する能力を長期間保持する。
【００５４】
トランスフェクションされた細胞、特に安定にトランスフェクションされた細胞を調製する方法は当業者に公知である。宿主細胞は、例えば短時間電界を供することによる細胞膜の透過化により細胞への核酸の取り込みを可能にするエレクトロポレーションで、又はウイルスベクターによるトランスフェクション若しくは感染で形質転換できる。組換えタンパク質の一過性発現の他に、用いる発現システムは、トランスフェクションされた宿主細胞のクローン選択をも可能にすることができ、好適な発現効率を有するクローン細胞株を選択可能である。
【００５５】
好ましい態様では、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３による少なくとも１つの核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞は真核哺乳動物細胞である。その配列が、記載の配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一の核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００５６】
特に好ましい態様では、本発明による宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３による少なくとも１つの核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸で安定にトランスフェクションされた、ＣＨＯ−Ｋ１株の細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞のサブクローン）である。その配列が、記載の配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一の核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００５７】
更に、本発明は、上で定義したようなＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製する方法に関するものであり、
ａ）上記のような宿主細胞を準備し、
ｂ）宿主細胞を培養し、
ｃ）必要に応じて選択し、そして
ｄ）発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を単離する、
ことを含む。
【００５８】
使用できる宿主細胞の例は、上記細胞である。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＣＨＯ細胞又はその誘導体であり、最も好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。好適な宿主細胞は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸で、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）によりトランスフェクションすることができる。
【００５９】
トランスフェクションされた宿主細胞は、接着細胞であっても懸濁培養物であってもよい。用いる宿主細胞は、接着細胞を懸濁培養に適応させるあいだの発現効率の低下を避けるため、懸濁培養中に存在することが好ましい。
【００６０】
初代培養細胞及び細胞株は、標準法（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９３、動物細胞培養：実践的アプローチ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社）により、好適な栄養培地中、塩濃度、ｐＨ、ビタミン、微量元素、選択剤、温度、通気などに関し、それぞれの場合において用いる宿主細胞の要求に対して調整され、所望の発現産物を最適に発現可能な発酵条件下で培養することができる。血清又は外来タンパク質のない、比較的高純度の発現産物を保証する栄養培地を使用することが有利である。
【００６１】
選択、特にクローン選択とは、所望の特性を有する宿主細胞を段階的間引きによって増殖させる方法を意味する。クローン選択法は、発現産物の十分な発現レベル及び／又は高グリコシル化パターンと高シアリル化状態を保証する宿主細胞クローンを選択することが好ましい。グリコシル化パターン及びシアリル化状態は、とりわけ、発現産物の半減期、生体内分布、免疫原性、及び精製挙動に影響を及ぼす。グリコシル化パターン及びシアル酸の状態を決定するための好適な方法は当業者に公知であり、とりわけ、ＩＥＦ（分画電気泳動）を用いる酵素的切断の組み合わせ、及びＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィ）を含む。
【００６２】
本発明の方法は、異種発現させたＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の宿主細胞からの単離を更に含み、好ましい態様では、宿主細胞の培地からの単離を含む。組換えポリペプチドは、単離し、必要に応じて、例えば細胞溶解、分画遠心法、沈殿、ゲルろ過、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィなどを含む当業者に公知の方法にしたがい精製することができる。組換えタンパク質を精製するための好適な方法の１つの例は、不溶性マトリックスが化学処理によりリガンドに結合できる親和性クロマトグラフィである。有用なリガンドは、マトリックスに結合可能な活性化学基を有する分子であり得る。リガンドは、通常、精製すべきポリペプチドに可逆的に結合可能なように選択される。精製すべき分子は、分子のリガンドへの結合に良好な条件下、宿主細胞の予備精製培地中でマトリックスに供され、未結合分子はその後の洗浄工程によって培地から除去される。精製すべきポリペプチドは、リガンドに結合したポリペプチドを引き離す溶液を供することによって溶出させることができる。他の好適な方法は、精製すべきポリペプチドが過剰の陽電荷又は陰電荷を介してマトリックスに結合できる陰イオン交換クロマトグラフィである。本発明の方法の好ましい態様では、発現産物は、初めに細胞培地を宿主細胞から除去することによって精製され、この後に、遠心工程及び／又はろ過工程が続いて細胞残屑を除去し得る。好ましい態様では、組換えＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質は、必要に応じてゲルろ過を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとの組み合わせによって宿主細胞の予備精製培地から精製される。このようにして得た発現産物は、その後、ＢＣＡ、光学密度測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、アミノ酸解析、アミノ末端配列決定、フィンガープリント（ＭＡＬＤＩ）、分子量測定（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ）などのような当業者に公知の方法で、量、同一性、及び純度に関して特徴付けることができる。
【００６３】
ＩＬ−１５／Ｆｃを組成物から精製するための特に好ましい方法は、以下の工程を含む：
ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供し、第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる；
ｂ）工程ａ）の溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィカラムに供し、第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる；そして
ｃ）工程ｂ）の溶出物をゲルろ過カラムに供し、第３のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる。
【００６４】
好ましい態様では、本発明の方法は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を、少なくとも１０ｐｇ／（細胞×日数）、より好ましくは少なくとも１５ｐｇ／（細胞×日数）の量で調製することを可能にする。
【００６５】
更に好ましい態様では、精製後のタンパク質は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である。
更に、本発明は、上で定義した通りの発現システム、核酸、又は宿主細胞の、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための使用に関するものであり、上記のように使用される。
【００６６】
更に、本発明は、ＣＨＯ細胞及びその誘導体、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞においてタンパク質を発現させるための、上で定義した通りのＣＤ５リーダーの使用に関する。驚くべきことに、タンパク質の発現又は細胞培養上清へのその放出は、ＣＤ５リーダーを用いると、リーダーを用いない発現と比較して２００〜３００倍高いことが示された。更に、ＣＤ５リーダーは、これらの細胞において、他のリーダーよりも際だって優れていることが示された（実施例２、図８を参照されたい）。タンパク質はどのタンパク質でもよい。好ましい態様では、タンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターによって、特にイントロンＡとの組み合わせによって調節される。
【００６７】
以下の実施例及び図面によって本発明を限定することなく具体的に説明する。
実施例
【実施例１】
【００６８】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃの産生
ＩＬ−１５／Ｆｃ産生ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を作製するには、ＩＬ−１５／Ｆｃの発現構築体を形成し、その分泌特性、それが含有する断片の同一性／完全性、及び好適な耐性遺伝子に関して最適化する必要がある。
【００６９】
ａ）出発材料
ヒトＩＬ−１５／Ｆｃ発現構築体（改変ＩＬ−１５／ヒトＦｃ）は、「ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター」の免疫部門（ハーバード大学医学部、ボストン、米国）より提供された。
【００７０】
オリゴヌクレオチドはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（エーバスベルク、ドイツ）から入手した。関連シグナルペプチドの配列は遺伝子ライブラリーから入手した。
制限酵素（ＢｇｌＩＩ、ＸＢａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＢｓｔＸＩ、ＡｐａＩ）、リポフェクタミン２０００、他の分子生物試薬（Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）、及びプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ、ｐｃＤＮＡ３．１は、インビトロジェン（カルルスルーエ、ドイツ）又はアマシャム−ファルマシア（ＮｈｅＩ、プロテインＡセファロース、ウプサラ、スウェーデン）から入手した。
【００７１】
コンピテント大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞はストラタジーン（ラ・ホーヤ、米国）から入手した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）はＫＭＦ Ｌａｂｏｒｃｈｅｍｉｅ（Ｓａｎｋｔ Ａｕｇｕｓｔｉｎ、ドイツ）から購入した。
【００７２】
プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−Ｍａｘｉキット、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−Ｇｉｇａキット）はキアゲン（ヒルデン、ドイツ）から購入した。
抗体は、ＢＤ−ファーミンジェン（マウス抗ｈＩＬ−１５；カタログ番号５５４７１２；ハイデルベルグ、ドイツ）及びＤｉａｎｏｖａ（ヤギ抗マウスＰＯＤ；カタログ番号１５−０３６−００３；ヤギ抗ヒトＰＯＤ；カタログ番号１０９−０３６−０８８；ハンブルグ、ドイツ）から入手した。
【００７３】
ｂ）方法／結果
出発プラスミドは、ｐＳｅｃＴａｇＡベクター骨格内に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジ領域、及びＣＨ２、ＣＨ３領域）に融合した改変ヒトＩＬ−１５を含む融合タンパク質のｃＤＮＡを含有する。プラスミドの構造は、本願で引用したＦｃ部分がマウスＩｇg２ａであること以外はＫｉｍら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：５７４２−５７４８；１９９８）によって記載されたものに相当する。
【００７４】
ｐＳｅｃＴａｇＡベクターに既に存在するＩｇｋリーダーを、ＩＬ−１５／Ｆｃ部分のインフレームクローニングによって融合タンパク質の分泌に用いた。このため、本来のＩＬ−１５配列から固有のシグナル配列を除去した。しかしながら、クローニングにより、Ｉｇｋリーダー配列の３’端とＩＬ−１５コード配列の５’端とのあいだに追加の１０アミノ酸を導入した。これは、タンパク質のプロセシング後も分泌タンパク質中に保持された。これらの非特異的アミノ酸を除去し、タンパク質の分泌特性を向上させるために、他の分泌タンパク質又は細胞表面タンパク質のさまざまなリーダー配列について試験した：マウスＩｇｋ（Ｃｏｌｏｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９−１０４；１９９２；受託番号Ｘ９１６７０）、ヒトＣＤ５（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４６−３４９；１９８６；受託番号Ｘ０４３９１）、ＣＤ４（Ｈｏｄｇｅら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：９９−１０４；１９９１；受託番号Ｍ３５１６０）、ＭＣＰ−１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｊｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４４：４８７−４９３；１９８９；受託番号Ｍ２４５４５）、及びＩＬ−２（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：３０５−３１０；１９８３；受託番号Ｋ０２０５６）（受託番号は「全米バイオテクノロジー情報センター」に基づいている）。Ｉｇｋリーダーと追加のアミノ酸を除去後、２本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることによって、リーダーを記載のシグナルペプチド配列で置換した。配列決定によって同一性を確認した。続いて、得られた構築体を、リポフェクタミン２０００を用いたＨＥＫ−２９３細胞の一過性トランスフェクションによって試験した。さまざまな構築体でトランスフェクションした細胞の細胞培養上清のタンパク質含量を、Ｍｏｌｌ及びＶｅｓｔｗｅｂｅｒの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６：７７−８４、１９９９）にしたがいプロテインＡ−セファロース精製後、ＢＣＡアッセイで測定した。融合タンパク質の両成分の存在を確かなものにするため、ＳＤＳゲルの銀染色、及びＦｃ部分又はＩＬ−１５部分に対するウエスタンブロットによってタンパク質の同一性を確認した。記載の実験においてＣＤ５リーダーは最良の結果を生じ、ベクターを更に最適化するために選択した。
【００７５】
Ｆｃ部分のｃＤＮＡを、エクソン／イントロン構造を含有するゲノムＤＮＡで置換してもタンパク質発現の向上に寄与するかどうかについて更に試験した。核のスプライス装置によって除去されるべきイントロンの存在は、核からのＲＮＡ輸送、及びＲＮＡ安定性を向上させることができる。したがって、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を挿入することによって、ゲノムＦｃ部分をＩＬ−１５ｃＤＮＡ配列に連結させた。得られたプラスミドをさまざまなリーダー配列で同様に改変し、上記のように試験した。しかしながら、ウエスタンブロットによるタンパク質の解析は、さまざまな望ましくないスプライス変異体が存在することを示した。したがって、ｃＤＮＡ型のＦｃ部分を使用し続けることに決定した。
【００７６】
その結果、得られたプラスミドはヒトＣＤ５リーダーとｃＤＮＡ−Ｆｃ部分とを含む。
改変ＩＬ−１５／Ｆｃ発現構築体の配列決定は、Ｆｃ部分が、オリジナル構築体に既に存在した３つの変異を含有することを示した。これらの変異のうちの２つは、高度に保存された位置のアミノ酸に関連した。第３の変異は、分子内及び分子間のシステイン結合の形成を阻止するために意図的に挿入した、ヒンジ領域の４位のＣｙｓ−Ａｌａ変異であった。
【００７７】
Ｃｙｓ−Ａｌａ変異を保持しながら２つの望ましくない変異を除去するために、ＲＴ−ＰＣＲでＦｃ ｃＤＮＡをサブクローニングした。用いたＲＮＡ源は、ＶＣＡＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築体でトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。増幅したＦｃ ｃＤＮＡ断片をＣＤ５−ｍｕｔＩＬ−１５プラスミドにクローニングし、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ制限処理でＦｃ部分を除去した。
【００７８】
得られたプラスミドを、異なる制限パターンに基づいて、及びその後の配列決定により再度解析し、ＣＤ５−６Ａｌａ７と称した。ＤＮＡ挿入剤としてのゼオシンの使用は変異を引き起こすため、ＩＬ−１５／Ｆｃの発現カセットをオリジナルｐＳｅｃＴａｇＡ骨格から切り出し、ＳＶ４０プロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。得られたプラスミドの両方の鎖を配列決定したところ、ＩＬ−１５／Ｆｃ発現カセットとの完全な一致を示した。
【００７９】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションと細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、そのタンパク質発現について構築体を再度試験した。陽性対照として、平行実験においてＣＤ５−６Ａｌａ７プラスミドでトランスフェクションを行った。
【００８０】
この目的のため、５×１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェル組織培養プレートに３重に細胞を蒔いた。２μｇのプラスミド及び４μｌのリポフェクタミン２０００をそれぞれ２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地で希釈し、トランスフェクションに用いた。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベーション後、混合物をピペットに取り、組織培養プレートの培地に加えた。
【００８１】
トランスフェクション後２目日に培地を除去し、ヒトＩＬ−１５部分に対するウエスタンブロットでＩＬ−１５／Ｆｃ含量を解析した：２０μｌの細胞培養上清を５μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、８５℃で５分間インキュベーションした。次にサンプルを１２％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。次にセミドライブロッティングチャンバーを用いてゲルをブロットした。５％ミルクパウダーのＰＢＳ溶液、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するブロッキング溶液でブロットを一晩処理した。次にブロッキング溶液で１：１０００に希釈したマウス抗ヒトＩＬ−１５モノクローナル抗体とともにブロットを４時間インキュベーションした。３回の洗浄工程（１０分間、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）後、ヤギ抗マウス２次抗体 ペルオキシダーゼ（希釈１：５０００）とともにブロットを室温で更に２時間インキュベーションした。ブロットを再度３回洗浄し、次にＬｕｍｉｌｉｇｈｔ溶液をブロット表面に滴下し、Ｘ線フィルムをブロットに対して感光させた。
【００８２】
ＣＤ５−６Ａｌａ７でトランスフェクションした後に得たシグナルの範囲内の特定のウエスタンブロットシグナルは、３回の平行したトランスフェクション全ての細胞培養上清がＩＬ−１５／Ｆｃをタンパク質として含有することを示した。したがって、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミド（図１〜３）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現に使用できることが示された。
【００８３】
ｃ）結論
ＩＬ−１５／ＦｃプラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７を調製した。これは、ＣＭＶプロモーターの制御下、ヒトＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡに融合した改変ヒトＩＬ−１５とともにＣＤ５リーダーを含有する発現カセットを含有する。安定な真核細胞クローンを選択するために、ネオマイシン耐性遺伝子を導入した。プラスミドを配列決定したところ、ベクター骨格に関連性のないほんのわずかな不一致（３塩基対の反復）を有するものの、関連コード領域においては１００％の一致を示した。構築体の機能性をＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションで確認した。
【実施例２】
【００８４】
所望の産物に対するＤＮＡを含有するプラスミドによる真核細胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞）のトランスフェクションは、治療用タンパク質を作製するための標準的な方法である。それにもかかわらず、このようにして作製した安定な細胞クローンによる低レベルの生産性は広く知られた問題である。したがって、既存の細胞株の生産性を増加させるためのさまざまな戦略がある。細胞においてプラスミドコピー数を増加させる試み（例えばメトトレキセート／ＤＨＦＲシステムを介して）は別として、更に発現構築体自体を改変することが可能である。強力なプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）に加えて、イントロンの導入により、より良いＲＮＡ安定性と、細胞のスプライス装置によって行われる核からのより良いＲＮＡ輸送をもたらす可能性がある。それにもかかわらず、イントロン／トランス遺伝子のどの組み合わせが好適か試験しなければならない。この目的のため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃ産生を増加させる組み合わせを発見するためにさまざまなイントロンをヒトＩＬ−１５／Ｆｃと組み合わせた。
【００８５】
ａ）材料
出発プラスミドとして用いたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドである。図１に図示されている。その配列は配列番号１に開示されている。
【００８６】
用いた試験系は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳＭ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ、受託番号：ＡＣＣ１１０）、又はＨＥＫ−２９３細胞（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、グリュンベルグ、ドイツ、ＡＥ８０５０３、ＱＢＩ−２９３Ａ）である。大腸菌細胞（ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ、ストラタジーン、ラ・ホーヤ、米国）も用いた。標準培養条件（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤環境）で細胞を培養した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１週間に２回、１：２０の比で継代した。ＨＥＫ−２９３細胞は１：６の比で継代した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に用いた培地は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＫＳ＋１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐであり、ＨＥＫ−２９３細胞に用いた培地はＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＫＳ＋１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐである。Ｏｐｔｉｍｅｍ１培地をトランスフェクションに用いた。全ての培地はインビトロジェン、カルルスルーエ、ドイツ（カタログ番号３１３３１−０２８；３２４３０−０２７；５１９８５−０１８）から入手した。用いたプラスミドは、ＣＭＶプロモーター及びキメライントロン、ヒトβ−グロブリン遺伝子の５’スプライスドナー部位及びＩｇＧ重鎖の可変領域の３’スプライスアクセプター部位を含有するｐＣｌ−Ｎｅｏ（プロメガ）である。ｐＭＧ（インビトロジェン）は、ＣＭＶ由来イントロンＡを含有する持続性ＣＭＶプロモーターである。ｐＳｗｉｔｃｈ（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）は、合成イントロンＩＶＳ８である。更に、以下の酵素及び制限酵素を用いた：ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、仔ウシ腸由来アルカリホスファターゼ。これら及び他の分子生物試薬（リポフェクタミン２０００）はインビトロジェンから入手した。ＮｈｅＩはアマシャム−ファルマシア（ウプサラ、スウェーデン）から入手し、プラスミド精製キットはキアゲン、ヒルデン、ドイツから入手した。エキスパンド ハイフィディリティＰＣＲシステム（カタログ番号１ ７３２ ６４１）はロシュ、マンハイム、ドイツから入手した。
【００８７】
ｂ）方法
ｉ）ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドのＩＬ−１５／Ｆｃ挿入物をＮｈｅＩ／ＡｐａＩ消化によって単離した。最初にプラスミドをＡｐａＩ制限処理によって線状にし、５’−突出末端をＴ４ポリメラーゼ処理で平滑末端にした。次にその後のＮｈｅＩ消化によってＩＬ−１５／Ｆｃ挿入物を単離した。ＮｈｅＩ及びＳｍａＩで消化したｐｃＩ Ｎｅｏに断片を連結した。
【００８８】
ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７のＣＭＶプロモーターを除去し、ｐＭＧ由来のイントロンＡを有する拡張ＣＭＶプロモーターと置換した：ｐＭＧプラスミドをＰａｃＩで切断し、突出末端をＴ４ポリメラーゼ処理で平滑末端にした。次のＸｂａＩ処理後、このようにして得た１．７ｋｂ断片はＣＭＶプロモーター＋イントロンＡを含有しているが、これをアガロースゲル電気泳動で精製した。ＮｈｅＩとその後のＮｒｕＩ制限消化によりＣＭＶプロモーターをｐｃＤＮＡ３．ｈＣＤ５．６Ａｌａ７から除去した。得られた断片を、ｐＭＧ−プロモーター−イントロンと４℃で一晩連結させた。
【００８９】
ｉｉｉ）ＩＶＳ８イントロンをＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７内のＣＭＶプロモーターの３’端とＩＬ−１５挿入物の５’端とのあいだにクローニングした。プラスミドをＮｈｅＩ制限消化で線状にし、その後、仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼで処理した。イントロンを、ＸｂａＩ制限部位を含有するプライマーを用いて、エキスパンド ハイフィディリティＰＣＲシステムにて以下の条件下でＰＣＲにより増幅した：用いた反応混合物は、２μｌのｄＮＴＰｓ（キアゲン、Ｔａｑ ｃｏｒｅキット、それぞれ２ミリモル／ｌ）、２５ｐｍｏｌのプライマー、５μｌの１０×バッファー、０．７５μｌのハイフィディリティＴａｑポリメラーゼ、１μｌ（およそ１５ｎｇ）のｐＳｗｉｔｃｈ−ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ断片から成り、最終容量５０μｌになるまで水を加えた。ＰＣＲプログラム（２５サイクル）は以下の通りである：９５℃で５分、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、７２℃で５分。ＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、０．８％アガロースゲルから溶離し、線状にしたプラスミドと連結させた。
【００９０】
得られたプラスミドで大腸菌ＸＬ１０ Ｇｏｌｄを形質転換し、プラスミドをミニプレップで解析した。適切な制限パターンを示すそれぞれのプラスミドのうち、１つのクローンをその後のエンドトキシンフリープラスミド調製に用いた。
【００９１】
ＩＬ−１５／Ｆｃの発現を、ＨＥＫ−２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクション後に解析した。トランスフェクション前日に細胞を５×１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェル細胞培養プレートに２重に蒔いた。Ｆｅｌｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７；１９８７）によるトランスフェクションのため、２μｇのプラスミド及び４μｌのリポフェクタミン２０００をいずれも２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地で希釈した。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベーションした後、混合物をピペットに取り、細胞培養プレート中の細胞培地に加えた。トランスフェクション後２日目に培地を除去し、ＩＬ−１５／ＦｃのＦｃ部分を標的にしたＥＬＩＳＡ試験でそのＩＬ−１５／Ｆｃ含量を測定した。
【００９２】
ｃ）結果
さまざまな発現構築体でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃの分泌は、他のベクター成分にほとんど影響されなかった。逆に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃの発現は、イントロンをＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に挿入した後、２００〜３００倍に増加した。オリジナル構築体ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７はタンパク質分泌レベルをほとんど検出できなかった（１０ｎｇ／ｍｌ以下）が、イントロンの挿入により、細胞をｐＭＧ１０Ａｌａ７でトランスフェクションした後のＩＬ−１５／Ｆｃレベルはおよそ３００ｎｇ／ｍｌであった（図４〜６；配列番号２）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃ発現レベルを示すＥＬＩＳＡデータを図４に示す。ｐＭＧ構築体でトランスフェクションした後の発現レベルが最高であったため、安定なＣＨＯ−Ｋ１発現細胞株を作製するために後者を選択した。
【００９３】
この目的のため、最初にプラスミドを１本鎖配列決定に供した。構築体の両方の鎖について、ＩＬ−１５／Ｆｃカセット、新たに挿入したＣＭＶプロモーター、及びイントロン断片を含有する領域を配列決定した。プラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＩＬ−１５／Ｆｃカセットを含有していた。ＣＭＶ（プラスミドＭＧ）由来のイントロンＡは、プロモーターと翻訳開始部位とのあいだに位置していた。プラスミドは、ＩＬ−１５／Ｆｃ断片の下流にＢＧＨポリＡ部位を含有していた；ネオマイシン耐性遺伝子はＳＶ４０プロモーターによって制御され、ＳＶ４０ポリＡ部位も含有していた。プラスミドは、大腸菌における選択及び増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有していた。
【００９４】
ｄ）考察及び結論
安定なＣＨＯ−Ｋ１−ＩＬ−１５／Ｆｃトランスフェクタントのタンパク質収率を上昇させるために、プロモーターとＩＬ−１５／Ｆｃカセットとのあいだにイントロンを導入することによって発現プラスミドを改変した。イントロン−トランス遺伝子−宿主細胞の組み合わせはタンパク質の発現に非常に影響を及ぼし、したがって、解析した２種の細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃ発現の増加に最も有効なイントロンを予測することは可能ではない。
【００９５】
ＨＥＫ−２９３細胞はイントロンの導入にほとんど影響されなかったが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞ではＩＬ−１５／Ｆｃ分泌の大きな増加が検出された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃタンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターとｐＭＧ由来イントロンＡとを含有するプラスミドを用いたところ、オリジナルのＩＬ−１５／Ｆｃ発現ベクターと比較して、１桁を越える規模で増加した。プラスミドは、予備臨床試験及び臨床試験のためのＩＬ−１５／Ｆｃの産生、又はＩＬ−１５／Ｆｃの工業的産生に使用できるＩＬ−１５／Ｆｃ産生細胞株の作製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体のマップを表す。
【図２】図２は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号１）。
【図３】図３は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号１）。
【図４】図４は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体のマップを表す。
【図５】図５は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号２）。
【図６】図６は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号２）。
【図７】図７Ａは、ＣＤ５リーダーを有するヒト改変ＩＬ−１５／Ｆｃの核酸配列を表す（配列番号３）。図７Ｂは、ＣＤ５リーダーを有するヒト改変ＩＬ−１５／Ｆｃのアミノ酸配列を表す（配列番号４）。図７Ｃは、ＣＤ５リーダーを有するヒト改変ＩＬ−１５／Ｆｃのアミノ酸配列を表す（配列番号５）。
【図８】図８は、その都度示したリーダー配列を含有するｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドでトランスフェクションした後のＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞培養上清におけるＩＬ−１５／Ｆｃ含量を表す。
【図９】図９は、さまざまな発現構築体でトランスフェクションした後のＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞培養上清におけるＩＬ−１５／Ｆｃ含量を表す。それぞれのバーは、いずれの場合も２回の独立した実験における２回の測定の平均＋ＳＥＭを表す。ｐｃＤＮＡ３．１は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７ベクターに相当する。ｐＶＳ８−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＳｗｉｔｃｈプラスミド（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）に相当する。ｐＭＧ−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＭＧプラスミド（インビトロジェン）に相当する。ｐＣＩＮｅｏ−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＣＩ−Ｎｅｏプラスミド（プロメガ）に相当する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン１５／Ｆｃ（ＩＬ−１５／Ｆｃ）融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸を含む発現システムに関するものであり、これによりＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製することができる。更に、本発明は、この発現システムを用いたＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の調製方法、及び宿主細胞においてタンパク質を発現させるための発現システム、核酸、宿主細胞、又はＣＤ５リーダーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物における免疫イベントは、免疫ネットワークのように作用する、非常に多数の複雑な細胞性及び無細胞性相互作用に基づいている。この複雑なネットワーク内の多くのメカニズムの機能は、近年になって解明されつつある。１９９４年に記載されたインターロイキン１５因子（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４：９６５−９６８）を含めたサイトカインは、免疫ネットワーク内の可溶性メッセンジャーとして主要な役割を果たしている。インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、免疫モジュレーター、成長因子、ケモカイン、及び生存因子として、Ｔ細胞、単球／マクロファージ、ＮＫ細胞、及び組織の他のＩＬ−１５感受性細胞、例えばケラチノサイトその他のような免疫系細胞の増殖、分化、活性化、及び生存に対して影響を及ぼす。免疫モジュレーターとしての機能の他に、ＩＬ−１５は、筋組織及び脂肪組織の代謝調節にも役割を果たす。
【０００３】
典型的には、ＩＬ−１５は、ヘテロ３量体インターロイキン１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）を介してエフェクター細胞に結合する。ＩＬ−１５Ｒは、ＩＬ−１５に特異的に結合するβ−サブユニット、同様にＩＬ−２によって認識されるα−サブユニット、及び同様にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−９及びＩＬ−１５などのインターロイキンファミリーの更なるメンバーによって認識されるγ−サブユニットから成る。
【０００４】
ＩＬ−１５は、例えば関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎、全腸炎、肺サルコイドーシス、又は全身性エリテマトーデスなどの非常に多数の自己免疫疾患及び慢性炎症性疾患、並びに移植臓器、組織、及び細胞の拒絶反応において役割を果たす。ＩＬ−１５は、リンパ性白血病においても役割を果たす。
【０００５】
インターロイキン１５は、がん患者及び免疫不全疾患の場合にはリンパ球の割合を増やすためにアゴニスト原理により、免疫系の病的活性化を伴う疾患の場合にはＩＬ−１５の作用をブロックする物質を用いることによるアンタゴニスト原理により、治療的に用いられる。これらの物質は、可溶性ＩＬ−１５受容体ポリペプチド、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５受容体に対する抗体、あるいは例えばＩＬ−１５成分と免疫グロブリン成分とを含有する融合タンパク質のようなＩＬ−１５部分を有する融合タンパク質（概説はＦｅｈｎｉｎｇｅｒ及びＣａｌｉｇｉｕｒｉ、２００１、Ｂｌｏｏｄ ９７（１）：１４−３２）であり得る。インターロイキン−免疫グロブリン融合タンパク質は有益であることが証明されている。
【０００６】
インターロイキンと免疫グロブリンとの組換え融合タンパク質は、原核細胞発現システムで調製することができる。これらの発現システムの実質的な不利益は、原核細胞で産生されたタンパク質のグリコシル化がないことであり、これは、発現産物の機能性及び安定性を損ない、したがって、発現産物の医学的有用性を制限するかもしれない。逆に、通常正しいグリコシル化を保証する、例えば哺乳動物細胞などの代替発現システムにおけるインターロイキンと免疫グロブリンとの組換え融合タンパク質の産生には、発現効率が比較的低いという問題がある（Ｚｈｅｎｇら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４０４１−４０４８）。したがって、大量の組換えＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を十分な純度で調製可能な真核生物の発現システムを提供する必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、この種の改良された発現システムを提供することである。
この目的は、１以上の核酸を含有する、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための発現システムを提供することによって達成され、これは、
ａ）ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸、
ｂ）少なくとも１つのプロモーター、及び
ｃ）ＣＤ５リーダーに対する少なくとも１つの核酸、
を含み、プロモーター及びＣＤ５リーダーに対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸に機能的に連結されている。
【０００８】
本発明の発現システムにより、例えば真核生物における組換えＤＮＡ技術によって、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を大規模で調製することが可能である。したがって、本発明は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を商業目的で調製することを可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
組換えＤＮＡ技術は、通常、遺伝情報を例えばベクターへ移送するための技術を意味する。これらのベクターは、例えば宿主への導入により遺伝情報が更に処理されることを可能にし、遺伝情報を新たな環境で増加させ、発現させる。遺伝情報は、通常、１以上の所望の遺伝子産物に対する情報を暗号化形態で含有する核酸の形態、例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの形態で存在する。ベクターとして作用し得るものの例は、例えばｃＤＮＡなどの核酸が組み込まれ得るプラスミドであり、宿主細胞において増加させ、必要に応じて、例えばプロモーター、エンハンサー、又はサイレンサーなどの転写調節配列の制御下で発現させる。プラスミドは、宿主細胞における所望の発現産物の合成並びに後者の安定性及び局在に影響を及ぼす配列、又は用いるプラスミド若しくは発現産物の選択を可能にする配列を更に含有することができる。
【００１０】
発現システムという用語は、本発明によれば、必要に応じて例えばリボソーム、アミノ酸、及び／又はｔＲＮＡなどの転写に必要であり得る更なる配列と組み合わせた、１以上の核酸を表し、発現システムは、好適な条件下、例えば好適な宿主細胞でＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の発現を引き起こすことが可能である。
【００１１】
好ましい態様によれば、発現システムは１以上の核酸から成る。
宿主細胞における発現を可能にするには、発現システムの核酸は、組換えＤＮＡ技術法によって調製できる１以上のベクターの部分であることができ、これは当業者に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編集）、１９８９、分子クローニング：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク）。当業者は、本発明に関して使用できる非常に多数のベクターについて知っている。真核細胞における発現に好適なのは、例えば酵母ベクターｐＹＥＳ（サッカロミセス・セレビシエで発現；インビトロジェン）及びｐＩＣＺ（ピキア・パストリスで発現；インビトロジェン）である。ｐＢａｃＰＡＫ９（昆虫細胞で発現；クローンテック）などのバキュロウイルスベクターや、発現すべき核酸配列に加えて好適な転写調節配列を挿入できる、Ｒｃ／ＣＭＶ、Ｒｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡ、及び他のＳＶ４０由来ベクターなどの、哺乳動物細胞における異種発現に用いられる多くのベクターも使用できる。
【００１２】
選択した宿主においてプラスミド複製を介在する複製起点に加えて、好適なベクターは、通常、選択可能マーカー遺伝子、及び核酸断片を挿入できる制限酵素の認識部位を含有することが好ましい。ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、制限酵素の好適な認識部位を介してベクターに導入することができる。
【００１３】
本発明の発現システムに同様に好適なウイルスベクターシステムは、例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、及びヘルペスウイルスベクター若しくはパピローマウイルスベクターを含む。
【００１４】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸は、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡであり、特に好ましくはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はその組み合わせである。
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする。本発明によるＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質は、２つの融合部分、即ちＩＬ−１５成分とＦｃ成分とを含有する融合タンパク質である。機能性タンパク質に加えて免疫グロブリンの融合部分を含有する組換えタンパク質は、例えばＣａｐｏｎら（ＵＳ５，４２８，１３０号）に記載されている。
【００１５】
Ｎ端の改変又は未改変ＩＬ−１５部分とＣ端のＦｃ部分とから成る融合タンパク質が好ましい。そのようなタンパク質は、例えばＷＯ９７／４１２３２号及びＫｉｍら（１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：５７４２−５７４８）に開示されている。
【００１６】
融合タンパク質のＩＬ−１５部分は、例えば活性化Ｔ細胞に発現するＩＬ−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）への選択的結合を介在する。したがって、ＩＬ−１５部分は天然ＩＬ−１５でもその変異体でもよい。
【００１７】
より好ましい態様では、ＩＬ−１５成分は野生型ＩＬ−１５である。これに関連して、ＩＬ−１５は、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、又はサル、好ましくはヒトなどのあらゆる種のＩＬ−１５であり得る。さまざまなスプライス変異体及び天然変異体も含まれる。哺乳動物の核酸、特にヒト又はマウス型の核酸が特に好ましい。
【００１８】
ＩＬ−１５変異体には、天然ＩＬ−１５と比較して、例えば１以上の欠失、挿入、又は置換、又はそれらの組み合わせなどの変異を有するＩＬ−１５成分が含まれる。しかしながら、用いるＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質によるＩＬ−１５Ｒへの結合を可能にする必要がある。これは、例えば、標識ＩＬ−１５、及びＩＬ−１５受容体を有する膜又は細胞を用いた放射性リガンド結合アッセイで確認することができるであろう（Ｃａｒｓｏｎ ＷＥら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０（４）：１３９５−１４０３）。
【００１９】
好ましい態様では、変異体はＩＬ−１５のような作用を有することができ（アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分）、その活性レベルは、ＩＬ−１５と比較して、同一でも、低下しても、増加していてもよい。アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に使用できる試験系は、ＩＬ−１５成分によるマウスＣＴＬＬ−２細胞増殖の刺激である。
【００２０】
成分が少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、更により好ましくは１００％、更により好ましくは１５０％、最も好ましくは少なくとも２００％の活性を有する場合は、本発明によれば、ＩＬ−１５成分はアゴニスト作用を有する。アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の活性は、野生型ＩＬ−１５による刺激と比較した（野生型ＩＬ−１５は１００％活性に相当する）、ＩＬ−１５成分による反応の刺激の割合を意味する。試験では、ＩＬ−１５成分単独でも融合タンパク質でも使用可能である。
【００２１】
アゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の場合、残基を同様の特性を有する他の残基に置換する保存的アミノ酸置換が好ましい。典型的な置換は、脂肪族アミノ酸群内、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸群内、酸性ラジカルを有するアミノ酸群内、アミド誘導体を有するアミノ酸群内、塩基性ラジカルを有するアミノ酸群内、又は芳香族ラジカルを有するアミノ酸内の置換である。典型的な保存的及び半保存的置換は以下の通りである。
【００２２】
【表１】
【００２３】
本発明の他の態様では、アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を使用する。この種の成分は、ＩＬ−１５の作用、又はＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒへの結合を阻害し、完全に又は部分的にのみ阻害することが可能である。アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分を有するＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に使用できる試験系は、ＷＯ９７／４１２３２号に記載の試験系である（ＢＡＦ−ＢＯ３細胞増殖アッセイ）。成分がＩＬ−１５介在作用又はＩＬ−１５のＩＬ−１５Ｒへの結合を少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９５％阻害する場合は、本発明によればＩＬ−１５成分はアンタゴニスト作用を有する。試験には、ＩＬ−１５成分単独でも融合タンパク質でも使用可能である。
【００２４】
アンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分の場合、残基を異なる特性を有する他の残基に置換する非保存的アミノ酸置換が好ましい。これらの置換は、ＩＬ−１５Ｒとの相互作用又はシグナル伝達に関与する分子の領域内で起こることが更に好ましい。
【００２５】
好ましい態様では、使用するアンタゴニスト作用を有するＩＬ−１５成分は、ＷＯ９７／４１２３２号に記載のＩＬ−１５変異体、又は５６位のアミノ酸（アスパラギン酸；ＡＡＡ２１５５１）に変異を有するＩＬ−１５成分である。インターロイキン１５の１４９位及び／又は１５６位のアミノ酸に点突然変異が導入されている、特にグルタミンをアスパラギン酸に置換した（ＷＯ９７／４１２３２号を参照されたい）変異体が最も好ましい。１つの態様では、記載の変異を組み合わせることも可能である。
【００２６】
１つの態様では、融合タンパク質の改変ＩＬ−１５部分は、野生型ＩＬ−１５、好ましくはヒト野生型ＩＬ−１５（例えば全米バイオテクノロジー情報センターのデータベースの受託番号ＡＡＡ２１５５１）と、又は他の天然変異体（例えば全米バイオテクノロジー情報センターのデータベースの受託番号ＣＡＡ６３９１４及びＣＡＡ７１０４４を有する変異体）と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００２７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の第２の機能単位は、Ｆｃ成分である。Ｆｃ部分は、パパイン切断で調製でき、そのアミノ酸配列は高度に保存されている、免疫グロブリンの定常（ｃ＝定常）断片を意味する。Ｆｃ断片は、通常抗原に結合しない抗体断片である。本発明によるＦｃ部分は、ヒンジ領域の他に、定常領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む、上で定義した通りの免疫グロブリン断片も意味することが好ましい。
【００２８】
Ｆｃ成分は、抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ、好ましくはＩｇＭ又はＩｇＧのＦｃ部分に由来し、より好ましくはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のＦｃ部分に由来する。
【００２９】
本発明の具体的態様では、融合タンパク質のＦｃ部分は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ断片であり、ＩｇＧの軽鎖及び重鎖の可変領域を欠失している。使用できるＩｇＧの例は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。ヒト又はマウスのＩｇＧ１が好ましい。
【００３０】
抗体のＦｃ部分全体又はその一部を本発明に使用可能である。しかしながら、Ｆｃ部分の一部は、好ましくは、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質が免疫グロブリン成分のないＩＬ−１５成分よりも血中循環半減期が長くなるようにデザインされる必要がある。これは、１以上の実験動物に融合タンパク質とＩＬ−１５成分を投与、例えば血流に注入し、血中循環半減期を比較することによって試験することができる。より長い半減期は、少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、更により好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも１００％の半減期の増加によって示される。
【００３１】
Ｆｃ部分は、少なくとも１つの変異を有するＦｃ部分でもよい。変異体Ｆｃは、ＩＬ−１５部分に関して上に記載したように、変異され得る。
１つの態様では、融合タンパク質の変異体Ｆｃ部分は、マウス又はヒトの野生型免疫グロブリン、好ましくはヒトＩｇＧ１−Ｆｃ又は天然変異体のＦｃ部分と、少なくとも６５％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％同一である。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、融合タンパク質のＦｃ部分は天然型であるか又は保存的アミノ酸置換を有し、完全なＦｃＲ結合部位及び／又は補体結合部位を含有する。融合タンパク質のＦｃ部分は、補体系の活性化及びＦｃ受容体発現細胞への結合を介在することができ、したがって、融合タンパク質のＩＬ−１５部分によって認識される細胞の枯渇を生ずる。補体活性化及びＦｃ受容体結合を介在するアミノ酸位置における変異の導入、特に非保存的アミノ酸置換は、これらの機能のスイッチを切ることを可能にする。これらの変異の例は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合部位又は補体結合部位（天然ヒトＩｇＧ１の２１４位、３５６位、３５８位、及び／又は４３５位のアミノ酸、あるいは天然マウスＩｇＧ２ＡのＬｅｕ２３５、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及び／又はＬｙｓ３２２）のものである。これらの位置のアミノ酸置換は、通常、Ｆｃ部分の溶解機能及び補体活性化機能（ＷＯ９７／４１２３２号）を欠失させる。
【００３３】
例えば発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の分子間結合、そして凝集を妨げるには、ヒトＦｃ部分のヒンジ領域の４位のアミノ酸システイン、より好ましくはヒトＩｇＧ１のアミノ酸（ヒトＩｇＧ１の１６７位）がアラニンに置換されている態様が更に好ましい。
【００３４】
他の好ましい態様では、Ｆｃ部分は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１又はマウス免疫グロブリンＩｇＧ２ＡのＦｃ部分であり、ヒンジ領域に加えて、重鎖領域ＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【００３５】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質では、ＩＬ−１５成分は、免疫グロブリン成分に直接又はリンカーを介して融合している。リンカーは、好ましくは２５アミノ酸以下、より好ましくは１５アミノ酸以下、更により好ましくは１０アミノ酸以下、最も好ましくは１、２、３、４、又は５アミノ酸から成る。
【００３６】
更に他の好ましい態様では、インターロイキンをコードするヒト核酸は、Ｆｃをコードするヒト核酸、又は例えばマウス若しくはラットなどの他の種のＦｃをコードする核酸と同様に組み合わされる。例えば、ＩＬ−１５をコードするヒト核酸は、ＩｇＧ１をコードするヒト核酸、ＩｇＧ２Ａをコードするマウス核酸、又はラット由来ＩｇＧ２Ｂをコードする核酸と同様に組み合わせることができる。核酸の更に可能な組み合わせは、当業者によって認識されるであろう。
【００３７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する最も好ましい核酸は、配列番号１の９７９〜２０１４位の配列、配列番号２若しくは配列番号３の１９８５〜３０２０位の配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸である。ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸を含む最も好ましいベクターは、配列番号１又は配列番号２のベクターである。
【００３８】
しかしながら、「ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸」という用語は、その配列が、配列番号３に示した塩基配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする塩基配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一の核酸も含み、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中循環半減期が上昇している（試験系に関しては上記を参照されたい）。
【００３９】
「ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸を含むベクター」という用語は、その配列が、配列番号１及び配列番号２に示した塩基配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一である核酸も含み、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００４０】
発現システムはプロモーターを更に含む。プロモーターとその機能は当業者に公知である。プロモーターは、例えばウイルス、細菌、又は真核生物由来であることができる。プロモーターは、発現すべき遺伝子の転写を構成的に制御しても、又は誘導性であってもよく、したがって遺伝子発現の特異的調節を可能にする。プロモーターは、更に細胞又は組織特異的であることができる。即ち、遺伝子産物の発現を特定細胞種に限定することができる。これらの特性を有するプロモーターは当業者に公知である。宿主細胞において発現を制御するのに特に好適なプロモーターは、例えば、酵母で発現させるためのＡＤＨ２プロモーター、又は昆虫細胞で発現させるためのポリヘドリンプロモーターである。哺乳動物細胞において遺伝子産物の強力な発現を介在するプロモーターは、例えば、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）プロモーター、及びＣＭＶｉ／ｅ（サイトメガロウイルス極初期ポリペプチド）プロモーターなどのウイルス遺伝子のウイルスプロモーターである。本発明に関し、ＣＭＶプロモーターが好ましい。ＣＭＶプロモーターには変異も含まれ、変異配列は、天然ＣＭＶプロモーター（Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓら、１９８３、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１（１）：４７−５８）と好ましくは９５％、より好ましくは９９％相同であり、及び／又は変異体の活性は、野生型プロモーターと比較して好ましくは９０〜１１０％、より好ましくは９５〜１０５％である。
【００４１】
更に、転写調節領域は、特にＣＭＶプロモーターを用いる場合は、１以上のイントロン、好ましくはイントロンＡ（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１４）：３９７９−３９８６）を含有することができる。この態様は、例えば転写因子に対する好適な結合部位を提示することにより、特に高いＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質量を達成することが可能であるという利点を有する。イントロンＡには変異も含まれ、変異配列は、天然イントロン、特にイントロンＡ（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９（１４）：３９７９−３９８６）と好ましくは８０％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％相同であり、及び／又は変異体の活性は、野生型イントロン、特にイントロンＡと比較して、好ましくは９０〜１１０％、より好ましくは９５〜１０５％である。
【００４２】
本発明による発現システムの他の要素は、ＣＤ５リーダー、即ち、ＣＤ５リンパ球抗原の分泌シグナル配列（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２３（６０８６）：３４６−３４９）に対する核酸である。この分泌シグナル配列は、発現産物の宿主細胞培地への分泌を介在する。ＣＤ５リーダーに対する核酸とＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸は、リーダーが融合タンパク質の分泌を介在できるように発現システム中に配置されている。転写及び翻訳後、ＣＤ５リーダーは、発現産物において融合タンパク質のカルボキシ末端に局在することが好ましいが、融合タンパク質のアミノ末端に局在することも等しく好ましいかもしれない。
【００４３】
驚くべきことに、ＣＤ５リーダーは、ＣＨＯ細胞において、匹敵するシグナル配列よりも２００〜３００倍高い発現産物の細胞培地への分泌を介在することが示された（実施例２、図８を参照されたい）。ＣＤ５リーダーには変異も含まれ、変異配列は、天然ＣＤ５リーダー（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２３（６０８６）：３４６−３４９）と、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、更により好ましくは９５％相同であり、及び／又は変異体の活性は、野生型ＣＤ５リーダーと比較して、好ましくは８０〜１２０％、より好ましくは９０〜１１０％、更により好ましくは９５〜１０５％である。
【００４４】
発現システムでは、プロモーター、及びＣＤ５リーダーに対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸に機能的に連結されている。機能的に連結されているとは、融合タンパク質に対する核酸に関し、その機能を発揮できるように、プロモーター、及びリーダーに対する核酸が配置されていることを意味する。プロモーターの機能は、融合タンパク質の発現を調節することである。１つの核酸上に両者が局在する場合は、プロモーターは通常融合タンパク質の５’、又は３’である。リーダーの機能は、融合タンパク質の分泌を介在することである。リーダーに対する核酸及び融合タンパク質が１つの核酸上に局在する場合は、リーダーは、通常融合タンパク質に隣接する。「機能的に連結されている」とは、プロモーター及びＣＤ５リーダーが、融合タンパク質に関して、プロモーターが融合タンパク質の発現を調節し、ＣＤ５リーダーが融合タンパク質の分泌を引き起こすように配置されていることを意味することが好ましい。
【００４５】
好ましい態様では、発現システムは、例えば発現システムでトランスフェクションされた宿主細胞がトランスフェクションされていない細胞に対して選択されることを可能にする選択可能マーカー遺伝子に対する少なくとも１つの核酸を更に含有する。マーカー遺伝子の例は、抗生物質と組み合わせて使用される耐性介在遺伝子である。マーカー遺伝子は例えば発現ベクター中に挿入され、適切にトランスフェクションされた宿主細胞に適用される抗生物質と共に使用される。真核生物宿主細胞を選択するために使用される抗生物質の公知の例は、アンピシリン、カナマイシン、ゼオシンであり、本発明の好ましい態様では、ネオマイシンであり、これらの全ては、宿主細胞が対応の耐性介在遺伝子の発現によって選択されることを可能にする。他のマーカー遺伝子は当業者に公知であり、例えば選択的遺伝子ｔｋ又はＤＨＦＲは、ＨＡＴ又はアミノプテリン及びメトトレキセートなどの対応の選択剤の適用と組み合わされる。例えばオワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質遺伝子及びその変異体のような他の好適な選択可能マーカー遺伝子は、発現ベクターでトランスフェクションされた宿主細胞を選択剤で処理することなく光学的に選択することを可能にする。
【００４６】
選択可能マーカー遺伝子としてトリプトファン合成酵素をコードする遺伝子を使用することが好ましく、対応の発現プラスミドは、選択及び発現のために、トリプトファン合成酵素欠損宿主細胞に導入される。
【００４７】
更に好ましい態様では、発現システムは、通常、転写を終了させる他に、ＲＮＡ転写物の安定性にも影響を及ぼすポリアデニル化シグナルの少なくとも１つの核酸も含む。その例は、ＳＶ４０由来、β−グロブリン遺伝子由来、又は好ましい態様ではウシ成長ホルモン遺伝子ＢＧＨ（ＥＰ１７３５５２号）由来のポリアデニル化配列である。ポリアデニル化シグナルの核酸は、融合タンパク質の発現又はその安定性を改善可能な方法における発現システムの部分である。通常、転写産物がＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸とポリアデニル化シグナルとを含むように融合タンパク質に対する核酸に連結されている。
【００４８】
更に他の態様では、例えば無細胞系における転写及び／又は翻訳の場合、発現システムは上記成分に加えて発現に必要な成分を含有する。この種の可能な成分の例は、転写因子、酵素（例えばペプチジルトランスフェラーゼ、アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素、及びＲＮＡポリメラーゼ）、及び他の細胞内タンパク質（例えばｅＩＦ４Ｅ、ｅＦＥ１、及びｅＥＦ２）、並びに更なる補助物質（ＡＴＰ、ＧＴＰ、及びマグネシウムイオン）、好ましくはｔＲＮＡ、アミノ酸、及び／又はリボソームである。
【００４９】
本発明の好ましい態様では、発現システムは、成分ａ）〜ｃ）、及び必要に応じてｄ）を含有する唯一の核酸を含み、それらの全ては上で定義されている通りである。
本発明の非常に好ましい態様では、発現システムは、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の配列のいずれかの核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する。しかしながら、その配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示した塩基配列のうちの１つ、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする塩基配列と、少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一な核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては上記を参照されたい）。
【００５０】
最も好ましい態様では、発現システムは、以下の成分が５’から３’へ配置されている核酸を含む：必要に応じてイントロンＡを伴うＣＭＶプロモーター、ＣＤ５リーダー、特にＩＬ−１５のアミノ酸１４９位及び／又は１５６位に点突然変異を有し、グルタミンがアスパラギン酸に置換されているＩＬ−１５から成るＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質（ＷＯ９７／４１２３２号を参照されたい）、ヒンジ領域の４位のアミノ酸システインがアラニンに置換されているヒトＩｇＧ１のＦｃ部分、必要に応じてポリアデニル化シグナル、及び必要に応じて少なくとも１つのマーカー遺伝子。マーカー遺伝子は、特に第２の核酸に配置されていてもよい。したがって、そのような核酸も（マーカー遺伝子を伴うものも伴わないものも）本発明による核酸の好ましい態様である。
【００５１】
更に、本発明は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質、プロモーター、ＣＤ５リーダー、必要に応じて選択可能マーカー遺伝子、及び必要に応じてポリアデニル化シグナルを含む核酸に関するものであり、全ての成分は上に記載されている。好ましい態様では、核酸は、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する。しかしながら、その配列が、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に示した塩基配列のうちの１つ、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする塩基配列と、少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一である核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００５２】
更に、本発明は、本発明による発現システム又は本発明による核酸を含有する宿主細胞に関するものである。
使用できる宿主細胞は、酵母細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ、ピキア・パストリス）、昆虫細胞（例えばＳｆ９）、又は哺乳動物細胞のような真核細胞である。この種の哺乳動物細胞の例は、ヒト胚性腎細胞株ＨＥＫ−２９３、チャイニーズハムスターの卵巣細胞から調製したＣＨＯ細胞株、及び例えばＣＨＯ−Ｋ１やＣＨＯ−ＤＨＦＲのようなその誘導体、細胞株ＢＨＫ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、及びＮＳ．１である。宿主細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＣＨＯ細胞又はその誘導体であり、最も好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。
【００５３】
好ましい態様では、宿主細胞は、発現システムの核酸で安定にトランスフェクションされた細胞である。安定にトランスフェクションされた細胞の場合、発現システムは標的細胞のゲノムに組み込まれ、ゲノム中に安定に保持される。一過性トランスフェクションとは対照的に、移入遺伝子は、分解されないだけでなく、それぞれの細胞分裂で倍加し、娘細胞に継代される。したがって、後者は所望のタンパク質を調製する能力を長期間保持する。
【００５４】
トランスフェクションされた細胞、特に安定にトランスフェクションされた細胞を調製する方法は当業者に公知である。宿主細胞は、例えば短時間電界を供することによる細胞膜の透過化により細胞への核酸の取り込みを可能にするエレクトロポレーションで、又はウイルスベクターによるトランスフェクション若しくは感染で形質転換できる。組換えタンパク質の一過性発現の他に、用いる発現システムは、トランスフェクションされた宿主細胞のクローン選択をも可能にすることができ、好適な発現効率を有するクローン細胞株を選択可能である。
【００５５】
好ましい態様では、配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３による少なくとも１つの核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する宿主細胞は真核哺乳動物細胞である。その配列が、記載の配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一の核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００５６】
特に好ましい態様では、本発明による宿主細胞は、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３による少なくとも１つの核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸で安定にトランスフェクションされた、ＣＨＯ−Ｋ１株の細胞（チャイニーズハムスターの卵巣細胞のサブクローン）である。その配列が、記載の配列と少なくともおよそ６０％、好ましくはおよそ７５％、特に好ましくはおよそ９０％、特におよそ９５％同一の核酸も含まれ、対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質はＩＬ−１５Ｒに結合し、免疫グロブリン成分のない対応のＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質と比較して血中半減期が上昇している（試験系に関しては、上記を参照されたい）。
【００５７】
更に、本発明は、上で定義したようなＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製する方法に関するものであり、
ａ）上記のような宿主細胞を準備し、
ｂ）宿主細胞を培養し、
ｃ）必要に応じて選択し、そして
ｄ）発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を単離する、
ことを含む。
【００５８】
使用できる宿主細胞の例は、上記細胞である。細胞は、好ましくは哺乳動物細胞であり、より好ましくはＣＨＯ細胞又はその誘導体であり、最も好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。好適な宿主細胞は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質をコードする核酸で、標準法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記）によりトランスフェクションすることができる。
【００５９】
トランスフェクションされた宿主細胞は、接着細胞であっても懸濁培養物であってもよい。用いる宿主細胞は、接着細胞を懸濁培養に適応させるあいだの発現効率の低下を避けるため、懸濁培養中に存在することが好ましい。
【００６０】
初代培養細胞及び細胞株は、標準法（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、１９９３、動物細胞培養：実践的アプローチ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ社）により、好適な栄養培地中、塩濃度、ｐＨ、ビタミン、微量元素、選択剤、温度、通気などに関し、それぞれの場合において用いる宿主細胞の要求に対して調整され、所望の発現産物を最適に発現可能な発酵条件下で培養することができる。血清又は外来タンパク質のない、比較的高純度の発現産物を保証する栄養培地を使用することが有利である。
【００６１】
選択、特にクローン選択とは、所望の特性を有する宿主細胞を段階的間引きによって増殖させる方法を意味する。クローン選択法は、発現産物の十分な発現レベル及び／又は高グリコシル化パターンと高シアリル化状態を保証する宿主細胞クローンを選択することが好ましい。グリコシル化パターン及びシアリル化状態は、とりわけ、発現産物の半減期、生体内分布、免疫原性、及び精製挙動に影響を及ぼす。グリコシル化パターン及びシアル酸の状態を決定するための好適な方法は当業者に公知であり、とりわけ、ＩＥＦ（分画電気泳動）を用いる酵素的切断の組み合わせ、及びＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（パルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィ）を含む。
【００６２】
本発明の方法は、異種発現させたＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質の宿主細胞からの単離を更に含み、好ましい態様では、宿主細胞の培地からの単離を含む。組換えポリペプチドは、単離し、必要に応じて、例えば細胞溶解、分画遠心法、沈殿、ゲルろ過、親和性クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィなどを含む当業者に公知の方法にしたがい精製することができる。組換えタンパク質を精製するための好適な方法の１つの例は、不溶性マトリックスが化学処理によりリガンドに結合できる親和性クロマトグラフィである。有用なリガンドは、マトリックスに結合可能な活性化学基を有する分子であり得る。リガンドは、通常、精製すべきポリペプチドに可逆的に結合可能なように選択される。精製すべき分子は、分子のリガンドへの結合に良好な条件下、宿主細胞の予備精製培地中でマトリックスに供され、未結合分子はその後の洗浄工程によって培地から除去される。精製すべきポリペプチドは、リガンドに結合したポリペプチドを引き離す溶液を供することによって溶出させることができる。他の好適な方法は、精製すべきポリペプチドが過剰の陽電荷又は陰電荷を介してマトリックスに結合できる陰イオン交換クロマトグラフィである。本発明の方法の好ましい態様では、発現産物は、初めに細胞培地を宿主細胞から除去することによって精製され、この後に、遠心工程及び／又はろ過工程が続いて細胞残屑を除去し得る。好ましい態様では、組換えＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質は、必要に応じてゲルろ過を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィと陰イオン交換クロマトグラフィとの組み合わせによって宿主細胞の予備精製培地から精製される。このようにして得た発現産物は、その後、ＢＣＡ、光学密度測定、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、アミノ酸解析、アミノ末端配列決定、フィンガープリント（ＭＡＬＤＩ）、分子量測定（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ）などのような当業者に公知の方法で、量、同一性、及び純度に関して特徴付けることができる。
【００６３】
ＩＬ−１５／Ｆｃを組成物から精製するための特に好ましい方法は、以下の工程を含む：
ａ）組成物を親和性クロマトグラフィカラムに供し、第１のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる；
ｂ）工程ａ）の溶出物を陰イオン交換クロマトグラフィカラムに供し、第２のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる；そして
ｃ）工程ｂ）の溶出物をゲルろ過カラムに供し、第３のＩＬ−１５／Ｆｃ溶出物をカラムから溶出させる。
【００６４】
好ましい態様では、本発明の方法は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を、少なくとも１０ｐｇ／（細胞×日数）、より好ましくは少なくとも１５ｐｇ／（細胞×日数）の量で調製することを可能にする。
【００６５】
更に好ましい態様では、精製後のタンパク質は少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である。
更に、本発明は、上で定義した通りの発現システム、核酸、又は宿主細胞の、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための使用に関するものであり、上記のように使用される。
【００６６】
更に、本発明は、ＣＨＯ細胞及びその誘導体、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞においてタンパク質を発現させるための、上で定義した通りのＣＤ５リーダーの使用に関する。驚くべきことに、タンパク質の発現又は細胞培養上清へのその放出は、ＣＤ５リーダーを用いると、リーダーを用いない発現と比較して２００〜３００倍高いことが示された。更に、ＣＤ５リーダーは、これらの細胞において、他のリーダーよりも際だって優れていることが示された（実施例２、図８を参照されたい）。タンパク質はどのタンパク質でもよい。好ましい態様では、タンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターによって、特にイントロンＡとの組み合わせによって調節される。
【００６７】
以下の実施例及び図面によって本発明を限定することなく具体的に説明する。
実施例
【実施例１】
【００６８】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃの産生
ＩＬ−１５／Ｆｃ産生ＣＨＯ−Ｋ１細胞株を作製するには、ＩＬ−１５／Ｆｃの発現構築体を形成し、その分泌特性、それが含有する断片の同一性／完全性、及び好適な耐性遺伝子に関して最適化する必要がある。
【００６９】
ａ）出発材料
ヒトＩＬ−１５／Ｆｃ発現構築体（改変ＩＬ−１５／ヒトＦｃ）は、「ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター」の免疫部門（ハーバード大学医学部、ボストン、米国）より提供された。
【００７０】
オリゴヌクレオチドはＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ（エーバスベルク、ドイツ）から入手した。関連シグナルペプチドの配列は遺伝子ライブラリーから入手した。
制限酵素（ＢｇｌＩＩ、ＸＢａＩ、ＢａｍＨＩ、ＳｍａＩ、ＢｓｔＸＩ、ＡｐａＩ）、リポフェクタミン２０００、他の分子生物試薬（Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）、及びプラスミドｐＳｅｃＴａｇＡ、ｐｃＤＮＡ３．１は、インビトロジェン（カルルスルーエ、ドイツ）又はアマシャム−ファルマシア（ＮｈｅＩ、プロテインＡセファロース、ウプサラ、スウェーデン）から入手した。
【００７１】
コンピテント大腸菌ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ細胞はストラタジーン（ラ・ホーヤ、米国）から入手した。ＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ）はＫＭＦ Ｌａｂｏｒｃｈｅｍｉｅ（Ｓａｎｋｔ Ａｕｇｕｓｔｉｎ、ドイツ）から購入した。
【００７２】
プラスミドＤＮＡ精製キット（Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−Ｍａｘｉキット、Ｅｎｄｏｆｒｅｅ−Ｇｉｇａキット）はキアゲン（ヒルデン、ドイツ）から購入した。
抗体は、ＢＤ−ファーミンジェン（マウス抗ｈＩＬ−１５；カタログ番号５５４７１２；ハイデルベルグ、ドイツ）及びＤｉａｎｏｖａ（ヤギ抗マウスＰＯＤ；カタログ番号１５−０３６−００３；ヤギ抗ヒトＰＯＤ；カタログ番号１０９−０３６−０８８；ハンブルグ、ドイツ）から入手した。
【００７３】
ｂ）方法／結果
出発プラスミドは、ｐＳｅｃＴａｇＡベクター骨格内に、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分（ヒンジ領域、及びＣＨ２、ＣＨ３領域）に融合した改変ヒトＩＬ−１５を含む融合タンパク質のｃＤＮＡを含有する。プラスミドの構造は、本願で引用したＦｃ部分がマウスＩｇg２ａであること以外はＫｉｍら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：５７４２−５７４８；１９９８）によって記載されたものに相当する。
【００７４】
ｐＳｅｃＴａｇＡベクターに既に存在するＩｇｋリーダーを、ＩＬ−１５／Ｆｃ部分のインフレームクローニングによって融合タンパク質の分泌に用いた。このため、本来のＩＬ−１５配列から固有のシグナル配列を除去した。しかしながら、クローニングにより、Ｉｇｋリーダー配列の３’端とＩＬ−１５コード配列の５’端とのあいだに追加の１０アミノ酸を導入した。これは、タンパク質のプロセシング後も分泌タンパク質中に保持された。これらの非特異的アミノ酸を除去し、タンパク質の分泌特性を向上させるために、他の分泌タンパク質又は細胞表面タンパク質のさまざまなリーダー配列について試験した：マウスＩｇｋ（Ｃｏｌｏｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １５２：８９−１０４；１９９２；受託番号Ｘ９１６７０）、ヒトＣＤ５（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：３４６−３４９；１９８６；受託番号Ｘ０４３９１）、ＣＤ４（Ｈｏｄｇｅら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：９９−１０４；１９９１；受託番号Ｍ３５１６０）、ＭＣＰ−１（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｊｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２４４：４８７−４９３；１９８９；受託番号Ｍ２４５４５）、及びＩＬ−２（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ ３０２：３０５−３１０；１９８３；受託番号Ｋ０２０５６）（受託番号は「全米バイオテクノロジー情報センター」に基づいている）。Ｉｇｋリーダーと追加のアミノ酸を除去後、２本鎖オリゴヌクレオチドをクローニングすることによって、リーダーを記載のシグナルペプチド配列で置換した。配列決定によって同一性を確認した。続いて、得られた構築体を、リポフェクタミン２０００を用いたＨＥＫ−２９３細胞の一過性トランスフェクションによって試験した。さまざまな構築体でトランスフェクションした細胞の細胞培養上清のタンパク質含量を、Ｍｏｌｌ及びＶｅｓｔｗｅｂｅｒの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、９６：７７−８４、１９９９）にしたがいプロテインＡ−セファロース精製後、ＢＣＡアッセイで測定した。融合タンパク質の両成分の存在を確かなものにするため、ＳＤＳゲルの銀染色、及びＦｃ部分又はＩＬ−１５部分に対するウエスタンブロットによってタンパク質の同一性を確認した。記載の実験においてＣＤ５リーダーは最良の結果を生じ、ベクターを更に最適化するために選択した。
【００７５】
Ｆｃ部分のｃＤＮＡを、エクソン／イントロン構造を含有するゲノムＤＮＡで置換してもタンパク質発現の向上に寄与するかどうかについて更に試験した。核のスプライス装置によって除去されるべきイントロンの存在は、核からのＲＮＡ輸送、及びＲＮＡ安定性を向上させることができる。したがって、スプライスドナー部位及びスプライスアクセプター部位を挿入することによって、ゲノムＦｃ部分をＩＬ−１５ｃＤＮＡ配列に連結させた。得られたプラスミドをさまざまなリーダー配列で同様に改変し、上記のように試験した。しかしながら、ウエスタンブロットによるタンパク質の解析は、さまざまな望ましくないスプライス変異体が存在することを示した。したがって、ｃＤＮＡ型のＦｃ部分を使用し続けることに決定した。
【００７６】
その結果、得られたプラスミドはヒトＣＤ５リーダーとｃＤＮＡ−Ｆｃ部分とを含む。
改変ＩＬ−１５／Ｆｃ発現構築体の配列決定は、Ｆｃ部分が、オリジナル構築体に既に存在した３つの変異を含有することを示した。これらの変異のうちの２つは、高度に保存された位置のアミノ酸に関連した。第３の変異は、分子内及び分子間のシステイン結合の形成を阻止するために意図的に挿入した、ヒンジ領域の４位のＣｙｓ−Ａｌａ変異であった。
【００７７】
Ｃｙｓ−Ａｌａ変異を保持しながら２つの望ましくない変異を除去するために、ＲＴ−ＰＣＲでＦｃ ｃＤＮＡをサブクローニングした。用いたＲＮＡ源は、ＶＣＡＭ−１／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築体でトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞株である。増幅したＦｃ ｃＤＮＡ断片をＣＤ５−ｍｕｔＩＬ−１５プラスミドにクローニングし、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ制限処理でＦｃ部分を除去した。
【００７８】
得られたプラスミドを、異なる制限パターンに基づいて、及びその後の配列決定により再度解析し、ＣＤ５−６Ａｌａ７と称した。ＤＮＡ挿入剤としてのゼオシンの使用は変異を引き起こすため、ＩＬ−１５／Ｆｃの発現カセットをオリジナルｐＳｅｃＴａｇＡ骨格から切り出し、ＳＶ４０プロモーターの制御下でネオマイシン耐性遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。得られたプラスミドの両方の鎖を配列決定したところ、ＩＬ−１５／Ｆｃ発現カセットとの完全な一致を示した。
【００７９】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションと細胞培養上清のウエスタンブロット解析によって、そのタンパク質発現について構築体を再度試験した。陽性対照として、平行実験においてＣＤ５−６Ａｌａ７プラスミドでトランスフェクションを行った。
【００８０】
この目的のため、５×１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェル組織培養プレートに３重に細胞を蒔いた。２μｇのプラスミド及び４μｌのリポフェクタミン２０００をそれぞれ２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地で希釈し、トランスフェクションに用いた。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベーション後、混合物をピペットに取り、組織培養プレートの培地に加えた。
【００８１】
トランスフェクション後２目日に培地を除去し、ヒトＩＬ−１５部分に対するウエスタンブロットでＩＬ−１５／Ｆｃ含量を解析した：２０μｌの細胞培養上清を５μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、８５℃で５分間インキュベーションした。次にサンプルを１２％ポリアクリルアミドゲルで泳動した。次にセミドライブロッティングチャンバーを用いてゲルをブロットした。５％ミルクパウダーのＰＢＳ溶液、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するブロッキング溶液でブロットを一晩処理した。次にブロッキング溶液で１：１０００に希釈したマウス抗ヒトＩＬ−１５モノクローナル抗体とともにブロットを４時間インキュベーションした。３回の洗浄工程（１０分間、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）後、ヤギ抗マウス２次抗体 ペルオキシダーゼ（希釈１：５０００）とともにブロットを室温で更に２時間インキュベーションした。ブロットを再度３回洗浄し、次にＬｕｍｉｌｉｇｈｔ溶液をブロット表面に滴下し、Ｘ線フィルムをブロットに対して感光させた。
【００８２】
ＣＤ５−６Ａｌａ７でトランスフェクションした後に得たシグナルの範囲内の特定のウエスタンブロットシグナルは、３回の平行したトランスフェクション全ての細胞培養上清がＩＬ−１５／Ｆｃをタンパク質として含有することを示した。したがって、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミド（図１〜３）は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるタンパク質発現に使用できることが示された。
【００８３】
ｃ）結論
ＩＬ−１５／ＦｃプラスミドｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７を調製した。これは、ＣＭＶプロモーターの制御下、ヒトＩｇＧ１−ＦｃのｃＤＮＡに融合した改変ヒトＩＬ−１５とともにＣＤ５リーダーを含有する発現カセットを含有する。安定な真核細胞クローンを選択するために、ネオマイシン耐性遺伝子を導入した。プラスミドを配列決定したところ、ベクター骨格に関連性のないほんのわずかな不一致（３塩基対の反復）を有するものの、関連コード領域においては１００％の一致を示した。構築体の機能性をＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクションで確認した。
【実施例２】
【００８４】
所望の産物に対するＤＮＡを含有するプラスミドによる真核細胞株（例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞）のトランスフェクションは、治療用タンパク質を作製するための標準的な方法である。それにもかかわらず、このようにして作製した安定な細胞クローンによる低レベルの生産性は広く知られた問題である。したがって、既存の細胞株の生産性を増加させるためのさまざまな戦略がある。細胞においてプラスミドコピー数を増加させる試み（例えばメトトレキセート／ＤＨＦＲシステムを介して）は別として、更に発現構築体自体を改変することが可能である。強力なプロモーター（例えばＣＭＶプロモーター）に加えて、イントロンの導入により、より良いＲＮＡ安定性と、細胞のスプライス装置によって行われる核からのより良いＲＮＡ輸送をもたらす可能性がある。それにもかかわらず、イントロン／トランス遺伝子のどの組み合わせが好適か試験しなければならない。この目的のため、ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃ産生を増加させる組み合わせを発見するためにさまざまなイントロンをヒトＩＬ−１５／Ｆｃと組み合わせた。
【００８５】
ａ）材料
出発プラスミドとして用いたプラスミドはｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドである。図１に図示されている。その配列は配列番号１に開示されている。
【００８６】
用いた試験系は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＤＳＭ、ブラウンシュヴァイク、ドイツ、受託番号：ＡＣＣ１１０）、又はＨＥＫ−２９３細胞（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ、グリュンベルグ、ドイツ、ＡＥ８０５０３、ＱＢＩ−２９３Ａ）である。大腸菌細胞（ＸＬ１０−Ｇｏｌｄ、ストラタジーン、ラ・ホーヤ、米国）も用いた。標準培養条件（５％ＣＯ２、３７℃、湿潤環境）で細胞を培養した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞を１週間に２回、１：２０の比で継代した。ＨＥＫ−２９３細胞は１：６の比で継代した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞に用いた培地は、ＤＭＥＭ−Ｆ１２＋１０％ＦＫＳ＋１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐであり、ＨＥＫ−２９３細胞に用いた培地はＤＭＥＭ＋Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ＦＫＳ＋１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐである。Ｏｐｔｉｍｅｍ１培地をトランスフェクションに用いた。全ての培地はインビトロジェン、カルルスルーエ、ドイツ（カタログ番号３１３３１−０２８；３２４３０−０２７；５１９８５−０１８）から入手した。用いたプラスミドは、ＣＭＶプロモーター及びキメライントロン、ヒトβ−グロブリン遺伝子の５’スプライスドナー部位及びＩｇＧ重鎖の可変領域の３’スプライスアクセプター部位を含有するｐＣｌ−Ｎｅｏ（プロメガ）である。ｐＭＧ（インビトロジェン）は、ＣＭＶ由来イントロンＡを含有する持続性ＣＭＶプロモーターである。ｐＳｗｉｔｃｈ（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）は、合成イントロンＩＶＳ８である。更に、以下の酵素及び制限酵素を用いた：ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＸｂａＩ、ＮｒｕＩ、ＰａｃＩ、ＳｍａＩ、ＸｈｏＩ、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、仔ウシ腸由来アルカリホスファターゼ。これら及び他の分子生物試薬（リポフェクタミン２０００）はインビトロジェンから入手した。ＮｈｅＩはアマシャム−ファルマシア（ウプサラ、スウェーデン）から入手し、プラスミド精製キットはキアゲン、ヒルデン、ドイツから入手した。エキスパンド ハイフィディリティＰＣＲシステム（カタログ番号１ ７３２ ６４１）はロシュ、マンハイム、ドイツから入手した。
【００８７】
ｂ）方法
ｉ）ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドのＩＬ−１５／Ｆｃ挿入物をＮｈｅＩ／ＡｐａＩ消化によって単離した。最初にプラスミドをＡｐａＩ制限処理によって線状にし、５’−突出末端をＴ４ポリメラーゼ処理で平滑末端にした。次にその後のＮｈｅＩ消化によってＩＬ−１５／Ｆｃ挿入物を単離した。ＮｈｅＩ及びＳｍａＩで消化したｐｃＩ Ｎｅｏに断片を連結した。
【００８８】
ｉｉ）ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７のＣＭＶプロモーターを除去し、ｐＭＧ由来のイントロンＡを有する拡張ＣＭＶプロモーターと置換した：ｐＭＧプラスミドをＰａｃＩで切断し、突出末端をＴ４ポリメラーゼ処理で平滑末端にした。次のＸｂａＩ処理後、このようにして得た１．７ｋｂ断片はＣＭＶプロモーター＋イントロンＡを含有しているが、これをアガロースゲル電気泳動で精製した。ＮｈｅＩとその後のＮｒｕＩ制限消化によりＣＭＶプロモーターをｐｃＤＮＡ３．ｈＣＤ５．６Ａｌａ７から除去した。得られた断片を、ｐＭＧ−プロモーター−イントロンと４℃で一晩連結させた。
【００８９】
ｉｉｉ）ＩＶＳ８イントロンをＰＣＲで増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７内のＣＭＶプロモーターの３’端とＩＬ−１５挿入物の５’端とのあいだにクローニングした。プラスミドをＮｈｅＩ制限消化で線状にし、その後、仔ウシ腸由来のアルカリホスファターゼで処理した。イントロンを、ＸｂａＩ制限部位を含有するプライマーを用いて、エキスパンド ハイフィディリティＰＣＲシステムにて以下の条件下でＰＣＲにより増幅した：用いた反応混合物は、２μｌのｄＮＴＰｓ（キアゲン、Ｔａｑ ｃｏｒｅキット、それぞれ２ミリモル／ｌ）、２５ｐｍｏｌのプライマー、５μｌの１０×バッファー、０．７５μｌのハイフィディリティＴａｑポリメラーゼ、１μｌ（およそ１５ｎｇ）のｐＳｗｉｔｃｈ−ＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶ断片から成り、最終容量５０μｌになるまで水を加えた。ＰＣＲプログラム（２５サイクル）は以下の通りである：９５℃で５分、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒、７２℃で５分。ＰＣＲ産物をＸｂａＩで切断し、０．８％アガロースゲルから溶離し、線状にしたプラスミドと連結させた。
【００９０】
得られたプラスミドで大腸菌ＸＬ１０ Ｇｏｌｄを形質転換し、プラスミドをミニプレップで解析した。適切な制限パターンを示すそれぞれのプラスミドのうち、１つのクローンをその後のエンドトキシンフリープラスミド調製に用いた。
【００９１】
ＩＬ−１５／Ｆｃの発現を、ＨＥＫ−２９３細胞又はＣＨＯ−Ｋ１細胞の一過性トランスフェクション後に解析した。トランスフェクション前日に細胞を５×１０５細胞／ウェルの濃度で６ウェル細胞培養プレートに２重に蒔いた。Ｆｅｌｇｎｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７；１９８７）によるトランスフェクションのため、２μｇのプラスミド及び４μｌのリポフェクタミン２０００をいずれも２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｍ１培地で希釈した。２つの溶液を混合し、室温で３０分間インキュベーションした後、混合物をピペットに取り、細胞培養プレート中の細胞培地に加えた。トランスフェクション後２日目に培地を除去し、ＩＬ−１５／ＦｃのＦｃ部分を標的にしたＥＬＩＳＡ試験でそのＩＬ−１５／Ｆｃ含量を測定した。
【００９２】
ｃ）結果
さまざまな発現構築体でトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃの分泌は、他のベクター成分にほとんど影響されなかった。逆に、ＣＨＯ−Ｋ１細胞によるＩＬ−１５／Ｆｃの発現は、イントロンをＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に挿入した後、２００〜３００倍に増加した。オリジナル構築体ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７はタンパク質分泌レベルをほとんど検出できなかった（１０ｎｇ／ｍｌ以下）が、イントロンの挿入により、細胞をｐＭＧ１０Ａｌａ７でトランスフェクションした後のＩＬ−１５／Ｆｃレベルはおよそ３００ｎｇ／ｍｌであった（図４〜６；配列番号２）。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃ発現レベルを示すＥＬＩＳＡデータを図４に示す。ｐＭＧ構築体でトランスフェクションした後の発現レベルが最高であったため、安定なＣＨＯ−Ｋ１発現細胞株を作製するために後者を選択した。
【００９３】
この目的のため、最初にプラスミドを１本鎖配列決定に供した。構築体の両方の鎖について、ＩＬ−１５／Ｆｃカセット、新たに挿入したＣＭＶプロモーター、及びイントロン断片を含有する領域を配列決定した。プラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＩＬ−１５／Ｆｃカセットを含有していた。ＣＭＶ（プラスミドＭＧ）由来のイントロンＡは、プロモーターと翻訳開始部位とのあいだに位置していた。プラスミドは、ＩＬ−１５／Ｆｃ断片の下流にＢＧＨポリＡ部位を含有していた；ネオマイシン耐性遺伝子はＳＶ４０プロモーターによって制御され、ＳＶ４０ポリＡ部位も含有していた。プラスミドは、大腸菌における選択及び増幅のためのアンピシリン耐性遺伝子を含有していた。
【００９４】
ｄ）考察及び結論
安定なＣＨＯ−Ｋ１−ＩＬ−１５／Ｆｃトランスフェクタントのタンパク質収率を上昇させるために、プロモーターとＩＬ−１５／Ｆｃカセットとのあいだにイントロンを導入することによって発現プラスミドを改変した。イントロン−トランス遺伝子−宿主細胞の組み合わせはタンパク質の発現に非常に影響を及ぼし、したがって、解析した２種の細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃ発現の増加に最も有効なイントロンを予測することは可能ではない。
【００９５】
ＨＥＫ−２９３細胞はイントロンの導入にほとんど影響されなかったが、ＣＨＯ−Ｋ１細胞ではＩＬ−１５／Ｆｃ分泌の大きな増加が検出された。ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるＩＬ−１５／Ｆｃタンパク質の発現は、ＣＭＶプロモーターとｐＭＧ由来イントロンＡとを含有するプラスミドを用いたところ、オリジナルのＩＬ−１５／Ｆｃ発現ベクターと比較して、１桁を越える規模で増加した。プラスミドは、予備臨床試験及び臨床試験のためのＩＬ−１５／Ｆｃの産生、又はＩＬ−１５／Ｆｃの工業的産生に使用できるＩＬ−１５／Ｆｃ産生細胞株の作製に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図１は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体のマップを表す。
【図２】図２は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号１）。
【図３】図３は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号１）。
【図４】図４は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体のマップを表す。
【図５】図５は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号２）。
【図６】図６は、ｐＭＧ１０Ａｌａ７発現構築体の配列を表す（配列番号２）。
【図７】図７Ａは、ＣＤ５リーダーを有するヒト改変ＩＬ−１５／Ｆｃの核酸配列を表す（配列番号３）。図７Ｂは、ＣＤ５リーダーを有するヒト改変ＩＬ−１５／Ｆｃのアミノ酸配列を表す（配列番号４）。図７Ｃは、ＣＤ５リーダーを有するヒト改変ＩＬ−１５／Ｆｃのアミノ酸配列を表す（配列番号５）。
【図８】図８は、その都度示したリーダー配列を含有するｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７プラスミドでトランスフェクションした後のＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞培養上清におけるＩＬ−１５／Ｆｃ含量を表す。
【図９】図９は、さまざまな発現構築体でトランスフェクションした後のＣＨＯ−Ｋ１細胞の細胞培養上清におけるＩＬ−１５／Ｆｃ含量を表す。それぞれのバーは、いずれの場合も２回の独立した実験における２回の測定の平均＋ＳＥＭを表す。ｐｃＤＮＡ３．１は、ｐｃＤＮＡ３．１ｈＣＤ５．６Ａｌａ７ベクターに相当する。ｐＶＳ８−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＳｗｉｔｃｈプラスミド（Ｖａｌｅｎｔｉｓ）に相当する。ｐＭＧ−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＭＧプラスミド（インビトロジェン）に相当する。ｐＣＩＮｅｏ−Ａｌａ７は、ＩＬ−１５／Ｆｃ構築体に対する構築体を有するｐＣＩ−Ｎｅｏプラスミド（プロメガ）に相当する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の核酸を含有する発現システムであって、
ａ）ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸、
ｂ）少なくとも１つのプロモーター、及び
ｃ）ＣＤ５リーダーに対する少なくとも１つの核酸、
を含み、プロモーター及びＣＤ５リーダーに対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸に機能的に連結されている、前記発現システム。
【請求項２】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
プロモーターが、イントロン、特にイントロンＡを更に含有する転写調節ユニットの部分である、請求項１又は２に記載の発現システム。
【請求項４】
融合タンパク質のＦｃ部分が免疫グロブリンＧのＦｃ断片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項５】
ｄ）選択可能マーカー遺伝子に対する少なくとも１つの核酸を更に含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項６】
ポリアデニル化シグナルに対する少なくとも１つの核酸を更に含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項７】
リボソーム、アミノ酸、及び／又はｔＲＮＡを更に含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項８】
唯一の核酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の配列を有する核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項１０】
請求項１〜４の成分ａ）〜ｃ）、及び場合により請求項５の成分ｄ）を含有する核酸。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する核酸。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現システム、又は請求項１０若しくは１１に記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＣＨＯ細胞株又はその誘導体、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞株の細胞である、請求項１２又は１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製する方法であって、
ａ）請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞を準備し、
ｂ）宿主細胞を培養し、
ｃ）必要に応じて選択し、そして
ｄ）発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を単離する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞株又はその誘導体、特に好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株の細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質が、少なくとも１０ｐｇ／（細胞×日数）の量で、好ましくは少なくとも１５ｐｇ／（細胞×日数）の量で調製される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現システム、請求項１０又は１１に記載の核酸、あるいは請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１９】
ＣＨＯ細胞又はその誘導体、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞においてタンパク質を発現させるためのＣＤ５リーダーの使用。
【請求項２０】
タンパク質の発現が、ＣＭＶプロモーターによって、特にイントロンＡとの組み合わせによって調節される、請求項１９に記載の使用。
【請求項１】
１以上の核酸を含有する発現システムであって、
ａ）ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する少なくとも１つの核酸、
ｂ）少なくとも１つのプロモーター、及び
ｃ）ＣＤ５リーダーに対する少なくとも１つの核酸、
を含み、プロモーター及びＣＤ５リーダーに対する核酸は、ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質に対する核酸に機能的に連結されている、前記発現システム。
【請求項２】
プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項１に記載の発現システム。
【請求項３】
プロモーターが、イントロン、特にイントロンＡを更に含有する転写調節ユニットの部分である、請求項１又は２に記載の発現システム。
【請求項４】
融合タンパク質のＦｃ部分が免疫グロブリンＧのＦｃ断片である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項５】
ｄ）選択可能マーカー遺伝子に対する少なくとも１つの核酸を更に含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項６】
ポリアデニル化シグナルに対する少なくとも１つの核酸を更に含有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項７】
リボソーム、アミノ酸、及び／又はｔＲＮＡを更に含有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項８】
唯一の核酸を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項９】
配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の配列を有する核酸、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の発現システム。
【請求項１０】
請求項１〜４の成分ａ）〜ｃ）、及び場合により請求項５の成分ｄ）を含有する核酸。
【請求項１１】
配列番号１、配列番号２、若しくは配列番号３の配列、又は配列番号４若しくは配列番号５のポリペプチドをコードする核酸を含有する核酸。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現システム、又は請求項１０若しくは１１に記載の核酸を含有する宿主細胞。
【請求項１３】
哺乳動物細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ＣＨＯ細胞株又はその誘導体、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞株の細胞である、請求項１２又は１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製する方法であって、
ａ）請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞を準備し、
ｂ）宿主細胞を培養し、
ｃ）必要に応じて選択し、そして
ｄ）発現したＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を単離する、
ことを含む、前記方法。
【請求項１６】
宿主細胞が、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞株又はその誘導体、特に好ましくはＣＨＯ−Ｋ１細胞株の細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質が、少なくとも１０ｐｇ／（細胞×日数）の量で、好ましくは少なくとも１５ｐｇ／（細胞×日数）の量で調製される、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＩＬ−１５／Ｆｃ融合タンパク質を調製するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の発現システム、請求項１０又は１１に記載の核酸、あるいは請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１９】
ＣＨＯ細胞又はその誘導体、特にＣＨＯ−Ｋ１細胞においてタンパク質を発現させるためのＣＤ５リーダーの使用。
【請求項２０】
タンパク質の発現が、ＣＭＶプロモーターによって、特にイントロンＡとの組み合わせによって調節される、請求項１９に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２００７−５３５９１９（Ｐ２００７−５３５９１９Ａ）
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５０７７４７（Ｐ２００７−５０７７４７）
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００３８８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１００３９５
【国際公開日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年１２月１３日（２００７．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１３日（２００５．４．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００５／００３８８８
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１００３９５
【国際公開日】平成１７年１０月２７日（２００５．１０．２７）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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